CN112105716A - 转化体以及使用其的有机化合物的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供在本来不具备内源性ED途径的细菌中，提高有机化合物的生产率的方法。在一个方式中，本发明涉及一种棒状细菌的转化体，其是在宿主棒状细菌中导入恩特纳‑杜德洛夫途径而得到的。在另一方式中，本发明涉及一种棒状细菌的转化体，其是在宿主棒状细菌中导入编码具有葡萄糖6‑磷酸脱氢酶活性的酶的基因、编码具有6‑磷酸葡糖酸脱水酶活性的酶的基因、以及编码具有2‑酮‑3‑脱氧‑6‑磷酸葡糖酸醛缩酶活性的酶的基因。

Description

转化体以及使用其的有机化合物的制造方法
技术领域
本发明涉及用于实施生物炼制工艺的能力得到强化的微生物、以及利用该微生物的有机化合物的高生产率制造方法。
背景技术
通过生物学方法由生物质来源的糖类原料制造有机酸、氨基酸和醇等有机化合物，从而制成化学制品、能源制品的技术被称为生物炼制。另一方面，由化石资源制造这些有机化合物的技术则被称为石油炼制。生物炼制与石油炼制不同，可解决资源枯竭问题、地球温暖化问题，作为环境友好型制造技术而受到期待。
但是，据说生物炼制的生产率通常低于石油炼制。
利用生物方法的生产率的提高方法之一是提高糖类向各种有机化合物的代谢速度和收率，提高生物反应溶液中的有机化合物的蓄积浓度(可高效实施目标有机化合物的分离·纯化)。
利用棒状杆菌属细菌的糖代谢介由埃姆登-迈耶霍夫-帕那斯途径(Embden-Meyerhof-Parnas Pathway，简称EMP途径)和戊糖磷酸途径(PP途径)而进行，糖类被变换为丙酮酸，然后进一步变换为各种有机化合物。另一方面，运动发酵单胞菌等部分微生物介由恩特纳-杜德洛夫途径(Entner-Doudoroff Pathway，简称ED途径)进行糖代谢。
ED途径包括：将葡萄糖6-磷酸变换为6-磷酸葡糖酸-1,5-内酯的葡萄糖6-磷酸脱氢酶(以下，缩写为“G6DH”)、将6-磷酸葡糖酸-1,5-内酯变换为6-磷酸葡糖酸的6-磷酸葡糖酸内酯酶、催化从6-磷酸葡糖酸至2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸的反应的6-磷酸葡糖酸脱水酶(以下，缩写为“EDD”)、以及使2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸断裂而生成甘油醛-3-磷酸和丙酮酸的酶2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶(以下，缩写为“EDA”)。据说由于利用ED途径的糖代谢中，ATP生成效率低，为了弥补上述问题而糖代谢速度高于EMP途径，结果在发酵生产中，在具有ED途径的微生物中可实现高的生产率。
专利文献1中，关于酿酒酵母属酵母记载了以下示例：在进行改造而使得不能通过EMP途径进行糖代谢的酵母中导入ED途径，糖代谢途径被改造为仅通过ED途径代谢糖。
专利文献2公开了一种异丁醇生产技术，其中，以大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母(Saccharomyces cerevisiae)或乳酸菌(Lactobacillus plantarum)为宿主导入或强化ED途径，并且使EMP途径及PP途径的酶失活，由此仅使ED途径中的碳流量增强。
专利文献3公开了，通过强化内源的ED途径，具体而言增强6-磷酸葡糖酸脱水酶活性或2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶活性、或这两者来提高L-氨基酸生产的收率。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特表平9-510360号公报
专利文献2:美国专利第2010/0120105号说明书
专利文献3:日本专利第3932945号公报
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明在一个方式中提供本来不具备内源性ED途径的细菌中，提高有机化合物的生产率的方法。
用于解决问题的技术方案
本发明的一个方式涉及一种棒状细菌的转化体，其在宿主棒状细菌中导入了恩特纳-杜德洛夫途径。
本发明的另一个方式涉及一种棒状细菌的转化体，其在宿主棒状细菌中导入编码具有葡萄糖6-磷酸脱氢酶活性的酶的基因、编码具有6-磷酸葡糖酸脱水酶活性的酶的基因、以及编码具有2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶活性的酶的基因。
本发明的另一个方式涉及一种有机化合物的制造方法，其包括：使本发明的棒状细菌转化体在除去增殖需要的因子中的至少1种的反应液中、或还原条件的反应液中反应的工序；以及回收反应培养基中的有机化合物的工序。
发明的效果
根据本发明，在一个方式中，可使棒状细菌中的有机化合物的制造高效化。例如，可提高有机化合物的生产中的生产速度和/或收率。
具体实施方式
本发明人等进行深入研究，结果发现，通过在棒状细菌中表达构成恩特纳-杜德洛夫途径(ED途径)的酶基因、使埃姆登-迈耶霍夫-帕那斯途径途径(EMP途径)和ED途径这2种糖酵解系统并存，可提高有机化合物的生产率。
推测在野生型且不具有ED途径的棒状细菌中通过使ED途径和EMP途径这2种糖酵解系统发挥功能，从而使得糖类的代谢变换消耗速度提高，有机化合物的生产率提高。但是，本发明可以不限定于该机制。
根据本发明，在一个方式中，可提高碳原料向糖类代谢产物即有机化合物的变换速度和变换率(收率)。
应予说明，专利文献1和2中，使内源性EMP途径失活。
另外，专利文献3中，虽然强化了内源性ED途径，但是氨基酸生产速度因ED途径的强化反而下降。
[宿主]
在本发明中，导入有ED途径的宿主为棒状细菌。
棒状细菌即自然界中存在的野生型本来不具有ED途径。
本发明中，棒状细菌是指伯杰氏鉴定细菌学手册[Bargeys Manual of DeterminativeBacteriology，Vol.8、599(1974)]中定义的一类微生物，只要在通常的需氧条件下增殖的微生物就没有特别限定。若举出具体例，可举出棒状杆菌属菌、短杆菌属菌、节细菌属菌菌、分枝杆菌属菌和微球菌属菌等。在棒状细菌中，优选为棒状杆菌属菌。
作为棒状杆菌属菌，可举出谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerance)、和解烷棒杆菌(Corynebacteriumalkanolyticum)等。其中，从安全且低聚木糖的利用能力高的角度出发，优选为谷氨酸棒状杆菌。
