KR102175112B1 - L-쓰레오닌 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법 - Google Patents

L-쓰레오닌 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 L-쓰레오닌 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법에 관한 것이다.

Description

L-쓰레오닌 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법{Microorganisms with enhanced ability to produce L-threonine and methods for producing L-threonine using the same}
본 출원은 L-쓰레오닌 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법에 관한 것이다.
쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료, 식품 첨가제 및 동물성장 촉진제로 널리 사용되며 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로도 사용된다. 미생물을 이용한 쓰레오닌 생산방법에 있어서, 수율을 향상시키기 위해 쓰레오닌 생합성 유전자(ex. ppc, aspC, thrABC) 강화와 함께 쓰레오닌 분해 경로를 차단하는 방법이 알려져 있다(Kwang-Ho Lee, et al., Molecular System Biology 2007). 쓰레오닌 분해 경로 상의 유전자로는 tdh, tdcB, glyA, ilvA 등이 있는데, 이들 중 ilvA (쓰레오닌 디아미나제, Threonine deaminase)가 가장 주요한 쓰레오닌 분해 유전자로 알려져 있다. 분해 유전자 중 ilvA 유전자를 결손할 경우 쓰레오닌의 수율은 크게 향상하지만 고가의 이소루신(isoleucine)에 대한 요구성이 나타나는 문제가 있으므로 일반적으로는 ilvA 활성 약화 및 isoleucine에 대한 고민감성 변이를 적용하는 것으로 알려져 있다(Akhverdian Valery Z, et al.).
한편 쓰레오닌과 글리신의 관계에 관해서는, 글리신 합성에 관여하는 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제의 주요 전구체는 세린이며, 효소 활성은 쓰레오닌을 전구체로 사용하는 경우보다 세린으로 사용할 때 24배 높다 (Simic et al., Appl Environ Microbiol. 2002)는 것이 알려져 있다. 그러나, 글리신 유입과 쓰레오닌 생산능에 관해서는 알려진 바 없다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 세포 밖으로 배출된 글리신을 유입시켜 이용 가능한 미생물을 개발하기 위해 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 글리신 트랜스포터 cycA를 도입하였으며, 그 결과 높은 수율로 L-쓰레오닌을 생산하는 균주를 완성하였다.
본 출원의 목적은 글리신 트랜스포터 활성이 강화된, L-쓰레오닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 본 출원의 미생물을 포함하는 L-쓰레오닌 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌 제조방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원의 하나의 양태는 글리신 트랜스포터 활성이 강화된, L-쓰레오닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 출원의 용어 "글리신 트랜스포터(glycine transporter)"는 세포 내로 글리신을 유입하는 기능을 갖는 단백질이라면 제한 없이 포함되며, 구체적으로는 D-세린/D-알라닌/글리신 트랜스포터(D-serine/D-alanine/glycine transporter)일 수 있다. 상기 글리신 트랜스포터는 D-세린/D-알라닌/글리신 트랜스포터 또는 글리신 유입 단백질과 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 "D-세린/D-알라닌/글리신 트랜스포터(D-serine/D-alanine/glycine transporter)"는, 세린, 알라닌 및 글리신 수송에 모두 관여할 수 있는 단백질로, 공지의 데이터 베이스인 NCBI Genbank 등에서 D-Serine/D-Alanine/glycine transporter 서열을 검색하여 그 정보를 얻을 수 있다. 상기 트랜스포터는 구체적으로 CycA, AapA 일 수 있고, 보다 구체적으로는 CycA 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 "CycA 단백질"은 세린, 알라닌 및 글리신 유입(uptake)에 관여하는 단백질을 의미한다. CycA 단백질은 cycA 유전자에 의해 코딩되며, cycA 유전자는 대장균(Escherichia coli), 크렙시엘라 뉴모니에(Klebsialla pneumoniae), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 등의 미생물에 존재하는 것으로 알려져 있다.
본 출원의 목적상, 본 출원의 CycA 단백질은 쓰레오닌 생산능을 강화할 수 있는 것이면 어느 것이든 포함될 수 있다. 구체적으로 상기 CycA 단백질은 코리네박테리움속 미생물 유래일 수 있고, 보다 구체적으로는 코리네박테리움 암모니아게네스 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)는 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes)와 동종으로, 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis), 브레비박테리움 스테이셔니스(Brevibacterium stationis)와 동일 분류군(taxon)으로 분류되었다(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 60: 874-879). 또한 상기 브레비박테리움 암모니아게네스는 코리네박테리움 스테이셔니스로 변경되어 명명된 바 있다.
따라서, 본 출원에서 용어 코리네박테리움 암모니아게네스, 브레비박테리움 암모니아게네스, 코리네박테리움 스테이셔니스, 브레비박테리움 스테이셔니스는 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원의 CycA 단백질은 서열번호 16 또는 이와 70% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 CycA 단백질은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 상동성 또는 동일성을 가지며, 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
더불어, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드로서, 세린, 알라닌 및 글리신 유입 활성을 갖는 폴리펩티드도 제한 없이 포함될 수 있다.
즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 폴리펩타이드' 또는 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드'라고 기재되어 있더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단 그리고/또는 C-말단에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 알지닌, 라이신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함하고, 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판을 포함한다.
본 출원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"는 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 폴리뉴클레오티드에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990) 참조).
상기 폴리뉴클레오티드는 본 출원의 CycA 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 CycA 단백질과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로 예를 들어, 서열번호 16 또는 서열번호 16과 70% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 17 또는 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 서열번호 16 또는 서열번호 16과 70% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 16의 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 70% 이상, 80% 이상, 구체적으로는 85% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
본 출원에서 용어 "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다. 보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
상기 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성 또는 동일성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]나 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 또한, 임의의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 출원의 용어 "단백질의 활성 강화" 는 미생물이 가진 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상되는 것을 의미한다. 상기 활성 강화는 외래의 단백질을 도입하는 것과, 내재적인 단백질의 활성 강화를 모두 포함할 수 있다. 즉, 특정 단백질의 내재적 활성이 있는 미생물에 외래 단백질을 도입하는 것과, 내재적 활성이 없는 미생물에 상기 단백질을 도입하는 것도 포함한다. 상기 "단백질 도입"은 특정 단백질의 활성이 미생물 내로 도입되어 발현되도록 변형되는 것을 의미한다. 이는 해당 단백질의 활성 강화로도 표현될 수 있다.
본 출원의 용어 "내재적"은 자연적, 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 상태를 의미한다.
본 출원에서 활성 강화는,
1) 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가,
2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형,
3) 상기 단백질의 활성이 강화되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형,
4) 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입, 또는
5) 이의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 1) 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터에 본원의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터에 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 숙주세포 내에 도입됨으로써 상기 숙주세포의 염색체 내 상기 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가시키는 방법으로 수행될 수 있다.
다음으로, 2) 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 CJ7 프로모터(대한민국 등록특허 제0620092호 및 WO2006/065095), lysCP1 프로모터(WO2009/096689), EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
또한, 4) 외래 폴리뉴클레오티드 서열의 도입은, 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
마지막으로, 5) 상기 1) 내지 4)의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법은, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 이의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 변형 중 하나 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.
본 출원의 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 출원의 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
본 출원의 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 출원의 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 용어 "L-쓰레오닌을 생산하는 미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 자연적으로 L-쓰레오닌 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 L-쓰레오닌의 생산능이 없는 모균주에 L-쓰레오닌의 생산능이 부여된 미생물을 의미할 수 있다. 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 L-쓰레오닌 생산을 위하여 유전적 변이가 일어나거나 활성을 강화시킨 미생물 일 수 있다.
예를 들어, 상기 L-쓰레오닌을 생산하는 미생물은 글리신 트랜스포터 활성이 강화된 미생물일 수 있다. 또는 이에 추가로 쓰레오닌 생합성 경로상의 효소의 피드백 제한이 억제되거나, 쓰레오닌 생합성 경로에 관여하는 효소를 강화 또는 억제하여 쓰레오닌을 생산하는 미생물일 수 있다. 또는 쓰레오닌 생합성에 영향을 미치지 않는 효소 또는 단백질의 활성이 불활성화 되어 쓰레오닌 생합성 경로로의 대사를 원활하게 함으로써 쓰레오닌을 생산하는 미생물일 수 있다. 또는, 쓰레오닌 생합성 경로상의 중간체, 보조인자, 또는 에너지원을 소모하는 경로상의 단백질 또는 효소의 활성을 불활성화시킨 미생물일 수 있다.
보다 구체적으로, lysC(aspartate kinase), hom(homoserine dehydrogenase) 폴리펩티드가 변이되어 쓰레오닌 생합성 경로의 피드백 제한을 억제하거나, 쓰레오닌 생산 증가에 관여하는 단백질의 발현을 강화시키거나, 쓰레오닌 분해 경로의 효소를 불활성화시킨 미생물일 수 있다.
다만 이는 한 가지 예에 불과하며, 이에 제한되지 않고, 다양한 공지의 L-쓰레오닌 생합성경로의 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증진시키거나 분해경로의 효소를 불활성화시킨 미생물일 수 있다. 상기의 L-쓰레오닌을 생산하는 미생물은 공지의 다양한 방법을 적용하여 제조될 수 있다.
본 출원의 용어 "단백질 활성의 불활성화"는 효소 또는 단백질의 발현이 천연의 야생형 균주, 모균주 또는 해당 단백질이 비변형된 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않거나 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미한다. 이때, 상기 감소는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 변이, 발현조절서열의 변형, 유전자 일부 또는 전체의 결손 등으로 단백질의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 단백질의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 암호화하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 단백질의 활성 정도가 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함하는 개념이다. 본 출원에 있어서, 상기 불활성화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 1) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 2) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 발현이 감소하도록 발현 조절 서열의 변형, 3) 상기 단백질의 활성이 제거 또는 약화되도록 단백질을 암호화하는 상기 유전자 서열의 변형, 4) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입; 5) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열을 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착을 불가능하게 만드는 방법; 6) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터를 부가하는 방법(Reverse transcription engineering, RTE) 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 목적상 본 출원의 미생물은 상기 글리신 트랜스포터를 포함하고 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다.
본 출원에서 상기 "L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 미생물"은 "L-쓰레오닌을 생산하는 미생물", "L-쓰레오닌 생산능을 갖는 미생물", "L-쓰레오닌 생산용 미생물"과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원의 쓰레오닌을 생산하는 미생물은 글리신 분해 단백질의 활성이 추가로 강화된 것일 수 있다. 상기 "쓰레오닌을 생산하는 미생물", "단백질의 활성 강화"는 전술한 바와 같다.
