WO2023038066A1 - 芳香族化合物の製造方法 - Google Patents

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WO2023038066A1
WO2023038066A1 PCT/JP2022/033612 JP2022033612W WO2023038066A1 WO 2023038066 A1 WO2023038066 A1 WO 2023038066A1 JP 2022033612 W JP2022033612 W JP 2022033612W WO 2023038066 A1 WO2023038066 A1 WO 2023038066A1
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WO
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gene
acid
nucleotide sequence
corynebacterium
mdh gene
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PCT/JP2022/033612
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雄一 壺井
史員 高橋
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花王株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing coryneform bacterium-producing aromatic compounds.
  • Corynebacterium glutamicum is a useful industrial microorganism that has been used for the production of various amino acids and nucleic acids since it was isolated as a glutamic acid-producing bacterium.
  • aromatic amino acids such as tyrosine and tryptophan
  • gallic acid such as gallic acid
  • 4-hydroxybenzoic acid such as 4-aminobenzoic acid
  • the shikimate pathway is an important metabolic pathway for the biosynthesis of aromatic compounds by plants and microorganisms. That is, phosphoenolpyruvate produced in glycolysis combines with erythrose 4-phosphate supplied from the pentose phosphate pathway to form 3-deoxy-D-arabinopeptulosonic acid 7-phosphate (DAHP). , 3-dehydroquinic acid (DHQ) and 3-dehydroshikimic acid (DHS) to shikimic acid. Furthermore, shikimic acid undergoes transfer of the phosphate group from adenosine triphosphate to become 3-phosphoshikimic acid, and then to chorismic acid via 3-phosphoeno-lpyruvylshikimic acid.
  • DAHP 3-deoxy-D-arabinopeptulosonic acid 7-phosphate
  • DHQ 3-dehydroquinic acid
  • DHS 3-dehydroshikimic acid
  • shikimic acid undergoes transfer of the phosphate group from adenosine triphosphat
  • the present invention relates to the following 1) and 2).
  • the present invention relates to providing a method for efficiently producing aromatic compounds using coryneform bacterium mutant strains.
  • the present inventors have found that the productivity of aromatic compounds such as gallic acid is improved in mutant coryneform bacteria in which the function of the cg2613 gene, one of the genes encoding malate dehydrogenase (mdh), is suppressed. I found out.
  • aromatic compounds such as gallic acid, 2,4-pyridinedicarboxylic acid, 2,5-pyridinedicarboxylic acid, catechol, L-DOPA, and 4-hydroxybenzoic acid or salts thereof are efficiently produced. becomes possible.
  • the identity of amino acid sequences or nucleotide sequences is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, genetic information processing software GENETYX Ver. 12 homology analysis (Search homology) program is used, unit size to compare (ktup) is set to 2, and analysis is performed.
  • GENETYX Ver. 12 homology analysis (Search homology) program is used, unit size to compare (ktup) is set to 2, and analysis is performed.
  • "at least 90% identity” with respect to the nucleotide sequence means 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, More preferably, it refers to identity of 99% or more.
  • nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted means 1 or more and 30 or less, preferably 1 or more and 24 or less, more preferably 1 15 or less, more preferably 1 or more and 9 or less, still more preferably 1 or more and 6 or less, still more preferably 1 or more and 3 or less nucleotides deleted, substituted, added, or inserted refers to an array.
  • “addition" of amino acids or nucleotides includes addition of amino acids or nucleotides to one and both termini of a sequence.
  • upstream and downstream with respect to a gene refer to upstream and downstream in the transcription direction of the gene.
  • a gene located downstream of a promoter means that the gene is present on the 3' side of the promoter in the DNA sense strand
  • upstream of the gene means that the gene is located 5' of the gene in the DNA sense strand. means the area on the side.
  • the term "originally” used for the functions, properties, and traits of a cell is used to indicate that the functions, properties, and traits originally exist in the cell.
  • the term “exogenous” is used to denote functions, properties, or traits that are introduced from outside rather than naturally present in the cell.
  • a "foreign" gene or polynucleotide is a gene or polynucleotide that has been exogenously introduced into the cell.
  • a foreign gene or polynucleotide may be derived from the same organism as the cell into which it is introduced, or from a heterologous organism (ie, a heterologous gene or polynucleotide).
  • coryneform bacteria belong to the group of mycolic acid-containing actinomycetes and refer to non-motile, aerobic Gram-positive bacteria that do not have the ability to form spores
  • Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Vol. 8, 599. (1974) encompasses a group of microorganisms. Specific examples include Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Mycobacterium, Rhodococcus, Streptomyces, and Micrococcus.
  • Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium halotolerance, Corynebacterium alcano Examples include Corynebacterium alkanolyticum, Corynebacterium callunae, and the like.
  • Brevibacterium ammoniagenes etc. are mentioned as a Brevibacterium genus microbe.
  • Arthrobacter globiformis includes Arthrobacter globiformis.
  • Mycobacterium genus includes Mycobacterium bovis and the like, and Micrococcus genus includes Micrococcus freudenreichii, Micrococcus leuteus, Micrococcus ureae, Micrococcus Coccus roseus (Micrococcus roseus) etc. are mentioned.
  • the coryneform bacteria the genus Corynebacterium is preferred, and Corynebacterium glutamicum is more preferred.
  • the coryneform bacterium (parent coryneform bacterium) used for producing the mutant coryneform bacterium of the present invention can be a wild strain, a mutant strain thereof, or an artificial It may be a genetic recombinant.
  • lactate (lactic acid) dehydrogenase (LDH) lactic acid dehydrogenase
  • phosphoenolpyruvate carboxylase phosphoenolpyruvate carboxylase
  • other gene-disrupted strains may be used.
  • It may also be a coryneform bacterium that has been modified to acquire or improve the ability to produce aromatic compounds.
  • Methods for acquiring or improving the ability of microorganisms to produce aromatic compounds include methods of incorporating into microorganisms polynucleotides encoding various enzymes for producing the desired aromatic compounds.
  • the coryneform bacterium used for producing the mutant coryneform bacterium in which the function of the mdh gene of the present invention is suppressed encodes an enzyme for producing the target aromatic compound or salt thereof to be produced. It is a recombinant in which an exogenous polynucleotide has been incorporated.
  • a recombinant with gallic acid-producing ability introduced with a polynucleotide encoding 3,4-dihydroxybenzoate hydroxylase a recombinant with catechol-producing ability introduced with a polynucleotide encoding protocatechuic acid decarboxylase
  • 2,4-PDCA-producing recombinants 2,5-PDCA-producing recombinants introduced with polynucleotides encoding protocatechuate-2,3-dioxygenase, polysynthetic chorismate lyase-encoding Examples thereof include recombinants having the ability to produce 4-hydroxybenzoic acid into which nucleotides have been introduced.
  • the aromatic compound is an organic aromatic compound that is biosynthesized in the cells of coryneform bacteria, that is, coryneform bacterium-producing organic aromatic compounds.
  • group compounds preferably aromatic compounds derived from 3-dehydroshikimic acid (DHS) and chorismic acid (Fig. 1).