作为合适的菌株，可举出谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株(FERMP-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233(FERM BP-1497)、以及MJ-233AB-41(FERMBP-1498)等。其中，优选为R株(FERM P-18976)、ATCC13032株、以及ATCC13869株。
这些菌株可从微生物保存机构即NBRC(NITE Biological Resource Center)、以及ATCC(American Type Culture Collection)等获取。
另外，这些微生物不仅可以为自然界中存在的野生株，也可以为其突变株或基因重组株。
[ED途径的导入]
在宿主棒状细菌中导入ED途径的一个方式可举出至少导入以下3个基因的方式。
(1)编码具有葡萄糖6-磷酸脱氢酶活性的酶的基因。
(2)编码具有6-磷酸葡糖酸脱水酶活性的酶的基因。
(3)编码具有2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶活性的酶的基因。
用于导入ED途径的基因可从各种生物中取得，只要在宿主棒状细菌内发挥功能，来源就没有特别限定。可在常见的基因序列数据库(例如KEGG；http://www.genome.jp/kegg/genes.html)中检索该基因序列。
用于导入ED途径的基因也可以在该基因编码的氨基酸序列中具有氨基酸缺失、添加或氨基酸置换，各酶具有上述(1)～(3)的酶活性即可。
在本发明中，在向宿主棒状细菌导入构成ED途径的酶基因时，可使用常见的基因重组技术(例如Michael R.Green&Joseph Sambrook,Molecular cloning,Cold springHarbor Laboratory Press记载的方法)来进行，可通过使用质粒载体的基因导入或整合至宿主棒状细菌染色体的方式来实施。
在本发明中，在一个或多个实施方式中，基因的导入是指以该基因能够在宿主内表达的方式导入。
例如，在将葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因导入至宿主棒状细菌时，优选将适当的启动子整合至该基因的5’-侧上游，此外进一步优选将终止子整合至3’-侧下游。
[具有葡萄糖6-磷酸脱氢酶活性的酶]
在本发明中，具有葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G6DH)活性的酶是指具有将葡萄糖6-磷酸变换为6-磷酸葡糖酸-1,5-内酯的活性的酶。
在本发明中，从有机化合物生产的高效化的观点出发，具有G6DH活性的酶优选为能够利用氧化型烟酰胺二核苷酸(NAD+)作为辅酶的酶。
作为编码以NAD+为辅酶的具有葡萄糖6-磷酸脱氢酶活性的酶的基因，可举出运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的葡萄糖6-磷酸-1-脱氢酶基因(zwf基因)或其种间同源基因。作为上述种间同源基因，可举出埃希菌属、假单胞菌属、肠杆菌属或泛菌属的种间同源基因。
应予说明，本发明中“种间同源基因”是指：存在于不同生物(例如不同种、不同属)的编码具有相同的功能的蛋白的类似基因。
[具有6-磷酸葡糖酸脱水酶活性的酶]
在本发明中，具有6-磷酸葡糖酸脱水酶(EDD)活性的酶是指：具有催化从6-磷酸葡糖酸至2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸的反应的活性的酶。
在本发明中，作为编码具有EDD活性的酶的基因，可举出运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的6-磷酸葡糖酸脱水酶基因(edd基因)或其种间同源基因。作为上述种间同源基因，可举出埃希菌属、假单胞菌属、肠杆菌属或泛菌属的种间同源基因。
[具有2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶活性的酶]
在本发明中，具有2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶(EDA)活性的酶是指：具有使2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸断裂而生成甘油醛-3-磷酸和丙酮酸的活性的酶。
在本发明中，作为编码具有EDA活性的酶的基因，可举出运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的6-磷酸葡糖酸脱水酶基因(eda基因)或其种间同源基因。作为上述种间同源基因，可举出埃希菌属、假单胞菌属、肠杆菌属或泛菌属的种间同源基因。
[转化体]
本发明的一个方式涉及在宿主棒状细菌中导入ED途径的转化体。
在一个或多个实施方式中，本发明的转化体为在宿主棒状细菌中至少导入上述(1)～(3)的基因的转化体。
通过在宿主棒状细菌中导入ED途径，从而细胞内的丙酮酸和/或磷酸烯醇式丙酮酸的产生亢进。
为了产生或高效产生有机化合物，可以在本发明的转化体中进一步导入基因，也可以使基因缺失和/或导入突变。这些基因的导入等可由本领域技术人员根据产生的有机化合物适当设计。
[有机化合物]
在一个或多个实施方式中，本发明的转化体产生的有机化合物可举出以丙酮酸为中间体的化合物或以磷酸烯醇式丙酮酸为中间体的化合物。
作为以丙酮酸为中间体的化合物或以磷酸烯醇式丙酮酸为中间体的化合物，可举出选自单羧酸、二羧酸、酮酸(ketocarboxylic acid)、羟基羧酸、氨基酸、一元醇、多元醇、芳香族化合物及维生素中的至少1种。
作为以丙酮酸为中间体的化合物，可举出L-乳酸、D-乳酸、乙酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、草酰乙酸、柠檬酸、顺式乌头酸、衣康酸、异柠檬酸、2-氧代戊二酸、2-羟基异戊酸、乙醇、1,3-丙二醇、甘油、丁醇、异丁醇、1,4-丁二醇、木糖醇、山梨糖醇、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸以及苏氨酸等。
作为以磷酸烯醇式丙酮酸为中间体的化合物，可举出莽草酸、原儿茶酸、儿茶酚、4-羟基苯甲酸、苯酚、酪氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸等。