본 출원의 용어 "글리신 분해 단백질"은 글리신 분해 경로에 직접 또는 간접적으로 관여하는 단백질로, "글리신 분해 시스템(glycine cleavage system; GCV)"을 구성하는 각각의 단백질, 또는 상기 단백질의 복합체(complex) 또는 상기 글리신 분해 시스템 자체를 의미하는 것으로 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 글리신 분해 단백질은 글리신 분해 시스템을 구성하는 T-단백질(GcvT), P-단백질(GcvP), L-단백질(GcvL), H-단백질(GcvH) 및 상기 글리신 분해 시스템의 조효소인 LipB, LipA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다(John E. Cronan, Microbiology and Molecular Biology Reviews., 13 April 2016). 상기 글리신 분해 단백질은 코리네박테리움 속 미생물 유래, 구체적으로 코리네박테리움 암모니아게네스 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 GcvP 단백질은 서열번호 38, GcvT 단백질은 서열번호 39, GcvH는 서열번호 40, LipA 단백질은 서열번호 41, LipB 단백질은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 상기 단백질과 각각 70% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 GcvP 단백질은 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 38의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 상동성 또는 동일성에 대한 설명은 GcvT, GcvH, LipA, LipB에 대해서도 동일하다. 또한, 상기 상동성 또는 동일성을 가지며, 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
더불어, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드로서, 글리신 분해 활성을 갖는 폴리펩티드도 제한 없이 포함될 수 있다.
상기 상동성 또는 동일성은 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어 "L-쓰레오닌을 생산하는 코리네박테리움 속 (the genus of Corynebacterium) 미생물"이란, L-쓰레오닌을 생산하는 미생물로써, 미생물의 속이 코리네박테리움 속에 속하는 미생물을 의미할 수 있다. 상기 L-쓰레오닌을 생산하는 미생물은 전술한 바와 같다. 구체적으로, 본 출원에서 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 코리네박테리움속 미생물이란 본 출원의 글리신 트랜스포터의 활성이 강화되거나, 또는 상기 글리신 트랜스포터를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 가지게 된 코리네박테리움속 미생물을 의미할 수 있다. 또한 이에 추가적으로 글리신 분해 단백질의 활성이 강화되거나, 또는 상기 글리신 분해 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 가지게 된 코리네박테리움속 미생물을 의미할 수 있다. 상기 "향상된 L-쓰레오닌 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물"은 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물보다 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 미생물을 의미한다. 상기 '비변형 미생물'은 천연형 코리네박테리움 속 균주 자체이거나, 상기 글리신 트랜스포터를 코딩하는 유전자를 포함하지 않는 미생물, 또는 상기 글리신 트랜스포터를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되지 않은 미생물을 의미한다.
본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 모든 코리네박테리움 속 미생물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스Cxorynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있고, 더욱 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 L-쓰레오닌 생산용 미생물을 포함하는, L-쓰레오닌 생산용 조성물을 제공한다.
상기 L-쓰레오닌 생산용 조성물은 본 출원의 L-쓰레오닌을 생산하는 미생물에 의해 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 조성물을 의미할 수 있다. 상기 조성물은 상기 L-쓰레오닌을 생산하는 미생물을 포함하며, 상기 균주를 이용하여 쓰레오닌을 생산할 수 있는 추가적인 구성을 제한없이 포함할 수 있다. 상기 쓰레오닌을 생산할 수 있는 추가적인 구성은 예를 들어, 발효용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제, 또는 배지의 구성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제로는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 미생물 배양하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌 제조방법을 제공한다.
본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 코리네박테리움속 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용될 수 있으며, 구체적으로는 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 또는 혐기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 당 알코올, 글리세롤, 등과 같은 알코올; 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산; 피루브산, 락트산, 아세트산, 시트르산과 같은 유기산, 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다.
그 외에 상기 배지에는 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.
배양물의 온도는 25℃ 내지 40℃일 수 있으며, 보다 구체적으로는 28℃ 내지 37℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 1 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 L-쓰레오닌 제조방법은 상기 배양 단계 이후 상기 미생물, 상기 배지, 이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물의 추출물 및 상기 미생물의 파쇄물 중에서 선택된 하나 이상의 물질로부터 L-쓰레오닌을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 회수 단계는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적 물질인 L-쓰레오닌을 회수할 수 있다. 예를 들어, 상기 L-쓰레오닌의 회수는 침전, 원심분리, 여과, 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.
본 출윈의 L-쓰레오닌 생산용 미생물은 우수한 쓰레오닌 생산능을 갖는바, 효율적인 L-쓰레오닌의 대량 생산에 활용될 수 있다.
이하 본 출원을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 야생형 코리네박테리움속 미생물을 이용한 L-쓰레오닌 생산균주 제작
실시예 1-1: L-쓰레오닌 생산능을 가진 코리네박테리움 속 미생물 균주의 제작
야생종 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 로부터 L-쓰레오닌 생산 균주를 개발하였다. 구체적으로, 쓰레오닌 생합성 경로에서 첫 번째 중요한 효소로 작용하는 aspartate kinase(lysC)의 피드백 저해(feedback inhibition) 해소를 위해 lysC의 377번 아미노산인 루신(Leucine)을 라이신(Lysine)으로 치환한 균주를 제작하였고 (서열번호 1), 이 균주를 기반으로 쓰레오닌 생합성 경로에서 중요한 homoserine dehydrogenase(hom)의 피드백 (feedback inhibition) 해소를 위해 hom의 398번 아미노산인 아르기닌(Arginine)을 글루타민(Glutamine)으로 치환하여 쓰레오닌 생산 균주를 제작하였다(서열번호 6).
실시예 1-1-1: lysC 변이 도입
구체적으로, lysC(L377K) 변이가 도입된 균주를 제작하기 위해 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 2 및 서열번호 3 혹은 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복하였다. 그 결과 lysC 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 515bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 538bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다. 증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 2 및 서열번호 5의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 2분 중합을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 377번째 루신이 라이신으로 치환된 아스파토키나제 변이체를 코딩하는 lysC 유전자의 변이를 포함하는 1023bp의 DNA 단편이 증폭되었다. 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다. 한편 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ(대한민국 등록 특허 제10-0924065호) 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 lysC(L377K) 변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDZ-L377K를 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법으로 ATCC13032에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 각 염기변이가 변이형 염기로 치환되어 있는 균주를 얻었으며, 이를 CJP1으로 명명하였다.
실시예 1-1-2: hom 변이 도입
CJP1 균주 기반으로 hom(R398Q) 변이가 도입된 균주를 제작하기 위해 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 7 및 서열번호 8 혹은 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복하였다. 그 결과 hom 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 668bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 659bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다. 증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 7 및 서열번호 10의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 2분 중합을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 398번째 아르기닌이 글루타민으로 치환된 homoserine dehydrogenase 변이체를 코딩하는 hom 유전자의 변이를 포함하는 1327bp의 DNA 단편이 증폭되었다. 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 한편 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 hom(R398Q) 변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDZ-R398Q를 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법에 의해 위에서 수득한 코리네박테리움 글루타미쿰 CJP1에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 각각 변이형 염기로 치환되어 있는 균주를 얻었다. 이 균주를 CJP1-R398Q로 명명하였으며, 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제 기탁하여 KCCM12120P로 기탁번호를 부여받았다(대한민국 등록특허 번호 제 10-1947959호).
실시예 1-2: D-alanine/D-serine/glycine transporter 유전자가 도입된 L-쓰레오닌 생산균주 제작
실시예 1-1에서 제조한 미생물에 코리네박테리움 글루타미쿰 염색체 내에 D-alanine/D-serine/glycine transporter 유전자를 삽입하기 위한 실험을 수행하였다.
실시예 1-2-1: 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 글리신 트랜스포터(CycA(Cam)) 도입 균주 제작
글리신 트랜스포터 단백질을 코딩하는 유전자 cycA를 삽입하기 위하여, 트랜스포존(Transposon)을 코딩하는 Ncgl2131 유전자를 삽입 사이트로 이용하였다(대한민국 등록 특허 제10-1126041호, Journal of Biotechnology 104, 5-25 Jorn Kalinowski et al, 2003 방법 이용) (서열번호 11). 트랜스포존 삽입용 벡터를 제작하기 위해 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 12 및 서열번호 13 혹은 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 각각 Ncgl2131 유전자로부터 5' 상단 부위의 2041bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 2040bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다. 증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 12 및 서열번호 15의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 4분 중합을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 중심 부위에 SpeI과 XhoI, 두 가지 제한효소의 인식부위를 포함하는 4066bp의 DNA 단편이 증폭되었다. 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다. 한편 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 Ncgl2131 유전자 위치로의 삽입용 벡터 pDZ-N2131을 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법으로 위 실시예 1-1에서 수득한 KCCM12120P 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 Ncgl2131 유전자가 결실된 균주를 얻었으며, 이를 KCCM12120P-N2131로 명명하였다.
한편, D-alanine/D-serine/glycine transporter 활성을 가진 유전자 단편을 획득하기 위해 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872 염색체를 주형으로 하여 서열번호 18 및 서열번호 19의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 90초를 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 1595bp의 cycA 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다 (서열번호 17).
공지된 코리네박테리움 속 미생물 유래의 프로모터 cj7을 포함하는 p117-cj7-gfp를 주형으로 하여 PCR을 실시하였다(대한민국 등록특허 제10-0620092호). 여기서 'p117'은 대장균-코리네박테리움 셔틀 벡터(E. coli-Corynebacterium shuttle vector)인 pECCG117(Biotechnology Letters 13(10): 721-726, 1991)을 나타내는 것이다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 반응은 서열번호 21 및 서열번호 22의 프라이머를 사용하여 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 30초를 28회 반복한 후, 72℃에서 3분간 중합반응을 수행하였다. 이로부터 증폭된 PCR 결과물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 350bp 크기의 cj7 단편을 획득하였다 (서열번호 20).
위에서 획득한 cj7 단편과 cycA 단편을 주형으로 하고, 서열번호 21 및 서열번호 19의 프라이머를 사용하여 융합(sewing) PCR을 실시하였다. PCR 반응은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 1945bp의 cj7-cycA 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 한편, 위에서 제작한 pDZ-N2131 벡터를 제한효소 xhoI으로 처리하고 65℃에서 20분간 열처리한 후, 획득한 cj7-cycA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 Ncgl2131 위치로 cycA 유전자를 삽입할 수 있는 벡터 pDZ-N2131/cj7-cycA(Cam)을 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법으로 KCCM12120P 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 Ncgl2131 위치가 cj7-cycA(Cam) 형태로 치환되어 있는 균주를 얻었으며, 이를 KCCM12120P/cycA(Cam)으로 명명하였다.
실시예 1-2-2: 대장균 유래 글리신 트랜스포터(CycA(Eco)) 도입 균주 제작
한편, 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 cycA 유전자와 그 활성을 비교하기 위해 기공지된 대장균 K-12 유래의 cycA 유전자를 위와 동일하게 KCCM12120P 균주에 도입하였다(Microbiology, 141(Pt 1); 133-40, 1995) . 구체적으로 대장균 K-12 W3110 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 1544bp의 cycA 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다 (서열번호 23).
