CN118355124A - 芳香族化合物的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种使用能够生产芳香族化合物或其盐的转化细胞制造芳香族化合物或其盐的方法、以及该转化细胞。该芳香族化合物或其盐的制造方法包括：培养下述(A)或(B)所示的多次跨膜型多肽的表达被强化的转化细胞的工序。(A)由序列编号2所示的氨基酸序列构成的多肽；(B)由与序列编号2所示的氨基酸序列具有至少76％的同一性的氨基酸序列构成的多肽。
Description
技术领域
本发明涉及一种使用了具有芳香族化合物生产能力的转化细胞的芳香族化合物的制造方法和该细胞。
背景技术
近年来，希望使用微生物从廉价原料的葡萄糖生产以没食子酸为代表的有用的芳香族化合物。其中，棒状菌(谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum))是用于各种氨基酸、核酸生产中的有用的工业微生物，近年来，还确立了以棒状菌为对象的基因重组技术，能够生产酪氨酸或色氨酸这样的芳香族氨基酸(非专利文献1)或没食子酸、4-羟基苯甲酸(非专利文献1)、4-氨基苯甲酸(非专利文献2)等的芳香族化合物等多种多样的有机化合物。其中，没食子酸由于还原性强，所以被用于照片的显影剂和蓝色油墨的制造原料等，另外，没食子酸丙酯等的酯被用作油脂或黄油的抗氧化剂。此外，将没食子酸脱羧合成的焦性没食子酸被用作电子材料、有机合成试剂、照片的显影液、毛织物的媒染剂等，因此高效地生产没食子酸是有益的。
莽草酸途径是植物或微生物生物合成芳香族化合物的重要的代谢途径。即，由糖酵解体系制得的磷酸烯醇丙酮酸与由戊糖磷酸途径供给的赤藓糖4-磷酸结合，形成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)，经由3-脱氢奎尼酸(DHQ)、3-脱氢莽草酸(DHS)形成莽草酸。此外，莽草酸从腺苷三磷酸转移磷酸基，成为3-磷酸莽草酸，经由3-磷酸烯醇丙酮酰莽草酸，形成分支酸。在莽草酸途径中，形成碳6元环后，进行双键的形成，由衍生自DHS的原儿茶酸，生产没食子酸、2,4-吡啶二羧酸(2,4-PDCA)、2,5-吡啶二羧酸(2,5-PDCA)、儿茶酚、L-DOPA等的芳香族化合物(图1)。
另一方面，虽然报道了属于MFS家族(易化因子超家族，majorfacilitatorsuperfamily)的多次跨膜型多肽中包括参与抗应激和抗性的蛋白质(专利文献1)，但是并不知晓这些蛋白质会提高芳香族化合物的生产率。
[专利文献1]美国专利第6,822,084号说明书
[非专利文献1]Metab.Eng.2018.50:122-141.
[非专利文献2]Metab.Eng.2016.38:322-330.
发明内容
本发明涉及以下的方案。
1)一种芳香族化合物或其盐的制造方法，其包括：培养下述(A)或(B)所示的多次跨膜型多肽的表达被强化的转化细胞的工序，
(A)由序列编号2所示的氨基酸序列构成的多肽；
(B)由与序列编号2所示的氨基酸序列具有至少76％的同一性的氨基酸序列构成的多肽。
2)一种下述(A)或(B)所示的多次跨膜型多肽的表达被强化的转化细胞，其以提高了3-脱氢莽草酸生产活性的微生物细胞为宿主，
(A)由序列编号2所示的氨基酸序列构成的多肽；
(B)由与序列编号2所示的氨基酸序列具有至少76％的同一性的氨基酸序列构成的多肽。
附图说明
图1是表示作为宿主使用了棒状菌时的各种芳香族化合物的生产途径的示意图。图中，aroG和aroF为2-脱氢-3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸醛缩酶(2-dehydro-3-deoxy-D-arabino-heptonate aldolase)，aroB为3-脱氢奎尼酸合成酶，aroD和qsuC为脱氢奎尼酸脱水酶，qsuD为奎尼酸/莽草酸脱氢酶，aroE3为莽草酸脱氢酶且hfm145为3,4-二羟基苯甲酸羟化酶，qsuB为脱氢莽草酸脱水酶，aroA为5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，aroC为分支酸合成酶，而且aroK为莽草酸激酶。
图2是通过细胞跨膜区域预测程序得到的分析结果。
具体实施方式
本发明涉及提供一种使用能够生产芳香族化合物或其盐的转化细胞制造芳香族化合物或其盐的方法、以及该转化细胞。
本发明者们发现：在属于MFS家族(major facilitator superfamily)的多次跨膜型多肽的表达被强化的转化细胞中，以没食子酸为代表的芳香族化合物的生产率提高，通过使用该转化细胞，能够高效地制造芳香族化合物或其盐。
根据本发明，能够通过环境负荷小的发酵法，高效地制造如原儿茶酸、没食子酸、2,4-吡啶二羧酸、2,5-吡啶二羧酸、儿茶酚、L-DOPA、4-羟基苯甲酸、4-氨基苯甲酸这样的芳香族化合物或其盐。
在本发明中，氨基酸序列或核苷酸序列的同一性通过利普曼-皮尔森(Lipman-Pearson)法(Science,1985,227:1435-1441)计算。具体而言，通过使用遗传信息处理软件GENETYX Ver.12的同源性分析(Search homology)程序，将Unit size to compare(ktup)设为2进行分析来算出。
在本发明中，“缺失、取代、添加或插入1个或多个氨基酸的氨基酸序列”是指缺失、取代、添加或插入1个以上10个以下、优选为1个以上8个以下、更优选为1个以上5个以下、进一步优选为1个以上3个以下的氨基酸的氨基酸序列。另外，“缺失、取代、添加或插入1个或多个核苷酸的核苷酸序列”是指缺失、取代、添加或插入1个以上30个以下、优选为1个以上24个以下、更优选为1个以上15个以下、进一步更优选为1个以上9个以下的核苷酸的核苷酸序列。在本发明中，氨基酸或核苷酸的“添加”包括向序列的一个末端和两个末端添加氨基酸或核苷酸。
在本发明中，控制区域与基因的“能够工作的连接”是指基因与控制区域以该基因在该控制区域的控制下能够表达的方式连接。基因与控制区域的“能够工作的连接”的步骤是本领域技术人员所公知的。
在本发明中，对细胞的功能或性状、特性所使用的术语“内源”是用于表示该功能、性状、特性存在于该细胞的野生型。相对而言，术语“外源”是用于表示不是原本存在于该细胞，而是从外部导入的功能、性状、特性。例如，“外源”基因或多核苷酸是从外部导入细胞的基因或多核苷酸。外源基因或多核苷酸可以来自与导入其的细胞同种的生物，也可以来自不同种的生物(即异种基因或多核苷酸)。
在本发明中，芳香族化合物是在宿主细胞内生物合成的有机芳香族化合物，具体是指经由莽草酸途径合成的芳香族化合物，优选为由3-脱氢莽草酸(DHS)或分支酸衍生的芳香族化合物(图1)。
具体而言，可以列举：原儿茶酸、儿茶酚、没食子酸、苯丙氨酸、L-DOPA、酪氨酸、前酪氨酸、色氨酸、4-羟基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、2,3-二羟基苯甲酸、2,4-吡啶二羧酸、2,5-吡啶二羧酸、4-氨基-3-羟基苯甲酸等。
其中，优选衍生自DHS的原儿茶酸；衍生自原儿茶酸的没食子酸、2,4-吡啶二羧酸(2,4-PDCA)、2,5-吡啶二羧酸(2,5-PDCA)、儿茶酚、L-DOPA；衍生自分支酸的4-羟基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、4-氨基-3-羟基苯甲酸、酪氨酸、色氨酸等，更优选为原儿茶酸、衍生自原儿茶酸的芳香族化合物(优选为没食子酸、L-DOPA)、4-羟基苯甲酸、4-氨基-3-羟基苯甲酸，更优选为没食子酸。
作为该芳香族化合物的盐，能够列举碱加成盐、酸加成盐等。作为碱加成盐，可以列举例如：与钠、钾等碱金属的盐、与钙、镁等碱土金属的盐等，作为酸加成盐，可以列举例如：盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等无机酸盐等。
在本发明中，转化细胞是下述(A)或(B)所示的多次跨膜型多肽的表达被强化的细胞。
(A)由序列编号2所示的氨基酸序列构成的多肽；
(B)由与序列编号2所示的氨基酸序列具有至少76％的同一性的氨基酸序列构成的多肽。
