CN108463555A - 生产苯甲醛的方法 - Google Patents

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檀上景子
福井启太
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Abstract

提供了生产苯甲醛的方法。通过使用具有氨基酸脱氨酶，4‑羟基扁桃酸合酶，(S)‑扁桃酸脱氢酶和苯甲酰甲酸脱羧酶的微生物从L‑苯丙氨酸或碳源生产苯甲醛。

Description

生产苯甲醛的方法
技术领域
本发明涉及通过使用微生物生产苯甲醛的方法。
背景技术
苯甲醛是扁桃仁(almond)和杏仁的气味的成分，并且通过混合在食品，饮料，香水等中用作芳香剂。主要通过化学合成来生产苯甲醛。
此外，已知一些涉及苯甲醛生物合成的酶。
已知氨基酸脱氨酶(amino acid deaminase,AAD)为催化氨基酸氧化脱氨反应的酶(EC 1.4.3.2)。已知奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的AAD能够将L-苯丙氨酸转化为苯丙酮酸(非专利文件1)。此外，已经报道了通过在L-苯丙氨酸存在下培养具有AAD的奇异变形杆菌生成苯丙酮酸(非专利文件1)。
已知4-羟基扁桃酸合酶(4-hydroxymandelate synthase,HMAS)为催化α-酮酸如4-羟基苯丙酮酸的氧化脱羧反应的酶(EC 1.13.11.46)。据报道，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的HMAS和丰加链霉菌(Streptomyces toyocaensis)的HMAS能够将苯丙酮酸转化为(S)-扁桃酸(非专利文件2和3)。此外，已报道通过在葡萄糖存在下培养导入了东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)的HMAS的大肠杆菌(Escherichiacoli)生成(S)-扁桃酸(非专利文件2)。
(S)-扁桃酸脱氢酶((S)-mandelate dehydrogenase,SMDH)是催化(S)-扁桃酸氧化反应生成苯甲酰甲酸的酶。已经报道了通过使用在大肠杆菌中异源表达的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的SMDH从(S)-扁桃酸生成苯甲酰甲酸(非专利文件4)。
苯甲酰甲酸脱羧酶(Benzoylformate decarboxylase,BFDC)是催化苯甲酰甲酸脱羧反应以生成苯甲醛的酶。已经报道了通过使用具有BFDC的恶臭假单胞菌的细胞从苯甲酰甲酸生成苯甲醛(非专利文件5)。
引用列表
非专利文献
NPL1：Massad G et al.,Proteus mirabilis amino acid deaminase:cloning,nucleotide sequence,and characterization of aad.J Bacteriol.1995Oct；177(20):5878-83。
NPL2：Sun Z et al.,Metabolic engineering of the L-phenylalaninepathway inEscherichia coli for the production of S-or R-mandelic acid.MicrobCell Fact.2011Sep 13；10:71。
NPL3：Liu SP et al.,Heterologous pathway for the production of L-phenylglycine from glucose by E.coli.J Biotechnol.2014Sep 30；186:91-7。
NPL4：Peng Wang et al.,Immobilization of(S)-mandelate dehydrogenaseand its catalytic performance on stereoselective transformation of mandelicacid.Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers Volume 45,Issue 3,May 2014,Pages 744-748。
NPL5：Park,J.K.and Jung,J.Y.,Production of benzaldehyde byencapsulated whole-cell benzoylformate decarboxylase,Enzyme Microb Technol,30,726-733,2002。
发明概述
本发明实现的目标
本发明的目标是开发通过使用微生物生产苯甲醛的新技术，并从而提供有效生产苯甲醛的方法。
实现目标的手段
为了实现上述目标，本发明的发明人进行了多项研究。作为结果，本发明人发现通过使用具有氨基酸脱氨酶，4-羟基扁桃酸合酶，(S)-扁桃酸脱氢酶和苯甲酰甲酸脱羧酶的微生物，可以从L-苯丙氨酸或葡萄糖生产苯甲醛，从而完成了本发明。
本发明可以例如如下实施。
[1]生产苯甲醛的方法，所述方法包括下述步骤(A)：
(A)通过使用具有以下四种酶的至少一种微生物生产苯甲醛：氨基酸脱氨酶、4-羟基扁桃酸合酶、(S)-扁桃酸脱氢酶，和苯甲酰甲酸脱羧酶，
其中所述至少一种微生物由独自具有所述四种酶的单一微生物，或者整体具有所述四种酶的多种微生物的组合组成。
[2]上述方法，其中通过选自(a)至(c)的方式实施步骤(A)：
(a)培养所述至少一种微生物；
(b)使用所述至少一种微生物的细胞；或者
(c)培养所述多种微生物的一部分和使用所述多种微生物的其余部分的细胞这两种方法的组合。
[3]上述方法，其中从碳源或L-苯丙氨酸生产苯甲醛。
[4]上述方法，其中通过下述步骤(B)或(C)实施步骤(A)：
(B)通过使用所述至少一种微生物从碳源生产苯甲醛；
(C)通过使用所述至少一种微生物将L-苯丙氨酸转化为苯甲醛，
其中步骤(B)中使用的所述至少一种微生物具有L-苯丙氨酸生产能力。
[5]上述方法，其中通过下述步骤(B1)、(C1)或(C2)实施步骤(A)：
(B1)在含有碳源的培养基中培养所述至少一种微生物以在所述培养基中生成并积累苯甲醛；
(C1)在含有L-苯丙氨酸的培养基中培养所述至少一种微生物以在所述培养基中生成并积累苯甲醛；
(C2)在反应混合物中允许所述至少一种微生物的细胞与L-苯丙氨酸共存以在所述反应混合物中生成并积累苯甲醛，
其中步骤(B1)中使用的所述至少一种微生物具有L-苯丙氨酸生产能力。
[6]上述方法，其中步骤(A)包含下述步骤(D1)和(D2)：
(D1)下述步骤(D1a)或(D1b)：
(D1a)从碳源生成苯丙酮酸、(S)-扁桃酸或苯甲酰甲酸；
(D1b)将L-苯丙氨酸转化为苯丙酮酸、(S)-扁桃酸或苯甲酰甲酸；
(D2)将步骤(D1)中生成的苯丙酮酸、(S)-扁桃酸或苯甲酰甲酸转化为苯甲醛，
其中通过使用至少一种微生物实施步骤(D1a)，所述至少一种微生物具有选自所述四种酶的与步骤(D1)对应的一种或多种酶，并具有L-苯丙氨酸生产能力，
其中通过使用至少一种微生物实施步骤(D1b)，所述至少一种微生物具有选自所述四种酶的与步骤(D1)对应的一种或多种酶，和
其中通过使用至少一种微生物实施步骤(D2)，所述至少一种微生物具有选自所述四种酶的与步骤(D2)对应的一种或多种酶。
[7]上述方法，
其中通过培养在步骤(D1a)中使用的所述至少一种微生物实施步骤(D1a)，和
其中通过使用在步骤(D1b)和(D2)中使用的相应微生物的细胞，或者通过培养步骤(D1b)和(D2)中使用的相应微生物实施步骤(D1b)和(D2)。
[8]上述方法，其中步骤(A)包括下述步骤(E1)和(E2)：
(E1)下述步骤(E1a)或(E1b)：
(E1a)通过使用具有氨基酸脱氨酶、4-羟基扁桃酸合酶和(S)-扁桃酸脱氢酶并具有L-苯丙氨酸生产能力的至少一种微生物从碳源生成苯甲酰甲酸；
(E1b)通过使用具有氨基酸脱氨酶、4-羟基扁桃酸合酶和(S)-扁桃酸脱氢酶的至少一种微生物将L-苯丙氨酸转化为苯甲酰甲酸；
(E2)通过使用具有苯甲酰甲酸脱羧酶的微生物将步骤(E1)中生成的苯甲酰甲酸转化为苯甲醛。
[9]上述方法，
其中通过培养在步骤(E1a)中使用的所述至少一种微生物来实施步骤(E1a)，和
其中通过使用在步骤(E1b)和(E2)中使用的相应微生物的细胞，或者通过培养在步骤(E1b)和(E2)中使用的相应微生物来实施步骤(E1b)和(E2)。
[10]上述方法，其中步骤(A)包括下述步骤(F1)和(F2)：
(F1)下述步骤(F1a)或(F1b)：
(F1a)在含有碳源的培养基中培养至少一种微生物以在所述培养基中生成并积累苯甲酰甲酸，所述至少一种微生物具有氨基酸脱氨酶、4-羟基扁桃酸合酶和(S)-扁桃酸脱氢酶并具有L-苯丙氨酸生产能力；
(F1b)在含有L-苯丙氨酸的培养基中培养至少一种微生物以在所述培养基中生成并积累苯甲酰甲酸，或者在反应混合物中允许至少一种微生物的细胞与L-苯丙氨酸共存以在所述反应混合物中生成并积累苯甲酰甲酸，所述至少一种微生物具有氨基酸脱氨酶、4-羟基扁桃酸合酶和(S)-扁桃酸脱氢酶；
(F2)在含有步骤(F1)中生成的苯甲酰甲酸的培养基中培养微生物以在所述培养基中生成并积累苯甲醛，或者在反应混合物中允许微生物的细胞与步骤(F1)中生成的苯甲酰甲酸共存以在所述反应混合物中生成并积累苯甲醛，所述微生物具有苯甲酰甲酸脱羧酶。
[11]上述方法，其中步骤(A)包括下述步骤(G1)至(G4)：
(G1)下述步骤(G1a)或(G1b)：
(G1a)通过使用具有氨基酸脱氨酶并具有L-苯丙氨酸生产能力的微生物从碳源生成苯丙酮酸；
(G1b)通过使用具有氨基酸脱氨酶的微生物将L-苯丙氨酸转化为苯丙酮酸；
(G2)通过使用具有4-羟基扁桃酸合酶的微生物将步骤(G1)中生成的苯丙酮酸转化为(S)-扁桃酸；
(G3)通过使用具有(S)-扁桃酸脱氢酶的微生物将步骤(G2)中生成的(S)-扁桃酸转化为苯甲酰甲酸；
(G4)通过使用具有苯甲酰甲酸脱羧酶的微生物将步骤(G3)中生成的苯甲酰甲酸转化为苯甲醛。
[12]上述方法，
其中通过培养步骤(G1a)中使用的微生物来实施步骤(G1a)，和
其中通过使用在步骤(G1b)和(G2)至(G4)中使用的相应微生物的细胞，或者通过培养步骤(G1b)和(G2)至(G4)中使用的相应微生物来实施步骤(G1b)和(G2)至(G4)。
[13]上述方法，其中所述细胞由所述一种或多种微生物的培养液，从所述培养液收集的细胞，其处理产品，或其组合组成。
[14]上述方法，其中所述氨基酸脱氨酶是下述(a)、(b)或(c)中定义的蛋白质：
(a)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，但该氨基酸序列包括1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并具有氨基酸脱氨酶活性的蛋白质；
(c)包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并具有氨基酸脱氨酶活性的蛋白质。
[15]上述方法，其中所述4-羟基扁桃酸合酶是下述(a)、(b)、(c)或(d)中定义的蛋白质：
(a)包含SEQ ID NO:14、16、18、20、22、33、36、41、43或45的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包含SEQ ID NO:14、16、18、20、22、33、36、41、43或45的氨基酸序列，但该氨基酸序列包括1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并具有4-羟基扁桃酸合酶活性的蛋白质；
(c)包含与SEQ ID NO:14、16、18、20、22、33、36、41、43或45的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并具有4-羟基扁桃酸合酶活性的蛋白质，
(d)包含(a)、(b)或(c)中定义的蛋白质的氨基酸序列，但具有特定突变的蛋白质，其中所述特定突变由与选自下组的一个或多个氨基酸残基对应的氨基酸残基处的突变组成：T2、M3、G5、Y18、A27、D35、E46、E180、A187、E191、V194、A199、D201、Q206、I217、D220、T222、G255、F319、G327、I336、K337、V343和Q347，
条件是从4-羟基扁桃酸合酶排除由SEQ ID NO:35和39的氨基酸序列组成的蛋白质。
[16]上述方法，其中所述特定突变由与选自下组的一种或多种突变对应的突变组成：T2N、M3I、G5R、Y18F、A27V、D35G、E46Q、E180K、A187V、E191K、V194G、A199(S,V)、D201N、Q206R、I217(L,V)、D220(A,N)、T222S、G255D、F319Y、G327(D,S)、I336V、K337Q、V343M和Q347L。
[17]上述方法，其中所述特定突变由与M3I/A199S/G255D、Y18F/D220N、A27V/E191K、D35G/E46Q/T222S/I336V、E180K/I217V/D220N、A187V/I217V、A199V/I217V/K337Q、D201N/I217V、I217V/F319Y和D220A/Q347L的任一种对应的突变组成。
[18]上述方法，其中所述(S)-扁桃酸脱氢酶是下述(a)、(b)或(c)中定义的蛋白质：
(a)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，但该氨基酸序列包括1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并具有(S)-扁桃酸脱氢酶活性的蛋白质；
(c)包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并具有(S)-扁桃酸脱氢酶活性的蛋白质。
[19]上述方法，其中所述苯甲酰甲酸脱羧酶是下述(a)、(b)或(c)中定义的蛋白质：
(a)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，但该氨基酸序列包括1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并具有苯甲酰甲酸脱羧酶活性的蛋白质；
(c)包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并具有苯甲酰甲酸脱羧酶活性的蛋白质。
[20]上述方法，其中所述微生物或所述多种微生物的每一种是细菌或酵母。
[21]上述方法，其中所述微生物或所述多种微生物的每一种是属于肠肝菌科的细菌或棒状杆菌细菌。
[22]上述方法，其中所述微生物或所述多种微生物的每一种是属于埃希氏菌属的细菌。
[23]上述方法，其中所述微生物或所述多种微生物的每一种是大肠杆菌。
[24]上述方法，其中所述方法进一步包括收集苯甲醛。
具体实施方式
以下，将详细解释本发明。
本发明的方法是通过使用具有氨基酸脱氨酶(AAD)、4-羟基扁桃酸合酶(HMAS)、(S)-扁桃酸脱氢酶(SMDH)和苯甲酰甲酸脱羧酶(BFDC)的微生物生产苯甲醛的方法。该微生物也称为“本发明的微生物”。该四种酶，即AAD、HMAS、SMDH和BFDC，也统称为“苯甲醛生成酶”。
<1>本发明的微生物
<1-1>具有四种苯甲醛生成酶的微生物
本发明的微生物是具有(含有)四种苯甲醛生成酶即AAD、HMAS、SMDH和BFDC的微生物。
表述“具有苯甲醛生成酶的微生物”具体是指，所述微生物表达并保留功能性苯甲醛生成酶。苯甲醛生成酶由编码苯甲醛生成酶的基因表达。编码苯甲醛生成酶的基因也称为“苯甲醛生成酶基因”。也就是说，本发明的微生物，即具有苯甲醛生成酶的微生物，具有苯甲醛生成酶基因。表述“具有苯甲醛生成酶的微生物”也表述为“具有苯甲醛生成酶基因的微生物”。
本发明的微生物可以是单一微生物，或者可以是多种微生物的组合。也就是说，在本发明中，作为单数形式的术语“微生物”例如“一个微生物”和“所述微生物”可以根据上下文解读为至少一种微生物，即单一微生物或者多种微生物的组合。
在本发明的微生物是单一微生物的情况下，该单一微生物独自具有全部四种苯甲醛生成酶。
在本发明的微生物是多种微生物的组合的情况下，该组合整体具有全部四种苯甲醛生成酶。换句话说，在本发明的微生物是多种微生物的组合的情况下，四种苯甲醛生成酶各自被多种微生物中的至少任一种所含有。苯甲醛生成酶各自可以被多种微生物中的任何一种或多种微生物中的两种或更多种所含有。多种微生物各自可以具有任何一种苯甲醛生成酶，或两种或更多种苯甲醛生成酶。对多种微生物各自所具有的苯甲醛生成酶的种类没有特别限制，只要实现苯甲醛的生产即可。可以根据各种条件例如实施生产步骤的模式如生产步骤中子步骤的配置适当选择多种微生物各自所含有的苯甲醛生成酶的种类。例如，本发明的微生物可以是具有四种各自的苯甲醛生成酶的四种微生物的组合，即具有AAD的微生物，具有HMAS的微生物，具有SMDH的微生物和具有BFDC的微生物的组合。除了由多种微生物各自所含有的苯甲醛生成酶的种类之外，多种微生物可以彼此相同或不同。例如，多种微生物可以是或可以不是来自相同的属、种或菌株的微生物。
本发明的微生物可以具有L-苯丙氨酸生产能力。术语“具有L-苯丙氨酸生产能力的微生物”是指在培养基如含有碳源的培养基中培养时能够生物合成L-苯丙氨酸的微生物。因此，具体而言，术语“具有L-苯丙氨酸生产能力的微生物”可以指能够从碳源生物合成L-苯丙氨酸的微生物。生物合成的L-苯丙氨酸可以用作生产苯甲醛的原料。因此，具体而言，术语“具有L-苯丙氨酸生产能力的微生物”还可以指能够以生产苯甲醛的原料所需的量生物合成L-苯丙氨酸的微生物。生物合成的L-苯丙氨酸可以作为产物在例如微生物细胞和/或培养基中积累或者可以不积累。也就是说，生物合成的L-苯丙氨酸可以立即被消耗掉。例如，生物合成的L-苯丙氨酸可以立即转化为苯甲醛或其中间体。因此，在一个实施方案中，可以基于苯甲醛或其中间体的生产来测量L-苯丙氨酸生产能力。
在本发明的微生物是单一微生物的情况下，该单一微生物可具有L-苯丙氨酸生产能力。
在本发明的微生物是多种微生物的组合的情况下，多种微生物中的任何一种或多种微生物可具有L-苯丙氨酸生产能力。多种微生物中的哪一种或哪些微生物具有L-苯丙氨酸生产能力没有特别限制，只要实现苯甲醛的生产即可。例如，至少具有AAD的微生物可以具有L-苯丙氨酸生产能力。
顺便提及，本发明的微生物具有苯甲醛生产能力。术语“具有苯甲醛生产能力的微生物”是指能够生产苯甲醛的微生物。术语“具有苯甲醛生产能力的微生物”可以指能够通过发酵，生物转化或其组合生产苯甲醛的微生物。也就是说，术语“具有苯甲醛生产能力的微生物”可以指能够从碳源或L-苯丙氨酸生产苯甲醛的微生物。特别地，术语“具有苯甲醛生产能力的微生物”可以指当在含有碳源的培养基中培养时能够在培养基中生产并积累苯甲醛或其中间体的微生物，所述中间体可以进一步转化为苯甲醛。另外，特别地，术语“具有苯甲醛生产能力的微生物”可以指当在含有L-苯丙氨酸的培养基中培养时，或者当在反应混合物中允许与L-苯丙氨酸共存或作用于L-苯丙氨酸时，能够在所述培养基或反应混合物中生产并积累苯甲醛或其中间体的微生物，所述中间体可以进一步转化为苯甲醛。
可以通过四种苯甲醛生成酶的作用从L-苯丙氨酸生产苯甲醛。因此，具有四种苯甲醛生成酶的本发明的微生物可以能够从L-苯丙氨酸生产苯甲醛。例如，本发明的微生物可以能够通过生物转化生产苯甲醛的步骤，或者通过生物转化生产苯甲醛的中间体的子步骤和将所述中间体转化为苯甲醛的后续子步骤的组合从L-苯丙氨酸生产苯甲醛。
当本发明的微生物具有L-苯丙氨酸生产能力时，微生物也可以能够从碳源生产苯甲醛。例如，本发明的微生物可以能够通过发酵生产苯甲醛的步骤，或者通过发酵生产苯甲醛的中间体的子步骤和将所述中间体转化为苯甲醛的后续子步骤的组合从碳源生产苯甲醛。
本发明的微生物可以能够在培养基或反应混合物中积累苯甲醛至能够从中收集苯甲醛的程度。本发明的微生物可以能够以例如0.01mM或更多，0.1mM更多，或1mM更多的量在培养基或反应混合物中积累苯甲醛。
在本发明的微生物是单一微生物的情况下，该单一微生物具有苯甲醛生产能力。
在本发明的微生物是多种微生物的组合的情况下，该组合整体具有苯甲醛生产能力。
微生物没有特别限制，只要它能够表达功能性苯甲醛生成酶并且能够用于生产苯甲醛即可。微生物的实例包括细菌和酵母。
细菌的实例包括属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌，棒状杆菌细菌(coryneform bacteria)和芽孢杆菌属(Bacillus)细菌。
属于肠杆菌科的细菌的实例包括属于埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、发光杆菌属(Photorhabdus)、普罗威登斯菌属(Providencia)、沙门氏菌属(Salmonella)、摩根菌属(Morganella)等的细菌。具体而言，可以使用根据NCBI(国家生物技术信息中心)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝91347)中使用的分类法分类为肠杆菌科的细菌。埃希氏菌属细菌没有特别限制，并且其实例包括根据微生物领域技术人员已知的分类法分类为埃希氏菌属的那些。埃希氏菌属细菌的实例包括例如Neidhardt et al.(Backmann B.J.,1996,Derivations and Genotypes of some mutant derivatives ofEscherichia coli K-12,pp.2460-2488,Table 1,In F.D.Neidhardt(ed.),Escherichia coli and SalmonellaCellular and Molecular Biology/Second Edition,American Society forMicrobiology Press,Washington,D.C.)的工作中描述的那些。埃希氏菌属细菌的实例包括例如大肠杆菌。大肠杆菌的具体实例包括例如大肠杆菌K-12菌株如W3110菌株(ATCC27325)和MG1655菌株(ATCC 47076)；大肠杆菌K5菌株(ATCC 23506)；大肠杆菌B菌株如BL21(DE3)菌株；及其衍生菌株。肠杆菌属细菌的实例包括例如成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)。泛菌属细菌的实例包括例如菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)、成团泛菌(Pantoeaagglomerans)和柠檬泛菌(Pantoea citrea)。欧文氏菌属细菌的实例包括解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)和胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)。克雷伯氏菌属细菌的实例包括植物克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。
棒状杆菌细菌的实例包括属于棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、微杆菌属(Microbacterium)等的细菌。
棒状杆菌细菌的具体实例包括以下物种。
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)
醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)
解烷棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)
美棒杆菌(Corynebacterium callunae)
钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
百合棒杆菌(Corynebacterium lilium)
栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)
嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)(Corynebacteriumefficiens)
