CN117957329A - 芳香族化合物的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种使用棒状菌突变株高效地制造芳香族化合物的方法。所述芳香族化合物或其盐的制造方法包括对抑制了下述(a)或(b)所示的mdh基因的功能的突变棒状菌进行培养的工序。(a)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；(b)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％以上的同一性的核苷酸序列构成，并且编码具有苹果酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。

Description

芳香族化合物的制造方法
技术领域
本发明涉及一种棒状菌生产性的芳香族化合物的制造方法。
背景技术
棒状菌(谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum))是作为谷氨酸生产菌被分离出来以来，能够在各种氨基酸或核酸生产中利用的有用工业微生物。近年来，也建立了以棒状菌为对象的基因重组技术，能够生产酪氨酸或色氨酸这样的芳香族氨基酸(非专利文献1)或者没食子酸、4-羟基苯甲酸(非专利文献1)、4-氨基苯甲酸(非专利文献2)等芳香族化合物等各种各样的有机化合物。
莽草酸途径是植物或微生物生物合成芳香族化合物的重要的代谢途径。即，糖酵解系统所生成的磷酸烯醇丙酮酸与由戊糖磷酸途径供给的赤藓糖-4-磷酸结合，形成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)，经由3-脱氢奎尼酸(DHQ)、3-脱氢莽草酸(DHS)，形成莽草酸。然后，莽草酸从腺苷三磷酸转移磷酸基，形成3-磷酸莽草酸，经由3-磷酸烯醇丙酮酰莽草酸，形成分支酸。在莽草酸途径中，在形成碳6元环后，进行双键的生成，从衍生自DHS的原儿茶酸生产没食子酸、2,4-吡啶二羧酸(2,4-PDCA)、2,5-吡啶二羧酸(2,5-PDCA)、儿茶酚、L-DOPA等芳香族化合物，由分支酸生产4-羟基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、4-氨基3-羟基苯甲酸等芳香族化合物(图1)。
〔非专利文献1〕Metab.Eng.2018.50:122-141.
〔非专利文献2〕Metab.Eng.2016.38:322-330.
发明内容
本发明涉及以下的1)～2)。
1)一种芳香族化合物或其盐的制造方法，其包括对抑制了下述(a)或(b)所示的mdh基因的功能的突变棒状菌进行培养的工序，
(a)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
(b)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％以上的同一性的核苷酸序列构成，并且编码具有苹果酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
2)一种抑制了下述(a)或(b)所示的mdh基因的功能的突变棒状菌，
(a)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
(b)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％以上的同一性的核苷酸序列构成，并且编码具有苹果酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
附图说明
图1是表示棒状菌的各种芳香族化合物的生产途径的示意图。
具体实施方式
本发明提供一种使用棒状菌突变株高效地制造芳香族化合物的方法。
本发明者们发现，在抑制了作为编码苹果酸脱氢酶(mdh)的基因之一的cg2613基因的功能的突变棒状菌中，以没食子酸为代表的芳香族化合物的生产率提高。
根据本发明，能够高效地制造如没食子酸、2,4-吡啶二羧酸、2,5-吡啶二羧酸、儿茶酚、L-DOPA、4-羟基苯甲酸这样的芳香族化合物或其盐。
在本发明中，氨基酸序列或核苷酸序列的同一性根据利普曼-皮尔森(Lipman-Pearson)法(Science,1985,227:1435-1441)进行计算。具体而言，可以使用遗传信息处理软件GENETYX Ver.12的同源性分析(Search homology)程序，将Unit size to compare(ktup)设为2进行分析而算出。
在本发明中，关于核苷酸序列的“至少90％的同一性”是指90％以上、优选95％以上、更优选96％以上、进一步优选97％以上、进一步更优选98％以上、尤其优选99％以上的同一性。
在本发明中，“缺失、取代、添加或插入1个或多个核苷酸的核苷酸序列”是指缺失、取代、添加或插入1个以上30个以下、优选1个以上24个以下、更优选1个以上15个以下、进一步优选1个以上9个以下、进一步更优选1个以上6个以下、尤其优选1个以上3个以下的核苷酸的核苷酸序列。在本说明书中，氨基酸或核苷酸的“添加”包括向序列的一个末端和两个末端添加氨基酸或核苷酸。