[有机化合物的制造方法]
本发明的转化体可在不伴有菌体增殖的反应液中以糖类为原料高效生产以丙酮酸为中间体的化合物或以磷酸烯醇式丙酮酸为中间体的化合物，例如，单羧酸、二羧酸、酮酸、羟基羧酸、氨基酸、一元醇、多元醇、芳香族化合物和维生素等。
因此，本发明的另一个方式涉及一种有机化合物的制造方法，其包括：使本发明的转化体在除去增殖需要的因子中的至少1种的反应液中、或还原条件的反应液中反应的工序；以及回收反应培养基中的有机化合物的工序。
在本发明的有机化合物的制造方法中，首先，在需氧条件下对上述的本发明的转化体进行增殖培养。
本发明的转化体的培养可使用含有碳源、氮源和无机盐等的常规营养培养基来进行。培养中，作为碳源，例如可分别单独使用或混合使用葡萄糖或废糖蜜等，并且，作为氮源，例如可分别单独使用或混合使用氨、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或尿素等。另外，作为无机盐，例如可使用磷酸一氢钾、磷酸二氢钾或硫酸镁等。此外，还可以根据需要将蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白氨基酸或生物素或硫胺素等各种维生素等营养素适当添加至培养基中。
培养通常在通气搅拌或振荡等需氧条件下，在约20℃～约60℃，优选约25℃～约35℃的温度下进行。培养时的pH例如为5～10左右，优选7～8左右的范围，培养中的pH调整可通过添加酸或碱来进行。培养开始时的碳源浓度为约1％(W/V)～约20％(W/V)，优选为约2％(W/V)～约5％(W/V)。另外，培养期通常为1～7天左右。
接着，回收本发明的转化体的培养菌体。作为从如上所述得到的培养物中回收分离培养菌体的方法，没有特别限定，例如可使用离心分离、膜分离等公知的方法。
可以对回收的培养菌体施加处理，将得到的菌体处理物用于接下来的工序。作为上述菌体处理物，可举出对培养菌体施加任意处理而得到的产物，例如可举出利用丙烯酰胺或角叉菜胶等将菌体固定而得的固定化菌体等。
利用从如上所述得到的培养物中回收分离的本发明的转化体的培养菌体或其菌体处理物的有机化合物的生成反应只要是在不伴有菌体增殖的反应液中就可以使用需氧条件和还原条件中的任一生成方式。有机化合物生成方式还可以为间歇式、连续式中的任一生成方式。
在本发明中，不增殖包括实质上不增殖或几乎不增殖。例如，可通过使用缺少或者限制需氧条件的反应中微生物的增殖需要的化合物即生物素、硫胺素等维生素类、氮源等中的1种以上的反应液，来避免或抑制转化体的增殖。
另外，在还原条件下，棒状细菌实质上不增殖，因此反应液的组成不受限制。还原条件下的反应液的氧化还原电位优选为约-200mV～约-500mV，更优选为约-150mV～约-500mV。反应液的还原状态可简便地用刃天青指示剂(若为还原状态，则由蓝色褪色为无色)来推断，为了准确，可使用氧化还原电位差计(例如BROADLEY JAMES公司制造，ORPElectrodes)来测定。
在本发明中，优选从在反应液中添加菌体或其处理物之后不久至采取有机化合物，维持还原条件，至少在采取有机化合物的时刻反应液为还原状态即可。期望在反应时间的约50％以上，更优选约70％以上，进一步优选约90％以上的时间内，反应液保持在还原条件下。其中，更期望在反应时间的约50％以上，更优选约70％以上，进一步优选约90％以上的时间内，反应液的氧化还原电位保持在约-200mV～约-500mV左右。
因此，本发明的一个方式涉及一种有机化合物的制造方法，其包括：使本发明的菌转化体在除去增殖需要的因子中的至少1种的反应液中、或还原条件的反应液中反应的工序；以及回收反应培养基中的有机化合物的工序。
反应液含有成为有机化合物生成的原料的有机碳源(例如糖类等)。作为有机碳源，可举出本发明的转化体在生化反应中可利用的物质。
具体而言，作为糖类，可举出：葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖或甘露糖等单糖类；纤维二糖、蔗糖、乳糖或麦芽糖等二糖类；或者糊精或可溶性淀粉等多糖类等。其中，优选为葡萄糖。
最后，采取如上所述在反应培养基中生成的有机化合物。其方法可使用生物工程中使用的公知方法。作为这样的公知方法，包括有机化合物生成液的盐析法、重结晶法、有机溶剂提取法、酯化蒸馏分离法、色谱分离法或电渗析法等，可根据生成有机化合物的特性适当决定其分离纯化收集法。
本发明在一个或多个实施方式中可涉及以下发明；
[1]一种棒状细菌的转化体，其是在宿主棒状细菌中导入恩特纳-杜德洛夫途径而得到的(Entner-Doudoroff Pathway)而得到的。
[2]一种棒状细菌的转化体，其在宿主棒状细菌中导入：
编码具有葡萄糖6-磷酸脱氢酶活性的酶的基因、
编码具有6-磷酸葡糖酸脱水酶活性的酶的基因、以及编码具有2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶活性的酶的基因。
[3]根据[2]记载的转化体，其中，上述葡萄糖6-磷酸脱氢酶为能够利用氧化型烟酰胺二核苷酸作为辅酶的酶。
[4]根据[1]～[3]中任一项记载的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒状杆菌。
[5]根据[1]～[4]中任一项记载的转化体，其中，上述转化体还导入有用于提高有机化合物的生产效率的基因。
[6]根据[1]～[5]中任一项记载的转化体，其中，宿主棒状细菌为谷氨酸棒状杆菌R(FERM P-18976)、ATCC13032或ATCC13869。
[7]一种谷氨酸棒状杆菌ALA98株(保藏编号:NITE BP-02688)转化体。
[8]一种有机化合物的制造方法，其包括：使[1]～[7]中任一项记载的转化体在除去增殖需要的因子中的至少1种的反应液中、或还原条件的反应液中反应的工序；以及回收反应培养基中的有机化合物的工序。
[9]根据[8]记载的有机化合物的制造方法，其包括：使用[1]至[7]中任一项记载的转化体，在反应液中由选自葡萄糖、果糖、纤维二糖、木二糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糊精、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和可溶性淀粉中的糖类变换为有机化合物，并从该反应液回收有机化合物。