  • protocatechuic acid Specifically, protocatechuic acid, catechol, gallic acid, phenylalanine, L-DOPA, tyrosine, pretyrosine, tryptophan, 4-hydroxybenzoic acid, 4-aminobenzoic acid, 2,3-dihydroxybenzoic acid, 2,4- pyridinedicarboxylic acid, 2,5-pyridinedicarboxylic acid, 4-amino-3-hydroxybenzoic acid and the like.
  • protocatechuic acid derived from DHS gallic acid derived from protocatechuic acid, 2,4-pyridinedicarboxylic acid (2,4-PDCA), 2,5-pyridinedicarboxylic acid (2,5-PDCA), Catechol, L-DOPA; 4-hydroxybenzoic acid, 4-amino-3-hydroxybenzoic acid, tyrosine, tryptophan, etc. derived from chorismic acid are preferred, more preferably protocatechuic acid and aromatic compounds derived from protocatechuic acid and more preferably gallic acid.
  • Examples of the salt of the aromatic compound include base addition salts and acid addition salts.
  • Examples of base addition salts include salts with alkali metals such as sodium and potassium, and salts with alkaline earth metals such as calcium and magnesium.
  • Examples of acid addition salts include hydrochlorides, sulfates, Mineral acid salts such as nitrates and phosphates are included.
  • the mdh gene is the gene encoding malate dehydrogenase (mdh).
  • Malate dehydrogenase is a redox enzyme that catalyzes the chemical reaction that oxidizes malate to oxaloacetate (or vice versa).
  • the mdh gene includes at least one polynucleotide selected from the group consisting of (a) or (b) below.
  • polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (b) consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and encoding a polypeptide having malate dehydrogenase activity
  • polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 represents the mdh gene (cg2613) derived from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 strain.
  • a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 preferably has 95% or more, more preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, and even more preferably 98% or more, Preferably, it includes a nucleotide sequence having an identity of 99% or more. , or an inserted nucleotide sequence.
  • suppression of the function of the mdh gene includes suppression of the expression of the mdh gene as well as suppression of the activity of the protein encoded by the mdh gene, and may be either complete suppression (inhibition) or incomplete suppression of the function. Suppression of such mdh gene function can be achieved by introducing deletion or inactivation mutations into the coding region, non-coding region, transcription or translation initiation region of the mdh gene (deletion or inactivation of the mdh gene).
  • the deletion or inactivation of the mdh gene includes removing part or all of the nucleotide sequence of the mdh gene from the genome or replacing it with another nucleotide sequence, It can be realized by inserting a nucleotide fragment, mutating the transcription or translation initiation region of the mdh gene, and the like. Preferably, part or all of the nucleotide sequence of the mdh gene is deleted or inactivated.
  • More specific examples include a method for specifically deleting or inactivating the mdh gene on the genome of cells, and after giving random deletion or inactivating mutations to the gene in cells, A method of selecting a cell having a desired mutation by evaluating the expression level or activity of the mdh protein, or genetic analysis can be mentioned.
  • Specific deletion or inactivation of the mdh gene includes, for example, methods based on homologous recombination. That is, a DNA fragment of the mdh gene into which an inactivating mutation has been introduced by base substitution, base insertion, or the like, or a DNA fragment containing the outer region of the mdh gene but not the mdh gene is constructed, and this is used as a parent microorganism (coryneform bacterium). ) It is possible to delete or inactivate the mdh gene on the genome by introducing it into cells and allowing homologous recombination to occur in the region containing the mdh gene in the genome of the parent microorganism.
  • a recombinant vector (such as a plasmid) having a DNA fragment containing a partial region of the mdh gene is incorporated into the parent microbial cell, and the partial region of the mdh gene of the parent microbial genome is disrupted by homologous recombination to obtain mdh. It is also possible to inactivate genes.
  • a DNA fragment obtained by randomly cloning a gene introduced with an inactivating mutation is introduced into a cell, and a gene on the genome of the cell Examples include a method of causing homologous recombination, a method of irradiating cells with ultraviolet rays, ⁇ -rays, etc. to induce mutations, and the like.
  • a gene inactivating mutation means a mutation in which the original function of the target gene is lost due to silence mutation, missense mutation, nonsense mutation, frameshift mutation, or the like.
  • genes introduced with inactivating mutations either do not express proteins or express proteins with impaired native activity.
  • Site-directed mutagenesis can be mentioned as a method for producing a DNA fragment containing the mdh gene introduced with an inactivating mutation.
  • Site-directed mutagenesis can be performed using mutagenic primers containing the nucleotide mutation to be introduced. For example, by PCR using the mdh gene as a template using two sets of primers containing the nucleotide mutation to be introduced, DNA fragments are prepared by amplifying the upstream and downstream sides of the region containing the mdh gene, respectively, and these are then subjected to SOE. DNA fragments containing the desired mutations can be constructed by ligating them together by -PCR (splicing by overlap extension PCR) (Gene, 1989, 77(1): p61-68).
  • site-directed mutagenesis for site-directed mutagenesis, the inverse PCR method, annealing method, etc. (edited by Muramatsu et al., "Revised 4th Edition New Genetic Engineering Handbook", Yodosha, p82-88), or Stratagene's QuickChange II Site- Commercially available kits for site-directed mutagenesis such as Directed Mutagenesis Kit and QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit can also be used.
  • Mutation primers can be prepared by well-known oligonucleotide synthesis methods such as the phosphoramidite method (Nucleic Acids Research, 1989, 17:7059-7071).
  • the template mdh gene may be prepared from the coryneform bacterium described above by a conventional method, or may be chemically synthesized.
  • methods applicable to coryneform bacteria include competent cell transformation method (J Bacteriol, 1967, 93: 1925-1937), electroporation method (FEMS Microbiol Lett, 1990, 55: 135-138), protoplast Transformation method (Mol Gen Genet, 1979, 168: 111-115), Tris-PEG method (J Bacteriol, 1983, 156: 1130-1134) and the like.
  • a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the mRNA sequence of the mdh gene is used as a polynucleotide having activity to degrade the transcription product of the mdh gene, or a polynucleotide that suppresses the translation of the transcription product into a protein.
  • Polynucleotides comprising nucleotide sequences or portions thereof are included. Specific examples include antisense RNA against mdh gene mRNA, siRNA against mdh gene mRNA, and ribozyme against mdh gene mRNA.
  • Cells in which the function of the mdh gene is suppressed can be selected by confirming the genome sequence.
  • cells in which the function of the mdh gene is suppressed can be selected using the expression level or activity of the mdh protein as an index.
  • the thus constructed mutant coryneform bacterium in which the function of the mdh gene is suppressed is cultured, preferably in the presence of sugars, and the desired aromatic compound or salt thereof is recovered to obtain an aromatic compound or a salt thereof. can be manufactured.
  • Glucose is preferred as the sugar, but monosaccharides such as fructose, mannose, arabinose, xylose and galactose, as well as sugars capable of producing glucose by metabolism can also be used.
  • sugars include oligosaccharides or polysaccharides having glucose units, disaccharides such as cellobiose, sucrose, lactose, maltose, trehalose, cellobiose, xylobiose; polysaccharides such as dextrin or soluble starch; is mentioned.
  • Molasses can also be used, for example, as a raw material containing these raw material compounds.