在本说明书中，关于基因的“上游”和“下游”是指该基因的转录方向的上游和下游。例如，“配置在启动子的下游的基因”是指在DNA有义链中在启动子的3’侧存在该基因，基因的上游是指DNA有义链中的该基因的5’侧的区域。
在本说明书中，对于细胞的功能、性状、特性所使用的术语“内源”是用于表示该功能、性状、特性原本就存在于该细胞中。相对而言，术语“外源”是用于表示不是原本存在于该细胞而是从外部导入的功能、性状、特性。例如，“外源”基因或多核苷酸是从外部导入细胞内的基因或多核苷酸。外源基因或多核苷酸可以来自与导入其的细胞同种的生物，也可以来自异种的生物(即异种基因或多核苷酸)。
在本发明中，棒状菌属于含有分枝菌酸的放线菌群，是指不具有孢子形成能力的无运动的、需氧的革兰氏阳性菌，包括Bergey's Manual of DeterminativeBacteriology,Vol.8,599(1974)中所定义的一组微生物。具体而言，可以列举棒状杆菌属菌、短杆菌属菌、节杆菌属(Arthrobacter)菌、分支杆菌属菌、红球菌属菌、链霉菌属菌、微球菌属菌等。
作为棒状杆菌属菌，可以列举谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、高效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、产氨棒状杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、耐盐棒状杆菌(Corynebacterium halotolerance)、解烷棒状杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)、帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae)等。
作为短杆菌属菌，可以列举产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)等。
作为节杆菌属菌，可以列举球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)等。
作为分支杆菌属菌，可以列举牛分支杆菌(Mycobacterium bovis)等；作为微球菌属菌，可以列举费氏微球菌(Micrococcus freudenreichii)、藤黄微球菌(Micrococcusleuteus)、脲微球菌(Micrococcus ureae)、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)等。
棒状菌中，优选为棒状杆菌属菌，更优选为谷氨酸棒状杆菌。
用于制作本发明的突变棒状菌的棒状菌(亲本棒状菌)只要是具有芳香族化合物的生产能力的，除了野生株以外，还可以为其突变株或人工基因重组体。例如，可以为乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase：LDH)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvatecarboxylase)等的基因的破坏株。另外，也可以为改型成获得或提高芳香族化合物的生产能力的棒状菌。作为获得或提高微生物的芳香族化合物生产能力的方法，可以列举将编码用于生产目标的芳香族化合物的各种酶的多核苷酸掺入微生物的方法。在优选的实施方式中，本发明的抑制了mdh基因的功能的突变棒状菌的制作中所使用的棒状菌是掺入了外源多核苷酸的重组体，该外源多核苷酸编码用于生产所要制造的目标芳香族化合物或其盐的酶。
例如，可以列举导入了编码3,4-二羟基苯甲酸羟化酶的多核苷酸的具有没食子酸生产能力的重组体、导入了编码原儿茶酸脱羧酶的多核苷酸的具有儿茶酚生产能力的重组体、向上述具有儿茶酚生产能力的重组体中导入了编码酪氨酸酚解酶的多核苷酸的具有L-DOPA生产能力的重组体、导入了编码原儿茶酸-4,5-双加氧酶的多核苷酸的具有2,4-PDCA生产能力的重组体、导入了编码原儿茶酸-2,3-双加氧酶的多核苷酸的具有2,5-PDCA生产能力的重组体、导入了编码分支酸裂解酶的多核苷酸的具有4-羟基苯甲酸生产能力的重组体等。
在本发明中，芳香族化合物是在棒状菌的菌体内生物合成的、即棒状菌生产性的有机芳香族化合物，具体而言，是指经由莽草酸途径而合成的芳香族化合物、优选是指衍生自3-脱氢莽草酸(DHS)或分支酸的芳香族化合物(图1)。
具体而言，可以列举原儿茶酸、儿茶酚、没食子酸、苯丙氨酸、L-DOPA、酪氨酸、前酪氨酸、色氨酸、4-羟基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、2,3-二羟基苯甲酸、2,4-吡啶二羧酸、2,5-吡啶二羧酸、4-氨基3-羟基苯甲酸等。
其中，优选为衍生自DHS的原儿茶酸；衍生自原儿茶酸的没食子酸、2,4-吡啶二羧酸(2,4-PDCA)、2,5-吡啶二羧酸(2,5-PDCA)、儿茶酚、L-DOPA；衍生自分支酸的4-羟基苯甲酸、4-氨基3-羟基苯甲酸、酪氨酸、色氨酸等，更优选为原儿茶酸和衍生自原儿茶酸的芳香族化合物，更优选为没食子酸。