在此，(A)由序列编号2所示的氨基酸序列构成的多肽是指来自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的属于MFS家族的膜转运蛋白(在本发明中，称为“GALT0”)。
在(B)的多肽中，与序列编号2所示的氨基酸序列的同一性至少为76％、优选为70％以上、更优选为80％以上、更优选为85％以上、更优选为90％以上、更优选为95％以上、更优选为96％以上、更优选为97％以上、更优选为98％以上、更优选为99％以上。
作为与序列编号2所示的氨基酸序列具有至少76％的同一性的氨基酸序列的例子，可以列举对于序列编号2所示的氨基酸序列缺失、取代、添加或插入1个或多个氨基酸的氨基酸序列。
(A)和(B)的多肽如后述的参考例所示，通过利用了细胞跨膜区域预测程序的分析确认具有多个跨膜螺旋结构，能够推测是“多次跨膜型多肽(Multiple transmembranepolypeptide)”。在此，作为细胞跨膜区域预测程序的例子，可以列举：TMHMM Server，v.2.0(Journal of Molecular Biology,2001,305:567-580)、DAS-TMfilter(Protein Eng.,2002,Volume15,Issue9:745-752)、PRED-TMR2(Protein Eng.,1999,Volume12,Issue8:631-634)等的使用预测方法的分析程序。
如后述的实施例所示，在以能够表达的方式导入了编码(A)和(B)的多肽的多核苷酸的细胞中，没食子酸、原儿茶酸这样的芳香族化合物的生产率提高。因此，(A)和(B)所示的多次跨膜型多肽被认为具有与该芳香族化合物或其盐的输送相关的转运子活性(称为“芳香族化合物转运子活性”)。
作为(B)的由与序列编号2所示的氨基酸序列具有至少76％的同一性的氨基酸序列构成的多次跨膜型多肽，可以列举例如以下的(B1)～(B3)的多肽。
(B1)由序列编号4所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有90％以上、优选为92％以上、更优选为95％以上、更优选为97％以上、更优选为98％以上、更优选为99％以上的同一性的氨基酸序列构成的多肽；
(B2)由序列编号6所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有90％以上、优选为92％以上、更优选为95％以上、更优选为97％以上、更优选为98％以上、更优选为99％以上的同一性的氨基酸序列构成的多肽；
(B3)由序列编号8所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有90％以上、优选为92％以上、更优选为95％以上、更优选为97％以上、更优选为98％以上、更优选为99％以上的同一性的氨基酸序列构成的多肽。
在此，由序列编号4所示的氨基酸序列构成的多肽为来自钝齿棒状杆菌(Corynebacterium crenatum)的膜转运蛋白，在本发明中称为“GALT1”。GALT1和GALT0的氨基酸序列的同一性为98％。
由序列编号6所示的氨基酸序列构成的多肽为来自谷氨酸棒状杆菌的膜转运蛋白，在本发明中，称为“GALT2”。GALT2和GALT0的氨基酸序列的同一性为90％。
由序列编号8所示的氨基酸序列构成的多肽为来自克氏棒状杆菌(Corynebacterium crudilactis)的膜转运蛋白，在本发明中，称为“GALT3”。GALT3和GALT0的氨基酸序列的同一性为85.4％。
此外，作为属于MFS家族的膜转运蛋白，除此以外还已知有与GALT0的氨基酸序列的同一性为75.5％的来自帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae DSM 20147)的多肽(“GALT4”；氨基酸序列：序列编号10、核苷酸序列：序列编号9)。
作为对上述多肽的氨基酸序列导入氨基酸的缺失、取代、添加或插入等突变的方法，可以列举例如对编码该氨基酸序列的核苷酸序列导入核苷酸的缺失、取代、添加或插入等突变的方法。作为向核苷酸序列导入突变的方法，可以列举例如：甲磺酸乙酯、N-甲基-N-亚硝基胍、亚硝酸等的化学突变原或紫外线、X射线、伽马射线、离子束等的物理突变原造成的诱变、定点突变法、Dieffenbach等(Cold Spring Harbar Laboratory Press,New York,581-621,1995)所记载的方法等。作为定点突变的方法，可以列举利用重叠延伸拼接(Splicing overlap extension，SOE)PCR(Horton et al.,Gene 77,61-68,1989)的方法、ODA法(Hashimoto-Gotoh et al.,Gene,152,271-276,1995)、Kunkel法(Kunkel,T.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1985,82,488)等。或者，也可以利用Site-DirectedMutagenesis System Mutan-SuperExpress Km试剂盒(Takara Bio Inc.)、TransformerTMSite-Directed Mutagenesis试剂盒(Clonetech公司)、KOD-Plus-Mutagenesis Kit(东洋纺织)等市售的定点突变用试剂盒。
在本发明中，上述(A)或(B)所示的多肽的表达被强化的转化细胞中，除了增加了该多肽的表达量的细胞以外，还包括：该多肽的活性(芳香族化合物转运子活性)被增强的细胞。该转化细胞具体而言，为以能够表达的方式导入了该多肽的表达所需要的多核苷酸的细胞，该多肽可以是外源的多肽，也可以是该细胞本来具有的多肽。例如，可以列举以能够表达的方式导入了该多核苷酸的细胞、该多核苷酸的表达的程度被增强的细胞。具体而言，可以列举：导入了包含该多核苷酸和与其以能够工作的方式连接的控制区域的载体或DNA片段的细胞、该多核苷酸的控制区域被替换成后述的高表达启动子或诱导启动子等强控制区域的细胞等。
在此，作为多核苷酸，可以列举编码上述(A)或(B)所示的多次跨膜型多肽的多核苷酸，优选可以列举下述(a)或(b)的多核苷酸(将这些多核苷酸也称为“本发明的多核苷酸”)。
(a)由序列编号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
(b)由与序列编号1所示的核苷酸序列具有至少76％的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸。
在此，(a)由序列编号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸是指编码上述的多次跨膜型多肽GALT0的基因(cg3038)。
在(b)的多核苷酸中，与序列编号1所示的核苷酸序列的同一性至少为76％、优选为80％以上、更优选为85％以上、更优选为90％以上、更优选为95％以上、更优选为96％以上、更优选为97％以上、更优选为98％以上、更优选为99％以上。
作为与序列编号1所示的核苷酸序列具有至少76％的同一性的核苷酸序列的例子，可以列举对序列编号1所示的核苷酸序列缺失、取代、添加或插入了1个或多个核苷酸的核苷酸序列。作为对核苷酸序列导入核苷酸的缺失、取代、添加或插入等突变的方法如上所述。上述多核苷酸可以为单链或双链的形态，或者可以为DNA、也可以为RNA。该DNA可以为cDNA、化学合成DNA等的人工DNA。
作为(b)的由与序列编号1所示的核苷酸序列具有至少76％的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸，可以列举例以下的(b1)～(b3)的多核苷酸。
(b1)由序列编号3所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有90％以上、优选为92％以上、更优选为95％以上、更优选为97％以上、更优选为98％以上、更优选为99％以上的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸；
