JP3932945B2 - Ｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−アミノ酸の製造法及びそれに用いる細菌に関し、詳しくは、Ｌ−アミノ酸生産能が向上した細菌及びそれを用いたＬ−アミノ酸の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸は、従来、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌を用いた発酵法により製造されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年）。また、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属（米国特許第3,220,929号）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、アエロバクター属、キャンディダ属（米国特許第3,563,857号）、エシェリヒア属（特開平5-244970号）等の微生物も、Ｌ−アミノ酸の製造に用いられている。、さらに、エンテロバクター属（EP 1 078 989 A2）、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントエア属に属する微生物（特開2000-106869号）も、Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の製造に用いられている。
【０００３】
また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アミノ酸の生合成酵素を増強することによって、Ｌ−アミノ酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例えば、クエン酸シンターゼ遺伝子が導入されたエンテロバクター属またはクレブシエラ属に属する細菌を用いたＬ−グルタミン酸の製造法（EP 0 999 282 A2）、あるいは、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする各遺伝子が導入されたエンテロバクター属細菌を用いたＬ−グルタミン酸の製造法（EP 1 078 989 A2）が開示されている。
【０００４】
一方、グルコース ６−リン酸イソメラーゼ（WO 01/02542 A1）、フルクトースホスホトランスフェラーゼ（WO 01/48146 A1）、エノラーゼ（WO 01/02543 A1）等の解糖系酵素遺伝子を導入することによって、Ｌ−アミノ酸の生産能を増加させる技術も知られている。
【０００５】
ところで、腸内細菌をはじめとする多くのグラム陰性細菌は、グルコース発酵経路の一つとして、エントナー・ドゥドロフ経路を有している。同経路は６−ホスホグルコン酸から２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸の反応を触媒する６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（以下、「ＥＤＤ」と略す）と２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸を開裂してグリセルアルデヒド−３−リン酸とピルビン酸を生成する酵素２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ（以下、「ＥＤＡ」と略す）から成る。ＥＤＤ及びＥＤＡをコードする遺伝子は、エシェリヒア・コリ及びザイモモナス・モビリス等でクローニングされ、塩基配列が報告されている。エシェリヒア・コリのＥＤＤをコードする遺伝子（edd）及びＥＤＡをコードする遺伝子（eda）の塩基配列は、GenBank accession L20897として登録されている。また、ザイモモナス・モビリスのedaの塩基配列はGenBank accession X58364として、eddの塩基配列はGenBank accession M60615 M37982として、データベースに登録されている。
しかし、エントナー・ドゥドロフ経路とＬ−アミノ酸生産性との関係は知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来知られている技術と異なる観点から、細菌のＬ−アミノ酸生産性を向上させる技術を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、グラム陰性細菌が持つエントナー・ドゥドロフ経路に着目した。糖からＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸に至る代謝経路のうち、主に炭酸ガスを発生するのは、ＥＤＤによって６−ホスホグルコン酸からリブロース−５−リン酸を生成する反応である。特に、ぺントースリン酸経路への炭素流入量が多い菌株では、この反応で放出される炭酸ガスも多いはずである。従って、ぺントースリン酸経路を回避することによって、Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸生産能を向上させることが可能であると考えた。
【０００８】
ぺントースリン酸経路への炭素流入量を減らすためには、▲１▼グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼあるいは６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼを欠損又は弱化させる、あるいは▲２▼エントナー・ドゥドロフ経路を強化する、という２つの方法が考えられる。両者ともに、同じくぺントースリン酸経路迂回効果を期待できるが、▲２▼の場合、活性の強弱を調節することで、ぺントースリン酸経路との炭素分配を変化させることができると考えられるため、ぺントースリン酸経路の中間物質の誘導体である核酸等の供給も可能であると考えられた。そして、種々検討を行った結果、エントナー・ドゥドロフ経路を強化することによって、細菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
【０００９】
（１）Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法において、
前記微生物は、エントナー・ドゥドロフ経路を有し、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性が増強されたグラム陰性細菌であり、前記Ｌ−アミノ酸は、ピルビン酸を中間体とする生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸から選ばれる、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（２）前記細菌は腸内細菌である(1)の方法。
（３）前記細菌はエンテロバクター属細菌である(2)の方法。
（４）６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性又は２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性が、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ又は２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は前記細菌細胞内のこれらの遺伝子の発現が増強されるようにこれらの遺伝子の発現調節配列を改変することにより増強された、(1)〜(3)のいずれかの方法。
（５）前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−グルタミン酸、又はＬ−グルタミン酸が中間体又はアミノ基供与体として用いられる生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸である(1)の方法。
（６）Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニンから選ばれる(1)〜(5)のいずれかの方法。
（７）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸である(6)の方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
＜１＞本発明の細菌
本発明において用いられるグラム陰性細菌は、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有し、かつ、エントナー・ドゥドロフ経路を有するグラム陰性細菌である。
【００１２】
本発明において、「Ｌ−アミノ酸を生産する能力」とは、本発明の細菌を培養したときに、培地中にＬ−アミノ酸を蓄積する能力をいう。このＬ−アミノ酸生産能は、グラム陰性細菌の野生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与または増強された性質であってもよい。本発明を適用することのできるＬ−アミノ酸としては、ピルビン酸を中間体とする生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸であり、具体的には、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン等が挙げられる。
後述の実施例に示すように、ＥＤＤ活性及びＥＤＡ活性を増強することによりエントナー・ドゥドロフ経路を強化された細菌は、アセトイン及び２，３−ブタンジオールの生成が増大した。２，３−ブタンジオールはアセトインから、アセトインはピルビン酸から生成するので、アセトイン及び２，３−ブタンジオールの生成が増大したことは、ピルビン酸の供給量が増大したことを示している。したがって、エントナー・ドゥドロフ経路を強化された細菌は、ピルビン酸を中間体とする生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸の生産能が上昇すると予想される。
【００１３】
エントナー・ドゥドロフ経路を有するグラム陰性細菌として具体的には、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属又はパントエア属、エシェリヒア属、シュードモナス属、アースロバクター属、及びアエロバクター属に属する細菌等が挙げられる。細菌がエントナー・ドゥドロフ経路を有するか否かは、例えば、菌体破砕液をグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ及び６−ホスホグルコン酸と混合し、６−ホスホグルコン酸を基質として生成するグリセルアルデヒド−３−リン酸を検出することによって決定することができる。グリセルアルデヒド−３−リン酸の生成が確認された細菌は、エントナー・ドゥドロフ経路を有する。
【００１４】
本発明に使用する細菌は、目的とするＬ−アミノ酸に応じて、適宜選択することができる。以下に、Ｌ−グルタミン酸の生産に適した細菌を例示するが、本発明はこれらに制限されない。
【００１５】
エンテロバクター属細菌として具体的には、以下の細菌が挙げられる。
エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）
エンテロバクター・アムニゲナス（Enterobacter amnigenus）
エンテロバクター・アスブリア（Enterobacter asburiae）
エンテロバクター・クロエッケ（Enterobacter cloacae）
エンテロバクター・ディソルベンス（Enterobacter dissolvens）
エンテロバクター・ジェルゴビア（Enterobacter gergoviae）
エンテロバクター・ホルマエッケ（Enterobacter hormaechei）
エンテロバクター・インターメディウス（Enterobacter intermedius）
エンテロバクター・ニミプレスラリス（Enterobacter nimipressuralis）
エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）
