JP2006311833A - L−チロシン生産菌及びl−チロシンの製造法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】L−チロシン生産能を有し、かつ、チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼを保持するエシェリヒア属細菌を培地で培養し、培地中または菌体内にL−チロシンを生成蓄積せしめ、該培地中または菌体内よりL−チロシンを採取することによって、L−チロシンを製造する。
【選択図】図7
Description
ミノ酸残基)に存在するか知られていない。
(1)L−チロシン生産能を有し、かつ、L−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼを保持するエシェリヒア属細菌。
(2)L−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが、野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の250〜269位のアミノ酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼである、(1)のエシェリヒア属細菌。
(3)L−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが、野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の250位のアラニン、251位のフェニルアラニン、253位のグルタミン、254位のアラニン、255位のロイシン、257位のヒスチジン、258位のフェニルアラニン、259位のアラニン、260位のスレオニン、261位のフェニルアラニン、263位のチロシン、265位のロイシン、266位のヒスチジン、267位のロイシン及び269位のグルタミン酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼである、(2)のエシェリヒア属細菌。
(4)250位のアラニンを置換するアミノ酸がフェニルアラニンであり、251位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がセリンであり、253位のグルタミンを置換するアミノ酸がロイシンであり、254位のアラニンを置換するアミノ酸がセリン、プロリン又はグリシンであり、255位のロイシンを置換するアミノ酸がグルタミン又はグリシンであり、257位のヒスチジンを置換するアミノ酸がチロシン、スレオニン、セリン、ア
ラニン又はロイシンであり、258位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がシステイン、アラニン、イソロイシン又はバリンであり、259位のアラニンを置換するアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンであり、260位のスレオニンを置換するアミノ酸がグリシン、アラニン、バリン、システイン、イソロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン又はセリンであり、261位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がメチオニン又はロイシンであり、263位のチロシンを置換するアミノ酸がシステイン、グリシン、スレオニン又はメチオニンであり、265位のロイシンを置換するアミノ酸がリジン、イソロイシン、チロシン又はアラニンであり、266位のヒスチジンを置換するアミノ酸がトリプトファン又はロイシンであり、267位のロイシンを置換するアミノ酸がチロシン又はヒスチジンであり、269位のグルタミン酸を置換するアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン又はロイシンである、(3)のエシェリヒア属細菌。
(5) 野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが以下の(a)または(b)に示すタンパク質である、(2)または(3)のエシェリヒア属細菌;
(a)配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(b)配列番号2のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
(6) さらに、プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の発現が低下するように改変された、(1)〜(5)のいずれかのエシェリヒア属細菌。
(7) さらに、チロシンリプレッサーをコードする遺伝子の発現が低下するように改変された、(1)〜(6)のいずれかのエシェリヒア属細菌。
(8) さらに、L−フェニルアラニンによる阻害が解除された3−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−7−リン酸シンターゼを保持する、(1)〜(7)のいずれかのエシェリヒア属細菌。
(9) さらに、シキミ酸キナーゼIIをコードする遺伝子の発現が増強するように改変された、(1)〜(8)のいずれかのエシェリヒア属細菌。
(10) (1)〜(9)のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌を培地で培養し、培地中または菌体内にL−チロシンを生成蓄積せしめ、該培地中または菌体内よりL−チロシンを採取する、L−チロシンの製造法。
(11) プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子及びチロシンリプレッサーをコードする遺伝子の発現が低下し、かつプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子およびシキミ酸キナーゼIIをコードする遺伝子の発現が増強するように改変され、さらにL−フェニルアラニンによる阻害が解除された3−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−7−リン酸シンターゼを保持する、エシェリヒア属細菌を培地で培養し、培地中または菌体内にL−チロシンを生成蓄積せしめ、該培地中または菌体内よりL−チロシンを採取する、L−チロシンの製造法。