作为该芳香族化合物的盐，可以列举碱加成盐、酸加成盐等。作为碱加成盐，例如可以列举与钠、钾等碱金属的盐、与钙、镁等碱土金属的盐等；作为酸加成盐，例如可以列举盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等矿酸盐等。
在本发明中，mdh基因是编码苹果酸脱氢酶(mdh)的基因。苹果酸脱氢酶(malatedehydrogenase)是催化将苹果酸氧化成草酰乙酸的(或其相反的)化学反应的酸化还原酶。
在本发明中，作为mdh基因，可以列举选自下述(a)或(b)中的至少1种多核苷酸。
(a)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
(b)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％以上的同一性的核苷酸序列构成，并且编码具有苹果酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
其中，由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸表示来自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032株的mdh基因(cg2613)。
作为与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列，可以列举具有优选95％以上、更优选96％以上、进一步优选97％以上、进一步更优选98％以上、尤其优选99％以上的同一性的核苷酸序列；作为该核苷酸序列的例子，可以列举相对于序列号1所示的核苷酸序列缺失、取代、添加或插入1个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明中，mdh基因的功能抑制除了mdh基因的表达抑制以外，还包括mdh基因所编码的蛋白质的活性抑制，可以是功能的完全抑制(阻碍)和不完全抑制中的任意种。这样的mdh基因的功能抑制可以通过以下的方式进行：对mdh基因的编码区域、非编码区域、转录或翻译开始区域导入缺失或钝化的突变(mdh基因的缺失或钝化)；或者导入具有分解mdh基因的转录产物的活性的多核苷酸、抑制从该转录产物向蛋白质的翻译的多核苷酸，由此抑制转录或翻译。
作为一个方式，mdh基因的缺失或钝化可以通过将mdh基因的核苷酸序列的一部分或全部从基因组中除去，或者与其他核苷酸序列置换；在mdh基因的序列中插入其他多核苷酸片段；对mdh基因的转录或翻译开始区域赋予突变等来实现。优选使mdh基因的核苷酸序列的一部分或全部缺失或钝化。作为更具体的例子，可以列举：使细胞的基因组上的mdh基因特异性缺失或钝化的方法；和对细胞中的该基因赋予随机的缺失或钝化突变后，进行mdh蛋白质的表达量、活性评价或基因分析，选择具有所希望的突变的细胞的方法。
mdh基因的特异性缺失或钝化例如可以列举利用同源重组的方法。即，构建通过碱基取代或碱基插入等而导入了钝化突变的mdh基因的DNA片段、或者包含mdh基因的外侧区域但不含mdh基因的DNA片段，将其掺入亲本微生物(棒状菌)细胞内，使包含亲本微生物基因组的mdh基因的区域发生同源重组，由此能够使基因组上的mdh基因缺失或钝化。或者，通过将具有包含mdh基因的部分区域的DNA片段的重组载体(质粒等)掺入亲本微生物细胞内，利用同源重组将亲本微生物基因组的mdh基因的部分区域分断，也能够使mdh基因钝化。作为使细胞中的基因随机缺失或钝化的方法，可以列举：将随机克隆有导入了钝化突变的基因的DNA片段导入细胞内，使该细胞的基因组上的基因之间发生同源重组的方法；对细胞照射紫外线、γ射线等而诱发突变的方法等。基因的钝化突变是指通过沉默突变、错义突变、无义突变、移码突变等而丧失靶标基因本来所具有的功能的突变。例如，导入了钝化突变的基因不表达蛋白质，或者表达本来活性受损的蛋白质。
作为制作包含导入了钝化突变的mdh基因的DNA片段的方法，可以列举定点突变导入。定点突变导入可以使用包含所要导入的核苷酸突变的突变用引物进行。例如，通过以使用了包含所要导入的核苷酸突变的2组引物的mdh基因为模板的PCR，制作将包含mdh基因的区域的上游侧和下游侧分别进行了扩增的DNA片段，接着，通过SOE-PCR(重叠延伸剪接(splicing by overlap extension)PCR)(Gene,1989,77(1):p61-68)将它们连接成1个，由此能够构建包含所希望的突变的DNA片段。或者，定点突变导入也可以使用反向PCR法或退火法等(村松等编、“修订第四版新基因工程手册”、羊土公司、p82-88)、或者Stratagene公司的QuickChange II定点突变试剂盒(Site-Directed Mutagenesis Kit)、QuickChange多点突变试剂盒(Multi Site-Directed Mutagenesis Kit)等市售的定点突变导入用试剂盒。
突变用引物可以利用亚磷酰胺法(Nucleic Acids Research,1989,17:7059-7071)等公知的寡核苷酸合成法进行制作。作为模板的mdh基因可以由上述的棒状菌利用通常方法进行制备，或者也可以化学合成。