  • Inedible agricultural waste such as straw (rice straw, barley straw, wheat straw, rye straw, oat straw, etc.), bagasse and corn stover, energy crops such as switchgrass, napier grass and miscanthus, and wood waste
  • a saccharified solution containing a plurality of sugars such as glucose, which is obtained by saccharifying waste paper or the like with a saccharifying enzyme or the like, can also be used.
  • the medium for culturing the mutant coryneform bacterium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc., and is a natural medium or a synthetic medium as long as it is a medium capable of efficiently culturing the mutant coryneform bacterium of the present invention. You may use either.
  • the carbon source the above sugars or molasses or saccharified solutions containing them are used.
  • sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, xylitol and glycerin; , maleic acid, and gluconic acid; alcohols, such as ethanol and propanol; and hydrocarbons, such as normal paraffin.
  • a carbon source can be used individually by 1 type or in mixture of 2 or more types.
  • the concentration of the saccharide, which is the raw material compound, in the culture medium is preferably 1 to 30 w/v%, more preferably 2 to 20 w/v%, and even more preferably 2 to 10 w/v%.
  • Nitrogen sources include, for example, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, soybean meal alkaline extract, corn steep liquor, alkylamines such as methylamine, nitrogen-containing organic compounds such as amino acids, ammonia or salts thereof.
  • alkylamines such as methylamine
  • nitrogen-containing organic compounds such as amino acids, ammonia or salts thereof.
  • Inorganic or organic ammonium compounds such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate and ammonium acetate), urea, aqueous ammonia, sodium nitrate, potassium nitrate and the like can be used.
  • inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous nitrate, manganese sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, and calcium carbonate.
  • vitamins, antifoaming agents, etc. can be added as necessary.
  • vitamins include biotin, thiamine (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), pantothenic acid, inositol, and nicotinic acid.
  • LB medium As media for coryneform bacteria, LB medium, A medium [J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)], BT medium [J. Mol. Microbiol. Biotechnol. )], CGXII media [J. Bacteriol.
  • the mutant coryneform bacterium Prior to the reaction or culture containing sugars, it is preferable to grow the mutant coryneform bacterium by culturing it in the same medium under aerobic conditions at a temperature of about 25-38°C for about 12-48 hours.
  • the culture temperature or reaction temperature is preferably 15 to 45°C, more preferably 25 to 37°C.
  • the culture or reaction time is 24 hours to 168 hours, preferably 24 hours to 96 hours, more preferably 24 hours to 72 hours, and can be performed with stirring or shaking as necessary.
  • antibiotics such as ampicillin and kanamycin may be added to the medium during the culture, if necessary.
  • Cultivation may be of batch type, fed-batch type, or continuous type. Among them, a batch system is preferable. Cultivation or reaction may be carried out under aerobic conditions or reducing conditions, but is preferably carried out under aerobic conditions.
  • the reaction or culture When the reaction or culture is performed under aerobic conditions, it is preferable to perform the reaction or culture under conditions that suppress excessive growth of the mutant coryneform bacterium from the viewpoint of the production efficiency of the target substance.
  • the target substance is a substance that is easily oxidized
  • the culture is preferably carried out under conditions with a low dissolved oxygen concentration in order to prevent the target substance from being oxidized.
  • the dissolved oxygen concentration is preferably 0.1 to 3 ppm, more preferably 0.1 to 1 ppm.
  • the method of collecting and purifying the aromatic compound or its salt from the culture is not particularly limited. That is, it can be carried out by combining well-known ion exchange resin method, precipitation method, crystallization method, recrystallization method, concentration method and other methods. For example, after the cells are removed by centrifugation or the like, ionic substances are removed with a cation and anion exchange resin, and the mixture is concentrated to obtain an aromatic compound or a salt thereof. Aromatic compounds or salts thereof accumulated in the culture may be used as they are without isolation.
  • a method for producing an aromatic compound or a salt thereof comprising the step of culturing a mutant coryneform bacterium in which the function of the mdh gene shown in (a) or (b) below is suppressed.
  • Aromatic compound is protocatechuic acid, gallic acid, 2,4-pyridinedicarboxylic acid, 2,5-pyridinedicarboxylic acid, catechol, L-DOPA, 4-hydroxybenzoic acid, 4-amino-3-hydroxybenzoic acid acid, tyrosine, tryptophan or salts thereof, preferably gallic acid, protocatechuic acid, catechol, L-DOPA, 2,4-pyridinedicarboxylic acid, 2,5-pyridinedicarboxylic acid or salts thereof, ⁇ 1> method.
  • ⁇ 3> The method of ⁇ 1>, wherein the aromatic compound is gallic acid or a salt thereof.
  • ⁇ 4> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the suppression of mdh gene function is suppression of mdh gene expression or activity suppression of a protein encoded by the mdh gene.
  • ⁇ 5> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the mdh gene function is suppressed by deletion or inactivation of the mdh gene.
  • coryneform bacterium is Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium halotolerance, Corynebacterium alkanolyticum, or Corynebacterium carnae, ⁇ 1> to ⁇ 5> either way.
  • ⁇ 7> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the coryneform bacterium is Corynebacterium glutamicum.
  • ⁇ 8> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the culture is performed in a medium containing sugar as a carbon source.
  • ⁇ 9> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, including the step of recovering an aromatic compound or a salt thereof from the culture.
  • genomic DNA was used as a template and amplified with primers OT23 and OT24 to obtain a DNA fragment on the 3' side of the cg0620 gene region.
  • a DNA fragment (OT25) containing the promoter (hereinafter referred to as tu promoter) of the tuf gene (cg0587) of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain was produced by artificial gene synthesis.
  • DNA fragment of the promoter region was amplified with primers OT26 and OT27 to obtain a DNA fragment of the promoter region.
  • two types of DNA fragments SEQ ID NOs: 2 and 3) containing a polypeptide gene (hereinafter abbreviated as hfm145VF) having 3,4-dihydroxybenzoate hydroxylase activity were prepared by artificial gene synthesis.
  • Each DNA fragment was used as a template and amplified with two kinds of DNA primers (OT30 and OT31 and OT32 and OT33) to obtain two kinds of DNA fragments.
  • pHKPsacB1 (described in Patent Document 1) as a template, a vector fragment was amplified with primers OT34 and OT35.
  • the resulting PCR product was treated with DpnI (Takara Bio).
  • each DNA fragment was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Takara Bio) and ligated with the In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio) to create the plasmid pHKPsacB_cg0620- Ptu-hfm145VF-hfm145VFopt was produced.
  • ECOS Competent E. coli strain DH5 ⁇ (Nippon Gene) was transformed with the obtained plasmid solution, and the cell solution was spread on an LB agar medium containing kanamycin and allowed to stand overnight at 37°C.
  • a transformant having the plasmid was inoculated into 2 mL of LB liquid medium containing kanamycin and cultured overnight at 37°C.
  • a plasmid was purified from this culture using NucleoSpin Plasmid EasyPure (TaKaRa) to obtain pHKPsacB_cg0620-Ptu-hfm145VF-hfm145VFopt.
  • KC148sr strain was analyzed by the PCR method (Sapphire Amp (Takara Bio)) using primers OT20 and OT36, the expected results were obtained. It was confirmed to be a single-crossover homologous recombinant introduced into the gene region.
