FR2847265A1 - Procede de production de l-aminoacides et bacteries utilisees dans ce procede - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de production d'un L-aminoacide comprenant la culture d'un micro-organisme capable de produire un L-aminoacide dans un milieu de sorte que ledit L-aminoacide s'accumule dans le milieu et la collecte dudit L-aminoacide à partir du milieu, où ledit micro-organisme est une bactérie utilisant le méthanol disposant de la voie de Entner-Doudoroff et qui est modifiée de telle manière que l'activité 6-phosphogluconate déshydratase et/ou l'activité 2-céto-3-désoxy-6-phosphogluconate aldolase est ou sont augmentées, et ledit L-aminoacide est choisi parmi les L-aminoacides produits par une voie de biosynthèse qui utilise l'acide pyruvique comme intermédiaire, ainsi qu'une bactérie qui est utilisée dans ce procédé.

Description

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La présente invention concerne un procédé de production d'un L-aminoacide et une bactérie utilisée dans ce procédé. Plus précisément, la présente invention concerne une bactérie utilisant le méthanol ayant une capacité de production de L-aminoacides améliorée et un procédé pour produire un L-aminoacide utilisant cette bactérie.

Conventionnellement, les L-aminoacides comme la L-lysine, l'acide L-glutamique, la L-thréonine, la L-leucine, la L-isoleucine, la Lvaline et la L-phénylalanine sont produits par fermentation au moyen de bactéries coryneformes appartenant aux genres Brevibacterium, Corynebacterium ou Microbacterium (Amino Acid Fermentation, the Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], p. 195-215,1986). De plus, il est possible aussi d'utiliser des micro-organismes appartenant aux genres Bacillus, Streptomyces, Penicillium (brevet U.S. n 3 220 929), Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Aerobacter, Candida (brevet U.S. n 3 563 857) et Escherichia (demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) n 5-244970) dans la production de Laminoacides.

Pour améliorer la productivité de ces micro-organismes, on a utilisé des souches bactériennes isolées à partir de mutants naturels ou artificiels de ces bactéries. De plus, on a décrit différentes techniques pour augmenter la capacité de production de L-aminoacides par stimulation d'enzymes de biosynthèse de L-aminoacides au moyen de techniques de génie génétique (brevets U. S. 4 278 765,4 346 170 et 6 040 160).

Le méthanol est une matière première souvent utilisée dans la fermentation qui est peu coûteuse et d'accès facile. On connaît des procédés de production de L-aminoacides par fermentation du méthanol au moyen de micro-organismes appartenant au genre Achromobacter ou Pseudomonas (demande de brevet japonais publiée (Kokoku) n 45- 25273), Protaminobacter (demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) n 49-125590), Protaminobacter ou Methanomonas (demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) n 50-25790), Microcyclus (demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) n 52-18886), Methylobacillus (demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) n 4- 91793), Bacillus (traduction Japonaise de la demande internationale PCT (Kohyo) n 3-505284 WO 90/12105). La demanderesse a développé des procédés pour produire des L-aminoacides

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au moyen de bactéries Methylophilus grâce à des techniques de culture utilisant la mutagenèse artificielle et le génie génétique (demande de brevet japonais n 11-368097).

On connaît aussi des techniques pour améliorer la capacité de production de L-aminoacides par introduction de gènes codant des enzymes glycolytiques comme la glucose-6-phosphate isomérase (demande de brevet international publiée n 01/02542 (WO 01/02542 Al)), la fructose phosphotransférase (demande de brevet international publiée n 01/48146 (WO 01/48146 Al)) et l'énolase (demande de brevet international publiée n 01/02543 (WO 01/02543 Al)).

De nombreuses bactéries utilisant le méthanol, y compris les entérobactéries, disposent de la voie de Entner-Doudoroff parmi d'autres voies de métabolisme du méthanol. Cette voie utilise la 6phosphogluconate déshydratase (dans la suite en abrégé "EDD") qui catalyse une réaction pour produire du 2-céto-3-désoxy-6phosphogluconate à partir de l'acide 6-phosphogluconique, et la 2-céto-3désoxy-6-phosphogluconate aldolase (dans la suite en abrégé "EDA") qui clive le 2-céto-3-désoxy-6-phosphogluconate pour produire le glycéraldéhyde-3-phosphate et l'acide pyruvique. Les gènes codant EDD et EDA ont été clonés à partir de Escherichia coli et Zymomonas mobilis, et leurs séquences nucléotidiques ont été décrites (Mol. Microbiol. 5,2901- 2911, J. Bacteriol. 172 (12), 7227-7240 (1990)). Les séquences nucléotidiques du gène codant EDD (edd) et du gène codant EDA (eda) de Escherichia coli se sont vu attribuer le numéro d'ordre GenBank L20897.

De plus, la séquence nucléotidique du gène eda de Zymomonas mobilis porte le numéro d'ordre GenBank X58364, et la séquence nucléotidique du gène edd porte le numéro d'ordre GenBank M60615 M37982 dans la base de données.

Il existe un net besoin de procédés de production peu coûteux pour obtenir des aminoacides destinés à être utilisés en agriculture et dans l'industrie alimentaire. La relation entre la voie de Entner-Doudoroff et la productivité de L-aminoacides n'a pas été décrite. La présente invention décrit cette relation et un procédé pour l'exploiter.

Ainsi, la présente invention a pour but de répondre au besoin évoqué ci-dessus grâce à un procédé pour améliorer la productivité de Laminoacides dans les bactéries.

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Pour atteindre ce but, la présente invention concerne un procédé de production d'un L-aminoacide comprenant la culture d'un micro-organisme capable de produire un L-aminoacide dans un milieu, de sorte que ledit L-aminoacide s'accumule dans le milieu, et la collecte dudit L-aminoacide à partir du milieu, où ledit micro-organisme est une bactérie utilisant le méthanol qui dispose de la voie de Entner-Doudoroff et qui est modifiée de telle manière que l'activité 6-phosphogluconate déshydratase et/ou l'activité 2-céto-3-désoxy-6-phosphogluconate aldolase sont augmentées, et ledit L-aminoacide est choisi parmi les L-aminoacides produits par une voie de biosynthèse qui utilise l'acide pyruvique comme intermédiaire.

La présente invention concerne aussi le procédé ci-dessus dans lequel la bactérie utilisant le méthanol est une bactérie appartenant au genre Methylophilus.

La présente invention concerne aussi le procédé évoqué cidessus dans lequel ladite activité 6-phosphogluconate déshydratase et/ou 2-céto-3-désoxy-6-phosphogluconate aldolase est augmentée par augmentation du nombre de copies d'un gène codant la 6phosphogluconate déshydratase et/ou la 2-céto-3-désoxy-6phosphogluconate aldolase, ou par modification d'une séquence régulant l'expression du gène de sorte que l'expression du gène est augmentée dans une cellule de la bactérie.

La présente invention concerne aussi le procédé décrit cidessus dans lequel ledit L-aminoacide est choisi parmi la L-lysine, la Lleucine, la L-isoleucine et la L-valine.

La présente invention concerne également une bactérie utilisant le méthanol disposant de la voie de Entner-Doudoroff où ladite bactérie est modifiée de sorte que l'activité 6-phosphogluconate déshydratase et/ou l'activité 2-céto-3-désoxy-6-phosphogluconate aldolase est augmentée, et qui est capable de produire un L-aminoacide par une voie de biosynthèse qui utilise l'acide pyruvique comme intermédiaire.

Enfin, la présente invention concerne un procédé de production d'un L-aminoacide qui est un produit d'une voie de biosynthèse qui utilise l'acide pyruvique comme intermédiaire, comprenant a) la culture d'une bactérie utilisant le méthanol disposant de la voie de Entner-Doudoroff dans un milieu, ladite bactérie étant capable de sécréter un L-aminoacide

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dans un milieu et b) la collecte dudit L-aminoacide à partir du milieu, où ladite bactérie est modifiée de manière à augmenter l'activité 6phosphogluconate déshydratase et/ou l'activité 2-céto-3-désoxy-6phosphogluconate aldolase.

La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui suit et se réfère aux dessins annexés, donnés uniquement à titre d'exemple, et dans lesquels : la figure 1 montre la construction du plasmide pRStac contenant le promoteur tac et des plasmides pRSIysE et pRSIysE24 consistant en le plasmide pRStac dans lequel a été inséré le gène lysE ou lysE24; et la figure 2 montre la construction du plasmide pRSIysEdapA contenant le gène lysE24 et le gène dapA*.

La demanderesse s'est intéressée à la voie de Entner-Doudoroff (appelée dans la suite "voie ED") parmi les voies métaboliques de la synthèse de l'acide pyruvique à partir de composés de type sucrephosphates. Les principales voies métaboliques du méthanol à l'acide pyruvique qui sert de matière première pour la synthèse de L-aminoacides comme la L-lysine dans des bactéries utilisant le méthanol strictement Gram-négatives sont la voie de Embden-Meyerhof-Parnas (appelée aussi dans la suite "voie EMP") et la voie de Entner-Doudoroff.

La demanderesse a d'abord augmenté l'activité enzymatique de la phosphofructokinase et de la phosphoglycérate kinase pour faire croître la production d'acide pyruvique. Cependant, lorsque l'on a tenté d'augmenter l'activité enzymatique, il n'a pas été possible d'introduire les gènes des enzymes correspondantes dans des cellules de bactéries utilisant le méthanol envisagées, ou bien la quantité de produit final Llysine produite n'était pas affectée, même lorsqu'il était possible d'introduire ces gènes. De ce fait, on a tenté d'augmenter le flux des métabolites impliqués dans la voie ED.

On a pris en compte deux procédés pour augmenter la production d'acide pyruvique au moyen de la voie ED, à savoir (1) l'élimination ou l'atténuation de gènes de la glucose-6-phosphate déshydrogénase, et (2) la stimulation de la voie de Entner-Doudoroff. Bien que l'on puisse prévoir que ces deux procédés entraînent une augmentation de l'acide pyruvique produit, le procédé (2) concerne le

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métabolisme de l'acide pyruvique et du ribulose monophosphate et la manière dont ils peuvent être harmonisés par le biais du contrôle des degrés d'activité. Il est possible aussi de fournir du ribulose-5-phosphate, qui est un intermédiaire de la voie du ribulose monophosphate, et des acides nucléiques, qui sont des dérivés ou des intermédiaires. A la suite de cette recherche, on a constaté qu'il était possible d'améliorer la capacité de production de L-aminoacides de bactéries utilisant le méthanol en stimulant la voie de Entner-Doudoroff, ce qui a conduit à la présente invention.