(12) プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、変異が導入された遺伝子を微生物に導入する工程、及び該微生物から3−フルオロチロシン耐性を有する微生物を選択し、選択された微生物からL−チロシンによる阻害が解除されたプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離する工程を含む、L−チロシンによる阻害が解除されたプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の取得方法。
(13)野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の250〜269位のアミノ酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼ。
<1>本発明のエシェリヒア属細菌
本発明のエシェリヒア属細菌は、L−チロシン生産能を有し、かつ、L−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼを保持するエシェリヒア属細菌である。
States of America )。
さらに、配列番号1の塩基配列を有するDNAによってコードされるタンパク質や、配列番号1の塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつ、上記活性を有するタンパク質であってもよい。ここでストリンジェントな条件としては、例えば、60℃、1×SSC,0.1%SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度で、1回より好ましくは2〜3回洗浄する条件が挙げられる。
なお、本発明においては、上記のような配列を有し、L−チロシンによってフィードバ
ック阻害を受けるプレフェン酸デヒドロゲナーゼを「野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼ」と呼ぶ。
250〜269位のアミノ酸の中で置換されるアミノ酸としてより好ましいものは、250位のアラニン、251位のフェニルアラニン、253位のグルタミン、254位のアラニン、255位のロイシン、257位のヒスチジン、258位のフェニルアラニン、259位のアラニン、260位のスレオニン、261位のフェニルアラニン、263位のチロシン、265位のロイシン、266位のヒスチジン、267位のロイシン及び269位のグルタミン酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸である。
これらのアミノ酸を置換するアミノ酸の種類はL−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型PDHを生じさせるものである限り特に制限されないが、特に好ましくは、250位のアラニンを置換するアミノ酸がフェニルアラニンであり、251位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がセリンであり、253位のグルタミンを置換するアミノ酸がロイシンであり、254位のアラニンを置換するアミノ酸がセリン、プロリン又はグリシンであり、255位のロイシンを置換するアミノ酸がグルタミン又はグリシンであり、257位のヒスチジンを置換するアミノ酸がチロシン、スレオニン、セリン、アラニン又はロイシンであり、258位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がシステイン、アラニン、イソロイシン又はバリンであり、259位のアラニンを置換するアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンであり、260位のスレオニンを置換するアミノ酸がグリシン、アラニン、バリン、システイン、イソロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン又はセリンであり、261位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がメチオニン又は
ロイシンであり、263位のチロシンを置換するアミノ酸がシステイン、グリシン、スレオニン又はメチオニンであり、265位のロイシンを置換するアミノ酸がリジン、イソロイシン、チロシン又はアラニンであり、266位のヒスチジンを置換するアミノ酸がトリプトファン又はロイシンであり、267位のロイシンを置換するアミノ酸がチロシン又はヒスチジンであり、269位のグルタミン酸を置換するアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン又はロイシンである。
なお、各アミノ酸の位置は配列番号2における位置を示している。ただし、アミノ酸の欠失、挿入、付加などによってその位置は前後することがあり、例えば、「260位のスレオニン」は、N末端側に1つのアミノ酸が挿入されれば本来260位のスレオニンはN末端から261番目のアミノ酸残基となるが、そのようなスレオニンも、本発明においては260位のスレオニンと呼ぶこととする。その他のアミノ酸についても同様である。
F.E., Gene, 1, 153 (1977) )がある。
ーター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。