  • KC148sr strain was cultured in 1 mL of LB liquid medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L sodium chloride) for 24 hours, and a portion of the culture was spread on LB agar medium containing 20% sucrose. KC148 strain was obtained by culturing.
  • the KC148 strain is a double-crossover homologous recombinant in which the Ptu-hfm145VF-hfm145VFop gene has been introduced into the cg0620 gene region as expected. It was confirmed.
  • a DNA fragment on the 5' side of the cg2613 gene amplified with primers 2613-up-F and 2613-up-R using the genomic DNA of ATCC 13032 strain ( NBRC 12168 strain) as a template, and primer 2613- using the genomic DNA as a template.
  • the resulting PCR product was treated with DpnI (Takara Bio).
  • each DNA fragment was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Takara Bio), ligated with In-Fusion HD cloning kit (Clontech), and pHKBsacB- ⁇ mdh. was made.
  • ECOS Competent E. coli strain DH5 ⁇ (Nippon Gene) was transformed with the obtained plasmid solution, and the cell solution was spread on an LB agar medium containing kanamycin and allowed to stand overnight at 37°C.
  • colony PCR was performed using Sapphire Amp (TaKaRa) as an enzyme.
  • a transformant having a plasmid in which gene transfer was confirmed was inoculated into 2 mL of LB liquid medium containing kanamycin and cultured overnight at 37°C.
  • a plasmid was purified from this culture using NucleoSpin Plasmid EasyPure (TaKaRa) to obtain pHKBsacB- ⁇ mdh.
  • KC148 ⁇ mdh-sr was cultured in 1 mL of LB liquid medium for 24 hours, and a portion of the culture was smear cultured on 20% sucrose-containing LB perspective medium to obtain the KC148 ⁇ mdh strain.
  • Colony PCR (Sapphire Amp) using primers 2613-coloP-F and 2613-coloP-R confirmed that the mdh gene (cg2613) was deleted by double-crossover homologous recombination. In addition, deletion of kanamycin resistance gene and sacB gene was confirmed.
  • cg2192-disrupted strain 1 Preparation of plasmid for disrupting cg2192 gene It was carried out in the same manner as in Example (2) 1). That is, primers 2192-up-F and 2192-up-R were used to amplify the DNA fragment on the 5' side of the cg2192 gene, and primers 2192-down-F and 2192- down-R was used. Using these two fragments and the vector fragment described in Example (2) 1), plasmid pHKBsacB- ⁇ cg2192 was constructed. Primers 2192-up-F and 2192-down-R were used for colony PCR.

Abstract

コリネ型細菌変異株を用いて、芳香族化合物を効率よく製造する方法を提供する。　下記（ａ）又は（ｂ）で示されるｍｄｈ遺伝子の機能が抑制された変異コリネ型細菌を培養する工程を含む、芳香族化合物又はその塩の製造方法。　（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド　（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド

Description

芳香族化合物の製造方法
　本発明は、コリネ型細菌生産性の芳香族化合物の製造方法に関する。
　コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）はグルタミン酸生産菌として単離されて以来、各種アミノ酸や核酸生産に利用されてきた有用工業微生物である。近年、コリネ型細菌を対象にした遺伝子組換え技術が確立されたこともあり、チロシンやトリプトファンのような芳香族アミノ酸（非特許文献１）や没食子酸、４－ヒドロキシ安息香酸（非特許文献１）、４－アミノ安息香酸（非特許文献２）等の芳香族化合物等、多様な有機化合物が生産可能となっている。
　シキミ酸経路は、植物や微生物が芳香族化合物を生合成する重要な代謝経路である。すなわち、解糖系で作られるホスホエノールピルビン酸がペントースリン酸経路から供給されるエリスロース４－リン酸と結合して３－デオキシ－Ｄ－アラビノペプツロソン酸７－リン酸（ＤＡＨＰ）となり、３－デヒドロキナ酸（ＤＨＱ）、３－デヒドロシキミ酸（ＤＨＳ）を経てシキミ酸となる。さらに、シキミ酸はアデノシン３リン酸からリン酸基が転移して、３－ホスホシキミ酸となり、３－ホスホエノ－ルピルビルシキミ酸を経てコリスミ酸となる。シキミ酸経路では炭素６員環の形成後二重結合の生成が行われ、ＤＨＳから誘導されるプロトカテク酸からは、没食子酸、２，４－ピリジンジカルボン酸（２，４－ＰＤＣＡ）、２，５－ピリジンジカルボン酸（２，５－ＰＤＣＡ）、カテコール、Ｌ－ＤＯＰＡ等の芳香族化合物が、コリスミ酸からは４－ヒドロキシ安息香酸、４－アミノ安息香酸、４－アミノ３－ヒドロキシ安息香酸等の芳香族化合物が生産される（図１）。
　　〔非特許文献１〕Metab. Eng. 2018. 50:122-141.
　　〔非特許文献２〕Metab. Eng. 2016. 38:322-330.
　本発明は、以下の１）～２）に係るものである。
　１）下記（ａ）又は（ｂ）で示されるｍｄｈ遺伝子の機能が抑制された変異コリネ型細菌を培養する工程を含む、芳香族化合物又はその塩の製造方法。
　　（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　　（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
　２）下記（ａ）又は（ｂ）で示されるｍｄｈ遺伝子の機能が抑制された変異コリネ型細菌。
　　（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　　（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
コリネ型細菌における各種芳香族化合物の生産経路を示す模式図。
発明の詳細な説明
　本発明は、コリネ型細菌変異株を用いて芳香族化合物を効率よく製造する方法を提供することに関する。
　本発明者らは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）をコードする遺伝子の一つであるｃｇ２６１３遺伝子の機能が抑制された変異コリネ型細菌において、没食子酸を始めとする芳香族化合物の生産性が向上することを見出した。
　本発明によれば、没食子酸、２，４－ピリジンジカルボン酸、２，５－ピリジンジカルボン酸、カテコール、Ｌ－ＤＯＰＡ、４－ヒドロキシ安息香酸のような芳香族化合物又はその塩を効率よく製造することが可能になる。
　本発明において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Science,1985,227:1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
　本発明において、ヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