La bactérie utilisant le méthanol qui est utilisée selon la présente invention est une bactérie capable de produire un L-aminoacide en utilisant la voie de Entner-Doudoroff.

Le terme "capable de produire un L-aminoacide" utilisé dans la présente invention désigne la capacité d'accumuler un L-aminoacide dans un milieu quand la bactérie selon la présente invention est cultivée dans ce milieu. Cette capacité de produire un L-aminoacide peut être une propriété d'une souche de type sauvage de la bactérie utilisant le méthanol ou une propriété conférée ou stimulée par culture. Les Laminoacides auxquels la présente invention peut être appliquée sont des L-aminoacides produits par une voie de biosynthèse utilisant l'acide pyruvique comme intermédiaire. Il peut s'agir par exemple de la L-lysine, de l'acide L-glutamique, de la L-thréonine, de la L-leucine, de la Lisoleucine, de la L-valine, de la L-sérine, de la L-alanine, de la L-tyrosine ou de la L-phénylalanine.

Comme le montrent les exemples présentés dans la suite, une bactérie disposant de la voie de Entner-Doudoroff stimulée du fait que les activités de EDD et EDA ont augmenté présente une production de Lvaline accrue. Comme la L-valine est produite à partir de l'acide pyruvique, l'augmentation de la production de L-valine traduit une augmentation de la quantité d'acide pyruvique fourni. De ce fait, on peut prévoir qu'une bactérie dont la voie de Entner-Doudoroff est stimulée aura une plus grande capacité de production d'un L-aminoacide quelconque produit par une voie de biosynthèse utilisant l'acide pyruvique comme intermédiaire.

Les bactéries utilisant le méthanol qui disposent de la voie de Entner-Doudoroff comprennent par exemple les bactéries appartenant au genre Methylophilus ou au genre Methylobacillus. Il est possible de

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déterminer si une bactérie dispose de la voie de Entner-Doudoroff par exemple en mélangeant une suspension de cellules lysées avec de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, de l'acide 6phosphogluconique et de l'acétylpyridine adénine dinucléotide et en détectant le glycéraldéhyde-3-phosphate produit à partir du substrat acide 6-phosphogluconique en mesurant l'augmentation de l'absorbance à 365 nm. Les bactéries dont on sait qu'elles produisent du glycéraldéhyde- 3-phosphate disposent de la voie de Entner-Doudoroff.

Selon la présente invention, une bactérie utilisant le méthanol, c'est-à-dire une bactérie méthylotrophe, est une bactérie qui peut se développer en consommant du méthanol à titre de principale source de carbone, et dont la capacité de production d'un L-aminoacide est stimulée ou conférée du fait qu'elle est modifiée pour stimuler l'activité EDD et/ou EDA. De telles bactéries sont par exemple les bactéries Methophilus comme Methylophilus methylotrophus et les bactéries Methylobacillus comme Methylobacillus glycogenes et Methylobacillus flagellatum.

Les bactéries Methylophilus comprennent par exemple la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB10515). La souche de Methylophilus methylotrophusAS1 (NCIMB10515) est disponible auprès des National Collections of Industrial and Marine Bacteria (Adresse : NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Royaume-Uni).

En outre, les bactéries Methylophilus glycogenes comprennent par exemple la souche T-11 (NCIMB 11375), la souche ATCC 21276, la souche ATCC 21371, la souche ATR80 (décrite dans Appl. Microbiol.

Biotechnol., 42, p. 67-72 (1994)) et la souche A513 (décrite dans Appl.

Microbiol. Biotechnol., 42, p. 67-72 (1994)). La souche de Methylobacillus glycogenes NCIMB 11375 est disponible auprès des National Collections of Industrial and Marine Bacteria (Adresse : NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Royaume-Uni). Les bactéries Methylobacillus flagellatum comprennent par exemple la souche KT (décrite dans Arch. Microbiol., 149, p. 441-446 (1988)).

La bactérie utilisant le méthanol selon la présente invention est une bactérie capable de produire un L-aminoacide et qui dispose de la voie de Entner-Doudoroff, et qui a été modifiée de sorte que l'activité EDD et/ou EDA est stimulée. De préférence, cette bactérie est une bactérie

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utilisant le méthanol qui a été modifiée de sorte que les activités EDD et EDA sont toutes deux stimulées.

L'expression "modifiée de telle manière que l'activité EDD ou EDA est stimulée" signifie que l'activité EDD ou EDA par cellule est supérieure à celle d'une bactérie utilisant le méthanol de type sauvage. Par exemple, on envisage des bactéries dans lesquelles le nombre de molécules de EDD ou EDA par cellule est augmenté, et des bactéries dans lesquelles l'activité spécifique de EDD ou EDA par molécule de EDD ou EDA est augmentée. De plus, la bactérie utilisant le méthanol de type sauvage devrait être comparée à une bactérie utilisant le méthanol qui n'a pas été soumise à une quelconque manipulation pour augmenter l'activité EDD ou EDA.

Il est possible d'obtenir une augmentation ou une stimulation de l'activité EDD et/ou EDA dans une bactérie en augmentant le nombre de copies d'un gène codant EDD et/ou EDA. Par exemple, il est possible de préparer un ADN recombiné par ligature d'un fragment de gène codant EDD et/ou EDA avec un vecteur fonctionnel dans une bactérie cible, de préférence un vecteur de type à copies multiples, que l'on introduit dans la bactérie pour la transformer. Quand il s'agit de stimuler à la fois l'activité EDD et l'activité EDA, il est possible d'incorporer séparément dans des vecteurs différents le fragment de gène codant EDD et le fragment de gène codant EDA, bien qu'il soit préférable de les incorporer dans le même vecteur. L'ADN recombiné peut être introduit dans une bactérie capable de produire un L-aminoacide, ou bien encore l'ADN recombiné peut être introduit dans une bactérie de type sauvage pour obtenir une souche transformante à laquelle est conférée ensuite une capacité de production de L-aminoacide.

Il est possible d'utiliser l'un quelconque des gènes provenant de bactéries disposant de la voie de Entner-Doudoroff comme gène codant EDD et comme gène codant EDA. Spécifiquement, les gènes dérivés de bactéries Escherichia sont envisagés selon la présente invention. Il a été décrit que le gène codant EDD (edd) et le gène codant EDA (eda) issus de Escherichia coli forment un opéron (J. Bacteriol., 174 (14) : 4638-46, juillet 1992). Dans la suite, le gène codant EDD est appelé edd et le gène codant EDA est appelé eda. De plus, il a été décrit également de tels gènes de bactéries du genre Zymomonas, et il est possible d'obtenir le

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gène edd et le gène eda par PCR (Polymerase Chain Reaction, voir White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)) au moyen d'amorces préparées sur la base des séquences de ces gènes, ou par hybridation au moyen d'une sonde préparée sur la base des séquences mentionnées ci-dessus.

Par exemple, il est possible d'obtenir un fragment d'opéron contenant les gènes edd et eda de Escherichia coli par PCR en utilisant les amorces eddF (SEQ ID NO: 11) et eda-R (SEQ ID NO: 12). Il est possible de même d'obtenir le gène edd et le gène eda d'autres micro-organismes. Les conditions d'hybridation sont par exemple des conditions dans lesquelles le lavage est réalisé a une concentration de sel correspondant à 1 x SSC, 0,1 % SDS, de préférence 0,1 x SSC, 0,1 % SDS, à 60 C.

En outre, le gène edd et le gène eda utilisés ne sont pas limités à des gènes de type sauvage, mais on envisage aussi, selon la présente invention, des mutants ou des gènes modifiés artificiellement qui codent des produits géniques, et qui incluent des substitutions, des délétions, des insertions ou des additions d'un ou plusieurs aminoacides à un ou plusieurs sites, à condition que les fonctions des enzymes EDD et EDA codées ne soient pas détériorées. Bien que le nombre de "plusieurs" aminoacides évoqué ici diffère en fonction de la position ou du type des résidus d'aminoacides dans la structure tridimensionnelle d'une protéine, il peut s'agir spécifiquement de 2 à 60, de préférence de 2 à 40, de préférence encore de 2 à 20. De plus, comme ADN codant une protéine sensiblement identique aux enzymes EDD et/ou EDA mentionnées précédemment, on envisage selon la présente invention un ADN hybridable avec des séquences nucléotidiques d'un gène edd ou eda connu (par exemple numéros d'ordre GenBank L20897, X58364, M60615, M37982) ou une sonde qui peut être produite à partir de ces séquences nucléotidiques dans des conditions stringentes et qui code une protéine ayant une activité similaire à celle de EDD ou EDA. Les conditions stringentes sont des conditions dans lesquelles il se forme un hybride spécifique et dans lesquelles un hybride non spécifique ne se forme pas. Il est difficile d'exprimer clairement cette condition en utilisant des valeurs numériques. Cependant, par exemple, les conditions stringentes comprennent des conditions dans lesquelles des ADN ayant une grande homologie, par exemple des ADN ayant une homologie de 70 % ou plus, de préférence de 80 % ou plus, de préférence encore de 90 % ou plus, de

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manière particulièrement préférable de 95 % ou plus, s'hybrident entre eux tandis que des ADN ayant une homologie inférieure aux valeurs cidessus ne s'hybrident pas entre eux. A titre d'alternative, les conditions stringentes sont illustrées par des conditions dans lesquelles les ADN s'hybrident entre eux à une concentration de sel correspondant à des conditions de lavage typiques de l'hybridation de Southern, c'est-à-dire 1 x SSC, 0,1 % SDS, de préférence 0,1 x SSC, 0,1 % SDS à 60 C.