위에서 획득한 cj7 단편과 cycA 단편을 주형으로 하고, 서열번호 21 및 서열번호 26의 프라이머를 사용하여 융합(sewing) PCR을 실시하였다. PCR 반응은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 90초를 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 1894bp의 cj7-cycA 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 한편, 위에서 제작한 pDZ-N2131 벡터를 제한효소 xhoI으로 처리하고 65℃에서 20분간 열처리한 후, 획득한 cj7-cycA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 Ncgl2131 위치로 cycA 유전자를 삽입할 수 있는 벡터 pDZ-N2131/cj7-cycA(Eco)를 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법으로 KCCM12120P 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 Ncgl2131 위치가 cj7-cycA(Eco) 형태로 치환되어 있는 균주를 얻었으며, 이를 KCCM12120P/cycA(Eco)로 명명하였다.
실시예 1-3: CycA가 도입된 균주의 L-쓰레오닌 생산능 평가
실시예 1-2에서 제작된 균주들의 L-쓰레오닌 생산능 테스트를 진행하였다. 종배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 위에서 획득한 균주들을 각각 접종한 후, 30℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 L-쓰레오닌 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 48 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다
종배지 (pH 7.0)
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
L-쓰레오닌 생산배지 (pH 7.2)
포도당 30g, KH2PO4 2g, Urea 3g, (NH4)2SO4 40g, Peptone 2.5g, CSL(Sigma) 5g(10 ml), MgSO4.7H2O 0.5g, Leucine 400mg, CaCO3 20g (증류수 1 리터 기준)
배양 종료 후 HPLC를 이용하여 생산된 여러 아미노산의 생산량을 측정하였다. 그 결과는 하기 [표 1]과 같다.
균주 Amino acid (g/l)
Thr Gly Ser Lys Ile Ala Val
KCCM12120P 1.61 0.27 0.04 2.73 0.07 0.14 0.04
KCCM12120P-N2131 1.60 0.28 0.04 2.74 0.08 0.15 0.05
KCCM12120P/cycA(Cam) 1.81 0.22 0.03 2.61 0.07 0.00 0.03
KCCM12120P/cycA(Eco) 1.37 0.30 0.05 2.92 0.07 0.02 0.03
L-쓰레오닌의 생산량이 늘어날수록 L-라이신의 생산량은 감소하는 반면, L-쓰레오닌 생산량이 증가할수록 L-쓰레오닌 생합성 경로상 부산물이 될 수 있는 L-이소류신(Ile), 글리신(Gly)은 증가할 수 있으므로 이들의 생산량을 함께 확인하였다. 또한, cycA 유전자의 transporter로서의 기능도 확인하고자 세린(Ser)과 알라닌(Ala), 발린(Val)의 생산량도 함께 확인하였다.
상기 [표 1]의 결과와 같이, 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 cycA 유전자가 도입된 KCCM12120P/cycA(Cam) 균주는 모균주인 KCCM12120P 균주 대비 L-쓰레오닌의 생산량은 12.5% 증가한 반면 L-라이신은 4% 가량 감소하였다. 또한 cycA 유전자 도입 효과로 글리신은 모균주 대비 18.5% 감소하였고, 세린, 발린은 모균주 대비 소폭 감소하였으며, 알라닌은 현저히 감소하여 배양액에서 검출되지 않는 것을 확인하였다.
한편, 대장균 유래 cycA 유전자가 도입된 KCCM12120P/cycA(Eco) 균주는 모균주 대비 L-쓰레오닌의 생산량이 14.9% 감소한 반면, L-라이신은 6.9%, 글리신은 10% 가량 증가하는 결과를 확인하였다. 이처럼 대장균 유래 cycA와 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 cycA 유전자 도입의 효과가 매우 상이하게 나타났으나 공통적으로 배양액 내 알라닌의 농도는 현저히 감소하는 양상을 나타내었다. 또한, 대장균 유래 cycA 또는 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 cycA를 도입한 경우 모두에서 이소류신(Ile) 생산량은 변화가 없었다.
위의 결과를 토대로, L-쓰레오닌 생산에 있어 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 cycA 유전자 도입이 효과적임을 확인하였다.
상기의 KCCM12120P/cycA(Cam) 균주는 CA09-0902로 명명하였고, 이를 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제 기탁하여 KCCM12484P로 기탁번호를 부여받았다.
실시예 1-4: Glycine Cleavage System 해당 유전자가 도입된 L-쓰레오닌 생산균주 제작
실시예 1-4-1: 글리신 분해 단백질 도입을 위한 벡터 제작
앞서 쓰레오닌 생산능 증가에 글리신 트랜스포터의 활성이 영향을 미침을 확인하였으므로, 세포내로 유입된 글리신의 세포내 이용능을 더욱 증가시키는 경우의 쓰레오닌 생산능을 확인하고자 하였다. 구체적으로는 글리신 분해 시스템(Glycine Cleavage System,이하 GCV system)을 도입하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 내에는 GCV system을 구성하는 단백질 6종 중 L-단백질, LipB, LipA을를 코딩하는 유전자만 알려져 있을 뿐 나머지 3종 단백질을 코딩하는 유전자는 알려진 바 없다. 따라서 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 GCV system을 도입하기 위하여 gcvP(서열번호 27), gcvT(서열번호 28), gcvH(서열번호 29), lipA(서열번호 30), lipB(서열번호 31) 도입 벡터를 제작하였다. 다음의 실험을 진행하였다. Glycine Cleavage System(이하 gcv system) 해당 유전자들 중 gcvPT 유전자 단편을 획득하기 위해 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872 염색체를 주형으로 하여 서열번호 32 및 서열번호 33의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 5분을 28회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 프로모터를 포함한 4936bp의 gcvPT 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다 (서열번호 27, 28).
또 다른 gcv system 해당 유전자인 gcvH-lipBA 유전자 단편을 획득하기 위해 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872 염색체를 주형으로 하여 서열번호 34 및 서열번호 35의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 3분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 프로모터를 포함한 3321bp의 gcvH-lipBA 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다 (서열번호 29, 30, 31).
위에서 획득한 gcvPT 단편과 gcvH-lipBA 단편을 주형으로 하고, 서열번호 32 및 서열번호 35의 프라이머를 사용하여 융합(sewing) PCR을 실시하였다. PCR 반응은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 10분을 28회 반복한 후, 72℃에서 12분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 8257bp의 gcvPTH-lipBA 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 한편, 상기 실시예 1-2에서 제작한 pDZ-N2131 벡터를 제한효소 speI과 xhoI으로 처리한 후, 획득한 gcvPTH-lipBA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 Ncgl2131 위치로 gcv system 유전자를 삽입할 수 있는 벡터 pDZ-N2131/gcvPTH-lipBA를 제작하였다.
실시예 1-4-2: 글리신 분해 단백질 도입 균주 제작
상기 실시예 1-2에서 획득한 pDZ-N2131/cj7-cycA(Cam) 벡터를 주형으로 하여 서열번호 36 및 서열번호 37의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 90초를 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 1944bp의 cj7-cycA(Cam) 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 한편, 위에서 제작한 pDZ-N2131/gcvPTH-lipBA 벡터를 제한효소 xhoI으로 처리하고 65℃에서 20분간 열처리한 후, 획득한 cj7-cycA(Cam) 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 Ncgl2131 위치로 D-alanine/D-serine/glycine transporter 유전자와 gcv system 유전자를 삽입할 수 있는 벡터 pDZ-N2131/gcv-lip-cycA(Cam)을 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법으로 KCCM12120P 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 Ncgl2131 위치가 gcvPTH-lipBA-cycA(Cam) 형태로 치환되어 있는 균주를 얻었으며, 이를 KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam)으로 명명하였다.
실시예 1-4-3: 글리신 트랜스포터 및 글리신 분해 단백질 도입 균주의 쓰레오닌 생산능 평가
실시예 1-2 및 1-4-2에서 제작된 균주들의 L-쓰레오닌 생산능 테스트를 진행하였다. 위의 종배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 위에서 획득한 균주들을 각각 접종한 후, 30℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 상기의 L-쓰레오닌 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 48 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
배양 종료 후 HPLC를 이용하여 생산된 여러 아미노산의 생산량을 측정하였다. 그 결과는 하기 [표 2]와 같다.
균주 Amino acid (g/l)
Thr Gly Ser Lys Ile Ala Val
KCCM12120P 1.61 0.27 0.04 2.73 0.07 0.14 0.04
KCCM12120P-N2131 1.60 0.28 0.04 2.74 0.08 0.15 0.05
KCCM12120P/cycA(Cam) 1.81 0.22 0.03 2.34 0.07 0.00 0.03
KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam) 2.04 0.13 0.02 2.36 0.10 0.00 0.01
상기 [표 2]의 결과와 같이, D-alanine/D-serine/glycine transporter 유전자와 함께 gcv system 유전자가 함께 도입된 KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주는 모균주인 KCCM12120P 균주 대비 26.7% 향상된 L-쓰레오닌 생산량을 보였는데, 이는 cycA 유전자만 도입된 KCCM12120P/cycA(Cam) 균주 대비 12.7% 향상된 생산량이다. 이를 토대로 cycA 유전자를 단독 도입한 경우보다 gcv system 유전자와 함께 도입한 균주의 L-쓰레오닌 생산량이 더욱 증가하는 것을 확인하였다.
KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주의 L-라이신 생산량은 KCCM12120P 대비 13.6% 감소했으며 KCCM12120P/cycA(Cam) 균주는 KCCM12120P 대비 14.3% 감소하였다. L-이소류신 생산량은 KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주에서 KCCM12120P 대비 증가하는 양상을 보였으나, 이는 실시예 1-3의 결과를 고려했을 때, L-쓰레오닌 생산량 증가에 의해 생합성 경로상 부산물인 L-이소류신이 함께 증가한 것으로 볼 수 있다.
글리신 생산량은 KCCM12120P 균주로부터 cycA 유전자만 도입했을 때에는 18.5% 감소하였고, gcv system 유전자들이 함께 도입된 경우 KCCM12120P 균주 대비 51.9% 감소하였다. 알라닌은 cycA 유전자 도입만으로도 큰 폭으로 감소하였고, gcv system 도입에 따른 역효과는 없는 것을 확인하였다. 세린과 발린 생산량은 극소량이지만 KCCM12120P/cycA(Cam) 균주와 KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주 모두 모균주 KCCM12120P 대비 감소하는 것을 확인하였다.
상기의 KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주는 CA09-0905로 명명하였고, 이를 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제 기탁하여 KCCM12485P로 기탁번호를 부여받았다.