ンリプレッサーをコードする遺伝子の発現が低下するように改変されたエシェリヒア属細菌であってもよい。チロシンリプレッサーをコードする遺伝子(tyrR遺伝子ともいう)としては、例えば、配列番号5の塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。また、チロシンリプレッサー活性を有するタンパク質をコードする限りにおいて、配列番号5の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここでストリンジェントな条件としては、例えば、60℃、1×SSC,0.1%SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度で、1回より好ましくは2〜3回洗浄する条件が挙げられる。tyrR遺伝子の発現量は野生株などの非改変株に比べて10%以下に低下していることが好ましい。なお、低下とは完全に発現量が消失した場合も含む。tyrR遺伝子の発現量を低下させるための改変は、遺伝子破壊や、プロモーターなどの発現調節領域の改変によって行うことができる。具体的には、上述したpheA遺伝子の破壊と同様の方法によって行うことができる。
本発明のL−チロシンの製造法は、本発明のエシェリヒア属細菌を培地で培養し、培地中または菌体内にL−チロシンを生成蓄積せしめ、該培地中または菌体内よりL−チロシンを採取する方法である。本発明のエシェリヒア属細菌を培養する方法は、従来のL−チロシン生産菌の培養方法と同様にして行うことができる。即ち、培地としては、炭素源、
窒素源、無機イオン、更に必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常のものを使用することができる。炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース等及びこれらを含有する澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩その他が使用できる。培養は好気的条件下で培地のpH及び温度を適宜調節しつつ、実質的にL−チロシンの生産蓄積が停止するまで行うことが好ましい。培養終了後の培養液中には著量のL−チロシンが生成蓄積される。培養液よりL−チロシンを採取するには、通常の方法が適用できる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下のものには限定されない。
バクト・トリプトン(ディフコ社製) 10g/L
酵母エキス(ディフコ社製) 5g/L
塩化ナトリウム 10g/L
pH7.0
[120℃、20分間蒸気滅菌を行った。]
L培地
バクトアガー 15g/L
120℃、20分間蒸気滅菌を行った。
グルコース 0.2%
硫酸マグネシウム 1mM
リン酸2水素カリウム 4.5g/L
クエン酸ナトリウム 0.5g/L
硫酸アンモニウム 1g/L
リン酸2ナトリウム 10.5g/L
thiamine hydrochloride 5mg/L
115℃、10分間蒸気滅菌を行った。
最小培地
バクトアガー 15g/L
115℃、10分間蒸気滅菌を行った。
グルコース 40g/L
硫酸アンモニウム 16g/L
リン酸2水素カリウム 1.0g/L
硫酸マグネシウム・7水塩 1.0g/L
硫酸鉄4・7水塩 10mg/L
硫酸マンガン4・7水塩 8mg/L
イーストエキストラクト 2.0g/L
局方炭酸カルシウム 30g/L
水酸化カリウムでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブ
但しグルコース及びMgSO4・7H2Oは別々に殺菌した。
適宜、L−フェニルアラニン、L−チロシンを添加した。
抗生物質として、クロラムフェニコール25mg/Lやアンピシリン100mg/Lを添加した。
(1)エシェリヒア・コリのtyrA由来変異型PDH遺伝子の取得
エシェリヒア・コリK-12 W3110株から通常の方法に従って染色体DNAを抽出した。一方、公知の文献[J. Mol. Biol. 180 (4), 1023(1984)] に記載されているtyrA遺伝子の塩基配列に基づいて、配列番号11及び12に示すような合成DNAプライマー2本を通常の方法で合成した。これらは、それぞれtyrA遺伝子の上流及び下流に相同な配列を持つ。この染色体DNAとプライマーを用いて、PCRを行い、約1kbpのDNA断片を得た。以下、図1に示すようにこの断片をEcoRIとSalIで切断した後、同じくEcoRIとSalIで切断したpSTV28(タカラバイオ社製)にLigation Kit Ver.2(タカラバイオ社製)を用いて連結した。このライゲーション溶液でエシェリヒア・コリ K-12 JM109株(タカラバイオ社製)を形質転換し、クロラムフェニコールを含むLB培地上で選択した。クロラムフェニコール耐性株にtyrA遺伝子が挿入されたかどうかをPCRで確認し、野生型tyrA遺伝子を保有する菌株からプラスミドを抽出し、プラスミドpSTVtyrA(W)を取得した。
JM109/pSTV28tyrA-1,2,5,10,24の菌体をLB培地を用いて37℃、15時間培養した培養液を遠心分離し、集菌した。次いで、該菌体を50mM Tris-HCl(pH7.5)にて2回洗浄し、氷冷下20%グリセロールを含む50mM Tris-HCl(pH7.5)に懸濁した後、30秒間、80回の超音波破砕することにより粗酵素液を調製した。PDH活性測定は[Biochemistry. 1990 Nov 6; 29(44): 10245-54]に従った。すなわち0.25mMプレフェン酸、1mM EDTA、1mM DTT、2mM NADを含んだ50mM Tris-HCl(pH7.5)存在下、30℃10分反応させ、生成するNADHを340nmの吸光波長にて測定した。タンパク質定量法はBradford法で行った。結果は図2に示すように、選択
した5株のうち1株が阻害解除型のPDHを保持していた。野生型PDHでは100μMのL-チロシン存在下で強く酵素反応が阻害されるのに対し、変異型PDHは800μMのL−チロシンでもほとんど阻害を受けなかった。以後、このフィードバック阻害解除型tyrAをtyrA(mut)と表記する。