エンテロバクター・テイロレ（Enterobacter taylorae）
【００１６】
さらに好ましくは、以下に示す菌株が挙げられる。
エンテロバクター・アグロメランス ＡＴＣＣ１２２８７
エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５
エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５６
エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３６０１
エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５及びＡＪ１３５５６は、１９９８年２月１９日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、住所 〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４４及びＦＥＲＭ Ｐ−１６６４５として寄託され、１９９９年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４及びＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５がが付与されている。エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３６０１は、１９９９年８月１８日に、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P-17516として寄託され、２０００年７月６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７２０７が付与されている。また、エンテロバクター・アグロメランス ＡＴＣＣ１２２８７は、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)、住所 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, United States of America）より分譲を受けることができる。
【００１７】
クレブシエラ属細菌としては、以下の細菌が挙げられる。
クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）
クレブシエラ・テリゲナ（K. terrigena）
【００１８】
さらに好ましくは、クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９が挙げられる。クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９は、平成１０年２月１９日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４６として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１６が付与されている。
【００１９】
クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９株は、北海道札幌市の土壌から分離された株である。
本発明で使用されるセラチア属に属する微生物には、以下のようなものがある。
【００２０】
セラチア・リクエファシエンス（Serratia liquefacience）
セラチア・エントモフィラ（Serratia entomophila）
セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）
セラチア・フォンティコーラ（Serratia fonticola）
セラチア・グリメシ（Serratia grimesii）
セラチア・プロテアマキュランス（Serratia proteamaculans）
セラチア・オドリフェラ（Serratia odorifera）
セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）
セラチア・ルビダエ（Serratia rubidaea ）
【００２１】
さらに好ましくは、以下に示す菌株が挙げられる。
セラチア・リクエファシエンス ＡＴＣＣ１４４６０
セラチア・リクエファシエンス ＡＴＣＣ１４４６０は、ＡＴＣＣより分譲を受けることができる。
【００２２】
本発明で使用されるエルビニア属に属する微生物には、以下のようなものがある。
エルビニア・ヘルビコーラ（Erwinia herbicola）（現在はパントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)として分類されている）
エルビニア・アナナス（E. ananas）
エルビニア・カクティシダ（E. cacticida）
エルビニア・クリサンテミ（E. chrysanthemi）
エルビニア・マロティボラ（E. mallotivora）
エルビニア・ペルシシナス（E. persicinus）
エルビニア・プシディ（E. psidii）
エルビニア・ケルシナ（E. quercina）
エルビニア・ラポンティシ（E. rhapontici）
エルビニア・ルブリファシエンス（E. rubrifaciens）
エルビニア・サリシス（E. salicis）
エルビニア・ウレドボラ（E. uredovora）
【００２３】
さらに好ましくは、エルビニア・ヘルビコーラ ＩＡＭ１５９５（パントエア・アグロメランス ＡＪ２６６６）が挙げられる。エルビニア・ヘルビコーラ ＩＡＭ１５９５は、東京大学分子細胞生物学研究所より分譲を受けることができる。
【００２４】
尚、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第９版には、エルビニア・ヘルビコーラは記載されておらず、エルビニア・ヘルビコーラとして分類されていた微生物は、パントエア・アグロメランスに分類されている。このように、エルビニア属に属する微生物及びパントエア属に属する微生物は、互いに近縁である。したがって、パントエア属に属する微生物は、エルビニア属に属する微生物と同様に使用することができる。そのようなパントエア属に属する微生物として、パントエア・アグロメランス及びパントエア・ディスパーサ（Pantoea dispersa）が挙げられる。エルビニア・ヘルビコーラ ＩＡＭ１５９５は、パントエア・アグロメランス ＡＪ２６６６と命名され、平成１１年２月２５日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６６０としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００２５】
本発明で使用されるエシェリヒア属に属する微生物には、エシェリヒア・コリ（Esherichia coli）が挙げられる。
【００２６】
さらに好ましくは、バリン耐性を有するエシェリヒア・コリ、具体的には以下に示す菌株が挙げられる。
エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣＣ１０７９８）
エシェリヒア・コリＷ（ＡＴＣＣ９６３７）
エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣＣ１０７９８）、エシェリヒア・コリＷ（ＡＴＣＣ９６３７）は、ＡＴＣＣより分譲を受けることができる。
【００２７】
本発明のグラム陰性細菌は、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有し、かつ、上記のようなエントナー・ドゥドロフ経路を有する細菌であって、ＥＤＤ活性もしくはＥＤＡ活性、又はこれらの両方の活性が増強されたグラム陰性細菌である。本発明の細菌は、好ましくはＥＤＤ活性及びＥＤＡ活性の両方が増強されたグラム陰性細菌である。
【００２８】
「ＥＤＤ活性又はＥＤＡ活性が増強された」とは、細胞当たりのＥＤＤ活性又はＥＤＡ活性が、野生型の細菌のそれよりも高くなったことをいう。例えば、細胞当たりのＥＤＤ又はＥＤＡ分子の数が増加した場合や、ＥＤＤ又はＥＤＡ分子当たりのＥＤＤ又はＥＤＡの比活性が上昇した場合などが該当する。また、比較対象となる野生型の細菌とは、ＥＤＤ活性又はＥＤＡ活性増強する操作が行われていない細菌である。
【００２９】
細菌のＥＤＤ活性及び／又はＥＤＡ活性の増強は、ＥＤＤ及び／又はＥＤＡをコードする遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、ＥＤＤ及び／又はＥＤＡをコードする遺伝子断片を、目的とする細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを同細菌に導入して形質転換すればよい。ＥＤＤ活性及びＥＤＡ活性の両方を増強する場合は、ＥＤＤをコードする遺伝子断片及びＥＤＡをコードする遺伝子断片は、それぞれ別個に異なるベクターに搭載してもよいが、同じベクターに搭載することが好ましい。尚、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌に上記組換えDNAを導入してもよいが、野生型の細菌に上記組換えDNAを導入して形質転換株を得、その後当該形質転換株にＬ−アミノ酸生産能を付与してもよい。
【００３０】
ＥＤＤをコードする遺伝子及びＥＤＡをコードする遺伝子は、エントナー・ドゥドロフ経路を有するグラム陰性細菌由来の遺伝子のいずれも使用することができる。具体的には、エンテロバクター属細菌由来の遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ由来のＥＤＤをコードする遺伝子（edd）及びＥＤＡをコードする遺伝子（eda）は、オペロンを形成していることが報告されている（J. Bacteriol., 1992, Jul; 174(14): 4638-46）。以下、ＥＤＤをコードする遺伝子をedd、ＥＤＡをコードする遺伝子をedaと記す。また、ザイモモナス属細菌の遺伝子も報告されており、これらの遺伝子の配列に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲ（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）、又は上記遺伝子の配列に基づいて作製したプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、edd及びeda遺伝子を取得することができる。例えば、エシェリヒア・コリのedd及びedaを含むオペロン断片は、後述のプライマーedd-F（配列番号１）及びeda-R（配列番号２）を用いたPCR法によって取得することができる。他の微生物のedd及びedaも、同様にして取得され得る。前記ハイブリダイゼーションの条件としては、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件が挙げられる。
【００３１】
染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【００３２】
PCR法により増幅されたedd及び／又はeda遺伝子は、エシェリヒア・コリ等の細胞内において自律複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pMW219, pSTV28, pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184等が挙げられる。
【００３３】
上記のように調製した組換えDNAをグラム陰性細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、D.A.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）、あるいはエレクトロポレーション法（Miller J.H., “A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., p.279, 1992）等が挙げられる。
【００３４】