[10]根据[8]或[9]记载的有机化合物的制造方法，其中，上述有机化合物为以丙酮酸为中间体的化合物或以磷酸烯醇式丙酮酸为中间体的化合物。
[11]根据[8]～[10]中任一项记载的有机化合物的制造方法，其中，上述有机化合物为选自单羧酸、二羧酸、酮酸、羟基羧酸、氨基酸、一元醇、多元醇、芳香族化合物和维生素中的至少1种。
实施例
以下通过实施例详细说明本发明，但是本发明不受这些实施例限定。
[实施例1]
以导入ED途径的谷氨酸棒状杆菌为宿主的乙醇、异丁醇、D-乳酸、丙氨酸和莽草酸生产 株的构建
(1)染色体DNA的制备·获取
由下述菌株制备染色体DNA。
关于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R(FERM P-18976)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis ATCC 31821)的染色体DNA，在按照菌株获取机构的信息进行培养后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNAIsolation Kit，安玛西亚公司制造)进行制备。
(2)基因表达质粒的构建
将用于分离目标酶基因的引物序列示于表1。PCR使用了Veriti热循环仪(AppliedBiosystems公司制造)，作为反应试剂，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa Bio株式会社制造)。将得到的DNA片段导入至含有tac启动子的克隆载体(pCRG5、pCRB214[FEBSLett.2012 Nov 30；586(23)：4228-4232])。
将导入的克隆载体和得到的质粒名示于表2。应予说明，zwf和edd在染色体上连续地在相同方向配置，因此一并进行克隆(序列号1)。
pCRG5克隆载体的构建
构建将来源于克隆载体pKK223-3(Pharmacia公司制作)的tac启动子序列和rrnB T1T2双向终止子序列导入至包含pCASE1 ori序列的载体pCRB22[Appl EnvironMicrobiol.2012 Jun；78(12)：4447-4457]而得到的pCRG5。在tac启动子序列扩增时，使用序列号7和8的引物，将得到的DNA片段导入至pCRB210[Microbiology.2015 Feb；161(Pt2)：254-263/WO2012/033112]。将得到的含有tac启动子的克隆载体命名为pCRG5。
[表1]
ED途径关联基因分离用引物
Figure BDA0002748478460000121
[表2]
ED途径关联基因表达质粒
基因源 酶基因 导入载体 质粒名
Zymomonas mobilis zwf-edd pCRG5 pCRG10
Zymomonas mobilis eda pCRB214 pCRG11
(3)染色体导入株的构建
基于已报告的在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株的生长不需要的序列[Appl Environ Microbiol.2005 Jun；71(6)：3369-3372](SSI区域)，确定用于以无标记方式将基因导入至谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株的染色体需要的DNA区域。通过PCR法扩增该DNA区域。将得到的DNA片段导入至无标记基因导入用质粒pCRA725[J Mol Microbiol Biotechnol.2004；8(4)：243-54/JP 2006-124440A]。应予说明，pCRG12中导入有用于通过反向PCR法将基因整合至SSI区域的限制酶位点(独特位点)。将SSI区域的分离、以及反向PCR中使用的引物序列和得到的染色体导入用载体示于表3。
[表3]
用于分离SSI区域的引物序列以及得到的染色体导入用载体
Figure BDA0002748478460000131
*：用于反向PCR法的引物
从上述表2中构建的ED途径关联基因表达质粒取得tac启动子融合酶基因片段，并将其导入至上述的染色体导入用载体而构建染色体导入用质粒pCRG14和pCRG15。另外，使用pCRB215[Appl Microbiol Biotechnol.2015 Jun；99(11)：4679-4689]和pCRB263[WO2017/146241]构建德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii)来源的ldhA基因的染色体导入用质粒pCRG16。将得到的染色体导入用质粒示于表4。
[表4]
ED途径以及D-乳酸生产关联基因染色体导入用质粒
Figure BDA0002748478460000132
(4)基于染色体基因重组构建生产株
无标记染色体基因导入用pCRA725为不能在谷氨酸棒状杆菌R内复制的质粒。在导入至质粒pCRA725的SSI区域与染色体上的同源区域的单交换株的情况下，显示pCRA725上的卡那霉素抗性基因的表达而引起的卡那霉素抗性和枯草杆菌(Bacillus subtilis)的sacR-sacB基因的表达而引起的在含蔗糖培养基中的致死性，与此相对，在双交换株的情况下，显示pCRA725上的卡那霉素抗性基因的脱落而引起的卡那霉素敏感性和sacR-sacB基因的脱落而引起的在含蔗糖培养基中的生长性。因此，无标记染色体基因导入株显示卡那霉素敏感性和含蔗糖培养基生长性。
通过上述方法，使用上述ED途径关联基因染色体导入用质粒构建ED途径关联基因染色体导入株。作为宿主菌株，使用棒状细菌CRZ14[Appl Microbiol Biotechnol.2015 Feb；99(3):1165-1172]和LPglc267[Appl Microbiol Biotechnol.2015 Jun；99(11):4679-4689]。
