RU2779461C1 - Микроорганизмы для получения l-тирозина и способ получения l-тирозина с их использованием - Google Patents
Микроорганизмы для получения l-тирозина и способ получения l-тирозина с их использованием Download PDFInfo
- Publication number
- RU2779461C1 RU2779461C1 RU2021121437A RU2021121437A RU2779461C1 RU 2779461 C1 RU2779461 C1 RU 2779461C1 RU 2021121437 A RU2021121437 A RU 2021121437A RU 2021121437 A RU2021121437 A RU 2021121437A RU 2779461 C1 RU2779461 C1 RU 2779461C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tyrosine
- gene
- region
- microorganism
- trp
- Prior art date
Links
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 title claims abstract description 266
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 90
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 229960004441 Tyrosine Drugs 0.000 claims abstract description 133
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 17
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims abstract description 10
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 claims abstract 25
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 claims description 103
- 101710043853 cpeA Proteins 0.000 claims description 66
- 101700035170 pheA Proteins 0.000 claims description 66
- 108010035004 Prephenate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 35
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- 101800001171 Leader peptide Proteins 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- FPWMCUPFBRFMLH-XGAOUMNUSA-N Prephenic acid Chemical compound O[C@H]1C=C[C@@](CC(=O)C(O)=O)(C(O)=O)C=C1 FPWMCUPFBRFMLH-XGAOUMNUSA-N 0.000 abstract 3
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 88
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 75
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 60
- 125000002707 L-tryptophyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(C([C@](N([H])[H])(C(=O)[*])[H])([H])[H])=C([H])N([H])C2=C1[H] 0.000 description 50
- 229960004799 Tryptophan Drugs 0.000 description 45
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 45
- 229960005190 Phenylalanine Drugs 0.000 description 31
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 27
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 25
- 230000002759 chromosomal Effects 0.000 description 24
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 24
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 24
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 21
- 239000002609 media Substances 0.000 description 20
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 description 20
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 19
- 101710042243 trpE(G) Proteins 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 101700011923 tyrA Proteins 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 15
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 14
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 14
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 13
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 13
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 13
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 13
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- 101710041570 DAHPS2 Proteins 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 101700043556 aroH Proteins 0.000 description 12
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 12
- 108091000081 Phosphotransferases Proteins 0.000 description 10
- 102000030951 Phosphotransferases Human genes 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 10
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 101710018378 DLEU1 Proteins 0.000 description 8
- 101710018188 IIL1 Proteins 0.000 description 8
- 101700021119 LEUC Proteins 0.000 description 8
- 101700064771 hacA Proteins 0.000 description 8
- 101710004442 ilv1 Proteins 0.000 description 8
- 101700050371 leuC1 Proteins 0.000 description 8
- GPMWEYVOEWNYSK-QMMMGPOBSA-N (2S)-2-amino-N-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)propanamide Chemical compound ONC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 GPMWEYVOEWNYSK-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 7
- WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-N Chorismic acid Chemical compound O[C@@H]1C=CC(C(O)=O)=C[C@H]1OC(=C)C(O)=O WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-N 0.000 description 6
- NGHMDNPXVRFFGS-IUYQGCFVSA-N D-erythrose 4-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O NGHMDNPXVRFFGS-IUYQGCFVSA-N 0.000 description 6
- 101700021706 aroP Proteins 0.000 description 6
- -1 aromatic amino acid Chemical class 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N Phosphoenolpyruvic acid Natural products OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 101710014135 exp5 Proteins 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 101710015455 ptsG Proteins 0.000 description 5
- 101710018447 ptsM Proteins 0.000 description 5
- NESXXUAWVHXRGX-UHFFFAOYSA-M sodium;1-carboxyethenyl hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)(=O)OC(=C)C([O-])=O NESXXUAWVHXRGX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 4
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 4
- 229960000310 ISOLEUCINE Drugs 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- 241000588902 Zymomonas mobilis Species 0.000 description 4
- 230000001851 biosynthetic Effects 0.000 description 4
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- FPWMCUPFBRFMLH-XGAOUMNUSA-L (1s,4s)-prephenate(2-) Chemical compound O[C@H]1C=C[C@@](CC(=O)C([O-])=O)(C([O-])=O)C=C1 FPWMCUPFBRFMLH-XGAOUMNUSA-L 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 101710042194 Trpgamma Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L mgso4 Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000002195 synergetic Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- HMBPQJMSMDRRDI-UHFFFAOYSA-L 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-hydroxybutanedioate Chemical compound OCC(N)(CO)CO.[O-]C(=O)C(O)CC([O-])=O HMBPQJMSMDRRDI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PJWIPEXIFFQAQZ-PUFIMZNGSA-N 3-Deoxy-D-arabino-heptulosonic acid 7-phosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC(=O)C(O)=O PJWIPEXIFFQAQZ-PUFIMZNGSA-N 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N Fructose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N 0.000 description 2
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 2
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 2
- 150000008553 L-tyrosines Chemical class 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N Linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N Maltose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@H]1CO)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N 0.000 description 2
- 101710017470 NT5C3B Proteins 0.000 description 2
- 108060005877 PAT1 Proteins 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N Palmitic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N Stearic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060008646 TRPA Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000037348 biosynthesis Effects 0.000 description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001718 repressive Effects 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108060008647 trpB Proteins 0.000 description 2
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 1
- PRKQVKDSMLBJBJ-UHFFFAOYSA-N Ammonium carbonate Chemical compound N.N.OC(O)=O PRKQVKDSMLBJBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DVARTQFDIMZBAA-UHFFFAOYSA-O Ammonium nitrate Chemical compound [NH4+].[O-][N+]([O-])=O DVARTQFDIMZBAA-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241001644925 Corynebacterium efficiens Species 0.000 description 1
- 241000186308 Corynebacterium stationis Species 0.000 description 1
- 241000337023 Corynebacterium thermoaminogenes Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N DMSO Substances CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007702 DNA assembly Methods 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L Dipotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010000898 EC 5.4.99.5 Proteins 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L Iron(II) sulfate Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-Methionine Natural products CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N Lactose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO)[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 229940045184 Malt extract Drugs 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N Methylnitronitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M Monopotassium phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 108010078762 Protein Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 description 1
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010033725 Recombinant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007312 Recombinant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229920000978 Start codon Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H Tricalcium phosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 108020003635 Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920000146 Untranslated region Polymers 0.000 description 1
- 229940029983 VITAMINS Drugs 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229940021016 Vitamin IV solution additives Drugs 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloids Natural products 0.000 description 1
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional Effects 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 235000005824 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000005712 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoids Natural products 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N monochloramine Chemical compound ClN QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 101700047848 pabA Proteins 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001116 prolino group Chemical group [H]OC(=O)C1([H])N(*)C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001737 promoting Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 235000020238 sunflower seed Nutrition 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamins Natural products 0.000 description 1
- GLUJNGJDHCTUJY-UHFFFAOYSA-N β-leucine Chemical compound CC(C)C(N)CC(O)=O GLUJNGJDHCTUJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к микроорганизму, продуцирующему L-тирозин, и получению L-тирозина с использованием этого микроорганизма. Предложен микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-тирозин, содержащий регуляторную область оперона trp и ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, функционально связанный с этой областью, где регуляторная область оперона trp содержит промотор (промотор trp). Также предложены способ получения L-тирозина с использованием указанного микроорганизма, экспрессионная кассета, содержащая регуляторную область оперона trp и ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, функционально связанный с этой областью, где регуляторная область оперона trp содержит промотор trp, а также композиция для получения L-тирозина, содержащая регуляторную область оперона trp и ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, функционально связанный с этой областью, экспрессионную кассету, содержащую то же самое, и микроорганизм рода Corynebacterium, содержащий то же самое, где регуляторная область оперона trp содержит промотор trp. Изобретение обеспечивает увеличение выхода продукции L-тирозина. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 17 табл., 12 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к микроорганизму, продуцирующему L-тирозин, включающему регуляторную область оперона trp и ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, функционально связанный с ней, а также способу получения L-тирозина с использованием микроорганизма.
Предшествующий уровень техники
L-тирозин представляет собой одну из аминокислот и используется в качестве важного материала для фармацевтического сырья, пищевых добавок, кормов для животных, биологически активных добавок и т.д. Для получения L-тирозина и других полезных материалов проводятся различные исследования по разработке микроорганизмов с использованием высокоэффективного производства и технологий процессов ферментации.
Процесс продуцирования L-тирозина микроорганизмами начинается с 3-дезокси-D-аробино-гептулозонат-7-фосфата (DAHP), полученного в результате реакции полимеризации фосфоенолпирувата (PEP), который является промежуточным звеном гликолиза, с эритрозо-4-фосфатом (Е4Р), который является промежуточным звеном пентозофосфатного пути. Затем DAHP биосинтезируется из хоризмата в префенат по общему ароматическому биосинтетическому пути и, наконец, преобразуется в L-тирозин по биосинтетическому пути L-тирозина. Во время этого процесса хоризмат может быть превращен в L-триптофан, а префенат может быть превращен в L-тирозин или L-фенилаланин. Таким образом, когда общий путь биосинтеза ароматических аминокислот усилен так, чтобы увеличить количество продуцируемого L-тирозина, можно ожидать, что продуцирование L-триптофана и L-фенилаланина при этом также увеличится. То есть при продуцировании L-тирозина, одновременно продуцируются фенилаланин и триптофан в качестве побочных продуктов, и, соответственно, необходимы различные исследования, такие как рекомбинация генов, очистка и т.д. Между тем, известно, что продуцирование L-триптофана регулируется репрессорами и аттенюаторами в соответствии с концентрацией L-триптофана, вырабатываемого микроорганизмами (Патент Кореи №10-0792095 B1).
При этих условиях, авторы настоящего изобретения приложили значительные усилия для разработки микроорганизма, способного продуцировать с высокой эффективностью L-тирозин, при этом они подтвердили, что когда гены, продуцирующие L-фенилаланин, регулируются промоторами оперона, продуцирующего L-триптофан, выход продукции L-тирозина увеличивается до более высокого уровня, тем самым осуществив настоящее изобретение.
Техническая задача
Одной из целей настоящего изобретения является создание микроорганизма, продуцирующего L-тирозин, включающего регуляторную область оперона trp и ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, функционально связанный с этой областью.
Другой целью настоящего изобретения является разработка способа получения L-тирозина, включающего культивирование микроорганизма в среде; и извлечение L-тирозина из культивируемого микроорганизма или среды.
Еще одной целью настоящего изобретения является создание экспрессионной кассеты, включающей регуляторную область оперона trp и ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, функционально связанный с этой областью.
Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа для регулирования активности префенатдегидрогеназы с использованием регуляторной области оперона trp и гена, кодирующего префенатдегидрогеназы, функционально связанного с этой обалстью.
Еще одна цель настоящего изобретения заключается в использовании L-тирозин-продуцирующего микроорганизма для получения L-тирозина.