　本発明において、「１又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列」とは、１個以上３０個以下、好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上９個以下、さらにより好ましくは１個以上６個以下、なお好ましくは１個以上３個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列をいう。本発明において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端へのアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。
　本発明において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。
　本発明において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
　本発明において、コリネ型細菌とは、ミコール酸含有放線菌群に属し、胞子形成能を持たない、非運動性、好気性のグラム陽性細菌を指し、Bergey's Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）に定義されている一群の微生物を包含する。具体的には、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、ロドコッカス属菌、ストレプトマイセス属菌、マイクロコッカス属菌、等が挙げられる。
　コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム　エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム　アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム　ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム　アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）、コリネバクテリウム　カルナエ（Corynebacterium callunae）等が挙げられる。
　ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）等が挙げられる。
　アースロバクター属菌としては、アースロバクター グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）等が挙げられる。
　マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス等が挙げられ、マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス フロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）、マイクロコッカス ルテウス（Micrococcus leuteus）、マイクロコッカス ウレアエ（Micrococcus ureae）、マイクロコッカス ロゼウス（Micrococcus roseus）等が挙げられる。
　コリネ型細菌のうち、好ましくはコリネバクテリウム属菌であり、より好ましくはコリネバクテリウム グルタミカムである。
　本発明の変異コリネ型細菌を作製するために用いられるコリネ型細菌（親コリネ型細菌）は、芳香族化合物の生産能を有するものであれば、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。例えば、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＬＤＨ）、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）等の遺伝子の破壊株であってもよい。また、芳香族化合物の生産能を獲得もしくは向上させるように改変されたコリネ型細菌であってもよい。微生物の芳香族化合物生産能を獲得もしくは向上させる方法としては、目的の芳香族化合物を生産するための各種酵素をコードするポリヌクレオチドを微生物に組み込む方法が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明のｍｄｈ遺伝子の機能が抑制された変異コリネ型細菌の作製に用いられるコリネ型細菌は、製造すべき目的の芳香族化合物又はその塩を生産するための酵素をコードする外来ポリヌクレオチドが組み込まれた組換え体である。
　例えば、３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した没食子酸生産能を有する組換え体、プロトカテク酸脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドを導入したカテコール生産能を有する組換え体、前記カテコール生産能を有する組換え体にチロシンフェノールリアーゼをコードするポリヌクレオチドを導入したＬ－ＤＯＰＡ生産能を有する組換え体、プロトカテク酸―４，５ージオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した２，４－ＰＤＣＡ生産能を有する組換え体、プロトカテク酸－２，３ージオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した２，５－ＰＤＣＡ生産能を有する組換え体、コリスミ酸リアーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した４－ヒドロキシ安息香酸生産能を有する組換え体等が挙げられる。
　本発明において、芳香族化合物とは、コリネ型細菌の菌体内で生合成される、すなわちコリネ型細菌生産性の有機芳香族化合物であり、具体的にはシキミ酸経路を介して合成される芳香族化合物、好ましくは、３－デヒドロシキミ酸（ＤＨＳ）やコリスミ酸から誘導される芳香族化合物を指す（図１）。
　具体的には、プロトカテク酸、カテコール、没食子酸、フェニルアラニン、Ｌ－ＤＯＰＡ、チロシン、プレチロシン、トリプトファン、４－ヒドロキシ安息香酸、４－アミノ安息香酸、２，３－ジヒドロキシ安息香酸、２，４－ピリジンジカルボン酸、２，５－ピリジンジカルボン酸、４－アミノ３－ヒドロキシ安息香酸等が挙げられる。
　このうち、ＤＨＳから誘導されるプロトカテク酸；プロトカテク酸から誘導される没食子酸、２，４－ピリジンジカルボン酸（２，４－ＰＤＣＡ）、２，５－ピリジンジカルボン酸（２，５－ＰＤＣＡ）、カテコール、Ｌ－ＤＯＰＡ；コリスミ酸から誘導される４－ヒドロキシ安息香酸、４－アミノ３－ヒドロキシ安息香酸、チロシン、トリプトファン等が好ましく、より好ましくは、プロトカテク酸及びプロトカテク酸から誘導される芳香族化合物であり、より好ましくは没食子酸である。
　当該芳香族化合物の塩としては、塩基付加塩、酸付加塩等を挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩等が挙げられ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の鉱酸塩等が挙げられる。
　本発明において、ｍｄｈ遺伝子はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）をコードする遺伝子である。リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍａｌａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）は、リンゴ酸をオキサロ酢酸へと酸化する（またはその逆の）化学反応を触媒する酸化還元酵素である。
　本発明において、ｍｄｈ遺伝子としては、下記（ａ）又は（ｂ）からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドが挙げられる。
　（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
　ここで、配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドは、コリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ　１３０３２株由来のｍｄｈ遺伝子（ｃｇ２６１３）を示す。
　配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列としては、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をを有するヌクレオチド配列が挙げられ、当該ヌクレオチド配列の例としては、配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列が挙げられる。
　本発明において、ｍｄｈ遺伝子の機能の抑制には、ｍｄｈ遺伝子の発現抑制の他、ｍｄｈ遺伝子がコードするタンパク質の活性抑制が含まれ、機能の完全抑制（阻害）及び不完全抑制のいずれでも良い。斯かるｍｄｈ遺伝子の機能の抑制は、ｍｄｈ遺伝子のコード領域、非コード領域、転写又は翻訳開始領域に対して欠失又は不活性化する変異を導入すること（ｍｄｈ遺伝子の欠失又は不活性化）、或いはｍｄｈ遺伝子の転写産物を分解する活性を有するポリヌクレオチド、当該転写産物からタンパク質への翻訳を抑制するポリヌクレオチドの導入により転写や翻訳を抑制することにより行なうことができる。
　一態様として、ｍｄｈ遺伝子の欠失又は不活性化は、ｍｄｈ遺伝子のヌクレオチド配列の一部若しくは全部をゲノム中から除去するか又は他のヌクレオチド配列と置き換えること、ｍｄｈ遺伝子の配列中に他のポリヌクレオチド断片を挿入すること、ｍｄｈ遺伝子の転写又は翻訳開始領域に変異を与えること、などによって実現することができる。好適には、ｍｄｈ遺伝子のヌクレオチド配列の一部若しくは全部を欠失させるか又は不活性化させる。より具体的な例としては、細胞のゲノム上のｍｄｈ遺伝子を特異的に欠失又は不活性化させる方法、及び、細胞中の当該遺伝子にランダムな欠失又は不活性化変異を与えた後、ｍｄｈタンパク質の発現量や活性評価、又は遺伝子解析を行って所望の変異を有する細胞を選択する方法が挙げられる。