(b2)由序列编号5所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有90％以上、优选为92％以上、更优选为95％以上、更优选为97％以上、更优选为98％以上、更优选为99％以上的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸；
(b3)由序列编号7所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有90％以上、优选为92％以上、更优选为95％以上、更优选为97％以上、更优选为98％以上、更优选为99％以上的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸。
在此，由序列编号3所示的核苷酸酸序列构成的多核苷酸为编码上述GALT1的多核苷酸，由序列编号5所示的核苷酸序列构成的多核苷酸为编码上述GALT2的多核苷酸，由序列编号7所示的核苷酸序列构成的多核苷酸为编码上述GALT3的多核苷酸。
上述多核苷酸可以引入载体中。优选含有本发明的多核苷酸的载体为表达载体。另外，优选该载体是能够将本发明的多核苷酸导入宿主微生物、且能够在宿主微生物内表达该多核苷酸的表达载体。优选该载体包含本发明的多核苷酸、以及与其以能够工作的方式连接的控制区域。该载体可以是质粒等在染色体外能够自我增殖和复制的载体，或者也可以是引入染色体内的载体。
作为具体的载体的例子，可以列举例如：pBluescript II SK(-)(Stratagene)、pUC18/19、pUC118/119等pUC系列载体(Takara Bio)、pET系列载体(Takara Bio)、pGEX系列载体(GE Healthcare)、pCold系列载体(Takara Bio)、pHY300PLK(Takara Bio)、pUB110(Mckenzie,T.et al.,1986,Plasmid 15(2):93-103)、pBR322(Takara Bio)、pRS403(Stratagene)、pMW218/219(Nippon Gene)、pRI909/910等的pRI系列载体(Takara Bio)、pBI系列载体(Clontech)、IN3系列载体(Inplanta Innovations)、pPTR1/2(Takara Bio)、pDJB2(D.J.Ballance et al.,Gene,36,321-331,1985)、pAB4-1(van Hartingsveldt W etal.,Mol Gen Genet,206,71-75,1987)、pLeu4(M.I.G.Roncero et al.,Gene,84,335-343,1989)、pPyr225(C.D.Skory et al.,Mol Genet Genomics,268,397-406,2002)、pFG1(Gruber,F.et al.,Curr Genet,18,447-451,1990)等。
另外，上述多核苷酸也可以构建为包含其的DNA片段。作为该DNA片段，可以列举例如：PCR扩增DNA片段和限制性内切酶切断DNA片段。优选该DNA片段可以是包含本发明的多核苷酸、以及与其以能够工作的方式连接的控制区域的表达盒。
上述载体或DNA片段所含的控制区域是用于在导入了该载体或DNA片段的宿主细胞内表达本发明的多核苷酸的序列，可以列举例如启动子或终止子等的表达调节区域、复制起始点等。该控制区域的种类可以根据要导入载体或DNA片段的宿主微生物的种类适当选择。根据需要，该载体或DNA片段也可以还具有抗生素抗性基因、氨基酸合成相关基因等的选择标记。
载体或DNA片段向宿主细胞的导入中可以使用通常的转化法，例如电穿孔法、转化法、转染法、接合法、原生质体法、粒子枪法、农杆菌法等。
导入了目标的载体或DNA片段的转化细胞能够利用选择标记进行选择。例如，在选择标记为抗生素抗性基因的情况下，能够通过用该抗生素添加培养基培养，来选择导入了目标的载体或DNA片段的细胞。另外，例如，在选择标记为氨基酸合成相关基因的情况下，可以在该氨基酸要求性的宿主细胞中导入基因后，以该氨基酸要求性的有无为标准，选择导入了目标的载体或DNA片段的细胞。或者，也可以通过PCR等调查转化细胞的DNA序列，由此确认导入目标的载体或DNA片段的导入。
另外，作为强控制区域，可以例示：作为公知的高表达启动子的T7启动子、lac启动子、tac启动子、trp启动子、tu启动子、gap启动子等，但不特别限定于这些。
此外，作为强控制区域，能够使用来自原核生物的诱导启动子，可以例示通过添加阿魏酸、香草酸或香草醛来施加诱导的vanA(cg2616)启动子、通过添加间苯二酚或2,4-二羟基苯甲酸来施加诱导的rhcH启动子、通过添加4-羟基苯甲酸来施加诱导的pcaI启动子、通过添加3-羟基苯甲酸来施加诱导的nagI(cg3351)基因的启动子、通过添加苯甲酸来施加诱导的benA(cg2637)基因的启动子(以下，简称为Pben)、或者通过果糖或蔗糖的任意一者的添加来施加诱导的cg2118基因的启动子或ptsS(cg2925)基因的启动子等，但不特别限定于这些。
作为将宿主细胞的基因组上存在的上述多核苷酸的控制区域替换成强控制区域的方法，可以列举将包含强控制区域和选择标记的多核苷酸序列的DNA片段导入宿主细胞，选择通过同源重组或非同源重组等转化的细胞的方法等。
在本发明中，宿主细胞只要是适于芳香族化合物或其盐的生产的细胞即可，可以使用微生物细胞、植物细胞和动物细胞的任意细胞，优选为微生物细胞。
从芳香族化合物或其盐的生产效率的观点、特别是从原儿茶酸、没食子酸、莽草酸、2,4-吡啶二羧酸、2,5-吡啶二羧酸、儿茶酚、L-DOPA、分支酸、4-羟基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、4-氨基-3-羟基苯甲酸等3-脱氢莽草酸衍生的芳香族化合物或其盐的生产效率的观点考虑，宿主细胞更加优选使用提高了3-脱氢莽草酸生产活性的微生物细胞。
作为微生物细胞，可以使用大肠杆菌、枯草杆菌、放线菌、假单胞菌属细菌、链球菌属细菌、乳杆菌属细菌、真菌(链孢霉属、曲霉属、木霉属等)、酵母(酿酒酵母属、克鲁维氏酵母属、裂殖酵母属、耶氏酵母(Yarrowia)属、丝孢酵母属、红冬孢酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属等)等的任一种，优选为原核微生物细胞，更优选为革兰氏阳性细菌，进一步优选为放线菌。
作为放线菌，优选被定义为棒状菌的一群微生物(Bergey's Manual ofDeterminative Bacteriology,Vol.8,599(1974))，具体可以列举：棒状杆菌属菌、短杆菌属菌、节杆菌属菌、分枝杆菌属菌、红球菌属菌、链霉菌属菌、微球菌属菌等。
作为棒状杆菌属菌，可以列举：谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、高效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、产氨棒状杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、耐盐棒状杆菌(Corynebacterium halotolerance)、解烷棒状杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)、钝齿棒状杆菌(Corynebacterium crenatum)、克氏棒状杆菌(Corynebacteriumcrudilactis)、帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae)等。
作为短杆菌属菌，可以举出产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)等。
作为节杆菌属菌，可以举出球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)等。