Еще одна цель настоящего изобретения заключается в использовании экспрессионной кассеты для получения L-тирозина.
Еще одна цель настоящего изобретения заключается в использовании композиции для получения L-тирозина.
Полезные эффекты изобретения
L-тирозин-продуцирующий микроорганизм по настоящему изобретению, который включает ген, кодирующий префенатдегидрогеназу и регуляторную область оперона trp, минимизирует накопление L-фенилаланина, не оказывая влияния на рост клеток и может с высокой эффективностью продуцировать L-тирозин Лучший вариант осуществления изобретения Настоящее изобретение подробно описано ниже. Между тем, соответствующие описания и воплощения, раскрытые в настоящем описании, могут также применяться к другим описаниям и воплощениям. То есть все комбинации различных элементов, представленные в настоящем раскрытии, относятся к области настоящего изобретения. Кроме того, объем настоящего раскрытия не может рассматриваться как ограниченный конкретным описанием, представленным ниже.
Для достижения вышеуказанных целей один из аспектов настоящего изобретения предлагает микроорганизм, продуцирующий L-тирозин, включающий регуляторную область оперона trp и ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, функционально связанный с этой областью.
Используемый здесь термин "L-тирозин" представляет собой одну из 20 α-аминокислот и классифицируется как гидрофильная аминокислота или ароматическая аминокислота. Тирозин является коммерчески важной аминокислотой, используемой в качестве предшественника фармацевтических препаратов, флавоноидов, алкалоидов и т.д.
Используемый здесь термин "оперон триптофана (оперон Trp)" относится к группе генов, кодирующих ферменты, участвующие в синтезе триптофана из хоризмовой кислоты (хоризмат), и включает структурные гены и регуляторные области экспрессии (или регуляторные области). В частности, оперон триптофана может быть опероном триптофана, полученным из микроорганизма рода Corynebacterium или опероном триптофана, полученным из микроорганизма рода Escherichia, но может включать оперон триптофана различного происхождения без ограничений при условии, что он может регулировать ген pheA в соответствии с настоящим изобретением. В частности, микроорганизм рода Corynebacterium может представлять собой Corynebacterium glutamicum, а микроорганизм рода Escherichia может представлять собой Е. coli, но микроорганизмы этим не ограничиваются. Кроме того, оперон триптофана может иметь известную нуклеотидную последовательность, и специалисты в данной области могут легко получить нуклеотидную последовательность оперона триптофана из базы данных, такой как NCBI или Kegg, и т.д. Обычный оперон триптофана активно транскрибируется, чтобы продуцировать достаточное количество триптофана, необходимое клеткам, но когда в клетках присутствует достаточное количество триптофана, репрессор связывается с триптофаном и инактивирует оперон триптофана, тем самым ингибируя транскрипцию. В настоящем раскрытии изобретения вышеуказанный термин может использоваться взаимозаменяемо с термином триптофановый оперон, trp оперон, и т.д.
Используемый здесь термин "регуляторная область оперона trp" относится к области, которая находится против хода транскрипции относительно структурных генов, составляющих оперон trp, и может регулировать экспрессию структурных генов. Структурные гены, образующие оперон trp в микроорганизме рода Corynebacterium, могут быть составлены из генов trpE, trpG, trpD, trpC, trpB и trpA, а структурные гены, образующие оперон trp в микроорганизме рода Escherichia могут быть составлены из генов trpE, trpD, trpC, trpB, и trpA. Регуляторная область оперона trp может находиться выше trpE в положении 5' структурных генов оперона trp.В частности, она может включать регулятор trp (trpR), промотор (промотор trp), оператор (trp оператор), лидерный пептид оперона trp (trp L), и аттенюатор trp, исключая структурные гены, которые могут составлять оперон trp.Более конкретно, она может включать промотор (промотор trp), оператор (оператор trp), лидерный пептид trp (trp L) и аттенюатор trp (аттенюатор trp). В настоящем описании регуляторная область оперона trp может включать, без ограничения, любую регуляторную область, расположенную против хода транскрипции относительно гена pheA, кодирующего префенатдегидрогеназу, и может регулировать экспрессию гена pheA. В настоящем раскрытии регуляторная область оперона trp может использоваться взаимозаменяемо с регуляторным фактором оперона trp, промотором trpE, промотором оперона trp, регуляторной областью trpE, регуляторным фактором trpE и регуляторной последовательностью trpE.
Например, регуляторная область оперона trp может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, но этим не ограничивается. Последовательность SEQ ID NO: 1 может быть подтверждена известной базой данных GenBank of NCBI.
В частности, регуляторная область оперона trp может состоять из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или нуклеотидной последовательности, имеющей гомологию или идентичность, составляющую по меньшей мере 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% или более с SEQ ID NO: 1. Кроме того, очевидно, что регуляторная область с делецией, модификацией, заменой или добавлением части последовательности также входит в объем настоящего изобретения при условии, что его нуклеотидная последовательность имеет такую гомологию или идентичность и выполняет функцию, соответствующую регуляторной области.
Используемые здесь термины "гомология" и "идентичность " относятся к степени соответствия между двумя заданными аминокислотными последовательностями или нуклеотидными последовательностями и могут быть выражены в процентах. Термины "гомология" и "идентичность" часто используются взаимозаменяемо друг с другом.
Гомология последовательностей или идентичность консервативных полинуклеотидов или полипептидов может быть определена стандартным алгоритмом выравнивания и может использоваться вместе с установленным по умолчанию штрафом за пропуск в последовательности, обнаруженным используемой программой. Как правило, ожидается, что гомологичные или идентичные последовательности гибридизуются со всеми или по меньшей мере с примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 85% или примерно 90% всей длины последовательностей при умеренных или жестких условиях. Полинуклеотиды, которые содержат вырожденные кодоны вместо кодонов, также рассматриваются при гибридизации полинуклеотидов.
Гомология или идентичность полипептидных или полинуклеотидных последовательностей может быть определена, например, с помощью алгоритма BLAST по литературе [см: Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)], или FASTA по Pearson (см: Methods Enzymol., 183, 63, 1990). На основе алгоритма BLAST была разработана программа, называемая BLASTN или BLASTX (см.: www.ncbi.nlm.nih.gov). Кроме того, независимо от того, имеют ли какие-либо аминокислотные или полинуклеотидные последовательности гомологию, сходство или идентичность друг с другом, это может быть идентифицировано путем сравнения последовательностей в эксперименте саузерн-блот гибридизация при жестких условиях, как определено, и соответствующие условия гибридизации, определенные в рамках данной области техники, могут быть установлены методом, хорошо известным специалистам в данной области, (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)
Используемый здесь термин "префенатдегидрогеназа" является одним из белков, необходимых для биосинтеза L-фенилаланина. Ген, кодирующий белок, может представлять собой, например, ген pheA, но не ограничивается этим. Белок также называют как бифункциональная хоризматмутаза/префенатдегидрогеназа. Поскольку префенатдегидрогеназа представляет собой фермент в пути, вовлеченном в получение L-фенилаланина из хоризмата или префената, и является ферментом на стадии конкуренции с биосинтетическим путем тирозина, его обычно выбирают в качестве целевого гена для инактивации продукции штаммов, продуцирующих тирозин. Однако когда префенатдегидрогеназа инактивирована, возникает проблема, заключающаяся в значительном снижении продуктивности, так как он влияет на рост штаммов.
В настоящем изобретении микроорганизмы, которые были генетически модифицированы таким образом, чтобы ген pheA регулировался регуляторной областью оперона trp, в частности, микроорганизмы, в которых регуляторную область оперона trp подставляли к области промотора для регуляции pheA, минимизируют накопление фенилаланина, не влияя при этом на рост клеток и улучшая продуцированием тирозина.
Кроме того, ген pheA, который представляет собой ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, может иметь делецию в части или всей регуляторной последовательности, находящейся против хода транскрипции по отношению к структурному гену pheA. Для осуществления настоящего изобретения, выше расположенная область структурного гена pheA может быть заменена регуляторной областью оперона trp, или регуляторная область оперона trp может быть вставлена выше области структурного гена pheA, чтобы включить структурный ген pheA, который может регулироваться экспрессией белка, кодируемого геном pheA с помощью регуляторной области оперона trp. Используемый здесь термин "ген pheA" может использоваться взаимозаменяемо с "геном, кодирующим префенатдегидрогеназу" и "структурным геном pheA ".
Используемый здесь термин "микроорганизм, продуцирующий L-тирозин" относится к микроорганизму, естественным образом обладающему способностью продуцировать L-тирозин или микроорганизму, который приобрел L-тирозин-продуцирующую способность от своего родительского штамма, не имеющего L-тирозин-продуцирующей способности. В частности, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, продуцирующий L-тирозин, включающий регуляторную область оперона trp и ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, функционально связанный с этой областью, но не ограничивающийся этим.
Более конкретно, "микроорганизм, продуцирующий L-тирозин" включает все микроорганизмы дикого типа и естественно или искусственно генетически модифицированные микроорганизмы, и может представлять собой микроорганизм, обладающий генетической модификацией или повышенной активностью для необходимого продуцирования L-тирозина, может представлять собой микроорганизм, в котором конкретный механизм ослаблен или усилен механизмом из-за введения чужеродного гена, или усиления или инактивации активности эндогенного гена. Для осуществления настоящего изобретения, микроорганизм, продуцирующий L-тирозин, включает регуляторную область оперона trp и ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, функционально связанный с этой областью, и обладает повышенной способностью продуцировать L-тирозин, а также может быть генетически модифицированным микроорганизмом или рекомбинантным микроорганизмом, но не ограничивается этим.
Более конкретно, микроорганизм, имеющий L-тирозин-продуцирующую способность по настоящему изобретению, относится к рекомбинантному микроорганизму, имеющему повышенную L-тирозин-продуцирующую способность посредством включения регуляторной области оперона trp и гена, кодирующего префенатдегидрогеназу, функционально связанного с этой областью, по настоящему изобретению, или в результате трансформации вектором, включающим регуляторную область оперона trp и ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, функционально связанный с ней.
В настоящем раскрытии "микроорганизм, включающий ген" может означать "генетически модифицированный микроорганизм", "микроорганизм,
модифицированный для экспрессии гена", "рекомбинантный микроорганизм, экспрессирующий ген" или "рекомбинантный микроорганизм, обладающий активностью белка, кодируемого геном", но не ограничивается этим.
Например, это может быть 1) микроорганизм, включающий регуляторную область оперона trp и ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, функционально связанный с этой областью, по настоящему изобретению, 2) микроорганизм, модифицированный для экспрессии регуляторной области оперона trp и гена, кодирующего префенатдегидрогеназу, функционально связанного с этой областью, 3) рекомбинантный микроорганизм, экспрессирующий регуляторную область оперона trp и ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, функционально связанный с этой областью, и 4) рекомбинантьный микроорганизм, который трансформирован вектором, включающим регуляторную область оперона trp и ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, функционально связанный с этой областью, для повышения L-тирозин-продуцирующей способности, но не ограничивается этим.