力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)
散枝短杆菌(Brevibacterium divaricatum)(谷氨酸棒杆菌)
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)(谷氨酸棒杆菌)
Brevibacterium immariophilum
乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒杆菌)
玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)
解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)
硫殖短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)
产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)(停滞棒杆菌(Corynebacteriumstationis))
白色短杆菌(Brevibacterium album)
赌状短杆菌(Brevibacterium cerinum)
嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)
棒状杆菌细菌的具体实例包括以下菌株。
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870
醋谷棒杆菌ATCC 15806
解烷棒杆菌ATCC 21511
美棒杆菌ATCC 15991
钝齿棒杆菌AS1.542
谷氨酸棒杆菌ATCC 13020、ATCC 13032、ATCC 13060、ATCC 13869、FERM BP-734
百合棒杆菌ATCC 15990
栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965
Corynebacterium efficiens(嗜热产氨棒杆菌)AJ12340(FERM BP-1539)
力士棒杆菌ATCC 13868
散枝短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC 14020
黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC 13826、ATCC 14067、AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC 13869
玫瑰色短杆菌ATCC 13825
解糖短杆菌ATCC 14066
硫殖短杆菌ATCC 19240
产氨棒杆菌(停滞棒杆菌)ATCC 6871、ATCC 6872
白色短杆菌ATCC 15111
赌状短杆菌ATCC 15112
嗜氨微杆菌ATCC 15354
棒状杆菌属细菌包括以前分类为短杆菌属(Brevibacterium)，但目前已被联合到棒状杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1991))。此外，停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)包括以前分类为产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)的细菌，但是目前根据16S rRNA等的核苷酸序列分析将其重新分类为停滞棒杆菌的细菌(Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,60,874-879(2010))。
芽孢杆菌属细菌的实例包括例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymixa)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)。枯草芽孢杆菌的具体实例包括例如枯草芽孢杆菌168马尔堡菌株(ATCC 6051)和PY79菌株(Plasmid,1984,12,1-9)。解淀粉芽孢杆菌的具体实例包括例如解淀粉芽孢杆菌T菌株(ATCC 23842)和N菌株(ATCC 23845)。
酵母的实例包括属于酵母属(Saccharomyces)的酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，假丝酵母属(Candida)如产朊假丝酵母(Candida utilis)，毕赤酵母属(Pichia)如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，汉逊酵母属(Hansenula)如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，以及裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
这些菌株可从例如美国典型培养物保藏中心(ATCC，地址：12301Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，United States ofAmerica)获得。也就是说，将登录号分配给相应菌株，并且可以通过使用这些登录号来购买菌株(参见http://www.atcc.org/)。美国典型培养物保藏中心(ATCC)的目录中列出了菌株的登录号。也可以从例如菌株保藏的保藏机构获得这些菌株。
已知氨基酸脱氨酶(AAD)为催化氨基酸氧化脱氨反应的酶(EC 1.4.3.2)。用于本发明的AAD至少使用L-苯丙氨酸作为底物。用于本发明的AAD可以使用或可以不使用任何其他氨基酸作为底物，只要它使用L-苯丙氨酸作为底物。也就是说，在本发明中，术语“AAD”是指具有催化L-苯丙氨酸氧化脱氨以生成苯丙酮酸的反应，即从L-苯丙氨酸、H2O和氧生成苯丙酮酸、H2O2和氨的反应的活性的蛋白质。该活性也称为“AAD活性”。编码AAD的基因也称为“AAD基因”。AAD也称为“氨基酸氧化酶”或“L-苯丙氨酸氧化酶”。AAD的实例包括普罗威登斯菌属细菌例如雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)(WO2009/028338)的AAD，变形杆菌属(Proteus)细菌例如奇异变形杆菌的AAD(Massad G et al.,Proteus mirabilisamino acid deaminase:cloning,nucleotide sequence,and characterization ofaad.J Bacteriol.1995Oct；177(20):5878-83.)，以及其他各种生物体的AAD。雷氏普罗威登斯菌的实例包括雷氏普罗威登斯菌AJ2770菌株(FERM BP-941)和IFO13501菌株。雷氏普罗威登斯菌AJ2770菌株(FERM BP-941)的AAD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，且由该基因编码的AAD的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。SEQ ID NO:11的AAD基因是实施例部分中使用的修饰型AAD基因。雷氏普罗威登斯菌AJ2770菌株(FERM BP-941)的野生型AAD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示。由该野生型AAD基因编码的AAD的氨基酸序列与由该修饰型AAD基因即SEQ ID NO:12编码的AAD的氨基酸序列相同。本发明的微生物可以具有一种AAD，或者两种或更多种AAD。
AAD活性可以通过例如在氧的存在下将酶与底物(即L-苯丙氨酸)温育，并测量产物即苯丙酮酸的酶和底物依赖性产生来测量(Massad G et al.,Proteus mirabilisamino acid deaminase:cloning,nucleotide sequence,and characterization ofaad.J Bacteriol.1995Oct；177(20):5878-83.)。苯丙酮酸的生成可以通过例如测量由于苯丙酮酸和三价铁离子之间的复合物形成引起的着色作为614nm处吸光度的增加来测量。
已知4-羟基扁桃酸合酶(HMAS)为催化α-酮酸如4-羟基苯丙酮酸的氧化脱羧反应的酶(EC 1.13.11.46)。用于本发明的HMAS至少使用苯丙酮酸作为底物。用于本发明的HMAS可以使用或不使用任何其他α-酮酸如4-羟基苯丙酮酸作为底物，只要它使用苯丙酮酸作为底物。也就是说，在本发明中，术语“HMAS”是指具有催化苯丙酮酸氧化脱羧以生成(S)-扁桃酸的反应，即从苯丙酮酸和氧生成(S)-扁桃酸和CO2的反应的活性的蛋白质。该活性也称为“HMAS活性”。编码HMAS的基因也称为“HMAS基因”。HMAS的实例包括拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)细菌例如东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)和Amycolatopsis balhimycina的HMAS，链霉菌属(Streptomyces)细菌例如天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、丰加链霉菌(Streptomyces toyocaensis)和龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)的HMAS，红球菌属(Rhodococcus)细菌例如椿象红球菌(Rhodococcus rhodnii)的HMAS，游动放线菌属(Actinoplanes)细菌例如替考游动放线菌(Actinoplanes teichomyceticus)、直线游动放线菌(Actinoplanes rectilineatus)和Actinoplanes subtropicus的HMAS，拟孢囊菌属(Kibdelosporangium)细菌例如荒漠拟孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)的HMAS，野野村氏菌属(Nonomuraea)细菌例如科克斯野野村氏菌(Nonomuraea coxensis)的HMAS，滑柱菌属(Herpetosiphon)细菌例如橙色滑柱菌(Herpetosiphon aurantiacus)的HMAS，以及其他各种生物体的HMAS。东方拟无枝酸菌、天蓝色链霉菌、丰加链霉菌、椿象红球菌、替考游动放线菌、Amycolatopsis balhimycina、荒漠拟孢囊菌、科克斯野野村氏菌、直线游动放线菌、Actinoplanes subtropicus、龟裂链霉菌和橙色滑柱菌的HMAS基因(经密码子优化用于在大肠杆菌中的表达)的核苷酸序列分别显示为SEQ ID NO:13、15、17、19、21、32、34、36、38、40、42和44，且由这些基因编码的HMAS的氨基酸序列分别显示为SEQ ID NO:14、16、18、20、22、33、35、36、39、41、43和45。本发明的微生物可以具有一种HMAS，或者两种或更多种HMAS。在一个实施方案中，可以从HMAS中排除具有显示为35和39的氨基酸序列的HMAS。在另一个实施方案中，可以从HMAS中排除具有显示为14、16、35和39的氨基酸序列的HMAS。类似地，可以从HMAS基因中排除编码具有显示为35和39的氨基酸序列或显示为14、16、35和39的氨基酸序列的HMAS的HMAS基因。
HMAS活性可以通过例如在氧的存在下将酶与底物(即苯丙酮酸)温育，并测量产物即(S)-扁桃酸的酶和底物依赖性产生来测量(Sun Z et al.,Metabolic engineering ofthe L-phenylalanine pathway inEscherichia coli for the production of S-or R-mandelic acid.Microb Cell Fact.2011Sep 13；10:71.)。
术语“(S)-扁桃酸脱氢酶(SMDH)”是指具有催化(S)-扁桃酸氧化反应生成苯甲酰甲酸的活性的蛋白质(EC 1.1.99.31)。该活性也称为“SMDH活性”。编码SMDH的基因也称为“SMDH基因”。SMDH的实例包括由假单胞菌属(Pseudomonas)细菌例如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的mdlB基因编码的MdlB蛋白质，以及其他各种生物体的SMDH。恶臭假单胞菌的mdlB基因(SMDH基因)的核苷酸序列显示为SEQ ID NO:27，且由该基因编码的MdlB蛋白质(SMDH)的氨基酸序列显示为SEQ ID NO:28。本发明的微生物可以具有一种SMDH，或者两种或更多种SMDH。
SMDH活性可以通过例如在NAD的存在下将酶与底物(即(S)-扁桃酸)温育，并测量NAD的酶和底物依赖性还原来测量(B.S.Al-Baharna and R.Y.Hamzah,Aerobicmetabolismof mandelates by Burkholderia cepacia ATTC 29351.Arab J.Biotech.,Vol.6,No.(1)Jan.(2003):13-28.)。SMDH活性还可以通过例如在吩嗪硫酸甲酯(PMS)和二氯靛酚(DCIP)的存在下将酶与底物(即(S)-扁桃酸)温育，并测量DCIP的酶和底物依赖性还原来测量(同上)。SMDH活性还可以通过例如在铁氰化钾的存在下将酶与底物(即(S)-扁桃酸)在磷酸钠-柠檬酸盐缓冲液中温育，并测量铁氰化钾的酶和底物依赖性还原来测量(Peng Wang et al.,Immobilization of(S)-mandelate dehydrogenase and itscatalytic performance on stereoselective transformation of mandelicacid.Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers Volume 45,Issue 3,May 2014,Pages 744-748.)。
术语“苯甲酰甲酸脱羧酶(BFDC)”是指具有催化苯甲酰甲酸脱羧反应以生成苯甲醛的活性的蛋白质(EC 4.1.1.7)。该活性也称为“BFDC活性”。编码BFDC的基因也称为“BFDC基因”。BFDC的实例包括由假单胞菌属细菌例如恶臭假单胞菌的mdlC基因编码的MdlC蛋白质，以及其他各种生物体的BFDC。恶臭假单胞菌的mdlC基因(BFDC基因)的核苷酸序列显示为SEQ ID NO:29，且由该基因编码的MdlC蛋白质(BFDC)的氨基酸序列显示为SEQ ID NO:30。本发明的微生物可以具有一种BFDC，或者两种或更多种BFDC。
BFDC活性可以通过例如将酶与底物(即苯甲酰甲酸)温育，并测量产物即苯甲醛的酶和底物依赖性产生来测量(Park,J.K.and Jung,J.Y.,Production of benzaldehyde byencapsulated whole-cell benzoylformate decarboxylase,Enzyme Microb Technol,30,726-733,2002.)。
也就是说，苯甲醛生成酶基因各自可以是例如具有以上例示的任何核苷酸序列的基因。另外，苯甲醛生成酶各自可以是例如具有以上例示的任何氨基酸序列的蛋白质。表述“基因或蛋白质具有核苷酸或氨基酸序列”包括基因或蛋白质包含核苷酸或氨基酸序列的情况，以及基因或蛋白质由核苷酸或氨基酸序列组成的情况。
苯甲醛生成酶基因各自可以是以上例示的任何苯甲醛生成酶基因的变体，只要保持其原始功能。类似地，苯甲醛生成酶各自可以是以上例示的任何苯甲醛生成酶的变体，只要保持其原始功能。保持其原始功能的变体也可以称为“保守变体”。保守变体的实例包括例如以上例示的苯甲醛生成酶基因和苯甲醛生成酶的同源物和人工修饰形式。
表述“保持原始功能”意味着基因或蛋白质的变体具有与原始基因或蛋白质的功能(例如活性或性质)对应的功能(例如活性或性质)。用于基因的表述“保持原始功能”意味着基因的变体编码保持原始功能的蛋白质。也就是说，用于AAD基因、HMAS基因、SMDH基因和BFDC基因的表述“保持原始功能”意味着基因的变体分别编码具有AAD活性、HMAS活性、SMDH活性和BFDC活性的蛋白质。用于AAD、HMAS、SMDH和BFDC的表述“保持原始功能”意味着蛋白质的变体分别具有AAD活性、HMAS活性、SMDH活性和BFDC活性。
以下将解释保守变体的实例。
苯甲醛生成酶基因的同源物或苯甲醛生成酶的同源物可以容易地从公共数据库中获得，通过例如使用以上例示的苯甲醛生成酶基因的任何核苷酸序列或以上例示的苯甲醛生成酶的任何氨基酸序列作为查询序列的BLAST搜索或FASTA搜索。此外，苯甲醛生成酶基因的同源物可以通过例如使用生物体例如细菌和酵母的染色体作为模板，和基于以上例示的苯甲醛生成酶基因的任何核苷酸序列制备的寡核苷酸作为引物的PCR获得。
苯甲醛生成酶基因各自可以是编码具有任何上述氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:12所示的关于AAD的氨基酸序列；SEQ ID NO:14、16、18、20、22、33、35、36、39、41、43或45所示的关于HMAS的氨基酸序列；SEQ ID NO:28所示的关于SMDH的氨基酸序列；和SEQ ID NO:30所示的关于BFDC的氨基酸序列)的蛋白质的基因，所述氨基酸序列包括一个或几个位置处的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，只要保持原始功能。例如，编码的蛋白质可以具有延伸或缺失的N端和/或C端。尽管上文使用的术语“一个或几个”所指的数字可以根据蛋白质的三维结构中的氨基酸残基的位置或氨基酸残基的类型而不同，具体地，其例如为1至50，1至40，或1至30，优选1至20，更优选1至10，仍更优选1至5，特别优选1至3。
上述一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加各自是保持蛋白质的原始功能的保守突变。保守突变的典型实例是保守取代。保守取代是下述突变，其中若取代位点是芳香族氨基酸，则在Phe、Trp和Tyr中相互取代；若它是疏水性氨基酸，则在Leu、Ile和Val中相互取代；若它是极性氨基酸，则在Gln和Asn之间相互取代；若它是碱性氨基酸，则在Lys、Arg和His中相互取代；若它是酸性氨基酸，则在Asp和Glu之间相互取代；并且若它是具有羟基的氨基酸，则在Ser和Thr之间相互取代。认为是保守取代的取代的实例包括，具体而言，从Ala向Ser或Thr的取代、从Arg向Gln、His或Lys的取代、从Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的取代、从Asp向Asn、Glu或Gln的取代、从Cys向Ser或Ala的取代、从Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的取代、从Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的取代、从Gly向Pro的取代、从His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的取代、从Ile向Leu、Met、Val或Phe的取代、从Leu向Ile、Met、Val或Phe的取代、从Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的取代、从Met向Ile、Leu、Val或Phe的取代、从Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代、从Ser向Thr或Ala的取代、从Thr向Ser或Ala的取代、从Trp向Phe或Tyr的取代、从Tyr向His、Phe或Trp的取代及从Val向Met、Ile或Leu的取代。此外，如上所述的氨基酸残基的此类取代、缺失、插入、添加等包括因基于基因来源的生物体的个体差异、种类的不同的情况等天然产生的突变(突变体或变体)。
此外，苯甲醛生成酶基因各自可以是编码具有与任何上述氨基酸序列的总氨基酸序列显示例如50％或更多、65％或更多，或80％或更多，优选90％或更多，更优选95％或更多，仍更优选97％或更多，特别优选99％或更多的同源性的氨基酸序列的蛋白质的基因，只要保持原始功能。另外，在本说明书中，“同源性”意味着“同一性”。具体而言，对于SEQ IDNO:22的情况，同一性可以是95％或更多。
此外，苯甲醛生成酶基因各自可以是能够在严格条件下与可以从任何上述核苷酸序列(例如SEQ ID NO:11所示的关于AAD基因的核苷酸序列；SEQ ID NO:13、15、17、19、21、32、34、36、38、40、42或44所示的关于HMAS基因的核苷酸序列；SEQ ID NO:27所示的关于SMDH基因的核苷酸序列；和SEQ ID NO:29所示的关于BFDC基因的核苷酸序列)制备的探针杂交的基因例如DNA，例如与任何上述核苷酸序列的整个序列或部分序列互补的序列，只要保持原始功能。“严格条件”是指形成所谓的特异性杂交且不形成非特异性杂交的条件。严格条件的实例包括高同源性的DNA彼此杂交，例如不少于50％、65％、或80％同源性，优选不少于90％同源性，更优选不少于95％同源性，仍更优选不少于97％同源性，特别优选不少于99％同源性的DNA彼此杂交，而较上述同源性低的DNA彼此不杂交的条件，或者典型的Southern杂交的清洗的条件，即在相当于60℃、1×SSC、0.1％SDS，优选60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，更优选68℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度及温度下洗涤1次、优选2或3次的条件。
如上所述，用于上述杂交的探针可以是基因的互补序列的一部分。此类探针可以通过使用基于公知的基因序列制备的寡核苷酸作为引物，及含有任何上述基因的DNA片段作为模板的PCR来制备。例如，可以使用具有约300bp长度的DNA片段作为探针。特别地，当使用约300bp长度的DNA片段作为探针时，杂交的清洗的条件可以是例如50℃、2×SSC和0.1％SDS。
此外，由于关于密码子简并性的性质根据宿主而改变，苯甲醛生成酶基因各自可以包括对于任意密码子的相应等同密码子的取代。也就是说，由于遗传密码的简并性，苯甲醛生成酶基因各自可以是上文例示的任何苯甲醛生成酶基因的变体。例如，苯甲醛生成酶基因各自可以是经修饰的基因，使得其具有根据所用宿主中密码子频率的最佳密码子。
可以通过例如使用数学算法确定两个序列间的序列同一性的百分比。此类数学算法的非限制性实例包括Myers和Miller(1988)CABIOS 4:11-17的算法、Smith et al.(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的同源性比对算法、Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的用于搜索同源性的方法、和Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264的算法的修改形式，例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877中描述的算法。
通过使用基于此类数学算法的程序，可以实施用于确定序列同一性的序列比较(即比对)。程序可以由计算机适当执行。此类程序的实例包括但不限于PC/Gene程序(可购自Intelligenetics,MountainView,Calif.)的CLUSTAL、ALIGN程序(Version 2.0)、和WisconsinGenetics Software Package，Version 8(可购自Genetics Computer Group(GCG),575Science Drive,Madison,Wis.,USA)的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、和TFASTA。可以通过使用例如初始参数实施使用这些程序的比对。CLUSTAL程序详细描述于Higgins etal.(1988)Gene 73:237-244(1988)、Higgins et al.(1989)CABIOS 5:151-153、Corpet etal.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90、Huang et al.(1992)CABIOS 8:155-65及Pearson et al.(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-331。