　ｍｄｈ遺伝子の特異的な欠失又は不活性化には、例えば相同組換えによる方法が挙げられる。すなわち、塩基置換や塩基挿入等によって不活性化変異を導入したｍｄｈ遺伝子のＤＮＡ断片、又はｍｄｈ遺伝子の外側領域を含むがｍｄｈ遺伝子を含まないＤＮＡ断片を構築し、これを親微生物（コリネ型細菌）細胞内に組み込んで親微生物ゲノムのｍｄｈ遺伝子を含む領域に相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上のｍｄｈ遺伝子を欠失又は不活性化させることが可能である。あるいは、ｍｄｈ遺伝子の一部領域を含むＤＮＡ断片を有する組換えベクター（プラスミド等）を親微生物細胞内に組み込み、親微生物ゲノムのｍｄｈ遺伝子の一部領域を相同組換えにより分断することによって、ｍｄｈ遺伝子を不活性化することも可能である。細胞中の遺伝子をランダムに欠失又は不活性化させる方法としては、不活性化変異を導入した遺伝子をランダムにクローニングしたＤＮＡ断片を細胞に導入し、該細胞のゲノム上の遺伝子との間に相同組換えを起こさせる方法、細胞に紫外線、γ線等を照射して突然変異を誘発する方法などが挙げられる。遺伝子の不活性化変異とは、サイレンス変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異等により、標的とする遺伝子が本来有する機能が失われる変異を意味する。例えば、不活性化変異を導入した遺伝子はタンパク質を発現しないか、又は本来の活性が損なわれたタンパク質を発現する。
　不活性化変異を導入したｍｄｈ遺伝子を含むＤＮＡ断片を作製する方法としては、部位特異的変異導入が挙げられる。部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。例えば、導入すべきヌクレオチド変異を含む２組のプライマーを用いたｍｄｈ遺伝子を鋳型とするＰＣＲにより、ｍｄｈ遺伝子を含む領域の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を作製し、次いでこれらをＳＯＥ－ＰＣＲ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ＰＣＲ）（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１－６８）により１つに連結することにより、所望の変異を含むＤＮＡ断片を構築することができる。あるいは、部位特異的変異導入には、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版　新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ８２－８８）、又はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　II　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　Ｍｕｌｔｉ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ等の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。
　変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９－７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。鋳型とするｍｄｈ遺伝子は、上述したコリネ型細菌から、常法により調製してもよく、又は化学合成してもよい。
　ＤＮＡ断片やベクターを微生物細胞に導入するには、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ＰＥＧ法等の周知の技術を適用することができる。例えばコリネ型細菌に適用可能な方法としては、コンピテントセル形質転換法（Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９６７，９３：１９２５－１９３７）、エレクトロポレーション法（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ，１９９０，５５：１３５－１３８）、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ，１９７９，１６８：１１１－１１５）、Ｔｒｉｓ－ＰＥＧ法（Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８３，１５６：１１３０－１１３４）などが挙げられる。
　また、ｍｄｈ遺伝子の転写産物を分解する活性を有するポリヌクレオチド、或いは当該転写産物からタンパク質への翻訳を抑制するポリヌクレオチドとしては、ｍｄｈ遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列と相補的又は実質的に相補的なヌクレオチド配列或いはその一部を含むポリヌクレオチドが挙げられる。具体的には、ｍｄｈ遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡ、ｍｄｈ遺伝子のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ、ｍｄｈ遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム等が挙げられる。
　ｍｄｈ遺伝子の機能が抑制された細胞は、そのゲノム配列を確認することにより選択することができる。あるいは、ｍｄｈタンパク質の発現量又は活性を指標に、ｍｄｈ遺伝子の機能が抑制された細胞を選択することができる。
　斯くして構築されたｍｄｈ遺伝子の機能が抑制された変異コリネ型細菌を培養、好ましくは糖類の存在下で培養し、目的の芳香族化合物又はその塩を回収することにより芳香族化合物又はその塩を製造することができる。
　糖類としては、グルコースが好適であるが、フルクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、ガラクトース等の単糖類の他、代謝によりグルコースを生成し得る糖類も使用できる。このような糖類にはグルコース単位を有するオリゴ糖又は多糖類が含まれ、セロビオース、スクロース(ショ糖)、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、キシロビオース等の二糖類；デキストリン又は可溶性澱粉等の多糖類等が挙げられる。
　また、例えばこれらの原料化合物を含む原料として、糖蜜も用いることができる。また、わら（稲わら、大麦わら、小麦わら、ライ麦わら、オート麦わら等）、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物や、スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物や、木くず、古紙等を糖化酵素等で糖化した、グルコース等の複数の糖を含む糖化液を用いることもできる。
　変異コリネ型細菌を培養する培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、本発明の変異コリネ型細菌の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、上記の糖類又はそれを含む糖蜜や糖化液が用いられるが、上記の糖類の他に、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
　培養液中の原料化合物である糖類の濃度は、１～３０ｗ／ｖ％が好ましく、２～２０ｗ／ｖ％がより好ましく、２～１０ｗ／ｖ％がさらに好ましい。
　窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、コーンスティープリカー、メチルアミン等のアルキルアミン類、アミノ酸等の含窒素有機化合物、アンモニアもしくはその塩（塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物）、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用することができる。　
　無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。
　さらに、必要に応じて、ビタミン類や消泡剤等を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
　コリネ型細菌用培地としては、ＬＢ培地、Ａ培地〔J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、ＢＴ培地〔J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕、ＣＧＸＩＩ培地〔J. Bacteriol. 175:5595-5603 (1993)〕等が挙げられ、これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
　なお、糖類を含む反応又は培養に先立ち、同様の培地で、変異コリネ型細菌を好気条件下で、温度約２５～３８℃で、約１２～４８時間培養して増殖させることが好ましい。
　培養温度又は反応温度は、１５～４５℃が好ましく、２５～３７℃がより好ましい。
　また、培養又は反応時間は、２４時間～１６８時間、好ましくは２４時間～９６時間、より好ましくは２４時間～７２時間、必要に応じ撹拌又は振とうしながら行うことができる。また、培養中は必要に応じてアンピシリンやカナマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
　培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
　培養又は反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよいが、好気的条件下で行うのが好ましい。
　好気的条件下で反応又は培養を行う場合、目的物質の生成効率の点から、変異コリネ型細菌の過度の増殖を抑制する条件下で行うのが好ましい。
　目的物質が酸化しやすい物質の場合は、目的物質の酸化を防ぐため、培養は溶存酸素濃度が低い条件で行うことが好ましい。具体的には溶存酸素濃度が０．１～３ｐｐｍが好ましく、０．１～１ｐｐｍがより好ましい。