edd及び／又はeda遺伝子のコピー数を高めることは、これらの遺伝子を細菌の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。細菌の染色体DNA上にedd及び／又はeda遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、edd及び／又はeda遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。
【００３５】
ＥＤＤ活性及び／又はＥＤＡ活性の増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体DNA上またはプラスミド上のedd及び／又はeda遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開WO00/18935に開示されているように、edd及び／又はeda遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変によりedd及び／又はeda遺伝子の発現が強化され、ＥＤＤ活性及び／又はＥＤＡ活性が増強される。これら発現調節配列の改変は、edd及び／又はeda遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００３６】
ＥＤＤ活性及びＥＤＡ活性が増強されたことは、菌体破砕液を、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ及び６−ホスホグルコン酸と混合し、６−ホスホグルコン酸を基質として生成するグリセルアルデヒド−３−リン酸を測定することによって、確認することができる。この反応において、反応後に残存した６−ホスホグルコン酸を、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼを用いて定量するか、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ過剰存在化で生成するピルビン酸を乳酸デヒドロゲナーゼを用いて定量することによって、ＥＤＤ活性を測定することができる。尚、６−ホスホグルコン酸又はピルビン酸は、デヒドロゲナーゼ反応におけるＮＡＤＨの増加により定量することができる。また、ＥＤＡ活性は、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸を基質として生成するピルビン酸を乳酸デヒドロゲナーゼを用いて検出することによって、測定することができる。
【００３７】
本発明のグラム陰性細菌は、ＥＤＤ及びＥＤＡ以外にも、これらの酵素活性の増強による効果を損なわない限り、Ｌ−アミノ酸生合成を触媒する酵素の活性が増強されていてもよい。
【００３８】
例えば、目的とするＬ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸である場合には、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」ともいう）、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ（以下、「ＣＳ」ともいう）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」ともいう）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等がある。Ｌ−グルタミン酸の生産に用いるる細菌がエンテロバクター属細菌の場合には、上記の酵素のうち、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１種または２種もしくは３種が好ましい。さらに、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨの３種の酵素の活性がともに高められていることが好ましい。特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのＣＳは、α−ケトグルタル酸、Ｌ−グルタミン酸及びＮＡＤＨによる阻害を受けないため、好ましいものである。
【００３９】
ＣＳをコードする遺伝子（ｇｌｔＡ）、ＰＥＰＣをコードする遺伝子（ｐｐｃ）およびＧＤＨをコードする遺伝子（ｇｄｈＡ）の供給源となる生物としては、ＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨ活性を有する生物ならいかなる生物でも良い。なかでも原核生物である細菌、たとえばエンテロバクター属、クレブシェラ属、エルビニア属、パントエア属、セラチア属、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属に属する細菌が好ましい。具体的な例としては、エシェリヒア・コリ、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等が挙げられる。ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、上記のような微生物の染色体ＤＮＡより得ることができる。
【００４０】
ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、おのおのＣＳ、ＰＥＰＣもしくはＧＤＨ活性を欠失した変異株を用いてその栄養要求性を相補するＤＮＡ断片を上記微生物の染色体ＤＮＡから単離することによって取得できる。またエシェリヒア属のこれら遺伝子、コリネバクテリウム属細菌のこれら遺伝子は既に塩基配列が明らかにされていることから（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２巻、５２４３〜５２４９頁、１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９〜９１６頁、１９８４年；Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３〜１９９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１４０巻、１８１７〜１８２８頁、１９９４年；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２１８巻、３３０〜３３９頁、１９８９年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３１７〜３２６頁、１９９２年）それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが可能である。これらの遺伝子のエンテロバクター属細菌等のグラム陰性細菌への導入は、EP 0 670 370 A2、USP 6,197,559、EP 0 999 282 A2、EP 1 078 989 A2に詳述されている。
【００４１】
ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨ、並びに上述した他の酵素の活性の増強は、前記のＥＤＤ及びＥＤＡ活性の増強と同様にして行うことができる。
また、本発明の細菌は、ＥＤＤ及び／又はＥＤＡ活性の増強による効果を損なわない限り、目的とするＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損されていてもよい。例えば、目的とするＬ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸の場合には、このような酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（以下、「αＫＧＤＨ」ともいう）、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。
【００４２】
上記の酵素の活性を低下または欠損させるには、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、目的とする酵素の活性が低下した変異株を選択する方法、あるいは、相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊等の方法がある。αＫＧＤＨをコードする遺伝子の遺伝子破壊については、USP 5,977,331に記載されている。
【００４３】
本発明の細菌の構築に際し、edd及びeda以外の遺伝子を導入する場合は、用いるベクターの種類は少ない方が好ましい。すなわち、ベクターは通常マーカー遺伝子を有しているが、マーカー遺伝子に対応した薬剤等を培地に含有させる必要があるため、ベクターの種類が多いと多数の薬剤を培地に添加することとなり、細菌の生育が悪くなることがある。したがって、ベクターの種類は少ない方が通常、好ましい。好ましいベクターの種類は２種以下、より好ましくは１種である。
【００４４】
また、それぞれコピー数の異なる２種又はそれ以上のベクターを用いる場合は、導入する遺伝子の種類に応じて、コピー数の高いベクターと低いベクターに分配する遺伝子の種類を検討することが好ましい。
【００４５】
遺伝子の単離、及び宿主細菌への遺伝子の導入又は遺伝子破壊等の操作に関し、染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
【００４６】
＜２＞本発明の細菌を用いたＬ−アミノ酸の生産
上記のようにして得られる本発明の細菌を培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造することができる。
【００４７】
本発明の細菌を用いてＬ−アミノ酸を生産するには、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いて常法により行うことができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株の利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
【００４８】
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。これらの中では、グルコース及びスクロースが好ましい。
【００４９】
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用される。
【００５０】
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用され、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。
【００５１】
無機塩類としてはりん酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養は、使用する細菌の種類によっても異なるが、通常、発酵温度20〜45℃、pHを5〜9に制御し、通気培養を行う。培養中にpHが下がる場合には、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして10時間〜120時間程度培養することにより、培養液中に著量のＬ−グルタミンが蓄積される。
【００５２】
培養終了後の培養液からＬ−アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法、例えばイオン交換樹脂法、沈澱法その他の方法に従って行えばよい。
【００５３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００５４】
＜１＞エントナー・ドゥドロフ経路を構成する酵素遺伝子のクローン化
エントナー・ドゥドロフ経路を構成する酵素ＥＤＤ及びＥＤＡをそれぞれコードする遺伝子edd及びedaは、エシェリヒア・コリ、ザイモモナス・モビリス等よりクローン化されている。エンテロバクター・アグロメランスは、分類上腸内細菌群に属し、エシェリヒア・コリと近縁とされ、更にエンテロバクター・アグロメランス中でエシェリヒア・コリの遺伝子は発現可能であることが知られている。従って、エシェリヒア・コリからedd及びeda遺伝子をクローン化することとした。
【００５５】