이상의 결과를 토대로 코리네박테리움 속 L-쓰레오닌 생산균주 기반으로 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 D-alanine/D-serine/glycine transporter 유전자인 cycA 유전자를 도입되었을 때, L-쓰레오닌 생산량이 증가하는 것을 확인하였다. 또한 cycA 유전자와 함께 gcv system 해당 유전자가 도입되었을 때, L-쓰레오닌 생산량은 더욱 큰 폭으로 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 2: cycA와 Glycine Cleavage System이 도입된 L-쓰레오닌 생산균주 KCCM11222P의 L-쓰레오닌 생산능 확인
실시예 1과 같이 CycA 및 gcv system을 기존 쓰레오닌 생산 균주에 도입한 효과를 확인하고자 실험을 수행하였다.
실시예 2-1: L-쓰레오닌 생산균주 KCCM11222P 균주에 CycA 도입
상기 실시예 1에서 사용된 형질전환 벡터 pDZ-N2131, pDZ-N2131/cj7-cycA(Cam)과 pDZ-N2131/cj7-cycA(Eco)를 각각 L-쓰레오닌 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11222P(대한민국 등록 특허 제 10-1335853호) 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 Ncgl2131 위치가 각각 결실, cj7-cycA(Cam) 또는 cj7-cycA(Eco) 형태로 치환되어 있는 균주를 얻었으며, 이를 각각 KCCM11222P-N2131, KCCM11222P/cycA(Cam) 또는 KCCM11222P/cycA(Eco)로 명명하였다.
제작된 균주들의 L-쓰레오닌 생산능 테스트를 진행하였다. 종배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 위에서 획득한 균주들을 각각 접종한 후, 30℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 L-쓰레오닌 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 32℃에서 48 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다
종배지 (pH 7.0)
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
L-쓰레오닌 생산배지 (pH 7.0)
포도당 100g, KH2PO4 2g, Urea 3g, (NH4)2SO4 25g, Peptone 2.5g, CSL(Sigma) 5g(10 ml), MgSO4.7H2O 0.5g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 3000 ㎍, CaCO3 30g (증류수 1 리터 기준)
배양 종료 후 HPLC를 이용하여 생산된 여러 아미노산의 생산량을 측정하였다. 그 결과는 하기 [표 3]과 같다.
균주 Amino acid (g/l)
Thr Gly Ser Lys Ile Ala Val
KCCM11222P 7.64 1.30 0.86 3.68 1.46 0.60 0.46
KCCM11222P-N2131 7.66 1.28 0.88 3.68 1.47 0.59 0.41
KCCM11222P/cycA(Cam) 8.80 1.02 0.85 3.13 1.42 0.01 0.42
KCCM11222P/cycA(Eco) 6.67 1.35 0.90 4.42 1.49 0.05 0.40
상기 [표 3]에서 보는 바와 같이, KCCM11222P/cycA(Cam) 균주는 모균주인 KCCM11222P 대비 15.2% 증가한 L-쓰레오닌 생산량을 보인 반면, L-라이신 생산량은 14.9% 감소하였다. 글리신과 알라닌은 KCCM11222P 대비 각각 21.5%, 98.3% 감소하는 결과를 보여 상기 실시예 1의 KCCM12120P 균주 기반에서의 평가 결과와 유사한 양상임을 확인하였다. 이소류신의 경우, KCCM11222P/cycA(Cam) 균주는 KCCM11222P 대비 3% 정도 감소하고, KCCM11222P/cycA(Eco) 균주는 KCCM11222P 대비 4% 정도 증가하여, 이소류신 생산량에 cycA 단백질 도입이 큰 영향을 주지 않는 것을 확인하였다. 특히 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 cycA 유전자가 도입된 균주의 경우는 이소류신 생산량이 감소함을 확인하였다.
한편, 대장균 유래 cycA 유전자가 도입된 KCCM11222P/cycA(Eco) 균주는 KCCM11222P 균주 대비 각각 12.7% 감소한 L-쓰레오닌 생산량과 20.1% 증가한 L-라이신 생산량을 나타내었다. 이로써 대장균 유래 cycA 유전자는 L-쓰레오닌 생산 증대에 효과가 없음을 확인하였다.
이를 통해, 쓰레오닌 생산능을 갖는 변이주에 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 cycA 단백질을 도입하면 쓰레오닌 생산능을 증대시킬 수 있음을 알 수 있다.
실시예 2-2: L-쓰레오닌 생산균주 KCCM11222P 균주에 CycA 및 gcv system 도입
실시예 1에서와 동일하게 cycA(Cam) 유전자와 gcv system 유전자의 조합 효과를 확인하기 위해 제작된 벡터 pDZ-N2131/gcv-lip-cycA(Cam)를 전기천공법으로 KCCM11222P 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 Ncgl2131 위치가 gcvPTH-lipBA-cycA(Cam) 형태로 치환되어 있는 균주를 얻었으며, 이를 KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam)으로 명명하였다.
제작된 균주들의 L-쓰레오닌 생산능 테스트를 진행하였다. 위의 종배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 위에서 획득한 균주들을 각각 접종한 후, 30℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 상기의 L-쓰레오닌 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 32℃에서 48 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
배양 종료 후 HPLC를 이용하여 생산된 여러 아미노산의 생산량을 측정하였다. 그 결과는 하기 [표 4]와 같다.
균주 Amino acid (g/l)
Thr Gly Ser Lys Ile Ala Val
KCCM11222P 7.63 1.32 0.87 3.70 1.45 0.60 0.45
KCCM11222P-N2131 7.64 1.29 0.88 3.68 1.45 0.58 0.40
KCCM11222P/cycA(Cam) 8.81 1.04 0.85 3.11 1.42 0.01 0.41
KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam) 10.31 0.57 0.49 3.17 1.50 0.00 0.31
상기 [표 4]의 결과와 같이, KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주는 모균주인 KCCM11222P 대비 35.1% 증가한 L-쓰레오닌 생산량을 보였는데, 이는 cycA 유전자만 도입된 KCCM11222P/cycA(Cam) 균주보다 17.0% 증가한 L-쓰레오닌 생산량이다. 이를 토대로 상기 실시예 1에서와 마찬가지로 재조합 L-쓰레오닌 생산균주 KCCM11222P 기반에서도 cycA 유전자를 단독 도입한 경우보다 gcv system 유전자와 함께 도입한 균주의 L-쓰레오닌 생산량이 더욱 증가하는 것을 확인하였다.
KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주의 L-라이신 생산량은 KCCM11222P 대비 14.3% 감소한 반면 KCCM11222P/cycA(Cam) 균주는 KCCM11222P 대비 15.9% 감소하였다. L-이소류신 생산량은 KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주에서 KCCM11222P 대비 3.4% 증가하는 양상을 보였으나, 이는 실시예 2-1의 결과를 고려했을 때, L-쓰레오닌 생산 증가에 따른 부수적인 효과로 해석할 수 있다.
글리신 생산량은 KCCM11222P 균주로부터 cycA 유전자만 도입했을 때에는 21.2% 감소하였고, gcv system 유전자들이 함께 도입된 경우 KCCM11222P 균주 대비 56.8% 감소하였다. 알라닌은 cycA 유전자 도입만으로도 큰 폭으로 감소하였고, gcv system 도입으로 더욱 감소하여 KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주에서 측정되지 않았다. KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주의 세린과 발린 생산량은 모균주 KCCM11222P 대비 각각 43.7%, 31.1% 감소하는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12484P 20190410 한국미생물보존센터(국외) KCCM12485P 20190410
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Microorganisms with enhanced ability to produce L-threonine and methods for producing L-threonine using the same <130> KPA181625-KR <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 421 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C.gl lysC variant <400> 1 Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 195 200 205 Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220 Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255 Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265 270 Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280 285 Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300 Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 310 315 320 Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 340 345 350 Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365 Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Lys Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380 Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400 Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 405 410 415 Ala Gly Thr Gly Arg 420 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcgagctcgg tacccgctgc gcagtgttga atac 34 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tggaaatctt ttcgatgttc acgttgacat 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 atgtcaacgt gaacatcgaa aagatttcca 30 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ctctagagga tccccgttca cctcagagac gatt 34 <210> 6 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C.gl Hom variant <400> 6 Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly 1 5 10 15 Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu 20 25 30 Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile 35 40 45 Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala 65 70 75 80 Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly 85 90 95 Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys 100 105 110 Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu 115 120 125 Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala 130 135 140 Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu 145 150 155 160 Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr 165 170 175 Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp 180 185 190 Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr 195 200 205 Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala 210 215 220 Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu 225 230 235 240 Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala 245 250 255 Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys 260 265 270 Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro 275 280 285 Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe 290 295 300 Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala 305 310 315 320 Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala 325 330 335 Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr 340 