另外，以棒状细菌CRZ1[J Mol Microbiol Biotechnol.2004；8(4):243-254]为宿主，使用以下质粒构建LHglc435：阿拉伯糖同化基因(araBAD)染色体导入用质粒pCRD109[ApplMicrobiol Biotechnol.2009 Nov；85(1):105-115]、阿拉伯糖转运蛋白基因(araE)染色体导入用质粒pCRD108[Appl Microbiol Biotechnol.2009 Nov；85(1):105-115]、木糖同化基因(xylAB)染色体导入用质粒Xyl4·Xyl5[Appl Microbiol Biotechnol.2008 Dec；81(4):691-699]、纤维二糖同化基因(bglF(V317A)bglA)染色体导入用质粒Cel1[ApplMicrobiol Biotechnol.2008 Dec；81(4):691-699]、gapA基因染色体导入用质粒pCRD907[Appl Environ Microbiol.2012 Jun；78(12):4447-4457]、gpi基因染色体导入用质粒pCRD913[Appl Environ Microbiol.2012 Jun；78(12):4447-4457]、tpi基因染色体导入用质粒pCRB224[Appl Microbiol Biotechnol.2013 Aug；97(15):6693-6703]、tkt-tal基因染色体导入用质粒pCRB283[WO2016/027870]、qsuB基因破坏用质粒pSKM26[WO2016/027870A1]、pobA基因破坏用质粒pCRA725-pobA/CG[WO2012/063860 A1]、poxF基因破坏用质粒pCRA725-poxF/CG[WO2012/067174 A1]、qsuD基因破坏用质粒pSKM27[WO2016/027870 A1]和aroK基因破坏用质粒pCRC329[WO2016/027870 A1]。应予说明，将本染色体基因重组的概要汇总于表5和6。
[表5]
基于染色体基因重组的ED途径以及D-乳酸生产关联基因导入株的构建
构建菌株名 宿主菌株名 重组质粒 染色体导入基因
CRZ14ED CRZ14 pCRG14，pCRG15 zwf-edd，eda
LPglc267ED LPglc267 pCRG14，pCRG15 zwf-edd，eda
LPglc349 LPglc267 pCRG16 IdhA(L.delbrueckii)
LPglc349ED LPglc267ED pCRG16 IdhA(L.delbrueckii)
LHglc435ED LHglc435 pCRG14，pCRG15 zwf-edd，eda
[表6]
基于染色体基因重组的构建菌株的概要
Figure BDA0002748478460000161
x2：表示导入至染色体的基因的个数
**：将混合糖同化基因即来自大肠杆菌K-12株的xylA基因(木糖异构酶)、xylB基因(木酮糖激酶)、araA基因(阿拉伯糖异构酶)、araB基因(核酮糖激酶)、araD基因(核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶)、来自谷氨酸棒杆菌R株的bglF(V317A)基因(β-葡糖苷酶)、bglA基因(6-磷酰-β-葡糖苷酶)以及来自谷氨酸棒杆菌ATCC 31831株的araE基因(阿拉伯糖转运蛋白)导入染色体。
(5)基于导入质粒构建有用物质生产株
在上述的染色体基因重组株中导入pCRA723[J Mol Microbiol Biotechnol.2004；8(4)：243-254]，由此构建乙醇生产株。通过导入pCRB-BNCTM[Appl Environ Microbiol.2012Feb；78(3)：865-875]、pCRD926和pCRD927[Biotechnol Bioeng.2013 Nov；110(11)：2938-48]而构建异丁醇生产株。通过导入pCRD914[Appl Environ Microbiol.2012 Jun；78(12)：4447-4457]而构建丙氨酸生产株。通过导入pCRB1-aroG/CG[WO2012/033112 A1]和pSKM7[WO2016/027870 A1]而构建莽草酸生产株。应予说明，将本生产株的概要汇总于表7。
[表7]
基于质粒导入的有用物质生产株的构建
Figure BDA0002748478460000171
谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ALA98在日本国千叶县木更津市KAZUSA镰足2-5-8122号室(邮政编码292-0818)的国家技术评估学会专利微生物保藏中心进行了国际保藏(基于布达佩斯条约的国际保藏的保藏日：2018年4月17日，保藏编号：NITEBP-02688)。
[实施例2]
验证利用产乙醇的谷氨酸棒状杆菌转化体的ED途径导入效果
使用以谷氨酸棒状杆菌R株为基础而构建的乙醇生产株ETH1株和ETH2株[参照实施例1(表7)]，研究增殖抑制条件下的乙醇生产率。使用添加有4％葡萄糖和5ng/L氯霉素(chloramphenicol)的营养培养基(在1升水中溶解2g尿素、2g酵母提取物、7g酪蛋白氨基酸、7g(NH4)2SO4、0.5g KH2PO4、0.5g K2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、6mg FeSO4·7H2O、4.2mgMnSO4·H2O、0.2mg生物素以及0.2mg硫胺素·HCl)在需氧条件下培养评价菌株，从而制备菌体。将得到的菌体悬浮于最小培养基(在1升水中溶解7g(NH4)2SO4、0.5g KH2PO4、0.5gK2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、6mg FeSO4·7H2O、4.2mg MnSO4·H2O、0.2mg生物素以及0.2mg硫胺素)，使得达到10g(干燥菌体)/L，添加葡萄糖开始生产反应。反应温度为33℃，适当添加氨水溶液而使pH维持6.5。将生产试验的结果示于表8。ED途径导入株(ETH2)与未导入ED途径的菌株(ETH1)相比，生产率显著提高。
[表8]
基于ED途径导入的有无的乙醇生产率比较
菌株 生产速度(mmol/L/h) 相对于糖的收率(％)
ETH1 23.6 80
ETH2 44.7 97
[实施例3]
验证利用异丁醇生产谷氨酸棒状杆菌转化体的ED途径导入效果
使用以谷氨酸棒状杆菌R株为基础而构建的异丁醇生产株IBU103株和IBU104株[参照实施例1(表7)]，研究增殖抑制条件下的异丁醇生产率。使用添加有4％葡萄糖、50ng/L卡那霉素、5ng/L氯霉素以及50ng/L博来霉素(zeocin)的营养培养基在需氧条件下培养评价菌株而制备菌体。将得到的菌体悬浮于最小培养基，使得达到20g(干燥菌体)/L，添加葡萄糖开始生产反应。反应温度为33℃，适当添加氨水溶液使pH维持7.5。将生产试验的结果示于表9。ED途径导入株(IBU104)与未导入ED途径的菌株(IBU103)相比，生产率显著提高。
[表9]