"Микроорганизм, обладающий повышенной способностью продуцировать L-тирозин", может относиться к микроорганизму, обладающему повышенной способностью продуцировать L-тирозин по сравнению с исходным штаммом или немодифицированным микроорганизмом до трансформации. "Немодифицированный микроорганизм" может быть нативным штаммом или микроорганизмом, который не был трансформирован вектором, включающим гены, кодирующие полинуклеотид и целевой белок.
В качестве микроорганизма для осуществления настоящего изобретения могут быть все микроорганизмы, способные продуцировать L-тирозин путем включения регуляторной области оперона trp и гена, кодирующего префенатдегидрогеназу, функционально связанного с ней. В настоящем изобретении термин "микроорганизм, способный продуцировать L-тирозин" может быть взаимозаменяемо использован с "микроорганизмом, продуцирующим L-тирозин" и "микроорганизмом, обладающим способностью продуцировать L-тирозин".
Микроорганизм может быть, например, микроорганизмом, принадлежащим к роду Enterbacter, микроорганизмом, принадлежащим к роду Escherichia, микроорганизмом, принадлежащим к роду Erwinia, микроорганизмом, принадлежащим к роду Serratia, микроорганизмом, принадлежащим к роду Providencia, микроорганизмом, принадлежащим к роду Corynebacterium, и микроорганизмом, принадлежащим к роду Brevibacterium, но он не ограничивается этим.
В частности, микроорганизм может быть микроорганизмом, принадлежащим к роду Corynebacterium. В настоящем раскрытии "микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, может быть конкретно микроорганизмом Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium stationis, и т.д., но он не ограничивается этим.
Другой аспект настоящего изобретения предлагает способ получения L-тирозина, включающий культивирование микроорганизма в среде; и извлечение L-тирозина из культивируемого микроорганизма или среды.
В вышеописанном способе стадия культивирования микроорганизма может быть осуществлена известным периодическим культивированием, непрерывным культивированием, культивированием с подпиткой и т.д., но этим не ограничивается. В частности, в зависимости от условий культивирования, рН культуры может быть скорректирован до подходящего значения (например, рН от 5 до 9, в частности рН от 6 до 8, и более конкретно рН 7,0) с использованием основного соединения (например, гидроксида натрия, гидроксида калия или аммиака) или кислого соединения (например, фосфорной кислоты или серной кислоты), но не ограничивается этим. Кроме того, кислород или кислородсодержащую газовую смесь можно вводить в культуру для поддержания аэробного состояния. Температура культивирования может поддерживаться от 20°С до 45°С, в частности от 25°С до 40°С, и культивирование может проводиться в течение от 10 до 160 часов, но культура не ограничивается вышеуказанным. Аминокислота, продуцируемая культурой, может секретироваться в среду или оставаться в клетках.
Кроме того, в качестве источника углерода для используемой питательной среды можно использовать сахара и углеводы (например, глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, патока, крахмал и целлюлоза), масла и жиры (например, соевое масло, масло семян подсолнечника, арахисовое масло и кокосовое масло), жирные кислоты (например, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота), спирты (например, глицерин и этанол) и органические кислоты (например, уксусная кислота) по отдельности или в комбинации, но источники углерода не ограничиваются этим. В качестве источника азота можно использовать азотсодержащие органические соединения (например, пептон, дрожжевой экстракт, мясная подливка, солодовый экстракт, кукурузный экстракт, соевая мука и мочевина) или неорганические соединения (например, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония) по отдельности или в комбинации, но источник азота этим не ограничивается. В качестве источника фосфора можно использовать дигидрофосфат калия, гидроортофосфат калия и их соответствующие натрийсодержащие соли и т.д., по отдельности или в комбинации, но источник фосфора этим не ограничивается. Кроме того, среда может содержать необходимые вещества, способствующие росту, такие как соли других металлов (например, сульфат магния или сульфат железа), аминокислоты и витамины.
В способе извлечения аминокислоты, полученной на этапе культивирования настоящего изобретения, целевые аминокислоты могут быть собраны из культивируемого раствора с использованием соответствующего способа, известного в данной области техники, согласно способу культивирования. Например, могут быть использованы центрифугирование, фильтрация, анионообменная хроматография, кристаллизация, ВЭЖХ и т.д., и целевые аминокислоты могут быть извлечены из среды или микроорганизма с использованием соответствующего метода, известного в данной области техники.
Кроме того, стадия извлечения может дополнительно включать процесс очистки и может быть выполнена с использованием соответствующего метода, известного в данной области техники. Таким образом, извлеченные аминокислоты могут находиться в очищенном состоянии или в виде раствора микробиологической ферментации, содержащего аминокислоты (Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008). Кроме того, до и после стадии культивирования, а также до и после стадии выделения, целевые аминокислоты могут быть эффективно извлечены путем дополнительного выполнения соответствующего способа, известного в данной области техники.
Еще один аспект настоящего изобретения предлагает экспрессионную кассету, включающую регуляторную область оперона trp и ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, функционально связанный с этой областью.
В настоящем изобретении термин "экспрессионная кассета" может представлять собой единицу генетической конструкции, включающую существенный регуляторный элемент, функционально связанный с геном, таким образом, что введенный ген экспрессируется, когда он присутствует в клетках индивидуума. Экспрессионная кассета может быть, например, в форме экспрессионного вектора, но не ограничивается этим, и может включать все генетические конструкции, имеющие наименьшую единицу, способную экспрессировать целевой ген, подлежащий введению.
Экспрессионная кассета может быть получена и очищена стандартной технологией рекомбинантной ДНК. Любой тип экспрессионной кассеты может использоваться без особых ограничений до тех пор, пока он может функционировать для экспрессии необходимого гена в различных клетках-хозяевах, таких как прокариотические клетки и эукариотические клетки, и до тех пор, пока он может функционировать для получения необходимого белка. Экспрессионная кассета может включать промотор, стартовый кодон, ген, кодирующий целевой белок и терминирующий кодон. Кроме того, он может, соответственно, включать ДНК, кодирующую сигнальный пептид, последовательность энхансера, нетранслируемые области на 5' и 3' концах целевого гена, область селектируемого маркера или реплицируемый участок и т.д. Кроме того, экспрессионная кассета может включать моноцистронный вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий один белок или полицистронный вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий два или более рекомбинантных белка, но не ограничивается этим.
Используемый здесь термин "вектор" может относиться к конструкции ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего целевой белок, который функционально связан с подходящей регуляторной последовательностью, так что целевой белок может быть экспрессирован в соответствующем хозяине. Регуляторная последовательность может включать промотор, способный инициировать транскрипцию, последовательность любого оператора для регулирования транскрипции, последовательность, кодирующую соответствующий домен связывания мРНК с рибосомой, и последовательность, регулирующую прекращение транскрипции и трансляции. После трансформации в подходящую клетку хозяина вектор может реплицироваться и функционировать независимо от генома хозяина и может быть интегрирован в сам геном хозяина.
Вектор, используемый в настоящем изобретении, не ограничен особым образом, при условии, что он может экспрессироваться в клетке хозяина, и таким образом, может быть использован любой вектор, известный в данной области. Примеры традиционно используемых векторов могут включать природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора могут использоваться pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A и т.д.; и в качестве плазмидного вектора могут быть использованы векторы на основе pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET и т.д.. В частности, могут использоваться векторы pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC и т.д., но не ограничиваются этим.
Векторы, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничены особым образом, и можно использовать известный экспрессионный вектор. Кроме того, ген или полинуклеотид, кодирующий целевой белок, может быть вставлен в хромосому с помощью вектора для внутриклеточной хромосомной вставки. Вставка полинуклеотида в хромосому может быть выполнена любым способом, известным в данной области техники, например, путем гомологичной рекомбинации, но не ограничивается этим. Кроме того, вектор может дополнительно включать селективный маркер для подтверждения вставки в хромосому. Селективный маркер используют для отбора клеток, которые были трансформированы вектором, т.е. для определения того, был ли введен целевой полинуклеотид, при этом могут быть использованы маркеры, которые показывают лекарственную устойчивость, ауксотрофию, устойчивость к цитотоксическим агентам или представляют отобранные фенотипы, такие как экспрессия поверхностных белков. В условиях, когда селективные агенты обрабатывают, только клетки, способные экспрессировать селективные маркеры, могут выжить или экспрессировать другие фенотипические признаки, и таким образом могут быть отобраны трансформированные клетки.
Используемый здесь термин "трансформация" относится к введению вектора, включающего полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, в клетку-хозяина таким образом, что белок, кодируемый полинуклеотидом, экспрессируется в клетке-хозяине. Для того, чтобы трансформированный полинуклеотид был экспрессирован в клетке-хозяине, он может быть либо вставлен в хромосому клетки-хозяина и расположен в ней, либо расположен экстрахромосомно, и оба случая могут быть включены. Кроме того, полинуклеотид включает ДНК и РНК, которые кодируют целевой белок. Полинуклеотид может быть введен в любой форме при условии, что он может быть введен в клетку-хозяина и экспрессирован в ней. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генетическую конструкцию, включающую все элементы, необходимые для собственной экспрессии. Метод трансформации включает любой способ введения нуклеиновой кислоты в клетку и может быть осуществлен путем выбора подходящего стандартного метода, известного в данной области техники, в зависимости от клетки-хозяина. Например, трансформация может быть выполнена использованием электропорации, преципитации фосфатом кальция (CaPO4), преципитации хлоридом кальция (CaCl2), микроинъекции, метода полиэтиленгликоля (ПЭГ), метода ДЕАЕ-декстрана, метода катионных липосом, метода с ацетатом лития-ДМСО, и т.д., но этим метод не ограничивается.
Кроме того, используемый здесь термин "функциональная связь" относится к функциональной связи между вышеуказанной полинуклеотидной последовательностью с промоторной последовательностью, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего целевой белок по настоящему изобретению, или с регуляторной областью. Действующая связь может быть получена методом рекомбинации генов, известным в данной области техники, а сайт-специфическое расщепление ДНК и лигирование может быть выполнено с использованием известных лиазы, лигазы и т.д., но этим не ограничивается.
Еще один аспект настоящего изобретения предлагает композицию для получения L-тирозина, включающую регуляторную область оперона trp и ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, функционально связанный с этой областью.
Композиция для получения L-тирозина включает регуляторную область оперона trp и ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, функционально связанный с этой областью, и может дополнительно иметь, без ограничения, конфигурацию, способную управлять геном или регуляторной областью оперона. Ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, и регуляторная область оперона trp могут быть в форме, включенной в вектор таким образом, что ген, функционально связанный и введенный в клетку хозяина, может быть экспрессирован. Экспрессия гена pheA, который является геном, кодирующим префенатдегидрогеназу, может регулироваться регуляторной областью оперона trp.