作为分枝杆菌属菌，可以举出牛分枝杆菌等，作为微球菌属菌，可以举出费氏微球菌(Micrococcus freudenreichii)、藤黄微球菌(Micrococcus leuteus)、脲微球菌(Micrococcus ureae)、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)等。
棒状菌中，优选为棒状杆菌属菌，更优选为谷氨酸棒状杆菌。
上述微生物细胞可以为野生株，但也可以是其突变株或人工基因重组体。
作为3-脱氢莽草酸生产活性提高了的微生物细胞，可以列举用于生产3-脱氢莽草酸所需要的基因被强化的微生物细胞，具体而言，可以列举实施过下述的(i)、(ii)、(iii)和(iv)中任意1种以上的基因操作的微生物细胞，可以列举实施过优选为(i)、(ii)、(iii)和(iv)中任意2种以上、更优选为3种以上、更加优选为(i)、(ii)、(iii)和(iv)的全部的基因操作的微生物细胞。
在此，基因的强化包括将规定的基因以能够表达的状态导入、向规定的基因或该基因的控制区域导入突变等。
(i)选自脱氢莽草酸脱水酶基因、脱氢奎尼酸脱水酶基因、奎尼酸脱氢酶基因和莽草酸脱氢酶基因中的1种以上的基因的强化。
(ii)选自由2-脱氢-3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸醛缩酶基因、3-脱氢奎尼酸合成酶基因、莽草酸脱氢酶基因构成的与莽草酸合成路径相关的基因组中的1种以上的基因的强化；
(iii)选自由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因、6-磷酸葡糖酸内酯酶基因、磷酸葡糖酸脱氢酶基因、核糖-5-磷酸异构酶基因、核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶基因、转酮醇酶基因和转醛醇酶基因构成的与戊糖磷酸路径相关的基因组中的1种以上的基因的强化；
(iv)编码具有3,4-二羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽的基因的强化。
在所制作的转化体中，(A)或(B)所示的多次跨膜型多肽的表达被强化例如能够通过在该转化体中，与其宿主细胞(母细胞)相比编码该多肽的基因的转录量提高来进行确认。其中，基因的转录量可以通过利用定量PCR的mRNA量测定、利用新一代测序仪的RNA-Seq分析、DNA微阵列分析等来进行测定。
而且，通过培养所制作的转化细胞，评价芳香族化合物或其盐的生产率，选择合适的转化细胞，能够得到有用的芳香族化合物或其盐的生产细胞。产物的测定方法能够按照后述参考例中记载的方法进行。
本发明的芳香族化合物或其盐的制造方法通过培养上述转化细胞、优选为在糖类的存在下培养上述转化细胞，回收目标的芳香族化合物或其盐来实施。
作为糖类，优选葡萄糖，但除了可以使用果糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖等单糖类以外，还可以使用能够通过代谢生成葡萄糖的糖类。这样的糖类包括具有葡萄糖单元的寡糖或多糖类，可以列举纤维二糖、蔗糖(Sucrose)、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、木二糖等的二糖类；糊精或可溶性淀粉等的多糖类等。
另外，作为例如含有这些原料化合物的原料，也可以使用糖蜜。另外，还可以使用秸秆(水稻秸秆、大麦秸秆、小麦秸秆、黑麦秸秆、燕麦秸秆等)、蔗渣、玉米秸秆等的非可食农业废弃物；柳枝稷、象草、芒草等的能源作物；利用糖化酶等将木屑、废纸等糖化而成的含有葡萄糖等多种糖的糖化液。
培养转化细胞的培养基含有碳源、氮源、无机盐类等，只要是能够有效地进行本发明的转化细胞的培养的培养基，则可以使用天然培养基、合成培养基中的任意种。
作为碳源，可以使用上述的糖类或含有上述糖类的糖蜜或糖化液，除了上述糖类以外，还可以使用：如甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油这样的糖醇；如乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸这样的有机酸；如乙醇、丙醇这样的醇；如正链烷烃这样的烃等。碳源可以单独使用1种，或者将2种以上混合使用。
培养液中的作为原料化合物的糖类的浓度优选为1～20w/v％，更优选为2～10w/v％，进一步优选为2～5w/v％。
作为氮源，例如可以使用蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆粕碱抽提物、甲胺等的烷基胺类、氨基酸等的含氮有机化合物、氨或其盐(如氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵这样的无机或有机铵化合物)、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸钾等。
作为无机盐类，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。
另外，根据需要，也可以添加维生素类或消泡剂等。作为维生素类，可以列举：生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、烟酸等。
作为棒状菌用培养基，可以列举：A培养基〔J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)〕、BT培养基〔J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)〕、CGXII培养基〔日本专利第6322576号〕等，在这些培养基中，使糖类浓度成为上述范围再使用即可。
此外，在含有糖类的反应或培养之前，优选利用相同的培养基，对转化体在好氧条件下，以温度约25～38℃培养约12～48小时，使其增殖。
培养温度或反应温度优选为15～45℃，更优选为25～37℃。
另外，培养或反应时间为24小时～168小时、优选为24小时～96小时、更优选为24小时～72小时，根据需要可以一边搅拌或振荡一边进行。另外，在培养中，根据需要也可以在培养基中添加氨苄西林或卡那霉素等的抗生素。
培养可以为间歇式、流加式、连续式中的任意方式。其中，优选间歇式。
培养或反应可以在好氧的条件下进行，也可以在还原条件下进行，优选在好氧的条件下进行。
在好氧的条件下进行反应或培养的情况下，从芳香族化合物或其盐的生成效率的观点考虑，优选在抑制转化体的过度增殖的条件下进行。
在芳香族化合物容易受到氧化的情况下，培养优选在溶存氧浓度低的条件下进行。例如在没食子酸的制造中，具体而言，溶存氧浓度优选为0.1～3ppm，更优选为0.1～1ppm。
芳香族化合物或其盐从培养物的回收和纯化方法没有特别限制。即，可以通过将公知的离子交换树脂法、沉淀法、晶析法、重结晶法、浓缩法、其他方法组合来实施。例如，只要在将菌体通过离心分离等除去后，用阳离子和阴离子交换树脂将离子性的物质除去，进行浓缩，则能够获得芳香族化合物或其盐。培养物中蓄积的芳香族化合物或其盐可以不进行分离而直接使用。
关于上述实施方式，在本发明中进一步公开以下的方式。
＜1＞一种芳香族化合物或其盐的制造方法，其包括培养下述(A)或(B)所示的多次跨膜型多肽的表达被强化的转化细胞的工序，
(A)由序列编号2所示的氨基酸序列构成的多肽；
(B)由与序列编号2所示的氨基酸序列具有至少76％的同一性的氨基酸序列构成的多肽。
＜2＞如＜1＞所述的方法，其中，所述(B)的由与序列编号2所示的氨基酸序列具有至少76％的同一性的氨基酸序列构成的多肽为以下的(B1)～(B3)所示的多肽，
(B1)由序列编号4所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成的多肽；
(B2)由序列编号6所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成的多肽；
(B3)由序列编号8所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成的多肽。
＜3＞如＜1＞或＜2＞所述的方法，其中，以能够表达的状态包含编码所述(A)或(B)所示的多次跨膜型多肽的多核苷酸。