基于ED途径导入的有无的异丁醇生产率比较
菌株 生产速度(mmol/L/h) 相对于糖的收率(％)
IBU103 15.9 59.8
IBU104 23.3 63.4
[实施例4]
验证利用产D-乳酸的谷氨酸棒状杆菌转化体的ED途径导入效果
使用以谷氨酸棒状杆菌R株为基础而构建的D-乳酸生产株LPglc349株和LPglc349ED株[参照实施例1(表6)]，研究增殖抑制条件下的D-乳酸生产率。使用添加有4％葡萄糖的营养培养基在需氧条件下培养评价菌株而制备菌体。将得到的菌体悬浮于最小培养基，使得达到10g(干燥菌体)/L，添加葡萄糖开始生产反应。反应温度为33℃，适当添加氨水溶液使pH维持7.0。将生产试验的结果示于表10。ED途径导入株(LPglc349ED)与未导入ED途径的菌株(LPglc349)相比，生产率显著提高。
[表10]
基于ED途径导入的有无的D-乳酸生产率比较
菌株 生产速度(mmol/L/h) 相对于糖的收率(％)
LPglc349 24.1 83
LPglc349ED 34.8 93
[实施例5]
验证利用产丙氨酸的谷氨酸棒状杆菌转化体的ED途径导入效果
使用以谷氨酸棒状杆菌R株为基础而构建的丙氨酸生产株ALA97株和ALA98株[参照实施例1(表7)]，研究增殖抑制条件下的丙氨酸生产率。使用添加有4％葡萄糖以及50ng/L卡那霉素的营养培养基在需氧条件下培养评价菌株而制备菌体。将得到的菌体悬浮于最小培养基，使得达到10g(干燥菌体)/L，添加葡萄糖开始生产反应。反应温度为33℃，适当添加氨水溶液使pH维持7.0。将生产试验的结果示于表11。ED途径导入株(ALA98)与未导入ED途径的菌株(ALA97)相比，生产率显著提高。
[表11]
基于ED途径导入的有无的丙氨酸生产率比较
菌株 生产速度(mmol/L/h) 相对于糖的收率(％)
ALA97 26.3 80
ALA98 45.0 86
[实施例6]
验证利用产莽草酸的谷氨酸棒状杆菌转化体的ED途径导入效果
使用以谷氨酸棒状杆菌R株为基础而构建的丙氨酸生产株SHI2株和SHI3株[参照实施例1(表7)]，研究增殖抑制条件下的丙氨酸生产率。使用添加有4％葡萄糖、50ng/L卡那霉素、5ng/L氯霉素、20μg/ml苯丙氨酸、20μg/ml酪氨酸、20μg/ml色氨酸以及10μg/ml对氨基苯甲酸的营养培养基在需氧条件下培养评价菌株而制备菌体。将得到的菌体悬浮于最小培养基，使得达到10g(干燥菌体)/L，添加葡萄糖开始生产反应。使用1000ml容量发酵罐(ABLE株式会社制造，型号：BMJ1L)，在反应温度为33℃、通气量为0.25L/分钟(air、1vvm)、溶解氧浓度(DO)为5％(将大气压下饱和溶解氧浓度设为100％)的条件下进行反应，适当添加氨水溶液使pH维持7.0。将生产试验的结果示于表12。ED途径导入株(SHI3)与未导入ED途径的菌株(SHI2)相比，生产率显著提高。
[表12]
基于ED途径导入的有无的莽草酸生产率比较
菌株 生产速度(mmol/L/h) 相对于糖的收率(％)
SHI2 0.22 16
SHI3 0.29 18
产业上的可利用性
本发明例如在有机酸、氨基酸以及醇等有用的有机化合物的制造中是有用的。
序列表
<110> 公益财团法人地球环境产业技术研究机构
<120> 转化体以及使用其的有机化合物的制造方法
<130> H4641-01
<150> JP 2018-88425
<151> 2018-05-01
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3274
<212> DNA
<213> 运动发酵单胞菌
<400> 1
atgacaaata ccgtttcgac gatgatattg tttggctcga ctggcgacct ttcacagcgt 60
atgctgttgc cgtcgcttta tggtcttgat gccgatggtt tgcttgcaga tgatctgcgt 120
atcgtctgca cctctcgtag cgaatacgac acagatggtt tccgtgattt tgcagaaaaa 180
gctttagatc gctttgtcgc ttctgaccgg ttaaatgatg acgctaaagc taaattcctt 240
aacaagcttt tctacgcgac ggtcgatatt acggatccga cccaattcgg aaaattagct 300
gacctttgtg gcccggtcga aaaaggtatc gccatttatc tttcgactgc gccttctttg 360
tttgaagggg caatcgctgg cctgaaacag gctggtctgg ctggtccaac ttctcgcctg 420
gcgcttgaaa aacctttagg tcaagatctt gcttcttccg atcatattaa tgatgcggtt 480
ttgaaagttt tctctgaaaa gcaagtttat cgtattgacc attatctggg taaagaaacg 540
gttcagaatc ttctgaccct gcgttttggt aatgctttgt ttgaaccgct ttggaattca 600
aaaggcattg accacgttca gatcagcgtt gctgaaacgg ttggtcttga aggtcgtatc 660
ggttatttcg acggttctgg cagcttgcgc gatatggttc aaagccatat ccttcagttg 720
gtcgctttgg ttgcaatgga accaccggct catatggaag ccaacgctgt tcgtgacgaa 780
aaggtaaaag ttttccgcgc tctgcgtccg atcaataacg acaccgtctt tacgcatacc 840
gttaccggtc aatatggtgc cggtgtttct ggtggtaaag aagttgccgg ttacattgac 900
gaactgggtc agccttccga taccgaaacc tttgttgcta tcaaagcgca tgttgataac 960
tggcgttggc agggtgttcc gttctatatc cgcactggta agcgtttacc tgcacgtcgt 1020
tctgaaatcg tggttcagtt taaacctgtt ccgcattcga ttttctcttc ttcaggtggt 1080