345 350 Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His 355 360 365 Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala 370 375 380 Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Gln Gln Glu 385 390 395 400 Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu 405 410 415 Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val 420 425 430 Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp 435 440 445 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tcgagctcgg taccccaccg gcgctgacta tgc 33 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cgcgctcttc ctgttggatt gtacgcaggg 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ccctgcgtac aatccaacag gaagagcgcg 30 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ctctagagga tcccgataga cagatttgtc cacg 34 <210> 11 <211> 1611 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 11 atgcaccacg agcaacccga agggtgcgaa gtgggcattc gtagaacaat cccagaggaa 60 agccgtacgg ctttcctcga catgatcaat caaggtatgt caggtcttgc tgcgtctaca 120 gcggtcgggg tcagtgaatt caccgggcga aagtgggcga aggccgccgg ggtgaaactg 180 acccgcggcc cgcgaggtgg caatgctttt gacaccgccg agaaacttga gattgcagcc 240 agcatgctag agaaaggatg cctaccccga gaaatcggcg agtatgtcgg catgactcgg 300 gccaatatat ccctatggcg caaacaaggc ccagacaagc ttcgccaacg cgcagccacc 360 ttgcgcaccg gcaagcgagc agctgaattc atccacgccc cggtgatggg cccttattat 420 gggccacgca cactccatca agtgttgcgt gaggactaca caacactgtt tgacgagtta 480 tctgcgttgg ggttgccagc acaggtgtgt ggggccttac ttcatcttgc tccaccacca 540 tcattacgct tttcttatat gtcgtgtgta gtgccgttat ttgctgatga aatcaaagtc 600 gtaggacaag gcacacgatt atcgttagaa gagaaaatga tgatccaacg tttccatgac 660 accggggtca gtgcagcaga aatcggtcga cgcctgggtc ggtgtcggca aacaatttcc 720 agggaacttc gacgtggtca agatgatgat ggacgttatc gtgcacgcga ctcctatgaa 780 ggtgcgatca ggaaactagc gcgtccgaaa acaccgaaac ttgatgccaa tcgtaggctt 840 cgggctgtgg tggtcgaggc gttgaataat aaattatctc cggagcagat ttctggtctt 900 ttagccaccg agcatgctaa cgatagctct atgcagatta gtcatgaaac tatttaccag 960 gcgttatatg ttcaaggtaa aggggcgttg cgtgatgaat tgaaggtgga gaaatttctt 1020 cgtaccggtc ggaagggacg taaaccgcag tcgaagttgc catcgagagg taagccgtgg 1080 gtggagggtg cgttgattag tcaacgccca gcagaagttg ctgatcgtgc tgtgcctggg 1140 cactgggagg gcgatttagt aattggtggt gaaaaccaag cgacagcgtt ggtgacgttg 1200 gtggagcgca cgagccggtt gacgttgatt aagcggttgg gggttaatca tgaggcgtcg 1260 actgtgacgg atgcgttggt ggagatgatg ggtgatttgc cgcaggcgtt gcgtcggagt 1320 ttgacgtggg atcagggtgt ggagatggca gagcatgcgc ggtttagcgt ggtgaccaag 1380 tgtccggtgt ttttctgtga tcctcattcg ccgtggcagc gtgggtcgaa tgagaatacg 1440 aatggattgg tcagggattt tttcccgaag ggcactaatt ttgctaaagt aagtgacgaa 1500 gaagttcagc gggcacagga tctgctgaat taccggccgc ggaaaatgca tggttttaaa 1560 agcgcgacgc aggtatatga aaaaatcgta gttggtgcat ccaccgattg a 1611 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tcgagctcgg taccctctgg tggtagttcg tag 33 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ctcgagcata ctagtatccc cgcaaagatc ggc 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 actagtatgc tcgagtacac gatctggacc aac 33 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ctctagagga tccctcaagc tgcctcgcaa cta 33 <210> 16 <211> 476 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 16 Met Ala Ser Tyr Asp Pro Gly His Ser Gln Val Lys Asn Thr Gly Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Ser His Val Glu Ser Asp His Leu Gln Arg Gly Leu Ser 20 25 30 Asn Arg His Ile Gln Leu Ile Ala Ile Gly Gly Ala Ile Gly Thr Gly 35 40 45 Leu Phe Met Gly Ser Gly Lys Thr Ile Ser Leu Ala Gly Pro Ser Val 50 55 60 Ile Leu Val Tyr Gly Ile Ile Gly Phe Met Leu Phe Phe Val Met Arg 65 70 75 80 Ala Met Gly Glu Leu Leu Leu Ser Asn Leu Asn Tyr Lys Ser Leu Arg 85 90 95 Asp Ala Val Ser Asp Ile Leu Gly Pro Thr Ala Gly Phe Val Cys Gly 100 105 110 Trp Thr Tyr Trp Phe Cys Trp Ile Val Thr Gly Met Ala Asp Val Val 115 120 125 Ala Ile Thr Gly Tyr Thr Gln Tyr Trp Trp Pro Asp Ile Ala Leu Trp 130 135 140 Ile Pro Gly Ala Leu Thr Ile Leu Leu Leu Leu Gly Leu Asn Leu Val 145 150 155 160 Ala Val Arg Leu Phe Gly Glu Leu Glu Phe Trp Phe Ala Ile Ile Lys 165 170 175 Leu Val Ala Ile Thr Ala Leu Ile Leu Val Gly Ala Val Met Val Ile 180 185 190 Ser Arg Phe Gln Ser Pro Asp Gly Asp Ile Ala Ala Val Ser Asn Leu 195 200 205 Ile Asp His Gly Gly Phe Phe Pro Asn Gly Ile Thr Gly Phe Leu Ala 210 215 220 Gly Phe Gln Ile Ala Ile Phe Ala Phe Val Gly Val Glu Leu Ala Gly 225 230 235 240 Thr Ala Ala Ala Glu Thr Lys Asp Pro Glu Lys Asn Leu Pro Arg Ala 245 250 255 Ile Asn Ser Ile Pro Ile Arg Ile Val Val Phe Tyr Ile Leu Ala Leu 260 265 270 Ala Val Ile Met Met Val Thr Pro Trp Asp Lys Val His Ser Asp Ser 275 280 285 Ser Pro Phe Val Gln Met Phe Ala Leu Ala Gly Leu Pro Ala Ala Ala 290 295 300 Gly Ile Ile Asn Phe Val Val Leu Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ala Asn 305 310 315 320 Ser Gly Ile Phe Ser Thr Ser Arg Met Leu Phe Gly Leu Ala Arg Glu 325 330 335 Gly Gln Ala Pro Lys Arg Trp Gly Ile Leu Ser Arg Asn Gln Val Pro 340 345 350 Ala Arg Gly Leu Leu Phe Ser Val Ala Cys Leu Val Pro Ser Leu Ala 355 360 365 Ile Leu Tyr Ala Gly Ala Ser Val Ile Asp Ala Phe Thr Leu Ile Thr 370 375 380 Thr Val Ser Ser Val Leu Phe Met Val Val Trp Ser Leu Ile Leu Ala 385 390 395 400 Ala Tyr Leu Val Phe Arg Arg Lys Phe Pro Glu Arg His Ala Ala Ser 405 410 415 Lys Phe Lys Val Pro Gly Gly Ala Phe Met Cys Trp Val Val Leu Ala 420 425 430 Phe Phe Ala Phe Met Val Val Val Leu Thr Phe Glu Asn Asp Thr Arg 435 440 445 Ser Ala Leu Met Val Thr Pro Ile Trp Phe Val Ile Leu Leu Ala Gly 450 455 460 Trp Phe Ile Ser Gly Gly Val Lys Arg Ala Arg Lys 465 470 475 <210> 17 <211> 1431 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 17 atggcatctt atgatcccgg gcattcacag gttaaaaata caggagtaga actcgactct 60 cacgtggagt cagaccatct ccaacgcggt cttagcaacc gacatatcca gttgattgcc 120 attggcggtg ctatcggcac cggactattt atgggatcgg gcaaaaccat ctcccttgct 180 ggtccttccg taatcttggt gtatggcatc atcggtttta tgctcttctt cgtcatgcgg 240 gcgatgggtg agcttttgct ctcgaacctc aactacaagt cattgcgtga tgccgtctcg 300 gacatcctcg ggcctaccgc tggtttcgta tgcggctgga cctactggtt ctgctggatt 360 gtcacaggca tggctgatgt cgtggctatt accggctaca cccaatactg gtggccagat 420 atcgcgctgt ggatacctgg agcattgacg attttattac tgctcgggtt aaatctcgtg 480 gcagtccgcc tctttggtga gttggaattt tggttcgcaa tcatcaagct ggtggctatt 540 actgcgctca tcctcgtcgg cgcggtgatg gttatttcgc gcttccaatc cccagacggc 600 gacattgcgg ctgtttccaa cctgatcgac catggcggct tcttcccgaa cggaatcacg 660 ggcttcctcg ccggattcca gattgctatc ttcgccttcg tcggcgtgga gcttgccggt 720 accgcggctg cagaaaccaa agacccagaa aagaatcttc ctcgcgcgat taactcgatt 780 cctattcgta tcgtcgtgtt ctacatcctg gctcttgcgg tcatcatgat ggttacccca 840 tgggacaagg tccacagtga ctccagccca tttgtgcaga tgtttgccct ggctggactg 900 ccggcggcag caggcattat taacttcgtg gtgctgacat ctgctgcttc atccgcgaac 960 agtggtattt tctccacatc acgcatgctg ttcggtctgg ctcgcgaagg ccaagcgccc 1020 aagcgttggg gcatcttgtc ccgtaaccaa gtcccagccc gcggcctgct gttctcagta 1080 gcgtgcctgg tcccgagcct ggcaatcttg tacgccggcg ccagcgtcat tgacgccttt 1140 acgttgatta ccaccgtgtc ttctgtgctg ttcatggtgg tatggagcct gatcctcgcg 1200 gcgtaccttg tcttccgccg caagttccca gaacgccatg cagcatccaa gttcaaggtc 1260 ccaggcgggg cgtttatgtg ctgggttgtt ctcgctttct tcgcgtttat ggtcgttgta 1320 ctgacctttg aaaatgacac tcggtccgct ttgatggtca ccccaatctg gttcgtgatc 1380 ctcttggccg gctggttcat ctccggcgga gtcaagcgcg ctaggaagtg a 1431 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 cgaaaggaaa cactcatggc atcttatgat ccc 33 <210> 19 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gggttgggtt ttcccgatct cgagcgattg cgtggcctcc aac 43 <210> 20 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cj7 <400> 20 agaaacatcc cagcgctact aatagggagc gttgaccttc cttccacgga ccggtaatcg 60 