＜4＞如＜3＞所述的方法，其中，编码(A)或(B)所示的多次跨膜型多肽的多核苷酸为下述(a)或(b)所示的多核苷酸，
(a)由序列编号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
(b)由与序列编号1所示的核苷酸序列具有至少76％的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸。
＜5＞如＜4＞所述的方法，其中，(b)由与序列编号1所示的核苷酸序列具有至少76％的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸为下述(b1)～(b3)所示的多核苷酸，
(b1)由序列编号3所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有90％以上的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸；
(b2)由序列编号5所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有90％以上的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸；
(b3)由序列编号7所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有90％以上的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸。
＜6＞如＜1＞～＜5＞中任一项所述的方法，其中，在糖类的存在下进行培养。
＜7＞如＜1＞～＜6＞中任一项所述的方法，其中，转化细胞的宿主为提高了3-脱氢莽草酸生产活性的微生物细胞。
＜8＞如＜7＞所述的方法，其中，提高了3-脱氢莽草酸生产活性的微生物细胞为实施过下述的(i)、(ii)、(iii)和(iv)中任意一种以上的基因操作的细胞，
(i)选自脱氢莽草酸脱水酶基因、脱氢奎尼酸脱水酶基因、奎尼酸脱氢酶基因和莽草酸脱氢酶基因中的1种以上的基因的强化；
(ii)选自由2-脱氢-3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸醛缩酶基因、3-脱氢奎尼酸合成酶基因、莽草酸脱氢酶基因构成的与莽草酸合成路径相关的基因组中的1种以上的基因的强化；
(iii)选自由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因、6-磷酸葡糖酸内酯酶基因、磷酸葡糖酸脱氢酶基因、核糖-5-磷酸异构酶基因、核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶基因、转酮醇酶基因和转醛醇酶基因构成的与戊糖磷酸路径相关的基因组中的1种以上的基因的强化；
(iv)编码具有3,4-二羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽的基因的强化。
＜9＞如＜8＞所述的方法，其中，提高了3-脱氢莽草酸生产活性的微生物细胞为实施过上述(i)、(ii)、(iii)和(iv)中任意2种以上的基因操作的微生物细胞。
＜10＞如＜8＞所述的方法，其中，提高了3-脱氢莽草酸生产活性的微生物细胞为实施过上述(i)、(ii)、(iii)和(iv)中任意3种以上的基因操作的微生物细胞。
＜11＞如＜8＞所述的方法，其中，提高了3-脱氢莽草酸生产活性的微生物细胞是实施过上述(i)、(ii)、(iii)和(iv)的基因操作的微生物细胞。
＜12＞如＜7＞～＜11＞中任一项所述的方法，其中，微生物细胞为棒状菌。
＜13＞如＜12＞所述的方法，其中，棒状菌为棒状杆菌属细菌。
＜14＞如＜13＞所述的方法，其中，棒状杆菌属细菌为谷氨酸棒状杆菌、高效棒状杆菌、产氨棒状杆菌、耐盐棒状杆菌、解烷棒状杆菌、钝齿棒状杆菌、克氏棒状杆菌或帚石南棒状杆菌。
＜15＞如＜13＞所述的方法，其中，棒状杆菌属细菌为谷氨酸棒状杆菌。
＜16＞如＜1＞～＜15＞中任一项所述的方法，其中，芳香族化合物或其盐为自3-脱氢莽草酸衍生的芳香族化合物或其盐。
＜17＞如＜16＞所述的方法，其中，芳香族化合物或其盐为没食子酸、原儿茶酸、儿茶酚、L-DOPA、2,4-吡啶二羧酸、2,5-吡啶二羧酸、4-羟基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、4-氨基-3-羟基苯甲酸、或它们的盐。
＜18＞如＜15＞所述的方法，其中，芳香族化合物或其盐为没食子酸、原儿茶酸、L-DOPA、4-羟基苯甲酸、4-氨基-3-羟基苯甲酸、或它们的盐。
＜19＞如＜18＞所述的方法，其中，芳香族化合物或其盐为没食子酸、原儿茶酸、或它们的盐。
＜20＞一种下述(A)或(B)所示的多次跨膜型多肽的表达被强化的转化细胞，其以提高了3-脱氢莽草酸生产活性的微生物细胞为宿主，
(A)由序列编号2所示的氨基酸序列构成的多肽；
(B)由与序列编号2所示的氨基酸序列具有至少76％的同一性的氨基酸序列构成的多肽。
＜21＞如＜20＞所述的转化细胞，其中，提高了3-脱氢莽草酸生产活性的微生物细胞为实施过下述的(i)、(ii)、(iii)和(iv)中任意1种以上的基因操作的细胞，
(i)选自脱氢莽草酸脱水酶基因、脱氢奎尼酸脱水酶基因、奎尼酸脱氢酶基因和莽草酸脱氢酶基因中的1种以上的基因的强化；
(ii)选自由2-脱氢-3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸醛缩酶基因、3-脱氢奎尼酸合成酶基因、莽草酸脱氢酶基因构成的与莽草酸合成路径相关的基因组中的1种以上的基因的强化；
(iii)选自由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因、6-磷酸葡糖酸内酯酶基因、磷酸葡糖酸脱氢酶基因、核糖-5-磷酸异构酶基因、核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶基因、转酮醇酶基因和转醛醇酶基因构成的与戊糖磷酸路径相关的基因组中的1种以上的基因的强化；
(iv)编码具有3,4-二羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽的基因的强化。
＜22＞如＜21＞所述的转化细胞，其中，提高了3-脱氢莽草酸生产活性的微生物细胞为实施过上述(i)、(ii)、(iii)和(iv)中任意2种以上的基因操作的微生物细胞。
＜23＞如＜21＞所述的转化细胞，其中，提高了3-脱氢莽草酸生产活性的微生物细胞为实施过上述(i)、(ii)、(iii)和(iv)中任意3种以上的基因操作的微生物细胞。
＜24＞如＜21＞所述的转化细胞，其中，提高了3-脱氢莽草酸生产活性的微生物细胞为实施过上述(i)、(ii)、(iii)和(iv)的基因操作的微生物细胞。
＜25＞如＜20＞～＜24＞中任一项所述的转化细胞，其中，所述(B)的由与序列编号2所示的氨基酸序列具有至少76％的同一性的氨基酸序列构成的多肽为以下的(B1)～(B3)所示的多肽，
(B1)由序列编号4所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成的多肽；
(B2)由序列编号6所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成的多肽；
(B3)由序列编号8所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成的多肽。
＜26＞如＜20＞～＜25＞中任一项所述的转化细胞，其中，以能够表达的状态包含编码所述(A)或(B)所示的多次跨膜型多肽的多核苷酸。
＜27＞如＜26＞所述的转化细胞，其中，编码所述(A)或(B)所示的多次跨膜型多肽的多核苷酸为下述(a)或(b)所示的多核苷酸，
(a)由序列编号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸；
(b)由与序列编号1所示的核苷酸序列具有至少76％的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸。