Еще один аспект настоящего изобретения предлагает способ регулирования активности префенатдегидрогеназы с использованием регуляторной области оперона trp и гена, кодирующего префенатдегидрогеназу, функционально связанного с этой областью.
Еще один аспект настоящего изобретения предлагает использование микроорганизма, продуцирующего L-тирозин, для получения L-тирозина.
Еще один аспект настоящего изобретения предлагает применение экспрессионной кассеты для получения L-тирозина.
Еще один аспект настоящего изобретения предлагает применение композиции для получения L-тирозина.
Способ осуществления изобретения
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие примеры. Однако эти Примеры приведены только в иллюстративных целях, и область применения изобретения не ограничивается этими Примерами.
Пример 1: Конструирование штамма, продуцирующего L-тирозин
Хотя Corynebacterium glutamicum дикого типа способен продуцировать L-тирозин, он не продуцирует L-тирозин в достаточном количестве для высвобождения в культуральную среду. В соответствии с целью настоящего изобретения, для идентификации генетического признака, повышающего способность к продуцированию L-тирозина, был использован штамм с повышенной способностью к продуцированию L-тирозина, а не штамм дикого типа. Таким образом, штамм, продуцирующий L-тирозин, был сконструирован путем усиления генов, необходимых для получения L-тирозина, на основе штамма Corynebacterium glutamicum АТСС 13869.
Во-первых, для увеличения поступления эритрозо-4-фосфата (Е4Р) в качестве предшественника L-тирозина, гены tkt были сверхэкспрессированы. В то же время aroP, ген-импортер ароматических аминокислот, который вводит L-тирозин в клетки, был удален.
Для генетической манипуляции сначала были получены нижележащие и вышележащие области гена aroP, в которые ген tkt следовало вставить путем замены. В частности, фрагмент гена в нижележащей области гена aroP был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, а фрагмент гена в вышележащей области гена aroP был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13869 в качестве матрицы, посредством ПЦР. Полимераза Solg™ Pfu-X DNA была использована в качестве полимеразы, и ПЦР проводили в условиях ПЦР-амплификации: с денатурацией при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 60 секунд, и последующей полимеризацией при 72°С в течение 5 минут.
Кроме того, для получения гена tkt, включающего промотор tkt, фрагмент гена tkt, включающий промотор tkt, был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС 13869 в качестве матрицы посредством ПЦР. Полимеразу Solg™ Pfu-X DNA использовали в качестве полимеразы, и ПЦР проводили в условиях ПЦР-амплификации: с денатурацией при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 150 секунд, и последующей полимеризацией при 72°С в течение 5 минут.
Амплифицированные вышележащие и нижележащие области промотора aroP, фрагмент гена tkt, включающий промотор tkt и вектор pDZ (Патент Кореи №10-0924065) для хромосомной трансформации расщепляли рестриктазой SmaI и клонировали с использованием метода сборки Гибсона (DG Gibson et at, NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) с целью получения рекомбинантной плазмиды, которая называется pDZ-ΔaroP::Pn-tkt. Клонирование проводили путем смешивания реагента для сборки Гибсона и каждого из фрагментов гена в рассчитанном количестве молей с последующей инкубацией при 50°С в течение 1 часа.
Последовательности праймеров, используемых для построения каждого из векторов, показаны в таблице 1 ниже.
Сконструированный вектор pDZ-ΔaroP::Pn-tkt трансформировали в штамм Corynebacterium glutamicum АТСС 13869 методом электропорации и затем подвергали вторичному кроссинговеру для получения штамма, в который был вставлен ген tkt, включающий промотор tkt, при одновременном удалении гена aroP. Соответствующие генетические манипуляции подтверждали с помощью секвенирования генома и метода ПЦР, с использованием праймеров SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, который может соответственно амплифицировать внешнюю область вышележащей области и нижележащей области гомологичной рекомбинации, куда был вставлен соответствующий ген, а полученный штамм был назван СМ06-0001.
Для усиления пути L-тирозина, ген tyrA, регулируемый обратной связью посредством L-тирозина, которой обладает Corynebacterium glutamicum, заменяли вариантом tyrA, не регулируемым обратной связью, полученным из Е. coli, включая сильный промотор gapA. Известно, что в белке tyrA, полученном из Е. coli, обратная связь ослабевает, когда метионин в положении 53 мутирован в изолейцин, а аланин в положении 354 мутирован в валин, и используется эта форма белка (SEQ ID NO: 10) (Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 103-110 (2007)).
Для генетической манипуляции сначала были получены вышележащие и нижележащие области гена tyrA, в которые ген tyrA следовало вставить путем замены. В частности, фрагмент гена в вышележащей области гена tyrA был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, а фрагмент гена в нижележащей области гена tyrA был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13869 в качестве матрицы, посредством ПЦР. Полимеразу Solg™ Pfu-X DNA использовали в качестве полимеразы, и ПЦР выполняли при следующих условиях амплификации: денатурация при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 60 секунд, с последующей полимеризацией при 72°С в течение 5 минут.
Кроме того, для того, чтобы получить вариант гена tyrA, происходящий из Е. coli, включающий промотор gapA, получали фрагмент промотора gapA с использованием праймеров SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13869, используемой в качестве матрицы, посредством ПЦР, а фрагмент гена tyrA, происходящего из Е. coli, получали с использованием праймеров SEQ-ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18 на основе синтетической ДНК варианта tyrA, в качестве матрицы, посредством ПЦР
Полимеразу SolgTM Pfu-X DNA использовали в качестве полимеразы, и ПЦР выполняли при следующих условиях амплификации: денатурация при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 60 секунд с последующей полимеризацией при 72°С в течение 5 минут
Амплифицированные вышележащие и нижележащие области гена tyrA, фрагмент варианта Е. coli-полученного гена tyrA, включающего промотор gapA, и вектор pDZ для хромосомной трансформации расщепляли рестриктазой SmaI, клонировали с использованием метода сборки Гибсона для получения рекомбинантной плазмиды, которая была названа pDZ-ΔtyrA::PgapA-tyrAm. Клонирование проводили путем смешивания реагента для сборки Гибсона и каждого из фрагментов гена в рассчитанном количестве молей с последующей инкубацией при 50°С в течение 1 часа.
Последовательности праймеров, используемых для построения каждого из векторов, показаны в Таблице 3 ниже.
Сконструированный вектор pDZ-ΔtyrA::PgapA-tyrAm был трансформирован в штамм СМ06-0001 методом электропорации, а затем подвергнут вторичному кроссинговеру для получения штамма, в который был вставлен вариант Е. со//-полученного гена tyrA, включающего промотор gapA, при одновременном удалении гена tyrA. Соответствующие генетические манипуляции были подтверждены секвенированием генома и методом ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, который может, соответственно, амплифицировать внешнюю область вышележащей области и нижележащей области гомологичной рекомбинации, куда был вставлен соответствующий ген, полученный штамм называется СМ06-0002.
Для увеличения выработки L-тирозина, ген aroG, вовлеченный в первую стадию общего пути биосинтеза ароматических аминокислот, был усилен добавлением сильного промотора к полученному из Е. coli варианту aroG, отвечающему за ослабление регулирования по принципу обратной связи. Известно, что в Е. coli-полученном белке aroG, обратная связь ослабевает (feedback is released) когда пролин в положении 150 заменяется лейцином, и когда используется эта форма белка (SEQ ID NO: 68) (Appl. Environ. Microbiol. 63, 761-762 (1997)).
Для генетических манипуляций были получены нижележащие и вышележащие области, в которые должен был быть дополнительно вставлен ген aroG. В частности, фрагмент гена в вышележащей области гена BBD29 14470 был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22, а фрагмент гена в нижележащей области гена BBD29 14470 был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13869, используемой в качестве матрицы, посредством ПЦР. Полимеразу SolgTM Pfu-X DNA использовали в качестве полимеразы, и ПЦР выполняли при следующих условиях амплификации: денатурация при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 60 секунд с последующей полимеризацией при 72°С в течение 5 минут
Амплифицированные вышележащие и нижележащие области, в которые дополнительно вставляют вариант aroG и вектор pDZ для хромосомной трансформации, расщепляли с помощью рестриктазы SmaI, клонировали с использованием метода сборки Гибсона для получения рекомбинантной плазмиды, которая была названа pDZ-Δ BBD29_14470. Клонирование проводили путем смешивания реагента для сборки Гибсона и каждого из фрагментов гена в рассчитанном количестве молей с последующей инкубацией при 50°С в течение 1 часа.
Кроме того, для получения происходящего из E.coli варианта гена aroG, включающего промотор gapA, получали фрагмент промотора gapA с использованием праймеров SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 26 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13869, используемой в качестве матрицы, посредством ПЦР, а вариант фрагмента происходящего из Е. coli гена aroG получали с использованием праймеров SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28 на основе синтетической ДНК происходящего из Е. coli варианта aroG, ослабляющего обратную связь, в качестве матрицы, посредством ПЦР. Полимеразу SolgTM Pfu-X DNA использовали в качестве полимеразы и ПЦР выполняли при следующих условиях амплификации: денатурация при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 60 секунд с последующей полимеризацией при 72°С в течение 5 минут
Амплифицированный фрагмент варианта гена aroG, включающего промотор gapA, и вектор pDZ-ΔBBD29 14470 для хромосомной трансформации расщепляли рестриктазой SeaI и клонировали с использованием метода сборки Гибсона для получения рекомбинантной плазмиды, которая была названа pDZ-ΔBBD29_14470::PgapA-aroGm. Клонирование проводили путем смешивания реагента для сборки Гибсона и каждого из фрагментов гена в рассчитанном количестве молей с последующей инкубацией при 50°С в течение 1 часа.
Последовательности праймеров, используемые для конструирования каждого из векторов, показаны в Таблице 5 ниже.
Сконструированным вектором pDZ-ΔBBD29 14470::PgapA-aroGm
трансформировали штамм СМ06-0002 методом электропорации и затем подвергали вторичному кроссинговеру для получения штамма, в который был вставлен ослабляющий обратную связь Е. coli-полученный вариант гена aroG, включающий промотор gapA. Соответствующие генетические манипуляции были подтверждены посредством секвенирования генома и метода ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30, который может соответственно амплифицировать внешнюю область вышележащей области и нижележащей области гомологичной рекомбинации, куда был вставлен соответствующий ген, полученный штамм называется СМ06-0003.
Пример 2: Оценка продуцирующей способности штаммов, продуцирующих L-Тирозин
Для подтверждения способности штаммов, сконструированных в примере 1, к продуцированию L-тирозина, штаммы культивировали и оценивали следующим образом. Каждый из штаммов инокулировали в 250-мл колбу с угловой перегородкой, содержащую 25 мл следующей посевной среды и культивировали при встряхивании при 200 об/мин при 30°С в течение 20 часов. Затем 1 мл раствора для посева инокулировали в 250-мл колбу с угловой перегородкой, содержащую 25 мл среды для продуцирования и культивировали при встряхивании при 200 об/мин при 30°С в течение 24 часов. После культивирования количество продуцированного L-тирозина, L-фенилаланина и L-триптофана измеряли с помощью ВЭЖХ.