为了获得与靶核苷酸序列同源的核苷酸序列，特别地，例如可以通过使用具有得分100和字长度12的BLASTN程序实施BLAST核苷酸搜索。为了获得与靶蛋白同源的氨基酸序列，特别地，例如可以通过使用具有得分50和字长度3的BLASTX程序实施BLAST蛋白质搜索。关于BLAST核苷酸搜索和BLAST蛋白质搜索，参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。另外，为了比较目的，可以使用缺口BLAST(BLAST 2.0)以获得包含缺口的比对。另外，可以使用PSI-BLAST以实施用于检测序列间的远离关系的重复搜索。关于缺口BLAST和PSI-BLAST，参见Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389。当使用BLAST、缺口BLAST、或PSI-BLAST时，可以使用每种程序(例如对于核苷酸序列为BLASTN，并且对于氨基酸序列为BLASTX)的初始参数。也可以手动实施比对。
两个序列间的序列同一性作为当以使彼此最大符合来比对两个序列时，两个序列中匹配的残基的比率来计算。
HMAS的实例还包括具有“特定突变”的HMAS。另外，HMAS基因的实例还包括编码具有“特定突变”的HMAS的HMAS基因。具有“特定突变”的HMAS也称为“突变体HMAS”。编码突变体HMAS的基因也称为“突变体HMAS基因”。
不具有“特定突变”的HMAS也称为“野生型HMAS”。编码野生型HMAS的基因也称为“野生型HMAS基因”。本文所指的术语“野生型”是为了方便区分“野生型”HMAS和“突变体”HMAS而使用，并且“野生型”HMAS不限于作为天然物质获得的那些，并且包括任何不具有“特定突变”的HMAS。野生型HMAS的实例包括例如上文例示的HMAS。另外，上文例示的HMAS的所有保守变体都应包括在野生型HMAS中，条件是此类保守变体不具有“特定突变”。
突变体HMAS可以与野生型HMAS相同，例如上文例示的HMAS和其保守变体，条件是突变体HMAS具有“特定突变”。也就是说，突变体HMAS可以是具有野生型HMAS的任何氨基酸序列，但具有“特定突变”的蛋白质。具体而言，突变体HMAS可以是例如具有如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的蛋白质，条件是所述突变体HMAS具有“特定突变”。另外，具体而言，突变体HMAS可以是例如具有如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，但该氨基酸序列包括一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的蛋白质，条件是所述突变体HMAS具有“特定突变”。另外，具体而言，突变体HMAS可以是例如具有与SEQ ID NO:22的氨基酸序列显示50％或更多，65％或更多，或80％或更多，90％或更多，95％或更多，97％或更多，或99％或更多的同一性的氨基酸序列的蛋白质，条件是该突变体HMAS具有“特定突变”。
在用作野生型HMAS的保守变体中，保守突变可以发生在“特定突变”位置以外的位置。即，换句话说，突变体HMAS可以是具有以上例示的HMAS的任何氨基酸序列，但是具有“特定突变”并且还包括在“特定突变”位置以外的位置的保守突变例如一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的蛋白质。
“特定突变”可以是对苯甲醛的生产有效的突变，例如导致本发明的方法中苯甲醛的生产增加的突变。此类苯甲醛的生产的增加可以是由于例如HMAS生成的(S)-扁桃酸的增加。因此，“特定突变”也可以是导致HMAS生成的(S)-扁桃酸增加的突变。
“特定突变”的实例包括对应于T2、M3、G5、Y18、A27、D35、E46、E180、A187、E191、V194、A199、D201、Q206、I217、D220、T222、G255、F319、G327、I336、K337、V343和Q347的氨基酸残基处的突变。“特定突变”可以由一个氨基酸残基处的突变组成，或者可以由两个或更多个氨基酸残基处的突变的组合组成。也就是说，“特定突变”可以包含例如与选自下组的一个或多个氨基酸残基对应的氨基酸残基处的突变或者由其组成：T2、M3、G5、Y18、A27、D35、E46、E180、A187、E191、V194、A199、D201、Q206、I217、D220、T222、G255、F319、G327、I336、K337、V343和Q347。
在上述用于定义氨基酸残基的符号中，数字代表在如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的位置，并且数字左侧的字母代表如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中相应位置处的氨基酸残基(即在相应位置处修饰前的氨基酸残基)。也就是说，例如“T2”代表如SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列中位置2处的T(Thr)残基。
在上述突变的每一个中，修饰后的氨基酸残基可以是除修饰前的氨基酸残基以外的任意氨基酸残基。修饰后的氨基酸残基的实例包括K(Lys)、R(Arg)、H(His)、A(Ala)、V(Val)、L(Leu)、I(Ile)、G(Gly)、S(Ser)、T(Thr)、P(Pro)、F(Phe)、W(Trp)、Y(Tyr)、C(Cys)、M(Met)，D(Asp)、E(Glu)、N(Asn)和Q(Gln)，条件是修饰后的氨基酸残基不同于修饰前的氨基酸残基。作为修饰后的氨基酸残基，可以选择对于苯甲醛的生产有效的那些。
“特定突变”的具体实例包括对应于T2N、M3I、G5R、Y18F、A27V、D35G、E46Q、E180K、A187V、E191K、V194G、A199(S,V)、D201N、Q206R、I217(L,V)、D220(A,N)、T222S、G255D、F319Y、G327(D,S)、I336V、K337Q、V343M和Q347L的突变。也就是说，在对应于T2、M3、G5、Y18、A27、D35、E46、E180、A187、E191、V194、A199、D201、Q206、I217、D220、T222、G255、F319、G327、I336、K337、V343和Q347的氨基酸残基处的突变可以是例如分别对应于T2N、M3I、G5R、Y18F、A27V、D35G、E46Q、E180K、A187V、E191K、V194G、A199(S,V)、D201N、Q206R、I217(L,V)、D220(A,N)、T222S、G255D、F319Y、G327(D,S)、I336V、K337Q、V343M和Q347L的突变。“特定突变”可以包含例如与选自下组的一种或多种突变对应的突变或者由其组成：T2N、M3I、G5R、Y18F、A27V、D35G、E46Q、E180K、A187V、E191K、V194G、A199(S,V)、D201N、Q206R、I217(L,V)、D220(A,N)、T222S、G255D、F319Y、G327(D,S)、I336V、K337Q、V343M和Q347L。
在上述用于定义突变的符号中，数字和数字左侧的字母表示与上述相同。在上述用于定义突变的符号中，数字右侧的字母代表在相应位置处修饰后的氨基酸残基。也就是说，例如，“T2N”代表用N(Asn)残基替换SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中位置2的T(Thr)残基的突变。另外，例如，A199(S,V)代表用S(Ser)或V(Val)残基替换SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中位置199处的A(Ala)残基的突变。
突变的组合没有特别限制。突变组合的具体实例包括M3I/A199S/G255D、Y18F/D220N、A27V/E191K、D35G/E46Q/T222S/I336V、E180K/I217V/D220N、A187V/I217V、A199V/I217V/K337Q、D201N/I217V、I217V/F319Y和D220A/Q347L。也就是说，“特定突变”可以包括例如对应于这些组合中的任一种的突变或者由其组成。
在上述用于定义组合的符号中，数字和数字左侧和右侧的字母表示与上述相同。在上述用于定义组合的符号中，一起标注并插入“/”的两个或更多个突变代表双重或更多重突变。也就是说，例如“M3I/A199S/G255D”代表M3I、A199S和G255D的三重突变。
“与SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中的位置X处的氨基酸残基处的突变对应的突变”应当解读为与SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中位置X处的氨基酸残基对应的氨基酸残基处的突变。也就是说，例如“与T2N对应的突变”代表用N(Asn)残基替换与T2对应的氨基酸残基的突变。
氨基酸序列中的“位置X”是指从氨基酸序列的N末端计数的第X位，并且N末端的氨基酸残基为位置1的氨基酸残基。上述突变中定义的位置代表相对位置，并且其绝对位置可以由于氨基酸残基的缺失、插入、添加等而移动。例如，若在SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中位置X的N端侧的位置缺失或插入一个氨基酸残基，则最初在位置X处的氨基酸残基重新定位于位置X-1或X+1，然而，其仍被视为“与SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列位置X处的氨基酸残基对应的氨基酸残基”。
在上述例示突变中定义的修饰前的氨基酸残基是典型的氨基酸残基，但不一定限于此。例如，“对应于T2的氨基酸残基”通常可以是T(Thr)残基，然而它可以不必然是T(Thr)残基。也就是说，当野生型HMAS具有除SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列以外的氨基酸序列时，“对应于T2的氨基酸残基”可以是除T(Thr)残基以外的氨基酸残基。因此，“对应于T2N的突变”不仅包括当“对应于T2的氨基酸残基”是T(Thr)残基时用N(Asn)残基替换该T(Thr)残基的突变，还包括当“对应于T2的氨基酸残基”是K(Lys)、R(Arg)、H(His)、A(Ala)、V(Val)、L(Leu)、I(Ile)、G(Gly)、S(Ser)、P(Pro)、F(Phe)、W(Trp)、C(Cys)、M(Met)、D(Asp)、E(Glu)或Q(Gln)残基时，用N(Asn)残基替换该残基的突变。其他突变可以同样比照适用。
在任意HMAS的氨基酸序列中，哪个氨基酸残基是“对应于SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列中位置X处的氨基酸残基的氨基酸残基”可以通过比对任意HMAS的氨基酸序列和SEQ ID NO:22的氨基酸序列来确定。可以通过例如使用已知的基因分析软件实施比对。此类软件的具体实例包括由Hitachi Solutions生产的DNASIS，由Genetyx生产的GENETYX等(Elizabeth C.Tyler et al.,Computers and Biomedical Research,24(1)72-96,1991；Barton GJ et al.,Journal of Molecular Biology,198(2),327-37,1987)。
本发明的微生物或其各个部分，即构成本发明的微生物的单一微生物或多种微生物的每一种，可以是固有具有苯甲醛生成酶基因的微生物，或者可以是经修饰以使其具有苯甲醛生成酶基因的微生物。固有具有苯甲醛生成酶基因的微生物的实例包括如上所述的从其衍生苯甲醛生成酶的微生物。经修饰以使其具有苯甲醛生成酶基因的微生物的实例包括导入了苯甲醛生成酶基因的微生物。此外，代替或者除本发明的微生物或其各个部分固有具有的苯甲醛生成酶基因之外，本发明的微生物或其各个部分，即构成本发明的微生物的单一微生物或多种微生物的每一种，可以导入适当的苯甲醛生成酶基因。将要导入苯甲醛生成酶基因的微生物和已经导入苯甲醛生成酶基因的微生物也统称为“宿主”。
苯甲醛生成酶基因可以通过例如从具有苯甲醛生成酶基因的生物体中克隆获得。对于克隆，可以使用含有该基因的核苷酸，例如基因组DNA和cDNA。或者，苯甲醛生成酶基因可以通过例如化学合成来获得(Gene,60(1),115-127(1987))。
获得的苯甲醛生成酶基因可以以其本身使用，或者可以在使用前进行修饰。也就是说，例如，可以修饰获得的苯甲醛生成酶基因从而获得其变体。可以通过使用已知的方法修饰基因。例如，可以通过位点特异性诱变方法将目标突变导入DNA的靶位点。也就是说，例如，可以通过位点特异性诱变方法修饰基因的编码区以使所编码蛋白质的特定位点包括氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加。位点特异性诱变方法的实例包括使用PCR的方法(Higuchi,R.,61,inPCR Technology,Erlich,H.A.Eds.,Stockton Press,1989；CarterP.,Meth.,inEnzymol.,154,382,1987)和使用噬菌体的方法(Kramer,W.and Frits,H.J.,Meth.inEnzymol.,154,350,1987；Kunkel,T.A.et al.,Meth.in Enzymol.,154,367,1987)。
另外，可以通过例如修饰野生型HMAS基因来获得突变体HMAS基因，从而使得所编码的HMAS具有“特定突变”。可以通过使用已知的方法例如位点特异性诱变方法来实施此类修饰。或者，可以在不使用野生型HMAS基因的情况下获得突变体HMAS基因。例如，可以通过化学合成直接获得突变体HMAS。获得的HMAS基因可以以其本身使用，或者可以在使用前进一步修饰。
将苯甲醛生成酶基因导入宿主的方法没有特别限制。苯甲醛生成酶基因被宿主以可表达的方式含有是足够的。苯甲醛生成酶基因可以通过与下文“增加蛋白质的活性的方法”中所述的基因的导入相同的方式导入微生物。
另外，当微生物在其染色体等上已经具有HMAS基因时，通过将“特定突变”导入染色体等上的HMAS基因，所述微生物也可以经修饰以具有突变体HMAS基因。可以通过例如天然突变、诱变处理或基因工程将突变导入染色体等上的基因。
此外，本发明的微生物可以是固有具有L-苯丙氨酸生产能力的微生物，或者可以是经修饰以使其具有L-苯丙氨酸生产能力的微生物。具有L-苯丙氨酸生产能力的微生物可以通过向如上所述的此类微生物赋予L-苯丙氨酸生产能力，或者通过增强如上所述微生物的L-苯丙氨酸生产能力而获得。
以下，将说明赋予或增强L-苯丙氨酸生产能力的方法的具体实例。如下文所例示的为赋予或增强L-苯丙氨酸生产能力的此类修饰可以独立使用或可以以任何适当的组合使用。
赋予或增强L-苯丙氨酸生产能力的方法的实例包括增加L-苯丙氨酸生物合成酶活性的方法。也就是说，本发明的微生物可以经修饰以使L-苯丙氨酸生物合成酶的活性增加。可以增加一种L-苯丙氨酸生物合成酶的活性，或者可以增加两种或更多种L-苯丙氨酸生物合成酶的活性。下文将描述增加蛋白质(酶等)的活性的方法。可以通过例如增加编码蛋白质的基因的表达来增加蛋白质(酶等)的活性。
L-苯丙氨酸生物合成酶的实例包括芳香族氨基酸的通用生物合成酶，例如3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(aroF,aroG,aroH)、3-脱氢奎尼酸合酶(aroB)、3-脱氢奎尼酸脱水酶(aroD)、莽草酸脱氢酶(aroE)、莽草酸激酶(aroK,aroL)、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(aroA)和分支酸合成酶(aroC)；以及分支酸变位酶(pheA)、预苯酸脱水酶(pheA)和酪氨酸转氨酶(tyrB)。在酶的名称之后的括号中显示的是编码酶的基因名称的实例(同样适用于下文的相同情况)。分支酸变位酶和预苯酸脱水酶可以由pheA基因编码为双功能酶。编码一些L-苯丙氨酸生物合成酶如DAHP合酶、3-脱氢奎尼酸合酶和3-脱氢奎尼酸脱水酶的基因的表达可以被酪氨酸阻遏物TyrR抑制，TyrR由tyrR基因编码。因此，可以通过例如降低酪氨酸阻遏物TyrR的活性来增加L-苯丙氨酸生物合成酶的活性。另外，一些L-苯丙氨酸生物合成酶可受到芳香族氨基酸例如L-苯丙氨酸的反馈抑制。例如，双功能分支酸变位酶-预苯酸脱水酶可受到L-苯丙氨酸的反馈抑制。因此，可以通过例如使用编码对此类反馈抑制脱敏的突变体L-苯丙氨酸生物合成酶的基因来增加L-苯丙氨酸生物合成酶的活性。
用于赋予或增强L-苯丙氨酸生产能力的方法的实例还包括降低参与除L-苯丙氨酸以外的物质的副生产的酶的活性的方法。此类除L-苯丙氨酸以外的物质也称为“副产物”。副产物的实例包括其他芳香族氨基酸例如L-酪氨酸和L-色氨酸。参与L-酪氨酸的副生产的酶的实例包括双功能酶分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶(tyrA)。
L-苯丙氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例包括例如分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶和酪氨酸阻遏物缺陷的大肠杆菌AJ12739(tyrA::Tn10,tyrR)(VKPM B-8197)(WO03/044191)，分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶和酪氨酸阻遏物缺陷，并且含有编码对反馈抑制脱敏的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶的突变体aroG基因、编码对反馈抑制脱敏的分支酸变位酶-预苯酸脱水酶的突变体pheA基因和编码莽草酸激酶的aroL基因的大肠杆菌AJ12741(JP H05-344881A)，含有编码对反馈抑制脱敏的分支酸变位酶-预苯酸脱水酶的pheA34基因的大肠杆菌HW1089(ATCC 55371)(美国专利号5,354,672)，大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681),大肠杆菌NRRLB-12141、NRRLB-12145、NRRLB-12146和NRRL B-12147(美国专利号4,407,952)。L-苯丙氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例还包括例如大肠杆菌K-12<W3110(tyrA)/pPHAB>(FERM BP-3566)、大肠杆菌K-12<W3110(tyrA)/pPHAD>(FERM BP-12659)、大肠杆菌K-12<W3110(tyrA)/pPHATerm>(FERM BP-12662)和大肠杆菌K-12AJ12604<W3110(tyrA)/pBR-aroG4,pACMAB>(FERM BP-3579)，其含有编码对反馈抑制脱敏的分支酸变位酶-预苯酸脱水酶的基因(EP 488424B1)。L-苯丙氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例还包括例如属于埃希氏菌属且具有增加的由yedA基因或yddG基因编码的蛋白质的活性的菌株(美国专利公开申请号2003/0148473和2003/0157667,WO03/044192)。L-苯丙氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例还包括例如谷氨酸棒杆菌菌株BPS-13(FERM BP-1777)、K77(FERM BP-2062)和K78(FERM BP-2063)(EP 331145 A,JP H02-303495 A)，其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸激酶活性降低，以及棒状杆菌细菌的酪氨酸营养缺陷型菌株(JP H05-049489A)。
用于培育具有L-苯丙氨酸生产能力的微生物的基因和蛋白质可以分别具有例如已知的核苷酸序列和氨基酸序列。此外，用于培育具有L-苯丙氨酸生产能力的微生物的基因和蛋白质可以分别是具有已知的核苷酸序列和氨基酸序列的基因和蛋白质的保守变体。具体而言，例如，用于培育具有L-苯丙氨酸生产能力的微生物的基因可以各自是编码以下蛋白质的基因，所述蛋白质具有已知的蛋白质的氨基酸序列，但包括一个或几个位置处的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，只要保持所述蛋白质的原始功能，即酶活性等。对于基因和蛋白质的保守变体，上述关于苯甲醛生成酶基因和苯甲醛生成酶的保守变体的描述可以比照适用。
本发明的微生物还可以具有其他任意修饰，只要实现苯甲醛的生产即可。
用于构建本发明的微生物的修饰的顺序没有特别限制。
<1-2>增加蛋白质活性的方法
以下，将说明增加蛋白质活性的方法，包括基因的导入的方法。
表述“蛋白质的活性增加”是指与未修饰菌株相比，蛋白质的活性增加。具体而言，表达“蛋白质的活性增加”可以指与未修饰菌株相比，每细胞的蛋白质的活性增加。本文使用的术语“未修饰菌株”是指未经修饰以增加目标蛋白的活性的对照菌株。未修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。未修饰菌株的具体实例包括微生物物种的相应类型菌株。未修饰菌株的具体实例还包括上文关于微生物描述例示的菌株。也就是说，在一个实施方案中，蛋白质的活性可以与类型菌株，即微生物所属物种的类型菌株相比增加。在另一个实施方案中，蛋白质的活性也可以与谷氨酸棒杆菌ATCC 13869菌株相比增加。在另一个实施方案中，蛋白质的活性也可以与谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌株相比增加。在另一个实施方案中，蛋白质的活性也可以与大肠杆菌K-12 MG1655菌株相比增加。状态“蛋白质的活性增加”也可以表达为“蛋白质的活性增强”。更具体地，表述“蛋白质的活性增加”可以意味着与未修饰菌株相比，每细胞的蛋白质的分子数目增加，和/或蛋白质的每个分子的功能增加。也就是说，表述“蛋白质的活性增加”中的术语“活性”不限于蛋白质的催化活性，而是也可以指编码蛋白质的基因的转录量(即mRNA的量)或蛋白质的翻译量(即蛋白质的量)。此外，状态“蛋白质的活性增加”不仅包括在固有具有目标蛋白质的活性的菌株中目标蛋白质的活性增加的状态，而且还包括对不固有具有目标蛋白质活性的菌株赋予目标蛋白质的活性的状态。此外，只要蛋白质的活性最终增加，可以减弱和/或消除宿主中固有包含的目标蛋白质的活性，然后可以对宿主赋予适当类型的目标蛋白质。
蛋白质的活性增加的程度没有特别限制，只要与未修饰菌株相比蛋白质的活性增加即可。蛋白质的活性可以增加至例如未修饰菌株的蛋白质活性的1.2倍或更多、1.5倍或更多、2倍或更多、或3倍或更多。此外，当未修饰的菌株不具有目标蛋白质的活性时，由于导入编码蛋白质的基因而产生蛋白质就足够了，例如蛋白质可以以可测量到其活性的程度产生。
可以通过例如增加编码蛋白质的基因的表达来实现用于增加蛋白质活性的修饰。表述“基因的表达增加”是指与未修饰菌株如野生型菌株和亲本菌株相比，基因的表达增加。具体而言，表述“基因的表达增加”可以指与未修饰菌株相比，每细胞的基因的表达量增加。更具体地，表述“基因的表达增加”可以指基因的转录量(即mRNA的量)增加，和/或基因的翻译量(即从基因表达的蛋白质的量)增加。状态“基因的表达增加”也称为“基因的表达增强”。基因的表达可以增加至例如未修饰菌株的基因表达的1.2倍或更多、1.5倍或更多、2倍或更多、或3倍或更多。此外，状态“基因的表达增加”不仅包括在固有表达目标基因的菌株中目标基因的表达量增加的状态，而且还包括将基因导入到不固有表达目标基因的菌株中并且在其中表达的状态。也就是说，短语“基因的表达增加”也可以意味着例如将目标基因导入不具有该基因的菌株中，并且在其中表达。