pSTVtyrA(W)またはpSTVtyrA(mut)でW3110ΔtyrR,tyrAを形質転換し、25mg/Lクロラムフェニコールを含むLB培地に塗り広げ、生育してきた菌体を1 cm2かきとって25 mg/Lのクロラムフェニコールを含む上述のエシェリヒア・コリ L-チロシン生産培地5mlに植菌し、37℃、24時間振盪培養した。培養後、培養液1mlをサンプリングし、培養液中のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度は、12,000 rpmで2分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈した培養液をバイオテックアナライザー(サクラ精器)により測定した。L−チロシン、L−フェニルアラニンの測定は残りの培養液に終濃度0.3 MとなるようにKOHを添加し、1時間ほど37 ℃で振盪してL-チロシンを溶解し、これを適当倍率に水で希釈し、Ultrafree-MC 0.45 μm Filter Unit(ミリポア)を通し不純物を除いてからHPLC(HITACHI)で行った。HPLCカラムはChromolith(MERCK)を用い、bufferは5 %アセトニトリル/0.1
% トリフルオロ酢酸を用いた。結果を表1及び図3に示す。tyrAが脱感作されたことによって、L-チロシンの蓄積が8〜10倍に向上することが明らかとなった。
フィードバックが解除されたPDHの遺伝子である、tyrA(mut)の配列を通常の方法に従って決定した。具体的なアミノ酸配列上の置換部位及びその対応塩基配列上の変異点を図4(A)に示す。この株で100位のプロリンがセリンに、260位のスレオニンがイソロイシンに置換していた。このどちらが、変異型PDHの脱感作に効果を示しているのかを確認するために、以下のような実験を行った(図4(B))。pSTVtyrA(mut)とpSTVtyrA(W)をtyrAの上流側のマルチクローニングサイトにあるEcoRIと100位の置換部位と260位の置換部位のあいだに位置するCpoIで消化した。ここで得られた、100位の置換部位のみを含む断片をpSTVtyrA(mut)とpSTVtyrA(W)の対応する断片それぞれにつなぎ変え、100位のみが置換されたpSTVtyrA(P100S)、および260位のみが置換されたpSTVtyrA(T260I)を作製した。これらプラスミドでW3110ΔtyrR,tyrAを形質転換し、得られた株をW3110ΔtyrR,tyrA / pSTVtyrA(P100S)、W3110ΔtyrR,tyrA /pSTVtyrA(T260I)と名づけた。この二つの株を培養した結果を表2及び図5に示す。結果、260位の置換が脱感作に効果を示しているということが明らかになった。以後の実験にはtyrA(T260I)を使用した。
(1)E.coliのtyrA由来変異型PDH遺伝子の取得
tyrAの250番目から270番目のアミノ酸それぞれに対して、ランダムに変異が入るプライマーを設計した(配列番号15〜35)。
これらのプライマー及び配列番号11,12のプライマーを用いて次のような変異導入PCRを行った(図8)。
1stPCR:pSTVtyrA(W)をテンプレートとし、配列番号15〜35のいずれかのプライマーとT2プライマー(配列番号12)を用いて変異導入部位から下流の配列をpyrobestDNAポリメラーゼ(Takara)で増幅する。
2ndPCR:1stPCRと一連のサイクルで行う。1stPCRで増幅したPCR産物がプライマーとしてtyrA(W)にアニールし、1stPCRで増幅されていないtyrAの上流側に向かって伸長する。
<1st/2nd PCR cycle>
96℃2min.→〔94℃30s.・60℃30s.・72℃30s.〕×20→〔94℃1min.・37℃1min.・72℃30s.〕×10→4℃
3rdPCR:2ndPCR産物をすべて混合したものをテンプレートにT1(配列番号11)とT2(配列番号12)で変異点の入ったtyrA全長を増幅する。
<3rdPCR cycle>96℃2min.→〔94℃30s.・55℃30s.・72℃1min.〕×30→4℃
増幅された変異型tyrA のPCR断片をpSTV28のSmaIサイトにライゲーションし、pSTVtyrA(mut)を得た。このプラスミドを用いて、W3110ΔtyrR,tyrA株を形質転換した。形質転換した株はクロラムフェニコール、0.1mM 3-fluoro-Tyrosineの入った最少培地に塗布し、37℃、24時間目に生育してきた株から、50株を候補株として取得した。
pSTVtyrA(W)とpSTVtyrA(mut)でW3110ΔtyrR,tyrAを形質転換し、25mg/Lクロラムフェニコールを含むLB培地に塗り広げ1 cm2かきとって25 mg/Lのクロラムフェニコールを含む上述のE.coli L-チロシン生産培地5mlに植菌し、37℃、24時間振盪培養した。培養後、培養液1mlをサンプリングし、培養液中のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度は、1
2,000 rpmで2分間遠心し、その上清液を適当倍率に水で希釈した培養液をバイオテックアナライザー(サクラ精器)により測定した。一方、L−チロシンの蓄積は、残りの培養液に終濃度0.3 MとなるようにKOHを添加し、1時間ほど37 ℃で振盪してL-チロシンを溶解し、これを適当倍率に水で希釈し、Ultrafree-MC 0.45 μm Filter Unit(ミリポア)を通し不純物を除いてからHPLC(HITACHI)で測定した。HPLCカラムはChromolith(MERCK)を用い、bufferは5 %アセトニトリル/0.1 % トリフルオロ酢酸を用いた。各置換体(変異型PDH)導入株のL-チロシンの蓄積を表3に示す。tyrAへの変異導入によって、L-チロシンの蓄積が1.5〜14倍に向上した株が取得されたことが明らかとなった。
フィードバック阻害が解除された各置換体の塩基配列を通常の方法に従って決定した。置換部位のアミノ酸及びコドンの配列を表3に示す。