atcttgcagc cgaacaagct gcgtattgtc ttacagcctg atgaaaccat ccagatttct 1140
atgatggtga aagaaccggg tcttgaccgt aacggtgcgc atatgcgtga agtttggctg 1200
gatctttccc tcacggatgt gtttaaagac cgtaaacgtc gtatcgctta tgaacgcctg 1260
atgcttgatc ttatcgaagg cgatgctact ttatttgtgc gtcgtgacga agttgaggcg 1320
cagtgggttt ggattgacgg aattcgtgaa ggctggaaag ccaacagtat gaagccaaaa 1380
acctatgtct ctggtacatg ggggccttca actgctatag ctctggccga acgtgatgga 1440
gtaacttggt atgactgatc tgcattcaac ggtagaaaag gttaccgcgc gcgttattga 1500
acgctcgcgg gaaacccgta aggcttatct ggatttgatc cagtatgagc gggaaaaagg 1560
cgtagaccgt ccaaacctgt cctgtagtaa ccttgctcat ggctttgcgg ctatgaatgg 1620
tgacaagcca gctttgcgcg acttcaaccg catgaatatc ggcgtcgtga cttcctacaa 1680
cgatatgttg tcggctcatg aaccatatta tcgctatccg gagcagatga aagtatttgc 1740
tcgcgaagtt ggcgcaacgg ttcaggtcgc cggtggcgtg cctgctatgt gcgatggtgt 1800
gacccaaggt cagccgggca tggaagaatc cctgtttagc cgcgatgtta tcgctttggc 1860
taccagcgtt tctttgtctc atggtatgtt tgaaggggct gcccttctcg gtatctgtga 1920
caagattgtc cctggtctgt tgatgggcgc tctgcgcttt ggtcacctgc cgaccattct 1980
ggtcccatca ggcccgatga cgactggtat cccgaacaaa gaaaaaatcc gtatccgtca 2040
gctctatgct cagggtaaaa tcggccagaa agaacttctg gatatggaag cggcttgcta 2100
ccatgctgaa ggtacctgca ccttctatgg tacggcaaac accaaccaga tggttatgga 2160
agtcctcggt cttcatatgc caggttcggc atttgttacc ccgggtaccc cgctccgcca 2220
ggctctgacc cgtgctgctg tgcatcgcgt tgctgaattg ggttggaagg gcgacgatta 2280
tcgtccgctt ggtaaaatca ttgacgaaaa atcaatcgtc aatgctattg ttggtctgtt 2340
ggcaaccggt ggttccacca accataccat gcatattccg gccattgctc gtgctgctgg 2400
tgttatcgtt aactggaatg acttccatga tctttctgaa gttgttccgt tgattgcccg 2460
catttacccg aatggcccgc gcgacatcaa tgaattccag aatgcaggcg gcatggctta 2520
tgtcatcaaa gaactgcttt ctgctaatct gttgaaccgt gatgtcacga ccattgccaa 2580
gggcggtatc gaagaatacg ccaaggctcc ggcattaaat gatgctggcg aattggtctg 2640
gaagccagct ggcgaacctg gtgatgacac cattctgcgt ccggtttcta atcctttcgc 2700
aaaagatggc ggtctgcgtc tcttggaagg taaccttggc cgtgcaatgt acaaggccag 2760
tgcggttgat cctaaattct ggaccattga agcaccggtt cgcgtcttct ctgaccaaga 2820
cgatgttcag aaagccttca aggctggcga attgaacaaa gacgttatcg ttgttgttcg 2880
tttccagggc ccgcgcgcaa acggtatgcc tgaattgcat aagctgaccc cggctttggg 2940
tgttctgcag gataatggct acaaagttgc tttggtaact gatggtcgta tgtccggtgc 3000
taccggtaaa gttccggttg ctttgcatgt cagcccagaa gctcttggcg gtggtgccat 3060
cggtaaatta cgtgatggcg atatcgtccg tatctcggtt gaagaaggca aacttgaagc 3120
tttggttcca gctgatgagt ggaatgctcg tccgcatgct gaaaaaccgg ctttccgtcc 3180
gggaaccgga cgcgaattgt ttgatatctt ccgtcagaat gctgctaaag ctgaagacgg 3240
tgcagtcgca atatatgcag gtgccggtat ctaa 3274
<210> 2
<211> 627
<212> DNA
<213> 运动发酵单胞菌
<400> 2
atgcgtgata tcgattccgt aatgcgtttg gcaccggtta tgccggtcct cgtcattgaa 60
gatattgctg atgcaaaacc tatcgcagaa gctttggttg ctggtggtct gaacgttctt 120