エシェリヒア・コリにおいては両遺伝子はオぺロンを形成している（J. Bacteriol., 1992, Jul;174(14):4638-46）。そこで、両遺伝子を同時に増幅できるプライマー、edd-F（配列番号１）及びeda-R（配列番号２）を設計し、PCRにより両遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。PCRは、宝酒造（株）製Pyrobest DNA Polymeraseを用い、94℃ 1分の反応の後、94℃ 3O秒、60℃ 3O秒、72℃ 3分からなる反応を30サイクル行った。
【００５６】
次に、得られた増幅断片を制限酵素SalI及びBamHIで完全分解し、プラスミドpMW219をSalI及びBamHIで完全分解したものと連結し、エシェリヒア・コリJM109（宝酒造（株）から購入）を形質転換した。得られた形質転換体から、目的とする大きさの断片を含むクローンを５株選び、それぞれの株からプラスミドを抽出した。
【００５７】
各々のプラスミドをエレクトロポレーション法（Miller J.H., “A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., p.279, 1992）によりエンテロバクター・アグロメランスAJ13601株に導入し、ＥＤＤ及びＥＤＡの活性を測定することにより、edd及びedaが発現しているクローンを選択することとした。
AJ13601株は、以下のようにして得られた菌株である。酸性環境下にてＬ−グルタミン酸耐性を有し、かつ、増殖速度に優れた株として、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355株を土壌から選択した。次に、AJ13355株から粘液質低生産性変異株を誘導し、さらにαＫＧＤＨ遺伝子を欠損させ、AJ13356株を得た。AJ13356株は、αＫＧＤＨ−Ｅ１サブユニット遺伝子（sucA）が破壊された結果、αＫＧＤＨ活性を欠損している。続いて、AJ13356株に、エシェリヒア・コリのクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc）、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdhA）遺伝子を有するプラスミドＲＳＦＣＰＧ、並びにブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇltA遺伝子を有するプラスミドｐＳＴＶＣＢを導入し、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株を得た。同株から、低ｐＨ環境下でＬ−グルタミン酸に対する耐性が向上し、かつ増殖度が最もよい菌株として、AJ13601株を選択した（EP 1 078 989 A2）。
【００５８】
前記のようにして、edd及びeda遺伝子断片を含むプラスミドを導入した形質転換体から無作為に選択した形質転換体を、テトラサイクリン、クロラムフェニコール及びカナマイシンをそれぞれ12.5m/L、25mg/L、25mg/L含むLBGM9液体培地（10g/L トリプトン、5g/L イーストエキストラクト、5g/L NaCl、5g/L グルコースを含む培地に、別殺菌した10× M9（128g/L Na2HPO4・7H20, 30g/L KH2PO4, 5g/L NaCl, 1Og/L NH4Cl）を1/10容添加）で15時間培養した。これらの培養液から遠心により集菌し、50mMTris−HCl pH7.6, 10mM MgCl2で菌体を２回洗浄した後、同バッファーに懸濁した。超音波によって菌体を破砕し、15000rpmで30分遠心し、得られた上清を粗酵素液とした。
【００５９】
ＥＤＤ及びＥＤＡの活性は、両酵素による反応産物を分光工学的手法を用いて測定することにより、同時に測定した。即ち、50mM Tris-HCl pH8.0, 10mM MgCl2, 1mM EDTA, 1mM APAD（アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド）, 5mM K2HPO4, グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ20unit, ６−ホスホグルコン酸、及び粗酵素液を混ぜ合わせ、365nmの吸収の増加を測定することにより、６−ホスホグルコン酸を基質として生成するグリセルアルデヒド−３−リン酸を測定した。ベクターのみを導入した株についても同様の測定を行った。結果を表１に示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】
いずれの株も活性が増強されていることが確認された。最も活性の高いものでは約7.2倍に増強されており、この株の持つプラスミドをpMW-EDDAとした。
【００６２】
＜２＞エントナー・ドゥドロフ経路強化株によるＬ−グルタミン酸生産
次に、エントナー・ドゥドロフ経路の強化がＬ−グルタミン酸生産に与える影響を検討した。
【００６３】
上項で用いたエンテロバクター・アグロメランスAJ13601株は、２種のプラスミドを保持しており、さらにedd及びedaを導入した株は３種のプラスミドを保持している。したがって、培養に３種の薬剤を培地に添加する必要がある。そのため、非常に生育が悪く、Ｌ−グルタミン酸生産培養評価系においては、ほとんど生育しなかった。そこで、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのクエン酸シンターゼ（以下、「CS」ともいう）遺伝子とedd及びeda遺伝子を一つのプラスミドに導入することにより、用いるプラスミドを２種にすることとした。
【００６４】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのCS遺伝子を含むプラスミドｐＳＴＶＣＢの構築に用いたベクターpSTV28と、edd及びeda遺伝子のクローニングに用いたベクターpMW219では、前者のほうがコピー数が高い。AJ13601株は、pSTV28べクターにてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのCS遺伝子を増強しているが、同遺伝子をpMW219を用いて導入するには、発現量を上昇させる必要があると思われた。そこで、CS遺伝子のプロモーター部位をエシェリヒア・コリのCS遺伝子のものに置き換えた遺伝子を構築した。
【００６５】
具体的には、プライマーGLTES1（配列番号３）とGLTEB0（配列番号４）を用い、エシェリヒア・コリW3110株の染色体を鋳型としてCS遺伝子のプロモーター領域を増幅した。更に、プライマーGLTBB0（配列番号５）及びGLTBA1（配列番号６）を用い、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株の染色体を鋳型としてCS遺伝子のORF領域を含む断片を増幅した。この両断片を鋳型として、プライマーGLTES2（配列番号７）及びGLTBA2（配列番号８）を用いてクロスオーバーPCRを行い、目的の断片を得た。この断片を制限酵素SmaI及びHindIIIで消化し、pSTV28の同部位に導入したものをpSTV-CB(*)とした。このプラスミドをKpnI及びHindIIIで消化し、エシェリヒア・コリのCS遺伝子のプロモーターとブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのCS遺伝子のコード領域を含む融合遺伝子断片を回収し、T4 DNAポリメラーゼによって末端を平滑化した。この融合遺伝子断片を、pMW219のSmaI部位に導入したものをpMW-CB(*)とした。また、同融合遺伝子断片を、pMW-EDDAをBamHI処理後、T4 DNAポリメラーゼによって平滑化したものと連結したものを、pMW-CB(*)・EDとした。
【００６６】
次に、AJ13601を、LBGM9液体培地で31.5℃終夜振とうし、１プレートにつき100〜200コロニーとなるよう適当に希釈し、テトラサイクリン12.5mg/Lを含むLBGM9プレートに塗布した。出現したコロニーについて、テトラサイクリン12.5mg/L、及びクロラムフェニコール25mg/Lを含むLBGM9プレートにレプリカし、クロラムフェニコール感受性となった株を取得し、この菌株をG106Sと命名した。G106S株は、RSFCPGのみを保有し、pSTVCBは脱落している。この菌株にpMW-CB(*)又はpMW-CB(*)・EDを導入した株を、それぞれG106S pMW・CB(*)、G106S pMW-CB(*)・EDとした。
【００６７】
これらの菌株のＬ−グルタミン酸生産能を評価するために、ジャーファーメンターによる培養評価に供した。培地には、50g/Lスクロース, 0.4/L MgSO4, 0.1mL/L GD-113(消泡剤), 4g/L (NH4)2S04, 2g/L KH2PO4, 4g/Lイーストエキストラクト,,10mg/L FeSO4・7H20, 10mg/L MnSO4・4〜5H20, O.4g/L L-リジン, 0.4g/L DL-メチオニン, 0.4g/L ジアミノピメリン酸, 12.5mg/L テトラサイクリン, 25mg/L クロラムフェニコールを含む培地300mlを用いた。培養は、通気1/1VVM、撹拌1300rpmで、アンモニアでpHを6.0に制御し、スクロースが消費されるまで行った。培地の660nmにおける吸光度及びＬ−グルタミン酸生産量の経時変化を、図１に示す。また、最終的なＬ−グルタミン酸の生産量を表２に示す。
【００６８】
【表２】
【００６９】
エントナー・ドゥドロフ経路を強化することによって、培養は遅延したものの、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させ得ることが示された。
＜３＞エントナー・ドゥドロフ経路強化株によるアセトイン及び２，３−ブタンジオールの生成に関する検討
前記G106S pMW・CB(*)、及びG106S pMW-CB(*)・ED株を、＜２＞におけるＬ−グルタミン酸生産能の評価と同様にして培養し、経時的に培地中及び菌体中のアセトイン及び２，３−ブタンジオールの生成量を測定した。測定は、ガスクロマトグラフィー（島津製作所、GC-1700A）により、以下の条件で行った。
【００７０】
使用カラム：VARIAN PORAPLOTQ PLOT FS25X32 (0.32mm X 25M)
温度：気化室 250℃、カラム 240℃、FID 250℃
カラム入口圧：180kPa
キャリアガス流量：1.6062ml/分
【００７１】
結果を、図２Ａ（培地中のアセトイン量）、図２Ｂ（培地中の２，３−ブタンジオール量）及び図２Ｃ（単位菌体当たりの生成アセトイン及び２，３−ブタンジオールの合計量）に示す。エントナー・ドゥドロフ経路を強化することによって、アセトイン及び２，３−ブタンジオールの生成が増大することが示された。
【００７２】
【発明の効果】
本発明により、エントナー・ドゥドロフ経路を有する微生物のＬ−アミノ酸生産能を向上させることができる。
【００７３】
【配列表】
【００７４】
【００７５】
【００７６】
【００７７】
【００７８】
【００７９】
【００８０】
【００８１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 edd及びeda遺伝子強化株の生育（Ａ）及びＬ−グルタミン酸生産量（Ｂ）を示す図。
【図２】 edd及びeda遺伝子強化株によるアセトイン及び２，３−ブタンジオールの生成量を示す図。（Ａ）培地中のアセトイン量、（Ｂ）培地中の２，３−ブタンジオール量、（Ｃ）単位菌体当たりの生成アセトイン及び２，３−ブタンジオールの合計量（乾燥菌体重量当たりの重量）。