可以通过例如增加基因的拷贝数来增加基因的表达。
可以通过将基因导入宿主的染色体增加基因的拷贝数。可以通过例如使用同源重组(Miller,J.H.,Experiments inMolecular Genetics,1972,Cold Spring HarborLaboratory)将基因导入染色体中。利用同源重组的基因转移方法的实例包括例如使用线性DNA的方法，例如Red驱动的整合(Datsenko,K.A.,and Wanner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:6640-6645(2000))，使用含有温度敏感性复制起点的质粒的方法，使用能够接合转移的质粒的方法，使用不具有在宿主中发挥功能的复制起点的自杀载体的方法，以及使用噬菌体的转导方法。可以仅导入基因的一个拷贝，或者可以导入基因的两个或更多个拷贝。例如，通过使用在染色体上以多个拷贝存在的序列作为靶标进行同源重组，可将多个拷贝的基因导入染色体。以多个拷贝存在于染色体上的此类序列的实例包括重复DNA和位于转座子两端的反向重复序列。或者，可以通过使用染色体上适当的序列，例如对于生产目标物质不必需的基因作为靶标来进行同源重组。此外，也可以通过使用转座子或Mini-Mu(日本专利公开(Kokai)号2-109985，美国专利号5,882,888，EP 805867B1)将基因随机导入染色体。
可以通过使用具有与全基因或其一部分互补的序列的探针的Southern杂交，使用基于该基因序列制备的引物的PCR等确认靶基因向染色体的导入。
此外，还可以通过将含有基因的载体导入宿主中来增加基因的拷贝数。例如，可以通过将含有靶基因的DNA片段与在宿主中发挥功能的载体连接来构建基因的表达载体，并用表达载体转化宿主来增加基因的拷贝数。含有靶基因的DNA片段可以通过例如使用具有目标基因的微生物的基因组DNA作为模板的PCR获得。作为载体，可以使用在宿主细胞中自主复制的载体。载体优选为多拷贝载体。此外，载体优选具有用于选择转化体的如抗生素抗性基因等标志物。此外，载体可以具有用于表达导入的基因的启动子和/或终止子。载体可以是例如源自细菌质粒的载体、源自酵母质粒的载体、源自噬菌体的载体、粘粒、噬菌粒等。在肠杆菌科细菌如大肠杆菌中自主复制的载体的具体实例包括，例如pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29(所有这些可购自Takara Bio)、pACYC184、pMW219(NIPPON GENE)、pTrc99A(Pharmacia)、pPROK系列载体(Clontech)、pKK233-2(Clontech)、pET系列载体(Novagen)、pQE系列载体(QIAGEN)、pCold TF DNA(Takara Bio)、pACYC系列载体、和广宿主谱载体RSF1010。在棒状杆菌细菌中自主复制的载体的具体实例包括例如pHM1519(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；pAM330(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；通过改善这些并且具有药物抗性基因获得的质粒；日本专利公开(Kokai)号3-210184中描述的质粒pCRY30；日本专利公开(Kokai)号2-72876和美国专利号5,185,262中描述的质粒pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE、和pCRY3KX；日本专利公开(Kokai)号1-191686中描述的质粒pCRY2和pCRY3；日本专利公开(Kokai)号58-192900中描述的pAJ655、pAJ611和pAJ1844；日本专利公开(Kokai)号57-134500中描述的pCG1；日本专利公开(Kokai)号58-35197中描述的pCG2；日本专利公开(Kokai)号57-183799中描述的pCG4和pCG11；日本专利公开(Kokai)号10-215883中描述的pVK7；WO2007/046389中描述的pVK9；WO2013/069634中描述的pVS7；和日本专利公开(Kokai)号9-070291中描述的pVC7。
当导入基因时，该基因被宿主以可表达的方式含有是足够的。具体而言，基因存在于宿主中以使其在宿主中发挥功能的启动子的控制下表达是足够的。术语“在宿主中发挥功能的启动子”是指在宿主中显示启动子活性的启动子。启动子可以是源自宿主的启动子，或异源启动子。启动子可以是待导入的基因的天然启动子或另一基因的启动子。作为启动子，例如还可以使用后述的此类更强的启动子。
用于终止基因转录的终止子可以位于基因的下游。终止子没有特别限制，只要它在宿主中发挥功能。终止子可以是源自宿主的终止子，或异源终止子。终止子可以是待导入的基因的天然终止子，或另一基因的终止子。终止子的具体实例包括例如T7终止子、T4终止子、fd噬菌体终止子、tet终止子和trpA终止子。
可用于各种微生物的载体、启动子和终止子详细公开于"FundamentalMicrobiology Vol.8,Genetic Engineering,KYORITSU SHUPPAN CO.,LTD,1987"中，并且可以使用那些。
此外，当导入两个或更多个基因时，基因各自被宿主以可表达方式含有是足够的。例如，所有基因可以由单个表达载体或染色体携带。此外，基因可以由两个或更多个表达载体分开携带，或者由单个或两个或更多个表达载体和染色体分开携带。还可以导入由两个或更多个基因构成的操纵子。“导入两个或更多个基因”的情况包括例如导入编码两种或更多种蛋白质(例如酶)的相应基因的情况、导入编码构成单个蛋白质复合物(例如酶复合物)的两个或更多个亚基的相应基因的情况，以及上述情况的组合。
要导入的基因没有特别限制，只要它编码在宿主中发挥功能的蛋白质。要导入的基因可以是源自宿主的基因，或者可以是异源基因。可以通过例如使用基于该基因的核苷酸序列设计的引物，并且使用具有该基因的生物体的基因组DNA、携带该基因的质粒等作为模板的PCR来获得要导入的基因。也可以例如基于该基因的核苷酸序列来完全合成要导入的基因(Gene,60(1),115-127(1987))。所获得的基因可以以其本身使用，或根据需要进行修饰后使用。也就是说，可以通过修饰该基因获得基因的变体。基因可以通过已知技术进行修饰。例如，可以通过位点特异性突变方法将目标突变导入DNA的目标位点。也就是说，可以通过位点特异性突变方法修饰基因的编码区域，使得编码的蛋白质的特定位点包括氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。位点特异性突变方法的实例包括利用PCR的方法(Higuchi,R.,61,inPCR Technology,Erlich,H.A.Eds.,Stockton Press(1989)；Carter,P.,Meth.inEnzymol.,154,382(1987))，和利用噬菌体的方法(Kramer,W.and Frits,H.J.,Meth.inEnzymol.,154,350(1987)；Kunkel,T.A.et al.,Meth.inEnzymol.,154,367(1987))。或者，可以完全合成基因的变体。
另外，当蛋白质作为由多个亚基组成的复合物发挥功能时，可以修饰多个亚基的部分或全部，只要蛋白质的活性最终增加即可。也就是说，例如，通过增加基因的表达来增加蛋白质的活性时，可以增强编码亚基的部分或全部基因的表达。通常优选增强编码亚基的全部基因的表达。此外，构成复合物的亚基可以源自单种生物体或两种或更多种生物体，只要该复合物具有目标蛋白质的功能即可。也就是说，例如，可以将编码多个亚基的相同生物体的基因导入宿主，或者可以将编码多个亚基的不同生物体的基因导入宿主中。
此外，可以通过改进基因的转录效率增加基因的表达。另外，还可以通过改进基因的翻译效率来增加基因的表达。基因的转录效率和基因的翻译效率可以通过例如修饰基因的表达控制序列来改进。术语“表达控制序列”统指影响基因表达的位点。表达控制序列的实例包括例如启动子、Shine-Dalgarno(SD)序列(也称为核糖体结合位点(RBS))，和RBS与起始密码子之间的间隔区。可以通过使用启动子搜索载体或基因分析软件如GENETYX鉴定表达控制序列。这些表达控制序列可以通过例如使用温度敏感载体的方法或Red驱动整合法(WO2005/010175)进行修饰。
可以通过例如用较强的启动子替换染色体上基因的启动子来改进基因的转录效率。术语“较强的启动子”是指与基因的固有存在的野生型启动子相比，提供基因的改进转录的启动子。较强的启动子的实例包括例如已知的高表达启动子如T7启动子、trp启动子、lac启动子、thr启动子、tac启动子、trc启动子、tet启动子、araBAD启动子、rpoH启动子、msrA启动子、Pm1启动子(源自双歧杆菌属)、PR启动子和PL启动子。可用于棒状杆菌细菌的较强的启动子的实例包括例如人工修饰的P54-6启动子(Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,674-679(2000))，在棒状杆菌细菌中用乙酸、乙醇、丙酮酸等可诱导的pta、aceA、aceB、adh和amyE启动子，和cspB、SOD和tuf(EF-Tu)启动子，其是能够在棒状杆菌细菌中提供大表达量的强启动子(Journal of Biotechnology,104(2003)311-323；Appl.Environ.Microbiol.,2005Dec；71(12):8587-96)，以及lac启动子、tac启动子和trc启动子。此外，作为较强的启动子，也可以通过使用各种报告基因获得高活性型的现有启动子。例如，通过使启动子区域中的-35和-10区域更接近共有序列，可以增强启动子的活性(WO00/18935)。高活性型启动子的实例包括各种tac样启动子(Katashkina JI et al.，俄罗斯联邦专利申请号2006134574)。Goldsteinet al.的文章(Prokaryotic PromotersinBiotechnology,Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995))等中描述了用于评估启动子的强度的方法和强启动子的实例。
可以通过例如用较强的SD序列替换染色体上的基因的Shine-Dalgarno(SD)序列(也称为核糖体结合位点(RBS))来改进基因的翻译效率。“较强的SD序列”是指与基因的固有存在的野生型SD序列相比，提供了mRNA的改进翻译的SD序列。较强的SD序列的实例包括例如源自噬菌体T7的基因10的RBS(Olins P.O.et al,Gene,1988,73,227-235)。此外，已知在RBS和起始密码子之间的间隔区中，特别是在紧接起始密码子(5'-UTR)的上游的序列中的几个核苷酸的取代、插入或缺失显著影响mRNA的稳定性和翻译效率，因此，也可以通过修饰它们来改进基因的翻译效率。
也可以通过例如修饰密码子来改进基因的翻译效率。例如，通过用更经常使用的同义密码子替换基因中存在的稀有密码子，可以改进基因的翻译效率。也就是说，可以修饰要导入的基因，例如，以便根据在待使用的宿主中观察到的密码子的频率包含最佳密码子。可以通过例如将目标突变导入DNA的目标位点的位点特异性突变方法替换密码子。或者，可以完全合成其中替换目标密码子的基因片段。“密码子使用数据库”(http://www.kazusa.or.jp/codon；Nakamura,Y.et al,Nucl.Acids Res.,28,292(2000))中公开了各种生物体中的密码子的频率。
此外，还可以通过扩增增加基因表达的调节子，或者缺失或减弱降低基因表达的调节子来增加基因的表达。
如上所述用于增加基因表达的此类方法可以独立使用或以任意组合使用。
此外，也可以通过例如增强酶的比活性来实现增加蛋白质活性的修饰。比活性的增强还包括对反馈抑制的脱敏。也就是说，当蛋白质受到代谢物的反馈抑制时，可以通过使宿主含有编码对反馈抑制脱敏的突变蛋白的基因来增加蛋白质的活性。在本发明中，除非另有说明，“对反馈抑制脱敏”包括反馈抑制的完全消除和反馈抑制的减弱。此外，状态“对反馈抑制脱敏”，即反馈抑制被消除或减弱的状态，也称为“对反馈抑制耐受”。可以通过例如搜索各种生物体来获得显示增强的比活性的蛋白质。此外，通过向现有蛋白质中导入突变，也可以获得高活性型的现有蛋白质。要导入的突变可以是例如在蛋白质的一个或几个位置上的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。可以通过例如如上所述的此类位点特异性突变方法导入突变。也可以通过例如诱变处理来导入突变。诱变处理的实例包括X射线照射、紫外线照射和使用突变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)和甲磺酸甲酯(MMS)的处理。此外，可以通过用羟胺在体外直接处理DNA来诱导随机突变。可以独立地使用比活性的增强，或者可以与如上所述的用于增强基因表达的此类方法以任意组合使用。
转化的方法没有特别限制，并且可以使用常规已知的方法。可以使用例如用氯化钙处理受体细胞以增加其对DNA的通透性的方法，其已被报告用于大肠杆菌K-12菌株(Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.,1970,53,159-162)，以及从生长阶段的细胞中制备感受态细胞，随后用DNA转化的方法，其已被报告用于枯草芽孢杆菌(Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E.,Gene,1977,1:153-167)。或者，还可以使用将DNA受体细胞制成原生质体或原生质球，其可以容易地摄取重组DNA，随后将重组DNA导入DNA受体细胞中的方法，已知其适用于枯草芽孢杆菌、放线菌和酵母(Chang,S.and Choen,S.N.,1979,Mol.Gen.Genet.,168:111-115；Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,1978,Nature,274:398-400；Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:1929-1933)。此外，还可以使用针对棒状杆菌细菌报告的电脉冲方法(日本专利公开(Kokai)号2-207791)。
可以通过测量蛋白质的活性来确认蛋白质的活性的增加。
也可以通过确认编码蛋白质的基因的表达的增加来确认蛋白质的活性的增加。可以通过确认基因的转录量的增加或通过确认从该基因表达的蛋白质的量的增加来确认基因表达的增加。
可以通过比较从基因转录的mRNA的量与未修饰菌株如野生型菌株或亲本菌株的mRNA的量来确认基因转录量的增加。用于评估mRNA量的方法的实例包括Northern杂交、RT-PCR等(Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)。mRNA的量可以增加至例如未修饰菌株的mRNA量的1.2倍或更多、1.5倍或更多、2倍或更多、或3倍或更多。
可以通过使用抗体的Western印迹法(Molecular Cloning,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)来确认蛋白质的量的增加。蛋白质的量可以增加至例如未修饰菌株的蛋白质的量的1.2倍或更多、1.5倍或更多、2倍或更多、或3倍或更多。
除导入苯甲醛生成酶基因外，上述用于增加蛋白质活性的方法还可以应用于增强任意蛋白质例如L-苯丙氨酸生物合成酶的活性，以及增强任意基因例如编码那些任意蛋白质的基因的表达。
<1-3>降低蛋白质活性的方法
以下，将说明降低蛋白质活性的方法。
表述“蛋白质的活性降低”是指与未修饰菌株相比，蛋白质的活性降低。具体而言，表述“蛋白质的活性降低”可以指与未修饰菌株相比，每细胞的蛋白质的活性降低。本文使用的术语“未修饰菌株”是指未经修饰以降低目标蛋白的活性的对照菌株。未修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。未修饰菌株的具体实例包括微生物物种的相应类型菌株。未修饰菌株的具体实例还包括上文关于微生物描述例示的菌株。也就是说，在一个实施方案中，蛋白质的活性可以与类型菌株即微生物所属物种的类型菌株相比降低。在另一个实施方案中，蛋白质的活性也可以与谷氨酸棒杆菌ATCC 13869菌株相比降低。在另一个实施方案中，蛋白质的活性也可以与谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌株相比降低。在另一个实施方案中，蛋白质的活性也可以与大肠杆菌K-12MG1655菌株相比降低。状态“蛋白质的活性降低”也包括蛋白质的活性完全消失的状态。更具体地，表述“蛋白质的活性降低”可以意味着与未修饰菌株相比，每细胞的蛋白质的分子数目减少，和/或蛋白质的每个分子的功能降低。也就是说，表述“蛋白质的活性降低”中的术语“活性”不限于蛋白质的催化活性，而是也可以指编码蛋白质的基因的转录量(即mRNA的量)或蛋白质的翻译量(即蛋白质的量)。状态“每细胞的蛋白质的分子数目减少”也包括蛋白质完全不存在的状态。状态“蛋白质的每个分子的功能降低”也包括每个蛋白质分子的功能完全消失的状态。蛋白质的活性降低的程度没有特别限制，只要与未修饰菌株相比活性降低即可。蛋白质的活性可以降低至未修饰菌株的蛋白质活性的例如50％或更少、20％或更少、10％或更少、5％或更少或0％。
可以通过例如降低编码蛋白质的基因的表达来实现用于降低蛋白质活性的修饰。表述“基因的表达降低”是指与未修饰菌株例如野生型菌株和亲本菌株相比，基因的表达降低。具体而言，表述“基因的表达降低”可以指与未修饰菌株相比，每个细胞的基因的表达降低。更具体地，表述“基因的表达降低”可以指基因的转录量(即mRNA的量)降低，和/或基因的翻译量(即从基因表达的蛋白质的量)降低。状态“基因的表达降低”也包括基因完全不表达的状态。状态“基因的表达降低”也称为“基因的表达减弱”。基因的表达可以降低至例如未修饰菌株的基因表达的50％或更少、20％或更少、10％或更少，5％或更少或0％。
基因表达的降低可以是由于例如转录效率的降低、翻译效率的降低或它们的组合。可以通过修饰基因的表达控制序列，如启动子、Shine-Dalgarno(SD)序列(也称为核糖体结合位点(RBS))、以及基因的RBS和起始密码子之间的间隔区来降低基因的表达。当修饰表达控制序列时，修饰表达控制序列的优选一个或更多个核苷酸，更优选两个或更多个核苷酸，特别优选三个或更多个核苷酸。例如，可以通过例如用较弱的启动子替换染色体上基因的启动子来降低基因的转录效率。术语“较弱的启动子”是指与基因的固有存在的野生型启动子相比，提供基因的减弱转录的启动子。较弱的启动子的实例包括例如诱导型启动子。也就是说，诱导型启动子可以在非诱导条件下，例如在不存在相应的诱导物的情况下，作为较弱的启动子发挥作用。此外，可以缺失表达控制序列的部分或全部。也可以通过例如操纵负责表达控制的因子来降低基因的表达。负责表达控制的因子的实例包括负责转录或翻译控制的低分子(诱导剂、抑制剂等)、负责转录或翻译控制的蛋白质(转录因子等)、负责转录或翻译控制的核酸(siRNA等)等。此外，还可以通过例如将降低基因表达的突变导入基因的编码区来降低基因的表达。例如，可以通过用宿主中较不常使用的同义密码子替换基因的编码区中的密码子来降低基因的表达。此外，例如如下文所述，基因的表达可以由于基因的破坏而降低。
也可以通过例如破坏编码蛋白质的基因来实现用于降低蛋白质活性的修饰。表述“破坏基因”是指基因经修饰以使不产生可以正常发挥功能的蛋白质。状态“不产生正常发挥功能的蛋白质”包括蛋白质完全不从基因产生的状态，以及其每分子的功能(如活性或性质)被降低或消除的蛋白质从基因产生的状态。
可以通过例如缺失染色体上基因的编码区的部分或全部来实现基因的破坏。此外，可以缺失包括染色体上基因上游和下游序列的整个基因。要缺失的区域可以是任何区域，例如N端区域、内部区域或C端区域，只要能降低蛋白质的活性即可。较长区域的缺失通常可以更可靠地使基因失活。此外，优选要缺失的区域的上游和下游的序列的阅读框是不相同的。
也可以通过例如向染色体上基因的编码区导入氨基酸取代(错义突变)、终止密码子(无义突变)、添加或缺失一个或两个核苷酸残基的移码突变等突变来实现基因的破坏(Journal of Biological Chemistry,272:8611-8617(1997)；Proceedings of theNational Academy of Sciences,USA,95 5511-5515(1998)；Journal of BiologicalChemistry,26 116,20833-20839(1991))。
也可以通过例如将另一个序列插入染色体上的基因的编码区中来实现基因的破坏。插入位点可以位于基因的任何区域中，并且较长区域的插入通常可以更可靠地使基因失活。优选插入位点上游和下游的序列的阅读框是不相同的。其他序列没有特别限定，只要选择减少或消除编码的蛋白质的活性的序列，并且其实例包括例如标志基因如抗生素抗性基因，以及可用于目标物质生产的基因。
如上所述的染色体上基因的此类修饰可以通过，例如制备经修饰以使其不能产生正常发挥功能的蛋白质的缺陷型基因，并用含有缺陷型基因的重组DNA转化宿主，以引起缺陷型基因与染色体上野生型基因之间的同源重组，从而用缺陷型基因替换染色体上的野生型基因来实现。在该过程中，若根据宿主的特征如营养缺陷选择的标志基因包括在重组DNA中，则操作变得更容易。缺陷型基因的实例包括包含基因的全部或部分缺失的基因、包含错义突变的基因、包含无义突变的基因、包含移码突变的基因、以及包含转座子或标志基因插入的基因。由缺陷型基因编码的蛋白质即便产生也具有与野生型蛋白质不同的构象，因此其功能减少或消除。已经基于利用同源重组的基因取代建立了此类基因破坏，并且存在使用线性DNA的方法，例如称为“Red驱动整合”的方法(Datsenko,K.A,and Wanner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:6640-6645(2000))，以及利用Red驱动整合与源自λ噬菌体的切除系统组合的方法(Cho,E.H.,Gumport,R.I.,Gardner,J.F.,J.Bacteriol.,184:5200-5203(2002))(参见WO2005/010175)，使用具有温度敏感性复制起点的质粒的方法，使用能够接合转移的质粒的方法，利用不具有在宿主中发挥功能的复制起点的自杀载体的方法(美国专利号6,303,383，日本专利公开(Kokai)号05-007491)等。
也可以通过例如诱变处理来实现降低蛋白质活性的修饰。诱变处理的实例包括X射线或紫外线的照射和用突变剂例如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)和甲磺酸甲酯(MMS)的处理。
当蛋白质作为由多个亚基组成的复合物发挥功能时，可以修饰多个亚基的部分或全部，只要蛋白质的活性最终降低即可。也就是说，例如，可以破坏编码相应亚基的多个基因的部分或全部等。此外，当存在蛋白质的多种同工酶时，可以减少多种同工酶的部分或全部活性，只要蛋白质的活性最终降低即可。也就是说，例如，可以破坏编码相应同工酶的多个基因的部分或全部等。
可以通过测量蛋白质的活性来确认蛋白质的活性的降低。
也可以通过确认编码蛋白质的基因的表达的降低来确认蛋白质的活性的降低。可以通过确认基因的转录量的减少或从该基因表达的蛋白质的量的减少来确认基因表达的降低。
可以通过比较从基因转录的mRNA的量与未修饰菌株中观察到的量来确认基因的转录量的降低。用于评估mRNA量的方法的实例包括Northern杂交、RT-PCR等(MolecularCloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)。mRNA的量优选降低至未修饰菌株中观察到的mRNA的量的例如50％或更少、20％或更少、10％或更少、5％或更少，或0％。
可以通过使用抗体的Western印迹法(Molecular Cloning,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor(USA)2001)来确认蛋白质的量的降低。蛋白质的量优选降低至未修饰菌株中观察到的蛋白质的量的例如50％或更少、20％或更少、10％或更少、5％或更少、或0％。
