JP2003274988A - Ｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents
Ｌ−アミノ酸の製造法Info
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
Abstract
(57)【要約】
【課題】 従来知られている技術と異なる観点から、細
菌のＬ−アミノ酸生産性を向上させる技術を提供する。 【解決手段】 Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微
生物を培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を培地中に生成蓄積
させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ
酸の製造法において、前記微生物として、エントナー・
ドゥドロフ経路を有し、かつ、６−ホスホグルコン酸デ
ヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６
−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両
方の活性が増強されたグラム陰性細菌を用いる。
菌のＬ−アミノ酸生産性を向上させる技術を提供する。 【解決手段】 Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微
生物を培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を培地中に生成蓄積
させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ
酸の製造法において、前記微生物として、エントナー・
ドゥドロフ経路を有し、かつ、６−ホスホグルコン酸デ
ヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６
−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両
方の活性が増強されたグラム陰性細菌を用いる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｌ−アミノ酸の製
造法及びそれに用いる細菌に関し、詳しくは、Ｌ−アミ
ノ酸生産能が向上した細菌及びそれを用いたＬ−アミノ
酸の製造法に関する。
造法及びそれに用いる細菌に関し、詳しくは、Ｌ−アミ
ノ酸生産能が向上した細菌及びそれを用いたＬ−アミノ
酸の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸は、
従来、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリ
ウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ
型細菌を用いた発酵法により製造されている（アミノ酸
発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６
年）。また、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシ
リウム属（米国特許第3,220,929号）、シュードモナス
属、アースロバクター属、セラチア属、アエロバクター
属、キャンディダ属（米国特許第3,563,857号）、エシ
ェリヒア属（特開平5-244970号）等の微生物も、Ｌ−ア
ミノ酸の製造に用いられている。、さらに、エンテロバ
クター属（EP 1 078 989 A2）、クレブシエラ属、エル
ビニア属又はパントエア属に属する微生物（特開2000-1
06869号）も、Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の製
造に用いられている。
従来、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリ
ウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ
型細菌を用いた発酵法により製造されている（アミノ酸
発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６
年）。また、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシ
リウム属（米国特許第3,220,929号）、シュードモナス
属、アースロバクター属、セラチア属、アエロバクター
属、キャンディダ属（米国特許第3,563,857号）、エシ
ェリヒア属（特開平5-244970号）等の微生物も、Ｌ−ア
ミノ酸の製造に用いられている。、さらに、エンテロバ
クター属（EP 1 078 989 A2）、クレブシエラ属、エル
ビニア属又はパントエア属に属する微生物（特開2000-1
06869号）も、Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の製
造に用いられている。
【０００３】また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アミノ
酸の生合成酵素を増強することによって、Ｌ−アミノ酸
の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例
えば、クエン酸シンターゼ遺伝子が導入されたエンテロ
バクター属またはクレブシエラ属に属する細菌を用いた
Ｌ−グルタミン酸の製造法（EP 0 999 282 A2）、ある
いは、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベ
ートカルボキシラーゼ、およびグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼをコードする各遺伝子が導入されたエンテロバク
ター属細菌を用いたＬ−グルタミン酸の製造法（EP 1 0
78 989 A2）が開示されている。
酸の生合成酵素を増強することによって、Ｌ−アミノ酸
の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例
えば、クエン酸シンターゼ遺伝子が導入されたエンテロ
バクター属またはクレブシエラ属に属する細菌を用いた
Ｌ−グルタミン酸の製造法（EP 0 999 282 A2）、ある
いは、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベ
ートカルボキシラーゼ、およびグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼをコードする各遺伝子が導入されたエンテロバク
ター属細菌を用いたＬ−グルタミン酸の製造法（EP 1 0
78 989 A2）が開示されている。
【０００４】一方、グルコース ６−リン酸イソメラー
ゼ（WO 01/02542 A1）、フルクトースホスホトランスフ
ェラーゼ（WO 01/48146 A1）、エノラーゼ（WO 01/0254
3 A1）等の解糖系酵素遺伝子を導入することによって、
Ｌ−アミノ酸の生産能を増加させる技術も知られてい
る。
ゼ（WO 01/02542 A1）、フルクトースホスホトランスフ
ェラーゼ（WO 01/48146 A1）、エノラーゼ（WO 01/0254
3 A1）等の解糖系酵素遺伝子を導入することによって、
Ｌ−アミノ酸の生産能を増加させる技術も知られてい
る。
【０００５】ところで、腸内細菌をはじめとする多くの
グラム陰性細菌は、グルコース発酵経路の一つとして、
エントナー・ドゥドロフ経路を有している。同経路は６
−ホスホグルコン酸から２−ケト−３−デオキシ−６−
ホスホグルコン酸の反応を触媒する６−ホスホグルコン
酸デヒドラターゼ（以下、「ＥＤＤ」と略す）と２−ケ
ト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸を開裂してグ
リセルアルデヒド−３−リン酸とピルビン酸を生成する
酵素２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸ア
ルドラーゼ（以下、「ＥＤＡ」と略す）から成る。ＥＤ
Ｄ及びＥＤＡをコードする遺伝子は、エシェリヒア・コ
リ及びザイモモナス・モビリス等でクローニングされ、
塩基配列が報告されている。エシェリヒア・コリのＥＤ
Ｄをコードする遺伝子（edd）及びＥＤＡをコードする
遺伝子（eda）の塩基配列は、GenBank accession L2089
7として登録されている。また、ザイモモナス・モビリ
スのedaの塩基配列はGenBank accession X58364とし
て、eddの塩基配列はGenBank accession M60615 M37982
として、データベースに登録されている。しかし、エン
トナー・ドゥドロフ経路とＬ−アミノ酸生産性との関係
は知られていない。
グラム陰性細菌は、グルコース発酵経路の一つとして、
エントナー・ドゥドロフ経路を有している。同経路は６
−ホスホグルコン酸から２−ケト−３−デオキシ−６−
ホスホグルコン酸の反応を触媒する６−ホスホグルコン
酸デヒドラターゼ（以下、「ＥＤＤ」と略す）と２−ケ
ト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸を開裂してグ
リセルアルデヒド−３−リン酸とピルビン酸を生成する
酵素２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸ア
ルドラーゼ（以下、「ＥＤＡ」と略す）から成る。ＥＤ
Ｄ及びＥＤＡをコードする遺伝子は、エシェリヒア・コ
リ及びザイモモナス・モビリス等でクローニングされ、
塩基配列が報告されている。エシェリヒア・コリのＥＤ
Ｄをコードする遺伝子（edd）及びＥＤＡをコードする
遺伝子（eda）の塩基配列は、GenBank accession L2089
7として登録されている。また、ザイモモナス・モビリ
スのedaの塩基配列はGenBank accession X58364とし
て、eddの塩基配列はGenBank accession M60615 M37982
として、データベースに登録されている。しかし、エン
トナー・ドゥドロフ経路とＬ−アミノ酸生産性との関係
は知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来知られ
ている技術と異なる観点から、細菌のＬ−アミノ酸生産
性を向上させる技術を提供することを課題とする。
ている技術と異なる観点から、細菌のＬ−アミノ酸生産
性を向上させる技術を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、グラム陰
性細菌が持つエントナー・ドゥドロフ経路に着目した。
糖からＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸に至る代謝経
路のうち、主に炭酸ガスを発生するのは、ＥＤＤによっ
て６−ホスホグルコン酸からリブロース−５−リン酸を
生成する反応である。特に、ぺントースリン酸経路への
炭素流入量が多い菌株では、この反応で放出される炭酸
ガスも多いはずである。従って、ぺントースリン酸経路
を回避することによって、Ｌ−グルタミン酸等のＬ−ア
ミノ酸生産能を向上させることが可能であると考えた。
性細菌が持つエントナー・ドゥドロフ経路に着目した。
糖からＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸に至る代謝経
路のうち、主に炭酸ガスを発生するのは、ＥＤＤによっ
て６−ホスホグルコン酸からリブロース−５−リン酸を
生成する反応である。特に、ぺントースリン酸経路への
炭素流入量が多い菌株では、この反応で放出される炭酸
ガスも多いはずである。従って、ぺントースリン酸経路
を回避することによって、Ｌ−グルタミン酸等のＬ−ア
ミノ酸生産能を向上させることが可能であると考えた。
【０００８】ぺントースリン酸経路への炭素流入量を減
らすためには、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼあるいは６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼを
欠損又は弱化させる、あるいはエントナー・ドゥドロ
フ経路を強化する、という２つの方法が考えられる。両
者ともに、同じくぺントースリン酸経路迂回効果を期待
できるが、の場合、活性の強弱を調節することで、ぺ
ントースリン酸経路との炭素分配を変化させることがで
きると考えられるため、ぺントースリン酸経路の中間物
質の誘導体である核酸等の供給も可能であると考えられ
た。そして、種々検討を行った結果、エントナー・ドゥ
ドロフ経路を強化することによって、細菌のＬ−アミノ
酸生産能を向上させることができることを見出し、本発
明を完成するに至った。すなわち本発明は、以下のとお
りである。
らすためには、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼあるいは６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼを
欠損又は弱化させる、あるいはエントナー・ドゥドロ
フ経路を強化する、という２つの方法が考えられる。両
者ともに、同じくぺントースリン酸経路迂回効果を期待
できるが、の場合、活性の強弱を調節することで、ぺ
ントースリン酸経路との炭素分配を変化させることがで
きると考えられるため、ぺントースリン酸経路の中間物
質の誘導体である核酸等の供給も可能であると考えられ
た。そして、種々検討を行った結果、エントナー・ドゥ
ドロフ経路を強化することによって、細菌のＬ−アミノ
酸生産能を向上させることができることを見出し、本発
明を完成するに至った。すなわち本発明は、以下のとお
りである。
【０００９】（１）Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有す
る微生物を培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を培地中に生成
蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−ア
ミノ酸の製造法において、前記微生物は、エントナー・
ドゥドロフ経路を有し、かつ、６−ホスホグルコン酸デ
ヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６
−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両
方の活性が増強されたグラム陰性細菌であり、前記Ｌ−
アミノ酸は、ピルビン酸を中間体とする生合成経路によ
って生成するＬ−アミノ酸から選ばれる、Ｌ−アミノ酸
の製造法。 （２）前記細菌は腸内細菌である(1)の方法。 （３）前記細菌はエンテロバクター属細菌である(2)の
方法。 （４）６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性又は２
−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラ
ーゼ活性が、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ又は
２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルド
ラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又
は前記細菌細胞内のこれらの遺伝子の発現が増強される
ようにこれらの遺伝子の発現調節配列を改変することに
より増強された、(1)〜(3)のいずれかの方法。 （５）前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−グルタミン酸、又はＬ
−グルタミン酸が中間体又はアミノ基供与体として用い
られる生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸である
(1)の方法。 （６）Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギ
ニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニンから選ば
れる(1)〜(5)のいずれかの方法。 （７）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸である(6)
の方法。
る微生物を培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を培地中に生成
蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−ア
ミノ酸の製造法において、前記微生物は、エントナー・
ドゥドロフ経路を有し、かつ、６−ホスホグルコン酸デ
ヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６
−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両
方の活性が増強されたグラム陰性細菌であり、前記Ｌ−
アミノ酸は、ピルビン酸を中間体とする生合成経路によ
って生成するＬ−アミノ酸から選ばれる、Ｌ−アミノ酸
の製造法。 （２）前記細菌は腸内細菌である(1)の方法。 （３）前記細菌はエンテロバクター属細菌である(2)の
方法。 （４）６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性又は２
−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラ
ーゼ活性が、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ又は
２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルド
ラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又
は前記細菌細胞内のこれらの遺伝子の発現が増強される
ようにこれらの遺伝子の発現調節配列を改変することに
より増強された、(1)〜(3)のいずれかの方法。 （５）前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−グルタミン酸、又はＬ
−グルタミン酸が中間体又はアミノ基供与体として用い
られる生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸である
(1)の方法。 （６）Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギ
ニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニンから選ば
れる(1)〜(5)のいずれかの方法。 （７）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸である(6)
の方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】＜１＞本発明の細菌
本発明において用いられるグラム陰性細菌は、Ｌ−アミ
ノ酸を生産する能力を有し、かつ、エントナー・ドゥド
ロフ経路を有するグラム陰性細菌である。
ノ酸を生産する能力を有し、かつ、エントナー・ドゥド
ロフ経路を有するグラム陰性細菌である。
【００１２】本発明において、「Ｌ−アミノ酸を生産す
る能力」とは、本発明の細菌を培養したときに、培地中
にＬ−アミノ酸を蓄積する能力をいう。このＬ−アミノ
酸生産能は、グラム陰性細菌の野生株の性質として有す
るものであってもよく、育種によって付与または増強さ
れた性質であってもよい。本発明を適用することのでき
るＬ−アミノ酸としては、ピルビン酸を中間体とする生
合成経路によって生成するＬ−アミノ酸であり、具体的
には、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタ
ミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシ
ン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン等が挙げられる。後述の
実施例に示すように、ＥＤＤ活性及びＥＤＡ活性を増強
することによりエントナー・ドゥドロフ経路を強化され
た細菌は、アセトイン及び２，３−ブタンジオールの生
成が増大した。２，３−ブタンジオールはアセトインか
ら、アセトインはピルビン酸から生成するので、アセト
イン及び２，３−ブタンジオールの生成が増大したこと
は、ピルビン酸の供給量が増大したことを示している。
したがって、エントナー・ドゥドロフ経路を強化された
細菌は、ピルビン酸を中間体とする生合成経路によって
生成するＬ−アミノ酸の生産能が上昇すると予想され
る。
る能力」とは、本発明の細菌を培養したときに、培地中
にＬ−アミノ酸を蓄積する能力をいう。このＬ−アミノ
酸生産能は、グラム陰性細菌の野生株の性質として有す
るものであってもよく、育種によって付与または増強さ
れた性質であってもよい。本発明を適用することのでき
るＬ−アミノ酸としては、ピルビン酸を中間体とする生
合成経路によって生成するＬ−アミノ酸であり、具体的
には、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタ
ミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシ
ン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン等が挙げられる。後述の
実施例に示すように、ＥＤＤ活性及びＥＤＡ活性を増強
することによりエントナー・ドゥドロフ経路を強化され
た細菌は、アセトイン及び２，３−ブタンジオールの生
成が増大した。２，３−ブタンジオールはアセトインか
ら、アセトインはピルビン酸から生成するので、アセト
イン及び２，３−ブタンジオールの生成が増大したこと
は、ピルビン酸の供給量が増大したことを示している。
したがって、エントナー・ドゥドロフ経路を強化された
細菌は、ピルビン酸を中間体とする生合成経路によって
生成するＬ−アミノ酸の生産能が上昇すると予想され
る。
【００１３】エントナー・ドゥドロフ経路を有するグラ
ム陰性細菌として具体的には、エンテロバクター属、ク
レブシエラ属、セラチア属、エルビニア属又はパントエ
ア属、エシェリヒア属、シュードモナス属、アースロバ
クター属、及びアエロバクター属に属する細菌等が挙げ
られる。細菌がエントナー・ドゥドロフ経路を有するか
否かは、例えば、菌体破砕液をグリセルアルデヒド−３
−リン酸デヒドロゲナーゼ及び６−ホスホグルコン酸と
混合し、６−ホスホグルコン酸を基質として生成するグ
リセルアルデヒド−３−リン酸を検出することによって
決定することができる。グリセルアルデヒド−３−リン
酸の生成が確認された細菌は、エントナー・ドゥドロフ
経路を有する。
ム陰性細菌として具体的には、エンテロバクター属、ク
レブシエラ属、セラチア属、エルビニア属又はパントエ
ア属、エシェリヒア属、シュードモナス属、アースロバ
クター属、及びアエロバクター属に属する細菌等が挙げ
られる。細菌がエントナー・ドゥドロフ経路を有するか
否かは、例えば、菌体破砕液をグリセルアルデヒド−３
−リン酸デヒドロゲナーゼ及び６−ホスホグルコン酸と
混合し、６−ホスホグルコン酸を基質として生成するグ
リセルアルデヒド−３−リン酸を検出することによって
決定することができる。グリセルアルデヒド−３−リン
酸の生成が確認された細菌は、エントナー・ドゥドロフ
経路を有する。
【００１４】本発明に使用する細菌は、目的とするＬ−
アミノ酸に応じて、適宜選択することができる。以下
に、Ｌ−グルタミン酸の生産に適した細菌を例示する
が、本発明はこれらに制限されない。
アミノ酸に応じて、適宜選択することができる。以下
に、Ｌ−グルタミン酸の生産に適した細菌を例示する
が、本発明はこれらに制限されない。
【００１５】エンテロバクター属細菌として具体的に
は、以下の細菌が挙げられる。 エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agg
lomerans） エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerog
enes） エンテロバクター・アムニゲナス（Enterobacter amnig
enus） エンテロバクター・アスブリア（Enterobacter asburia
e） エンテロバクター・クロエッケ（Enterobacter cloaca
e） エンテロバクター・ディソルベンス（Enterobacter dis
solvens） エンテロバクター・ジェルゴビア（Enterobacter gergo
viae） エンテロバクター・ホルマエッケ（Enterobacter horma
echei） エンテロバクター・インターメディウス（Enterobacter
intermedius） エンテロバクター・ニミプレスラリス（Enterobacter n
imipressuralis） エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazaki
i） エンテロバクター・テイロレ（Enterobacter taylora
e）
は、以下の細菌が挙げられる。 エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agg
lomerans） エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerog
enes） エンテロバクター・アムニゲナス（Enterobacter amnig
enus） エンテロバクター・アスブリア（Enterobacter asburia
e） エンテロバクター・クロエッケ（Enterobacter cloaca
e） エンテロバクター・ディソルベンス（Enterobacter dis
solvens） エンテロバクター・ジェルゴビア（Enterobacter gergo
viae） エンテロバクター・ホルマエッケ（Enterobacter horma
echei） エンテロバクター・インターメディウス（Enterobacter
intermedius） エンテロバクター・ニミプレスラリス（Enterobacter n
imipressuralis） エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazaki
i） エンテロバクター・テイロレ（Enterobacter taylora
e）
【００１６】さらに好ましくは、以下に示す菌株が挙げ
られる。 エンテロバクター・アグロメランス ＡＴＣＣ１２２８
７ エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５ エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５６ エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３６０１ エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５及
びＡＪ１３５５６は、 １９９８年２月１９日に、工業技術院生命工学工業技術
研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生
物寄託センター、住所 〒305-5466 日本国茨城県つく
ば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、それぞれ受託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４４及びＦＥＲＭ Ｐ−１６６
４５として寄託され、１９９９年１月１１日にブダペス
ト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−６６１４及びＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５がが付
与されている。エンテロバクター・アグロメランス Ａ
Ｊ１３６０１は、１９９９年８月１８日に、工業技術院
生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P-17516として
寄託され、２０００年７月６日にブダペスト条約に基づ
く国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７２
０７が付与されている。また、エンテロバクター・アグ
ロメランス ＡＴＣＣ１２２８７は、ＡＴＣＣ（アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Ty
pe Culture Collection)、住所 10801 University Boul
evard, Manassas, VA 20110-2209, United States of A
merica）より分譲を受けることができる。
られる。 エンテロバクター・アグロメランス ＡＴＣＣ１２２８
７ エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５ エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５６ エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３６０１ エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５及
びＡＪ１３５５６は、 １９９８年２月１９日に、工業技術院生命工学工業技術
研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生
物寄託センター、住所 〒305-5466 日本国茨城県つく
ば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、それぞれ受託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４４及びＦＥＲＭ Ｐ−１６６