＜28＞如＜27＞所述的转化细胞，其中，(b)由与序列编号1所示的核苷酸序列具有至少76％的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸为下述(b1)～(b3)所示的多核苷酸，
(b1)由序列编号3所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有90％以上的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸；
(b2)由序列编号5所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有90％以上的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸；
(b3)由序列编号7所示的核苷酸序列或与该核苷酸序列具有90％以上的同一性的核苷酸序列构成的多核苷酸。
＜29＞如＜20＞～＜28＞中任一项所述的转化细胞，其中，微生物细胞为棒状菌。
＜30＞如＜29＞所述的转化细胞，其中，棒状菌为棒状杆菌属细菌。
＜31＞如＜30＞所述的转化细胞，其中，棒状杆菌属细菌为谷氨酸棒状杆菌、高效棒状杆菌、产氨棒状杆菌、耐盐棒状杆菌、解烷棒状杆菌、钝齿棒状杆菌、克氏棒状杆菌或帚石南棒状杆菌。
＜32＞如＜31＞所述的转化细胞，其中，棒状杆菌属细菌为谷氨酸棒状杆菌。
实施例
以下，利用实施例对本发明进行进一步详细地说明，但本发明的技术的范围并不限定于以下的实施例。
(1)没食子酸(有时也称为GAL)生产菌的制作
1)用于将cg0620基因区域取代为具有3,4-二羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽基因的质粒的构建
下述的实施例中所示的碱基号为ATCC13032株的基因组序列的碱基号，关于该基因组序列信息，从NCBI的GB数据库中以登录号NC_006958获得。
PCR用酶使用了PrimeSTAR Max DNAPolymerase(TaKaRa公司)。
以ATCC13032株(＝NBRC 12168株)的基因组DNA为模板，利用引物OT20和OT21进行扩增，得到cg0620基因区域的5’侧的DNA片段。另外，以基因组DNA为模板，利用引物OT23和OT24进行扩增，得到cg0620基因区域的3’侧的DNA片段。另外，通过人工基因合成，制作含有谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株所具有的tuf基因(cg0587)的启动子(以下，称为tu启动子)的DNA片段(OT25)。以其为模板，利用引物OT26和OT27进行扩增，得到启动子区域的DNA片段。另外，通过人工基因合成，制作2种(序列编号11和12)含有具有3,4-二羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽基因(以下，简称为hfm145VF)的DNA片段。以各DNA片段为模板，分别利用2种DNA引物(OT30与OT31以及OT32与OT33)进行扩增，得到2种DNA片段。另外，以pHKPsacB1为模板，利用引物OT34和OT35，扩增载体片段。对所得到的PCR产物，进行利用DpnI(Takara Bio)的处理。对所得到的6种PCR产物，使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(Takara Bio)纯化各DNA片段，利用In-Fusion HD Cloning Kit(Takara Bio)进行连接，由此制作质粒pHKPsacB_cg0620-Ptu-hfm145VF-hfm145VFopt。使用所得到的质粒溶液，转化到ECOSCompetent E.Coli DH5α株(Nippon Gene公司)，将细胞液涂布到含有卡那霉素的LB琼脂培养基，在37℃下静置一晚。将具有质粒的转化体接种于含有卡那霉素的LB液体培养基2mL，在37℃下培养一晚。从该培养液中，使用NucleoSpin Plasmid EasyPure(TaKaRa公司)进行质粒的纯化，得到pHKPsacB_cg0620-Ptu-hfm145VF-hfm145VFopt。
2)具有3,4-二羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽基因导入株的制作
应用利用电穿孔(Bio-rad)的转化法，将上述的质粒pHKPsacB_cg0620-Ptu-hfm145VF-hfm145VFopt导入CY44株(CY44株为日本专利6322576号公报的参考例14记载的tkt株，通过tu启动子控制转酮醇酶(有时也称为tkt)基因的转录而强化了表达。另外，通过苯甲酸的添加，能够诱导脱氢莽草酸脱水酶基因(有时也称为qsuB)基因和vanR(cg2615)基因的转录。此外，莽草酸脱氢酶(有时也称为aroE3)基因被VanR抑制子控制。)，以卡那霉素抗性进行选择，从而得到KC148sr株。通过使用引物OT20和OT36的引物的PCR法(SapphireAmp(Takara Bio))对KC148sr株进行分析，结果得到了如预想的结果，因此，确认了KC148sr株为质粒pHKPsacB_cg0620-Ptu-hfm145VF-hfm145VFopt被导入到cg0620基因区域的单交叉型同源重组体。
将KC148sr株在1mL的LB液体培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠)中培养24小时，将培养液的一部分在含有20％蔗糖的LB琼脂培养基上进行涂抹培养，由此得到KC148株。通过使用引物OT36和OT37的引物的PCR法(Sapphire Amp(Takara Bio))，确认了KC148株如预想那样为Ptu-hfm145VF-hfm145VFop基因被导入至cg0620基因区域的双交叉型同源重组体。
(2)乳酸脱氢酶基因(以下，有时也称为ldh基因)破坏株的制作
1)用于破坏ldh(cg3219)基因的质粒的制作
PCR用酶使用了PrimeSTAR Max DNAPolymerase(TaKaRa公司)。以pHKPsacB1(记载于日本专利6322576号公报)为模板，利用引物pHKPsacB-F2和pHKPsacB-R2扩增载体片段。以ATCC13032株(＝NBRC 12168株)的基因组DNA为模板，利用引物3219-up-F和3219-up-R进行扩增，得到cg3219基因的5’侧的DNA片段，且以基因组DNA为模板利用引物3219-down-F和3219-down-R扩增，得到cg3219基因的3’侧的DNA片段。对所得到的PCR产物，进行利用DpnI(Takara Bio)的处理。对所得到的3种PCR产物，利用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(Takara Bio)，将各DNA片段纯化后，利用In-Fusion HD cloning kit(clontech公司)进行连接，制作pHKBsacB-Δldh。使用所得到的质粒溶液，转化到ECOS Competent E.Coli DH5α株(Nippon Gene公司)，将细胞液涂布到含有卡那霉素的LB琼脂培养基，在37℃下静置一晚。以所得到的菌落为模板，使用Sapphire Amp(TaKaRa公司)作为酶，进行菌落PCR。引物利用3219-up-F和3219-down-R，确认目标DNA片段的导入。将具有确认导入了基因的质粒的转化体接种于含有卡那霉素的LB液体培养基2mL，在37℃下培养一晚。从该培养液中，使用NucleoSpin Plasmid EasyPure(TaKaRa公司)，进行质粒的纯化，得到pHKBsacB-Δldh。
2)ldh基因(cg3219)的破坏株的获得