根据用于破坏的手段，可以通过确定基因的部分或全部的核苷酸序列、基因的限制酶图谱、全长等来确认基因的破坏。上述用于降低蛋白质活性的方法可以应用于降低任意蛋白质例如参与副产物的副生产的酶的活性，以及降低任意基因例如编码那些任意蛋白质的基因的表达。
<2>本发明的方法
本发明的方法是通过使用本发明的微生物来生产苯甲醛的方法。换句话说，本发明的方法是生产苯甲醛的方法，其包括通过使用本发明的微生物生产苯甲醛的步骤。该步骤也称为“生产步骤”。
可以通过例如发酵、生物转化、或其组合来生产苯甲醛。也就是说，可以通过例如发酵、生物转化、或其组合来实施生产步骤。具体而言，可以通过例如培养本发明的微生物、使用本发明的微生物的细胞、或其组合来实施生产步骤。组合可以具体是培养构成本发明的微生物的多种微生物的一部分和使用所述多种微生物的其余部分的细胞这两种方法组合。可以从例如碳源或L-苯丙氨酸生产苯甲醛。
<2-1>发酵方法
可以通过例如具有L-苯丙氨酸生产能力的本发明的微生物的发酵来生产苯甲醛。也就是说，本发明的方法的实施方案可以是通过具有L-苯丙氨酸生产能力的本发明的微生物的发酵来生产苯甲醛的方法。该实施方案也称为“发酵方法”。另外，通过具有L-苯丙氨酸生产能力的本发明的微生物的发酵来生产苯甲醛的步骤也称为“发酵步骤”。
可以通过培养本发明的微生物来实施发酵步骤。具体而言，在发酵方法中，可以从碳源生产苯甲醛。也就是说，发酵步骤可以是例如在培养基例如含有碳源的培养基中培养本发明的微生物以在培养基中生产并积累苯甲醛的步骤。也就是说，发酵方法可以是包括在培养基例如含有碳源的培养基中培养本发明的微生物，以在培养基中生产并积累苯甲醛的步骤的生产苯甲醛的方法。另外，换句话说，发酵步骤可以是例如通过使用本发明的微生物从碳源生产苯甲醛的步骤。
在本发明的微生物是多种微生物的组合的情况下，可以同时或可以不同时培养所述多种微生物。例如，可以将多种微生物同时接种并培养，或者可以在不同的时机单独或以任意组合接种并培养。培养此类多种微生物的顺序和时机没有特别限制，只要实现从碳源生产苯甲醛即可。例如，可以按此顺序接种具有AAD的微生物、具有HMAS的微生物、具有SMDH的微生物和具有BFDC的微生物。在本发明的微生物是多种微生物的组合的情况下使用的短语“在含有碳源的培养基中培养本发明的微生物”是指在含有碳源的培养基中培养选自多种微生物中的至少一种微生物，以实现从碳源生产苯甲醛，并且不一定指在含有碳源的培养基中培养全部多种微生物。也就是说，在本发明的微生物是多种微生物的组合的情况下使用的短语“在含有碳源的培养基中培养本发明的微生物”可以指，例如在含有碳源的培养基中培养至少具有L-苯丙氨酸生产能力的微生物，其可以是具有AAD的微生物。也就是说，例如，在含有碳源的培养基中培养具有AAD的微生物，从而完全消耗碳源以生成如后所述的此类中间体后，可以开始培养其他微生物。为了在消耗碳源后培养微生物，可以根据需要使用任何可以用作或可以不用作生产苯甲醛的原料的额外碳源。
使用的培养基没有特别限制，只要本发明的微生物可以在其中增殖并且生产苯甲醛。作为培养基，例如可以使用用于培养微生物例如细菌和酵母的常见培养基。培养基可以含有碳源、氮源、磷源和硫源，以及根据需要的其他培养基组分例如各种有机组分和无机组分。培养基组分的类型和浓度可以根据各种条件例如使用的微生物的类型适当确定。
碳源没有特别限制，只要本发明的微生物可以利用它并生产苯甲醛。碳源的具体实例包括例如，糖例如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、赤糖糊(blackstrap molasses)、淀粉的水解产物和生物质的水解产物；有机酸例如乙酸、柠檬酸、琥珀酸和葡糖酸；醇例如乙醇、甘油和粗制甘油；以及脂族酸。作为碳源，可以优选使用植物来源的材料。植物的实例包括例如玉米、稻、小麦、大豆、甘蔗、甜菜和棉。植物来源的材料的实例包括器官例如根、茎、树干、枝、叶、花和种子，包括它们的植物体，以及这些植物器官的分解产物。植物来源的材料在其使用时的形式没有特别限制，并且它们可以以任何形式，例如未加工的产品、果汁、研磨产物和纯化产物使用。戊糖例如木糖、己糖例如葡萄糖、或它们的混合物可以从例如植物生物质获得并使用。具体而言，这些糖可以通过对植物生物质进行处理，例如蒸汽处理、用浓酸水解、用稀酸水解、用酶如纤维素酶水解、和碱处理获得。由于半纤维素与纤维素相比通常更容易水解，可以预先水解植物生物质中的半纤维素以释放戊糖，然后可以水解纤维素以生成己糖。此外，可以通过从己糖转化，例如通过对本发明的微生物赋予将己糖如葡萄糖转化为木糖的途径来供应木糖。作为碳源，可以使用一种碳源，或者可以组合使用两种或更多种碳源。
培养基中碳源的浓度没有特别限制，只要本发明的微生物可以增殖并生产苯甲醛。培养基中碳源的浓度可以在不抑制苯甲醛生产的范围内尽可能高。培养基中碳源的初始浓度可以是例如5至30％(w/v)，优选10至20％(w/v)。此外，可以根据需要向培养基中额外供应碳源。例如，可以与伴随发酵进程的碳源的减少或消耗成比例地向培养基中额外供应碳源。虽然碳源可以暂时耗尽，只要最终可以生产苯甲醛，但优选实施培养以使碳源不耗尽或碳源不持续耗尽。
氮源的具体实例包括例如铵盐例如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵，有机氮源例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物和大豆蛋白质分解产物、氨和尿素。用于pH调节的氨气和氨水也可以用作氮源。作为氮源，可以使用一种氮源，或者可以组合使用两种或更多种氮源。
磷源的具体实例包括例如磷酸盐例如磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，和磷酸聚合物例如焦磷酸。作为磷源，可以使用一种磷源，或者可以组合使用两种或更多种磷源。
硫源的具体实例包括例如无机硫化合物例如硫酸盐、硫代硫酸盐和亚硫酸盐，以及含硫氨基酸例如半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽。作为硫源，可以使用一种硫源，或者可以组合使用两种或更多种硫源。
其他各种有机和无机组分的具体实例包括例如无机盐例如氯化钠和氯化钾；微量金属例如铁、锰、镁和钙；维生素例如维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酰胺和维生素B12；氨基酸；核酸；和含有这些的有机组分例如蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物和大豆蛋白质分解产物。作为其他各种有机和无机组分，可以使用一种组分，或者可以组合使用两种或更多种组分。
此外，当使用需要营养物例如氨基酸用于其生长的营养缺陷型突变株时，优选向培养基补充此类需要的营养物。
培养条件没有特别限制，只要本发明的微生物可以增殖，并且生产苯甲醛。可以在例如用于微生物例如细菌和酵母培养的通常条件下实施培养。培养条件可以根据各种条件例如使用的微生物的类型适当确定。另外，根据需要，可以诱导苯甲醛生成酶基因的表达。
可以通过使用液体培养基实施培养。在培养时，例如在固体培养基如琼脂培养基上培养的本发明的微生物可以直接接种到液体培养基中，或者可以将作为种子培养物的液体培养基中培养的本发明的微生物接种到用于主培养的液体培养基。也就是说，培养可以作为种子培养和主培养分开实施。在此类情况下，种子培养和主培养的培养条件可以是或可以不是相同的。至少在主培养期间生产苯甲醛是足够的。在培养开始时培养基中含有的本发明的微生物的量没有特别限制。例如，在培养开始时，可以将显示4至100的OD660的种子培养液以0.1至100质量％、优选1至50质量％的量添加到用于主培养的培养基中。
可以作为分批培养、补料分批培养、连续培养或这些的组合实施培养。在培养开始时使用的培养基也称为“起始培养基”。在补料分批培养或连续培养中向培养系统(例如发酵罐)供应的培养基也称为“补料培养基”。向补料分批培养或连续培养中的培养系统供应补料培养基也称为“补料”。此外，当作为种子培养和主培养分开实施培养时，种子培养和主培养的培养方案可以是或可以不是相同的。例如，种子培养和主培养两者都可以作为分批培养实施。或者，例如种子培养可以作为分批培养实施，而主培养可以作为补料分批培养或连续培养实施。
在本发明中，各种组分例如碳源可以包含在起始培养基、补料培养基或二者中。也就是说，在培养期间各种组分例如碳源可以单独或以任意组合额外供应到培养基。这些组分可以供应一次或多次，或者可以连续供应。起始培养基中含有的组分的类型可以与或可以不与补料培养基中含有的组分的类型相同。此外，起始培养基中含有的组分的浓度可以与或可以不与补料培养基中含有的组分的浓度相同。此外，可以使用含有不同类型和/或不同浓度的组分的两种或更多种补料培养基。例如，当补料间歇实施两次或更多次时，对于每次补料补料培养基中含有的组分的类型和/或浓度可以相同或可以不相同。
可以例如在需氧条件下实施培养。术语“需氧条件”可以指培养基中的溶解氧浓度为0.33ppm或更高，或者优选1.5ppm或更高时的条件。氧浓度可以控制为例如饱和氧浓度的1至50％，优选约5％。可以例如通气或振荡实施培养。培养基的pH可以是例如3至10，优选4.0至9.5。在培养过程中，可以根据需要调节培养基的pH。可以通过使用各种碱性和酸性物质例如氨气、氨水、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸镁、氢氧化钠、氢氧化钙和氢氧化镁来调节培养基的pH。培养温度可以是例如20至45℃，优选25至37℃。培养时间可以是例如10至120小时。培养可以继续，例如，直到培养基中含有的碳源被耗尽，或直到本发明的微生物的活性丧失。
通过在上述此类条件下培养本发明的微生物，在培养基中积累苯甲醛。
可以通过用于检测或鉴定化合物的已知方法确认苯甲醛的生产。此类方法的实例包括例如HPLC、UPLC、LC/MS、GC/MS和NMR。这些方法可以单独使用，或者可以以适当的组合使用。这些方法还可以用于确定培养基中存在的各种组分的浓度。
可以适当收集生产的苯甲醛。也就是说，本发明的方法可以进一步包括收集苯甲醛的步骤。该步骤也称为“收集步骤”。收集步骤可以是从培养液中，特别是从培养基中收集苯甲醛的步骤。可以通过用于分离和纯化化合物的已知方法收集生产的苯甲醛。此类方法的实例包括例如离子交换树脂法、膜处理、沉淀、萃取、蒸馏和结晶。可以具体通过用有机溶剂例如乙酸乙酯萃取或通过蒸汽蒸馏收集苯甲醛。这些方法可以单独使用，或者可以以适当的组合使用。
此外，当苯甲醛沉积在培养基中时，可以通过例如离心或过滤来收集它。沉积在培养基中的苯甲醛和溶解在培养基中的苯甲醛也可以在溶解在培养基中的苯甲醛结晶后一起分离。
除了苯甲醛之外，收集的苯甲醛可以含有例如微生物细胞，培养基组分，水分和微生物的副产物代谢物。收集的苯甲醛的纯度可以是例如30％(w/w)或更高、50％(w/w)或更高，70％(w/w)或更高、80％(w/w)或更高、90％(w/w)或更高、或95％(w/w)或更高。
<2-2>生物转化方法
也可以通过例如使用本发明的微生物的生物转化来生产苯甲醛。也就是说，本发明的方法的另一个实施方案可以是通过使用本发明的微生物的生物转化来生产苯甲醛的方法。该实施方案也称为“生物转化方法”。另外，通过使用本发明的微生物的生物转化来生产苯甲醛的步骤也称为“生物转化步骤”。
具体而言，在生物转化方法中，可以从L-苯丙氨酸生产苯甲醛。更具体地，在生物转化方法中，可以通过使用本发明的微生物将L-苯丙氨酸转化为苯甲醛来生产苯甲醛。也就是说，生物转化步骤可以是通过使用本发明的微生物将L-苯丙氨酸转化为苯甲醛的步骤。在生物转化步骤中，作为转化前物质的L-苯丙氨酸也称为“底物”，作为转化后物质的苯甲醛也称为“产物”。
L-苯丙氨酸可以作为游离化合物，其盐或其混合物使用。也就是说，除非另有说明，本发明中使用的术语“L-苯丙氨酸”是指游离形式的L-苯丙氨酸，其盐或其混合物。盐的实例可以包括例如硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、铵盐、钠盐和钾盐。作为盐，可以采用一种盐，或者可以组合采用两种或更多种盐。
作为L-苯丙氨酸，可以使用商业产品，或者可以使用适当制备和获得的产品。生产L-苯丙氨酸的方法没有特别限制，并且可以使用例如已知的方法。可以通过例如化学合成法，酶法，生物转化法，发酵法，提取法或这些的组合来生产L-苯丙氨酸。也就是说，可以通过例如培养具有L-苯丙氨酸生产能力的微生物(L-苯丙氨酸生产微生物)，并从培养液中收集L-苯丙氨酸来生产L-苯丙氨酸。生产的L-苯丙氨酸可以以其本身用于本发明的方法，或者根据需要进行适当的处理例如浓缩、稀释、干燥、溶解、分馏、提取和纯化后使用。也就是说，作为L-苯丙氨酸，例如可以使用纯化至所需程度的纯化产物，或者可以使用含有L-苯丙氨酸的材料。含有L-苯丙氨酸的材料没有特别限制，只要本发明的微生物可以使用L-苯丙氨酸。含有L-苯丙氨酸的材料的具体实例包括通过培养具有L-苯丙氨酸生产微生物获得的培养液，从培养液分离出的培养上清液，以及其处理产品例如其浓缩产品(如浓缩液体)和其干燥产品。
在一个实施方案中，生物转化步骤可以通过例如培养本发明的微生物实施。该实施方案也称为“生物转化方法的第一实施方案”。也就是说，生物转化步骤可以是例如在含有L-苯丙氨酸的培养基中培养本发明的微生物以将L-苯丙氨酸转化为苯甲醛的步骤。生物转化步骤具体可以是在含有L-苯丙氨酸的培养基中培养本发明的微生物以在培养基中生成并积累苯甲醛的步骤。
在本发明的微生物是多种微生物的组合的情况下，可以同时或可以不同时培养所述多种微生物。例如，可以将多种微生物同时接种并培养，或者可以在不同的时机单独或以任意组合接种并培养。培养此类多种微生物的顺序和时机没有特别限制，只要实现从L-苯丙氨酸生产苯甲醛即可。例如，可以按此顺序接种具有AAD的微生物、具有HMAS的微生物、具有SMDH的微生物和具有BFDC的微生物。在本发明的微生物是多种微生物的组合的情况下使用的短语“在含有L-苯丙氨酸的培养基中培养本发明的微生物”是指在含有L-苯丙氨酸的培养基中培养选自多种微生物中的至少一种微生物，以实现L-苯丙氨酸向苯甲醛的转化，并且不一定指在含有L-苯丙氨酸的培养基中培养全部多种微生物。也就是说，在本发明的微生物是多种微生物的组合的情况下使用的短语“在含有L-苯丙氨酸的培养基中培养本发明的微生物”可以指，例如在含有L-苯丙氨酸的培养基中培养至少具有AAD的微生物。也就是说，例如，在含有L-苯丙氨酸的培养基中培养具有AAD的微生物，从而将L-苯丙氨酸完全转化为如后所述的此类中间体后，可以开始培养其他微生物。
使用的培养基没有特别限制，只要所述培养基含有L-苯丙氨酸，并且本发明的微生物可以在其中增殖并生产苯甲醛。培养条件没有特别限制，只要本发明的微生物可以增殖并且生产苯甲醛。关于发酵方法中提及的培养的描述，例如关于培养基和培养条件的描述，可以比照适用于生物转化方法的第一实施方案中的培养，除了在该实施方案中培养基含有L-苯丙氨酸。
在整个培养周期培养基中可以含有L-苯丙氨酸，或者仅在培养的部分周期培养基中可以含有L-苯丙氨酸。也就是说，短语“在含有L-苯丙氨酸的培养基中培养微生物”并不一定意味着在整个培养周期培养基中含有L-苯丙氨酸。例如，从培养开始，培养基中可以含有或可以不含有L-苯丙氨酸。当培养基中在培养开始时不含有L-苯丙氨酸时，将L-苯丙氨酸在培养开始后供应到培养基中。供应的时机可以根据各种条件例如培养周期的长度适当确定。例如，在本发明的微生物充分生长后，可以向培养基供应L-苯丙氨酸。此外，在任何情况下，可以根据需要向培养基中额外供应L-苯丙氨酸。例如，可以与伴随苯甲醛生成的L-苯丙氨酸的减少或消耗成比例地向培养基中额外供应L-苯丙氨酸。向培养基中供应L-苯丙氨酸的方法没有特别限制。例如，可以通过将含有L-苯丙氨酸的补料培养基补料到培养基中来向培养基中供应L-苯丙氨酸。此外，例如可以将本发明的微生物和L-苯丙氨酸生产微生物共培养，以允许L-苯丙氨酸生产微生物在培养基中生产L-苯丙氨酸，从而向培养基供应L-苯丙氨酸。这些供应方法可以单独使用，或者可以以适当的组合使用。培养基中的L-苯丙氨酸的浓度没有特别限制，只要本发明的微生物可以使用L-苯丙氨酸作为苯甲醛的原料。培养基中的L-苯丙氨酸的浓度例如可以是1mM或更高、10mM或更高、或者30mM或更高，或者可以是5M或更低、2M或更低、或者1M或更低，或者可以在其组合限定的范围内。在整个培养周期，培养基中可以含有或可以不含有上述例示范围内的浓度的L-苯丙氨酸。例如，在培养开始时培养基中可以含有上述例示范围内的浓度的L-苯丙氨酸，或者可以在培养开始后将其供应到培养基中以使实现上述例示范围内的浓度。当作为种子培养和主培养分开实施培养的情况下，至少在主培养期间生产苯甲醛就足够了。因此，至少在主培养期间，即在主培养的整个周期或在主培养的部分周期，培养基中含有L-苯丙氨酸就足够了，也就是说，在种子培养期间培养基中可以含有或可以不含有L-苯丙氨酸。在此类情况下，关于培养的术语例如“培养周期(培养的周期)”和“培养开始”可以理解为与主培养有关的术语。
在另一个实施方案中，生物转化步骤也可以通过例如使用本发明的微生物的细胞实施。该实施方案也称为“生物转化方法的第二实施方案”。也就是说，生物转化步骤可以是例如通过使用本发明的微生物的细胞将反应混合物中的L-苯丙氨酸转化为苯甲醛的步骤。生物转化步骤具体可以是允许本发明的微生物的细胞与L-苯丙氨酸在反应混合物中共存以在反应混合物中生成并积累苯甲醛的步骤。生物转化步骤可以是，更具体地，允许本发明的微生物的细胞作用于反应混合物中的L-苯丙氨酸以在反应混合物中生成并积累苯甲醛的步骤。通过使用此类细胞实施的生物转化步骤也称为“转化反应”。
在本发明的微生物是多种微生物的组合的情况下，可以同时或可以不同时向反应混合物供应所述多种微生物。例如，可以在不同的时机单独或以任意组合向反应混合物供应多种微生物。向反应混合物供应此类多种微生物的顺序和时机没有特别限制，只要实现L-苯丙氨酸向苯甲醛的转化即可。例如，可以按此顺序向反应混合物供应具有AAD的微生物的细胞、具有HMAS的微生物的细胞、具有SMDH的微生物的细胞和具有BFDC的微生物的细胞。在本发明的微生物是多种微生物的组合的情况下使用的短语“在反应混合物中允许本发明的微生物的细胞与L-苯丙氨酸共存或者作用于L-苯丙氨酸”是指在反应混合物中允许选自多种微生物中的至少一种微生物的细胞与L-苯丙氨酸共存或者作用于L-苯丙氨酸，以实现L-苯丙氨酸向苯甲醛的转化，并且不一定指在反应混合物中允许全部多种微生物的细胞与L-苯丙氨酸共存或者作用于L-苯丙氨酸。也就是说，在本发明的微生物是多种微生物的组合的情况下使用的短语“在反应混合物中允许本发明的微生物的细胞与L-苯丙氨酸共存或者作用于L-苯丙氨酸”可以指，例如在反应混合物中允许至少具有AAD的微生物的细胞与L-苯丙氨酸共存或者作用于L-苯丙氨酸。也就是说，例如，在反应混合物中允许具有AAD的微生物的细胞与L-苯丙氨酸共存或者作用于L-苯丙氨酸，从而将L-苯丙氨酸完全转化为如后所述的此类中间体后，可以向反应混合物供应其他微生物的细胞。
可以通过培养本发明的微生物来获得本发明的微生物的细胞。用于获得细胞的培养方法没有特别限制，只要本发明的微生物可以增殖即可。在用于获得细胞的培养时，培养基中可以含有或可以不含有L-苯丙氨酸。另外，在用于获得细胞的培养时，培养基中可以生产或可以不生产苯甲醛。关于发酵方法中提及的培养的描述，例如关于培养基和培养条件的描述，可以比照适用于为获得用于生物转化方法的第二实施方案的细胞的培养。
细胞可以在培养基中(培养液)中含有时用于转化反应，或者在从培养基(培养液)收集后用于转化反应。细胞还可以根据需要进行处理后用于转化反应。也就是说，细胞的实例包括含有细胞的培养液，从培养液收集的细胞，或其处理产物。处理产物的实例包括通过对细胞(例如含有细胞的培养液，或从培养液收集的细胞)进行处理获得的产物。这些形式的细胞可以单独施用，或者可以以适当的组合使用。
从培养基中收集细胞的方法没有特别限制，例如可以使用已知的方法。此类方法的实例包括例如自发沉淀、离心和过滤。也可以使用絮凝剂。这些方法可以单独使用，或者可以以适当的组合使用。可以根据需要通过使用适当的介质洗涤收集的细胞。可以根据需要通过使用适当的介质重新悬浮收集的细胞。可用于洗涤或悬浮细胞的介质的实例包括例如水性介质(水性溶剂)例如水和水性缓冲液。
细胞处理的实例包括例如稀释、冷凝、固定化在载体如丙烯酰胺和卡拉胶上、冷冻和解冻处理，以及增加细胞膜渗透性的处理。可以通过例如使用表面活性剂或有机溶剂来增加细胞膜的渗透性。这些处理可以单独使用，或者可以以适当的组合使用。
用于转化反应的细胞没有特别限制，只要细胞具有苯甲醛生产能力即可。细胞可以具有或可以不具有增殖能力。
可以在适当的反应混合物中实施转化反应。具体而言，可以通过在适当的反应混合物中允许细胞和L-苯丙氨酸共存来实施转化反应。可以通过分批方法来实施或者可以通过柱方法来实施转化反应。在分批方法的情况下，可以通过例如在反应容器中含有的反应混合物中将本发明的微生物的细胞与L-苯丙氨酸混合来实施转化反应。转化反应可以静态实施，或者可以在搅拌或摇动反应混合物的情况下实施。在柱方法的情况下，可以通过例如使含有L-苯丙氨酸的反应混合物通过填充有固定化细胞的柱来实施转化反应。反应混合物的实例包括基于水性介质(水性溶剂)例如水和水性缓冲液的那些。
除了L-苯丙氨酸之外，反应混合物可以根据需要含有除L-苯丙氨酸之外的组分。除了L-苯丙氨酸之外的组分的实例包括氧、金属离子例如三价铁离子、缓冲剂和其他各种介质组分。反应混合物中含有的组分的类型和浓度可以根据各种条件例如使用的微生物的类型来确定。
转化反应的条件(溶解氧浓度、反应混合物的pH、反应温度、反应时间、各种组分的浓度等)没有特别限制，只要生成苯甲醛即可。可以用例如用于使用微生物细胞例如静止细胞的物质转化的通常条件来实施转化反应。转化反应的条件可以根据各种条件例如使用的微生物的类型来确定。可以例如在需氧条件下实施转化反应。术语“需氧条件”可以指反应混合物中的溶解氧浓度为0.33ppm或更高，或者优选1.5ppm或更高时的条件。氧浓度可以控制为例如饱和氧浓度的1至50％，优选约5％。反应混合物的pH可以是例如通常6.0至10.0，优选6.5至9.0。反应温度可以是例如通常15至50℃，优选15至45℃，更优选20至40℃。反应时间可以是例如5分钟至200小时。在柱方法的情况下，反应混合物的加载速率可以是例如使得反应时间落入上述例示的反应时间范围内的速率。此外，转化反应也可以在例如培养条件例如用于微生物如细菌和酵母的培养的通常条件下实施。在转化反应期间，细胞可以增殖或可以不增殖。也就是说，关于生物转化方法的第一实施方案中提及的培养条件的描述也可以比照适用于生物转化方法的第二实施方案中的转化反应的条件，除了在第二实施方案中细胞可以增殖或可以不增殖。在此类情况下，用于获得细胞的培养条件和转化反应的条件可以相同或可以不相同。反应混合物中的L-苯丙氨酸的浓度例如可以是1mM或更高、10mM或更高、或者30mM或更高，或者可以是5M或更低、2M或更低、或者1M或更低，或者可以在其组合限定的范围内。反应混合物中的细胞的密度例如可以是1或更高，或者可以是300或更低，或者可以在其组合限定的范围内。
在转化反应期间，可以将细胞、L-苯丙氨酸和其他组分单独或以其任何任意组合额外供应到反应混合物中。例如，可以与伴随苯甲醛生成的L-苯丙氨酸的减少或消耗成比例地向反应混合物中额外供应L-苯丙氨酸。这些组分可以供应一次或多次，或者可以连续供应。
用于向反应混合物中供应各种组分例如L-苯丙氨酸的方法没有特别限制。这些组分各自可以通过例如直接将它们加入到反应混合物中来供应到反应混合物中。此外，例如可以将本发明的微生物和L-苯丙氨酸生产微生物共培养，以允许L-苯丙氨酸生产微生物在反应混合物中生产L-苯丙氨酸，从而向反应混合物供应L-苯丙氨酸。
此外，从转化反应的开始到结束，反应条件可以是恒定的，或者它们可以在转化反应期间改变。表述“反应条件在转化反应期间改变”不仅包括反应条件在时间上改变的情况，而且也包括反应条件在空间上改变的情况。表述“反应条件在空间上改变”是指，例如当通过柱方法实施转化反应时，反应条件例如反应温度和细胞密度根据流动中的位置而不同。
通过实施如上所述的生物转化步骤来获得含有苯甲醛的培养基(即培养液)或反应混合物。可以以与上述发酵方法相同的方式实施苯甲醛生产和苯甲醛收集的确认。也就是说，生物转化方法可以进一步包括收集步骤，例如从培养液(或者培养基)或反应混合物中收集苯甲醛的步骤。除了苯甲醛之外，收集的苯甲醛可以含有例如微生物细胞、培养基组分、反应混合物组分、水分和微生物的副产物代谢物。收集的苯甲醛的纯度可以是例如30％(w/w)或更高、50％(w/w)或更高、70％(w/w)或更高、80％(w/w)或更高、90％(w/w)或更高、或95％(w/w)或更高。