gagtgcctaa aaccgcatgc ggcttaggct ccaagatagg ttctgcgcgg ccgggtaatg 120 catcttcttt agcaacaagt tgaggggtag gtgcaaataa gaacgacata gaaatcgtct 180 cctttctgtt tttaatcaac atacaccacc acctaaaaat tccccgacca gcaagttcac 240 agtattcggg cacaatatcg ttgccaaaat attgtttcgg aatatcatgg gatacgtacc 300 caacgaaagg aaacactc 318 <210> 21 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gccgatcttt gcggggatac tagtatgctc gagagaaaca tcccagcgct a 51 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gagtgtttcc tttcgttg 18 <210> 23 <211> 470 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 23 Met Val Asp Gln Val Lys Val Val Ala Asp Asp Gln Ala Pro Ala Glu 1 5 10 15 Gln Ser Leu Arg Arg Asn Leu Thr Asn Arg His Ile Gln Leu Ile Ala 20 25 30 Ile Gly Gly Ala Ile Gly Thr Gly Leu Phe Met Gly Ser Gly Lys Thr 35 40 45 Ile Ser Leu Ala Gly Pro Ser Ile Ile Phe Val Tyr Met Ile Ile Gly 50 55 60 Phe Met Leu Phe Phe Val Met Arg Ala Met Gly Glu Leu Leu Leu Ser 65 70 75 80 Asn Leu Glu Tyr Lys Ser Phe Ser Asp Phe Ala Ser Asp Leu Leu Gly 85 90 95 Pro Trp Ala Gly Tyr Phe Thr Gly Trp Thr Tyr Trp Phe Cys Trp Val 100 105 110 Val Thr Gly Met Ala Asp Val Val Ala Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Phe 115 120 125 Trp Phe Pro Asp Leu Ser Asp Trp Val Ala Ser Leu Ala Val Ile Val 130 135 140 Leu Leu Leu Thr Leu Asn Leu Ala Thr Val Lys Met Phe Gly Glu Met 145 150 155 160 Glu Phe Trp Phe Ala Met Ile Lys Ile Val Ala Ile Val Ser Leu Ile 165 170 175 Val Val Gly Leu Val Met Val Ala Met His Phe Gln Ser Pro Thr Gly 180 185 190 Val Glu Ala Ser Phe Ala His Leu Trp Asn Asp Gly Gly Trp Phe Pro 195 200 205 Lys Gly Leu Ser Gly Phe Phe Ala Gly Phe Gln Ile Ala Val Phe Ala 210 215 220 Phe Val Gly Ile Glu Leu Val Gly Thr Thr Ala Ala Glu Thr Lys Asp 225 230 235 240 Pro Glu Lys Ser Leu Pro Arg Ala Ile Asn Ser Ile Pro Ile Arg Ile 245 250 255 Ile Met Phe Tyr Val Phe Ala Leu Ile Val Ile Met Ser Val Thr Pro 260 265 270 Trp Ser Ser Val Val Pro Glu Lys Ser Pro Phe Val Glu Leu Phe Val 275 280 285 Leu Val Gly Leu Pro Ala Ala Ala Ser Val Ile Asn Phe Val Val Leu 290 295 300 Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ala Asn Ser Gly Val Phe Ser Thr Ser Arg 305 310 315 320 Met Leu Phe Gly Leu Ala Gln Glu Gly Val Ala Pro Lys Ala Phe Ala 325 330 335 Lys Leu Ser Lys Arg Ala Val Pro Ala Lys Gly Leu Thr Phe Ser Cys 340 345 350 Ile Cys Leu Leu Gly Gly Val Val Met Leu Tyr Val Asn Pro Ser Val 355 360 365 Ile Gly Ala Phe Thr Met Ile Thr Thr Val Ser Ala Ile Leu Phe Met 370 375 380 Phe Val Trp Thr Ile Ile Leu Cys Ser Tyr Leu Val Tyr Arg Lys Gln 385 390 395 400 Arg Pro His Leu His Glu Lys Ser Ile Tyr Lys Met Pro Leu Gly 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actggtgtgg aagcgtcatt cgcgcatttg 600 tggaatgacg gcggctggtt cccgaaaggt ttaagtggct tctttgccgg attccagata 660 gcggttttcg ctttcgtggg gattgagctg gtaggtacaa cagctgcgga aaccaaagat 720 ccagagaaat cactgccacg cgcgattaac tccattccga tccgtatcat tatgttctac 780 gtcttcgcgc tgattgtgat tatgtccgtg acgccgtgga gttcggtagt cccggagaaa 840 agcccgtttg ttgaactgtt cgtgttggta gggctgcctg ctgccgcaag cgtgatcaac 900 tttgtggtgc tgacctctgc ggcgtcttcc gctaacagcg gcgtcttctc taccagccgt 960 atgctgtttg gtctggcgca ggaaggtgtg gcaccgaaag cgttcgctaa actttctaag 1020 cgcgcagtac ccgcgaaagg gctgacgttc tcgtgtatct gtctgctcgg cggcgtggtg 1080 atgttgtatg tgaatcctag tgtgattggc gcgttcacga tgattacaac cgtttccgcg 1140 attctgttta tgttcgtctg gacgattatc ctttgctcgt accttgtgta tcgcaaacag 1200 cgtcctcatc tacatgagaa gtcgatctac aagatgccgc tcggcaagct gatgtgctgg 1260 gtatgtatgg cgttctttgt gttcgtggtc gtgttgctga cactggaaga tgacactcgc 1320 caggcgctgc tggttacccc gctgtggttt atcgcgctgg ggttgggctg gctgtttatt 1380 ggtaagaagc gggctgctga actgcggaaa taa 1413 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agcaacggcg tggttggcga agacctcgtc 600 ggcgcagtag ttgcctacac cggtacggag ggcgatattt ttgacccacg tgctgttatc 660 gaagaaatcc atggccgcgg cggacttgtt tccgtcgcgg ctgacttgtt gtccttgctg 720 cttctggaag gcccaggctc gttcggtgca gacattgtca ttggttcctc ccaacgcttt 780 ggtgtgccgc tcttctttgg tggcccacac gctgctttca tggcagtaac tgacaagcta 840 aagcgtcaga tgccaggccg tttggtcggc gtatcggtcg attctgaggg ccgtcctgct 900 taccgcttgg cgctgcagac tcgtgaacag cacatccgcc gtgaacgcgc gacgtcaaat 960 atttgtaccg cgcaggcact tctggccaac gtggctgcca tgtacgccgt ctaccacggt 1020 ccagaaggct tgaaggagat tgctaaccac gtgcactcct tggctgcttc ctttgccggt 1080 gcagttacta ctcagggtct gaagattact tcctcggagt tcttcgacac cgttaccgtt 1140 gccggcgttg atgccgcatc cattaagttc agcttggaaa aggccggata cctggtgcgc 1200 accattggcg aggataaggt ttctgtctcc ttcggtgagt ccgcaaccca aggcgatgtt 1260 actgtcttgg cggacgcctt tggtgccgct gcagtagata atgcagattt cccactgcct 1320 gaagcactca cccgcaccac cgaggtgctc acccacgaaa tctttaactc cattcactcc 1380 gaaacccaga tgatgcgtta cctgcgcaag ctcggtgata aggatctggc tctagatcgc 1440 accatgattc ctttgggctc atgcaccatg aagctcaacc caaccgcagc catggaaccg 1500 atcacctggc cagaattcgc caatgttcac ccttactccc ctgaatacgc aacccagggc 1560 tggcgtgagc tcattgaaga gttggaaggc tggttggctg agctgaccgg ctacgccaag 1620 gtttctatcc aaccaaacgc tggttcccag ggcgagctag ctggtctttt ggctatccgc 1680 cgctaccacg tcgcaaatgg tgacaccaac cgcgatatcg tgttgattcc tgcgtccgcg 1740 cacggcacca acgctgcctc cgcgaccctg gcaaatctgc gcgttgttgt ggttaagacc 1800 gccgaagacg gctccatcga tctggaagat ctcgatgcga agatcgccaa gcatggtcag 1860 aacatggccg gaatcatgat cacctaccca tccactcacg gcgtctttga cccagaggtt 1920 cgtgaagtct gcgacaagat ccatgccgct ggcggccagg tctacattga tggcgcaaac 1980 atgaatgctt tgactggttg ggctcagccg ggcaagttcg gtggcgatgt ctcgcacttg 2040 aacctgcaca agactttcac cattccgcac ggcggtggcg gcccaggtgt tggaccaatt 2100 ggtgtcgctg agcacctcat tccattcctg ccaacggatg ctgcagctga tgagctggat 2160 cctgctaacc caaccccagt agaacagggc gttccaatta ctgcttcgca gtttggttcc 2220 gctggtgttc tgccgattac ctgggcatac atcgcaatga ccggtggcga gggtctaacc 2280 tccgctactg cacacgccat cttgggtgct aactaccttg cgcgcgaact ctccgattcc 2340 ttcccaattc tgttcaccgg taatgaaggt cttgttgcgc acgagtgcat tttggatctg 2400 cgcgcgctaa ccgatgcctc aggcgttact gcagcagacg ttgccaagcg tttgatcgac 2460 tttggcttcc acgctcctac cctcgcattc ccagtggctg gcaccttgat ggtggaacct 2520 actgagtctg aggatattgc tgaactggat cgtttcattg aagcaatgcg caccatccgt 2580 gcggagattc aggaaatcat cgatggcaag atcgcatatg aagattcggt catccgccac 2640 gcaccttaca ccgcaccgtc agtctcaagc gatgattggg agtactcctt tagccgtgaa 2700 aaggccgcat ggccagttcc ttcactgcgt ttgaacaagt acttcccacc ggtacgccgc 2760 ctggatgaag cttacggcga ccgcaacctg gtgtgctcct gcccaccgcc agaggcattc 2820 gacttcgatg ccgacaccga ttccaccgag gaggcttaa 2859 <210> 28 <211> 1104 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 28 atgtcagaac tacgccagtc cccactgcac gcagagcacg aaaagctcgg cgcatccttt 60 accgcttttg gcccttggaa tatgccacta aagtacggca aggagctcga tgagcaccac 120 gcagtgcgta atgcagtcgg catgtttgac ctctcgcaca tgggtgagat ttgggtcaac 180 ggcccagacg ccgctgcatt tttgtcctat gcgctgatct ccaacatgga gaccgtgaaa 240 aatggcaagg cgaagtactc catgattgtt gctgaagacg gcggcatcat cgatgaccta 300 atttcctacc gtttctccga taccaagttc ttggtagtgc caaacgctgg caacactgat 360 gtggtttggg aagcttttaa tcagcgcatt gaaggcttcg atgtagaact caacaatgag 420 tccttggatg ttgcgatgat tgccctgcag ggccccaatg ctgccaaggt tctagttgaa 480 caggttgctg aagagtccaa ggaagaagta gaaaaccttc cttactatgc cgcaaccatg 540 gccaaagtcg cagacgttga caccatcgtc gcgcgcaccg gctacaccgg cgaagacggc 600 ttcgagctga tgatctacaa cgccgatgcg accaagctct ggcagctttt catcgaccaa 660 gatggtgtta ctccatgcgg tttagcttca cgcgattcct tgcgcttgga agctggcatg 720 cctttgtacg gcaatgagct ttcccgcgat atcacccctg tcgaggcagg catgggtgtg 780 gcgtttaaga agaagaccgc tgacttcgtc ggcgccgagg tcctgcgtca acgcttggaa 840 gaaggcccta agcaagttat caaggctttg acctcctctg agcgccgtgc agcgcgcacc 900 ggtgctgaaa tctatgccgg cgagcagttg gtaggcaccg taacttcggg tcagccatcg 960 ccgacgctgg gacaccctat tgccctggca ctggtagata