使用上述得到的质粒pHKBsacB-Δldh，利用电穿孔法(Bio-rad)转化到KC148。以卡那霉素抗性进行选择，由此获得KC148Δldh-sr。以所得到的菌落为模板，使用引物sacB-1和3219-up1500进行PCR(Sapphire Amp)，结果得到了如预想的结果，因此，确认了质粒pHKBsacB-Δldh通过单交叉型同源重组被导入到cg3219基因区域。将KC148Δldh-sr在1mL的LB液体培养基中培养24小时，将培养液的一部分在含有20％蔗糖的LB琼脂培养基上进行涂抹培养，由此得到KC148Δldh株。通过利用了引物3219-coloP-F和3219-coloP-R的菌落PCR(Sapphire Amp)，确认了ldh基因(cg3219)通过双交叉型同源重组发生了缺失。同时，确认了卡那霉素抗性基因和sacB基因也发生了缺失。
(3)GALT0基因在cg3219基因座的敲入株的制作
1)用于将GALT0基因敲入cg3219基因座的质粒的制作
PCR用酶使用了PrimeSTAR Max DNAPolymerase(TaKaRa公司)。以pHKBsacB-Δldh为模板，利用引物ocJK83和ocJK84扩增载体片段。以ATCC13032株(＝NBRC 12168株)的基因组DNA为模板，利用引物ocJKT85和ocJKT86进行扩增，得到包含GALT0基因(序列编号1)的ORF区域的DNA片段。对所得到的2种PCR产物，使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(Takara Bio)纯化各DNA片段后，利用In-Fusion HD cloning kit(clontech公司)进行连接，制作pHKBsacB-Δldh::GALT0。本质粒在ldh基因上游的质粒区域下游连接有GALT0基因的ORF。使用所得到的质粒溶液，转化到ECOS Competent E.Coli DH5α株(Nippon Gene公司)，将细胞液涂布于含有卡那霉素的LB琼脂培养基，在37℃下静置一晚。以所得到的菌落为模板，使用Sapphire Amp(TaKaRa公司)作为酶，进行菌落PCR。引物使用ocJK105和ocJK106，确认了目标DNA片段的导入。将具有确认导入了基因的质粒的转化体接种于含有卡那霉素的LB液体培养基2mL，在37℃下培养一晚。从该培养液中，使用NucleoSpinPlasmid EasyPure(TaKaRa公司)，进行质粒的纯化，得到pHKBsacB-Δldh::GALT0。
2)GALT0基因向cg3219基因座的敲入株的获得
使用上述得到的质粒pHKBsacB-Δldh::GALT0，通过电穿孔法(Bio-rad)转化到KC148中。利用卡那霉素抗性进行选择，由此获得KC148Δldh::GALT0-sr。以所得到的菌落为模板，使用引物ocJK107和ocJK87进行PCR(Sapphire Amp)，结果得到了如预想的结果，因此，确认了质粒pHKBsacB-Δldh::GALT0通过单交叉型同源重组被导入cg3219基因区域。将KC148Δldh::GALT0-sr在1mL的LB液体培养基中培养24小时，将培养液的一部分在含有20％蔗糖的LB琼脂培养基上进行涂抹培养，由此得到KC148Δldh::GALT0株。通过利用了引物ocJK107和ocJK110的菌落PCR(Sapphire Amp)，确认了GALT0基因被敲入cg3219基因座。同时，确认了卡那霉素抗性基因和sacB基因也发生了缺失。
(4)GALT3基因向cg3219基因座的敲入株的制作
1)用于将GALT3基因敲入cg3219基因座的质粒的制作
PCR用酶使用了PrimeSTAR Max DNAPolymerase(TaKaRa公司)。以pHKBsacB-Δldh为模板，利用引物ocJK83和ocJK84扩增载体片段。以由Eurofins Genomics株式会社人工基因合成的序列编号GALT3_nuc所示的DNA片段为模板，利用引物ocJKT87和ocJKT88进行扩增，得到含有GALT3基因(序列编号7)的ORF区域的DNA片段。对得到的2种PCR产物，使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(Takara Bio)将各DNA片段纯化后，利用In-Fusion HDcloning kit(clontech公司)进行连接，制作pHKBsacB-Δldh::GALT3。本质粒在ldh基因上游的质粒区域下游连接有GALT3基因的ORF。使用所得到的质粒溶液对ECOS CompetentE.Coli DH5α株(Nippon Gene公司)进行转化，将细胞液涂布于含有卡那霉素的LB琼脂培养基，在37℃下静置一晚。以所得到的菌落为模板，使用Sapphire Amp(TaKaRa公司)作为酶，进行菌落PCR。引物使用ocJK105和ocJK106，确认导入了目标DNA片段。将具有确认了基因的导入的质粒的转化体接种于含有卡那霉素的LB液体培养基2mL，在37℃下培养一晚。从该培养液中，利用NucleoSpin Plasmid EasyPure(TaKaRa公司)进行质粒的纯化，得到pHKBsacB-Δldh::GALT3。
2)GALT3基因向cg3219基因座的敲入株的获得
使用上述得到的质粒pHKBsacB-Δldh::GALT3，利用电穿孔法(Bio-rad)转化到KC148中。通过用卡那霉素抗性进行选择，获得KC148Δldh::GALT3-sr。以得到的菌落为模板，使用引物ocJK107和ocJK98进行PCR(Sapphire Amp)，结果得到了如预想的结果，因此，确认了质粒pHKBsacB-Δldh::GALT3通过单交叉型同源重组而被导入到cg3219基因区域。将KC148Δldh::GALT3-sr在1mL的LB液体培养基中培养24小时，将培养液的一部分在含有20％蔗糖的LB琼脂培养基上进行涂抹培养，由此获得KC148Δldh::GALT3株。通过使用了引物ocJK107和ocJK110的菌落PCR(Sapphire Amp)，确认了GALT3基因被敲入cg3219基因座。并且，确认了卡那霉素抗性基因和sacB基因也发生了缺失。
[表1]
(5)芳香族化合物生产率的评价
将KC148Δldh株、KC148Δldh::GALT0株和KC148Δldh::GALT3株在LB板上画线，在30℃下培养3天。将在板上生长的菌体接种于加入了4mL LB培养基的圆底带盖试管(Spitz)(荣研化学)中，在30℃下以200rpm进行24小时振荡培养(前培养)。在表2所示的CGXII培养基中添加苯甲酸钠使其终浓度成为1mM，在Bio Jr.8(ABLE Company)的培养槽中加入100mL。将上述前培养液接种1mL，在32℃、700rpm、100mL/min的通气量的条件下进行18小时振荡培养，评价芳香族化合物的生产率。将培养液用稀硫酸适当稀释，通过离心将菌体除去后，回收上清液。对上清液中的没食子酸(GAL)和原儿茶酸(有时也称为PCA)浓度进行定量。将结果表示于表3。与KC148Δldh株相比，KC148Δldh::GALT0株时，没食子酸浓度为3.1倍，原儿茶酸浓度为4.8倍，确认有芳香族化合物的生产率提高效果。同样地，在KC148Δldh::GALT3株时，没食子酸浓度为2.7倍，原儿茶酸浓度为3.1倍，确认有芳香族化合物的生产率提高效果。
此外，导入GALT1或GALT2基因来代替GALT0基因的GALT1株和GALT2株也与突变前的株相比显示出优异的原儿茶酸和没食子酸的生产率提高效果。
[表2]
CGXII培养基
| 葡萄糖 | 50g/L |
| (NH4)2SO4 | 20g/L |
| KH2PO4 | 1g/L |
| K2HPO4 | 1g/L |
| MgSO4 7H2O | 0.25g/L |
| CaCl2 2H2O | 10mg/L |
| FeSO4 7H2O | 10mg/L |
| MnSO4 5H2O | 10mg/L |
| ZnSO4 7H2O | 1mg/L |
| CuSO4 5H2O | 0.2mg/L |
| NiCl2 6H2O | 0.02mg/L |
| 生物素(pH7) | 0.2mg/L |
| 胰蛋白胨 | 50g/L |
[表3]
| GAL(mM) | PCA(mM) | |
| KC148Δldh | 0.48 | 0.14 |
| KC148Δldh::GALT0 | 1.50 | 0.70 |