L'ADN chromosomique peut être préparé à partir d'une bactérie jouant le rôle de donneur d'ADN, par exemple par le procédé de Saito et Miura (H. Saito et K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72,619 (1963) ; Text for Bioengineering Experiments, Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japon, p. 97-98, Baifukan, 1992).

Si l'on prépare un ADN recombiné en ligaturant les gènes edd et/ou eda amplifiés par PCR avec un ADN vecteur réplicable de manière autonome dans une cellule de Escherichia coli et si on l'introduit dans Escherichia coli, les opérations subséquentes sont facilitées. Le vecteur réplicable de manière autonome dans Escherichia coli peut être par exemple pMW219, pSTV28, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322 ou pACYC184.

Pour introduire un ADN recombiné préparé de la manière décrite ci-dessus dans une bactérie Methylophilus, il est possible d'utiliser un procédé quelconque à condition qu'il conduise à une efficacité de transformation suffisante. Il est possible par exemple d'utiliser l'électroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)).

Il est possible aussi d'augmenter le nombre de copies du gène edd et/ou eda en permettant à des copies multiples de ces gènes d'exister dans l'ADN chromosomique d'une bactérie. Pour introduire des copies multiples du gène edd et/ou eda dans l'ADN chromosomique d'une bactérie, on réalise une recombinaison homologue en utilisant comme cible une séquence dont il existe des copies multiples dans l'ADN chromosomique. Il peut s'agir d'un ADN répétitif ou d'une répétition inversée présente à une extrémité d'un élément transposable. En outre, comme décrit dans la demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 2-109985, il est possible aussi d'incorporer le gène edd et/ou eda dans un transposon et de l'amener à être transféré pour introduire des copies multiples des gènes dans l'ADN chromosomique.

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Outre les procédés d'amplification génique mentionnés précédemment, il est possible aussi d'obtenir une stimulation des activités ADD et/ou EDA en remplaçant une séquence de régulation de l'expression telle qu'un promoteur du gène edd et/ou eda dans l'ADN chromosomique ou un plasmide par un promoteur plus fort. Par exemple, il peut s'agir du promoteur lac, du promoteur trp ou du promoteur trc. En outre, comme décrit dans la demande de brevet international publiée WO 00/18935, il est possible de modifier le promoteur pour le rendre plus fort en introduisant une substitution de plusieurs nucléotides dans la région du promoteur du gène edd et/ou eda. La substitution ou la modification de ces promoteurs augmente l'expression du gène edd et/ou eda de sorte que les activités de EDD et/ou EDA sont stimulées ou augmentées. Il est possible de combiner la modification de ces séquences de régulation de l'expression avec l'augmentation du nombre de copies du gène edd et/ou eda.

On peut confirmer la stimulation ou l'augmentation des activités de EDD et EDA en mélangeant une suspension de cellules lysées avec de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase et de l'acide 6phosphogluconique et en mesurant le glycéraldéhyde-3-phosphate produit à partir de l'acide 6-phosphogluconique à titre de substrat. Dans cette réaction, on peut mesurer l'activité EDD en quantifiant l'acide 6phosphogluconique restant après la réaction avec la 6-phosphogluconate déshydrogénase, ou en quantifiant l'acide pyruvique produit en présence d'un excès de 2-céto-3-désoxy-6-phosphogluconate aldolase avec la lactate déshydrogénase. Il est possible de quantifier l'acide 6phosphogluconique ou l'acide pyruvique par le biais d'une augmentation du NADH dans la réaction avec la déshydrogénase. De plus, il est possible aussi de mesurer l'activité EDA en détectant l'acide pyruvique produit à partir du substrat 2-céto-3-désoxy-6-phosphogluconate avec la lactate déshydrogénase.

La bactérie selon la présente invention est une bactérie utilisant le méthanol qui est modifiée de sorte que l'activité EDD et/ou EDA est augmentée, et qui est capable de produire un L-aminoacide par une voie de biosynthèse dans laquelle l'acide pyruvique constitue un intermédiaire.

Le L-aminoacide peut être par exemple la L-lysine, l'acide L-glutamique, la

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L-thréonine, la L-leucine, la L-isoleucine, la L-valine, la L-sérine, la Lalanine, la L-thyrosine ou la L-phénylalanine.

On peut obtenir la bactérie selon la présente invention en modifiant une bactérie utilisant le méthanol capable de produire un Laminoacide de manière à stimuler ou augmenter l'activité EDD et/ou EDA.

Il est possible aussi d'obtenir une bactérie utilisant le méthanol selon la présente invention en conférant une capacité de production d'un Laminoacide à une bactérie assimilant le méthanol modifiée de telle manière que l'activité EDD et/ou EDA est augmentée. De plus, la bactérie utilisant le méthanol selon la présente invention peut être une bactérie a laquelle a été conférée une capacité de production d'un L-aminoacide du fait d'une modification telle que l'activité EDD et/ou EDA est stimulée.

Il est possible d'obtenir une bactérie utilisant le méthanol capable de produire un L-aminoacide en conférant à une souche de type sauvage d'une bactérie utilisant le méthanol une capacité de production d'un L-aminoacide. Pour conférer une capacité de production d'un Laminoacide, il est possible d'utiliser les procédés utilisés conventionnellement pour cultiver des bactéries coryneformes et des bactéries Escherichia, par exemple l'acquisition de souches mutantes auxotrophes, de souches résistant à des analogues ou de souches mutantes concernant la régulation métabolique, la création de souches recombinées dans lesquelles une enzyme du système de biosynthèse de Laminoacides est stimulée ("Amino Acid Fermentation", the Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], 1ère édition, publié le 30 mai 1986, p. 77-100). Lors de la culture de bactéries produisant un Laminoacide, les propriétés d'auxotrophie, de résistance à des analogues, de mutation concernant la régulation métabolique peuvent être conférées individuellement, ou bien deux ou plusieurs d'entre elles peuvent être conférées en combinaison. Les enzymes du système de biosynthèse peuvent être stimulées individuellement ou bien deux ou plusieurs d'entre elles peuvent être stimulées en combinaison. De plus, il est possible de conférer des propriétés incluant l'auxotrophie, la résistance à des analogues et une mutation concernant la régulation métabolique et de stimuler simultanément une enzyme du système de biosynthèse.

Par exemple, il est possible de cultiver des bactéries produisant de la L-lysine sous forme de souches mutantes présentant une

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auxotrophie pour la L-homosérine ou la L-thréonine et la L-méthionine (demandes de brevet japonais publiées n 48-28078 et 56-6499), de souches mutantes présentant une auxotrophie pour l'inositol ou l'acide acétique (demandes de brevet japonais mises à la disposition du public n 55-9784 et 56-8692) ou de souches mutantes qui sont résistantes à l'oxalysine, à l'hydroxamate de lysine, à la S-(2-aminoéthyl)-cystéine, à la y-méthyllysine, à l'a-chlorocaprolactame, au DL-[alpha]-amino-#-caprolactame, à l'a-amino-lauryllactame, à un analogue de l'acide aspartique, à un médicament de type sulfonamide, à un quinoïde ou à la N-lauroylleucine.

Dans la suite, on va décrire un procédé pour conférer ou stimuler une capacité de production d'un L-aminoacide par le biais de l'augmentation de l'expression d'un gène d'une enzyme dans un système de biosynthèse de L-aminoacides.

Il est possible de conférer une capacité de production de Llysine par exemple en stimulant les activités de la dihydrodipicolinate synthase et de l'aspartokinase.

Il est possible de stimuler les activités de la dihydrodipicolinate synthase et de l'aspartokinase dans une bactérie utilisant le méthanol en transformant cette bactérie avec un ADN recombiné préparé en ligaturant un fragment de gène codant la dihydrodipicolinate synthase et un fragment de gène codant l'aspartokinase avec un vecteur fonctionnel dans cette bactérie, de préférence un vecteur de type à copies multiples. Par suite de l'augmentation du nombre de copies du gène codant la dihydrodipicolinate synthase et du gène codant l'aspartokinase dans les cellules de la souche transformante, il est possible d'augmenter ou stimuler les activités de ces enzymes. Dans la suite, la dihydrodipicolinate synthase, l'aspartokinase et l'aspartokinase III sont appelées également en abrégé DDPS, AK et AKIII, respectivement.

Il est possible d'utiliser des micro-organismes quelconques comme micro-organismes fournissant un gène codant la DDPS et un gène codant AK, à condition que les micro-organismes puissent exprimer une activité DDPS et une activité AK dans une bactérie utilisant le méthanol.

De tels micro-organismes peuvent être des souches de type sauvage ou des souches mutantes dérivées de celles-ci. Spécifiquement, il peut s'agir de la souche de E coli (Escherichia coli) K-12 et de la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB10515). Comme on connaît les

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séquences nucléotidiques du gène codant la DDPS provenant de bactéries Escherichia (dapA, Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297 (1986)) et du gène codant la AKIII provenant de bactéries Escherichia (lyse, Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N. et Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261,1052 (1986)), on peut obtenir ces gènes par PCR en utilisant des amorces synthétisées sur la base des séquences nucléotidiques de ces gènes et, comme matrice, l'ADN chromosomique d'un micro-organisme comme E coli K-12.

A titre d'exemples spécifiques, les gènes dapA et lysC issus de E. coli seront illustrés dans la suite. Toutefois, les gènes utilisés selon la présente invention ne sont pas limités à ceux-ci.

Selon la présente invention, on préfère que DDPS et AK ne subissent pas une rétroinhibition par la L-lysine. On sait que DDPS de type sauvage provenant de E coli subit une rétroinhibition par la L-lysine et que AKIII de type sauvage provenant de E, coli subit une suppression et une rétroinhibition par la L-lysine. De ce fait, les gènes dapA et LysC qui sont introduits dans une bactérie utilisant le méthanol codent de préférence une DDPS et une AKIII comportant une mutation qui élimine la rétroinhibition par la L-lysine. Dans la suite la DDPS comportant une mutation qui élimine la rétroinhibition par la L-lysine sera appelée également "DDPS mutante", et un ADN codant la DDPS mutante peut aussi être appelé "dapA mutant ou dapA*". La AKIII provenant de E, coli comportant une mutation qui élimine la rétroinhibition par la L-lysine peut être appelée "AKIII mutante", et un ADN codant la AKIII mutante peut aussi être appelé /ysCmutant.