<2-3>子步骤的组合
可以通过但不限于中间体的生成来实施生产步骤例如发酵步骤和生物转化步骤。中间体的实例包括苯丙酮酸、(S)-扁桃酸和苯甲酰甲酸，其分别是由AAD、HMAS和SMDH催化的反应的产物。在由苯丙酮酸、(S)-扁桃酸和苯甲酰甲酸组成的阵列中，苯丙酮酸的一侧也称为“上游”，苯甲酰甲酸的一侧也称为“下游”。也就是说，生产步骤可以包含多个步骤，其中多个步骤伴随有一种或多种中间体的生成。生产步骤中包含的此类多个步骤的每一个也称为“子步骤”。生产步骤可以包含例如2、3或4个子步骤。生产步骤的子步骤的实例包括发酵子步骤和生物转化子步骤。发酵子步骤的实例包括从碳源生产中间体的步骤。生物转化子步骤的实例包括将L-苯丙氨酸转化为中间体的步骤，将中间体转化为另一个下游中间体的步骤，以及将中间体转化为苯甲醛的步骤。生产步骤的子步骤的组合没有特别限制，只要实现苯甲醛的生产即可。
生产步骤可以包括例如从碳源生产中间体的步骤，以及将中间体转化为苯甲醛的步骤。也就是说，生产步骤可以包括例如从碳源生产苯丙酮酸、(S)-扁桃酸或者苯甲酰甲酸的步骤，以及将苯丙酮酸、(S)-扁桃酸或者苯甲酰甲酸转化为苯甲醛的步骤。具体而言，生产步骤可以包括例如从碳源生产苯甲酰甲酸的步骤，以及将苯甲酰甲酸转化为苯甲醛的步骤。此外，生产步骤可以包括例如从碳源生产中间体A的步骤，将中间体A转化为另一种下游中间体B的步骤，以及将中间体B转化为苯甲醛的步骤。此外，生产步骤可以包括例如从碳源生产苯丙酮酸的步骤，将苯丙酮酸转化为(S)-扁桃酸的步骤，将(S)-扁桃酸转化为苯甲酰甲酸的步骤，以及将苯甲酰甲酸转化为苯甲醛的步骤。
生产步骤也可以包括例如将L-苯丙氨酸转化为中间体的步骤，以及将中间体转化为苯甲醛的步骤。也就是说，生产步骤可以包括例如将L-苯丙氨酸转化为苯丙酮酸、(S)-扁桃酸或者苯甲酰甲酸的步骤，以及将苯丙酮酸、(S)-扁桃酸或者苯甲酰甲酸转化为苯甲醛的步骤。具体而言，生产步骤可以包括例如将L-苯丙氨酸转化为苯甲酰甲酸的步骤，以及将苯甲酰甲酸转化为苯甲醛的步骤。此外，生产步骤可以包括例如将L-苯丙氨酸转化为中间体A的步骤，将中间体A转化为另一种下游中间体B的步骤，以及将中间体B转化为苯甲醛的步骤。此外，生产步骤可以包括例如将L-苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的步骤，将苯丙酮酸转化为(S)-扁桃酸的步骤，将(S)-扁桃酸转化为苯甲酰甲酸的步骤，以及将苯甲酰甲酸转化为苯甲醛的步骤。
此外，与生产步骤一样，生产步骤的每个子步骤可以包含其他子步骤。关于生产步骤及其子步骤的描述可以比照适用于生产步骤的每个子步骤及其进一步的子步骤。也就是说，例如将L-苯丙氨酸转化为苯甲酰甲酸的步骤可以包含将L-苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的步骤，将苯丙酮酸转化为(S)-扁桃酸的步骤，以及将(S)-扁桃酸转化为苯甲酰甲酸的步骤。在每一个发酵子步骤中，要生产的中间体也称为“产物”。在每一个生物转化子步骤中，转化前的物质也称为“底物”，转化后的物质也称为“产物”。也就是说，例如在将L-苯丙氨酸转化为中间体的步骤中，认为L-苯丙氨酸是底物，认为中间体是产物。
关于实施发酵步骤的手段的描述可以比照适用于实施生产步骤的每一个发酵子步骤的手段。关于实施生物转化步骤的手段的描述可以比照适用于实施生产步骤的每一个生物转化子步骤的手段。在这种情况下，在生产步骤中使用的“本发明的微生物”可以解读为具有对应于每个子步骤的苯甲醛生成酶的微生物。此外，作为发酵步骤产物的“苯甲醛”可以解读为每个发酵子步骤的对应产物。另外，作为生物转化步骤的底物和产物的“L-苯丙氨酸”和“苯甲醛”可以分别解读为每个生物转化子步骤的对应底物和产物。在每一个生物转化子步骤中，除了L-苯丙氨酸之外，将紧接在前的子步骤中生成的产物用作底物。每个生物转化子步骤的底物可以作为游离化合物，其盐或其混合物使用。关于L-苯丙氨酸的盐的描述可以比照适用于其他底物的盐。
通过使用具有对应于子步骤的苯甲醛生成酶的微生物实施生产步骤的每个子步骤。用于每个发酵子步骤的术语“对应于生产步骤的子步骤的苯甲醛生成酶”是指催化L-苯丙氨酸转化为子步骤的产物的单一酶或连续酶。另外，用于每个生物转化子步骤的术语“对应于生产步骤的子步骤的苯甲醛生成酶”是指催化子步骤的底物转化为子步骤的产物的单一酶或连续酶。也就是说，例如通过使用具有AAD的微生物、具有HMAS的微生物、具有SMDH的微生物和具有BFDC的微生物分别实施从碳源生产苯丙酮酸或者将L-苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的步骤，将苯丙酮酸转化为(S)-扁桃酸的步骤，将(S)-扁桃酸转化为苯甲酰甲酸的步骤，以及将苯甲酰甲酸转化为苯甲醛的步骤。此外，例如通过使用具有AAD的微生物，具有AAD和HMAS的微生物，或者具有AAD、HMAS和SMDH的微生物分别实施从碳源生产苯丙酮酸、(S)-扁桃酸或苯甲酰甲酸或者将L-苯丙氨酸转化为苯丙酮酸、(S)-扁桃酸或苯甲酰甲酸的步骤。此外，例如通过使用具有HMAS、SMDH和BFDC的微生物，具有SMDH和BFDC的微生物，或者具有BFDC的微生物分别实施将苯丙酮酸、(S)-扁桃酸或苯甲酰甲酸转化为苯甲醛的步骤。对于任何其他子步骤，可以适当采用具有子步骤所需的苯甲醛生成酶的微生物。
在具有多种苯甲醛生成酶的微生物用于生产步骤的子步骤的情况下，微生物可以是单一微生物，或者可以是多种微生物的组合。关于本发明的微生物(即，具有四种苯甲醛生成酶的微生物)的描述可以比照适用于具有多种苯甲醛生成酶的微生物。也就是说，例如，具有AAD、HMAS和SMDH的微生物可以是独自具有AAD、HMAS和SMDH的单一微生物，或者可以是整体具有AAD、HMAS和SMDH的多种微生物的组合。
用于生产步骤的特定子步骤的微生物可以与用于生产步骤的另一个子步骤的微生物不同或相同。也就是说，在单一微生物独自具有对应于特定子步骤的苯甲醛生成酶和对应于另一个子步骤的苯甲醛生成酶的情况下，微生物可以共同用于这些子步骤。
可以通过例如培养具有对应于子步骤的苯甲醛生成酶的微生物或者使用具有对应于子步骤的苯甲醛生成酶的微生物的细胞来实施生产步骤的每个子步骤。也就是说，生产步骤的每个发酵子步骤也可以是在含有碳源的培养基中培养具有对应于子步骤的苯甲醛生成酶并具有L-苯丙氨酸生产能力的微生物以在培养基中生成并积累对应产物的步骤。此外，生产步骤的每个生物转化子步骤可以是在含有对应底物的培养基中培养具有对应于子步骤的苯甲醛生成酶的微生物以在培养基中生成并积累对应产物的步骤。生产步骤的每个生物转化子步骤也可以是在反应混合物中允许具有对应于子步骤的苯甲醛生成酶的微生物的细胞与对应底物共存以在反应混合物中生成并积累对应产物的步骤。可以通过培养或通过使用细胞来实施生产步骤的所有子步骤。或者，可以通过培养来实施子步骤的一部分，而可以通过使用细胞来实施子步骤的其余部分。可以根据各种条件例如对应于子步骤的苯甲醛生成酶的类型和在子步骤中使用的微生物的类型来适当选择实施生产步骤的每个子步骤的条件。
也就是说，具体而言，例如生产步骤可以包括下述步骤(1)和(2)：
(1)下述步骤(1a)或(1b)：
(1a)在含有碳源的培养基中培养至少一种微生物以在所述培养基中生成并积累苯甲酰甲酸，所述至少一种微生物具有氨基酸脱氨酶、4-羟基扁桃酸合酶和(S)-扁桃酸脱氢酶并具有L-苯丙氨酸生产能力；
(1b)在含有L-苯丙氨酸的培养基中培养至少一种微生物以在所述培养基中生成并积累苯甲酰甲酸，或者在反应混合物中允许至少一种微生物的细胞与L-苯丙氨酸共存以在所述反应混合物中生成并积累苯甲酰甲酸，所述至少一种微生物具有氨基酸脱氨酶、4-羟基扁桃酸合酶和(S)-扁桃酸脱氢酶；
(2)在含有步骤(1)中生成的苯甲酰甲酸的培养基中培养微生物以在所述培养基中生成并积累苯甲醛，或者在反应混合物中允许微生物的细胞与步骤(1)中生成的苯甲酰甲酸共存以在所述反应混合物中生成并积累苯甲醛，所述微生物具有苯甲酰甲酸脱羧酶。
可以单独实施或者可以不单独实施生产步骤的子步骤。也就是说，可以在部分时期或整个时期期间同时实施生产步骤的子步骤的部分或全部。例如，在部分时期或整个时期期间可以单独实施，或者可以同时实施生成产物的子步骤A和使用所述产物作为底物的子步骤B。也就是说，例如子步骤A和B可以同时开始，或者子步骤B可以在子步骤A的过程中或完成之后开始。例如，可以通过在子步骤A开始时在反应系统(例如反应混合物或培养基)中允许具有对应于子步骤A和B的苯甲醛生成酶的微生物与子步骤A的底物共存来同时开始子步骤A和B。或者，例如可以在反应系统中不存在具有对应于子步骤B的苯甲醛生成酶的微生物的条件下开始子步骤A，然后通过在子步骤A的过程中或完成之后在反应系统中允许具有对应于子步骤B的苯甲醛生成酶的微生物存在来开始子步骤B。此外，在使用前可以收集或可以不收集子步骤A的产物。也就是说，例如可以收集子步骤A的产物，并且可以通过使用由此收集的产物实施子步骤B。子步骤A的产物可以以其本身用于子步骤B，或者根据需要进行适当的处理例如浓缩、稀释、干燥、溶解、分馏、提取和纯化后使用。这些关于子步骤A和B的描述可以应用于连续子步骤的任意组合。
实施例
以下，将参考实施例更具体地解释本发明。但是，本发明不受这些实施例的限制。
实施例1：源自雷氏普罗威登斯菌AJ2770的氨基酸脱氨酶(AAD)的表达
<1>用于源自雷氏普罗威登斯菌AJ2770的氨基酸脱氨酶的表达的质粒pSFN-AAD的构建
从大肠杆菌pTB2(WO2009/028338，实施例2)中提取含有源自雷氏普罗威登斯菌AJ2770的氨基酸脱氨酶基因的质粒。通过使用质粒作为模板，PCR扩增含有氨基酸脱氨酶基因的DNA片段。作为引物，使用NdeI-aad-5R6R8L-F(5’-GGGAATTCCATATGAAAATCTCGcGtcGtAAGCTgTTATTAGGGGTTGG T-3’；SEQ ID NO:1)和aad-HindIII-R(5’-CCCAAGCTTTTAGCTAAAACGGGAAAGTTTATA-3’；SEQ ID NO:2)。通过在以下条件下使用KOD-plus-ver.2(TOYOBO)来实施PCR：
1个循环 94℃,2min
25个循环 98℃,10sec
55℃,10sec
68℃,90sec
1个循环 68℃,90sec
4℃
将获得的约1400bp的DNA片段用限制酶NdeI和HindIII处理，并与用NdeI和HindIII类似处理的pSFN Sm_Aet(WO2006/075486,实施例1、6和12)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pSFN-AAD。由pSFN-AAD含有的AAD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，由该基因编码的AAD的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
<2>表达源自雷氏普罗威登斯菌AJ2770的氨基酸脱氨酶的菌株的培养液的制备
在LB-amp(100mg/L)平板，即含有100mg/L氨苄青霉素的LB平板上于25℃过夜培养导入了氨基酸脱氨酶表达质粒pSFN-AAD的大肠杆菌JM109。将获得的细胞接种到装在Sakaguchi烧瓶中的100mL TB-amp(100mg/L)，即含有100mg/L氨苄青霉素的TB培养基中，并在25℃振荡培养16小时。以下将获得的培养液用作AAD培养液。
实施例2：4-羟基扁桃酸合酶(HMAS)的表达
<1>用于4-羟基扁桃酸合酶的表达质粒的构建
通过以下程序构建用于4-羟基扁桃酸合酶(HMAS)的表达质粒，pET22-hmaS Ao、pET22-hmaS Sc、pET22-hmaS Rr、pET22-hmaS St、pET22-hmaS At、pET22-hmaS Ab、pET22-hmaS Ka、pET22-hmaS Nc、pET22-hmaS Ar、pET22-hmaS As、pET22-hmaS Sr和pET22-hmaSHa。此外，为了比较，通过以下程序构建用于4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的表达质粒，pET22-HPPD Sa和pET22-HPPD Pp。与HMAS一样，HPPD是α-酮酸加氧酶之一。HPPD作用于与HMAS相同的底物，而HPPD生成与HMAS不同的产物。
<1-1>用于源自东方拟无枝酸菌的4-羟基扁桃酸合酶的表达的质粒pET22-hmaSAo的构建
将编码源自东方拟无枝酸菌的4-羟基扁桃酸合酶(GenBank登录号：WP_037311069)的基因的合成外包给Life Technologies，并获得插入含有该基因的DNA片段的质粒。基因经密码子优化用于在大肠杆菌中的表达。通过使用质粒作为模板，PCR扩增含有4-羟基扁桃酸合酶基因的DNA片段。作为引物，使用NdeI-hmaS Ao-F(5’-ggaattccatATGCAGAACTTTGAAATCGA-3’；SEQ ID NO:3)和hmaS Ao-XhoI-R(5’-accgctcgagTCAACGACCGGCAACTTCGC-3’；SEQ ID NO:4)。通过在以下条件下使用KOD-plus-ver.2(TOYOBO)来实施PCR：
1个循环 94℃,2min
25个循环 98℃,10sec
60℃,10sec
68℃,60sec
1个循环 68℃,60sec
4℃
将获得的约1000bp的DNA片段用限制酶NdeI和XhoI处理，并与用NdeI和XhoI类似处理的pET22b(Novagen)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pET22-hmaS Ao。由pET22-hmaS Ao含有的HMAS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，由该基因编码的HMAS的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
<1-2>用于源自天蓝色链霉菌的4-羟基扁桃酸合酶的表达的质粒pET22-hmaS Sc的构建
将编码源自天蓝色链霉菌的4-羟基扁桃酸合酶(GenBank登录号：WP_011028841)的基因的合成外包给Life Technologies，并获得插入含有该基因的DNA片段的质粒。基因经密码子优化用于在大肠杆菌中的表达。通过使用质粒作为模板，PCR扩增含有4-羟基扁桃酸合酶基因的DNA片段。作为引物，使用AseI-hmaS Sc-F(5’-ggaattcattaATGCTGCCTCCGTTTCCGT-3’；SEQ ID NO:5)和hmaS Sc-XhoI-R(5’-accgctcgagTCAACGACGTGCCGGACCCA-3’；SEQ ID NO:6)。通过在以下条件下使用KOD-plus-ver.2(TOYOBO)来实施PCR：
1个循环 94℃,2min
25个循环 98℃,10sec
60℃,10sec
68℃,60sec
1个循环 68℃,60sec
4℃
将获得的约1100bp的DNA片段用限制酶AseI和XhoI处理，并与用NdeI和XhoI处理的pET22b(Novagen)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pET22-hmaS Sc。由pET22-hmaS Sc含有的HMAS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，由该基因编码的HMAS的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
<1-3>用于源自椿象红球菌的4-羟基扁桃酸合酶的表达的质粒pET22-hmaS Rr的构建
将编码源自椿象红球菌的4-羟基扁桃酸合酶(GenBank登录号：WP_037255771)的基因的合成外包给Eurofins Genomics，并获得插入含有该基因的DNA片段的质粒。基因经密码子优化用于在大肠杆菌中的表达。将通过用限制酶NdeI和XhoI处理质粒获得的约1100bp的DNA片段与用NdeI和XhoI类似处理的pET22b(Novagen)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pET22-hmaSRr。由pET22-hmaS Rr含有的HMAS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，由该基因编码的HMAS的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
<1-4>用于源自丰加链霉菌的4-羟基扁桃酸合酶的表达的质粒pET22-hmaS St的构建
将编码源自丰加链霉菌的4-羟基扁桃酸合酶(GenBank登录号：AAM80551)的基因的合成外包给Eurofins Genomics，并获得插入含有该基因的DNA片段的质粒。基因经密码子优化用于在大肠杆菌中的表达。将通过用限制酶NdeI和XhoI处理质粒获得的约1100bp的DNA片段与用NdeI和XhoI类似处理的pET22b(Novagen)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pET22-hmaS St。由pET22-hmaS St含有的HMAS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，由该基因编码的HMAS的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
<1-5>用于源自替考游动放线菌的4-羟基扁桃酸合酶的表达的质粒pET22-hmaSAt的构建
将编码源自替考游动放线菌的4-羟基扁桃酸合酶(GenBank登录号：CAG15040)的基因的合成外包给Eurofins Genomics，并获得插入含有该基因的DNA片段的质粒。基因经密码子优化用于在大肠杆菌中的表达。将通过用限制酶NdeI和XhoI处理质粒获得的约1100bp的DNA片段与用NdeI和XhoI类似处理的pET22b(Novagen)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pET22-hmaSAt。由pET22-hmaS At含有的HMAS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示，由该基因编码的HMAS的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。
<1-6>用于源自Amycolatopsis balhimycina的4-羟基扁桃酸合酶的表达的质粒pET22-hmaS Ab的构建
将编码源自Amycolatopsis balhimycina的4-羟基扁桃酸合酶(GenBank登录号：CAC48371)的基因的合成外包给Eurofins Genomics，并获得插入含有该基因的DNA片段的质粒。基因经密码子优化用于在大肠杆菌中的表达。将通过用限制酶NdeI和XhoI处理质粒获得的约1100bp的DNA片段与用NdeI和XhoI类似处理的pET22b(Novagen)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pET22-hmaS Ab。由pET22-hmaS Ab含有的HMAS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示，由该基因编码的HMAS的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示。
<1-7>用于源自荒漠拟孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)的4-羟基扁桃酸合酶的表达的质粒pET22-hmaS Ka的构建
将编码源自荒漠拟孢囊菌的4-羟基扁桃酸合酶(GenBank登录号：WP_051895522)的基因的合成外包给Eurofins Genomics，并获得插入含有该基因的DNA片段的质粒。基因经密码子优化用于在大肠杆菌中的表达。将通过用限制酶NdeI和XhoI处理质粒获得的约1000bp的DNA片段与用NdeI和XhoI类似处理的pET22b(Novagen)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pET22-hmaSKa。由pET22-hmaS Ka含有的HMAS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示，由该基因编码的HMAS的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示。
<1-8>用于源自科克斯野野村氏菌(Nonomuraea coxensis)的4-羟基扁桃酸合酶的表达的质粒pET22-hmaS Nc的构建
将编码源自科克斯野野村氏菌的4-羟基扁桃酸合酶(GenBank登录号：WP_026214630)的基因的合成外包给Eurofins Genomics，并获得插入含有该基因的DNA片段的质粒。基因经密码子优化用于在大肠杆菌中的表达。将通过用限制酶NdeI和XhoI处理质粒获得的约1100bp的DNA片段与用NdeI和XhoI类似处理的pET22b(Novagen)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pET22-hmaS Nc。由pET22-hmaS Nc含有的HMAS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示，由该基因编码的HMAS的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示。
<1-9>用于源自直线游动放线菌(Actinoplanes rectilineatus)的4-羟基扁桃酸合酶的表达的质粒pET22-hmaS Ar的构建
将编码源自直线游动放线菌的4-羟基扁桃酸合酶(GenBank登录号：WP_045739980)的基因的合成外包给Eurofins Genomics，并获得插入含有该基因的DNA片段的质粒。基因经密码子优化用于在大肠杆菌中的表达。将通过用限制酶NdeI和XhoI处理质粒获得的约1000bp的DNA片段与用NdeI和XhoI类似处理的pET22b(Novagen)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pET22-hmaS Ar。由pET22-hmaS Ar含有的HMAS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示，由该基因编码的HMAS的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示。
<1-10>用于源自Actinoplanes subtropicus的4-羟基扁桃酸合酶的表达的质粒pET22-hmaS As的构建
将编码源自Actinoplanes subtropicus的4-羟基扁桃酸合酶(GenBank登录号：WP_030437841)的基因的合成外包给Eurofins Genomics，并获得插入含有该基因的DNA片段的质粒。基因经密码子优化用于在大肠杆菌中的表达。将通过用限制酶NdeI和XhoI处理质粒获得的约1100bp的DNA片段与用NdeI和XhoI类似处理的pET22b(Novagen)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pET22-hmaS As。由pET22-hmaS As含有的HMAS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示，由该基因编码的HMAS的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示。
<1-11>用于源自龟裂链霉菌的4-羟基扁桃酸合酶的表达的质粒pET22-hmaS Sr的构建