ctgcagcaaa cctcgaagaa 1020 ggcgcagaag tagaagtgga tattcgcggc aagcgttacc ccttcaccgt taccaagacg 1080 cctttctata gccgcgagaa gtaa 1104 <210> 29 <211> 390 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 29 atggctaacc tacctgcaga atttacttac tccgaagacc acgagtggat taacgccgct 60 caggacgcaa tcgttggcaa aactgttcgc atcggcatca cttctgttgc cgcagaccgt 120 cttggtgagg ttgtcttcgc tgagcttcca gcagttggcg atagcgtcac tgcaggtgaa 180 acctgtggtg aggttgaatc caccaagtcc gtttctgacc tgtacagccc tgtcaccggt 240 accgtgaccg ctgtgaacga gacagtgcac gatgattatg aaatcatcaa caatgatcct 300 ttcggtgaag gttggctgtt tgaggtcgag gttgaagaac tcggcgaggt tatgaccgct 360 gatgaatacg cggcagaaaa cggcatctaa 390 <210> 30 <211> 1062 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 30 atgctccgca ttgaaaagaa gaatgcggag tcacccattg agcagaagcc gaggtggatc 60 cgcaaccagg tccgcactgg ccctggttat gaggacatga aaaagcgtgt tgctggcgct 120 ggcctgcaca ctgtctgcca ggaggcaggc tgtcctaata tccacgaatg ctgggagtcc 180 cgagaagcca ccttccttat cggcggtgac cgttgtactc gccgttgtga cttctgcgat 240 attgccactg gtaagccgca ggcattggac accgatgagc cgcgtcgcgt ttcggaaaac 300 atccaagaga tgaatctgaa ctacgccacg atcactggtg ttacccgtga tgaccttcca 360 gatgagggcg catggctata tgctgaagtg gttcgtaaga tccacgagaa gaaccctcac 420 acgggtgtag aaaacctcac cccggacttc tccggcaagc cagacctgct gcaggaagtc 480 ttcgaggctc gccctgaggt tttcgctcac aacttggaaa ccgttcctcg tattttcaag 540 cgtatccgcc cggcattccg ttatgagcgt tctctggatg ttttgcagca ggcacacgac 600 ttcggcctga tcaccaagtc gaacttgatc ttgggcatgg gtgaaactga ggaagagatt 660 caggaagctc tacgcgatat gcgctctgtg ggcactgaca tcattaccat tacgcagtac 720 ctgcgtcctg gtcctcgttt ccacccaatt gagcgttggg ttcgccctga ggagttcatt 780 gcgcactccg agtacgccaa ggaattgggc tttaccgtta tgtctggtcc tttggttcgt 840 tcttcttacc gcgcgggcaa gctctacacc caggcgatga aggcacgtgg ctgggagctg 900 ccagaaaatc tcaagcacct ggaagaaact tctgatggcg caaccgctca ggaagcttcg 960 tcgctgttga agaagtacgg cccttccgag gaaacgccag ttacttcccg catggcaaag 1020 acgcctgtgg gtgcagataa atttactgct agcatccgct aa 1062 <210> 31 <211> 822 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 31 atgactgctc cgcgtgaccc gtttttcccc gctgatcgtt ctattcgcgc ttctactgcc 60 ccggtagagg tgagacgttt aggtcgtatg gattatcaag aagcctggga ctatcaagca 120 gaagtcgcag cgcagcgcgc acgtgacgaa gttgcagaca cgttgctggt cgttgagcac 180 cccgctgtgt atacggcggg caagcgcacg cagcccgaag atatgcccac caacggtctt 240 ccggttatca atgttgatcg tggcggccgg attacctggc acggcgaggg ccagttggtg 300 gtctacccga ttatcaagtt ggcagagcct gtcgatgtcg tcgattatgt ccgccgtctg 360 gaagaagctg ttattcatac cgttcgggaa atgggggtaa caactgctgg gcgtatcgat 420 ggtcgctcag gcgtgtgggt gccatcgact accgctgcga aagacccggc agcatcgcac 480 cgagaccgca agattgcggc cttaggcatc cgcattacgc gtggggttac catgcatggt 540 ctggcgctca attgcgacaa tatcttggac tactacgagc acattattgc ctgcggtatt 600 gatgatgccg atatcaccac cctggcgcta gagctgggcc gcgacgtcac cgtagatgat 660 gcggttgagc ccttgctcat tgcgcttgac gatgccttgg ccggccgcat ggtcgtcgcc 720 gaccacactt tcgcatctgc cccagacccc atcaaattag ctaatgagaa agcgcgccaa 780 gcacgcgcgc agtcttcctt gactgatcat gcaggctctt aa 822 <210> 32 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gccgatcttt gcggggatac tagtcaggat gcaattgcca tcc 43 <210> 33 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 atgcgccatt agcgtggttg caccggttgc tacc 34 <210> 34 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 tagcaaccgg tgcaaccacg ctaatggcgc attg 34 <210> 35 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gggttgggtt ttcccgatct cgagcagcaa gcccatgccc aag 43 <210> 36 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 tgggcatggg cttgctgctc gagagaaaca tcccagcgct a 41 <210> 37 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gggttgggtt ttcccgatct cgagcgattg cgtggcctcc aac 43 <210> 38 <211> 952 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 38 Met Asp Phe Ile Ala Arg His Leu Gly Pro Asp Ala Thr Glu Ser Lys 1 5 10 15 Asp Met Leu Ala Arg Val Gly Tyr Asp Ser Val Glu Ala Leu Val Thr 20 25 30 Ser Ala Ile Pro Gln Ser Ile Ser Ile Thr Asp Ala Leu Asn Met Pro 35 40 45 Gln Ala Leu Ser Glu Thr Asp Ala Gln Ala Lys Leu Arg Ala Tyr Ala 50 55 60 Asp Lys Asn Val Val Leu Lys Ser Phe Tyr Gly Gln Gly Tyr Ser Asp 65 70 75 80 Thr Ile Thr Pro Ala Val Ile Arg Arg Gly Leu Val Glu Asp Ala Gly 85 90 95 Trp Tyr Thr Ala Tyr Thr Pro Tyr Gln Pro Glu Ile Ser Gln Gly Arg 100 105 110 Leu Glu Ser Leu Leu Asn Phe Gln Thr Met Val Gln Asp Leu Thr Gly 115 120 125 Leu Pro Ile Ala Asn Ala Ser Leu Leu Asp Glu Ala Ser Ala Val Ala 130 135 140 Glu Ala Val Gly Leu Met Ser Arg Ala Val Lys Lys Gly Arg Arg Val 145 150 155 160 Leu Leu Asp Ala Arg Leu His Pro Gln Val Leu Thr Val Ala Ala Glu 165 170 175 Arg Ala Arg Ala Ile Asp Leu Glu Val Glu Ile Ala Asp Leu Ser Asn 180 185 190 Gly Val Val Gly Glu Asp Leu Val Gly Ala Val Val Ala Tyr Thr Gly 195 200 205 Thr Glu Gly Asp Ile Phe Asp Pro Arg Ala Val Ile Glu Glu Ile His 210 215 220 Gly Arg Gly Gly Leu Val Ser Val Ala Ala Asp Leu Leu Ser Leu Leu 225 230 235 240 Leu Leu Glu Gly Pro Gly Ser Phe Gly Ala Asp Ile Val Ile Gly Ser 245 250 255 Ser Gln Arg Phe Gly Val Pro Leu Phe Phe Gly Gly Pro His Ala Ala 260 265 270 Phe Met Ala Val Thr Asp Lys Leu Lys Arg Gln Met Pro Gly Arg Leu 275 280 285 Val Gly Val Ser Val Asp Ser Glu Gly Arg Pro Ala Tyr Arg Leu Ala 290 295 300 Leu Gln Thr Arg Glu Gln His Ile Arg Arg Glu Arg Ala Thr Ser Asn 305 310 315 320 Ile Cys Thr Ala Gln Ala Leu Leu Ala Asn Val Ala Ala Met Tyr Ala 325 330 335 Val Tyr His Gly Pro Glu Gly Leu Lys Glu Ile Ala Asn His Val His 340 345 350 Ser Leu Ala Ala Ser Phe Ala Gly Ala Val Thr Thr Gln Gly Leu Lys 355 360 365 Ile Thr Ser Ser Glu Phe Phe Asp Thr Val Thr Val Ala Gly Val Asp 370 375 380 Ala Ala Ser Ile Lys Phe Ser Leu Glu Lys Ala Gly Tyr Leu Val Arg 385 390 395 400 Thr Ile Gly Glu Asp Lys Val Ser Val Ser Phe Gly Glu Ser Ala Thr 405 410 415 Gln Gly Asp Val Thr Val Leu Ala Asp Ala Phe Gly Ala Ala Ala Val 420 425 430 Asp Asn Ala Asp Phe Pro Leu Pro Glu Ala Leu Thr Arg Thr Thr Glu 435 440 445 Val Leu Thr His Glu Ile Phe Asn Ser Ile His Ser Glu Thr Gln Met 450 455 460 Met Arg Tyr Leu Arg Lys Leu Gly Asp Lys Asp Leu Ala Leu Asp Arg 465 470 475 480 Thr Met Ile Pro Leu Gly Ser Cys Thr Met Lys Leu Asn Pro Thr Ala 485 490 495 Ala Met Glu Pro Ile Thr Trp Pro Glu Phe Ala Asn Val His Pro Tyr 500 505 510 Ser Pro Glu Tyr Ala Thr Gln Gly Trp Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu 515 520 525 Glu Gly Trp Leu Ala Glu Leu Thr Gly Tyr Ala Lys Val Ser Ile Gln 530 535 540 Pro Asn Ala Gly Ser Gln Gly Glu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ile Arg 545 550 555 560 Arg Tyr His Val Ala Asn Gly Asp Thr Asn Arg Asp Ile Val Leu Ile 565 570 575 Pro Ala Ser Ala His Gly Thr Asn Ala Ala Ser Ala Thr Leu Ala Asn 580 585 590 Leu Arg Val Val Val Val Lys Thr Ala Glu Asp Gly Ser Ile Asp Leu 595 600 605 Glu Asp Leu Asp Ala Lys Ile Ala Lys His Gly Gln Asn Met Ala Gly 610 615 620 Ile Met Ile Thr Tyr Pro Ser Thr His Gly Val Phe Asp Pro Glu Val 625 630 635 640 Arg Glu Val Cys Asp Lys Ile His Ala Ala Gly Gly Gln Val Tyr Ile 645 650 655 Asp Gly Ala Asn Met Asn Ala Leu Thr Gly Trp Ala Gln Pro Gly Lys 660 665 670 Phe Gly Gly Asp Val Ser His Leu Asn Leu His Lys Thr Phe Thr Ile 675 680 685 Pro His Gly Gly Gly Gly Pro Gly Val Gly Pro Ile Gly Val Ala Glu 690 695 700 His Leu Ile Pro Phe Leu Pro Thr Asp Ala Ala Ala Asp Glu Leu Asp 705 710 715 720 Pro Ala Asn Pro Thr Pro Val Glu Gln Gly Val Pro Ile Thr Ala Ser 725 730 735 Gln Phe Gly Ser Ala Gly Val Leu Pro Ile Thr Trp Ala Tyr Ile Ala 740 745 750 Met Thr Gly Gly Glu Gly Leu Thr Ser Ala Thr Ala His Ala Ile Leu 755 760 765 Gly Ala Asn Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Ser Asp Ser Phe Pro Ile Leu 770 775 780 Phe Thr Gly Asn Glu Gly Leu Val Ala His Glu Cys Ile Leu