４５として寄託され、１９９９年１月１１日にブダペス
ト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−６６１４及びＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５がが付
与されている。エンテロバクター・アグロメランス Ａ
Ｊ１３６０１は、１９９９年８月１８日に、工業技術院
生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P-17516として
寄託され、２０００年７月６日にブダペスト条約に基づ
く国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７２
０７が付与されている。また、エンテロバクター・アグ
ロメランス ＡＴＣＣ１２２８７は、ＡＴＣＣ（アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Ty
pe Culture Collection)、住所 10801 University Boul
evard, Manassas, VA 20110-2209, United States of A
merica）より分譲を受けることができる。
【００１７】クレブシエラ属細菌としては、以下の細菌
が挙げられる。 クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella plantic
ola） クレブシエラ・テリゲナ（K. terrigena）
が挙げられる。 クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella plantic
ola） クレブシエラ・テリゲナ（K. terrigena）
【００１８】さらに好ましくは、クレブシエラ・プラン
ティコーラ ＡＪ１３３９９が挙げられる。クレブシエ
ラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９は、平成１０年
２月１９日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託セン
ター）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４６として寄
託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づ
く国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６
１６が付与されている。
ティコーラ ＡＪ１３３９９が挙げられる。クレブシエ
ラ・プランティコーラ ＡＪ１３３９９は、平成１０年
２月１９日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託セン
ター）に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４６として寄
託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づ
く国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６
１６が付与されている。
【００１９】クレブシエラ・プランティコーラ ＡＪ１
３３９９株は、北海道札幌市の土壌から分離された株で
ある。本発明で使用されるセラチア属に属する微生物に
は、以下のようなものがある。
３３９９株は、北海道札幌市の土壌から分離された株で
ある。本発明で使用されるセラチア属に属する微生物に
は、以下のようなものがある。
【００２０】セラチア・リクエファシエンス（Serratia
liquefacience） セラチア・エントモフィラ（Serratia entomophila） セラチア・フィカリア（Serratia ficaria） セラチア・フォンティコーラ（Serratia fonticola） セラチア・グリメシ（Serratia grimesii） セラチア・プロテアマキュランス（Serratia proteamac
ulans） セラチア・オドリフェラ（Serratia odorifera） セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica） セラチア・ルビダエ（Serratia rubidaea ）
liquefacience） セラチア・エントモフィラ（Serratia entomophila） セラチア・フィカリア（Serratia ficaria） セラチア・フォンティコーラ（Serratia fonticola） セラチア・グリメシ（Serratia grimesii） セラチア・プロテアマキュランス（Serratia proteamac
ulans） セラチア・オドリフェラ（Serratia odorifera） セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica） セラチア・ルビダエ（Serratia rubidaea ）
【００２１】さらに好ましくは、以下に示す菌株が挙げ
られる。 セラチア・リクエファシエンス ＡＴＣＣ１４４６０ セラチア・リクエファシエンス ＡＴＣＣ１４４６０
は、ＡＴＣＣより分譲を受けることができる。
られる。 セラチア・リクエファシエンス ＡＴＣＣ１４４６０ セラチア・リクエファシエンス ＡＴＣＣ１４４６０
は、ＡＴＣＣより分譲を受けることができる。
【００２２】本発明で使用されるエルビニア属に属する
微生物には、以下のようなものがある。 エルビニア・ヘルビコーラ（Erwinia herbicola）（現
在はパントエア・アグロメランス(Pantoea agglomeran
s)として分類されている） エルビニア・アナナス（E. ananas） エルビニア・カクティシダ（E. cacticida） エルビニア・クリサンテミ（E. chrysanthemi） エルビニア・マロティボラ（E. mallotivora） エルビニア・ペルシシナス（E. persicinus） エルビニア・プシディ（E. psidii） エルビニア・ケルシナ（E. quercina） エルビニア・ラポンティシ（E. rhapontici） エルビニア・ルブリファシエンス（E. rubrifaciens） エルビニア・サリシス（E. salicis） エルビニア・ウレドボラ（E. uredovora）
微生物には、以下のようなものがある。 エルビニア・ヘルビコーラ（Erwinia herbicola）（現
在はパントエア・アグロメランス(Pantoea agglomeran
s)として分類されている） エルビニア・アナナス（E. ananas） エルビニア・カクティシダ（E. cacticida） エルビニア・クリサンテミ（E. chrysanthemi） エルビニア・マロティボラ（E. mallotivora） エルビニア・ペルシシナス（E. persicinus） エルビニア・プシディ（E. psidii） エルビニア・ケルシナ（E. quercina） エルビニア・ラポンティシ（E. rhapontici） エルビニア・ルブリファシエンス（E. rubrifaciens） エルビニア・サリシス（E. salicis） エルビニア・ウレドボラ（E. uredovora）
【００２３】さらに好ましくは、エルビニア・ヘルビコ
ーラ ＩＡＭ１５９５（パントエア・アグロメランス
ＡＪ２６６６）が挙げられる。エルビニア・ヘルビコー
ラＩＡＭ１５９５は、東京大学分子細胞生物学研究所よ
り分譲を受けることができる。
ーラ ＩＡＭ１５９５（パントエア・アグロメランス
ＡＪ２６６６）が挙げられる。エルビニア・ヘルビコー
ラＩＡＭ１５９５は、東京大学分子細胞生物学研究所よ
り分譲を受けることができる。
【００２４】尚、バージーズ・マニュアル・オブ・デタ
ーミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual
of Determinative Bacteriology）第９版には、エルビ
ニア・ヘルビコーラは記載されておらず、エルビニア・
ヘルビコーラとして分類されていた微生物は、パントエ
ア・アグロメランスに分類されている。このように、エ
ルビニア属に属する微生物及びパントエア属に属する微
生物は、互いに近縁である。したがって、パントエア属
に属する微生物は、エルビニア属に属する微生物と同様
に使用することができる。そのようなパントエア属に属
する微生物として、パントエア・アグロメランス及びパ
ントエア・ディスパーサ（Pantoea dispersa）が挙げら
れる。エルビニア・ヘルビコーラ ＩＡＭ１５９５は、
パントエア・アグロメランス ＡＪ２６６６と命名さ
れ、平成１１年２月２５日に、工業技術院生命工学工業
技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特
許生物寄託センター）に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６
６６０としてブダペスト条約に基づき国際寄託されてい
る。
ーミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual
of Determinative Bacteriology）第９版には、エルビ
ニア・ヘルビコーラは記載されておらず、エルビニア・
ヘルビコーラとして分類されていた微生物は、パントエ
ア・アグロメランスに分類されている。このように、エ
ルビニア属に属する微生物及びパントエア属に属する微
生物は、互いに近縁である。したがって、パントエア属
に属する微生物は、エルビニア属に属する微生物と同様
に使用することができる。そのようなパントエア属に属
する微生物として、パントエア・アグロメランス及びパ
ントエア・ディスパーサ（Pantoea dispersa）が挙げら
れる。エルビニア・ヘルビコーラ ＩＡＭ１５９５は、
パントエア・アグロメランス ＡＪ２６６６と命名さ
れ、平成１１年２月２５日に、工業技術院生命工学工業
技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特
許生物寄託センター）に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６
６６０としてブダペスト条約に基づき国際寄託されてい
る。
【００２５】本発明で使用されるエシェリヒア属に属す
る微生物には、エシェリヒア・コリ（Esherichia col
i）が挙げられる。
る微生物には、エシェリヒア・コリ（Esherichia col
i）が挙げられる。
【００２６】さらに好ましくは、バリン耐性を有するエ
シェリヒア・コリ、具体的には以下に示す菌株が挙げら
れる。 エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣＣ１０７９８） エシェリヒア・コリＷ（ＡＴＣＣ９６３７） エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣＣ１０７９８）、
エシェリヒア・コリＷ（ＡＴＣＣ９６３７）は、ＡＴＣ
Ｃより分譲を受けることができる。
シェリヒア・コリ、具体的には以下に示す菌株が挙げら
れる。 エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣＣ１０７９８） エシェリヒア・コリＷ（ＡＴＣＣ９６３７） エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣＣ１０７９８）、
エシェリヒア・コリＷ（ＡＴＣＣ９６３７）は、ＡＴＣ
Ｃより分譲を受けることができる。
【００２７】本発明のグラム陰性細菌は、Ｌ−アミノ酸
を生産する能力を有し、かつ、上記のようなエントナー
・ドゥドロフ経路を有する細菌であって、ＥＤＤ活性も
しくはＥＤＡ活性、又はこれらの両方の活性が増強され
たグラム陰性細菌である。本発明の細菌は、好ましくは
ＥＤＤ活性及びＥＤＡ活性の両方が増強されたグラム陰
性細菌である。
を生産する能力を有し、かつ、上記のようなエントナー
・ドゥドロフ経路を有する細菌であって、ＥＤＤ活性も
しくはＥＤＡ活性、又はこれらの両方の活性が増強され
たグラム陰性細菌である。本発明の細菌は、好ましくは
ＥＤＤ活性及びＥＤＡ活性の両方が増強されたグラム陰
性細菌である。
【００２８】「ＥＤＤ活性又はＥＤＡ活性が増強され
た」とは、細胞当たりのＥＤＤ活性又はＥＤＡ活性が、
野生型の細菌のそれよりも高くなったことをいう。例え
ば、細胞当たりのＥＤＤ又はＥＤＡ分子の数が増加した
場合や、ＥＤＤ又はＥＤＡ分子当たりのＥＤＤ又はＥＤ
Ａの比活性が上昇した場合などが該当する。また、比較
対象となる野生型の細菌とは、ＥＤＤ活性又はＥＤＡ活
性増強する操作が行われていない細菌である。
た」とは、細胞当たりのＥＤＤ活性又はＥＤＡ活性が、
野生型の細菌のそれよりも高くなったことをいう。例え
ば、細胞当たりのＥＤＤ又はＥＤＡ分子の数が増加した
場合や、ＥＤＤ又はＥＤＡ分子当たりのＥＤＤ又はＥＤ
Ａの比活性が上昇した場合などが該当する。また、比較
対象となる野生型の細菌とは、ＥＤＤ活性又はＥＤＡ活
性増強する操作が行われていない細菌である。
【００２９】細菌のＥＤＤ活性及び／又はＥＤＡ活性の
増強は、ＥＤＤ及び／又はＥＤＡをコードする遺伝子の
コピー数を高めることによって達成される。例えば、Ｅ
ＤＤ及び／又はＥＤＡをコードする遺伝子断片を、目的
とする細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピ
ー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを
同細菌に導入して形質転換すればよい。ＥＤＤ活性及び
ＥＤＡ活性の両方を増強する場合は、ＥＤＤをコードす
る遺伝子断片及びＥＤＡをコードする遺伝子断片は、そ
れぞれ別個に異なるベクターに搭載してもよいが、同じ
ベクターに搭載することが好ましい。尚、Ｌ−アミノ酸
生産能を有する細菌に上記組換えDNAを導入してもよい
が、野生型の細菌に上記組換えDNAを導入して形質転換
株を得、その後当該形質転換株にＬ−アミノ酸生産能を
付与してもよい。
増強は、ＥＤＤ及び／又はＥＤＡをコードする遺伝子の
コピー数を高めることによって達成される。例えば、Ｅ
ＤＤ及び／又はＥＤＡをコードする遺伝子断片を、目的
とする細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピ
ー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを
同細菌に導入して形質転換すればよい。ＥＤＤ活性及び
ＥＤＡ活性の両方を増強する場合は、ＥＤＤをコードす
る遺伝子断片及びＥＤＡをコードする遺伝子断片は、そ
れぞれ別個に異なるベクターに搭載してもよいが、同じ
ベクターに搭載することが好ましい。尚、Ｌ−アミノ酸
生産能を有する細菌に上記組換えDNAを導入してもよい
が、野生型の細菌に上記組換えDNAを導入して形質転換
株を得、その後当該形質転換株にＬ−アミノ酸生産能を