将DNA片段或载体导入至微生物细胞例如可以应用磷酸钙法、电穿孔法、脂质转染法、粒子枪法、PEG法等公知的技术。例如作为能够应用于棒状菌的方法，可以列举感受态细胞转化法(J Bacteriol,1967,93:1925-1937)、电穿孔法(FEMS Microbiol Lett,1990,55:135-138)、原生质体转化法(Mol Gen Genet,1979,168:111-115)、Tris-PEG法(JBacteriol,1983,156:1130-1134)等。
另外，作为具有分解mdh基因的转录产物的活性的多核苷酸、或者抑制从该转录产物向蛋白质的翻译的多核苷酸，可以列举与mdh基因的mRNA的核苷酸序列互补或实质上互补的核苷酸序列或含有其一部分的多核苷酸。具体而言，可以列举与mdh基因的mRNA对应的反义RNA、与mdh基因的mRNA对应的siRNA、与mdh基因的mRNA对应的核酶等。
抑制了mdh基因的功能的细胞可以通过确认其基因组序列来选择。或者，可以将mdh蛋白质的表达量或活性作为指标，选择抑制了mdh基因的功能的细胞。
对如此构建的抑制了mdh基因的功能的突变棒状菌进行培养，优选在糖类的存在下进行培养，回收目标芳香族化合物或其盐，由此能够制造芳香族化合物或其盐。
作为糖类，优选葡萄糖，除了果糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖等单糖类以外，还可以使用通过代谢能够生成葡萄糖的糖类。这样的糖类包括具有葡萄糖单元的寡糖或多糖类，可以列举纤维二糖、蔗糖(sucrose)、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、木二糖等二糖类；糊精或可溶性淀粉等多糖类等。
另外，作为例如含有这些的原料化合物的原料，也可以使用糖蜜。另外，还可以使用秸秆(水稻秸秆、大麦秸秆、小麦秸秆、黑麦秸秆、燕麦秸秆等)、蔗渣、玉米秸秆等非可食农业废弃物；柳枝稷、象草、芒草等能源作物；利用糖化酶等将木屑、废纸等糖化而成的含有葡萄糖等多种糖的糖化液。
培养突变棒状菌的培养基含有碳源、氮源、无机盐类等，只要是能够有效地进行本发明的突变棒状菌的培养的培养基，可以使用天然培养基、合成培养基中的任意种。
作为碳源，可以使用上述的糖类或含有其的糖蜜、糖化液，除了上述的糖类以外，还可以使用：如甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油这样的糖醇；如乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸这样的有机酸；如乙醇、丙醇这样的醇；如正链烷烃这样的烃等。碳源可以单独使用1种，或者将2种以上混合使用。
培养液中的作为原料化合物的糖类的浓度优选为1～30w/v％，更优选为2～20w/v％，进一步优选为2～10w/v％。
作为氮源，例如可以使用蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆粕碱提取物、玉米浆、甲胺等烷基胺类、氨基酸等含氮有机化合物、氨或其盐(如氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵这样的无机或有机铵化合物)、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。
作为无机盐类，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。
另外，根据需要，也可以添加维生素类或消泡剂等。作为维生素类，可以列举生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、烟酸等。
作为棒状菌用培养基，可以列举LB培养基、A培养基〔J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)〕、BT培养基〔J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)〕、CGXII培养基〔J.Bacteriol.175:5595-5603(1993)〕等，在这些培养基中，使糖类浓度成为上述范围再使用即可。
此外，在含有糖类的反应或培养之前，优选利用相同的培养基，对突变棒状菌在好氧条件下、以温度约25～38℃培养约12～48小时，使其增殖。
培养温度或反应温度优选为15～45℃，更优选为25～37℃。
另外，培养或反应时间为24小时～168小时，优选为24小时～96小时，更优选为24小时～72小时，根据需要可以一边搅拌或振荡一边进行。另外，在培养中，根据需要也可以在培养基中添加氨苄西林或卡那霉素等抗生物质。
培养可以为间歇式、流加式、连续式中的任意种。其中，优选间歇式。
培养或反应可以在好氧的条件下进行，也可以在还原条件下进行，优选在好氧的条件下进行。
在好氧的条件下进行反应或培养的情况下，从目标物质的生成效率的方面考虑，优选在抑制突变棒状菌的过度增殖的条件下进行。
在目标物质为容易氧化的物质的情况下，为了防止目标物质的氧化，培养优选在溶存氧浓度低的条件下进行。具体而言，溶存氧浓度优选为0.1～3ppm，更优选为0.1～1ppm。
芳香族化合物或其盐从培养物中的回收和纯化方法没有特别限制。即，可以通过将公知的离子交换树脂法、沉淀法、晶析法、再结晶法、浓缩法、其他方法组合而实施。例如，可以在通过离心分离等除去菌体后，利用阳离子和阴离子交换树脂除去离子性的物质，进行浓缩，则能够获得芳香族化合物或其盐。蓄积于培养物中的芳香族化合物或其盐也可以不进行分离而直接使用。