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−アミノ酸の製造法及びそれに用いる細菌に関し、詳しくは、Ｌ−アミノ酸生産能が向上した細菌及びそれを用いたＬ−アミノ酸の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸は、従来、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌を用いた発酵法により製造されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年）。また、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属（米国特許第3,220,929号）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、アエロバクター属、キャンディダ属（米国特許第3,563,857号）、エシェリヒア属（特開平5-244970号）等の微生物も、Ｌ−アミノ酸の製造に用いられている。、さらに、エンテロバクター属（EP 1 078 989 A2）、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントエア属に属する微生物（特開2000-106869号）も、Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の製造に用いられている。
【０００３】
また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アミノ酸の生合成酵素を増強することによって、Ｌ−アミノ酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例えば、クエン酸シンターゼ遺伝子が導入されたエンテロバクター属またはクレブシエラ属に属する細菌を用いたＬ−グルタミン酸の製造法（EP 0 999 282 A2）、あるいは、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする各遺伝子が導入されたエンテロバクター属細菌を用いたＬ−グルタミン酸の製造法（EP 1 078 989 A2）が開示されている。
【０００４】
一方、グルコース ６−リン酸イソメラーゼ（WO 01/02542 A1）、フルクトースホスホトランスフェラーゼ（WO 01/48146 A1）、エノラーゼ（WO 01/02543 A1）等の解糖系酵素遺伝子を導入することによって、Ｌ−アミノ酸の生産能を増加させる技術も知られている。
【０００５】
ところで、腸内細菌をはじめとする多くのグラム陰性細菌は、グルコース発酵経路の一つとして、エントナー・ドゥドロフ経路を有している。同経路は６−ホスホグルコン酸から２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸の反応を触媒する６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（以下、「ＥＤＤ」と略す）と２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸を開裂してグリセルアルデヒド−３−リン酸とピルビン酸を生成する酵素２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ（以下、「ＥＤＡ」と略す）から成る。ＥＤＤ及びＥＤＡをコードする遺伝子は、エシェリヒア・コリ及びザイモモナス・モビリス等でクローニングされ、塩基配列が報告されている。エシェリヒア・コリのＥＤＤをコードする遺伝子（edd）及びＥＤＡをコードする遺伝子（eda）の塩基配列は、GenBank accession L20897として登録されている。また、ザイモモナス・モビリスのedaの塩基配列はGenBank accession X58364として、eddの塩基配列はGenBank accession M60615 M37982として、データベースに登録されている。
しかし、エントナー・ドゥドロフ経路とＬ−アミノ酸生産性との関係は知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来知られている技術と異なる観点から、細菌のＬ−アミノ酸生産性を向上させる技術を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、グラム陰性細菌が持つエントナー・ドゥドロフ経路に着目した。糖からＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸に至る代謝経路のうち、主に炭酸ガスを発生するのは、ＥＤＤによって６−ホスホグルコン酸からリブロース−５−リン酸を生成する反応である。特に、ぺントースリン酸経路への炭素流入量が多い菌株では、この反応で放出される炭酸ガスも多いはずである。従って、ぺントースリン酸経路を回避することによって、Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸生産能を向上させることが可能であると考えた。
【０００８】
ぺントースリン酸経路への炭素流入量を減らすためには、▲１▼グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼあるいは６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼを欠損又は弱化させる、あるいは▲２▼エントナー・ドゥドロフ経路を強化する、という２つの方法が考えられる。両者ともに、同じくぺントースリン酸経路迂回効果を期待できるが、▲２▼の場合、活性の強弱を調節することで、ぺントースリン酸経路との炭素分配を変化させることができると考えられるため、ぺントースリン酸経路の中間物質の誘導体である核酸等の供給も可能であると考えられた。そして、種々検討を行った結果、エントナー・ドゥドロフ経路を強化することによって、細菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
【０００９】
（１）Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法において、
前記微生物は、エントナー・ドゥドロフ経路を有し、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性が増強されたグラム陰性細菌であり、前記Ｌ−アミノ酸は、ピルビン酸を中間体とする生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸から選ばれる、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（２）前記細菌は腸内細菌である(1)の方法。
（３）前記細菌はエンテロバクター属細菌である(2)の方法。
（４）６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性又は２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性が、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ又は２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は前記細菌細胞内のこれらの遺伝子の発現が増強されるようにこれらの遺伝子の発現調節配列を改変することにより増強された、(1)〜(3)のいずれかの方法。
（５）前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−グルタミン酸、又はＬ−グルタミン酸が中間体又はアミノ基供与体として用いられる生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸である(1)の方法。
（６）Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニンから選ばれる(1)〜(5)のいずれかの方法。
（７）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸である(6)の方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
＜１＞本発明の細菌
本発明において用いられるグラム陰性細菌は、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有し、かつ、エントナー・ドゥドロフ経路を有するグラム陰性細菌である。
【００１２】
本発明において、「Ｌ−アミノ酸を生産する能力」とは、本発明の細菌を培養したときに、培地中にＬ−アミノ酸を蓄積する能力をいう。このＬ−アミノ酸生産能は、グラム陰性細菌の野生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与または増強された性質であってもよい。本発明を適用することのできるＬ−アミノ酸としては、ピルビン酸を中間体とする生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸であり、具体的には、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン等が挙げられる。
後述の実施例に示すように、ＥＤＤ活性及びＥＤＡ活性を増強することによりエントナー・ドゥドロフ経路を強化された細菌は、アセトイン及び２，３−ブタンジオールの生成が増大した。２，３−ブタンジオールはアセトインから、アセトインはピルビン酸から生成するので、アセトイン及び２，３−ブタンジオールの生成が増大したことは、ピルビン酸の供給量が増大したことを示している。したがって、エントナー・ドゥドロフ経路を強化された細菌は、ピルビン酸を中間体とする生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸の生産能が上昇すると予想される。
【００１３】
エントナー・ドゥドロフ経路を有するグラム陰性細菌として具体的には、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属又はパントエア属、エシェリヒア属、シュードモナス属、アースロバクター属、及びアエロバクター属に属する細菌等が挙げられる。細菌がエントナー・ドゥドロフ経路を有するか否かは、例えば、菌体破砕液をグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ及び６−ホスホグルコン酸と混合し、６−ホスホグルコン酸を基質として生成するグリセルアルデヒド−３−リン酸を検出することによって決定することができる。グリセルアルデヒド−３−リン酸の生成が確認された細菌は、エントナー・ドゥドロフ経路を有する。
【００１４】
本発明に使用する細菌は、目的とするＬ−アミノ酸に応じて、適宜選択することができる。以下に、Ｌ−グルタミン酸の生産に適した細菌を例示するが、本発明はこれらに制限されない。
【００１５】
エンテロバクター属細菌として具体的には、以下の細菌が挙げられる。
エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）
エンテロバクター・アムニゲナス（Enterobacter amnigenus）
エンテロバクター・アスブリア（Enterobacter asburiae）
エンテロバクター・クロエッケ（Enterobacter cloacae）
エンテロバクター・ディソルベンス（Enterobacter dissolvens）
エンテロバクター・ジェルゴビア（Enterobacter gergoviae）
エンテロバクター・ホルマエッケ（Enterobacter hormaechei）
エンテロバクター・インターメディウス（Enterobacter intermedius）
エンテロバクター・ニミプレスラリス（Enterobacter nimipressuralis）
エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）
エンテロバクター・テイロレ（Enterobacter taylorae）
【００１６】
さらに好ましくは、以下に示す菌株が挙げられる。
エンテロバクター・アグロメランス ＡＴＣＣ１２２８７
エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５
エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５６
エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３６０１
エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５及びＡＪ１３５５６は、１９９８年２月１９日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、住所 〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４４及びＦＥＲＭ Ｐ−１６６４５として寄託され、１９９９年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４及びＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５がが付与されている。エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３６０１は、１９９９年８月１８日に、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P-17516として寄託され、２０００年７月６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７２０７が付与されている。また、エンテロバクター・アグロメランス ＡＴＣＣ１２２８７は、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)、住所 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, United States of America）より分譲を受けることができる。
【００１７】
クレブシエラ属細菌としては、以下の細菌が挙げられる。
クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）
クレブシエラ・テリゲナ（K. terrigena）
【００１８】
さらに好ましくは、クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９が挙げられる。クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９は、平成１０年２月１９日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４６として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１６が付与されている。
【００１９】
クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９株は、北海道札幌市の土壌から分離された株である。
本発明で使用されるセラチア属に属する微生物には、以下のようなものがある。
【００２０】
セラチア・リクエファシエンス（Serratia liquefacience）
セラチア・エントモフィラ（Serratia entomophila）
セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）
セラチア・フォンティコーラ（Serratia fonticola）
セラチア・グリメシ（Serratia grimesii）
セラチア・プロテアマキュランス（Serratia proteamaculans）
セラチア・オドリフェラ（Serratia odorifera）
セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica）
セラチア・ルビダエ（Serratia rubidaea ）
【００２１】
さらに好ましくは、以下に示す菌株が挙げられる。
セラチア・リクエファシエンス ＡＴＣＣ１４４６０
セラチア・リクエファシエンス ＡＴＣＣ１４４６０は、ＡＴＣＣより分譲を受けることができる。
【００２２】
本発明で使用されるエルビニア属に属する微生物には、以下のようなものがある。
エルビニア・ヘルビコーラ（Erwinia herbicola）（現在はパントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)として分類されている）
エルビニア・アナナス（E. ananas）
エルビニア・カクティシダ（E. cacticida）
エルビニア・クリサンテミ（E. chrysanthemi）
エルビニア・マロティボラ（E. mallotivora）
エルビニア・ペルシシナス（E. persicinus）
エルビニア・プシディ（E. psidii）
エルビニア・ケルシナ（E. quercina）
エルビニア・ラポンティシ（E. rhapontici）
エルビニア・ルブリファシエンス（E. rubrifaciens）
エルビニア・サリシス（E. salicis）
エルビニア・ウレドボラ（E. uredovora）
【００２３】
さらに好ましくは、エルビニア・ヘルビコーラ ＩＡＭ１５９５（パントエア・アグロメランス ＡＪ２６６６）が挙げられる。エルビニア・ヘルビコーラ ＩＡＭ１５９５は、東京大学分子細胞生物学研究所より分譲を受けることができる。
【００２４】
尚、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第９版には、エルビニア・ヘルビコーラは記載されておらず、エルビニア・ヘルビコーラとして分類されていた微生物は、パントエア・アグロメランスに分類されている。このように、エルビニア属に属する微生物及びパントエア属に属する微生物は、互いに近縁である。したがって、パントエア属に属する微生物は、エルビニア属に属する微生物と同様に使用することができる。そのようなパントエア属に属する微生物として、パントエア・アグロメランス及びパントエア・ディスパーサ（Pantoea dispersa）が挙げられる。エルビニア・ヘルビコーラ ＩＡＭ１５９５は、パントエア・アグロメランス ＡＪ２６６６と命名され、平成１１年２月２５日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６６０としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００２５】
本発明で使用されるエシェリヒア属に属する微生物には、エシェリヒア・コリ（Esherichia coli）が挙げられる。
【００２６】
さらに好ましくは、バリン耐性を有するエシェリヒア・コリ、具体的には以下に示す菌株が挙げられる。
エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣＣ１０７９８）
エシェリヒア・コリＷ（ＡＴＣＣ９６３７）
エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣＣ１０７９８）、エシェリヒア・コリＷ（ＡＴＣＣ９６３７）は、ＡＴＣＣより分譲を受けることができる。
【００２７】
本発明のグラム陰性細菌は、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有し、かつ、上記のようなエントナー・ドゥドロフ経路を有する細菌であって、ＥＤＤ活性もしくはＥＤＡ活性、又はこれらの両方の活性が増強されたグラム陰性細菌である。本発明の細菌は、好ましくはＥＤＤ活性及びＥＤＡ活性の両方が増強されたグラム陰性細菌である。
【００２８】
「ＥＤＤ活性又はＥＤＡ活性が増強された」とは、細胞当たりのＥＤＤ活性又はＥＤＡ活性が、野生型の細菌のそれよりも高くなったことをいう。例えば、細胞当たりのＥＤＤ又はＥＤＡ分子の数が増加した場合や、ＥＤＤ又はＥＤＡ分子当たりのＥＤＤ又はＥＤＡの比活性が上昇した場合などが該当する。また、比較対象となる野生型の細菌とは、ＥＤＤ活性又はＥＤＡ活性増強する操作が行われていない細菌である。
【００２９】
細菌のＥＤＤ活性及び／又はＥＤＡ活性の増強は、ＥＤＤ及び／又はＥＤＡをコードする遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、ＥＤＤ及び／又はＥＤＡをコードする遺伝子断片を、目的とする細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを同細菌に導入して形質転換すればよい。ＥＤＤ活性及びＥＤＡ活性の両方を増強する場合は、ＥＤＤをコードする遺伝子断片及びＥＤＡをコードする遺伝子断片は、それぞれ別個に異なるベクターに搭載してもよいが、同じベクターに搭載することが好ましい。尚、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌に上記組換えDNAを導入してもよいが、野生型の細菌に上記組換えDNAを導入して形質転換株を得、その後当該形質転換株にＬ−アミノ酸生産能を付与してもよい。
【００３０】
ＥＤＤをコードする遺伝子及びＥＤＡをコードする遺伝子は、エントナー・ドゥドロフ経路を有するグラム陰性細菌由来の遺伝子のいずれも使用することができる。具体的には、エンテロバクター属細菌由来の遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ由来のＥＤＤをコードする遺伝子（edd）及びＥＤＡをコードする遺伝子（eda）は、オペロンを形成していることが報告されている（J. Bacteriol., 1992, Jul; 174(14): 4638-46）。以下、ＥＤＤをコードする遺伝子をedd、ＥＤＡをコードする遺伝子をedaと記す。また、ザイモモナス属細菌の遺伝子も報告されており、これらの遺伝子の配列に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲ（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）、又は上記遺伝子の配列に基づいて作製したプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、edd及びeda遺伝子を取得することができる。例えば、エシェリヒア・コリのedd及びedaを含むオペロン断片は、後述のプライマーedd-F（配列番号１）及びeda-R（配列番号２）を用いたPCR法によって取得することができる。他の微生物のedd及びedaも、同様にして取得され得る。前記ハイブリダイゼーションの条件としては、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件が挙げられる。
【００３１】
染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【００３２】
PCR法により増幅されたedd及び／又はeda遺伝子は、エシェリヒア・コリ等の細胞内において自律複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pMW219, pSTV28, pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184等が挙げられる。
【００３３】
上記のように調製した組換えDNAをグラム陰性細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、D.A.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）、あるいはエレクトロポレーション法（Miller J.H., “A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., p.279, 1992）等が挙げられる。
【００３４】
edd及び／又はeda遺伝子のコピー数を高めることは、これらの遺伝子を細菌の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。細菌の染色体DNA上にedd及び／又はeda遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、edd及び／又はeda遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。
【００３５】