付与してもよい。
【００３０】ＥＤＤをコードする遺伝子及びＥＤＡをコ
ードする遺伝子は、エントナー・ドゥドロフ経路を有す
るグラム陰性細菌由来の遺伝子のいずれも使用すること
ができる。具体的には、エンテロバクター属細菌由来の
遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ由来のＥＤＤ
をコードする遺伝子（edd）及びＥＤＡをコードする遺
伝子（eda）は、オペロンを形成していることが報告さ
れている（J. Bacteriol., 1992, Jul; 174(14): 4638-
46）。以下、ＥＤＤをコードする遺伝子をedd、ＥＤＡ
をコードする遺伝子をedaと記す。また、ザイモモナス
属細菌の遺伝子も報告されており、これらの遺伝子の配
列に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲ（PC
R：polymerase chain reaction； White,T.J. et al.,
Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）、又は上記遺伝子
の配列に基づいて作製したプローブを用いたハイブリダ
イゼーションによって、edd及びeda遺伝子を取得するこ
とができる。例えば、エシェリヒア・コリのedd及びeda
を含むオペロン断片は、後述のプライマーedd-F（配列
番号１）及びeda-R（配列番号２）を用いたPCR法によっ
て取得することができる。他の微生物のedd及びedaも、
同様にして取得され得る。前記ハイブリダイゼーション
の条件としては、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当
する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件が挙げられ
る。
ードする遺伝子は、エントナー・ドゥドロフ経路を有す
るグラム陰性細菌由来の遺伝子のいずれも使用すること
ができる。具体的には、エンテロバクター属細菌由来の
遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ由来のＥＤＤ
をコードする遺伝子（edd）及びＥＤＡをコードする遺
伝子（eda）は、オペロンを形成していることが報告さ
れている（J. Bacteriol., 1992, Jul; 174(14): 4638-
46）。以下、ＥＤＤをコードする遺伝子をedd、ＥＤＡ
をコードする遺伝子をedaと記す。また、ザイモモナス
属細菌の遺伝子も報告されており、これらの遺伝子の配
列に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲ（PC
R：polymerase chain reaction； White,T.J. et al.,
Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）、又は上記遺伝子
の配列に基づいて作製したプローブを用いたハイブリダ
イゼーションによって、edd及びeda遺伝子を取得するこ
とができる。例えば、エシェリヒア・コリのedd及びeda
を含むオペロン断片は、後述のプライマーedd-F（配列
番号１）及びeda-R（配列番号２）を用いたPCR法によっ
て取得することができる。他の微生物のedd及びedaも、
同様にして取得され得る。前記ハイブリダイゼーション
の条件としては、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当
する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件が挙げられ
る。
【００３１】染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌
から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miu
ra, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工
学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、
１９９２年参照）等により調製することができる。
から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miu
ra, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工
学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、
１９９２年参照）等により調製することができる。
【００３２】PCR法により増幅されたedd及び／又はeda
遺伝子は、エシェリヒア・コリ等の細胞内において自律
複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを調製し、
これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、後の操作
がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自
律複製可能なベクターとしては、pMW219, pSTV28, pUC1
9、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR3
22, pACYC184等が挙げられる。
遺伝子は、エシェリヒア・コリ等の細胞内において自律
複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを調製し、
これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、後の操作
がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自
律複製可能なベクターとしては、pMW219, pSTV28, pUC1
9、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR3
22, pACYC184等が挙げられる。
【００３３】上記のように調製した組換えDNAをグラム
陰性細菌に導入するには、これまでに報告されている形
質転換法に従って行えばよい。例えば、D.A.Morrisonの
方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）、受容
菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す
方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(197
0)）、あるいはエレクトロポレーション法（Miller J.
H., “A Short Course in Bacterial Genetics; Handbo
ok”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.,
p.279, 1992）等が挙げられる。
陰性細菌に導入するには、これまでに報告されている形
質転換法に従って行えばよい。例えば、D.A.Morrisonの
方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）、受容
菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す
方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(197
0)）、あるいはエレクトロポレーション法（Miller J.
H., “A Short Course in Bacterial Genetics; Handbo
ok”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.,
p.279, 1992）等が挙げられる。
【００３４】edd及び／又はeda遺伝子のコピー数を高め
ることは、これらの遺伝子を細菌の染色体DNA上に多コ
ピー存在させることによっても達成できる。細菌の染色
体DNA上にedd及び／又はeda遺伝子を多コピーで導入す
るには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に
利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピ
ー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因
子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用で
きる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されてい
るように、edd及び／又はeda遺伝子をトランスポゾンに
搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入
することも可能である。
ることは、これらの遺伝子を細菌の染色体DNA上に多コ
ピー存在させることによっても達成できる。細菌の染色
体DNA上にedd及び／又はeda遺伝子を多コピーで導入す
るには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に
利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピ
ー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因
子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用で
きる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されてい
るように、edd及び／又はeda遺伝子をトランスポゾンに
搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入
することも可能である。
【００３５】ＥＤＤ活性及び／又はＥＤＡ活性の増強
は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体DNA上また
はプラスミド上のedd及び／又はeda遺伝子のプロモータ
ー等の発現調節配列を強力なものに置換することによっ
ても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモ
ーター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとし
て知られている。また、国際公開WO00/18935に開示され
ているように、edd及び／又はeda遺伝子のプロモーター
領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改
変することも可能である。これらのプロモーター置換ま
たは改変によりedd及び／又はeda遺伝子の発現が強化さ
れ、ＥＤＤ活性及び／又はＥＤＡ活性が増強される。こ
れら発現調節配列の改変は、edd及び／又はeda遺伝子の
コピー数を高めることと組み合わせてもよい。
は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体DNA上また
はプラスミド上のedd及び／又はeda遺伝子のプロモータ
ー等の発現調節配列を強力なものに置換することによっ
ても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモ
ーター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとし
て知られている。また、国際公開WO00/18935に開示され
ているように、edd及び／又はeda遺伝子のプロモーター
領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改
変することも可能である。これらのプロモーター置換ま
たは改変によりedd及び／又はeda遺伝子の発現が強化さ
れ、ＥＤＤ活性及び／又はＥＤＡ活性が増強される。こ
れら発現調節配列の改変は、edd及び／又はeda遺伝子の
コピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００３６】ＥＤＤ活性及びＥＤＡ活性が増強されたこ
とは、菌体破砕液を、グリセルアルデヒド−３−リン酸
デヒドロゲナーゼ及び６−ホスホグルコン酸と混合し、
６−ホスホグルコン酸を基質として生成するグリセルア
ルデヒド−３−リン酸を測定することによって、確認す
ることができる。この反応において、反応後に残存した
６−ホスホグルコン酸を、６−ホスホグルコン酸デヒド
ロゲナーゼを用いて定量するか、２−ケト−３−デオキ
シ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ過剰存在化で生
成するピルビン酸を乳酸デヒドロゲナーゼを用いて定量
することによって、ＥＤＤ活性を測定することができ
る。尚、６−ホスホグルコン酸又はピルビン酸は、デヒ
ドロゲナーゼ反応におけるＮＡＤＨの増加により定量す
ることができる。また、ＥＤＡ活性は、２−ケト−３−
デオキシ−６−ホスホグルコン酸を基質として生成する
ピルビン酸を乳酸デヒドロゲナーゼを用いて検出するこ
とによって、測定することができる。
とは、菌体破砕液を、グリセルアルデヒド−３−リン酸
デヒドロゲナーゼ及び６−ホスホグルコン酸と混合し、
６−ホスホグルコン酸を基質として生成するグリセルア
ルデヒド−３−リン酸を測定することによって、確認す
ることができる。この反応において、反応後に残存した
６−ホスホグルコン酸を、６−ホスホグルコン酸デヒド
ロゲナーゼを用いて定量するか、２−ケト−３−デオキ
シ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ過剰存在化で生
成するピルビン酸を乳酸デヒドロゲナーゼを用いて定量
することによって、ＥＤＤ活性を測定することができ
る。尚、６−ホスホグルコン酸又はピルビン酸は、デヒ
ドロゲナーゼ反応におけるＮＡＤＨの増加により定量す
ることができる。また、ＥＤＡ活性は、２−ケト−３−
デオキシ−６−ホスホグルコン酸を基質として生成する
ピルビン酸を乳酸デヒドロゲナーゼを用いて検出するこ
とによって、測定することができる。
【００３７】本発明のグラム陰性細菌は、ＥＤＤ及びＥ
ＤＡ以外にも、これらの酵素活性の増強による効果を損
なわない限り、Ｌ−アミノ酸生合成を触媒する酵素の活
性が増強されていてもよい。
ＤＡ以外にも、これらの酵素活性の増強による効果を損
なわない限り、Ｌ−アミノ酸生合成を触媒する酵素の活
性が増強されていてもよい。
【００３８】例えば、目的とするＬ−アミノ酸がＬ−グ
ルタミン酸である場合には、グルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼ（以下、「ＧＤＨ」ともいう）、グルタミンシンテ
ターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒド
ロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シン
ターゼ（以下、「ＣＳ」ともいう）、ホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」ともい
う）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、ピルビン
酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸
カルボキシラーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムター
ゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド
−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソ
メラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホ
フルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等が
ある。Ｌ−グルタミン酸の生産に用いるる細菌がエンテ
ロバクター属細菌の場合には、上記の酵素のうち、Ｃ
Ｓ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１種または２種も
しくは３種が好ましい。さらに、ＣＳ、ＰＥＰＣおよび
ＧＤＨの３種の酵素の活性がともに高められていること
が好ましい。特に、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムのＣＳは、α−ケトグルタル酸、Ｌ−グルタミ
ン酸及びＮＡＤＨによる阻害を受けないため、好ましい
ものである。
ルタミン酸である場合には、グルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼ（以下、「ＧＤＨ」ともいう）、グルタミンシンテ
ターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒド
ロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シン
ターゼ（以下、「ＣＳ」ともいう）、ホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」ともい
う）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、ピルビン
酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸
カルボキシラーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムター
ゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド
−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソ
メラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホ
フルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等が
ある。Ｌ−グルタミン酸の生産に用いるる細菌がエンテ
ロバクター属細菌の場合には、上記の酵素のうち、Ｃ
Ｓ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１種または２種も
しくは３種が好ましい。さらに、ＣＳ、ＰＥＰＣおよび
ＧＤＨの３種の酵素の活性がともに高められていること
が好ましい。特に、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムのＣＳは、α−ケトグルタル酸、Ｌ−グルタミ
ン酸及びＮＡＤＨによる阻害を受けないため、好ましい
ものである。
【００３９】ＣＳをコードする遺伝子（ｇｌｔＡ）、Ｐ
ＥＰＣをコードする遺伝子（ｐｐｃ）およびＧＤＨをコ
ードする遺伝子（ｇｄｈＡ）の供給源となる生物として
は、ＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨ活性を有する生物ならい
かなる生物でも良い。なかでも原核生物である細菌、た
とえばエンテロバクター属、クレブシェラ属、エルビニ
ア属、パントエア属、セラチア属、エシェリヒア属、コ
リネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス
属に属する細菌が好ましい。具体的な例としては、エシ
ェリヒア・コリ、ブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタム等が挙げられる。ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝
子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、上記のような微生物の染
色体ＤＮＡより得ることができる。
ＥＰＣをコードする遺伝子（ｐｐｃ）およびＧＤＨをコ
ードする遺伝子（ｇｄｈＡ）の供給源となる生物として
は、ＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨ活性を有する生物ならい
かなる生物でも良い。なかでも原核生物である細菌、た
とえばエンテロバクター属、クレブシェラ属、エルビニ
ア属、パントエア属、セラチア属、エシェリヒア属、コ
リネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス
属に属する細菌が好ましい。具体的な例としては、エシ
ェリヒア・コリ、ブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタム等が挙げられる。ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝
子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、上記のような微生物の染
色体ＤＮＡより得ることができる。
【００４０】ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇ
ｄｈＡ遺伝子は、おのおのＣＳ、ＰＥＰＣもしくはＧＤ
Ｈ活性を欠失した変異株を用いてその栄養要求性を相補
するＤＮＡ断片を上記微生物の染色体ＤＮＡから単離す
ることによって取得できる。またエシェリヒア属のこれ
ら遺伝子、コリネバクテリウム属細菌のこれら遺伝子は
既に塩基配列が明らかにされていることから（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２巻、５２４３〜５２４９頁、
１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９
〜９１６頁、１９８４年；Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３
〜１９９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、
第１４０巻、１８１７〜１８２８頁、１９９４年；Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２１８巻、３３０〜３３
９頁、１９８９年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３１７〜３２６頁、１９９２
年）それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成
し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得する
ことが可能である。これらの遺伝子のエンテロバクター
属細菌等のグラム陰性細菌への導入は、EP 0 670 370 A
2、USP 6,197,559、EP 0 999 282 A2、EP 1 078 989 A2
に詳述されている。
ｄｈＡ遺伝子は、おのおのＣＳ、ＰＥＰＣもしくはＧＤ
Ｈ活性を欠失した変異株を用いてその栄養要求性を相補
するＤＮＡ断片を上記微生物の染色体ＤＮＡから単離す
ることによって取得できる。またエシェリヒア属のこれ
ら遺伝子、コリネバクテリウム属細菌のこれら遺伝子は
既に塩基配列が明らかにされていることから（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２巻、５２４３〜５２４９頁、
１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９
〜９１６頁、１９８４年；Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３
〜１９９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、
第１４０巻、１８１７〜１８２８頁、１９９４年；Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２１８巻、３３０〜３３
９頁、１９８９年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３１７〜３２６頁、１９９２
年）それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成
し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得する
ことが可能である。これらの遺伝子のエンテロバクター
属細菌等のグラム陰性細菌への導入は、EP 0 670 370 A
2、USP 6,197,559、EP 0 999 282 A2、EP 1 078 989 A2
に詳述されている。
【００４１】ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨ、並びに上述
した他の酵素の活性の増強は、前記のＥＤＤ及びＥＤＡ
活性の増強と同様にして行うことができる。また、本発
明の細菌は、ＥＤＤ及び／又はＥＤＡ活性の増強による
効果を損なわない限り、目的とするＬ−アミノ酸の生合
成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒す
る酵素の活性が低下あるいは欠損されていてもよい。例
えば、目的とするＬ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸の場
合には、このような酵素としては、α−ケトグルタル酸
デヒドロゲナーゼ（以下、「αＫＧＤＨ」ともいう）、
イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラ
ーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、
アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラー
ゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デカルボ
キシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等が挙げら
れる。
した他の酵素の活性の増強は、前記のＥＤＤ及びＥＤＡ
活性の増強と同様にして行うことができる。また、本発
明の細菌は、ＥＤＤ及び／又はＥＤＡ活性の増強による
効果を損なわない限り、目的とするＬ−アミノ酸の生合
成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒す
る酵素の活性が低下あるいは欠損されていてもよい。例
えば、目的とするＬ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸の場
合には、このような酵素としては、α−ケトグルタル酸
デヒドロゲナーゼ（以下、「αＫＧＤＨ」ともいう）、
イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラ
ーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、
アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラー
ゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デカルボ
キシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等が挙げら
れる。
【００４２】上記の酵素の活性を低下または欠損させる
には、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニ
トロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異
処理に用いられている変異剤によって処理し、目的とす
る酵素の活性が低下した変異株を選択する方法、あるい
は、相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊
等の方法がある。αＫＧＤＨをコードする遺伝子の遺伝
子破壊については、USP 5,977,331に記載されている。
には、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニ
トロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異
処理に用いられている変異剤によって処理し、目的とす
る酵素の活性が低下した変異株を選択する方法、あるい
は、相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊
等の方法がある。αＫＧＤＨをコードする遺伝子の遺伝
子破壊については、USP 5,977,331に記載されている。
【００４３】本発明の細菌の構築に際し、edd及びeda以
外の遺伝子を導入する場合は、用いるベクターの種類は
少ない方が好ましい。すなわち、ベクターは通常マーカ
ー遺伝子を有しているが、マーカー遺伝子に対応した薬
剤等を培地に含有させる必要があるため、ベクターの種
類が多いと多数の薬剤を培地に添加することとなり、細
菌の生育が悪くなることがある。したがって、ベクター
の種類は少ない方が通常、好ましい。好ましいベクター
の種類は２種以下、より好ましくは１種である。
外の遺伝子を導入する場合は、用いるベクターの種類は
少ない方が好ましい。すなわち、ベクターは通常マーカ
ー遺伝子を有しているが、マーカー遺伝子に対応した薬
剤等を培地に含有させる必要があるため、ベクターの種
類が多いと多数の薬剤を培地に添加することとなり、細
菌の生育が悪くなることがある。したがって、ベクター
の種類は少ない方が通常、好ましい。好ましいベクター
の種類は２種以下、より好ましくは１種である。