Selon la présente invention, il n'est pas nécessaire que DDPS et AK soient mutantes. On sait par exemple que la DDPS de type sauvage provenant de bactéries Corynebacterium ne subit pas rétroinhibition par la L-lysine.

Une séquence nucléotidique de dapA de type sauvage provenant de E coli est présentée à titre d'exemple dans SEQ ID NO: 13, et la séquence d'aminoacides de la DDPS de type sauvage codée par cette séquence nucléotidique est présentée à titre d'exemple dans SEQ ID NO: 14.

L'ADN codant la DDPS mutante qui ne subit pas de rétroinhibition par la L-lysine peut être un ADN codant une DDPS ayant la séquence d'aminoacides de SEQ ID NO: 14, mais où le résidu histidine en

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position 118 est remplacé par un résidu tyrosine. De plus, l'ADN codant une AKIII mutante qui ne subit pas de rétroinhibition par la L-lysine peut être un ADN codant une AKIII où le résidu thréonine à la position 352 est remplacé par un résidu isoleucine (brevet US 6 040 160).

Le plasmide utilisé pour le clonage de gène peut être un plasmide quelconque à condition qu'il puisse se répliquer dans des microorganismes comme les bactéries Escherichia, et il peut s'agir par exemple de pBR322, pTWV228, pMW119 ou pUC19.

Le vecteur qui est fonctionnel dans des bactéries utilisant le méthanol peut être par exemple un plasmide qui peut se répliquer de manière autonome dans des bactéries utilisant le méthanol. Il peut s'agir spécifiquement de RSF1010 qui est un vecteur à large spectre d'hôtes, et de ses dérivés, par exemple pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y. D.

Plasmid, 16,161-167 (1986)) et pMFY42 (Gène, 44,53 (1990)), pRP301, pTB70 (Nature, 287,396, (1980)).

Pour préparer un ADN recombiné par ligature de dapA et lysC à un vecteur qui est fonctionnel dans une bactérie utilisant le méthanol, le vecteur est digéré avec une enzyme de restriction appropriée pour les extrémités d'un fragment d'ADN contenant dapA et lysC. Habituellement, la ligature est réalisée au moyen d'une ligase comme l'ADN ligase de T4. dapA et lysC peuvent être incorporés dans des vecteurs séparés ou dans le même vecteur.

Il est possible d'utiliser le plasmide à large spectre d'hôtes RSFD80 (W095/16042) comme plasmide ayant un dapA mutant codant une DDPS mutante et un lysC mutant codant une AKIII mutante. La souche de E coli JM109 transformée avec ce plasmide a été appelée AJ12396 et a été déposée auprès du National Institute of Bioscience of Advanced Industrial Science and Technology le 28 octobre 1993 et s'est vue attribuer le numéro de dépôt FERM P-13936. Puis, le dépôt a été transformé en un dépôt international conformément au Traité de Budapest le 1er novembre 1994 et s'est vu attribuer le numéro de dépôt FERM BP- 4859. Il est possible d'obtenir RSFD80 à partir de la souche AJ12396 au moyen de procédés connus.

Le gène dapA mutant contenu dans le plasmide RSFD80 a une séquence consistant en la séquence nucléotidique de dapA de type sauvage présentée dans SEQ ID NO: 13 dans laquelle C du nucléotide

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n 623 est remplacé par T. Il en résulte que la DDPS mutante codée a la séquence d'aminoacides de SEQ ID NO: 14, à ceci près que le résidu histidine à la position 118 est remplacé par un résidu tyrosine. En outre, le gène lysC mutant contenu dans le plasmide RSFD80 a la séquence nucléotidique de lysC de type sauvage dans laquelle le résidu nucléotidique C à la position 1638 est remplacé par T (brevet US 6 040 160). Il en résulte que la AKIII mutante codée a une séquence dans laquelle le résidu thréonine à la position 352 est remplacé par un résidu isoleucine.

Il est possible d'utiliser un procédé quelconque pour introduire un ADN recombiné préparé comme décrit ci-dessus dans une bactérie utilisant le méthanol, à condition qu'il conduise à une efficacité de transformation suffisante. Par exemple il est possible d'utiliser l'électroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)).

Il est possible aussi de stimuler ou augmenter l'activité DDPS et l'activité AK en permettant à des copies multiples des gènes dapA et lysC d'être présentes sur l'ADN chromosomique d'une bactérie utilisant le méthanol. Pour introduire des copies multiples des gènes dapA et lysC dans l'ADN chromosomique d'une bactérie utilisant le méthanol, on réalise une recombinaison homologue en utilisant comme cible une séquence qui est présente sur l'ADN chromosomique en un certain nombre de copies multiples. Il est possible d'utiliser comme séquence présente sur l'ADN chromosomique en un certain nombre de copies multiples un ADN répétitif ou une répétition inversée présente à l'extrémité d'un élément transposable. A titre d'alternative, comme décrit dans la demande de brevet japonais mise à la disposition du public (Kokai) n 2-109985, il est possible d'introduire des copies multiples des gènes dapA et/ou /ysCdans l'ADN chromosomique en les incorporant dans un transposon et en transférant celui-ci. Dans ces deux procédés, par suite du nombre accru de copies de gènes dapA et lysC dans les souches transformantes, les activités de DDPS et AK sont amplifiées.

Outre l'amplification génique ci-dessus, il est possible de stimuler le gène souhaité en remplaçant une séquence de contrôle de l'expression comme les promoteurs de dapA et lysC par des promoteurs plus forts (demande de brevet japonais mise à la position du public n 1- 215280). Comme promoteurs forts, on connaît par exemple le promoteur

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lac, le promoteur trp, le promoteur trc, le promoteur tac, le promoteur PR et le promoteur PL du phage lambda, le promoteur tet, le promoteur amyE et le promoteur spac. L'introduction de ces promoteurs augmente l'expression du gène souhaité de sorte que l'activité de l'enzyme codée par ce gène est amplifiée. Il est possible de combiner l'augmentation de l'expression d'une séquence de contrôle avec l'augmentation du nombre de copies du gène souhaité.

Pour préparer un ADN recombiné par ligature d'un fragment de gène et d'un vecteur, le vecteur est digéré avec une enzyme de restriction correspondant à l'extrémité du fragment de gène. Habituellement, la ligature est réalisée au moyen d'une ligase comme l'ADN ligase de T4. Comme procédés pour la digestion, la ligature de l'ADN, la préparation d'ADN chromosomique, la PCR, la préparation d'ADN plasmidique, la transformation, la conception d'oligonucléotides utilisés comme amorces, il est possible d'utiliser des procédés courants bien connus de l'homme du métier. De tels procédés sont décrits par Sambrook, J., Fritsch, E. F., et Maniatis, T., dans "Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ème édition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Outre la stimulation de DDPS et AK, il est possible de stimuler aussi d'autres enzymes impliquées dans la biosynthèse de la L-lysine. De telles enzymes comprennent les enzymes de la voie du diaminopimélate comme la dihydrodipicolinate réductase, la diaminopimélate décarboxylase, la diaminopimélate déshydrogénase (voir W096/40934 pour toutes les enzymes précédentes), la phosphoénolpyruvate carboxylase (demande de brevet japonais mise à la disposition du public n 60-87788), l'aspartate aminotransférase (demande de brevet japonais publiée n 6-102028), la diaminopimélate épimérase et l'aspartate semialdéhyde déshydrogénase, et les enzymes de la voie de l'aminoadipate comme l'homoaconitate hydratase.

L'aspartokinase, l'aspartate semialdéhyde déshydrogénase, la dihydrodipicolinate synthase, la dihydrodipicolinate réductase et la diaminopimélate décarboxylase provenant de Methylophilus methylotrophus à titre de bactérie utilisant le méthanol sont décrites dans WOOO/61723.

De plus, les micro-organismes selon la présente invention peuvent avoir une activité diminuée d'une enzyme qui catalyse une

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réaction pour produire un composé différent de la L-lysine par une voie constituant une ramification de la voie de biosynthèse de la L-lysine, ou bien ils peuvent être déficients en une telle enzyme. L'homosérine déshydrogénase (voir W095/23864) est un exemple d'enzyme qui catalyse une réaction pour produire un composé différent de la L-lysine par une voie qui constitue une ramification de la voie de biosynthèse de la L-lysine.

Il est possible d'utiliser de même pour d'autres L-aminoacides les techniques mentionnées précédemment pour stimuler les activités d'enzymes impliquées dans la biosynthèse de la L-lysine. La bactérie utilisant le méthanol selon la présente invention peut avoir un phénotype de type sauvage, à ceci près qu'elle est modifiée de sorte que l'activité EDD et/ou EDA est stimulée, à condition qu'elle soit capable de produire un L-aminoacide.

De plus, il est possible aussi d'améliorer la capacité de produire un L-aminoacide en stimulant ou augmentant l'activité d'une protéine impliquée dans la sécrétion extracellulaire du L-aminoacide. Par exemple, comme protéine impliquée dans la sécrétion extracellulaire de la L-lysine, on connaît la protéine LysE codée par le gène lyse La demanderesse a confirmé que, bien que le gène lyse de type sauvage provenant de bactéries Brevibacterium ne soit pas fonctionnel dans des bactéries Methylophilus ou des bactéries Methylobacillus, il est possible de le modifier pour qu'il soit fonctionnel dans une bactérie méthylotrophe. Des exemples de variants correspondants de la protéine LysE comprennent LysE24 et sont décrits dans les exemples qui suivent.

La protéine LysE qui est codée par le gène lysE comporte six régions en hélice hydrophobes. On suppose que certaines de ces régions hydrophobes sont des domaines transmembranaires. On suppose également qu'une région située entre les troisième et quatrième régions à partir de l'extrémité N-terminale est hydrophile et a une structure en boucle. Dans la présente invention, cette région hydrophile est appelée région en boucle. La séquence nucléotidique de lysE de type sauvage et la séquence d'aminoacides de la protéine LysE de Brevibacterium lactofermentum sont montrées dans SEQ ID NOS : et 8. Dans cette séquence d'aminoacides, les régions en hélice hydrophobes correspondent aux aminoacides n 5 à 20,37 à 58,67 à 93, 146 à 168,181 à 203 et 211 à 232. La région en boucle correspond aux aminoacides n 94 à 145.