关于上述的实施方式，在本发明中进一步公开以下的方式。
＜1＞一种芳香族化合物或其盐的制造方法，其包括对抑制了下述(a)或(b)所示的mdh基因的功能的突变棒状菌进行培养的工序，
(a)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
(b)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％以上的同一性的核苷酸序列构成，并且编码具有苹果酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
＜2＞如＜1＞的方法，其中，芳香族化合物为原儿茶酸、没食子酸、2,4-吡啶二羧酸、2,5-吡啶二羧酸、儿茶酚、L-DOPA、4-羟基苯甲酸、4-氨基-3-羟基苯甲酸、酪氨酸、色氨酸或它们的盐，优选为没食子酸、原儿茶酸、儿茶酚、L-DOPA、2,4-吡啶二羧酸、2,5-吡啶二羧酸或它们的盐。
＜3＞如＜1＞的方法，其中，芳香族化合物为没食子酸或其盐。
＜4＞如＜1＞～＜3＞中任一项的方法，其中，mdh基因的功能抑制是mdh基因的表达抑制或mdh基因所编码的蛋白质的活性抑制。
＜5＞如＜1＞～＜3＞中任一项的方法，其中，mdh基因的功能抑制通过mdh基因的缺失或钝化来实现。
＜6＞如＜1＞～＜5＞中任一项的方法，其中，棒状菌为谷氨酸棒状杆菌、高效棒状杆菌、产氨棒状杆菌、耐盐棒状杆菌、解烷棒状杆菌或帚石南棒状杆菌。
＜7＞如＜1＞～＜5＞中任一项的方法，其中，棒状菌为谷氨酸棒状杆菌。
＜8＞如＜1＞～＜7＞中任一项的方法，其中，在含有糖类作为碳源的培养基中进行培养。
＜9＞如＜1＞～＜8＞中任一项的方法，其中，包括从所述培养物中回收芳香族化合物或其盐的工序。
＜10＞一种抑制了下述(a)或(b)所示的mdh基因的功能的突变棒状菌，
(a)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
(b)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％以上的同一性的核苷酸序列构成，并且编码具有苹果酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
实施例
以下，利用实施例对本发明进行更详细地说明，但本发明的技术范围并不限定于以下的实施例。
(1)没食子酸生产菌的制作
1)用于将cg0620基因区域取代为具有3,4-二羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽基因的质粒的构建
下述的实施例中所示的碱基号是ATCC13032株的基因组序列的碱基号，关于该基因组序列信息，从NCBI的GB数据库中以登录号NC_006958的形式获得。
PCR用酶使用了PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa公司)。
以ATCC13032株(＝NBRC 12168株)的基因组DNA为模板，利用引物OT20和OT21进行扩增，得到cg0620基因区域的5’侧的DNA片段。另外，以基因组DNA为模板，利用引物OT23和OT24进行扩增，得到cg0620基因区域的3’侧的DNA片段。另外，通过人工基因合成，制作含有谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株所具有的tuf基因(cg0587)的启动子(以下称为tu启动子)的DNA片段(OT25)。以其为模板，利用引物OT26和OT27进行扩增，得到启动子区域的DNA片段。另外，通过人工基因合成，制作2种(序列号2和3)含有具有3,4-二羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽基因(以下，简记为hfm145VF)的DNA片段。以各DNA片段为模板，分别利用两种DNA引物(OT30和OT31以及OT32和OT33)进行扩增，得到2种DNA片段。另外，以pHKPsacB1(专利文献1所记载)为模板，利用引物OT34和OT35扩增载体片段。对所得到的PCR产物进行利用DpnI(Takara Bio)的处理。对于所得到的6种PCR产物，使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(Takara Bio)，对各DNA片段进行纯化，利用In-Fusion HD Cloning Kit(Takara Bio)进行连接，从而制作质粒pHKPsacB_cg0620-Ptu-hfm145VF-hfm145VFopt。使用所得到的质粒溶液，转化成ECOS Competent E.Coli DH5α株(Nippon Gene Co.,Ltd.)，将细胞液涂布于含有卡那霉素的LB琼脂培养基，在37℃下静置一晩。将具有质粒的转化体接种于含有卡那霉素的LB液体培养基2mL，在37℃下培养一晩。从该培养液中，使用NucleoSpin PlasmidEasyPure(TaKaRa公司)进行质粒的纯化，得到pHKPsacB_cg0620-Ptu-hfm145VF-hfm145VFopt。