ＥＤＤ活性及び／又はＥＤＡ活性の増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体DNA上またはプラスミド上のedd及び／又はeda遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開WO00/18935に開示されているように、edd及び／又はeda遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変によりedd及び／又はeda遺伝子の発現が強化され、ＥＤＤ活性及び／又はＥＤＡ活性が増強される。これら発現調節配列の改変は、edd及び／又はeda遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００３６】
ＥＤＤ活性及びＥＤＡ活性が増強されたことは、菌体破砕液を、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ及び６−ホスホグルコン酸と混合し、６−ホスホグルコン酸を基質として生成するグリセルアルデヒド−３−リン酸を測定することによって、確認することができる。この反応において、反応後に残存した６−ホスホグルコン酸を、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼを用いて定量するか、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ過剰存在化で生成するピルビン酸を乳酸デヒドロゲナーゼを用いて定量することによって、ＥＤＤ活性を測定することができる。尚、６−ホスホグルコン酸又はピルビン酸は、デヒドロゲナーゼ反応におけるＮＡＤＨの増加により定量することができる。また、ＥＤＡ活性は、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸を基質として生成するピルビン酸を乳酸デヒドロゲナーゼを用いて検出することによって、測定することができる。
【００３７】
本発明のグラム陰性細菌は、ＥＤＤ及びＥＤＡ以外にも、これらの酵素活性の増強による効果を損なわない限り、Ｌ−アミノ酸生合成を触媒する酵素の活性が増強されていてもよい。
【００３８】
例えば、目的とするＬ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸である場合には、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」ともいう）、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ（以下、「ＣＳ」ともいう）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」ともいう）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等がある。Ｌ−グルタミン酸の生産に用いるる細菌がエンテロバクター属細菌の場合には、上記の酵素のうち、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１種または２種もしくは３種が好ましい。さらに、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨの３種の酵素の活性がともに高められていることが好ましい。特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのＣＳは、α−ケトグルタル酸、Ｌ−グルタミン酸及びＮＡＤＨによる阻害を受けないため、好ましいものである。
【００３９】
ＣＳをコードする遺伝子（ｇｌｔＡ）、ＰＥＰＣをコードする遺伝子（ｐｐｃ）およびＧＤＨをコードする遺伝子（ｇｄｈＡ）の供給源となる生物としては、ＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨ活性を有する生物ならいかなる生物でも良い。なかでも原核生物である細菌、たとえばエンテロバクター属、クレブシェラ属、エルビニア属、パントエア属、セラチア属、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属に属する細菌が好ましい。具体的な例としては、エシェリヒア・コリ、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等が挙げられる。ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、上記のような微生物の染色体ＤＮＡより得ることができる。
【００４０】
ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、おのおのＣＳ、ＰＥＰＣもしくはＧＤＨ活性を欠失した変異株を用いてその栄養要求性を相補するＤＮＡ断片を上記微生物の染色体ＤＮＡから単離することによって取得できる。またエシェリヒア属のこれら遺伝子、コリネバクテリウム属細菌のこれら遺伝子は既に塩基配列が明らかにされていることから（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２巻、５２４３〜５２４９頁、１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９〜９１６頁、１９８４年；Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３〜１９９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１４０巻、１８１７〜１８２８頁、１９９４年；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２１８巻、３３０〜３３９頁、１９８９年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３１７〜３２６頁、１９９２年）それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが可能である。これらの遺伝子のエンテロバクター属細菌等のグラム陰性細菌への導入は、EP 0 670 370 A2、USP 6,197,559、EP 0 999 282 A2、EP 1 078 989 A2に詳述されている。
【００４１】
ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨ、並びに上述した他の酵素の活性の増強は、前記のＥＤＤ及びＥＤＡ活性の増強と同様にして行うことができる。
また、本発明の細菌は、ＥＤＤ及び／又はＥＤＡ活性の増強による効果を損なわない限り、目的とするＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損されていてもよい。例えば、目的とするＬ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸の場合には、このような酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（以下、「αＫＧＤＨ」ともいう）、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。
【００４２】
上記の酵素の活性を低下または欠損させるには、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、目的とする酵素の活性が低下した変異株を選択する方法、あるいは、相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊等の方法がある。αＫＧＤＨをコードする遺伝子の遺伝子破壊については、USP 5,977,331に記載されている。
【００４３】
本発明の細菌の構築に際し、edd及びeda以外の遺伝子を導入する場合は、用いるベクターの種類は少ない方が好ましい。すなわち、ベクターは通常マーカー遺伝子を有しているが、マーカー遺伝子に対応した薬剤等を培地に含有させる必要があるため、ベクターの種類が多いと多数の薬剤を培地に添加することとなり、細菌の生育が悪くなることがある。したがって、ベクターの種類は少ない方が通常、好ましい。好ましいベクターの種類は２種以下、より好ましくは１種である。
【００４４】
また、それぞれコピー数の異なる２種又はそれ以上のベクターを用いる場合は、導入する遺伝子の種類に応じて、コピー数の高いベクターと低いベクターに分配する遺伝子の種類を検討することが好ましい。
【００４５】
遺伝子の単離、及び宿主細菌への遺伝子の導入又は遺伝子破壊等の操作に関し、染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
【００４６】
＜２＞本発明の細菌を用いたＬ−アミノ酸の生産
上記のようにして得られる本発明の細菌を培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造することができる。
【００４７】
本発明の細菌を用いてＬ−アミノ酸を生産するには、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いて常法により行うことができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株の利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
【００４８】
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。これらの中では、グルコース及びスクロースが好ましい。
【００４９】
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用される。
【００５０】
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用され、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。
【００５１】
無機塩類としてはりん酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養は、使用する細菌の種類によっても異なるが、通常、発酵温度20〜45℃、pHを5〜9に制御し、通気培養を行う。培養中にpHが下がる場合には、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして10時間〜120時間程度培養することにより、培養液中に著量のＬ−グルタミンが蓄積される。
【００５２】
培養終了後の培養液からＬ−アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法、例えばイオン交換樹脂法、沈澱法その他の方法に従って行えばよい。
【００５３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００５４】
＜１＞エントナー・ドゥドロフ経路を構成する酵素遺伝子のクローン化
エントナー・ドゥドロフ経路を構成する酵素ＥＤＤ及びＥＤＡをそれぞれコードする遺伝子edd及びedaは、エシェリヒア・コリ、ザイモモナス・モビリス等よりクローン化されている。エンテロバクター・アグロメランスは、分類上腸内細菌群に属し、エシェリヒア・コリと近縁とされ、更にエンテロバクター・アグロメランス中でエシェリヒア・コリの遺伝子は発現可能であることが知られている。従って、エシェリヒア・コリからedd及びeda遺伝子をクローン化することとした。
【００５５】
エシェリヒア・コリにおいては両遺伝子はオぺロンを形成している（J. Bacteriol., 1992, Jul;174(14):4638-46）。そこで、両遺伝子を同時に増幅できるプライマー、edd-F（配列番号１）及びeda-R（配列番号２）を設計し、PCRにより両遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。PCRは、宝酒造（株）製Pyrobest DNA Polymeraseを用い、94℃ 1分の反応の後、94℃ 3O秒、60℃ 3O秒、72℃ 3分からなる反応を30サイクル行った。
【００５６】
次に、得られた増幅断片を制限酵素SalI及びBamHIで完全分解し、プラスミドpMW219をSalI及びBamHIで完全分解したものと連結し、エシェリヒア・コリJM109（宝酒造（株）から購入）を形質転換した。得られた形質転換体から、目的とする大きさの断片を含むクローンを５株選び、それぞれの株からプラスミドを抽出した。