Посевная среда (рН 7,0)
20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH2PO4, 8 г K2HPO4, 0,5 г MgSO4⋅7H2O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамина HCl, 2000 мкг пантотената кальция и 2000 мкг никотинамида (на литр дистиллированной воды)
Среда для продуцирования (рН 7,0)
30 г глюкозы, 15 г (NH4)2SO4, 1,2 г MgS04.7H2O, 1 г KH2PO4, 5 г дрожжевого экстракта, 900 мкг биотина, 4500 мкг тиамина HCl, 4500 мкг пантотената кальция и 30 г СаСО3 (на литр дистиллированной воды).
Результаты продуцирования L-тирозина, L-фенилаланина и L-триптофана в культурах дикого типа Corynebacterium glutamicum АТСС 13869, СМ06-0001, СМ06-0002 и СМ06-0003 приведены в Таблице 7.
L-тирозин не продуцировался в штамме СМ06-0001, в котором повышено поступление Е4Р, предшественника, полученного путем удаления гена импортера ароматических аминокислот из штамма дикого типа, и L-тирозин также не был обнаружен в СМ06-0002, в котором ингибирование обратной связи tyrA было дополнительно ослаблено в СМ06-0001.
Продуцирование L-тирозина и L-фенилаланина было подтверждено в штамме СМ06-0003, в котором общий путь синтеза ароматических соединений усиливался в результате ослабления ингибирования обратной связи aroG в штамме СМ06-0002. Кроме того, продуцирование L-тирозина и L-фенилаланина значительно увеличилось по сравнению с предыдущими штаммами, тогда как не было резкого изменения в продуцировании L-триптофана.
Пример 3: Делеция гена pheA у штаммов, продуцирующих L-тирозин
Было подтверждено, что при усилении общего пути синтеза ароматических соединений в Примере 2 L-фенилаланин продуцировался в наибольшем количестве, за ним следовало продуцирование L-тирозина, а L-триптофан продуцировался в небольшом количестве. Следовательно, можно ожидать, что продуцирование L-тирозина и L-триптофана увеличится, если путь синтеза L-фенилаланина будет удален.
Чтобы удалить путь синтеза L-фенилаланина, был удален ген pheA, участвующий в первой стадии ответвления от префеновой кислоты. Для такого удаления гена, сначала были получены вышележащие и нижележащие области гена pheA. В частности, фрагмент гена в вышележащей области гена pheA был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32, и фрагмент гена в нижележащей области гена pheA был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13869, используемой в качестве матрицы, посредством ПЦР. Полимеразу SolgTM Pfu-X DNA использовали в качестве полимеразы, и ПЦР выполняли при следующих условиях амплификации: денатурация при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 60 секунд с последующей полимеризацией при 72°С в течение 5 минут
Амплифицированные вышележащие и нижележащие области гена pheA и вектор pDZ для хромосомной трансформации расщепляли с помощью рестриктазы SmaI и клонировали с использованием метода сборки Гибсона для получения рекомбинантной плазмиды, которая была названа pDZ-ΔpheA. Клонирование проводили путем смешивания реагента для сборки Гибсона и каждого из фрагментов гена в рассчитанном количестве молей с последующей инкубацией при 50°С в течение 1 часа.
Последовательности праймеров, используемые для построения каждого из векторов, показаны в Таблице 8 ниже.
Сконструированный вектор pDZ-ΔpheA трансформировали в штамм СМ06-0003 методом электропорации и затем подвергли вторичному кроссинговеру для получения штамма, в котором удален pheA. Соответствующие генетические манипуляции были подтверждены посредством секвенирования генома и метода ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36, который, соответственно, может амплифицировать внешнюю область вышележащей области и нижележащей области гомологичной рекомбинации, откуда соответствующий ген был удален, полученный штамм называется СМ06-0004.
Пример 4: Оценка продуцирующей способности штаммов, продуцирующих L-тирозин, у которых удален ген pheA
Для подтверждения способности штаммов, сконструированных в Примере 3, к продуцированию L-тирозина, штаммы культивировали с использованием метода и композиций среды, описанных в Примере 2.
Результаты продуцирования L-тирозина, L-фенилаланина и L-триптофана в культурах штаммов, продуцирующих L-тирозин, СМ06-0003 и СМ06-0004, приведены в Таблице 10 выше. Штамм СМ06-0004, в котором удален pheA, продуцирует L-тирозин в качестве основного продукта со значительным снижением продукции L-фенилаланина. Как и в Примере 2, существенных изменений в продуцировании L-триптофана не наблюдали.
Однако, поскольку штамм СМ06-0004 не может продуцировать L-фенилаланин, он может расти только при наличии L-фенилаланина, содержащегося в дрожжевом экстракте среды, и демонстрирует только около 1/3 потребления сахара по сравнению со штаммом, в котором ген pheA не удален. То есть было подтверждено, что удаление гена pheA у микроорганизмов оказывает большое влияние на рост штаммов, при этом штаммы не могут быть использованы для получения целевого продукта.
Пример 5: Конструирование штаммов, продуцирующих L-тирозин, в которых заменен промотор гена pheA
Из результатов Примеров 2 и 4, можно предсказать, что концентрация L-триптофана точным образом регулируется так, чтобы не мешать росту клеток, при этом L-триптофан поддерживается в низкой концентрации в течение всего времени культивирования. Из литературы также известно, что продуцирование L-триптофана одновременно регулируется с помощью аттенюатора и промотороа в соответствии с концентрацией L-триптофана (Appl. Environ Microbiol 59 791, 1993).
Следовательно, ген pheA, продуцирующий L-фенилаланин, подвергается регуляторному механизму L-триптофана, так что регулирование гена pheA может осуществляться в соответствии с концентрацией L-триптофана.
В частности, в качестве контроля были также сконструированы и подвергнуты сравнению штаммы с введенным промотором ilvB, который позволяет регулировать pheA концентрацией L-изолейцина, а также промотором leuA и промотором leuC, которые позволяют регулировать pheA концентрацией L-лейцина, в дополнение к регуляторной области trpE, которая позволяет регулировать pheA концентрацией L-триптофана.
Для того чтобы ген pheA мог регулироваться регуляторной областью гена trpE, были получены вышележащая область, в которую следует вставить ген, регуляторная область trpE и нижележащая область, в которую следует вставить ген. В частности, фрагмент гена в вышележащей области, в которую следует вставить ген, был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38; фрагмент гена в регуляторной области trpE был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40; и фрагмент гена в нижележащей области, в которую следует вставить ген, был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 42 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13869, используемой в качестве матрицы, посредством ПЦР. Полимеразу SolgTM Pfu-X DNA использовали в качестве полимеразы, и ПЦР выполняли при следующих условиях амплификации: денатурация при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 30 секунд с последующей полимеризацией при 72°С в течение 5 минут
Амплифицированные вышележащие и нижележащие области, в которые должен быть вставлен ген, регуляторная область trpE и вектор pDZ для хромосомной трансформации расщепляли с помощью рестриктазы Smal, клонировали с использованием метода сборки Гибсона для получения рекомбинантной плазмиды, которая была названа pDZ-ΔPpheA::PtrpE. Клонирование проводили путем смешивания реагента для сборки Гибсона и каждого из фрагментов гена в рассчитанном количестве молей с последующей инкубацией при 50°С в течение 1 часа.
Для достижения регулирования гена pheA промотором гена ilvB, были получены вышележащая область, в которую должен быть вставлен ген, область промотора гена ilvB и нижележащая область, в которую должен быть вставлен ген. В частности, фрагмент гена в вышележащей области, в которую должен быть вставлен ген, был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 43, фрагмент гена в промоторной области гена ilvB был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 45, и фрагмент гена в нижележащей области, в которую должен быть вставлен ген, был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 42 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13869, используемой в качестве матрицы, посредством ПЦР. Полимеразу SolgTM Pfu-X DNA использовали в качестве полимеразы, и ПЦР выполняли при следующих условиях амплификации: денатурация при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 30 секунд с последующей полимеризацией при 72°С в течение 5 минут
Амплифицированные вышележащие и нижележащие области, в которые должен быть вставлен ген, область промотора гена ilvB и вектор pDZ для хромосомной трансформации расщепляли с помощью рестриктазы SmaI, клонировали с использованием метода сборки Гибсона для получения рекомбинантной плазмиды, которая была названа pDZ-ΔPpheA::PilvB. Клонирование проводили путем смешивания реагента для сборки Гибсона и каждого из фрагментов гена в рассчитанном количестве молей с последующей инкубацией при 50°С в течение 1 часа.
Для того, чтобы ген pheA мог регулироваться промотором гена leuA, были получены вышележащая область, в которую ген должен быть вставлен, область промотора leuA, и нижележащая область, в которую ген должен быть вставлен. В частности, фрагмент гена в вышележащей области, в которую ген должен быть вставлен, был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 47, фрагмент гена в области промотора leuA был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49, и фрагмент гена в нижележащей области, в которую ген должен быть вставлен, был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 42 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13869, используемой в качестве матрицы, посредством ПЦР. Полимеразу SolgTM Pfu-X DNA использовали в качестве полимеразы, и ПЦР выполняли при следующих условиях амплификации денатурация при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 30 секунд с последующей полимеризацией при 72°С в течение 5 минут
Амплифицированные вышележащие и нижележащие области, в которые ген должен быть вставлен, область промотора leuA и вектор pDZ для хромосомной трансформации расщепляли с помощью рестриктазы SmaI, клонировали с использованием метода сборки Гибсона для получения рекомбинантной плазмиды, которая была названа pDZ-ΔPpheA::PleuA. Клонирование проводили путем смешивания реагента для сборки Гибсона и каждого из фрагментов гена в рассчитанном количестве молей с последующей инкубацией при 50°С в течение 1 часа.
Для того, чтобы ген pheA мог регулироваться промотором leuC, были получены вышележащая область, в которую должен быть вставлен ген, область промотора leuC и нижележащая область, в которую должен быть вставлен ген. В частности, фрагмент гена в вышележащей области, в которую ген должен быть вставлен, был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 51, фрагмент гена в области промотора leuC был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 53, а фрагмент гена в нижележащей области, в которую ген должен быть вставлен, был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 54 и SEQ ID NO: 42 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13869, используемой в качестве матрицы, посредством ПЦР. Полимеразу SolgTM Pfu-X DNA использовали в качестве полимеразы, и ПЦР выполняли при следующих условиях амплификации: денатурация при 95°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 60°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 30 секунд с последующей полимеризацией при 72°С в течение 5 минут
Амплифицированные вышележащие и нижележащие области, в которуые ген должен быть вставлен, область промотора гена leuC и вектор pDZ для хромосомной трансформации расщепляли с помощью рестриктазы SmaI и клонировали с использованием метода сборки Гибсона для получения рекомбинантной плазмиды, которая была названа pDZ-ΔPpheA::PleuC. Клонирование проводили путем смешивания реагента для сборки Гибсона и каждого из фрагментов гена в рассчитанном количестве молей с последующей инкубацией при 50°С в течение 1 часа.