Asp Leu 785 790 795 800 Arg Ala Leu Thr Asp Ala Ser Gly Val Thr Ala Ala Asp Val Ala Lys 805 810 815 Arg Leu Ile Asp Phe Gly Phe His Ala Pro Thr Leu Ala Phe Pro Val 820 825 830 Ala Gly Thr Leu Met Val Glu Pro Thr Glu Ser Glu Asp Ile Ala Glu 835 840 845 Leu Asp Arg Phe Ile Glu Ala Met Arg Thr Ile Arg Ala Glu Ile Gln 850 855 860 Glu Ile Ile Asp Gly Lys Ile Ala Tyr Glu Asp Ser Val Ile Arg His 865 870 875 880 Ala Pro Tyr Thr Ala Pro Ser Val Ser Ser Asp Asp Trp Glu Tyr Ser 885 890 895 Phe Ser Arg Glu Lys Ala Ala Trp Pro Val Pro Ser Leu Arg Leu Asn 900 905 910 Lys Tyr Phe Pro Pro Val Arg Arg Leu Asp Glu Ala Tyr Gly Asp Arg 915 920 925 Asn Leu Val Cys Ser Cys Pro Pro Pro Glu Ala Phe Asp Phe Asp Ala 930 935 940 Asp Thr Asp Ser Thr Glu Glu Ala 945 950 <210> 39 <211> 367 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 39 Met Ser Glu Leu Arg Gln Ser Pro Leu His Ala Glu His Glu Lys Leu 1 5 10 15 Gly Ala Ser Phe Thr Ala Phe Gly Pro Trp Asn Met Pro Leu Lys Tyr 20 25 30 Gly Lys Glu Leu Asp Glu His His Ala Val Arg Asn Ala Val Gly Met 35 40 45 Phe Asp Leu Ser His Met Gly Glu Ile Trp Val Asn Gly Pro Asp Ala 50 55 60 Ala Ala Phe Leu Ser Tyr Ala Leu Ile Ser Asn Met Glu Thr Val Lys 65 70 75 80 Asn Gly Lys Ala Lys Tyr Ser Met Ile Val Ala Glu Asp Gly Gly Ile 85 90 95 Ile Asp Asp Leu Ile Ser Tyr Arg Phe Ser Asp Thr Lys Phe Leu Val 100 105 110 Val Pro Asn Ala Gly Asn Thr Asp Val Val Trp Glu Ala Phe Asn Gln 115 120 125 Arg Ile Glu Gly Phe Asp Val Glu Leu Asn Asn Glu Ser Leu Asp Val 130 135 140 Ala Met Ile Ala Leu Gln Gly Pro Asn Ala Ala Lys Val Leu Val Glu 145 150 155 160 Gln Val Ala Glu Glu Ser Lys Glu Glu Val Glu Asn Leu Pro Tyr Tyr 165 170 175 Ala Ala Thr Met Ala Lys Val Ala Asp Val Asp Thr Ile Val Ala Arg 180 185 190 Thr Gly Tyr Thr Gly Glu Asp Gly Phe Glu Leu Met Ile Tyr Asn Ala 195 200 205 Asp Ala Thr Lys Leu Trp Gln Leu Phe Ile Asp Gln Asp Gly Val Thr 210 215 220 Pro Cys Gly Leu Ala Ser Arg Asp Ser Leu Arg Leu Glu Ala Gly Met 225 230 235 240 Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Leu Ser Arg Asp Ile Thr Pro Val Glu Ala 245 250 255 Gly Met Gly Val Ala Phe Lys Lys Lys Thr Ala Asp Phe Val Gly Ala 260 265 270 Glu Val Leu Arg Gln Arg Leu Glu Glu Gly Pro Lys Gln Val Ile Lys 275 280 285 Ala Leu Thr Ser Ser Glu Arg Arg Ala Ala Arg Thr Gly Ala Glu Ile 290 295 300 Tyr Ala Gly Glu Gln Leu Val Gly Thr Val Thr Ser Gly Gln Pro Ser 305 310 315 320 Pro Thr Leu Gly His Pro Ile Ala Leu Ala Leu Val Asp Thr Ala Ala 325 330 335 Asn Leu Glu Glu Gly Ala Glu Val Glu Val Asp Ile Arg Gly Lys Arg 340 345 350 Tyr Pro Phe Thr Val Thr Lys Thr Pro Phe Tyr Ser Arg Glu Lys 355 360 365 <210> 40 <211> 129 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 40 Met Ala Asn Leu Pro Ala Glu Phe Thr Tyr Ser Glu Asp His Glu Trp 1 5 10 15 Ile Asn Ala Ala Gln Asp Ala Ile Val Gly Lys Thr Val Arg Ile Gly 20 25 30 Ile Thr Ser Val Ala Ala Asp Arg Leu Gly Glu Val Val Phe Ala Glu 35 40 45 Leu Pro Ala Val Gly Asp Ser Val Thr Ala Gly Glu Thr Cys Gly Glu 50 55 60 Val Glu Ser Thr Lys Ser Val Ser Asp Leu Tyr Ser Pro Val Thr Gly 65 70 75 80 Thr Val Thr Ala Val Asn Glu Thr Val His Asp Asp Tyr Glu Ile Ile 85 90 95 Asn Asn Asp Pro Phe Gly Glu Gly Trp Leu Phe Glu Val Glu Val Glu 100 105 110 Glu Leu Gly Glu Val Met Thr Ala Asp Glu Tyr Ala Ala Glu Asn Gly 115 120 125 Ile <210> 41 <211> 353 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 41 Met Leu Arg Ile Glu Lys Lys Asn Ala Glu Ser Pro Ile Glu Gln Lys 1 5 10 15 Pro Arg Trp Ile Arg Asn Gln Val Arg Thr Gly Pro Gly Tyr Glu Asp 20 25 30 Met Lys Lys Arg Val Ala Gly Ala Gly Leu His Thr Val Cys Gln Glu 35 40 45 Ala Gly Cys Pro Asn Ile His Glu Cys Trp Glu Ser Arg Glu Ala Thr 50 55 60 Phe Leu Ile Gly Gly Asp Arg Cys Thr Arg Arg Cys Asp Phe Cys Asp 65 70 75 80 Ile Ala Thr Gly Lys Pro Gln Ala Leu Asp Thr Asp Glu Pro Arg Arg 85 90 95 Val Ser Glu Asn Ile Gln Glu Met Asn Leu Asn Tyr Ala Thr Ile Thr 100 105 110 Gly Val Thr Arg Asp Asp Leu Pro Asp Glu Gly Ala Trp Leu Tyr Ala 115 120 125 Glu Val Val Arg Lys Ile His Glu Lys Asn Pro His Thr Gly Val Glu 130 135 140 Asn Leu Thr Pro Asp Phe Ser Gly Lys Pro Asp Leu Leu Gln Glu Val 145 150 155 160 Phe Glu Ala Arg Pro Glu Val Phe Ala His Asn Leu Glu Thr Val Pro 165 170 175 Arg Ile Phe Lys Arg Ile Arg Pro Ala Phe Arg Tyr Glu Arg Ser Leu 180 185 190 Asp Val Leu Gln Gln Ala His Asp Phe Gly Leu Ile Thr Lys Ser Asn 195 200 205 Leu Ile Leu Gly Met Gly Glu Thr Glu Glu Glu Ile Gln Glu Ala Leu 210 215 220 Arg Asp Met Arg Ser Val Gly Thr Asp Ile Ile Thr Ile Thr Gln Tyr 225 230 235 240 Leu Arg Pro Gly Pro Arg Phe His Pro Ile Glu Arg Trp Val Arg Pro 245 250 255 Glu Glu Phe Ile Ala His Ser Glu Tyr Ala Lys Glu Leu Gly Phe Thr 260 265 270 Val Met Ser Gly Pro Leu Val Arg Ser Ser Tyr Arg Ala Gly Lys Leu 275 280 285 Tyr Thr Gln Ala Met Lys Ala Arg Gly Trp Glu Leu Pro Glu Asn Leu 290 295 300 Lys His Leu Glu Glu Thr Ser Asp Gly Ala Thr Ala Gln Glu Ala Ser 305 310 315 320 Ser Leu Leu Lys Lys Tyr Gly Pro Ser Glu Glu Thr Pro Val Thr Ser 325 330 335 Arg Met Ala Lys Thr Pro Val Gly Ala Asp Lys Phe Thr Ala Ser Ile 340 345 350 Arg <210> 42 <211> 273 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 42 Met Thr Ala Pro Arg Asp Pro Phe Phe Pro Ala Asp Arg Ser Ile Arg 1 5 10 15 Ala Ser Thr Ala Pro Val Glu Val Arg Arg Leu Gly Arg Met Asp Tyr 20 25 30 Gln Glu Ala Trp Asp Tyr Gln Ala Glu Val Ala Ala Gln Arg Ala Arg 35 40 45 Asp Glu Val Ala Asp Thr Leu Leu Val Val Glu His Pro Ala Val Tyr 50 55 60 Thr Ala Gly Lys Arg Thr Gln Pro Glu Asp Met Pro Thr Asn Gly Leu 65 70 75 80 Pro Val Ile Asn Val Asp Arg Gly Gly Arg Ile Thr Trp His Gly Glu 85 90 95 Gly Gln Leu Val Val Tyr Pro Ile Ile Lys Leu Ala Glu Pro Val Asp 100 105 110 Val Val Asp Tyr Val Arg Arg Leu Glu Glu Ala Val Ile His Thr Val 115 120 125 Arg Glu Met Gly Val Thr Thr Ala Gly Arg Ile Asp Gly Arg Ser Gly 130 135 140 Val Trp Val Pro Ser Thr Thr Ala Ala Lys Asp Pro Ala Ala Ser His 145 150 155 160 Arg Asp Arg Lys Ile Ala Ala Leu Gly Ile Arg Ile Thr Arg Gly Val 165 170 175 Thr Met His Gly Leu Ala Leu Asn Cys Asp Asn Ile Leu Asp Tyr Tyr 180 185 190 Glu His Ile Ile Ala Cys Gly Ile Asp Asp Ala Asp Ile Thr Thr Leu 195 200 205 Ala Leu Glu Leu Gly Arg Asp Val Thr Val Asp Asp Ala Val Glu Pro 210 215 220 Leu Leu Ile Ala Leu Asp Asp Ala Leu Ala Gly Arg Met Val Val Ala 225 230 235 240 Asp His Thr Phe Ala Ser Ala Pro Asp Pro Ile Lys Leu Ala Asn Glu 245 250 255 Lys Ala Arg Gln Ala Arg Ala Gln Ser Ser Leu Thr Asp His Ala Gly 260 265 270 Ser

Claims (11)

  1. L-쓰레오닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물에서 글리신 트랜스포터의 활성이 강화된 미생물로서,
    상기 글리신 트랜스포터가 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 유래의 CycA 단백질인, 미생물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 16 또는 이와 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 글리신 분해 단백질의 활성이 추가로 강화된, 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 글리신 분해 단백질은 GcvP, GcvT, GcvH, LipB 및 LipA로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질인, 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 글리신 분해 단백질은 코리네박테리움 암모니아게네스 유래인, 미생물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 GcvP는 서열번호 38, GcvT 단백질은 서열번호 39, GcvH는 서열번호 40, LipA 단백질은 서열번호 41, LipB 단백질은 서열번호 42 또는 상기 서열번호와 각각 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 미생물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 L-쓰레오닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 미생물.
  10. 제1항 및 제4항 내지 제9항 중 한 항의 미생물을 포함하는 L-쓰레오닌 생산용 조성물.
  11. 제1항 및 제4항 내지 제9항 중 한 항의 미생물을 배양하는 단계; 및
    상기 미생물 또는 배지에서 L-쓰레오닌을 회수하는 단계를 포함하는, L-쓰레오닌 제조방법.

KR1020190046935A 2019-04-22 2019-04-22 L-쓰레오닌 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법 KR102175112B1 (ko)

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