【００５７】
各々のプラスミドをエレクトロポレーション法（Miller J.H., “A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., p.279, 1992）によりエンテロバクター・アグロメランスAJ13601株に導入し、ＥＤＤ及びＥＤＡの活性を測定することにより、edd及びedaが発現しているクローンを選択することとした。
AJ13601株は、以下のようにして得られた菌株である。酸性環境下にてＬ−グルタミン酸耐性を有し、かつ、増殖速度に優れた株として、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355株を土壌から選択した。次に、AJ13355株から粘液質低生産性変異株を誘導し、さらにαＫＧＤＨ遺伝子を欠損させ、AJ13356株を得た。AJ13356株は、αＫＧＤＨ−Ｅ１サブユニット遺伝子（sucA）が破壊された結果、αＫＧＤＨ活性を欠損している。続いて、AJ13356株に、エシェリヒア・コリのクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc）、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdhA）遺伝子を有するプラスミドＲＳＦＣＰＧ、並びにブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇltA遺伝子を有するプラスミドｐＳＴＶＣＢを導入し、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株を得た。同株から、低ｐＨ環境下でＬ−グルタミン酸に対する耐性が向上し、かつ増殖度が最もよい菌株として、AJ13601株を選択した（EP 1 078 989 A2）。
【００５８】
前記のようにして、edd及びeda遺伝子断片を含むプラスミドを導入した形質転換体から無作為に選択した形質転換体を、テトラサイクリン、クロラムフェニコール及びカナマイシンをそれぞれ12.5m/L、25mg/L、25mg/L含むLBGM9液体培地（10g/L トリプトン、5g/L イーストエキストラクト、5g/L NaCl、5g/L グルコースを含む培地に、別殺菌した10× M9（128g/L Na2HPO4・7H20, 30g/L KH2PO4, 5g/L NaCl, 1Og/L NH4Cl）を1/10容添加）で15時間培養した。これらの培養液から遠心により集菌し、50mMTris−HCl pH7.6, 10mM MgCl2で菌体を２回洗浄した後、同バッファーに懸濁した。超音波によって菌体を破砕し、15000rpmで30分遠心し、得られた上清を粗酵素液とした。
【００５９】
ＥＤＤ及びＥＤＡの活性は、両酵素による反応産物を分光工学的手法を用いて測定することにより、同時に測定した。即ち、50mM Tris-HCl pH8.0, 10mM MgCl2, 1mM EDTA, 1mM APAD（アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド）, 5mM K2HPO4, グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ20unit, ６−ホスホグルコン酸、及び粗酵素液を混ぜ合わせ、365nmの吸収の増加を測定することにより、６−ホスホグルコン酸を基質として生成するグリセルアルデヒド−３−リン酸を測定した。ベクターのみを導入した株についても同様の測定を行った。結果を表１に示す。
【００６０】
【表１】
いずれの株も活性が増強されていることが確認された。最も活性の高いものでは約7.2倍に増強されており、この株の持つプラスミドをpMW-EDDAとした。
【００６２】
＜２＞エントナー・ドゥドロフ経路強化株によるＬ−グルタミン酸生産
次に、エントナー・ドゥドロフ経路の強化がＬ−グルタミン酸生産に与える影響を検討した。
【００６３】
上項で用いたエンテロバクター・アグロメランスAJ13601株は、２種のプラスミドを保持しており、さらにedd及びedaを導入した株は３種のプラスミドを保持している。したがって、培養に３種の薬剤を培地に添加する必要がある。そのため、非常に生育が悪く、Ｌ−グルタミン酸生産培養評価系においては、ほとんど生育しなかった。そこで、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのクエン酸シンターゼ（以下、「CS」ともいう）遺伝子とedd及びeda遺伝子を一つのプラスミドに導入することにより、用いるプラスミドを２種にすることとした。
【００６４】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのCS遺伝子を含むプラスミドｐＳＴＶＣＢの構築に用いたベクターpSTV28と、edd及びeda遺伝子のクローニングに用いたベクターpMW219では、前者のほうがコピー数が高い。AJ13601株は、pSTV28べクターにてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのCS遺伝子を増強しているが、同遺伝子をpMW219を用いて導入するには、発現量を上昇させる必要があると思われた。そこで、CS遺伝子のプロモーター部位をエシェリヒア・コリのCS遺伝子のものに置き換えた遺伝子を構築した。
【００６５】
具体的には、プライマーGLTES1（配列番号３）とGLTEB0（配列番号４）を用い、エシェリヒア・コリW3110株の染色体を鋳型としてCS遺伝子のプロモーター領域を増幅した。更に、プライマーGLTBB0（配列番号５）及びGLTBA1（配列番号６）を用い、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株の染色体を鋳型としてCS遺伝子のORF領域を含む断片を増幅した。この両断片を鋳型として、プライマーGLTES2（配列番号７）及びGLTBA2（配列番号８）を用いてクロスオーバーPCRを行い、目的の断片を得た。この断片を制限酵素SmaI及びHindIIIで消化し、pSTV28の同部位に導入したものをpSTV-CB(*)とした。このプラスミドをKpnI及びHindIIIで消化し、エシェリヒア・コリのCS遺伝子のプロモーターとブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのCS遺伝子のコード領域を含む融合遺伝子断片を回収し、T4 DNAポリメラーゼによって末端を平滑化した。この融合遺伝子断片を、pMW219のSmaI部位に導入したものをpMW-CB(*)とした。また、同融合遺伝子断片を、pMW-EDDAをBamHI処理後、T4 DNAポリメラーゼによって平滑化したものと連結したものを、pMW-CB(*)・EDとした。
【００６６】
次に、AJ13601を、LBGM9液体培地で31.5℃終夜振とうし、１プレートにつき100〜200コロニーとなるよう適当に希釈し、テトラサイクリン12.5mg/Lを含むLBGM9プレートに塗布した。出現したコロニーについて、テトラサイクリン12.5mg/L、及びクロラムフェニコール25mg/Lを含むLBGM9プレートにレプリカし、クロラムフェニコール感受性となった株を取得し、この菌株をG106Sと命名した。G106S株は、RSFCPGのみを保有し、pSTVCBは脱落している。この菌株にpMW-CB(*)又はpMW-CB(*)・EDを導入した株を、それぞれG106S pMW・CB(*)、G106S pMW-CB(*)・EDとした。
【００６７】
これらの菌株のＬ−グルタミン酸生産能を評価するために、ジャーファーメンターによる培養評価に供した。培地には、50g/Lスクロース, 0.4/L MgSO4, 0.1mL/L GD-113(消泡剤), 4g/L (NH4)2S04, 2g/L KH2PO4, 4g/Lイーストエキストラクト,,10mg/L FeSO4・7H20, 10mg/L MnSO4・4〜5H20, O.4g/L L-リジン, 0.4g/L DL-メチオニン, 0.4g/L ジアミノピメリン酸, 12.5mg/L テトラサイクリン, 25mg/L クロラムフェニコールを含む培地300mlを用いた。培養は、通気1/1VVM、撹拌1300rpmで、アンモニアでpHを6.0に制御し、スクロースが消費されるまで行った。培地の660nmにおける吸光度及びＬ−グルタミン酸生産量の経時変化を、図１に示す。また、最終的なＬ−グルタミン酸の生産量を表２に示す。
【００６８】
【表２】
エントナー・ドゥドロフ経路を強化することによって、培養は遅延したものの、Ｌ−グルタミン酸生産能を向上させ得ることが示された。
＜３＞エントナー・ドゥドロフ経路強化株によるアセトイン及び２，３−ブタンジオールの生成に関する検討
前記G106S pMW・CB(*)、及びG106S pMW-CB(*)・ED株を、＜２＞におけるＬ−グルタミン酸生産能の評価と同様にして培養し、経時的に培地中及び菌体中のアセトイン及び２，３−ブタンジオールの生成量を測定した。測定は、ガスクロマトグラフィー（島津製作所、GC-1700A）により、以下の条件で行った。
【００７０】
使用カラム：VARIAN PORAPLOTQ PLOT FS25X32 (0.32mm X 25M)
温度：気化室 250℃、カラム 240℃、FID 250℃
カラム入口圧：180kPa
キャリアガス流量：1.6062ml/分
【００７１】
結果を、図２Ａ（培地中のアセトイン量）、図２Ｂ（培地中の２，３−ブタンジオール量）及び図２Ｃ（単位菌体当たりの生成アセトイン及び２，３−ブタンジオールの合計量）に示す。エントナー・ドゥドロフ経路を強化することによって、アセトイン及び２，３−ブタンジオールの生成が増大することが示された。
【００７２】
【発明の効果】
本発明により、エントナー・ドゥドロフ経路を有する微生物のＬ−アミノ酸生産能を向上させることができる。
【００７３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 edd及びeda遺伝子強化株の生育（Ａ）及びＬ−グルタミン酸生産量（Ｂ）を示す図。
【図２】 edd及びeda遺伝子強化株によるアセトイン及び２，３−ブタンジオールの生成量を示す図。（Ａ）培地中のアセトイン量、（Ｂ）培地中の２，３−ブタンジオール量、（Ｃ）単位菌体当たりの生成アセトイン及び２，３−ブタンジオールの合計量（乾燥菌体重量当たりの重量）。
Claims (6)
- Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法において、前記微生物は、エントナー・ドゥドロフ経路を有し、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性がこれらの酵素をコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は前記細菌細胞内のこれらの遺伝子の発現が増強されるようにこれらの遺伝子のプロモーターを改変することにより増強されたグラム陰性細菌であり、前記Ｌ−アミノ酸は、ピルビン酸を中間体とする生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸から選ばれる、Ｌ−アミノ酸の製造法。
- 前記細菌は腸内細菌である請求項１記載の方法。
- 前記細菌はエンテロバクター属細菌である請求項２記載の方法。
- 前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−グルタミン酸、又はＬ−グルタミン酸が中間体又はアミノ基供与体として用いられる生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸である請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
- Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニンから選ばれる請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸である請求項５記載の方法。
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