【００４４】また、それぞれコピー数の異なる２種又は
それ以上のベクターを用いる場合は、導入する遺伝子の
種類に応じて、コピー数の高いベクターと低いベクター
に分配する遺伝子の種類を検討することが好ましい。
それ以上のベクターを用いる場合は、導入する遺伝子の
種類に応じて、コピー数の高いベクターと低いベクター
に分配する遺伝子の種類を検討することが好ましい。
【００４５】遺伝子の単離、及び宿主細菌への遺伝子の
導入又は遺伝子破壊等の操作に関し、染色体ＤＮＡの調
製、染色体ＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼ
ーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの
切断及び連結、形質転換、プライマーとして用いるオリ
ゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られ
ている通常の方法を採用することができる。これらの方
法は、Sambrook, J.,Fritsch, E. F., and Maniatis,
T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second
Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press,
(1989)等に記載されている。
導入又は遺伝子破壊等の操作に関し、染色体ＤＮＡの調
製、染色体ＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼ
ーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの
切断及び連結、形質転換、プライマーとして用いるオリ
ゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られ
ている通常の方法を採用することができる。これらの方
法は、Sambrook, J.,Fritsch, E. F., and Maniatis,
T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second
Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press,
(1989)等に記載されている。
【００４６】＜２＞本発明の細菌を用いたＬ−アミノ酸
の生産 上記のようにして得られる本発明の細菌を培地で培養
し、Ｌ−アミノ酸を培地中に生成蓄積させ、該培地より
Ｌ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製
造することができる。
の生産 上記のようにして得られる本発明の細菌を培地で培養
し、Ｌ−アミノ酸を培地中に生成蓄積させ、該培地より
Ｌ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製
造することができる。
【００４７】本発明の細菌を用いてＬ−アミノ酸を生産
するには、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応
じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する
通常の培地を用いて常法により行うことができる。合成
培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に
使用される炭素源および窒素源は培養する菌株の利用可
能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
するには、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応
じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する
通常の培地を用いて常法により行うことができる。合成
培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に
使用される炭素源および窒素源は培養する菌株の利用可
能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
【００４８】炭素源としては、グルコース、グリセロー
ル、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノー
ス、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使
用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノー
ル等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用し
て用いられる。これらの中では、グルコース及びスクロ
ースが好ましい。
ル、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノー
ス、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使
用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノー
ル等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用し
て用いられる。これらの中では、グルコース及びスクロ
ースが好ましい。
【００４９】窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモ
ニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩ま
たは硝酸塩等が使用される。
ニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩ま
たは硝酸塩等が使用される。
【００５０】有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタ
ミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプ
トン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が
使用され、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変
異株を使用する場合には要求される栄養素を補添するこ
とが好ましい。
ミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプ
トン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が
使用され、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変
異株を使用する場合には要求される栄養素を補添するこ
とが好ましい。
【００５１】無機塩類としてはりん酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養は、使用する細菌の種類によっても異なるが、通
常、発酵温度20〜45℃、pHを5〜9に制御し、通気培養を
行う。培養中にpHが下がる場合には、炭酸カルシウムを
加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。か
くして10時間〜120時間程度培養することにより、培養
液中に著量のＬ−グルタミンが蓄積される。
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養は、使用する細菌の種類によっても異なるが、通
常、発酵温度20〜45℃、pHを5〜9に制御し、通気培養を
行う。培養中にpHが下がる場合には、炭酸カルシウムを
加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。か
くして10時間〜120時間程度培養することにより、培養
液中に著量のＬ−グルタミンが蓄積される。
【００５２】培養終了後の培養液からＬ−アミノ酸を採
取する方法は、公知の回収方法、例えばイオン交換樹脂
法、沈澱法その他の方法に従って行えばよい。
取する方法は、公知の回収方法、例えばイオン交換樹脂
法、沈澱法その他の方法に従って行えばよい。
【００５３】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００５４】＜１＞エントナー・ドゥドロフ経路を構成
する酵素遺伝子のクローン化 エントナー・ドゥドロフ経路を構成する酵素ＥＤＤ及び
ＥＤＡをそれぞれコードする遺伝子edd及びedaは、エシ
ェリヒア・コリ、ザイモモナス・モビリス等よりクロー
ン化されている。エンテロバクター・アグロメランス
は、分類上腸内細菌群に属し、エシェリヒア・コリと近
縁とされ、更にエンテロバクター・アグロメランス中で
エシェリヒア・コリの遺伝子は発現可能であることが知
られている。従って、エシェリヒア・コリからedd及びe
da遺伝子をクローン化することとした。
する酵素遺伝子のクローン化 エントナー・ドゥドロフ経路を構成する酵素ＥＤＤ及び
ＥＤＡをそれぞれコードする遺伝子edd及びedaは、エシ
ェリヒア・コリ、ザイモモナス・モビリス等よりクロー
ン化されている。エンテロバクター・アグロメランス
は、分類上腸内細菌群に属し、エシェリヒア・コリと近
縁とされ、更にエンテロバクター・アグロメランス中で
エシェリヒア・コリの遺伝子は発現可能であることが知
られている。従って、エシェリヒア・コリからedd及びe
da遺伝子をクローン化することとした。
【００５５】エシェリヒア・コリにおいては両遺伝子は
オぺロンを形成している（J. Bacteriol., 1992, Jul;1
74(14):4638-46）。そこで、両遺伝子を同時に増幅でき
るプライマー、edd-F（配列番号１）及びeda-R（配列番
号２）を設計し、PCRにより両遺伝子を含むＤＮＡ断片
を増幅した。PCRは、宝酒造（株）製Pyrobest DNA Poly
meraseを用い、94℃ 1分の反応の後、94℃ 3O秒、60℃
3O秒、72℃ 3分からなる反応を30サイクル行った。
オぺロンを形成している（J. Bacteriol., 1992, Jul;1
74(14):4638-46）。そこで、両遺伝子を同時に増幅でき
るプライマー、edd-F（配列番号１）及びeda-R（配列番
号２）を設計し、PCRにより両遺伝子を含むＤＮＡ断片
を増幅した。PCRは、宝酒造（株）製Pyrobest DNA Poly
meraseを用い、94℃ 1分の反応の後、94℃ 3O秒、60℃
3O秒、72℃ 3分からなる反応を30サイクル行った。
【００５６】次に、得られた増幅断片を制限酵素SalI及
びBamHIで完全分解し、プラスミドpMW219をSalI及びBam
HIで完全分解したものと連結し、エシェリヒア・コリJM
109（宝酒造（株）から購入）を形質転換した。得られ
た形質転換体から、目的とする大きさの断片を含むクロ
ーンを５株選び、それぞれの株からプラスミドを抽出し
た。
びBamHIで完全分解し、プラスミドpMW219をSalI及びBam
HIで完全分解したものと連結し、エシェリヒア・コリJM
109（宝酒造（株）から購入）を形質転換した。得られ
た形質転換体から、目的とする大きさの断片を含むクロ
ーンを５株選び、それぞれの株からプラスミドを抽出し
た。
【００５７】各々のプラスミドをエレクトロポレーショ
ン法（Miller J.H., “A Short Course in Bacterial G
enetics; Handbook”, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, U.S.A., p.279, 1992）によりエンテロバクタ
ー・アグロメランスAJ13601株に導入し、ＥＤＤ及びＥ
ＤＡの活性を測定することにより、edd及びedaが発現し
ているクローンを選択することとした。AJ13601株は、
以下のようにして得られた菌株である。酸性環境下にて
Ｌ−グルタミン酸耐性を有し、かつ、増殖速度に優れた
株として、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355
株を土壌から選択した。次に、AJ13355株から粘液質低
生産性変異株を誘導し、さらにαＫＧＤＨ遺伝子を欠損
させ、AJ13356株を得た。AJ13356株は、αＫＧＤＨ−Ｅ
１サブユニット遺伝子（sucA）が破壊された結果、αＫ
ＧＤＨ活性を欠損している。続いて、AJ13356株に、エ
シェリヒア・コリのクエン酸シンターゼ遺伝子（glt
A）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝
子（ppc）、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdh
A）遺伝子を有するプラスミドＲＳＦＣＰＧ、並びにブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇltA
遺伝子を有するプラスミドｐＳＴＶＣＢを導入し、SC17
sucA/RSFCPG+pSTVCB株を得た。同株から、低ｐＨ環境下
でＬ−グルタミン酸に対する耐性が向上し、かつ増殖度
が最もよい菌株として、AJ13601株を選択した（EP 1 07
8 989 A2）。
ン法（Miller J.H., “A Short Course in Bacterial G
enetics; Handbook”, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, U.S.A., p.279, 1992）によりエンテロバクタ
ー・アグロメランスAJ13601株に導入し、ＥＤＤ及びＥ
ＤＡの活性を測定することにより、edd及びedaが発現し
ているクローンを選択することとした。AJ13601株は、
以下のようにして得られた菌株である。酸性環境下にて
Ｌ−グルタミン酸耐性を有し、かつ、増殖速度に優れた
株として、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355
株を土壌から選択した。次に、AJ13355株から粘液質低
生産性変異株を誘導し、さらにαＫＧＤＨ遺伝子を欠損
させ、AJ13356株を得た。AJ13356株は、αＫＧＤＨ−Ｅ
１サブユニット遺伝子（sucA）が破壊された結果、αＫ
ＧＤＨ活性を欠損している。続いて、AJ13356株に、エ
シェリヒア・コリのクエン酸シンターゼ遺伝子（glt
A）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝
子（ppc）、およびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdh
A）遺伝子を有するプラスミドＲＳＦＣＰＧ、並びにブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇltA
遺伝子を有するプラスミドｐＳＴＶＣＢを導入し、SC17