　培養物からの芳香族化合物又はその塩の回収及び精製方法は特に制限されない。すなわち、周知のイオン交換樹脂法、沈澱法、晶析法、再結晶法、濃縮法その他の方法を組み合わせることにより実施できる。例えば、菌体を遠心分離等で除去した後、カチオン及びアニオン交換樹脂でイオン性の物質を除き、濃縮すれば芳香族化合物又はその塩を取得することができる。培養物中に蓄積された芳香族化合物又はその塩は、そのまま単離することなく用いてもよい。
　上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞下記（ａ）又は（ｂ）で示されるｍｄｈ遺伝子の機能が抑制された変異コリネ型細菌を培養する工程を含む、芳香族化合物又はその塩の製造方法。
　　（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　　（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
＜２＞芳香族化合物がプロトカテク酸、没食子酸、２，４－ピリジンジカルボン酸、２，５－ピリジンジカルボン酸、カテコール、Ｌ－ＤＯＰＡ、４－ヒドロキシ安息香酸、４－アミノ３－ヒドロキシ安息香酸、チロシン、トリプトファン又はそれらの塩であり、好ましくは、没食子酸、プロトカテク酸、カテコール、Ｌ－ＤＯＰＡ、２，４－ピリジンジカルボン酸、２，５－ピリジンジカルボン酸又はそれらの塩である、＜１＞の方法。
＜３＞芳香族化合物が没食子酸又はその塩である、＜１＞の方法。
＜４＞ｍｄｈ遺伝子の機能の抑制がｍｄｈ遺伝子の発現抑制又はｍｄｈ遺伝子がコードするタンパク質の活性抑制である、＜１＞～＜３＞のいずれかの方法。
＜５＞ｍｄｈ遺伝子の機能の抑制がｍｄｈ遺伝子の欠失又は不活性化によりなされる、＜１＞～＜３＞のいずれかの方法。
＜６＞コリネ型細菌がコリネバクテリウム グルタミカム、コリネバクテリウム エフィシェンス、コリネバクテリウム アンモニアゲネス、コリネバクテリウム ハロトレランス、コリネバクテリウム アルカノリティカム又はコリネバクテリウム カルナエである、＜１＞～＜５＞のいずれかの方法。
＜７＞コリネ型細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである、＜１＞～＜５＞のいずれかの方法。
＜８＞炭素源として糖類を含む培地で培養される、＜１＞～＜７＞のいずれかの方法。
＜９＞前記培養物から芳香族化合物又はその塩を回収する工程を含む、＜１＞～＜８＞のいずれかの方法。
＜１０＞下記（ａ）又は（ｂ）で示されるｍｄｈ遺伝子の機能が抑制された変異コリネ型細菌。
　　（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　　（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
　以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
（１）没食子酸生産菌の作製
　１）ｃｇ０６２０遺伝子領域を３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド遺伝子と置換するためのプラスミドの構築
　下記の実施例で示す塩基番号は、ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノム配列の塩基番号であり、該ゲノム配列情報については、ＮＣＢＩのＧＢデータベースから、アクセッション番号ＮＣ＿００６９５８として取得した。
　ＰＣＲ用酵素はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を用いた。
　ＡＴＣＣ１３０３２株（＝ＮＢＲＣ １２１６８株）のゲノムＤＮＡを鋳型にプライマーＯＴ２０及びＯＴ２１にて増幅し、ｃｇ０６２０遺伝子領域の５’側のＤＮＡ断片を得た。またゲノムＤＮＡを鋳型にプライマーＯＴ２３及びＯＴ２４にて増幅し、ｃｇ０６２０遺伝子領域の３’側のＤＮＡ断片を得た。また、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株が有するｔｕｆ遺伝子（ｃｇ０５８７）のプロモーター（以下、ｔｕプロモーターと称する）を含むＤＮＡ断片（ＯＴ２５）を人工遺伝子合成にて作製した。これを鋳型にプライマーＯＴ２６及びＯＴ２７にて増幅して、プロモーター領域のＤＮＡ断片を得た。また、３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド遺伝子（以下、ｈｆｍ１４５ＶＦと略記する）を含むＤＮＡ断片を人工遺伝子合成にて２種類（配列番号２と３）作製した。それぞれのＤＮＡ断片を鋳型にし、それぞれ２種類のＤＮＡプライマー（ＯＴ３０とＯＴ３１及びＯＴ３２とＯＴ３３）にて増幅し、２種類のＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１（特許文献１に記載）を鋳型に、プライマーＯＴ３４及びＯＴ３５にて、ベクター断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた６種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ０６２０－Ｐｔｕ－ｈｆｍ１４５ＶＦ－ｈｆｍ１４５ＶＦｏｐｔを作製した。得られたプラスミド溶液を用いてＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ.　Ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（ニッポンジーン社）に形質転換し、細胞液をカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して、３７℃で一晩静置した。プラスミドを持つ形質転換体をカナマイシンンを含むＬＢ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（ＴａＫａＲａ社）と用いてプラスミドの精製を行い、ｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ０６２０－Ｐｔｕ－ｈｆｍ１４５ＶＦ－ｈｆｍ１４５ＶＦｏｐｔを得た。
　２）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド遺伝子導入株の作製
　エレクトロポレーション（Ｂｉｏ－ｒａｄ）による形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ０６２０－Ｐｔｕ－ｈｆｍ１４５ＶＦ－ｈｆｍ１４５ＶＦｏｐｔをＣＹ４４株（ＣＹ４４株は、特許６３２２５７６号公報の参考例１４記載のｔｋｔ株であり、ｔｋｔ遺伝子の転写をｔｕプロモーターによって制御することによって発現が強化されている。また、ｑｓｕＢ遺伝子とｖａｎＲ遺伝子の転写を安息香酸の添加により誘導することができる。さらにａｒｏＥ３遺伝子がＶａｎＲリプレッサーにより制御される。）に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ１４８ｓｒ株を取得した。プライマーＯＴ２０及びＯＴ３６のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ１４８ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ１４８ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ０６２０－Ｐｔｕ－ｈｆｍ１４５ＶＦ－ｈｆｍ１４５ＶＦｏｐｔがｃｇ０６２０遺伝子領域に導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
　ＫＣ１４８ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ１４８株を得た。プライマーＯＴ３６とＯＴ３７のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ１４８株が予想通りＰｔｕ－ｈｆｍ１４５ＶＦ－ｈｆｍ１４５ＶＦｏｐ遺伝子がｃｇ０６２０遺伝子領域に導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
（２）ｍｄｈ破壊株の作製
　１）ｍｄｈ（ｃｇ２６１３）遺伝子を破壊するためのプラスミドの作製
　ＰＣＲ用酵素はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を用いた。ｐＨＫＰｓａｃＢ１（特許６３２２５７６号公報に記載）を鋳型に、プライマーｐＨＫＰｓａｃＢ－Ｆ２及びｐＨＫＰｓａｃＢ－Ｒ２でベクター断片を増幅した。ＡＴＣＣ１３０３２株（＝ＮＢＲＣ　１２１６８株）のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマー２６１３－ｕｐ－Ｆ及び２６１３－ｕｐ－Ｒにて増幅したｃｇ２６１３遺伝子の５’側のＤＮＡ断片、及びゲノムＤＮＡを鋳型にプライマー２６１３－ｄｏｗｎ－Ｆ及び２６１３－ｄｏｗｎ－Ｒにて増幅したｃｇ２６１３遺伝子の３’側のＤＮＡ断片を得た。得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた３種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｍｄｈを作製した。得られたプラスミド溶液を用いてＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ.　Ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（ニッポンジーン社）に形質転換し、細胞液をカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して、３７℃で一晩静置した。得られたコロニーを鋳型にして、Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（ＴａＫａＲａ社）を酵素として用い、コロニーＰＣＲを行った。プライマーは２６１３－ｕｐ－Ｆ及び２６１３－ｄｏｗｎ－Ｒを用いて、目的ＤＮＡ断片の導入を確認した。遺伝子の導入が確認されたプラスミドを持つ形質転換体をカナマイシンンを含むＬＢ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（ＴａＫａＲａ社）と用いてプラスミドの精製を行い、ｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｍｄｈを得た。