将编码源自龟裂链霉菌的4-羟基扁桃酸合酶(GenBank登录号：WP_050515337)的基因的合成外包给Eurofins Genomics，并获得插入含有该基因的DNA片段的质粒。基因经密码子优化用于在大肠杆菌中的表达。将通过用限制酶NdeI和XhoI处理质粒获得的约1100bp的DNA片段与用NdeI和XhoI类似处理的pET22b(Novagen)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pET22-hmaSSr。由pET22-hmaS Sr含有的HMAS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:42所示，由该基因编码的HMAS的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示。
<1-12>用于源自橙色滑柱菌(Herpetosiphon aurantiacus)的4-羟基扁桃酸合酶的表达的质粒pET22-hmaS Ha的构建
将编码源自橙色滑柱菌的4-羟基扁桃酸合酶(GenBank登录号：ABX04531)的基因的合成外包给Eurofins Genomics，并获得插入含有该基因的DNA片段的质粒。基因经密码子优化用于在大肠杆菌中的表达。将通过用限制酶NdeI和XhoI处理质粒获得的约1100bp的DNA片段与用NdeI和XhoI类似处理的pET22b(Novagen)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pET22-hmaS Ha。由pET22-hmaS Ha含有的HMAS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示，由该基因编码的HMAS的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示。
<1-13>用于源自阿维菌素链霉菌(Streptomyces avermitilis)的4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的表达的质粒pET22-HPPD Sa的构建
将编码源自阿维菌素链霉菌的4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(GenBank登录号：WP_010986553)的基因的合成外包给Eurofins Genomics，并获得插入含有该基因的DNA片段的质粒。基因经密码子优化用于在大肠杆菌中的表达。将通过用限制酶NdeI和XhoI处理质粒获得的约1100bp的DNA片段与用NdeI和XhoI类似处理的pET22b(Novagen)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pET22-HPPD Sa。由pET22-HPPD Sa含有的HPPD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示，由该基因编码的HPPD的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。
<1-14>用于源自恶臭假单胞菌的4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的表达的质粒pET22-HPPD Pp的构建
将编码源自恶臭假单胞菌的4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(GenBank登录号：WP_046820065)的基因的合成外包给Eurofins Genomics，并获得插入含有该基因的DNA片段的质粒。基因经密码子优化用于在大肠杆菌中的表达。将通过用限制酶NdeI和XhoI处理质粒获得的约1100bp的DNA片段与用NdeI和XhoI类似处理的pET22b(Novagen)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pET22-HPPD Pp。由pET22-HPPD Pp含有的HPPD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示，由该基因编码的HPPD的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示。
<2>表达4-羟基扁桃酸合酶的菌株的培养液的制备
将源自东方拟无枝酸菌的4-羟基扁桃酸合酶的表达质粒pET22-hmaS Ao导入大肠杆菌BL21(DE3)，并从氨苄青霉素抗性菌株中获得含有该质粒的转化株。在LB-amp(100mg/L)平板上于30℃过夜培养转化株。将获得的细胞接种到装在Sakaguchi烧瓶中的100mL含有100mg/L氨苄青霉素的Overnight Express Instant TB培养基(Novagen)中，并在30℃振荡培养16小时。以下将获得的培养液用作HMAS Ao培养液。类似地，获得HMAS Sc培养液、HMASRr培养液、HMAS St培养液、HMAS At培养液、HMAS Ab培养液、HMAS Ka培养液、HMAS Nc培养液、HMAS Ar培养液、HMAS As培养液、HMAS Sr培养液、HMAS Ha培养液、HPPD Sa培养液和HPPD Pp培养液。
实施例3：源自恶臭假单胞菌的(S)-扁桃酸脱氢酶(MdlB,SMDH)的表达
<1>用于源自恶臭假单胞菌的(S)-扁桃酸脱氢酶的表达的质粒的构建
将编码源自恶臭假单胞菌的(S)-扁桃酸脱氢酶(GenBank登录号：BAM38408)的基因和编码源自恶臭假单胞菌的苯甲酰甲酸脱羧酶(GenBank登录号：BAM38407)的基因的合成外包给Life Technologies，并获得插入含有彼此连接的这些基因的DNA片段的质粒。这些基因经密码子优化用于在大肠杆菌中的表达。通过使用质粒作为模板，PCR扩增含有(S)-扁桃酸脱氢酶基因的DNA片段。作为引物，使用NdeI-mdlB-F(5’-ggaattccatATGAGCCGCAACCTGTTTAA-3’；SEQ ID NO:7)和mdlB-XhoI-R(5’-accgctcgagTCATGCATGGGTGCCTTTAC-3’；SEQ ID NO:8)。通过在以下条件下使用KOD-plus-ver.2(TOYOBO)来实施PCR：
1个循环 94℃,2min
25个循环 98℃,10sec
60℃,10sec
68℃,60sec
1个循环 68℃,60sec
4℃
将获得的约1200bp的DNA片段用限制酶NdeI和XhoI处理，并与用NdeI和XhoI类似处理的pET22b(Novagen)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pET22-mdlB。由pET22-mdlB含有的mdlB基因(SMDH基因)的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示，由该基因编码的MdlB(SMDH)的氨基酸序列如SEQID NO:28所示。
<2>表达(S)-扁桃酸脱氢酶的菌株的培养液的制备
将源自恶臭假单胞菌的(S)-扁桃酸脱氢酶的表达质粒pET22-mdlB导入大肠杆菌BL21(DE3)，并从氨苄青霉素抗性菌株中获得含有该质粒的转化株。在LB-amp(100mg/L)平板上于30℃过夜培养转化株。将获得的细胞接种到装在Sakaguchi烧瓶中的100mL含有100mg/L氨苄青霉素的Overnight Express Instant TB培养基(Novagen)中，并在37℃振荡培养16小时。以下将获得的培养液用作MdlB培养液。
实施例4：源自恶臭假单胞菌的苯甲酰甲酸脱羧酶(MdlC,BFDC)的表达
<1>用于源自恶臭假单胞菌的苯甲酰甲酸脱羧酶的表达的质粒的构建
通过使用实施例3中描述的插入编码源自恶臭假单胞菌的(S)-扁桃酸脱氢酶(GenBank登录号：BAM38408)的基因和编码源自恶臭假单胞菌的苯甲酰甲酸脱羧酶(GenBank登录号：BAM38407)的基因的质粒作为模板，PCR扩增含有苯甲酰甲酸脱羧酶基因的DNA片段。作为引物，使用AseI-mdlC-F(5’-ggaattcattaATGGCAAGCGTTCATGGCA-3’；SEQID NO:9)和mdlC-XhoI-R(5’-accgctcgagTCATTTAACCGGACTAACGG-3’；SEQ ID NO:10)。通过在以下条件下使用KOD-plus-ver.2(TOYOBO)来实施PCR：
1个循环 94℃,2min
25个循环 98℃,10sec
60℃,10sec
68℃,60sec
1个循环 68℃,60sec
4℃
将获得的约1600bp的DNA片段用限制酶AseI和XhoI处理，并与用NdeI和XhoI类似处理的pET22b(Novagen)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pET22-mdlC。由pET22-mdlC含有的mdlC基因(BFDC基因)的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示，由该基因编码的MdlC(BFDC)的氨基酸序列如SEQID NO:30所示。
<2>表达苯甲酰甲酸脱羧酶的菌株的培养液的制备
将源自恶臭假单胞菌的苯甲酰甲酸脱羧酶的表达质粒pET22-mdlC导入大肠杆菌BL21(DE3)，并从氨苄青霉素抗性菌株中获得含有该质粒的转化株。在LB-amp(100mg/L)平板上于30℃过夜培养转化株。将获得的细胞接种到装在Sakaguchi烧瓶中的100mL含有100mg/L氨苄青霉素的Overnight Express Instant TB培养基(Novagen)中，并在37℃振荡培养16小时。以下将获得的培养液用作MdlC培养液。
实施例5：从L-Phe合成苯甲醛
通过使用在实施例1至4中获得的培养液，通过下述程序从L-苯丙氨酸(L-Phe)合成苯甲醛。苯甲醛通过HPLC分析定量。分析条件如下。
流动相A：10mM KH2PO4/10mM K2HPO4
流动相B：乙腈
流速：1.0mL/min
柱温度：40℃
检测：UV 210nm
柱：CAPCELLPAK MGII,4.6x 150mm,3μm(Shiseido)
梯度：0-2min(B:2％),2-16min(B:2-50％),16.1-20min(B:2％)
将实施例1中获得的10mL AAD培养液的等分试样离心，除去8mL上清液，并将细胞悬浮于剩余的培养上清液中，以得到5倍浓缩液。该浓缩液作为AAD浓缩液用于以下反应。类似地，从HMAS培养液、HPPD培养液、MdlB培养液和MdlC培养液制备5倍浓缩液，并将其作为HMAS浓缩液、HPPD浓缩液、MdlB浓缩液和MdlC浓缩液用于以下反应。
<1>1步反应
将含有50mM L-Phe、0.01mM硫酸铁、10mM柠檬酸三钠、30mM抗坏血酸钠、10mM焦磷酸硫胺素、1mM硫酸镁、100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、0.02mLAAD浓缩液、0.1mLHMAS或HPPD浓缩液、0.04mLMdlB浓缩液和0.02mLMdlC浓缩液的反应混合物(1mL)放入试管中，并于15℃振荡20小时。将0.01mL反应混合物的等分试样与1mL反应终止液(1％磷酸，50％乙醇)混合，并将其离心上清液进行HPLC分析。结果显示在表1中。
表1
添加的培养液 苯甲醛(mM)
AAD、HMAS Ao、MdlB和MdlC N.D.
AAD、HMAS Sc、MdlB和MdlC N.D.
AAD、HMAS Rr、MdlB和MdlC 0.10
AAD、HMAS St、MdlB和MdlC 0.45
AAD、HMAS At、MdlB和MdlC 4.47
AAD、HMAS Ab、MdlB和MdlC 0.04
AAD、HMAS Ka、MdlB和MdlC N.D.
AAD、HMAS Nc、MdlB和MdlC 0.15
AAD、HMAS Ar、MdlB和MdlC N.D.
AAD、HMAS As、MdlB和MdlC 0.14
AAD、HMAS Sr、MdlB和MdlC 2.19
AAD、HMAS Ha、MdlB和MdlC N.D.
AAD、HPPD Sa、MdlB和MdlC N.D.
AAD、HPPD Pp、MdlB和MdlC N.D.
N.D.：未检出。
<2>2步反应
将含有50mM L-Phe、0.01mM硫酸铁、10mM柠檬酸三钠、30mM抗坏血酸钠、10mM焦磷酸硫胺素、1mM硫酸镁、100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、0.02mLAAD浓缩液、0.1mLHMAS或HPPD浓缩液和0.02mLMdlB浓缩液的反应混合物(1mL)放入试管中，并于15℃振荡20小时。将反应混合物离心，将0.49mL上清液等分试样与0.01mL MdlC浓缩液混合，并将所得混合物放入试管并于15℃振荡4小时。将0.1mL反应混合物的等分试样与1mL反应终止液(1％磷酸，50％乙醇)混合，并将其离心上清液进行HPLC分析。结果显示在表2中。
表2
添加的培养液 苯甲醛(mM)
AAD、HMAS Ao、MdlB和MdlC 1.30
AAD、HMAS Sc、MdlB和MdlC 0.57
AAD、HMAS Rr、MdlB和MdlC 1.11
AAD、HMAS St、MdlB和MdlC 0.97
AAD、HMAS At、MdlB和MdlC 7.07
AAD、HMAS Ab、MdlB和MdlC 0.28
AAD、HMAS Ka、MdlB和MdlC N.D.
AAD、HMAS Nc、MdlB和MdlC 4.31
AAD、HMAS Ar、MdlB和MdlC N.D.
AAD、HMAS As、MdlB和MdlC 0.29
AAD、HMAS Sr、MdlB和MdlC 5.23
AAD、HMAS Ha、MdlB和MdlC N.D.
AAD、HPPD Sa、MdlB和MdlC N.D.
AAD、HPPD Pp、MdlB和MdlC N.D.
N.D.：未检出。
实施例6：用于AAD、HMAS At和MdlB(SMDH)共表达的质粒pHSG-AHB的构建
<1>含有AAD基因的DNA片段的制备
作为第一步，通过使用实施例1中描述的源自雷氏普罗威登斯菌AJ2770的氨基酸脱氨酶的表达质粒pSFN-AAD作为模板，PCR扩增含有SD序列和AAD基因上游部分的DNA片段A以及含有AAD基因下游部分的DNA片段B。作为引物，EcoRI-SD-aad-F(5’-ACCGgaattctaaggaggaatgcatATGAA-3’；SEQ ID NO:46)和aad-delEcoRI-R(5’-CTCTTTAAATACTGGaAATTCTTTTCTCAG-3’；SEQ ID NO:49)用于DNA片段A的扩增，而aad-delEcoRI-F(5’-CTGAGAAAAGAATTtCCAGTATTTAAAGAG-3’；SEQ ID NO:48)和aad-SacI-R(5’-ACCGgagctcTTAGCTAAAACGGGAAAGTT-3’；SEQ ID NO:47)用于DNA片段B的扩增。作为第二步，通过使用DNA片段A和B作为模板，PCR扩增含有SD序列和消除了EcoRI识别位点的全长AAD基因的DNA片段C。作为引物，EcoRI-SD-aad-F(SEQ ID NO:46)和aad-SacI-R(SEQ ID NO:47)用于DNA片段C的扩增。通过在以下条件下使用KOD-plus-ver.2(TOYOBO)来为每个DNA片段的扩增实施PCR：
1个循环 94℃,2min
25个循环 98℃,10sec
60℃,10sec
68℃,90sec
1个循环 68℃,90sec
4℃
将获得的约1400bp的DNA片段用限制酶EcoRI和SacI处理，并在以下用作含有AAD基因的DNA片段。
<2>含有HMAS At基因的DNA片段的制备
通过使用实施例1中描述的源自雷氏普罗威登斯菌AJ2770的氨基酸脱氨酶的表达质粒pSFN-AAD作为模板，PCR扩增含有phoC启动子序列的DNA片段。作为引物，使用PphoCup-F(5’-AAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAG-3’；SEQ ID NO:50)和PphoC NdeI-R(5’-CATATGcattcctccttacggtgttatatg-3’；SEQ ID NO:51)。分开地，通过使用实施例2<1-5>中描述的源自替考游动放线菌的4-羟基扁桃酸合酶的表达质粒pET22-hmaS At作为模板，PCR扩增含有HMAS At基因的DNA片段。作为引物，使用PphoC-NdeI-hmaS At-F(5’-ccgtaaggaggaatgCATATGACCATGACGGGCCACTTTC-3’；SEQ ID NO:52)和T7终止子(5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’；SEQ ID NO:53)。通过使用如此获得的两个DNA片段作为模板，PCR扩增含有彼此连接的phoC启动子和HMAS At基因的DNA片段。作为引物，使用SacI-PphoC-F(5’-accgGAGCTCattttttcaatgtgatttta-3’；SEQ ID NO:54)和T7终止子(SEQ IDNO:53)。通过在以下条件下使用KOD-plus-ver.2(TOYOBO)来实施PCR：
1个循环 94℃,2min
25个循环 98℃,10sec
60℃,10sec
68℃,60sec
1个循环 68℃,60sec
4℃
将获得的约1200bp的DNA片段用限制酶SacI和XhoI处理，并在以下用作含有HMASAt基因的DNA片段。
<3>含有mdlB(SMDH)基因的DNA片段的制备
以与<2>中描述的相同的方式PCR扩增含有phoC启动子序列的DNA片段。分开地，通过使用实施例3中描述的源自恶臭假单胞菌的(S)-扁桃酸脱氢酶的表达质粒pET22-mdlB作为模板，PCR扩增含有mdlB(SMDH)基因的DNA片段。作为引物，使用PphoC-NdeI-mdlB-F(5’-ccgtaaggaggaatgCATATGAGCCGCAACCTGTTTAACG-3’；SEQ ID NO:55)和mdlB-BamHI-R(5’-ACCGggatccTCATGCATGGGTGCCTTTAC-3’；SEQ ID NO:56)。通过使用如此获得的两个DNA片段作为模板，PCR扩增含有彼此连接的phoC启动子和mdlB(SMDH)基因的DNA片段。作为引物，使用XhoI-PphoC-F(5’-accgCTCGAGattttttcaatgtgatttta-3’；SEQ ID NO:57)和mdlB-BamHI-R(SEQ ID NO:56)。通过在以下条件下使用KOD-plus-ver.2(TOYOBO)来实施PCR：
1个循环 94℃,2min
25个循环 98℃,10sec
60℃,10sec
68℃,60sec
1个循环 68℃,60sec
4℃
将获得的约1300bp的DNA片段用限制酶XhoI和BamHI处理，并在以下用作含有mdlB(SMDH)基因的DNA片段。
<4>含有AAD、HMAS At和mdlB(SMDH)基因的质粒的构建
将以上获得的含有AAD、HMAS At和mdlB(SMDH)基因的所有DNA片段与用EcoRI和BamHI处理的pHSG298(Takara Bio)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从卡那霉素抗性菌株中提取含有所有AAD、HMAS At和mdlB(SMDH)基因的目标质粒，并将该质粒命名为pHSG-AHB。
实施例7：从葡萄糖合成苯甲醛
将实施例6中构建的用于AAD、HMAS At和MdlB(SMDH)共表达的质粒pHSG-AHB导入大肠杆菌L-苯丙氨酸生产菌株AJ12741(JP H05-344881A)，并获得含有该质粒的转化株作为卡那霉素和氨苄青霉素抗性菌株。将获得的菌株命名为pHSG-AHB/AJ12741。类似地，将不表达AAD、HMAS At或MdlB(SMDH)的对照载体pHSG298导入AJ12741菌株，并将获得的转化株命名为pHSG/AJ12741。通过使用构建的菌株，通过下述程序从葡萄糖合成苯甲醛。苯甲醛通过HPLC分析定量。分析条件如实施例5中所述。
构建的菌株pHSG-AHB/AJ12741和pHSG/AJ12741各自在LB-km(25mg/L)-amp(100mg/L)平板，即含有25mg/L卡那霉素和100mg/L氨苄青霉素的LB平板上于25℃培养3天。将获得的细胞接种到4mL苯甲酰甲酸生产培养基(20g/L葡萄糖，1g/LMgSO4-7H2O，2g/L酵母提取物，16g/L(NH4)2SO4，1g/LKH2PO4，10mg/LFeSO4-7H2O，10mg/LMnSO4-5H2O，0.1g/LL-酪氨酸，30g/LCaCO3，25mg/L卡那霉素和100mg/L氨苄青霉素，调整到pH 7.0)并于30℃振荡培养48小时。将培养液离心，将0.49mL上清液等分试样与0.01mL实施例5中制备的MdlC浓缩液混合，并将所得混合物放入试管并于15℃振荡4小时。将0.1mL反应混合物的等分试样与1mL反应终止液(1％磷酸，50％乙醇)混合，并将其离心上清液进行HPLC分析。结果，对于pHSG-AHB/AJ12741菌株检测到2.92mM苯甲醛，而对于pHSG/AJ12741菌株没有检测到苯甲醛。
如上所述，揭示了可以通过使用表达AAD、HMAS、MdlB(SMDH)和MdlC(BFDC)的微生物从L-苯丙氨酸或葡萄糖生产苯甲醛。
实施例8：通过HMAS的修饰改进苯甲醛的生产
为了改进苯甲醛的生产，将各种突变导入源自替考游动放线菌的4-羟基扁桃酸合酶(HMAS At)中。
<1>用于HMAS At-His(1)的表达的质粒的构建
通过使用实施例2<1-5>中描述的插入编码源自替考游动放线菌的4-羟基扁桃酸合酶的基因的质粒作为模板，PCR扩增含有HMAS At基因的DNA片段。作为引物，使用T7启动子(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；SEQ ID NO:58)和hmaS At-XhoHis-R(5’-accgctcgagACGGCCATCCGCGGCAGCCT-3’；SEQ ID NO:59)。通过在以下条件下使用KOD-plus-ver.2(TOYOBO)来实施PCR：
1个循环 94℃,2min
25个循环 98℃,10sec
60℃,10sec
68℃,60sec
1个循环 68℃,60sec
4℃
将获得的约1100bp的DNA片段用限制酶NdeI和XhoI处理，并与用NdeI和XhoI类似处理的pET22b(Novagen)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pET22-hmaS At-His。当使用该质粒时，HMAS At与在C末端融合的His标签表达。将该His标签融合的HMAS At命名为HMAS At-His。
<2>用于突变体HMAS At-His(1)的表达的质粒的构建
通过使用pET22-hmaS At-His作为模板，将表3中显示的突变各自导入到HMAS At-His中。通过在以下条件下使用PrimeSTAR Max(Takara Bio)和表3中显示的引物实施突变的导入：
30个循环 98℃,10sec
60℃,15sec
72℃,40sec
1个循环 4℃
表3
用每种PCR溶液转化大肠杆菌JM109，并从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒。以下将获得的质粒用作突变体HMAS At-His的表达质粒。
<3>突变体HMAS At-His(1)的纯化
将实施例8<2>中获得的突变体HMAS At-His的表达质粒各自导入大肠杆菌BL21(DE3)，从氨苄青霉素抗性菌株获得含有各自质粒的转化株。在LB-amp(100mg/L)平板上于30℃过夜培养转化株。将获得的细胞接种到装在试管中的10mL含有100mg/L氨苄青霉素的Overnight Express Instant TB培养基(Novagen)中，并在30℃振荡培养16小时。通过离心从培养液中获得细胞，用2mL xTractor缓冲液(Takara Bio)悬浮，并在室温下静置温育20分钟，从而破坏细胞。将细胞破碎产物离心从而除去细胞碎片，并且以下将上清液用作可溶级分。将可溶级分应用于用缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 8.0),300mM NaCl和10mM咪唑)预先平衡的His标签融合蛋白的纯化柱HisTALON Superflow Cartridges(Takara Bio,CV＝1mL)，以使蛋白质吸附到柱上。用相同的缓冲液冲洗掉未吸附到柱上的蛋白质。通过使洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 8.0)，300mM NaCl和150mM咪唑)以1.5mL/分钟的流速通过柱子洗脱吸附到柱上的蛋白质。通过使用Amicon Ultra-15 30K(Millipore)收集并浓缩洗脱级分。浓缩液用20mM Tris-HCl(pH 7.6)稀释，并在以下用作突变体HMAS At-His的纯化酶。