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La présente demanderesse a trouvé que le gène lysE était létal quand il est exprimé dans une bactérie utilisant le méthanol, mais que l'ADN codant un variant de la protéine LysE dépourvu de la région en boucle, on consistant sensiblement seulement en les hélices hydrophobes, favorisait la sécrétion de L-lysine et/ou L-arginine à l'extérieur d'une cellule de la bactérie utilisant le méthanol. Le gène lysE24 code une protéine LysE mutante qui ne comporte pas la région en boucle de type sauvage, ou une protéine LysE mutante qui consiste sensiblement seulement en les hélices hydrophobes.

La protéine LysE de type mutant mentionnée précédemment n'est pas limitée particulièrement à condition qu'elle comporte une ou plusieurs hélices hydrophobes et qu'elle favorise la sécrétion extracellulaire de la L-lysine, de la L-arginine ou de ces deux L-aminoacides quand elle est introduite dans une bactérie utilisant le méthanol. Spécifiquement, on envisage un ADN codant une LysE de type mutant qui contient les première à sixième hélices hydrophobes à partir de l'extrémité Nterminale. Plus spécifiquement, on envisage un ADN codant un peptide contenant les première à troisième hélices hydrophobes à partir de l'extrémité N-terminale et un peptide contenant les quatrième à sixième hélices hydrophobes à partir de l'extrémité N-terminale. Le gène lysE24 mentionné précédemment est un exemple de gène lysE de type mutant qui code un peptide contenant les première à troisième hélices hydrophobes et un peptide contenant les quatrième à sixième hélices hydrophobes. Le gène lysE24 résulte de l'introduction d'un codon d'arrêt en aval de la région codant la troisième hélice hydrophobe. La demanderesse a confirmé que si la région en aval de ce codon d'arrêt est délétée, la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 contenant le gène lysE24 ne conduit pas à l'accumulation de L-lysine dans le milieu. De ce fait, on en a déduit qu'un peptide contenant les première à troisième hélices hydrophobes et un peptide contenant les quatrième à sixième hélices hydrophobes sont traduits séparément et fonctionnent séparément dans une bactérie utilisée dans le méthanol. La quantité de L-lysine ou de L-arginine produite augmente néanmoins si le gène lysE24 est introduit dans une bactérie utilisant le méthanol.

Il est possible d'utiliser un micro-organisme quelconque comme micro-organisme d'origine pour un ADN codant une protéine impliquée

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dans la sécrétion de la L-lysine à l'extérieur d'une cellule, c'est-à-dire le gène lysE ou un gène homologue de celui-ci, à condition que le microorganisme choisi comporte des variants des gènes pouvant exprimer l'activité de sécrétion de la L-lysine dans une bactérie utilisant le méthanol. Spécifiquement, de tels micro-organismes comprennent par exemple des bactéries coryneformes comme Corynebacterium glutamicum et Brevibacterium lactofermentum, des bactéries Escherichia comme Escherichia coli, des bactéries Pseudomonas comme Pseudomonas aeruginosa, des bactéries Mycobacterium comme Mycobacterium tuberculosis.

Quand l'expression d'un gène de sécrétion d'aminoacides est augmentée dans une bactérie utilisant le méthanol, il est possible de préparer un ADN recombiné par ligature de son fragment de gène à un vecteur fonctionnel dans une bactérie utilisant le méthanol, de préférence un vecteur de type à copies multiples, et transformation de la bactérie utilisant le méthanol. A titre d'alternative, il est possible d'incorporer le gène dans un transposon que l'on introduit dans le chromosome. De plus, il est possible aussi de ligaturer en amont du gène un promoteur qui conduit à une transcription marquée dans une bactérie utilisant le méthanol.

Il est possible de produire un L-aminoacide en cultivant une bactérie utilisant le méthanol capable de produire le L-aminoacide obtenue comme décrit ci-dessus dans un milieu pour produire et accumuler le Laminoacide dans la culture et en recueillant le L-aminoacide à partir de la culture.

Il est possible de cultiver le micro-organisme utilisé selon la présente invention par un procédé utilisé typiquement pour la culture d'un micro-organisme utilisant le méthanol. Le milieu utilisé peut être un milieu naturel ou synthétique à condition qu'il contienne une source de carbone, une source d'azote, des ions inorganiques et d'autres composants organiques à l'état de traces.

Si le méthanol est utilisé comme principale source de carbone, la L-lysine ou la L-arginine peut être produite à faible coût. Quand le méthanol est utilisé comme principale source de carbone, il est ajouté à un milieu en une quantité de 0,001 à 30 %. Comme source d'azote, on utilise le sulfate d'ammonium, par exemple, en l'ajoutant au milieu. Par

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ailleurs, il est possible d'ajouter de petites quantités de composants présents à l'état de traces comme le phosphate de potassium, le phosphate de sodium, le sulfate de magnésium, le sulfate ferreux et le sulfate de manganèse.

On réalise la culture dans des conditions aérobies sous agitation ou aération par agitation, à un pH de 5 à 9 et à une température de 20 à 45 C, et habituellement la culture est achevée en 24 à 120 h.

On peut recueillir la L-lysine ou la L-arginine à partir de la culture par une combinaison de procédés connus, par exemple en utilisant une résine échangeuse d'ions, la précipitation et d'autres procédés connus.

Dans la suite, la présente invention va être illustrée plus précisément à l'aide d'exemples non limitatifs dans lesquels les réactifs utilisés ont été obtenus auprès de Wako Pure Chemicals ou Nacalai Tesque, sauf indications contraires. Les compositions des milieux utilisés dans chaque exemple sont présentées ci-dessous. On a ajusté le pH avec NaOH ou HCI pour tous les milieux.

Milieu LB : Tryptone peptone (Difco) 10 g/L Extrait de levure (Difco) 5 g/L NaCl 10 g/L pH 7,0
Ces composants ont été stérilisés à la vapeur à 120 C pendant 20 min.

Milieu gélose LB : Milieu LB : Bacto gélose 15 g/L
Ces composants ont été stérilisés à la vapeur à 120 C pendant 20 min.

Milieu SEII : K2HP04 1,9 g/L

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NaH2P04 1,56 g/L MgS04-7H20 0,2 g/L (NH4)2S04 5 g/L CuSO4#TH2O 5 g/L MnS04-5H20 25 g/L ZnS04-7H20 23 g/L CaCl2#2H2O 72 mg/L FeCl3#6H2O 9,7 mg/L CaC03 (Kanto Kagaku) 30 g/L Méthanol 2 % (v/v) pH 7,0
Les composants différents du méthanol ont été soumis à une stérilisation à la vapeur à 121 C pendant 15 min, et le méthanol a été ajouté après un refroidissement suffisant du milieu.

Milieu gélose SE II : K2HP04 1,9 g/L NaH2P04 1,56 g/L MgS04-7H20 0,2 g/L (NH4)2S04 5 g/L CuSO4#5H2O 5 g/L MnSO4#TH2O 25 g/L ZnS04-7H20 23 g/L CaCl2#2H2O 72 mg/L FeCl3#6H2O 9,7 mg/L Méthanol 0,5 % (v/v) pH 7,0 Bacto gélose (Difco) 15 g/L
Les composants différents du méthanol ont été soumis à une stérilisation à la vapeur à 121 C pendant 15 min, et le méthanol a été ajouté après un refroidissement suffisant du milieu.

Exemple 1

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<1> Clonage de gènes d'enzymes de la voie de Entner-Doudoroff
On a cloné à partir de Escherichia coli et Zymomonas mobilis les gènes edd et eda qui codent les enzymes EDD et EDA, respectivement, qui font partie de la voie de Entner-Doudoroff. Comme on sait que les gènes de Escherichia coli peuvent être exprimés dans la souche de Methylophilus methylotrophus AS1, on a décidé de cloner les gènes edd et eda provenant de Escherichia coli et de les exprimer dans une bactérie Methylophilus.

(1) Construction du plasmide pMW-EDDA
Les gènes edd et eda forment un opéron dans Escherichia coli (J. Bacteriol., 174 (14) : 4638-46, juillet 1992) qu'il est possible d'obtenir au moyen de techniques connues. Ainsi, on a conçu edd-F (SEQ ID NO: 11) et eda-R (SEQ ID NO: 12) comme amorces permettant d'amplifier simultanément les gènes eda et edd lors de l'amplification d'un fragment d'ADN qui inclut les deux gènes par PCR en utilisant comme matrice l'ADN chromosomique de la souche de E coli W3110. On a réalisé la PCR en utilisant l'ADN polymérase Pyrobest (Takara Shuzo), en parcourant 30 cycles consistant chacun en une réaction à 94 C pendant 1 min, suivie par des réactions à 94 C pendant 30 s, à 60 C pendant 30 s et à 72 C pendant 3 min.

Puis, on a digéré totalement le fragment amplifié obtenu avec les enzymes de restriction Sali et BamHI, on l'a ligaturé au plasmide pMW219 totalement digéré avec les enzymes de restriction SalI et BamHI que l'on a utilisé pour transformer Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo). On a inoculé les colonies de transformants obtenues à du milieu liquide LB contenant 20 mg/L de kanamycine et on les a cultivées à 37 C pendant 8 h sous agitation. On a extrait l'ADN plasmidique de chaque bouillon de culture par le procédé alcali-SDS, et on a confirmé la structure de chaque plasmide par digestion avec des enzymes de restriction et détermination de la séquence nucléotidique pour obtenir le plasmide cible. On a appelé ce plasmide pMW-EDDA.

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(2) Construction du plasmide pRSedda destiné à être utilisé pour l'introduction des gènes edd et eda dans une bactérie Methylophilus.