2)具有3,4-二羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽基因导入株的制作
应用利用电穿孔(Bio-rad)的转化法，将上述的质粒pHKPsacB_cg0620-Ptu-hfm145VF-hfm145VFopt导入至CY44株(CY44株为日本专利6322576号公报的参考例14所记载的tkt株，通过利用tu启动子控制tkt基因的转录而强化了表达。另外，通过添加苯甲酸，能够诱导qsuB基因和vanR基因的转录。并且，aroE3基因被VanR抑制子控制。)，以卡那霉素抗性进行选择，由此获得KC148sr株。通过使用引物OT20和OT36的引物的PCR法(SapphireAmp(Takara Bio))对KC148sr株进行分析，得到了如预想的结果，因此，确认了KC148sr株为质粒pHKPsacB_cg0620-Ptu-hfm145VF-hfm145VFopt导入cg0620基因区域而成的一次交叉型同源重组体。
将KC148sr株在1mL的LB液体培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠)中培养24小时，将培养液的一部分在含有20％蔗糖的LB琼脂培养基上进行涂抹培养，由此得到KC148株。通过使用引物OT36和OT37的引物的PCR法(Sapphire Amp(Takara Bio))，确认了KC148株如预想那样为Ptu-hfm145VF-hfm145VFop基因导入至cg0620基因区域而成的二次交叉型同源重组体。
(2)mdh破坏株的制作
1)用于破坏mdh(cg2613)基因的质粒的制作
PCR用酶使用了PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa公司)。以pHKPsacB1(日本专利6322576号公报所记载)为模板，利用引物pHKPsacB-F2和pHKPsacB-R2扩增载体片段。以ATCC13032株(＝NBRC 12168株)的基因组DNA为模板，利用引物2613-up-F和2613-up-R进行扩增，得到cg2613基因的5’侧的DNA片段，并且以基因组DNA为模板，利用引物2613-down-F和2613-down-R进行扩增，得到cg2613基因的3’侧的DNA片段。对所得到的PCR产物进行利用DpnI(Takara Bio)的处理。对于所得到的3种PCR产物，使用NucleoSpin Gel andPCR Clean-up(Takara Bio)对各DNA片段进行纯化后，利用In-Fusion HD cloning kit(clontech公司)进行连接，制作pHKBsacB-Δmdh。使用所得到的质粒溶液，转化成ECOSCompetent E.Coli DH5α株(Nippon Gene Co.,Ltd.)，将细胞液涂布于含有卡那霉素的LB琼脂培养基，在37℃下静置一晩。以所得到的菌落为模板，使用Sapphire Amp(TaKaRa公司)作为酶，进行菌落PCR。引物使用2613-up-F和2613-down-R，确认目标DNA片段的导入。将具有确认导入了基因的质粒的转化体接种于含有卡那霉素的LB液体培养基2mL中，在37℃下培养一晩。从该培养液中，使用NucleoSpin Plasmid EasyPure(TaKaRa公司)进行质粒的纯化，得到pHKBsacB-Δmdh。
2)mdh基因(cg2613)的破坏株的获得
使用上述所得到的质粒pHKBsacB-Δmdh，利用电穿孔法(Bio-rad)转化成KC148。以卡那霉素抗性进行选择，由此获得KC148Δmdh-sr。以所得到的菌落为模板，使用引物sacB-1和2613-up1500进行PCR(Sapphire Amp)，得到了如预想的结果，因此，确认了通过一次交叉型同源重组，将质粒pHKBsacB-Δmdh导入到cg2613基因区域内。将KC148Δmdh-sr在1mL的LB液体培养基中培养24小时，将培养液的一部分在含有20％蔗糖的LB琼脂培养基上进行涂抹培养，由此得到KC148Δmdh株。利用使用了引物2613-coloP-F和2613-coloP-R的菌落PCR(Sapphire Amp)，确认了mdh基因(cg2613)由于二次交叉型同源重组而缺失。同时，确认了卡那霉素抗性基因和sacB基因也缺失。
[表1]
引物名称 序列 序列号
OT20 AAAACGACGGCCAGTCAAATACGGCGCAGCCATCC 4
OT21 GGACCGAAACGATCTGTTTTATCCAGCCTGACAAA 5
OT23 CCGGCCCACGTGGCCATCTGGCTAGGGCAAAATCA 6
OT24 ATCCTCTAGAGTCGAGACCACAAGAATTCCAAAAC 7
OT26 GGCCAGCTGGGCCATTTAAA 8
OT27 TTAATTAATTCCTCCTTTTATATTATTCAT 9
OT30 GGAGGAATTAATTAAATGAATCATGTACCAGTGGC 10
OT31 AAATTTAAACCTCCTTATACTTCGAAGCGTGGTA 11