sucA/RSFCPG+pSTVCB株を得た。同株から、低ｐＨ環境下
でＬ−グルタミン酸に対する耐性が向上し、かつ増殖度
が最もよい菌株として、AJ13601株を選択した（EP 1 07
8 989 A2）。
【００５８】前記のようにして、edd及びeda遺伝子断片
を含むプラスミドを導入した形質転換体から無作為に選
択した形質転換体を、テトラサイクリン、クロラムフェ
ニコール及びカナマイシンをそれぞれ12.5m/L、25mg/
L、25mg/L含むLBGM9液体培地（10g/L トリプトン、5g/L
イーストエキストラクト、5g/L NaCl、5g/L グルコー
スを含む培地に、別殺菌した10× M9（128g/L Na2HPO4・
7H20, 30g/L KH2PO4, 5g/L NaCl, 1Og/L NH4Cl）を1/10
容添加）で15時間培養した。これらの培養液から遠心に
より集菌し、50mMTris−HCl pH7.6, 10mM MgCl2で菌体
を２回洗浄した後、同バッファーに懸濁した。超音波に
よって菌体を破砕し、15000rpmで30分遠心し、得られた
上清を粗酵素液とした。
を含むプラスミドを導入した形質転換体から無作為に選
択した形質転換体を、テトラサイクリン、クロラムフェ
ニコール及びカナマイシンをそれぞれ12.5m/L、25mg/
L、25mg/L含むLBGM9液体培地（10g/L トリプトン、5g/L
イーストエキストラクト、5g/L NaCl、5g/L グルコー
スを含む培地に、別殺菌した10× M9（128g/L Na2HPO4・
7H20, 30g/L KH2PO4, 5g/L NaCl, 1Og/L NH4Cl）を1/10
容添加）で15時間培養した。これらの培養液から遠心に
より集菌し、50mMTris−HCl pH7.6, 10mM MgCl2で菌体
を２回洗浄した後、同バッファーに懸濁した。超音波に
よって菌体を破砕し、15000rpmで30分遠心し、得られた
上清を粗酵素液とした。
【００５９】ＥＤＤ及びＥＤＡの活性は、両酵素による
反応産物を分光工学的手法を用いて測定することによ
り、同時に測定した。即ち、50mM Tris-HCl pH8.0, 10m
M MgCl 2, 1mM EDTA, 1mM APAD（アセチルピリジンアデ
ニンジヌクレオチド）, 5mM K2HPO4, グリセルアルデヒ
ド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ20unit, ６−ホスホグ
ルコン酸、及び粗酵素液を混ぜ合わせ、365nmの吸収の
増加を測定することにより、６−ホスホグルコン酸を基
質として生成するグリセルアルデヒド−３−リン酸を測
定した。ベクターのみを導入した株についても同様の測
定を行った。結果を表１に示す。
反応産物を分光工学的手法を用いて測定することによ
り、同時に測定した。即ち、50mM Tris-HCl pH8.0, 10m
M MgCl 2, 1mM EDTA, 1mM APAD（アセチルピリジンアデ
ニンジヌクレオチド）, 5mM K2HPO4, グリセルアルデヒ
ド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ20unit, ６−ホスホグ
ルコン酸、及び粗酵素液を混ぜ合わせ、365nmの吸収の
増加を測定することにより、６−ホスホグルコン酸を基
質として生成するグリセルアルデヒド−３−リン酸を測
定した。ベクターのみを導入した株についても同様の測
定を行った。結果を表１に示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】いずれの株も活性が増強されていることが
確認された。最も活性の高いものでは約7.2倍に増強さ
れており、この株の持つプラスミドをpMW-EDDAとした。
確認された。最も活性の高いものでは約7.2倍に増強さ
れており、この株の持つプラスミドをpMW-EDDAとした。
【００６２】＜２＞エントナー・ドゥドロフ経路強化株
によるＬ−グルタミン酸生産 次に、エントナー・ドゥドロフ経路の強化がＬ−グルタ
ミン酸生産に与える影響を検討した。
によるＬ−グルタミン酸生産 次に、エントナー・ドゥドロフ経路の強化がＬ−グルタ
ミン酸生産に与える影響を検討した。
【００６３】上項で用いたエンテロバクター・アグロメ
ランスAJ13601株は、２種のプラスミドを保持してお
り、さらにedd及びedaを導入した株は３種のプラスミド
を保持している。したがって、培養に３種の薬剤を培地
に添加する必要がある。そのため、非常に生育が悪く、
Ｌ−グルタミン酸生産培養評価系においては、ほとんど
生育しなかった。そこで、ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムのクエン酸シンターゼ（以下、「CS」と
もいう）遺伝子とedd及びeda遺伝子を一つのプラスミド
に導入することにより、用いるプラスミドを２種にする
こととした。
ランスAJ13601株は、２種のプラスミドを保持してお
り、さらにedd及びedaを導入した株は３種のプラスミド
を保持している。したがって、培養に３種の薬剤を培地
に添加する必要がある。そのため、非常に生育が悪く、
Ｌ−グルタミン酸生産培養評価系においては、ほとんど
生育しなかった。そこで、ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムのクエン酸シンターゼ（以下、「CS」と
もいう）遺伝子とedd及びeda遺伝子を一つのプラスミド
に導入することにより、用いるプラスミドを２種にする
こととした。
【００６４】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムのCS遺伝子を含むプラスミドｐＳＴＶＣＢの構築に用
いたベクターpSTV28と、edd及びeda遺伝子のクローニン
グに用いたベクターpMW219では、前者のほうがコピー数
が高い。AJ13601株は、pSTV28べクターにてブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムのCS遺伝子を増強して
いるが、同遺伝子をpMW219を用いて導入するには、発現
量を上昇させる必要があると思われた。そこで、CS遺伝
子のプロモーター部位をエシェリヒア・コリのCS遺伝子
のものに置き換えた遺伝子を構築した。
ムのCS遺伝子を含むプラスミドｐＳＴＶＣＢの構築に用
いたベクターpSTV28と、edd及びeda遺伝子のクローニン
グに用いたベクターpMW219では、前者のほうがコピー数
が高い。AJ13601株は、pSTV28べクターにてブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムのCS遺伝子を増強して
いるが、同遺伝子をpMW219を用いて導入するには、発現
量を上昇させる必要があると思われた。そこで、CS遺伝
子のプロモーター部位をエシェリヒア・コリのCS遺伝子
のものに置き換えた遺伝子を構築した。
【００６５】具体的には、プライマーGLTES1（配列番号
３）とGLTEB0（配列番号４）を用い、エシェリヒア・コ
リW3110株の染色体を鋳型としてCS遺伝子のプロモータ
ー領域を増幅した。更に、プライマーGLTBB0（配列番号
５）及びGLTBA1（配列番号６）を用い、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム2256株の染色体を鋳型とし
てCS遺伝子のORF領域を含む断片を増幅した。この両断
片を鋳型として、プライマーGLTES2（配列番号７）及び
GLTBA2（配列番号８）を用いてクロスオーバーPCRを行
い、目的の断片を得た。この断片を制限酵素SmaI及びHi
ndIIIで消化し、pSTV28の同部位に導入したものをpSTV-
CB(*)とした。このプラスミドをKpnI及びHindIIIで消化
し、エシェリヒア・コリのCS遺伝子のプロモーターとブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムのCS遺伝子の
コード領域を含む融合遺伝子断片を回収し、T4 DNAポリ
メラーゼによって末端を平滑化した。この融合遺伝子断
片を、pMW219のSmaI部位に導入したものをpMW-CB(*)と
した。また、同融合遺伝子断片を、pMW-EDDAをBamHI処
理後、T4 DNAポリメラーゼによって平滑化したものと連
結したものを、pMW-CB(*)・EDとした。
３）とGLTEB0（配列番号４）を用い、エシェリヒア・コ
リW3110株の染色体を鋳型としてCS遺伝子のプロモータ
ー領域を増幅した。更に、プライマーGLTBB0（配列番号
５）及びGLTBA1（配列番号６）を用い、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム2256株の染色体を鋳型とし
てCS遺伝子のORF領域を含む断片を増幅した。この両断
片を鋳型として、プライマーGLTES2（配列番号７）及び
GLTBA2（配列番号８）を用いてクロスオーバーPCRを行
い、目的の断片を得た。この断片を制限酵素SmaI及びHi
ndIIIで消化し、pSTV28の同部位に導入したものをpSTV-
CB(*)とした。このプラスミドをKpnI及びHindIIIで消化
し、エシェリヒア・コリのCS遺伝子のプロモーターとブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムのCS遺伝子の
コード領域を含む融合遺伝子断片を回収し、T4 DNAポリ
メラーゼによって末端を平滑化した。この融合遺伝子断
片を、pMW219のSmaI部位に導入したものをpMW-CB(*)と
した。また、同融合遺伝子断片を、pMW-EDDAをBamHI処
理後、T4 DNAポリメラーゼによって平滑化したものと連
結したものを、pMW-CB(*)・EDとした。
【００６６】次に、AJ13601を、LBGM9液体培地で31.5℃
終夜振とうし、１プレートにつき100〜200コロニーとな
るよう適当に希釈し、テトラサイクリン12.5mg/Lを含む
LBGM9プレートに塗布した。出現したコロニーについ
て、テトラサイクリン12.5mg/L、及びクロラムフェニコ
ール25mg/Lを含むLBGM9プレートにレプリカし、クロラ
ムフェニコール感受性となった株を取得し、この菌株を
G106Sと命名した。G106S株は、RSFCPGのみを保有し、pS
TVCBは脱落している。この菌株にpMW-CB(*)又はpMW-CB(
*)・EDを導入した株を、それぞれG106S pMW・CB(*)、G10
6S pMW-CB(*)・EDとした。
終夜振とうし、１プレートにつき100〜200コロニーとな
るよう適当に希釈し、テトラサイクリン12.5mg/Lを含む
LBGM9プレートに塗布した。出現したコロニーについ
て、テトラサイクリン12.5mg/L、及びクロラムフェニコ
ール25mg/Lを含むLBGM9プレートにレプリカし、クロラ
ムフェニコール感受性となった株を取得し、この菌株を
G106Sと命名した。G106S株は、RSFCPGのみを保有し、pS
TVCBは脱落している。この菌株にpMW-CB(*)又はpMW-CB(
*)・EDを導入した株を、それぞれG106S pMW・CB(*)、G10
6S pMW-CB(*)・EDとした。
【００６７】これらの菌株のＬ−グルタミン酸生産能を
評価するために、ジャーファーメンターによる培養評価
に供した。培地には、50g/Lスクロース, 0.4/L MgSO4,
0.1mL/L GD-113(消泡剤), 4g/L (NH4)2S04, 2g/L KH2PO
4, 4g/Lイーストエキストラクト,,10mg/L FeSO4・7H20,
10mg/L MnSO4・4〜5H20, O.4g/L L-リジン, 0.4g/L DL-
メチオニン, 0.4g/L ジアミノピメリン酸, 12.5mg/L テ
トラサイクリン, 25mg/L クロラムフェニコールを含む
培地300mlを用いた。培養は、通気1/1VVM、撹拌1300rpm
で、アンモニアでpHを6.0に制御し、スクロースが消費
されるまで行った。培地の660nmにおける吸光度及びＬ
−グルタミン酸生産量の経時変化を、図１に示す。ま
た、最終的なＬ−グルタミン酸の生産量を表２に示す。
評価するために、ジャーファーメンターによる培養評価
に供した。培地には、50g/Lスクロース, 0.4/L MgSO4,
0.1mL/L GD-113(消泡剤), 4g/L (NH4)2S04, 2g/L KH2PO
4, 4g/Lイーストエキストラクト,,10mg/L FeSO4・7H20,
10mg/L MnSO4・4〜5H20, O.4g/L L-リジン, 0.4g/L DL-
メチオニン, 0.4g/L ジアミノピメリン酸, 12.5mg/L テ
トラサイクリン, 25mg/L クロラムフェニコールを含む
培地300mlを用いた。培養は、通気1/1VVM、撹拌1300rpm
で、アンモニアでpHを6.0に制御し、スクロースが消費
されるまで行った。培地の660nmにおける吸光度及びＬ
−グルタミン酸生産量の経時変化を、図１に示す。ま
た、最終的なＬ−グルタミン酸の生産量を表２に示す。
【００６８】
【表２】
表２
────────────────────────────────────
OD620nm(×1/101) 培養時間(h) L-グルタミン酸(g/L)
────────────────────────────────────
G106S pMW・CB(*) 0.334 12 30.4
G106S pMW-CB(*)・ED 0.258 16 36.8
────────────────────────────────────
【００６９】エントナー・ドゥドロフ経路を強化するこ
とによって、培養は遅延したものの、Ｌ−グルタミン酸
生産能を向上させ得ることが示された。 ＜３＞エントナー・ドゥドロフ経路強化株によるアセト
イン及び２，３−ブタンジオールの生成に関する検討 前記G106S pMW・CB(*)、及びG106S pMW-CB(*)・ED株を、
＜２＞におけるＬ−グルタミン酸生産能の評価と同様に
して培養し、経時的に培地中及び菌体中のアセトイン及
び２，３−ブタンジオールの生成量を測定した。測定
は、ガスクロマトグラフィー（島津製作所、GC-1700A）
により、以下の条件で行った。
とによって、培養は遅延したものの、Ｌ−グルタミン酸
生産能を向上させ得ることが示された。 ＜３＞エントナー・ドゥドロフ経路強化株によるアセト
イン及び２，３−ブタンジオールの生成に関する検討 前記G106S pMW・CB(*)、及びG106S pMW-CB(*)・ED株を、
＜２＞におけるＬ−グルタミン酸生産能の評価と同様に
して培養し、経時的に培地中及び菌体中のアセトイン及
び２，３−ブタンジオールの生成量を測定した。測定
は、ガスクロマトグラフィー（島津製作所、GC-1700A）
により、以下の条件で行った。
【００７０】使用カラム：VARIAN PORAPLOTQ PLOT FS25
X32 (0.32mm X 25M) 温度：気化室 250℃、カラム 240℃、FID 250℃ カラム入口圧：180kPa キャリアガス流量：1.6062ml/分
X32 (0.32mm X 25M) 温度：気化室 250℃、カラム 240℃、FID 250℃ カラム入口圧：180kPa キャリアガス流量：1.6062ml/分