　２）ｍｄｈ遺伝子（ｃｇ２６１３）の破壊株の取得
　上記で得られたプラスミドｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｍｄｈを用いて、ＫＣ１４８にエレクトロポレーション法（Ｂｉｏ－ｒａｄ）により形質転換した。カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ１４８Δｍｄｈ―ｓｒを取得した。得られたコロニーを鋳型にして、プライマーｓａｃＢ－１及び２６１３－ｕｐ１５００を用いてＰＣＲ（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ）を行ったところ予想通りの結果が得られたことから、プラスミドｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｍｄｈが１回交差型相同組換えによりｃｇ２６１３遺伝子領域に導入されたことを確認した。ＫＣ１４８Δｍｄｈ―ｓｒを１ｍＬのＬＢ液体培地中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ観点培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ１４８Δｍｄｈ株を得た。プライマー２６１３－ｃｏｌｏＰ－Ｆ及び２６１３－ｃｏｌｏＰ－Ｒを用いたコロニーＰＣＲ（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ）により、ｍｄｈ遺伝子（ｃｇ２６１３）が２回交差型相同組換えにより欠失していることを確認した。合わせて、カナマイシン耐性遺伝子とｓａｃＢ遺伝子も欠失していることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（３）没食子酸の生産性の評価
　ＫＣ１４８及びＫＣ１４８Δｍｄｈ株をＬＢプレートに画線し、３０℃で２日間培養した。表２に示すＣＧＸＩＩ培地に終濃度１ｍＭとなるよう安息香酸ナトリウムを添加し、丸底スピッツ（栄研化学）に１．５ｍＬ仕込んだ。ＫＣ１４８及びＫＣ１４８Δｍｄｈのコロニーを植菌し、３２℃、２００ｒｐｍで２４時間振盪培養を行い、没食子酸の生産性を評価した。培養液を希硫酸で適宜希釈し、遠心にて菌体を除去した後、上清を回収した。上清中のグルコース濃度と没食子酸濃度を定量した。結果を表３に示した。ＫＣ１４８株と比較してＫＣ１４８Δｍｄｈ株では、消費糖に対する没食子酸収率が、１．４倍に向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
参考例１　没食子酸、パラアミノ安息香酸及びグルコースの定量
１）分析条件
　回収した上清はアクロプレップ９６フィルタープレート（０．２μｍＧＨＰ膜、日本ポール）を用いて不溶物の除去を行ない、反応液をＨＰＬＣに供した。
　ＨＰＬＣの装置はＣｈｒｏｍａｓｔｅｒ（日立ハイテクサイエンス）を用いた。没食子酸とパラアミノ安息香酸の分析には、Ｌ－カラム　ＯＤＳ（４．６ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ、化学物質評価研究機構）を用い、溶離液Ａを０．１Ｍ　リン酸二水素カリウムの０．１％リン酸溶液、溶離液Ｂを７０％メタノールとし、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度４０℃の条件にてグラジエント溶出を行なった。没食子酸及びパラアミノ安息香酸の検出にはＵＶ検出器（検出波長２１０及び２８０ｎｍ）を用いた。
　グルコースの分析にはＩＣｓｅｐ　ＩＯＮ－３００（７．８ｍｍ×３００ｍｍ、東京化成工業）を用い、溶離液を３７ｍＭ硫酸溶液とし、流速０．５ｍＬ／分、カラム温度５０℃の条件で検出を行った。グルコースの検出にはＲＩを用いた。
比較例
（１）コリネ型細菌のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）活性を持つ遺伝子の抽出
　ｃｇ２６１３以外のｍｄｈ活性を持つ遺伝子をデータベース（KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, https://www.genome.jp/kegg-bin/show_organism?org=T00244）から抽出し、ｃｇ７６３（配列番号２８）とｃｇ２１９２（配列番号２９）を得た。
（２）ｃｇ７６３破壊株の作製
　１）ｃｇ７６３遺伝子を破壊するためのプラスミドの作製
　実施例（２）１）と同様に行った。すなわちｃｇ７６３遺伝子の５’側のＤＮＡ断片の増幅にはプライマー７６３－ｕｐ－Ｆ及び７６３－ｕｐ－Ｒを、ｃｇ２６１３遺伝子の３’側のＤＮＡ断片の増幅にはプライマー７６３－ｄｏｗｎ－Ｆ及び７６３－ｄｏｗｎ－Ｒを用いた。これら２断片と、実施例（２）１）に記載のベクター断片を用い、プラスミドｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｃｇ７６３を作製した。コロニーＰＣＲにはプライマーは７６３－ｕｐ－Ｆ及び７６３－ｄｏｗｎ－Ｒを用いた。
　２）ｃｇ７６３遺伝子の破壊株の取得
　（２）１）で得られたプラスミドを用い、実施例（２）２）と同様に行った。ＫＣ１４８Δｃｇ７６３―ｓｒ株の確認のＰＣＲには、プライマーｓａｃＢ－１及び７６３－ｕｐ１５００を用いた。ＫＣ１４８Δｃｇ７６３株の確認のＰＣＲにはプライマー７６３－ｃｏｌｏＰ－Ｆ及び７６３－ｃｏｌｏＰ－Ｒを用いた。
（３）ｃｇ２１９２破壊株の作製
　１）ｃｇ２１９２遺伝子を破壊するためのプラスミドの作製
　実施例（２）１）と同様に行った。すなわちｃｇ２１９２遺伝子の５’側のＤＮＡ断片の増幅にはプライマー２１９２－ｕｐ－Ｆ及び２１９２－ｕｐ－Ｒを、ｃｇ２１９２遺伝子の３’側のＤＮＡ断片の増幅にはプライマー２１９２－ｄｏｗｎ－Ｆ及び２１９２－ｄｏｗｎ－Ｒを用いた。これら２断片と、実施例（２）１）に記載のベクター断片を用い、プラスミドｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｃｇ２１９２を作製した。コロニーＰＣＲにはプライマーは２１９２－ｕｐ－Ｆ及び２１９２－ｄｏｗｎ－Ｒを用いた。
　２）ｃｇ２１９２遺伝子の破壊株の取得
　（３）１）で得られたプラスミドを用い、実施例（２）２）と同様に行った。ＫＣ１４８Δｃｇ２１９２―ｓｒ株の確認のＰＣＲには、プライマーｓａｃＢ－１及び２１９２－ｕｐ１５００を用いた。ＫＣ１４８Δｃｇ２１９２株の確認のＰＣＲにはプライマー２１９２－ｃｏｌｏＰ－Ｆ及び２１９２－ｃｏｌｏＰ－Ｒを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（４）没食子酸の生産性の評価
　実施例（３）と同様の方法で、ＫＣ１４８、ＫＣ１４８Δ７６３及びＫＣ１４８Δ２１９２株を評価した。結果を表５に示した。ＫＣ１４８株と比較して、ＫＣ１４８Δ７６３株では、消費糖に対する没食子酸収率が０．９１倍、ＫＣ１４８Δ２１９２株では０．７１倍に低下した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005

Claims (10)

  1. 　下記（ａ）又は（ｂ）で示されるｍｄｈ遺伝子の機能が抑制された変異コリネ型細菌を培養する工程を含む、芳香族化合物又はその塩の製造方法。
    　　（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
    　　（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
  2. 　芳香族化合物が没食子酸、プロトカテク酸、カテコール、Ｌ－ＤＯＰＡ、２，４－ピリジンジカルボン酸、２，５－ピリジンジカルボン酸又はそれらの塩である、請求項１記載の方法。
  3. 　芳香族化合物が没食子酸又はその塩である、請求項１記載の方法。
  4. 　ｍｄｈ遺伝子の機能の抑制がｍｄｈ遺伝子の発現抑制又はｍｄｈ遺伝子がコードするタンパク質の活性抑制である、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 　ｍｄｈ遺伝子の機能の抑制がｍｄｈ遺伝子の欠失又は不活性化によりなされる、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  6. 　コリネ型細菌がコリネバクテリウム グルタミカム、コリネバクテリウム エフィシェンス、コリネバクテリウム アンモニアゲネス、コリネバクテリウム ハロトレランス、コリネバクテリウム アルカノリティカム又はコリネバクテリウム カルナエである、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　コリネ型細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  8. 　炭素源として糖類を含む培地で培養される、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
  9. 　前記培養物から芳香族化合物又はその塩を回収する工程を含む、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
  10. 　下記（ａ）又は（ｂ）で示されるｍｄｈ遺伝子の機能が抑制された変異コリネ型細菌。
    　　（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
    　　（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
     
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