OT32 GGAGGTTTAAATTTATGAATCATGTACCGGTCGC 12
OT33 GTGCCTCGGGTCTAAGGCCACGTGGGCCGGCGCGC 13
OT34 TCGACTCTAGAGGATCTACT 14
OT35 ACTGGCCGTCGTTTTACAAC 15
OT36 GCACAGCCGTAGAAATC 16
OT37 CGAAATCTCAGTTGGAGG 17
pHKPsacB-F2 CTCGACTCTAGAGGATCTACTAGTCATATGGA 18
pHKPsacB-R2 CTGCCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTC 19
2613-up-F CATGCCTGCAGGCAGTGCCAGAATTTTGAATATTTGAGGTCAAG 20
2613-up-R GTTAAAGATAAACAATCCTCAATCCTTGTAGGGGGTCCTCTAAG 21
2613-down-F TTGTTTATCTTTAACGCATGACTTCGCTTTTCGACGCCCCAACC 22
2613-down-R TCCTCTAGAGTCGAGGCTGACCCTTCCTCTGGTTTCCACCTAAG 23
sacB-1 ATAGTTTGCGACAGTGCCGTCAGCG 24
2613-up1500 CGATGTTCCCTGGGGCTCCAAAGGCGCC 25
2613-coloP-F CATGCGCTTGGACATGCCAGATGCCTTCGC 26
2613-coloP-R TAAATCCACGCTGGGTCATCTGCTCAAGCA 27
(3)没食子酸的生产率的评价
将KC148和KC148Δmdh株在LB板上画线，在30℃下培养2日。向表2所示的CGXII培养基中添加苯甲酸钠，使其最终浓度成为1mM，在圆底Spitz(荣研化学)中加入1.5mL。将KC148和KC148Δmdh的菌落植菌，以32℃、200rpm进行24小时振荡培养，对没食子酸的生产率进行评价。将培养液用稀硫酸适当稀释，通过离心除去菌体后，回收上清液。对上清液中的葡萄糖浓度和没食子酸浓度进行定量。将结果示于表3。与KC148株相比，在KC148Δmdh株中，相对于消耗糖的没食子酸收率提高至1.4倍。
[表2]
[表3]
相对于消耗糖的收率(％：g/g)
KC148 1.55
KC148Δmdh 2.19
参考例1没食子酸、对氨基苯甲酸和葡萄糖的定量
1)分析条件
对于所回收的上清液，使用AcroPrep 96孔过滤板(0.2μmGHP膜、Nihon PallLtd.)，进行不溶物的除去，将反应液供于HPLC。
HPLC的装置使用Chromaster(Hitachi High-Tech Science Corporation)。在没食子酸和对氨基苯甲酸的分析中，使用L-柱ODS(4.6mm I.D.×150mm、化学物质评价研究机构)，将洗脱液A设为0.1M磷酸二氢钾的0.1％磷酸溶液，将洗脱液B设为70％甲醇，在流速1.0mL/分钟、柱温度40℃的条件下进行梯度洗脱。在没食子酸和对氨基苯甲酸的检测中，使用UV检测器(检测波长210和280nm)。
在葡萄糖的分析中，使用ICsep ION-300(7.8mm×300mm、东京化成工业)，将洗脱液设为37mM硫酸溶液，在流速0.5mL/分钟、柱温度50℃的条件下进行检测。在葡萄糖的检测中，使用RI。
比较例
(1)棒状菌的具有苹果酸脱氢酶(mdh)活性的基因的提取
从数据库(KEGG:Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,https://www.genome.jp/kegg-bin/show_organism？org＝T00244)中提取cg2613以外的具有mdh活性的基因，得到cg763(序列号28)和cg2192(序列号29)。
(2)cg763破坏株的制作
1)用于破坏cg763基因的质粒的制作
与实施例(2)1)同样地进行。即，在cg763基因的5’侧的DNA片段的扩增中，使用引物763-up-F和763-up-R，在cg2613基因的3’侧的DNA片段的扩增中，使用引物763-down-F和763-down-R。使用这两个片段和实施例(2)1)所记载的载体片段，制作质粒pHKBsacB-Δcg763。菌落PCR中，引物使用763-up-F和763-down-R。
2)cg763基因的破坏株的获得
使用(2)1)中所得到的质粒，与实施例(2)2)同样地进行。在确认KC148Δcg763-sr株的PCR中，使用引物sacB-1和763-up1500。在确认KC148Δcg763株的PCR中，使用引物763-coloP-F和763-coloP-R。
(3)cg2192破坏株的制作
1)用于破坏cg2192基因的质粒的制作
与实施例(2)1)同样地进行。即，在cg2192基因的5’侧的DNA片段的扩增中，使用引物2192-up-F和2192-up-R，在cg2192基因的3’侧的DNA片段的扩增中，使用引物2192-down-F和2192-down-R。使用这两个片段和实施例(2)1)所记载的载体片段，制作质粒pHKBsacB-Δcg2192。在菌落PCR中，引物使用2192-up-F和2192-down-R。