(3)で取得された株のうち、もっとも収率の高かった257/265、2番目に収率の高かった254/269(収率5.5%、2.5%)、実施例1で取得したT260I(収率3.5%)の菌体をLB培地を用いて37℃、15時間培養した培養液を遠心分離し、集菌した。次いで、該菌体を50mM Tris-HCl(pH7.5)にて2回洗浄し、氷冷下20%グリセロールを含む50mM Tris-HCl(pH7.5)に懸濁した後、30秒間、80回の超音波破砕することにより粗酵素液を調製した。PDH活性測定は[Biochemistry. 1990 Nov 6; 29(44): 10245-54]に従った。すなわち0.25mMプレフェン酸、1mM EDTA、1mM DTT、2mM NAD+を含んだ50mM Tris-HCl(pH7.5)存在下、30℃10分反応させ、生成するNADHを340nmの吸光波長にて測定した。タンパク質定量法はBradford法で行った。結果は図9に示すように、野生型PDHでは100μML-チロシン存在下で強く酵素反応が阻害されるのに対し、T260I、254/269では800μMのチロシンでもほとんど阻害を受けなかった。しかし、257/265に変異の入った株に関しては、収率が高いにもかかわらず活性は測定できなかった。
実施例2とほぼ同様の方法を用いて変異型tyrA 株を取得した。異なる点は、1st/2nd PCR後、PCRプロダクトを混合せずに、各プライマーを用いて得られたPCRプロダクトに対し個別に3rd PCRを行った点である。各プライマーを用いて得られたクローンからそれぞれ3〜10個の株を候補株として取得した。これらの株を(2)と同様の方法で培養、塩基配列分析を行った結果を表4に示す。それぞれ、1種類〜8種類のアミノ酸に置換され、チロシン収率の向上した株が取得できたことが明らかとなった。
プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子(pheA)の欠失は、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645] によって行った。この方法によれば、目的とする遺伝子を合成オリゴヌクレオチドの5'側にデザインし、抗生物質耐性遺伝子を3’側にデザインした合成オリゴヌクレオチドを用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することが出来る。公知の文献[J. Mol. Biol. 180 (4), 1023(1984)] に記載されているpheA遺伝子塩基配列と [Gene. 1982 Oct; 19(3): 327-36.] に記載されているpCE1134のカナマイシン耐性遺伝子NptII遺伝子の配列に基づいて、pheA遺伝子及び鋳型プラスミドに抗生物質耐性を付与する遺伝子のそれぞれに近接する領域に、それぞれ相補的なプライマーを設計した。配列番号13および14に示すような合成DNAプライマーを2本通常の方法で合成した。このプライマーを用いてpCE1134をテンプレートに、PCRを行った。
。プラスミドpKD46はPCR産物をW3110ΔtyrR,tyrAに組み込むために必要である。
(1)pMGLの作製
FERM BP-4796に搭載されているpMGAL1(脱感作型aroG4、野生型aroL及び野生型pheAを含むプラスミド)をHindIIIで消化してpheA遺伝子を切り出し、再度ライゲーションを行うことで、脱感作型aroG4と野生型aroLのみがpM119に組み込まれたプラスミドを作製しpMGLと名づけた(図6)。
実施例4で作製したW3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Kmに実施例1で作製したpSTVtyrA(T260I)、pSTVtyrA(W)、またはpSTV28を導入してW3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/ pSTVtyrA(T260I)、W3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/pSTVtyrA(W)、およびこれらの比較対照用にW3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/pSTV28を作製した。さらに、pMGLでこれらの株を形質転換して、W3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/pMGL/pSTVtyrA(T260I)、W3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/pMGL/pSTVtyrA(W)、およびこれらの比較対照用にW3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/pMGLを作製した。
形質転換株W3110ΔtyrR,tyrA,pheA/pMGL/pSTV28-tyrAをエシェリヒア・コリ L-チロシン生産培地を用いて37度で28時間培養した。その結果を表5及び図7に示す。
分析は、実施例1−(3)と同様の方法で行った。W3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km株では、変異型tyrAを導入することで0.8〜1.0g/Lが3.3〜3.5g/Lと約5倍になり、W3110ΔtyrR,tyrA,pheA::Km/pMGL株では、変異型tyrAを導入することで3.9g/Lが5.7〜6.0g/Lと約1.5倍の収率向上効果が見られた。さらに、変異型tyrAを導入することで副生物のL-フェニルアラニンが生成されなくなるということが明らかになった。
Claims (13)
- L−チロシン生産能を有し、かつ、L−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼを保持するエシェリヒア属細菌。
- L−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが、野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の250〜269位のアミノ酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼである、請求項1に記載のエシェリヒア属細菌。