Сконструированные векторы pDZ-ΔPpheA::PtrpE, pDZ-ΔPpheA::PilvB, pDZ-ΔPpheA::PleuA, и pDZ-ΔPpheA::PleuC трансформировали в штамм СМ06-0003 методом электропорации, а затем подвергали вторичному кроссинговеру для получения штаммов, в которых ген pheA мог регулироваться регуляторной областью trpE или промотором ilvB, leuA или leuC. Соответствующие генетические манипуляции были подтверждены посредством секвенирования генома и метода ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 56, который может соответственно амплифицировать внешнюю область вышележащей области и нижележащей области гомологичной рекомбинации, в которую была вставлена соответствующая регуляторная область или промотор. Полученный штамм, в который была вставлена регуляторная область trpE выше гена pheA, был назван СМ06-0005, полученный штамм, в который был вставлен промотор ilvB, был назван СМ06-0006, полученный штамм, в который был вставлен промотор leuA, был назван СМ06-0007, а полученный штамм, в который был вставлен промотор leuC, был назван СМ06-0008.
Последовательности праймеров, используемые для построения каждого из векторов, показаны в Таблице 11 ниже.
Пример 6: Оценка продуцирующей способности штаммов с заменой
промотора гена pheA штаммов, продуцирующих L-тирозин
Для подтверждения L-тирозин-продуцирующей способности штаммов, сконструированных в Примере 5, штаммы культивировали с использованием метода и композиций среды, описанных в Примере 2.
Результаты продуцирования L-тирозина, L-фенилаланина и L-триптофана в культурах штаммов, продуцирующих L-тирозин, СМ06-0003, СМ06-0004, СМ06-0005, СМ06-0006, СМ06-0007 и СМ06-0008 показаны в Таблице 12 выше.
Для штамма СМ06-0004, в котором удален pheA, L-тирозин был получен с выходом 5,08%. Таким образом, в случае штамма СМ06-0005, в котором путь L-фенилаланина мог регулироваться концентрацией L-триптофана, он продуцировал L-тирозин с продуцированием L-фенилаланина в небольшом количестве, и при этом можно было ожидать более высокого выхода L-тирозина по сравнению со штаммом СМ06-0003, в котором путь L-фенилаланина не регулировался, и можно было ожидать более низкого его выхода по сравнению со штаммом СМ06-0004, в котором был удален путь L-фенилаланина. Однако, вопреки ожиданиям, штамм СМ06-0005 показал улучшенную продуцирующую способность по сравнению со штаммом СМ06-0004, продуцируя L-тирозин с выходом 5,37%. Продуцирование L-тирозина штаммом СМ06-0005 увеличилось на 283% по сравнению с исходным штаммом СМ06-0003 и на 144% по сравнению со штаммом СМ06-0004. Приведенные выше результаты подтверждают, что когда pheA может регулироваться концентрацией L-триптофана, продуцирование L-тирозина может значительно увеличиться до неожиданного уровня. Кроме того, в качестве контроля, аналогичного применению L-триптофан-регуляторного механизма на ген pheA, продуцирование L-тирозина было значительно увеличено по сравнению с СМ06-0006 штаммом, в котором pheA мог регулироваться концентрацией L-изолейцина, и штаммами СМ06-0007 и СМ06-0008, в которых регулирование pheA осуществлялось концентрацией L-лейцина. Таким образом, было подтверждено, что введение механизма регулирования L-триптофана на pheA оказывает больший синергетический эффект на продуцирование L-тирозина по сравнению с удалением pheA или введением других механизмов регулирования.
Пример 7: Конструирование штаммов, продуцирующих L-тирозин, с системой, отличной от фосфотрансферазной (PTS), у которых удален ген pheA, и штаммов, у которых заменен промотор
Поскольку продуцирование L-тирозина начинается с PEP и Е4Р в качестве предшественников, использование системы, отличной от фосфотрансферазной системы (PTS), может обеспечить увеличение поставок PEP, и, следовательно, возможно высокое продуцирование L-тирозина (Nature biotechnol 14 620, 1996). Поэтому, ptsG, ген PTS штамма, был удален, и был введен Zymomonas mobilis АТСС10988-полученный glf ген, не относящийся к PTS.
Для удаления ptsG и вставки glf были получены вышележащие и нижележащие области, в которые следовало вставить glf, полученный из Zymomonas mobilis. В частности, фрагмент гена в вышележащей области гена ptsG был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58, а фрагмент гена в нижележащей области гена ptsG был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 60 на основе хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13869, используемой в качестве матрицы, посредством ПЦР. Полимеразу SolgTM Pfu-X DNA использовали в качестве полимеразы, и ПЦР выполняли при следующих условиях амплификации денатурация при 95 С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95 С в течение 30 секунд, отжига при 60 С в течение 30 секунд и полимеризации при 72 С в течение 60 секунд с последующей полимеризацией при 72 С в течение 5 минут
Кроме того, для того, чтобы получить ген glf включающий хорошо известный промотор cj7 (SEQ ID NO: 61, Патент Кореи No. 10-0620092), фрагмент промотора cj7 был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 63 на основании синтетической ДНК промотора cj7 в качестве матрицы, посредством ПЦР, и фрагмент гена glf был получен с использованием праймеров SEQ ID NO: 64 и SEQ ID NO: 65 на основании хромосомной ДНК Zymomonas mobilis АТСС10988 в качестве матрицы посредством ПЦР. Полимеразу SolgTM Pfu-X DNA использовали в качестве полимеразы, и ПЦР выполняли при следующих условиях амплификации денатурация при 95 С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами денатурации при 95 С в течение 30 секунд, отжига при 60 С в течение 30 секунд и полимеризации при 72 С в течение 60 секунд с последующей полимеризацией при 72 С в течение 5 минут
Амплифицированные вышележащие и нижележащие области гена ptsG, фрагмент гена glf включающий промотор cj7, и вектор pDZ для хромосомной трансформации расщепляли рестриктазой SeaI и клонировали с использованием метода сборки Гибсона для получения рекомбинантной плазмиды, которая была названа pDZ-ΔptsG::pcj7-glf. Клонирование проводили путем смешивания реагента для сборки Гибсона и каждого из фрагментов гена в рассчитанном количестве молей с последующей инкубацией при 50°С в течение 1 часа.
Последовательности праймеров, используемые в Примере 7, показаны в Таблице 13 ниже.
Сконструированный вектор pDZ-ΔptsG::pcj7-glf трансформировали в штамм СМ06-0003 методом электропорации и затем подвергали вторичному кроссинговеру для получения штамма, в который был вставлен Zymomonas mobilis-полученный ген glf включающий промотор cj7. Соответствующие генетические манипуляции были подтверждены посредством секвенирования генома и метода ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 66 и SEQ ID NO: 67, который может соответственно амплифицировать внешнюю область вышележащей области и нижележащей области гомологичной рекомбинации, куда был вставлен соответствующий ген. Полученный штамм называется СМ06-0009.
Вектор pDZ-ΔpheA, сконструированный в Примере 3, трансформировали в штамм СМ06-0009, созданный выше, методом электропорации и затем подвергали вторичному кроссинговеру для получения штамма, в котором был удален ген pheA. Соответствующие генетические манипуляции были подтверждены посредством секвенирования генома и метода ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36, который может, соответственно, амплифицировать внешнюю область вышележащей области и нижележащей области гомологичной рекомбинации, откуда соответствующий ген был удален. Полученный штамм называется СМ06-0011.
Каждый из векторов pDZ-ΔPpheA::PtrpE, pDZ-ΔPpheA::PilvB, pDZ-ΔPpheA::PleuA, and pDZ-ΔPpheA::PleuC, сконструированных в Примере 5, был трансформирован в штамм СМ06-0009, сконструированный выше, методом электропорации и затем подвергнут вторичному кроссинговеру для получения штаммов, в которые регуляторная область или промотор вставлены выше гена pheA. Соответствующие генетические манипуляции были подтверждены посредством секвенирования генома и метода ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 56, который может, соответственно, амплифицировать внешнюю область вышележащей области и нижележащей области гомологичной рекомбинации, куда вставлена соответствующая регуляторная область или промотор. Полученный штамм, в который регуляторная область trpE вставлена выше гена pheA, называется СМ06-0010, полученный штамм, в который вставлен промотор ilvB, называется СМ06-0012, полученный штамм, в который вставлен промотор leuA, называется СМ06-0013, и полученный штамм, в который вставлен промотор leuC называется СМ06-0014.
Пример 8: Оценка продуцирующей способности штаммов, продуцирующих L-тирозин, с системой, отличной от фосфотрансферазной (PTS), у которых удален ген pheA, и штаммов, у которых заменен промотор
Для подтверждения способности штаммов, сконструированных в Пример 7, к продуцированию L-тирозина, штаммы культивировали с использованием метода и композиции среды, описанных в Примере 2.
Результаты продуцирования L-тирозина, L-фенилаланина и L-триптофана в культурах штаммов, продуцирующих L-тирозин, СМ06-0003, СМ06-0009, СМ06 - ООП, СМ06-0010, СМ06-0012, СМ06-0013 и СМ06-0014, показаны в таблице 15 выше.
Как и ожидалось, было подтверждено, что продуцирование L-тирозина и L-фенилаланина было увеличено в штамме СМ06-0009, не являющимся штаммом с PTS, способным усиливать подачу PEP, по сравнению со штаммом СМ06-0003, который является штаммом с PTS. Аналогично, в этом случае не наблюдалось значительного увеличения продуцирования L-триптофана.
В случае штамма СМ06-0011, в котором был удален pheA, на основе штамма, не являющимся штаммом с PTS, было подтверждено, что, хотя продуцирование L-тирозина было увеличено по сравнению с исходным штаммом с выходом 5,85%, конечное количество продуцируемого L-тирозина было уменьшено по сравнению с родительским штаммом, а продуктивность была снижена из-за очень низкого потребления сахара. Как и в Примере 6, можно было ожидать, что штамм СМ06-0010 может продуцировать L-тирозин с более низким выходом. Однако на самом деле СМ06-0010 продуцировал L-тирозин с выходом 7,06%, который был увеличен на 20,7% по сравнению со штаммом СМ06-0011. Кроме того, количество L-тирозина, продуцируемого штаммом СМ06-0010 было увеличено на 45% по сравнению с родительским штаммом СМ06-0009 и на 91% по сравнению со штаммом СМ06-0011. Кроме того, было также подтверждено, что продуцирование L-тирозина было значительно увеличена как по сравнению со штаммом СМ06-00012, у которого концентрация L-изолейцина могла регулировать pheA, так и со штаммами СМ06-00013 и СМ06-00014, в которых концентрация L-лейцина могла регулировать pheA, тем самым подтверждая, что введение механизма регулирования L-триптофаном в pheA оказывает больший синергетический эффект на продуцирование L-тирозина по сравнению с удалением pheA или введением других механизмов регулирования.