gaagtaacgc ttcgcacccc ttgtgctctt gaagccatca agatcatgaa agaagttccg 180
ggtgccgttg ttggtgccgg tacggttctg aacgcaaaaa tgctcgacca agctcaggaa 240
gctggttgcg aatttttcgt tagcccgggt ctgaccgctg acctcggcaa gcatgctgtt 300
gcccagaaag cagctttgct tccaggtgtt gctaatgctg ctgatgtgat gcttggtctt 360
gaccttggtc ttgatcgctt caaattcttc ccggctgaaa atatcggtgg tttacctgcc 420
ctgaagtcca tggcttctgt tttccgtcag gttcgtttct gcccgaccgg cggtatcacc 480
ccgacgtcag ctcctaaata tcttgaaaac ccgtccattc tttgcgtcgg tggtagctgg 540
gttgttccgg ctggcaaacc agatgtcgca aaaatcacgg cactcgctaa agaagcttct 600
gctttcaagc gcgctgctgt tgcctaa 627
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> zwf-edd基因的扩增引物 (F)
<400> 3
ctctagtact atgacaaata ccgtttcgac gatg 34
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> zwf-edd基因的扩增引物 (R)
<400> 4
ctctagtact ttagataccg gcacctgcat 30
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> eda基因的扩增引物 (F)
<400> 5
ctctcatatg cgtgatatcg attccgtaat g 31
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> eda基因的扩增引物 (R)
<400> 6
ctctcatatg ttaggcaaca gcagcgc 27
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 扩增引物
<400> 7
ctcttctaga gtcgacggct gtgcaggtcg taaatc 36
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 扩增引物
<400> 8
ctctgatatc aacacacctt tctaaaaagt ttccttc 37
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 扩增引物
<400> 9
ctcttctaga gctttgttag gtgtctctgg 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 扩增引物
<400> 10
ctcttctaga tcaccaccat gaagaagtcc 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 扩增引物
<400> 11
ctctctcgag gcaacagtgc ttcatactgc 30
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 扩增引物
<400> 12
ctctctcgag acggattgaa cccaagacg 29
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 扩增引物
<400> 13
ctctcctgca ggcacgaacc tcaattagcc tg 32
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 扩增引物
<400> 14
ctctcctgca gggatgactt gatgcaggtg tg 32
PCT/RO/134表
Figure QDA0002748478540000011

Claims (8)

1.一种棒状细菌的转化体，其特征在于，是在宿主棒状细菌中导入恩特纳-杜德洛夫途径而得到的。
2.根据权利要求1所述的转化体，其中，
在宿主棒状细菌中导入以下的基因：
编码具有葡萄糖6-磷酸脱氢酶活性的酶的基因、
编码具有6-磷酸葡糖酸脱水酶活性的酶的基因、以及
编码具有2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶活性的酶的基因。
3.根据权利要求2所述的转化体，其中，
所述葡萄糖6-磷酸脱氢酶为能够利用氧化型烟酰胺二核苷酸作为辅酶的酶。
4.根据权利要求1～权利要求3中任一项所述的转化体，其中，
宿主棒状细菌为谷氨酸棒状杆菌。
5.一种有机化合物的制造方法，其特征在于，包括：
使权利要求1～权利要求4中任一项所述的转化体在除去增殖需要的因子中的至少1种的反应液中、或在还原条件的反应液中反应的工序；以及
回收反应培养基中的有机化合物的工序。
6.根据权利要求5所述的有机化合物的制造方法，其中，包括：
使用权利要求1～权利要求4中任一项所述的转化体，在反应液中，由选自葡萄糖、果糖、纤维二糖、木二糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糊精、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和可溶性淀粉中的糖类变换为有机化合物，并从该反应液回收有机化合物的工序。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的有机化合物的制造方法，其中，
所述有机化合物为以丙酮酸为中间体的化合物或以磷酸烯醇式丙酮酸为中间体的化合物。
8.根据权利要求5～权利要求7中任一项所述的有机化合物的制造方法，其中，
所述有机化合物为选自单羧酸、二羧酸、酮酸、羟基羧酸、氨基酸、一元醇、多元醇、芳香族化合物和维生素中的至少1种。
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