- L−チロシンによるフィードバック阻害が解除された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが、野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の250位のアラニン、251位のフェニルアラニン、253位のグルタミン、254位のアラニン、255位のロイシン、257位のヒスチジン、258位のフェニルアラニン、259位のアラニン、260位のスレオニン、261位のフェニルアラニン、263位のチロシン、265位のロイシン、266位のヒスチジン、267位のロイシン及び269位のグルタミン酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼである、請求項2に記載のエシェリヒア属細菌。
- 250位のアラニンを置換するアミノ酸がフェニルアラニンであり、251位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がセリンであり、253位のグルタミンを置換するアミノ酸がロイシンであり、254位のアラニンを置換するアミノ酸がセリン、プロリン又はグリシンであり、255位のロイシンを置換するアミノ酸がグルタミン又はグリシンであり、257位のヒスチジンを置換するアミノ酸がチロシン、スレオニン、セリン、アラニン又はロイシンであり、258位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がシステイン、アラニン、イソロイシン又はバリンであり、259位のアラニンを置換するアミノ酸がロイシン、バリン又はイソロイシンであり、260位のスレオニンを置換するアミノ酸がグリシン、アラニン、バリン、システイン、イソロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン又はセリンであり、261位のフェニルアラニンを置換するアミノ酸がメチオニン又はロイシンであり、263位のチロシンを置換するアミノ酸がシステイン、グリシン、スレオニン又はメチオニンであり、265位のロイシンを置換するアミノ酸がリジン、イソロイシン、チロシン又はアラニンであり、266位のヒスチジンを置換するアミノ酸がトリプトファン又はロイシンであり、267位のロイシンを置換するアミノ酸がチロシン又はヒスチジンであり、269位のグルタミン酸を置換するアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン又はロイシンである、請求項3に記載のエシェリヒア属細菌。
- 野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼが以下の(a)または(b)に示すタンパク質である、請求項2または3に記載のエシェリヒア属細菌;
(a)配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(b)配列番号2のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。 - さらに、プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の発現が低下するように改変された、請求項1〜5のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌。
- さらに、チロシンリプレッサーをコードする遺伝子の発現が低下するように改変された、請求項1〜6のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌。
- さらに、L−フェニルアラニンによる阻害が解除された3−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−7−リン酸シンターゼを保持する、請求項1〜7のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌。
- さらに、シキミ酸キナーゼIIをコードする遺伝子の発現が増強するように改変された、請求項1〜8のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌を培地で培養し、培地中または菌体内にL−チロシンを生成蓄積せしめ、該培地中または菌体内よりL−チロシンを採取する、L−チロシンの製造法。
- プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子及びチロシンリプレッサーをコードする遺伝子の発現が低下し、かつプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子およびシキミ酸キナーゼIIをコードする遺伝子の発現が増強するように改変され、さらにL−フェニルアラニンによる阻害が解除された3−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−7−リン酸シンターゼを保持するエシェリヒア属細菌を培地で培養し、培地中または菌体内にL−チロシンまたはその誘導体を生成蓄積せしめ、該培地中または菌体内よりL−チロシンまたはその誘導体を採取する、L−チロシンまたはその誘導体の製造法。
- プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子に変異を導入し、変異が導入された遺伝子を微生物に導入する工程、及び該微生物から3−フルオロチロシン耐性を有する微生物を選択し、選択された微生物からL−チロシンによる阻害が解除されたプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を単離する工程を含む、L−チロシンによる阻害が解除されたプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の取得方法。
- 野生型プレフェン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の250〜269位のアミノ酸から選ばれる1又は2以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型プレフェン酸デヒドロゲナーゼ。
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