【００７１】結果を、図２Ａ（培地中のアセトイン
量）、図２Ｂ（培地中の２，３−ブタンジオール量）及
び図２Ｃ（単位菌体当たりの生成アセトイン及び２，３
−ブタンジオールの合計量）に示す。エントナー・ドゥ
ドロフ経路を強化することによって、アセトイン及び
２，３−ブタンジオールの生成が増大することが示され
た。
量）、図２Ｂ（培地中の２，３−ブタンジオール量）及
び図２Ｃ（単位菌体当たりの生成アセトイン及び２，３
−ブタンジオールの合計量）に示す。エントナー・ドゥ
ドロフ経路を強化することによって、アセトイン及び
２，３−ブタンジオールの生成が増大することが示され
た。
【００７２】
【発明の効果】本発明により、エントナー・ドゥドロフ
経路を有する微生物のＬ−アミノ酸生産能を向上させる
ことができる。
経路を有する微生物のＬ−アミノ酸生産能を向上させる
ことができる。
【００７３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.）
<120> Ｌ−アミノ酸の製造法
<130> P-9050
<140>
<141> 2002-03-27
<160> 8
<170> PatentIn Ver. 2.0
【００７４】
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 1
cgctagtcga ccaattttta cactttcagg cctcg 35
【００７５】
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 2
gggggggatc cagtcagaat gtcacgtttg ataat 35
【００７６】
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 3
cccccgggtc tgttacctgc agacgtcg 28
【００７７】
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 4
acgcacgata tccctttcaa acatttaagg tctccttagc gc 42
【００７８】
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 5
gtttgaaagg gatatcgtgg ct 22
【００７９】
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 6
aaaagcttat cgacgctccc ctcccca 27
【００８０】
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 7
cccccgggat ttccttcctc cggtctgctt 30
【００８１】
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 8
taaagcttgg tcagggcgtt ggcggtggcg 30
【図１】 edd及びeda遺伝子強化株の生育（Ａ）及びＬ
−グルタミン酸生産量（Ｂ）を示す図。
−グルタミン酸生産量（Ｂ）を示す図。
【図２】 edd及びeda遺伝子強化株によるアセトイン及
び２，３−ブタンジオールの生成量を示す図。（Ａ）培
地中のアセトイン量、（Ｂ）培地中の２，３−ブタンジ
オール量、（Ｃ）単位菌体当たりの生成アセトイン及び
２，３−ブタンジオールの合計量（乾燥菌体重量当たり
の重量）。
び２，３−ブタンジオールの生成量を示す図。（Ａ）培
地中のアセトイン量、（Ｂ）培地中の２，３−ブタンジ
オール量、（Ｃ）単位菌体当たりの生成アセトイン及び
２，３−ブタンジオールの合計量（乾燥菌体重量当たり
の重量）。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
(Ｃ１２Ｐ 13/14
Ｃ１２Ｒ 1:01）
(72)発明者 浅野 貴弘
神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素
株式会社発酵技術研究所内
(72)発明者 渡辺 保之
神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素
株式会社発酵技術研究所内
(72)発明者 中松 亘
東京都千代田区神田錦町２−２東京電機大
学工学部物質工学科内
Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA07 BA71 BA74 CA04
DA05 EA04 FA02 FA13 GA14
4B064 AE03 AE04 AE05 AE06 AE07
AE20 AE24 AE35 CA02 CA19
DA01 DA10
Claims (7)
- 【請求項１】 Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微
生物を培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を培地中に生成蓄積
させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ
酸の製造法において、 前記微生物は、エントナー・ドゥドロフ経路を有し、か
つ、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは
２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルド
ラーゼ活性、又はこれらの両方の活性が増強されたグラ
ム陰性細菌であり、前記Ｌ−アミノ酸は、ピルビン酸を
中間体とする生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸
から選ばれる、Ｌ−アミノ酸の製造法。 - 【請求項２】 前記細菌は腸内細菌である請求項１記載
の方法。 - 【請求項３】 前記細菌はエンテロバクター属細菌であ
る請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 ６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活
性又は２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸
アルドラーゼ活性が、６−ホスホグルコン酸デヒドラタ
ーゼ又は２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン
酸アルドラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高める
こと、又は前記細菌細胞内のこれらの遺伝子の発現が増
強されるようにこれらの遺伝子の発現調節配列を改変す
ることにより増強された、請求項１〜３のいずれか一項
に記載の方法。 - 【請求項５】 前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−グルタミン
酸、又はＬ−グルタミン酸が中間体又はアミノ基供与体
として用いられる生合成経路によって生成するＬ−アミ
ノ酸である請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ
−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロ
イシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン
から選ばれる請求項１〜５のいずれか一項に記載の方
法。 - 【請求項７】 前記Ｌ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸で
ある請求項６記載の方法。
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| JP2002088668A JP3932945B2 (ja) | 2002-03-27 | 2002-03-27 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| AU2003202509A AU2003202509B2 (en) | 2002-03-27 | 2003-03-25 | Method for producing L-amino acid |
| PE2003000298A PE20031014A1 (es) | 2002-03-27 | 2003-03-25 | Metodo para producir l-aminoacido |
| DK03006936T DK1352966T3 (da) | 2002-03-27 | 2003-03-26 | Fremgangsmåde til fremstilling af L-aminosyrer |
| RU2003108441/13A RU2307165C2 (ru) | 2002-03-27 | 2003-03-26 | Способ получения l-аминокислоты |
| EP03006936A EP1352966B1 (en) | 2002-03-27 | 2003-03-26 | Method for producing L-amino acid |
| ES03006936T ES2243826T3 (es) | 2002-03-27 | 2003-03-26 | Procedimiento para la produccion de l-aminoacidos. |
| MYPI20031113A MY130526A (en) | 2002-03-27 | 2003-03-26 | Method for producing l-amino acid |
| US10/396,488 US7037690B2 (en) | 2002-03-27 | 2003-03-26 | Method for producing L-amino acid |
| AT03006936T ATE299945T1 (de) | 2002-03-27 | 2003-03-26 | Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren |
| DE60301031T DE60301031T2 (de) | 2002-03-27 | 2003-03-26 | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren |
| TW092107210A TWI308594B (en) | 2002-03-27 | 2003-03-27 | Method for producing l-amino acid |
| CNB031226884A CN100529094C (zh) | 2002-03-27 | 2003-03-27 | L-氨基酸的生产方法 |
| BRPI0300978-5B1A BR0300978B1 (pt) | 2002-03-27 | 2003-03-27 | Método para a produção de um ácido L-glutâmico |
| KR1020030019209A KR100949048B1 (ko) | 2002-03-27 | 2003-03-27 | Ｌ-아미노산의 생산 방법 |
| PL03359383A PL359383A1 (en) | 2002-03-27 | 2003-03-27 | Method of manufacture of l-amino acid |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003274988A true JP2003274988A (ja) | 2003-09-30 |
| JP3932945B2 JP3932945B2 (ja) | 2007-06-20 |
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ID=28449463
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| RU (1) | RU2307165C2 (ja) |
| TW (1) | TWI308594B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JP2005333984A (ja) * | 2004-04-26 | 2005-12-08 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| WO2007100009A1 (ja) * | 2006-03-03 | 2007-09-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| WO2008075483A1 (ja) | 2006-12-19 | 2008-06-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| WO2008090770A1 (ja) | 2007-01-22 | 2008-07-31 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法 |
| WO2008133161A1 (ja) | 2007-04-17 | 2008-11-06 | Ajinomoto Co., Inc. | カルボキシル基を有する酸性物質の製造法 |
| JP2009540860A (ja) * | 2006-06-26 | 2009-11-26 | シージェイチェイルジェダンコーポレーション | グリセロールを用いたアミノ酸生産方法 |
| WO2010027045A1 (ja) | 2008-09-08 | 2010-03-11 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法 |
| WO2010027022A1 (ja) | 2008-09-05 | 2010-03-11 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸生産菌及びｌ－アミノ酸の製造法 |
| WO2013069634A1 (ja) | 2011-11-11 | 2013-05-16 | 味の素株式会社 | 発酵法による目的物質の製造法 |
| WO2019211958A1 (ja) * | 2018-05-01 | 2019-11-07 | 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 | 形質転換体及びそれを用いた有機化合物の製造方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| JP4599726B2 (ja) | 2001-02-20 | 2010-12-15 | 味の素株式会社 | Ｌ−グルタミン酸の製造法 |
| JP3932945B2 (ja) * | 2002-03-27 | 2007-06-20 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
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