Pour introduire les gènes edd et eda dans une bactérie Methylophilus, on a utilisé le plasmide pRS connu pour construire le plasmide pRSedda. pRS est un plasmide contenant le segment de vecteur du plasmide pVIC40 (demande de brevet international publiée W090/04636, demande de brevet international publiée en japonais (Kohyo) n 3-501682) obtenu à partir de pVIC40 par délétion d'une région d'ADN codant l'opéron thréonine contenue dans le plasmide. Le plasmide pVIC40 est issu du vecteur plasmidique à large spectre d'hôtes pAYC32 (Chistorerdov, A. Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 1986,16, 161-167), qui est un dérivé de RSF1010.

Plus précisément, on a construit pRS de la manière suivante.

On a digéré le plasmide pVIC40 avec EcoRI et on l'a ajouté à une solution de phénol/chloroforme, et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure, et on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol, et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 %. On a recueilli un fragment d'ADN d'environ 8 kilopaires de base (en abrégé "kpb") contenant le côté vecteur en utilisant la trousse de collecte d'ADN EASY TRAP Ver. 2 (Takara Shuzo).

On a autoligaturé le fragment de la région vecteur du plasmide pVIC40 préparé comme décrit ci-dessus en utilisant la trousse de ligature d'ADN DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo). On a utilisé cette solution de réaction de ligature pour transformer Escherichia coli (cellules compétentes de E coli JM109, Takara Shuzo). On a appliqué les cellules à du milieu gélose LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on les a incubées pendant une nuit à 37 C. On a inoculé chacune des colonies apparaissant sur le milieu gélose à du milieu liquide LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on les a cultivées à 37 C pendant 8 h sous agitation.

On a extrait l'ADN plasmidique de chaque bouillon de culture par le procédé alcali-SDS et on a confirmé la structure de chaque plasmide par digestion avec des enzymes de restriction pour obtenir pRS.

Puis, on a construit le plasmide pRStac comportant le promoteur tac à partir de pRS selon le schéma montré sur la figure 1. On a digéré le vecteur pRS avec les enzymes de restriction EcoRI et PstI, on l'a ajouté à une solution de phénol/chloroforme et on a mélangé pour

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terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure et on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol, et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 %. On a recueilli un fragment d'ADN de 8 kpb en utilisant la trousse de collecte d'ADN EASY TRAP Ver. 2 (Takara Shuzo). On a amplifié la région du promoteur tac par PCR en utilisant comme matrice le plasmide pKK223-3 (vecteur d'expression, Pharmacia) et les amorces montrées dans SEQ ID NOS:1 et 2 (on a parcouru 30 fois un cycle consistant en une dénaturation à 94 C pendant 20 s, une hybridation à 55 C pendant 30 s et une réaction d'extension à 72 C pendant 60 s). On a utilisé l'ADN polymérase Pyrobest (Takara Shuzo) pour la PCR. On a purifié le fragment d'ADN contenant le promoteur tac amplifié en utilisant PCR prep (Promega) puis on l'a digéré au niveau des sites d'enzymes de restriction préalablement conçus dans les amorces, c'est-à-dire au niveau des sites EcoRI et EcoT22I. Puis, on a ajouté le mélange réactionnel à une solution de phénol/chloroforme et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure et on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol, et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 %. On a recueilli un fragment d'ADN d'environ 0,15 kpb avec EASY TRAP Ver. 2.

On a ligaturé le produit de digestion du vecteur pRS et le fragment de région du promoteur tac préparé comme décrit ci-dessus en utilisant la trousse de ligature d'ADN DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo). On a utilisé cette solution de réaction de ligature pour transformer Escherichia coli (cellules compétentes de E, coliJM109, Takara Shuzo). On a étalé les cellules sur du milieu gélose LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on les a incubées pendant une nuit à 37 C. On a inoculé chacune des colonies apparaissant sur le milieu gélose à du milieu liquide LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on les a cultivées à 37 C pendant 8 h sous agitation. On a extrait l'ADN plasmidique de chaque bouillon de culture par le procédé alcali-SDS et on a confirmé la structure de chaque plasmide par digestion avec des enzymes de restriction pour obtenir pRStac. On a choisi comme plasmide pRStac un plasmide dans lequel les directions de transcription du gène de résistance à la streptomycine sur le vecteur pRS et du promoteur tac étaient identiques.

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Le plasmide pRStac est un plasmide consistant en pRS dans lequel le promoteur tac est inséré pour l'expression des gènes.

Puis, on a digéré le plasmide pRStac avec les enzymes de restriction Sse8387I (Takara Shuzo) et SapI (New England Biolabs), on l'a ajouté à une solution de phénol/chloroforme et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure, et on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol, et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 % pour obtenir un fragment d'ADN d'environ 8,0 kpb. Puis, on a digéré pMW-EDDA construit en (1) ci-dessus avec les enzymes de restriction Sali et BamHI, on a ajouté à une solution de phénol/chloroforme et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure, on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 % pour obtenir un fragment d'ADN d'environ 2,9 kpb.

On a ligaturé le produit de digestion du vecteur pRStac et le fragment de région des gènes edd et eda préparé comme décrit ci-dessus en utilisant la trousse de ligature d'ADN DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo). On a utilisé cette solution de réaction de ligature pour transformer Escherichia coli (cellules compétentes de E. coli JM109, Takara Shuzo). On a étalé les cellules sur du milieu gélose LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on les a incubées pendant une nuit à 37 C. On a inoculé chacune des colonies apparaissant sur le milieu gélosé à du milieu liquide LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on les a cultivées à 37 C pendant 8 h sous agitation. On a extrait l'ADN plasmidique de chaque bouillon de culture en utilisant le procédé alcali-SDS, et on a confirmé la structure de chaque plasmide par digestion avec des enzymes de restriction et détermination de la séquence nucléotidique pour obtenir le plasmide cible. On a appelé ce plasmide pRSedda. Dans pRSedda, les gènes edd et eda étaient positionnés de telle manière que leur direction de transcription était la même que celle du promoteur tac.

<2> Construction d'une bactérie produisant de la L-lysine à partir d'une bactérie Methylophilus.

Pour examiner l'effet du plasmide pRSedda sur la production de L-lysine, on a construit le plasmide pBBR-lysEdapA qui peut coexister avec

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un vecteur dérivé de pRS et qui permet l'amplification de gènes codant une protéine ayant une activité de sécrétion de la L-lysine et l'enzyme DDPS.

(1) Construction de pRSIysE
On a cloné un gène lyse, qui était un gène homologue du gène facilitant la sécrétion de la L-lysine connu pour Corynebacterium glutamicum R127 (Vrljic M., Sahm H., Eggeling L., Molecular Microbiology 22 :815-826 (1996)) à partir de la souche de Brevibacterium lactofermentum 2256, et on a tenté de l'exprimer dans une bactérie Methylophilus.

On a digéré le plasmide pRStac obtenu comme décrit ci-dessus avec les enzymes de restriction Sse8387I (Takara Shuzo) et SapI (New England Biolabs), on a ajouté à une solution de phénol/chloroforme et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure, on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 % pour obtenir un fragment d'ADN d'environ 9,0 kpb.

On a amplifié le fragment de gène lysE par PCR en utilisant comme matrice le chromosome extrait de la souche de Brevibacterium lactofermentum 2256 (ATCC13869) et les amorces montrées dans SEQ ID NOS : 5 et 6 (dénaturation à 94 C pendant 20 s, hybridation à 55 C pendant 30 s et réaction d'extension à 72 C pendant 90 s). On a utilisé l'ADN polymérase Pyrobest (Takara Shuzo) pour la PCR. Dans l'amplification ci-dessus, pour que l'expression du gène lyse devienne possible dans une bactérie Methylophilus, on a conçu les amorces de manière que les nucléotides de 9 à 15 pb à partir du codon d'initiation de la traduction du gène lysE soient remplacés par une séquence dont on sait qu'elle est fonctionnelle dans une bactérie Methylophilus (Wyborn, N. R., Mills, J., Williamis, S. G. et Jones, C. W., Eur. J. Biochem., 240,314-322 (1996)). On a purifié le fragment obtenu en utilisant PCR prep (Promega) puis on l'a digéré avec les enzymes de restriction Sse8387I et SapI. On a ajouté le mélange réactionnel à une solution de phénol/chloroforme et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure, on a extrait les ADN par

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précipitation à l'éthanol et on les a recueillis à partir d'un gel d'agarose à 0,8 %.

On a ligaturé le produit de digestion du vecteur pRStac et le fragment de région du gène lysE préparé comme décrit ci-dessus en utilisant la trousse de ligature d'ADN DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo). On a utilisé cette solution de réaction de ligature pour transformer Escherichia coli (cellules compétentes de E coli JM109, Takara Shuzo). On a étalé les cellules sur du milieu gélose LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on les a incubées pendant une nuit à 37 C. On a inoculé chacune des colonies apparaissant sur le milieu gélose à du milieu liquide LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on les a cultivées à 37 C pendant 8 h sous agitation. On a extrait l'ADN plasmidique de chaque bouillon de culture par le procédé alcali-SDS et on a confirmé la structure de chaque plasmide par digestion avec des enzymes de restriction et détermination de la séquence nucléotidique pour obtenir pRSIysE (figure 1). Dans pRSIysE, le gène lysE était positionné de telle manière que sa direction de transcription était la même que celle du promoteur tac.

(2) Introduction du plasmide pRSIysE dans une bactérie Methylophilus
On a introduit pRSIysE obtenu comme décrit ci-dessus dans la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB10515) par électroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43,197 (1997)). De plus, on a introduit pRS dans la souche AS1 à titre de témoin de la même manière que pour pRSIysE. A titre de résultat, on a obtenu plusieurs milliers de colonies par g d'ADN en utilisant pRS comme témoin, tandis que l'on a obtenu seulement quelques colonies avec pRSIysE.

Quand on a extrait les plasmides de souches transformantes dont on considérait qu'elles contenaient pRSIysE et quand on a étudié leurs séquences nucléotidiques, on a découvert une mutation spontanée dans une région codant lyse pour tous les plasmides examinés, et, dans certains cas, on a découvert une mutation non-sens par laquelle un codon codant un aminoacide était remplacé par un codon d'arrêt qui terminait la traduction. Dans d'autres plasmides, on a observé une délétion dans le gène lysE On a considéré que, dans tous les cas, la fonction de lysE était perdue.