Пример 9. Скрининг микроорганизмов, устойчивых к аналогам L-тирозина
В этом Примере, чтобы ослабить ингибирование по принципу обратной связи L-тирозина на основе Corynebacterium glutamicum АТСС 13869 в качестве родительского штамма, был проведен эксперимент по отбору штаммов, устойчивых к гидроксамату L-тирозина, который является аналогом L-тирозина, с использованием метода искусственной мутации.
В частности, мутация была индуцирована методом искусственного мутагенеза с использованием N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина (далее именуемого NTG). Штамм АТСС 13869 культивировали в посевной среде в течение 18 часов и инокулировали в 4 мл посевной среды, а затем культивировали до тех пор, пока OD660 не достигал примерно 1,0. После центрифугирования культуральной среды для выделения клеток, которые дважды промывали 50 mM Трис-малатным буфером (рН 6,5) и суспендировали в конечном объеме, составляющем 4 мл этого же буфера. Раствор NTG (2 мг/мл в 0,05 Μ Tris-малатного буфера (рН 6,5)) добавляли к суспензии клеток до конечной концентрации 150 мг/л, и полученному продукту давали постоять при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем центрифугировали для сбора клеток, и клетки дважды промывали тем же буфером для удаления NTG. Окончательно промытые клетки суспендировали в 4 мл 20%-го раствора глицерина и хранили при -70°С до использования. NTG-обработанные штаммы высевали в минимальной среде, содержащей 0,5 г/л гидроксамат L-тирозина и благодаря этому процессу было получено 100 штаммов, обладающих устойчивостью к гидроксамат L-тирозину.
Пример 10. Оценка способности штаммов, устойчивых к гидроксамату L-тирозина, продуцировать L-тирозин
Была подтверждена L-тирозин-продуцирующая способность устойчивых к гидроксамату L-тирозина 100 штаммов, полученных в Примере 9. Каждый из 100 штаммов, полученных в Примере 9, инокулировали в 250-мл колбу с угловой перегородкой, содержащую 25 мл посевной среды, а затем культивировали при встряхивании при 200 об/мин при 30°С в течение 20 часов. Затем 1 мл раствора посевной культуры инокулировали в 250-мл колбе с угловой перегородкой, содержащей 24 мл среды для продуцирования и культивировали при встряхивании при 200 об/мин при 30°С в течение 48 часов.
После культивирования количество продуцируемых аминокислот измеряли методом ВЭЖХ. Среди 100 протестированных штаммов концентрация аминокислот в культивируемой среде для 10 лучших штаммов, которые показали отличную способность продуцировать L-тирозин, показана в таблице 16. 10 штаммов-кандидатов, идентифицированных с помощью вышеупомянутого процесса, были названы как АТСС 13869 YAR-1 и АТСС 13869 YAR-10 соответственно.
Среди них были отобраны штаммы АТСС 13869 YAR-6 и АТСС 13869 YAR-8, обладающие самой высокой способностью продуцировать L-тирозин.
Пример 11. Замена промотора гена pheA у штаммов, обладающих устойчивостью к гидроксамату L-тирозина
Ген pheA штаммов АТСС 13869 YAR-6 и YAR-8, отобранных в Пример 10, может регулироваться регуляторной областью оперона trp.С этой целью, вектор pDZ-ΔPpheA::PtrpE, сконструированный в Примере 5, трансформировали в каждый из штаммов АТСС 13869 YAR-6 и YAR-8 методом электропорации и затем подвергали вторичному кроссинговеру для получения штаммов, в которых ген pheA мог регулироваться регуляторной областью trpE. Соответствующие генетические манипуляции были подтверждены посредством секвенирования генома и метода ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 56, который может, соответственно, амплифицировать внешнюю область вышележащей области и нижележащей области гомологичной рекомбинации, куда была вставлена соответствующая регуляторная область. Полученные штаммы АТСС 13869 YAR-6 и YAR-8, в которые была вставлена регуляторная область trpE выше гена pheA, были названы, как YAR-6P и YAR-8P, соответственно.
Пример 12. Оценка продуцирующей способности устойчивых к гидроксамату L-тирозина штаммов АТСС 13869, в которых был заменен промотор гена pheA
Для подтверждения способности штаммов, сконструированных в Примере 11, к продуцированию L-тирозина, штаммы культивировали с использованием метода и композиции среды, описанных в Примере 2.
Результаты продуцирования L-тирозина, L-фенилаланина и L-триптофана в культурах штаммов АТСС 13869, устойчивых к гидроксамат L-тирозину, и штаммов, в которых заменен промотор гена pheA, показаны в Таблице 17 выше.
Как и в Примерах 6 и 8, где ген pheA может регулироваться регуляторной областью trpE, можно ожидать снижения продуцирования L-фенилаланина и увеличения продуцирования L-тирозина. Фактические экспериментальные результаты подтвердили, что в штаммах АТСС 13869 YAR-6P и АТСС 13869 YAR-8P значительно снижается продуцирование L-фенилаланина в качестве побочного продукта и увеличивается продуцирование L-тирозина в качестве целевого продукта, причем на более высоком уровне по сравнению с сокращением продуцирования L-фенилаланина. Основываясь на этих результатах, было подтверждено, что при использовании механизма регулирования гена pheA L-триптофаном количество продуцируемого L-тирозина может быть значительно повышено до непредсказуемого уровня без снижения нормы потребления сахара, и комбинация регуляторной области оперона trp и гена pheA может привести к значительному синергетическому эффекту на продуцирование L-тирозина.
Приведенные выше результаты подтвердили, что продуцирование L-тирозина было значительно увеличено до неожиданного уровня, при регулировании гена pheA концентрацией L-триптофана. В конкретном примере было подтверждено, что продуцирование L-тирозина было значительно увеличено до неожиданного уровня даже у случайно мутировавших штаммов, а также у штаммов, которые были модифицированы для повышения способности продуцировать L-тирозин.
Штамм СМ06-0010 был депонирован в Корейском культурном центре микроорганизмов (KCCM), Международном органе по депонированию, в соответствии с Будапештским договором 15 апреля 2019 года, с регистрационным номером KCCM12487P.
Исходя из вышесказанного, специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение, сможет понять, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без изменения технических концепций или существенных характеристик настоящего изобретения. В этой связи примеры воплощений, раскрытые в настоящем документе, предназначены только для иллюстративных целей и не должны истолковываться как ограничивающие рамки настоящего изобретения. Напротив, настоящее изобретение предназначено для охвата не только примерных воплощений, но также различных альтернатив, модификаций, эквивалентов и других воплощений, которые могут быть включены в сущность и объем настоящего изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
--->
<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> L-TYROSINE-PRODUCING MICROORGANISM AND METHOD FOR PRODUCING
L-TYROSINE USING THE SAME
<130> OPA20084
<150> KR 10-2019-0071797
<151> 2019-06-17
<160> 68
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 294
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223>регуляторнаяобластьоперона ttp
<400> 1
taattgagac aagcttccca ctatgtgata aagtcccatt ttgtgaataa ctcttgtctc 60
agtcaaagca cccagtggtg gtggcgcgct aactaagcga gcctgacacc tcaagttgtt 120
ttcactttga tgaatttttt aaggctcgta cttcgttcga cgaagaagcg ggccttttgt 180
ggtttttagc ccacaaccgg caagccctgg atcgaatgaa gctcgcagcg agtaattatt 240
tgatgtttcc cagaaaggct tcagccccac aatgatttcc tcggtaggtg cccc 294
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 2
tcgagctcgg taccctggga acttgtcgac gctat 35
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 3
tgttcggcaa gcattgtggt gtgggcaatg atcac 35
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 4
attaacggtt aaagtactca ttgtgaggtg gcggg 35
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 5
ctctagagga tccccggagc tgctgtccaa cgtgg 35
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 6
ccacaccaca atgcttgccg aacatttttc ttttc 35
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 7
cacaatgagt actttaaccg ttaatggagt ccttg 35
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 8
acgcgccaag tcggacg 17
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 9
cgcacgatgt ttacctgcg 19
<210> 10
<211> 1122
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223>ген tyrA
<400> 10
atggttgctg aattgaccgc attacgcgat caaattgatg aagtcgataa agcgctgctg 60
aatttattag cgaagcgtct ggaactggtt gctgaagtgg gcgaggtgaa aagccgcttt 120
ggactgccta tttatgttcc ggagcgcgag gcatctattt tggcctcgcg tcgtgcagag 180
gcggaagctc tgggtgtacc gccagatctg attgaggatg ttttgcgtcg ggtgatgcgt 240
gaatcttact ccagtgaaaa cgacaaagga tttaaaacac tttgtccgtc actgcgtccg 300
gtggttatcg tcggcggtgg cggtcagatg ggacgcctgt tcgagaagat gctgaccctc 360
tcgggttatc aggtgcggat tctggagcaa catgactggg atcgagcggc tgatattgtt 420
gccgatgccg gaatggtgat tgttagtgtg ccaatccacg ttactgagca agttattggc 480
aaattaccgc ctttaccgaa agattgtatt ctggtcgatc tggcatcagt gaaaaatggg 540
ccattacagg ccatgctggt ggcgcatgat ggtccggtgc tggggctaca cccgatgttc 600
ggtccggaca gcggtagcct ggcaaagcaa gttgtggtct ggtgtgatgg acgtaaaccg 660
gaagcatacc aatggtttct ggagcaaatt caggtctggg gcgctcggct gcatcgtatt 720
agcgccgtcg agcacgatca gaatatggcg tttattcagg cactgcgcca ctttgctact 780
tttgcttacg ggctgcacct ggcagaagaa aatgttcagc ttgagcaact tctggcgctc 840
tcttcgccga tttaccgcct tgagctggcg atggtcgggc gactgtttgc tcaggatccg 900
cagctttatg ccgacatcat tatgtcgtca gagcgtaatc tggcgttaat caaacgttac 960
tataagcgtt tcggcgaggc gattgagttg ctggagcagg gcgataagca ggcgtttatt 1020
gacagtttcc gcaaggtgga gcactggttc ggcgattacg tgcagcgttt tcagagtgaa 1080
agccgcgtgt tattgcgtca ggcgaatgac aatcgccagt aa 1122
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 11
ttcgagctcg gtaccctatc aaaaccgagt tcttcc 36
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 12
gtcgttttta ggcctcctga caagtgtggc acatac 36
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 13
tgacaatcgc cagtaatttt atcggctgat gattct 36
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 14
actctagagg atccccaacg cgattgcatt cggctc 36
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 15
gtgccacact tgtcaggagg cctaaaaacg accgag 36
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 16
tcaattcagc aaccatgttg tgtctcctct aaagat 36
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 17
ttagaggaga cacaacatgg ttgctgaatt gaccgc 36
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 18
tcatcagccg ataaaattac tggcgattgt cattcg 36
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 19
gcccactagt cgaatccc 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 20
ctgtccgcaa cctgtgcg 18
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 21
tcgagctcgg taccccccgg cggtatcgag gtagt 35
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 22
gacaagttta gtactttaat cacccgcggg gaccc 35
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 23
ggtgattaaa gtactaaact tgtcccgagg gtgag 35
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 24
ctctagagga tcccctatca gtcacttccc tgaga 35
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 25
gcgggtgatt aaagtgaggc ctaaaaacga ccgag 35
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 26
gttctgataa ttcatgttgt gtctcctcta aagat 35
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 27
atgaattatc agaacgacga 20
<210> 28
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 28
cgggacaagt ttagtttacc cgcgacgcgc tttta 35
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 29