2)cg2192基因的破坏株的获得
使用(3)1)中所得到的质粒，与实施例(2)2)同样地进行。在确认KC148Δcg2192-sr株的PCR中，使用引物sacB-1和2192-up1500。在确认KC148Δcg2192株的PCR中，使用引物2192-coloP-F和2192-coloP-R。
[表4]
引物名称 序列 序列号
763-up-F CATGCCTGCAGGCAGCGCCATCGCTTTGGCGGTCATCGTCCTCG 30
763-up-R CGCGCAGAGAATCCCTCAATTCGGTTTAGGTATACCGAAATGTA 31
763-down-F GGGATTCTCTGCGCGTTAAACCTGGCCATCTAGAGGAATTCCTC 32
763-down-R TCCTCTAGAGTCGAGTCAGTCGCCGAAAACCTGCTGTCTATGGT 33
763-up1500 TCCGCGGTGGTTACCTTCTGGAACTCC 34
763-coloP-F AGCGAGTAAATCACCGCGTATCTTTGGTGA 35
763-coloP-R CCCTGCCTACCACCTGCTCGGTTTCCCGGT 36
2192-up-F CATGCCTGCAGGCAGTCCGTATGCTCCCAAACCTCCGCCTGGGA 37
2192-up-R TAGAAGATGTTCAACTTCCTTTTATCTCCGCGAGTTCTCTGCCG 38
2192-down-F GTTGAACATCTTCTAACTGCTTTCTTTAAAGCACCCGCACATGT 39
2192-down-R TCCTCTAGAGTCGAGAACTGCCGAGAGTGCATTCCAGATGGCAT 40
2192-up1500 TAACTGGTGCTTTGTCGTCCACGTATC 41
2192-coloP-F ACAACCGTTGTCACAACATCTGTTTCATTA 42
2192-coloP-R TGAAGCTGATCGATGGGTTGGGAGTGAACT 43
(4)没食子酸的生产率的评价
按照与实施例(3)相同的方法，对KC148、KC148Δ763和KC148Δ2192株进行评价。将结果示于表5。与KC148株相比，在KC148Δ763株中，相对于消耗糖的没食子酸收率降低至0.91倍，在KC148Δ2192株中，降低至0.71倍。
[表5]
相对于消耗糖的收率(％：g/g)
KC148 1.55
KC148Δ763 1.41
KC148Δ2192 1.10

Claims (10)

1.一种芳香族化合物或其盐的制造方法，其中，
包括对抑制了下述(a)或(b)所示的mdh基因的功能的突变棒状菌进行培养的工序，
(a)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
(b)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％以上的同一性的核苷酸序列构成，并且编码具有苹果酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中，
芳香族化合物为没食子酸、原儿茶酸、儿茶酚、L-DOPA、2,4-吡啶二羧酸、2,5-吡啶二羧酸或它们的盐。
3.如权利要求1所述的方法，其中，
芳香族化合物为没食子酸或其盐。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
mdh基因的功能抑制是mdh基因的表达抑制或mdh基因所编码的蛋白质的活性抑制。
5.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
mdh基因的功能抑制是通过mdh基因的缺失或钝化而实现的。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，
棒状菌为谷氨酸棒状杆菌、高效棒状杆菌、产氨棒状杆菌、耐盐棒状杆菌、解烷棒状杆菌或帚石南棒状杆菌。
7.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，
棒状菌为谷氨酸棒状杆菌。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，
利用含有糖类作为碳源的培养基进行培养。
9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，
包括从所述培养物中回收芳香族化合物或其盐的工序。
10.一种突变棒状菌，其中，
抑制了下述(a)或(b)所示的mdh基因的功能，
(a)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
(b)由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％以上的同一性的核苷酸序列构成，并且编码具有苹果酸脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
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