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Comme décrit ci-dessus, la fréquence d'introduction de pRSIysE contenant le gène lyse de longueur intégrale dans Methylophilus methylotrophus était extrêmement basse, et il n'a été possible d'introduire que des plasmides contenant le gène lyse mutant, de sorte que les mutations éliminaient la fonction. En prenant en compte ces faits en combinaison, on a considéré que l'introduction du gène lysE dans Methylophilusmethylotrophusétait létale. Ceci indique que le gène lyse ne peut pas fonctionner universellement pour la sécrétion de L-lysine dans des bactéries hétérogènes.

On a appliqué la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 contenant le plasmide pRSIysE comportant une mutation à une boîte de SEII contenant 50 mg/L de streptomycine et on a cultivé pendant une nuit à 37 C. Puis, on a prélevé par grattage des cellules sur environ 10 cm2de la surface du milieu, on les a inoculées à du milieu de production SEII (20 ml) contenant 50 mg/L de streptomycine, et on les a cultivées à 37 C pendant 34 h sous agitation. Après la fin de la culture, on a retiré les cellules par centrifugation, et on a déterminé la concentration de L-lysine dans le surnageant de la culture au moyen d'un analyseur d'aminoacides (chromatographie liquide à haute vitesse, Nihon Bunko). A titre de résultat, on n'a obtenu sensiblement aucune souche dans laquelle la sécrétion de L-lysine était stimulée malgré l'introduction du gène lysE mutant.

(3) Obtention d'un gène assurant une activité de sécrétion de la L-lysine dans des bactéries Methylophilus.

Comme décrit dans la section précédente, on a suggéré que le gène lysE connu est létal dans les bactéries Methylophilus ce qui conduisait à de nombreux gènes non fonctionnels mutants.

Cependant, pendant l'analyse de pRSIysE dans lequel une mutation était introduite, on a obtenu un gène lyse mutant qui était fonctionnel dans les bactéries Methylophilus et que l'on a appelé lysE24.

Quand on a analysé la séquence nucléotidique de ce gène, on a constaté que cette mutation ne conduisait pas à une substitution d'aminoacides mais qu'il s'agissait d'une mutation non-sens introduisant un codon d'arrêt au voisinage du centre de la région traduite du gène lysE.

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La séquence nucléotidique du gène lysE24 déterminée est montrée dans SEQ ID NO: 9. A titre de comparaison, la séquence nucléotidique du gène lyse de type sauvage de Brevibacterium lactofermentum est montrée dans SEQ ID NO: 7. Dans le gène lysE24, T (thymine) a été insérée après G (guanine) à la 355eme position, ce qui a conduit à la séquence montrée dans SEQ ID NO: 9. Le plasmide contenant le gène lysE24a été appelé pRSIysE24 (figure 1).

La souche de E coli JM109 transformée avec le plasmide pRSIysE24 a été appelée AJ13830 et cette souche a été déposée auprès du National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary le 4 juin 2001 et s'est vue attribuer le numéro de dépôt FERM P-18369. Puis, ce dépôt a été transformé en un dépôt international conformément au Traité de Budapest le 13 mai 2002 sous le numéro de dépôt FERM BP-8040.

On a constaté que quand on introduisait le gène lysE24 dans la souche de Methylophilus methylotrophus AS1, la L-lysine s'accumulait dans le milieu. On a considéré que ceci était dû à une stimulation de la sécrétion de L-lysine.

(4) Construction du plasmide pRSdapA contenant le gène dapA*.

On a préparé un plasmide contenant un gène (dapA*) codant la dihydrodipicolinate synthase qui n'était pas soumise à une rétro-inhibition par la L-lysine, à titre de gène d'une enzyme du système de biosynthèse de la L-lysine.

On a digéré pRStac avec Sse8387I et XbaI, on a ajouté à une solution de phénol/chloroforme et on a mélangé pour terminer la réaction.

Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure, on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 % pour recueillir un fragment d'ADN d'environ 9 kpb.

On a utilisé comme matrice le plasmide connu RSFD80 (W090/16042) contenant le fragment de gène dapA* pour amplifier dapA* par PCR en utilisant les amorces montrées dans SEQ ID NOS : et 4 (dénaturation à 94 C pendant 20 s, hybridation à 55 C pendant 30 s et réaction d'extension à 72 C pendant 60 s). On a utilisé l'ADN polymérase Pyrobest (Takara Shuzo) pour la PCR. On a purifié le fragment dapA*

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obtenu en utilisant PCR prep (Promega) puis on l'a digéré avec les enzymes de restriction Sse8387I et XbaI. On a ajouté le mélange réactionnel à une solution de phénol/chloroforme et on l'a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure et on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 % pour recueillir un fragment d'ADN d'environ 0,1 kpb.

On a ligaturé le produit de digestion du vecteur pRStac et le fragment de région du gène dapA* préparé comme décrit ci-dessus en utilisant la trousse de ligature d'ADN DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo). On a utilisé cette solution de réaction de ligature pour transformer Escherichia coli (cellules compétentes de E co/iJM109, Takara Shuzo). On a étalé les cellules sur du milieu gélosé LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on a incubé pendant une nuit à 37 C. On a inoculé chacune des colonies apparaissant sur le milieu gélose à du milieu liquide LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on les a cultivées à 37 C pendant 8 h sous agitation. On a extrait l'ADN plasmidique de chaque bouillon de culture par le procédé alcali-SDS et on a confirmé la structure de chaque plasmide par digestion avec des enzymes de restriction et détermination de la séquence nucléotidique pour obtenir le plasmide pRSdapA. Dans ce plasmide, le gène dapA* était positionné de telle manière que sa direction de transcription était la même que celle du promoteur tac.

(5) Construction d'un plasmide contenant les gènes lysE24et dapA*.

Pour évaluer l'effet de la combinaison des gènes lysE24 et dapA*, on a construit un plasmide consistant en le plasmide pRSIysE dans lequel le gène dapA* était inséré, selon le schéma montré sur la figure 2.

On a digéré le plasmide pRSIysE24 préparé en (3) ci-dessus avec l'enzyme de restriction SapI et on a rendu franches les extrémités du produit en utilisant la trousse DNA Blunting Kit (Takara Shuzo). De plus, on a digéré le plasmide pRSdapA préparé en (4) ci-dessus avec les enzymes de restriction EcoRI et SapI, et on a séparé un fragment d'environ 1 kpb contenant le promoteur tac et la région dapA* sur un gel d'agarose à 0,8 % et on l'a recueilli en utilisant EASY TRAP Ver. 2 (Takara Shuzo). On a muni ce fragment d'extrémités franches de la manière décrite ci-dessus

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et on l'a ligaturé au produit de digestion de pRSIysE24 mentionné cidessus au moyen de la trousse de ligature d'ADN DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo).

On a utilisé cette solution de réaction de ligature pour transformer Escherichia coli (cellules compétentes de E coli JM109, Takara Shuzo). On a étalé les cellules sur du milieu gélose LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on les a incubées pendant une nuit à 37 C.

On a inoculé chacune des colonies apparaissant sur le milieu gélose à du milieu liquide LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on les a cultivées à 37 C pendant 8 h sous agitation. On a extrait l'ADN plasmidique de chaque bouillon de culture par le procédé alcali-SDS et on a confirmé la structure de chaque plasmide par digestion avec des enzymes de restriction et détermination de la séquence nucléotidique pour obtenir le plasmide pRSIysEdapA. Dans ce plasmide, le gène lysE24 et le gène dapA* étaient positionnés de telle manière que leurs directions de transcription étaient identiques.

On a appelé AJ13832 la souche de E coli JM109 transformée avec le plasmide pRSIysEdapA, et on a déposé cette souche auprès du National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary le 4 juin 2001 et elle s'est vue attribuer le numéro de dépôt FERM P-18371. Puis, le dépôt a été transformé en un dépôt international conformément au Traité de Budapest le 13 mai 2002, sous le numéro de dépôt FERM BP-8042.

(6) Construction du plasmide pBBR-lysEdapA qui peut coexister avec le vecteur pRS
On a préparé le plasmide pBBR-lysEdapA à partir de pRSIysEdapA.

On sait que le plasmide pBBR1 peut se répliquer dans la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 et qu'il peut coexister avec le vecteur pRS (Canadian Journal of Microbiology, 43.197 (1997) ; MoBiTec GmbH, Lotzestrasse 22a 37083 Gottingen Germany, peut être obtenu auprès de Funakoshi). Tout d'abord, on a digéré pBBR1 avec DraI et on a ajouté à une solution de phénol/chloroforme, et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure, on a recueilli les ADN par précipitation à

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l'éthanol et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 % pour recueillir un fragment d'ADN d'environ 5,3 kpb.

Puis, on a digéré avec EcoRI et BglII, le plasmide pRSIysEdapA construit en (5) ci-dessus et on l'a ajouté à une solution de phénol/chloroforme, et on a mélangé pour terminer la réaction. Après avoir centrifugé le mélange réactionnel, on a recueilli la couche supérieure, on a recueilli les ADN par précipitation à l'éthanol et on les a séparés sur un gel d'agarose à 0,8 % pour recueillir un fragment d'ADN d'environ 2,0 kpb contenant les gènes lysE24 et dapA.

On a ligaturé le produit de digestion du vecteur pBBR1 et le fragment d'ADN contenant les régions des gènes lysE24 et dapA préparé comme décrit ci-dessus en utilisant la trousse de ligature d'ADN DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo). On a utilisé cette solution de réaction de ligature pour transformer Escherichia coli (cellules compétentes de E coli JM109, Takara Shuzo). On a étalé les cellules sur du milieu gélosé LB contenant 20 mg/L de kanamycine et on les a incubées pendant une nuit à 37 C. On a inoculé chacune des colonies apparaissant sur le milieu gélose à du milieu liquide LB contenant 20 mg/L de streptomycine et on les a cultivées à 37 C pendant 8 h sous agitation. On a extrait l'ADN plasmidique de chaque bouillon de culture par le procédé alcali-SDS, et on a confirmé la structure de chaque plasmide par digestion avec des enzymes de restriction et détermination de la séquence nucléotidique pour obtenir pBBR-lysEdapA.