| KC148Δldh::GALT3 | 1.27 | 0.45 |
参考例1没食子酸和原儿茶酸的定量
对回收的上清液使用AcroPrep 96孔过滤板(0.2μmGHP膜、Nihon Pall Ltd.)进行不溶物的除去，将反应液供于HPLC。
HPLC的装置使用Chromaster(日立高新技术)。使用L-柱ODS(4.6mm I.D.×150mm、化学物质评价研究机构)，将洗脱液A设为0.1M磷酸二氢钾的0.1％磷酸溶液，将洗脱液B设为70％甲醇，在流速1.0mL/分钟、柱温40℃的条件下进行梯度洗脱。检测使用UV检测器(检测波长210)。
参考例2使用细胞跨膜区域预测程序的跨膜螺旋结构的分析
将目标的多肽序列(这里为GALT0)发送至http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/。其结果，预测到跨膜螺旋(跨膜区域)部分，得到其前后为细胞膜内(inside)和细胞膜外(outside)的分析结果(图2)。由此，得到GALT0为具有12个跨膜区域的12次跨膜型的多肽的预测结果。同样地GALT1以后也能够预测到跨膜区域。
Claims (22)
1.一种芳香族化合物或其盐的制造方法，其中，
包括：
培养下述(A)或(B)所示的多次跨膜型多肽的表达被强化的转化细胞的工序，
(A)由序列编号2所示的氨基酸序列构成的多肽；
(B)由与序列编号2所示的氨基酸序列具有至少76％的同一性的氨基酸序列构成的多肽。
2.如权利要求1所述的方法，其中，
所述(B)的由与序列编号2所示的氨基酸序列具有至少76％的同一性的氨基酸序列构成的多肽为以下的(B1)～(B3)所示的多肽，
(B1)由序列编号4所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成的多肽；
(B2)由序列编号6所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成的多肽；
(B3)由序列编号8所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成的多肽。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，
以能够表达的状态包含编码所述(A)或(B)所示的多次跨膜型多肽的多核苷酸。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
在糖类的存在下进行培养。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，
转化细胞的宿主为提高了3-脱氢莽草酸生产活性的微生物细胞。
6.如权利要求4所述的方法，其中，
提高了3-脱氢莽草酸生产活性的微生物细胞为实施过下述的(i)、(ii)、(iii)和(iv)中任意1种以上的基因操作的细胞，
(i)选自脱氢莽草酸脱水酶基因、脱氢奎尼酸脱水酶基因、奎尼酸脱氢酶基因和莽草酸脱氢酶基因中的1种以上的基因的强化；
(ii)选自由2-脱氢-3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸醛缩酶基因、3-脱氢奎尼酸合成酶基因、莽草酸脱氢酶基因构成的与莽草酸合成路径相关的基因组中的1种以上的基因的强化；
(iii)选自由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因、6-磷酸葡糖酸内酯酶基因、磷酸葡糖酸脱氢酶基因、核糖-5-磷酸异构酶基因、核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶基因、转酮醇酶基因和转醛醇酶基因构成的与戊糖磷酸路径相关的基因组中的1种以上的基因的强化；
(iv)编码具有3,4-二羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽的基因的强化。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中，
微生物细胞为棒状菌。
8.如权利要求7所述的方法，其中，
棒状菌为棒状杆菌属细菌。
9.如权利要求8所述的方法，其中，
棒状杆菌属细菌为谷氨酸棒状杆菌、高效棒状杆菌、产氨棒状杆菌、耐盐棒状杆菌、解烷棒状杆菌、钝齿棒状杆菌、克氏棒状杆菌或帚石南棒状杆菌。
10.如权利要求8所述的方法，其中，
棒状杆菌属细菌为谷氨酸棒状杆菌。
11.如权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，
芳香族化合物或其盐为由3-脱氢莽草酸衍生的芳香族化合物或其盐。
12.如权利要求11所述的方法，其中，
芳香族化合物或其盐为没食子酸、原儿茶酸、儿茶酚、L-DOPA、2,4-吡啶二羧酸、2,5-吡啶二羧酸、4-羟基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、4-氨基-3-羟基苯甲酸、或它们的盐。
13.如权利要求12所述的方法，其中，
芳香族化合物或其盐为没食子酸、原儿茶酸、L-DOPA、4-羟基苯甲酸、4-氨基-3-羟基苯甲酸、或它们的盐。
14.如权利要求13所述的方法，其中，
芳香族化合物或其盐为没食子酸、原儿茶酸、或它们的盐。
15.一种下述(A)或(B)所示的多次跨膜型多肽的表达被强化的转化细胞，其中，
以提高了3-脱氢莽草酸生产活性的微生物细胞为宿主，
(A)由序列编号2所示的氨基酸序列构成的多肽；
(B)由与序列编号2所示的氨基酸序列具有至少76％的同一性的氨基酸序列构成的多肽。
16.如权利要求15所述的转化细胞，其中，
提高了3-脱氢莽草酸生产活性的微生物细胞为实施过下述的(i)、(ii)、(iii)和(iv)中任意1种以上的基因操作的细胞，
(i)选自脱氢莽草酸脱水酶基因、脱氢奎尼酸脱水酶基因、奎尼酸脱氢酶基因和莽草酸脱氢酶基因中的1种以上的基因的强化；
(ii)选自由2-脱氢-3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸醛缩酶基因、3-脱氢奎尼酸合成酶基因、莽草酸脱氢酶基因构成的与莽草酸合成路径相关的基因组中的1种以上的基因的强化；
(iii)选自由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因、6-磷酸葡糖酸内酯酶基因、磷酸葡糖酸脱氢酶基因、核糖-5-磷酸异构酶基因、核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶基因、转酮醇酶基因和转醛醇酶基因构成的与戊糖磷酸路径相关的基因组中的1种以上的基因的强化；
(iv)编码具有3,4-二羟基苯甲酸羟化酶活性的多肽的基因的强化。
17.如权利要求15或16所述的转化细胞，其中，
所述(B)的由与序列编号2所示的氨基酸序列具有至少76％的同一性的氨基酸序列构成的多肽为以下的(B1)～(B3)所示的多肽，
(B1)由序列编号4所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成的多肽；
(B2)由序列编号6所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成的多肽；
(B3)由序列编号8所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成的多肽。
18.如权利要求15～17中任一项所述的转化细胞，其中，
以能够表达的状态包含编码所述(A)或(B)所示的多次跨膜型多肽的多核苷酸。
19.如权利要求15～18中任一项所述的转化细胞，其中，
微生物细胞为棒状菌。
20.如权利要求19所述的转化细胞，其中，
棒状菌为棒状杆菌属细菌。
21.如权利要求20所述的转化细胞，其中，
棒状杆菌属细菌为谷氨酸棒状杆菌、高效棒状杆菌、产氨棒状杆菌、耐盐棒状杆菌、解烷棒状杆菌、钝齿棒状杆菌、克氏棒状杆菌或帚石南棒状杆菌。
22.如权利要求21所述的转化细胞，其中，
棒状杆菌属细菌为谷氨酸棒状杆菌。
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