ttgatatgac cgcagcctga 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 30
ctgcattctc atcgatcttg 20
<210> 31
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 31
ttcgagctcg gtacccccga ccaggccaca cgcg 34
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 32
aataatccgg ccggccatgg ggttacacag cttaacccgc 40
<210> 33
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 33
cgggttaagc tgtgtaaccc catggccggc cggattatt 39
<210> 34
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 34
cgactctaga ggatccccgc tgacaacagc aacgtcg 37
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 35
ccagcgatga tcgcgccg 18
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 36
atcgccgtgg agccagcc 18
<210> 37
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 37
ttcgagctcg gtacccggag gggtttccac ctcg 34
<210> 38
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 38
tgggaagctt gtctcaatta tgtctgttgc tcaattagcg 40
<210> 39
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 39
ctaattgagc aacagacata attgagacaa gcttccca 38
<210> 40
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 40
aattggtgcg tcgctcatgg ggcacctacc gaggaa 36
<210> 41
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 41
ttcctcggta ggtgccccat gagcgacgca ccaattgttg 40
<210> 42
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 42
cgactctaga ggatcccccc gaagagttcg gctgcg 36
<210> 43
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 43
cagcgctaat cttggctctg tctgttgctc aattagcg 38
<210> 44
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 44
ctaattgagc aacagacaga gccaagatta gcgctgaa 38
<210> 45
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 45
aattggtgcg tcgctcatcc gctcaggggc ggcgg 35
<210> 46
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 46
tccgccgccc ctgagcggat gagcgacgca ccaattgttg 40
<210> 47
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 47
ggggggaact ttggagtttg tctgttgctc aattagcg 38
<210> 48
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 48
ctaattgagc aacagacaaa ctccaaagtt ccccccc 37
<210> 49
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 49
aattggtgcg tcgctcattg tgttcaacct tcttaaaaag 40
<210> 50
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 50
ttaagaaggt tgaacacaat gagcgacgca ccaattgttg 40
<210> 51
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 51
aaatgtaaga ttcaaagatg tctgttgctc aattagcg 38
<210> 52
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 52
ctaattgagc aacagacatc tttgaatctt acatttcata g 41
<210> 53
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 53
aattggtgcg tcgctcatgg aactcaccgt ccttac 36
<210> 54
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 54
gtaaggacgg tgagttccat gagcgacgca ccaattgttg 40
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 55
ccagcgatga tcgcgccg 18
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 56
atcgccgtgg agccagcc 18
<210> 57
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 57
ttcgagctcg gtacccgagg gctcactgac gttga 35
<210> 58
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 58
cgctgggatg tttctaccgg attcgattcc tcag 34
<210> 59
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 59
cgctcccaga agtaggctca aaccttgccc ataac 35
<210> 60
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 60
ctctagagga tccccctccc ccaaaccacg ctttt 35
<210> 61
<211> 318
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223>промотор cj7
<400> 61
agaaacatcc cagcgctact aatagggagc gttgaccttc cttccacgga ccggtaatcg 60
gagtgcctaa aaccgcatgc ggcttaggct ccaagatagg ttctgcgcgg ccgggtaatg 120
catcttcttt agcaacaagt tgaggggtag gtgcaaataa gaacgacata gaaatcgtct 180
cctttctgtt tttaatcaac atacaccacc acctaaaaat tccccgacca gcaagttcac 240
agtattcggg cacaatatcg ttgccaaaat attgtttcgg aatatcatgg gatacgtacc 300
caacgaaagg aaacactc 318
<210> 62
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 62
ggaatcgaat ccggtagaaa catcccagcg ctact 35
<210> 63
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 63
tactttcaga actcatgagt gtttcctttc gttgg 35
<210> 64
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 64
acgaaaggaa acactcatga gttctgaaag tagtc 35
<210> 65
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 65
gggcaaggtt tgagcctact tctgggagcg ccaca 35
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 66
acattaagtg gtaggcgctg a 21
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>праймер
<400> 67
cataacaggg cagaacaaac 20
<210> 68
<211> 1053
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223>ген aroG
<400> 68
atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60
gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120
aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180
tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240
gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300
acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360
gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420
gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480
gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540
tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600
aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660
gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720
tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780
caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840
gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900
gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960
ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020
ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053
<---
Claims (8)
1. Микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-тирозин, содержащий регуляторную область оперона trp и ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, функционально связанный с этой областью, где регуляторная область оперона trp содержит промотор (промотор trp).
2. Микроорганизм по п. 1, где регуляторная область оперона trp расположена против хода транскрипции по отношению к гену, кодирующему префенатдегидрогеназу.
3. Микроорганизм по п. 1, где ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, представляет собой ген pheA.
4. Микроорганизм по п. 1, где регуляторная область оперона trp дополнительно содержит одно или более, выбранное из группы, состоящей из регулятора trp, оператора trp, лидерного пептида trp и аттенюатора trp.
5. Микроорганизм по п. 1, где регуляторная область оперона trp состоит из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1.
6. Способ получения L-тирозина, включающий культивирование микроорганизма по любому из пп. 1-5 в среде и выделение L-тирозина из культивируемого микроорганизма или среды.
7. Экспрессионная кассета, содержащая регуляторную область оперона trp и ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, функционально связанный с этой областью, где регуляторная область оперона trp содержит промотор (промотор trp).
8. Композиция для получения L-тирозина, содержащая регуляторную область оперона trp и ген, кодирующий префенатдегидрогеназу, функционально связанный с этой областью, экспрессионную кассету, содержащую то же самое, и микроорганизм рода Corynebacterium, содержащий то же самое, где регуляторная область оперона trp содержит промотор (промотор trp).
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2019-0071797 | 2019-06-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2779461C1 true RU2779461C1 (ru) | 2022-09-07 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006311833A (ja) * | 2004-06-15 | 2006-11-16 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−チロシン生産菌及びｌ−チロシンの製造法 |
| US7700328B2 (en) * | 2006-06-07 | 2010-04-20 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Method for producing an L-tyrosine over-producing bacterial strain |
| RU2593957C2 (ru) * | 2012-01-10 | 2016-08-10 | СиДжей ЧЕИЛДЗЕДАНГ КОРПОРЕЙШН | МИКРООРГАНИЗМ ИЗ РОДА Escherichia, ОБЛАДАЮЩИЙ УСИЛЕННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ К ПРОДУКЦИИ L-ТРИПТОФАНА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРИПТОФАНА С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006311833A (ja) * | 2004-06-15 | 2006-11-16 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−チロシン生産菌及びｌ−チロシンの製造法 |
| US7700328B2 (en) * | 2006-06-07 | 2010-04-20 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Method for producing an L-tyrosine over-producing bacterial strain |
| RU2593957C2 (ru) * | 2012-01-10 | 2016-08-10 | СиДжей ЧЕИЛДЗЕДАНГ КОРПОРЕЙШН | МИКРООРГАНИЗМ ИЗ РОДА Escherichia, ОБЛАДАЮЩИЙ УСИЛЕННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ К ПРОДУКЦИИ L-ТРИПТОФАНА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРИПТОФАНА С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GOWRISHANKAR J. ET AL. Regulation of phenylalanine biosynthesis in Escherichia coli K-12: control of transcription of the pheA operon. J Bacteriol. 1982 Jun;150(3):1130-7. doi: 10.1128/jb.150.3.1130-1137.1982. Найдено онлайн: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC216333/pdf/jbacter00259-0142.pdf Дата обращения 14.02.2022. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11499173B2 (en) | Modified polypeptide with attenuated activity of citrate synthase and method for producing L-amino acid using the same | |
| KR102183209B1 (ko) | L-쓰레오닌 배출 단백질의 변이체 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산 방법 | |
| KR102204917B1 (ko) | L-히스티딘 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 히스티딘 생산방법 | |
| CN114072492B (zh) | 生产l-酪氨酸的微生物及利用其生产l-酪氨酸的方法 | |
| US20240026397A1 (en) | Microorganism producing l-valine and method for producing l-valine using the same | |
| AU2020260919B2 (en) | Microorganism Having Enhanced L-Threonine Producing Ability And Method For Producing Threonine Using The Same | |
| RU2732338C1 (ru) | Микроорганизм для получения L-аминокислоты с повышенной активностью α-глюкозидазы и способ получения L-аминокислоты с его использованием | |
| JP7547511B2 (ja) | 新規ｌ－チロシン排出タンパク質変異体及びそれを用いてｌ－チロシンを生産する方法 | |
| RU2779461C1 (ru) | Микроорганизмы для получения l-тирозина и способ получения l-тирозина с их использованием | |
| KR102147381B1 (ko) | 아세토하이드록시산 신타제 신규 변이체 및 이를 포함하는 미생물 | |
| RU2824668C1 (ru) | Микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-аминокислоты, и способ получения L-аминокислот с его использованием | |
| RU2808831C1 (ru) | Новый вариант L-тирозин-экспортирующего белка и способ получения L-тирозина с его использованием | |
| RU2822660C1 (ru) | Микроорганизмы, продуцирующие L-валин, и способ получения L-валина с их использованием | |
| RU2811953C1 (ru) | Новый промотор и его применение | |
| RU2787592C1 (ru) | Новый промотор и его применение | |
| RU2805253C1 (ru) | Новый модифицированный полипептид с ослабленной активностью цитратсинтазы и способ получения L-аминокислоты с его использованием | |
| JP7571139B2 (ja) | クエン酸シンターゼの活性が弱化した新規な変異型ポリペプチド及びそれを用いたｌ－アミノ酸生産方法 | |
| RU2826456C1 (ru) | Вариант альдолазы arog и способ получения аминокислоты с разветвленной цепью с его использованием | |
| AU2021420802A1 (en) | Novel promoter and use thereof | |
| AU2022235362A1 (en) | Microorganism Of The Genus Corynebacterium For Producing L-Amino Acid And Method For Producing L-Amino Acid Using The Same | |
| BR112021021219B1 (pt) | Micro-organismo com capacidade de produção de lhistidina melhorada de corynebacterium glutamicum, método para produzir l-histidina com o uso do mesmo e composição para produzir l-histidina |