On a introduit le plasmide pBBR-lysEdapA obtenu comme décrit ci-dessus dans la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 par électroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43,197 (1997)). De plus, on a introduit aussi pBBR1 dans la souche AS1 à titre de témoin de la même manière que pour pBBR-lysEdapA.

<3> Production de L-lysine au moyen d'une souche dans laquelle la voie de Entner-Doudoroff était stimulée.

On a évalué la capacité de production de L-lysine en introduisant le plasmide p-RSedda dans la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 contenant le plasmide pBBR-lysEdapA obtenu comme décrit ci-dessus (désignée aussi en abrégé ASl/pBBR-lysEdapA) par électroporation. On a étudié les concentrations intracellulaires de

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L-aminoacides et les concentrations de L-aminoacides dans le surnageant de culture pour la souche transformante obtenue (appelée aussi ASl/pBBR-lysEdapA/pRSedda) et pour la souche de Methylophilus methylotrophus ASl/pBBR-lysEdapA dans laquelle le plasmide pRS a été introduit (appelée aussi ASl/pBBR-lysEdapA/pRS).

On a cultivé chaque souche transformante pendant une nuit à 37 C sur une boîte de SEII contenant 50 mg/L de streptomycine et 50 mg/L de kanamycine. Puis, on a prélevé par grattage les cellules sur environ 10 cm2 de la surface du milieu, on les a inoculées à du milieu de production SEII (20 ml) contenant 50 mg/L de streptomycine et 50 mg/L de kanamycine, et on les a cultivées à 37 C pendant 48 h sous agitation.

Après la fin de la culture, on a retiré les cellules d'une partie du bouillon de culture par centrifugation, et on a déterminé les concentrations de L-aminoacide dans le surnageant de culture en utilisant un analyseur d'aminoacides (chromatographie liquide à grande vitesse, Nihon Bunko).

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous. ASl/pBBR-lysEdapA/pRSedda conduisait à une accumulation de L-lysine dans le milieu à une plus grande concentration que ASl/pBBR- lysEdapA/pRS, de sorte qu'il apparaît que la productivité de L-lysine était améliorée par la stimulation des gènes edd et eda.

Tableau 1

<tb>
<tb> Souche <SEP> bactérienne <SEP> Concentration <SEP> de <SEP> L-lysine <SEP> dans <SEP> le
<tb> surnageant <SEP> de <SEP> culture <SEP> (g/L)
<tb> AS1/pBBR-lysEdapA/pRS <SEP> 1,15
<tb> AS1/pBBR-lysEdapA/rRSedda <SEP> 1,35
<tb>

Comme décrit ci-dessus, ces résultats montrent qu'il est possible d'améliorer la production de L-lysine en stimulant l'expression des gènes de la voie de Entner-Doudoroff.

<4> Production de L-valine au moyen d'une souche dont la voie de Entner-Doudoroff est stimulée
On a introduit le plasmide pRSedda obtenu comme décrit ci-dessus dans la souche de Methylophilus methylotrophus AS1 de type

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sauvage par électroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43,197 (1997)). De plus, on a introduit aussi le plasmide pRS dans la souche AS1 de la même manière, à titre de témoin.

On a étudié les concentrations intracellulaires de L-aminoacides et les concentrations de L-aminoacides dans le surnageant de culture pour la souche transformante obtenue (appelée aussi AS1/pRSedda) et pour la souche de Methylophilus methylotrophus dans laquelle le plasmide pRS a été introduit (appelée aussi ASI/pRS) à titre de témoin.

On a cultivé chaque souche transformante pendant une nuit à 37 C sur une boîte de SEII contenant 50 mg/L de streptomycine. Puis, on a prélevé par grattage les cellules sur environ 10 cm2 de la surface du milieu, on les a inoculées à du milieu de production SEII (20 ml) contenant 50 mg/L de streptomycine, et on les a cultivées à 37 C pendant 48 h sous agitation. Après la fin de la culture, on a retiré les cellules d'une partie du bouillon de culture par centrifugation, et on a déterminé les concentrations de L-aminoacides dans le surnageant de culture en utilisant un analyseur d'aminoacides.

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous. La L-valine s'accumulait dans le milieu contenant AS1/pRSedda à une plus grande concentration que dans le cas de ASl/pRS, de sorte qu'il apparaît que la production de L-valine était améliorée grâce à la stimulation des gènes eddet eda.

Tableau 2

<tb>
<tb> Souche <SEP> bactérienne <SEP> Concentration <SEP> de <SEP> L-valine <SEP> dans <SEP> le
<tb> surnageant <SEP> de <SEP> culture <SEP> (g/L)
<tb> AS1/pRS <SEP> 0,01
<tb> ASl/pRSedda <SEP> 0,20
<tb>

Comme décrit ci-dessus, ces résultats montrent qu'il est possible d'améliorer la capacité de production de L-valine en stimulant l'expression des gènes de la voie de Entner-Doudoroff.

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<5> Etude de la capacité de production d'autres L-aminoacides avec une souche dont la voie de Entner-Doudoroff a été stimulée
On a cultivé AS1/pRSedda et AS1/pRS pendant une nuit à 37 C sur une boîte de SEII contenant 50 mg/L de streptomycine. Puis, on a prélevé par grattage les cellules sur environ 10 cm2 de la surface du milieu, on les a inoculées à du milieu de production SEII (20 ml) contenant 50 mg/L de streptomycine, et on les a cultivées à 37 C pendant 48 h sous agitation. Après la fin de la culture, on a retiré les cellules d'une partie du bouillon de culture par centrifugation, et on a déterminé les concentrations de L-aminoacides dans le surnageant de culture en utilisant un analyseur d'aminoacides.

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous. Tous les L-aminoacides s'accumulaient dans le milieu contenant AS1/pRSedda à des concentrations plus élevées que dans le cas de ASl/pRS, de sorte qu'il apparaît que les productions de différents L-aminoacides étaient améliorées du fait de la stimulation de l'expression des gènes edd et eda. En particulier, outre la L-valine dans la section (4) ci-dessus, les productions de L-leucine et de L-isoleucine étaient nettement améliorées.

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Tableau 3

<tb>
<tb> L-aminoacide <SEP> Concentration <SEP> de <SEP> L-aminoacides
<tb> dans <SEP> le <SEP> surnageant <SEP> de <SEP> culture
<tb> (mg/L)
<tb> ASl/pRS <SEP> ASl/pRSedda
<tb> Acide <SEP> L-aspartique <SEP> 0 <SEP> 2
<tb> L-thréonine <SEP> 9,4 <SEP> 18,6
<tb> L-sérine <SEP> 1,8 <SEP> 2
<tb> Acide <SEP> L-glutamique <SEP> 35,9 <SEP> 46,8
<tb> Glycine <SEP> 4,5 <SEP> 6,4
<tb> L-alanine <SEP> 16,7 <SEP> 37,9
<tb> L-valine <SEP> 10,2 <SEP> 202,3
<tb> L-isoleucine <SEP> 9,5 <SEP> 100,1
<tb> L-leucine <SEP> 10,8 <SEP> 53,8
<tb> L-tyrosine <SEP> 8,4 <SEP> 9,7
<tb> L-phénylalanine <SEP> 18,4 <SEP> 20,9
<tb> L-lysine <SEP> 6,4 <SEP> 8
<tb> L-arginine <SEP> 3,6 <SEP> 4
<tb>

D'après ce qui précède, il apparaît qu'il est possible d'améliorer la production de différents L-aminoacides en stimulant ou augmentant l'expression des gènes de la voie de Entner-Doudoroff.

Claims (6)

REVENDICATIONS

1. Procédé de production d'un L-aminoacide comprenant la culture d'un micro-organisme capable de produire un L-aminoacide dans un milieu de sorte que ledit L-aminoacide s'accumule dans le milieu et la collecte dudit L-aminoacide à partir du milieu, caractérisé en ce que ledit micro-organisme est une bactérie utilisant le méthanol disposant de la voie de Entner-Doudoroff et qui est modifiée de telle manière que l'activité 6-phosphogluconate déshydratase et/ou l'activité 2-céto-3-désoxy-6phosphogluconate aldolase est ou sont augmentées, et ledit L-aminoacide est choisi parmi les L-aminoacides produits par une voie de biosynthèse qui utilise l'acide pyruvique comme intermédiaire.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite bactérie utilisant le méthanol comprend une bactérie appartenant au genre Methylophilus.

3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'activité 6-phosphogluconate déshydratase et/ou l'activité 2-céto-3-désoxy-6-phosphogluconate aldolase est ou sont augmentées par augmentation du nombre de copies d'un gène codant la 6-phosphogluconate déshydratase et/ou la 2-céto-3-désoxy-6phosphogluconate aldolase, ou par modification d'une séquence de régulation de l'expression dudit gène de sorte que l'expression du gène est augmentée dans ladite bactérie.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit L-aminoacide est choisi dans le groupe consistant en la L-lysine, la L-leucine, la L-isoleucine et la L-valine.

5. Bactérie utilisant le méthanol disposant de la voie de EntnerDoudoroff caractérisée en ce qu'elle est modifiée de sorte que l'activité 6-phosphogluconate déshydratase et/ou l'activité 2-céto-3-désoxy-6phosphogluconate aldolase est ou sont augmentées et en ce qu'elle est capable de produire un L-aminoacide par une voie de biosynthèse qui utilise l'acide pyruvique comme intermédiaire.

6. Procédé de production d'un L-aminoacide qui est un produit d'une voie de biosynthèse utilisant l'acide pyruvique comme intermédiaire, caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'une bactérie utilisant le méthanol et disposant de la voie de Entner-Doudoroff dans un milieu,

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ladite bactérie étant capable de sécréter un L-aminoacide dans le milieu, et la collecte dudit L-aminoacide à partir du milieu, ladite bactérie étant modifiée pour augmenter l'activité 6-phosphogluconate déshydratase et/ou 2-céto-3-désoxy-6-phosphogluconate aldolase.