<4>用于HMAS At-His(2)的表达的质粒的构建
通过使用实施例1中描述的源自雷氏普罗威登斯菌AJ2770的氨基酸脱氨酶的表达质粒pSFN-AAD作为模板，PCR扩增含有phoC启动子序列的DNA片段。作为引物，使用PphoCup-F(SEQ ID NO:50)和PphoC NdeI-R(SEQ ID NO:51)。分开地，通过使用实施例8<1>中描述的源自替考游动放线菌的4-羟基扁桃酸合酶的表达质粒pET22-hmaS At-His作为模板，PCR扩增含有HMAS At-His基因的DNA片段。作为引物，使用PphoC-NdeI-hmaS At-F(SEQ IDNO:52)和His6SacI-R(5’-ACCGgagctcagtggtggtggtggtggtg-3’；SEQ ID NO:64)。通过使用如此获得的两个DNA片段作为模板，PCR扩增含有彼此连接的phoC启动子和HMAS At-His基因的DNA片段。作为引物，使用EcoRI-PphoC-F(5’-gaaccgGAATTCattttttcaatgtgatttta-3’；SEQ ID NO:65)和His6SacI-R(SEQ ID NO:64)。通过在以下条件下使用KOD-plus-ver.2(TOYOBO)来实施PCR：
1个循环 94℃,2min
25个循环 98℃,10sec
60℃,10sec
68℃,60sec
1个循环 68℃,60sec
4℃
将获得的约1200bp的DNA片段用限制酶EcoRI和SacI处理，并与用EcoRI和SacI类似处理的pUC18(Takara Bio)连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pPC-hmaS At-His。
通过使用pPC-hmaS At-His作为模板，PCR扩增含有phoC启动子序列的DNA片段。作为引物，使用PphoC up-F(SEQ ID NO:50)和PphoC SDact NdeI-R(5’-ATGGTCATatggattcctccttacggtgtt-3’；SEQ ID NO:66)。通过在以下条件下使用KOD-plus-ver.2(TOYOBO)来实施PCR：
1个循环 94℃,2min
25个循环 98℃,10sec
60℃,10sec
68℃,60sec
1个循环 68℃,60sec
4℃
将获得的DNA片段用限制酶EcoRI和NdeI处理，并与用EcoRI和NdeI类似处理的pPC-hmaS At-His连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取目标质粒，并将该质粒命名为pPC-hmaS At-His(SDatc)。当使用该质粒时，HMAS At与在C末端融合的His标签表达，即作为HMAS At-His。
<5>用于突变体HMAS At-His(2)的表达的质粒的构建
通过使用pPC-hmaS At-His(SDatc)作为模板，将突变各自导入到HMAS At-His中。通过在以下条件下使用GeneMorph II RandomMutagenesis试剂盒(AgilentTechnologies)实施突变的导入。作为引物，使用M13Primer M4(5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’；SEQ ID NO:67)和M13Primer RV(5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’；SEQ ID NO:68)。
1个循环 95℃,2min
30个循环 95℃,30sec
60℃,30sec
72℃,60sec
1个循环 72℃,10min
4℃
将获得的DNA片段用限制酶NdeI和XhoI处理，并与用NdeI和XhoI类似处理的pPC-hmaS At-His连接。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109，从氨苄青霉素抗性菌株中提取质粒，从而获得突变体HMAS At-His的表达质粒文库。用质粒文库转化大肠杆菌JM109，获得含有突变体HMAS At-His表达质粒的转化株。从相应的转化株提取质粒，并确定突变体HMASAt-His基因的核苷酸序列。获得的突变体具有表4中所示的突变。
表4
突变体编号 突变
3 G327D
4 G327S
5 Y18F/D220N
6 D35G/E46Q/T222S/I336V
7 D220A/Q347L
8 M3I/A199S/G255D
9 T2N
10 V194G
11 Q206R
12 A27V/E191K
13 I217V
<6>突变体HMAS At-His(2)的纯化
在LB-amp(100mg/L)平板上于30℃各自过夜培养含有编号10-13的突变体HMASAt-His的表达质粒的转化株。将获得的细胞接种到装在试管中的10mLTB-amp(100mg/L)中，并在37℃振荡培养16小时。以与实施例8<3>中描述的相同的方式实施细胞的处理和酶的纯化，从而获得突变体HMAS At-His的纯化酶。类似地，培养含有pPC-hmaS At-His(SDatc)的转化株，并纯化野生型(WT)HMAS At-His，从而获得野生型HMAS At-His的纯化酶。
<7>通过使用突变体HMAS At-His的纯化酶从L-Phe合成苯甲醛
通过使用纯化的HMAS At-His的突变体和野生型的酶，通过下述程序以2步从L-苯丙氨酸(L-Phe)合成苯甲醛。苯甲醛通过HPLC分析定量。分析条件与实施例5中描述的相同。
将含有50mM L-Phe、0.01mM硫酸铁、10mM柠檬酸三钠、30mM抗坏血酸钠、10mM焦磷酸硫胺素、1mM硫酸镁、100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、0.02mLAAD浓缩液、0.25mg/LHMAS At-His的纯化酶和0.02mL MdlB浓缩液的反应混合物(1mL)放入试管中，并于15℃振荡20小时。将反应混合物离心，将0.49mL上清液等分试样与0.01mLMdlC浓缩液混合，并将所得混合物放入试管并于15℃振荡4小时。将0.1mL反应混合物的等分试样与1mL反应终止液(1％磷酸，50％乙醇)混合，并将其离心上清液进行HPLC分析。结果显示在表5中。
表5
突变体编号 突变 苯甲醛(mM)
1 I217L 1.26
2 I336V 1.47
10 V194G 1.07
11 Q206R 1.74
12 A27V/E191K 2.05
13 I217V 1.26
WT - 1.03
<8>用于突变体HMAS At-His(3)的表达的质粒的构建
通过使用编码具有I217V突变的突变体HMAS At-His的pPC-hmaS At-His I217V(SDatc)作为模板，将突变各自进一步导入到其中。以与实施例8<5>中描述的相同的方式实施突变的导入和质粒文库的构建。用质粒文库转化大肠杆菌JM109，获得含有突变体HMASAt-His表达质粒的转化株。从相应的转化株提取质粒，并确定突变体HMAS At-His基因的核苷酸序列。获得的突变体具有表6中所示的突变。
表6
突变体编号 突变
14 E180K/I217V/D220N
15 G5R/I217V
16 I217V/V343M
17 Q206R/I217V
18 A199V/I217V/K337Q
19 I217V/F319Y
20 A187V/I217V
21 D201N/I217V
<9>表达突变体HMAS At-His的菌株的培养液的制备
在LB-amp(100mg/L)平板上于30℃各自过夜培养含有编号3-12和14-21的突变体HMAS At-His的表达质粒的转化株。将获得的细胞接种到装在试管中的10mL TB-amp(100mg/L)中，并在37℃振荡培养16小时。通过离心浓缩获得的培养液，以获得5倍浓缩液。类似地，培养含有pPC-hmaS At-His(SDatc)的转化株，并且制备野生型(WT)HMAS At-His的培养液的5倍浓缩液。这些浓缩液作为HMAS At-His浓缩液用于以下反应。
<7>通过使用突变体HMAS At-His从L-Phe合成苯甲醛
通过使用HMAS At-His浓缩液，通过下述程序以2步从L-苯丙氨酸(L-Phe)合成苯甲醛。苯甲醛通过HPLC分析定量。分析条件与实施例5中描述的相同。
将含有50mM L-Phe、0.01mM硫酸铁、10mM柠檬酸三钠、30mM抗坏血酸钠、10mM焦磷酸硫胺素、1mM硫酸镁、100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、0.02mLAAD浓缩液、0.1mLHMAS At-His浓缩液和0.02mLMdlB浓缩液的反应混合物(1mL)放入试管中，并于15℃振荡20小时。将反应混合物离心，将0.49mL上清液等分试样与0.01mLMdlC浓缩液混合，并将所得混合物放入试管并于15℃振荡4小时。将0.1mL反应混合物的等分试样与1mL反应终止液(1％磷酸，50％乙醇)混合，并将其离心上清液进行HPLC分析。结果显示在表7中。
表7
突变体编号 突变 苯甲醛(mM)
3 G327D 3.51
4 G327S 4.76
5 Y18F/D220N 4.07
6 D35G/E46Q/T222S/I336V 3.03
7 D220A/Q347L 2.71
8 M3I/A199S/G255D 3.04
9 T2N 4.38
10 V194G 4.78
11 Q206R 3.31
12 A27V/E191K 3.14
14 E180K/I217V/D220N 3.43
15 G5R/I217V 3.37
16 I217V/V343M 3.62
17 Q206R/I217V 3.34
18 A199V/I217V/K337Q 3.24
19 I217V/F319Y 3.14
20 A187V/I217V 3.26
21 D201N/I217V 3.44
WT - 2.69
工业适用性
根据本发明，可以从L-苯丙氨酸或者碳源有效地生产苯甲醛。
序列表说明
SEQ ID NO:
1-10：引物
11：雷氏普罗威登斯菌AJ2770的AAD基因的核苷酸序列
12：雷氏普罗威登斯菌AJ2770的AAD的氨基酸序列
13：东方拟无枝酸菌的HMAS基因的核苷酸序列
14：东方拟无枝酸菌的HMAS的氨基酸序列
15：天蓝色链霉菌的HMAS基因的核苷酸序列
16：天蓝色链霉菌的HMAS的氨基酸序列
17：丰加链霉菌的HMAS基因的核苷酸序列
18：丰加链霉菌的HMAS的氨基酸序列
19：椿象红球菌的HMAS基因的核苷酸序列
20：椿象红球菌的HMAS的氨基酸序列
21：替考游动放线菌的HMAS基因的核苷酸序列
22：替考游动放线菌的HMAS的氨基酸序列
23：阿维菌素链霉菌的HPPD基因的核苷酸序列
24：阿维菌素链霉菌的HPPD的氨基酸序列
25：恶臭假单胞菌的HPPD基因的核苷酸序列
26：恶臭假单胞菌的HPPD的氨基酸序列
27：恶臭假单胞菌的SMDH基因的核苷酸序列
28：恶臭假单胞菌的SMDH的氨基酸序列
29：恶臭假单胞菌的BFDC基因的核苷酸序列
30：恶臭假单胞菌的BFDC的氨基酸序列
31：雷氏普罗威登斯菌AJ2770的野生型AAD基因的核苷酸序列
32：Amycolatopsis balhimycina的HMAS基因的核苷酸序列
33：Amycolatopsis balhimycina的HMAS的氨基酸序列
34：荒漠拟孢囊菌的HMAS基因的核苷酸序列
35：荒漠拟孢囊菌的HMAS的氨基酸序列
36：科克斯野野村氏菌的HMAS基因的核苷酸序列
37：科克斯野野村氏菌的HMAS的氨基酸序列
38：直线游动放线菌的HMAS基因的核苷酸序列
39：直线游动放线菌的HMAS的氨基酸序列
40：Actinoplanes subtropicus的HMAS基因的核苷酸序列
41：Actinoplanes subtropicus的HMAS的氨基酸序列
42：龟裂链霉菌的HMAS基因的核苷酸序列
43：龟裂链霉菌的HMAS的氨基酸序列
44：橙色滑柱菌的HMAS基因的核苷酸序列
45：橙色滑柱菌的HMAS的氨基酸序列
46-68：引物
序列表
<110> 味之素株式会社
<120> 生产苯甲醛的方法
<130> D788-16396
<150> JP2016-003878
<151> 2016-01-12
<160> 68
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
gggaattcca tatgaaaatc tcgcgtcgta agctgttatt aggggttggt 50
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
cccaagcttt tagctaaaac gggaaagttt ata 33
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
ggaattccat atgcagaact ttgaaatcga 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
accgctcgag tcaacgaccg gcaacttcgc 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
ggaattcatt aatgctgcct ccgtttccgt 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
accgctcgag tcaacgacgt gccggaccca 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
ggaattccat atgagccgca acctgtttaa 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
accgctcgag tcatgcatgg gtgcctttac 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
ggaattcatt aatggcaagc gttcatggca 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
accgctcgag tcatttaacc ggactaacgg 30
<210> 11
<211> 1419
<212> DNA
<213> 雷氏普罗威登斯菌
<400> 11
atgaaaatct cgcgtcgtaa gctgttatta ggggttggtg ctgctggtgt tttagcaggg 60
ggtgctgcgg ttgttcctat gatcaatcgt gaaggtcgtt ttgaatcgac taaatcacgt 120
gtaccagctg ttgctggcac agaaggcaaa ttaccagagt ctgcagatgc agtcatcatc 180
ggtgccggcc ttcaagggat catgactgca attaaccttg ctgaaaaagg tcttaatgtt 240
gttatctgtg aaaaaggtgt tgtcggtggt gagcaatcag gccgtgcata tagccaaatt 300
atcagttata agacttcccc agctattttc cctttacacc attacggaaa aattcaatgg 360
cttggcatga acgaaaaaat cggtgctgat accagctacc gtgttcaagg ccgtgttgaa 420
gtaccttcaa gcgaagaaga tttagaaatt tcaagagcct ggattaaatc tgcatctgaa 480
aacccaggtt tcgatacacc tttacgtacc cgtatgattg aaggaactga actggcgaat 540
cgtctggttg atgcacaaac tccatggaaa atcggtggat ttgaagaaga ctcaggtagc 600
cttgaccctg aagttgtcac accaaccatg gcaaactacg caaaatcaat cggtattcgc 660
atctacacca attgcgcagt acgtggtatt gaaacggcgg gcggcaaaat ttctgatgtt 720
gtcacagaaa aaggtgcaat caaaacttct cgtgttgttc tgacgggcgg tatttggtcg 780
cgtctgttca tgggtaactt aggcattgat gttccaacac tgaacgttta cctatcacaa 840
cagcgtatta ctggcgtacc aggcgcacca aaaggtaacg tccacttacc taacggtatt 900
cacttccgtg aacaagctga tggtacctac gccgttgcgc cacgtatctt tactagctct 960
atcgtaaaag acagcttcct gttaggacca agattcctac acgtattagg cggcggggaa 1020
ttaccattag agttctctct tggtaaagat ttattcaact ccttcatgat ggcaacgtct 1080
tggaacttag acgagaaaac accttttgaa gagttccgta ccgcaactaa tacaccaaac 1140
aacgaacact tagatggcgt tctggaaaga ctgagaaaag aattcccagt atttaaagag 1200
tctaaagtgg ttgaacgttg gggtggtacc gttgcaccaa cggatgatga aattccaatt 1260
atttcaacaa tcgagcagta tccaggacta gtcatcaaca ccgccacagg ctggggtatg 1320
acggaaagcc ctgcatctgg tcgattaacg gcagaattgt taatgggcga aacaccattt 1380
attgatccta cgccgtataa actttcccgt tttagctaa 1419
<210> 12
<211> 472
<212> PRT
<213> 雷氏普罗威登斯菌
<400> 12
Met Lys Ile Ser Arg Arg Lys Leu Leu Leu Gly Val Gly Ala Ala Gly
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Gly Ala Ala Val Val Pro Met Ile Asn Arg Glu Gly
20 25 30
Arg Phe Glu Ser Thr Lys Ser Arg Val Pro Ala Val Ala Gly Thr Glu
35 40 45
Gly Lys Leu Pro Glu Ser Ala Asp Ala Val Ile Ile Gly Ala Gly Leu
50 55 60
Gln Gly Ile Met Thr Ala Ile Asn Leu Ala Glu Lys Gly Leu Asn Val
65 70 75 80
Val Ile Cys Glu Lys Gly Val Val Gly Gly Glu Gln Ser Gly Arg Ala
85 90 95
Tyr Ser Gln Ile Ile Ser Tyr Lys Thr Ser Pro Ala Ile Phe Pro Leu
100 105 110
His His Tyr Gly Lys Ile Gln Trp Leu Gly Met Asn Glu Lys Ile Gly
115 120 125
Ala Asp Thr Ser Tyr Arg Val Gln Gly Arg Val Glu Val Pro Ser Ser
130 135 140
Glu Glu Asp Leu Glu Ile Ser Arg Ala Trp Ile Lys Ser Ala Ser Glu
145 150 155 160
Asn Pro Gly Phe Asp Thr Pro Leu Arg Thr Arg Met Ile Glu Gly Thr
165 170 175
Glu Leu Ala Asn Arg Leu Val Asp Ala Gln Thr Pro Trp Lys Ile Gly
180 185 190
Gly Phe Glu Glu Asp Ser Gly Ser Leu Asp Pro Glu Val Val Thr Pro
195 200 205
Thr Met Ala Asn Tyr Ala Lys Ser Ile Gly Ile Arg Ile Tyr Thr Asn
210 215 220
Cys Ala Val Arg Gly Ile Glu Thr Ala Gly Gly Lys Ile Ser Asp Val
225 230 235 240
Val Thr Glu Lys Gly Ala Ile Lys Thr Ser Arg Val Val Leu Thr Gly
245 250 255
Gly Ile Trp Ser Arg Leu Phe Met Gly Asn Leu Gly Ile Asp Val Pro
260 265 270
Thr Leu Asn Val Tyr Leu Ser Gln Gln Arg Ile Thr Gly Val Pro Gly
275 280 285
Ala Pro Lys Gly Asn Val His Leu Pro Asn Gly Ile His Phe Arg Glu
290 295 300
Gln Ala Asp Gly Thr Tyr Ala Val Ala Pro Arg Ile Phe Thr Ser Ser
305 310 315 320
Ile Val Lys Asp Ser Phe Leu Leu Gly Pro Arg Phe Leu His Val Leu
325 330 335
Gly Gly Gly Glu Leu Pro Leu Glu Phe Ser Leu Gly Lys Asp Leu Phe
340 345 350
Asn Ser Phe Met Met Ala Thr Ser Trp Asn Leu Asp Glu Lys Thr Pro
355 360 365
Phe Glu Glu Phe Arg Thr Ala Thr Asn Thr Pro Asn Asn Glu His Leu
370 375 380
Asp Gly Val Leu Glu Arg Leu Arg Lys Glu Phe Pro Val Phe Lys Glu
385 390 395 400
Ser Lys Val Val Glu Arg Trp Gly Gly Thr Val Ala Pro Thr Asp Asp
405 410 415
Glu Ile Pro Ile Ile Ser Thr Ile Glu Gln Tyr Pro Gly Leu Val Ile
420 425 430
Asn Thr Ala Thr Gly Trp Gly Met Thr Glu Ser Pro Ala Ser Gly Arg
435 440 445
Leu Thr Ala Glu Leu Leu Met Gly Glu Thr Pro Phe Ile Asp Pro Thr
450 455 460
Pro Tyr Lys Leu Ser Arg Phe Ser
465 470
<210> 13
<211> 1041
<212> DNA
<213> 东方拟无枝酸菌
<400> 13
atgcagaact ttgaaatcga ccaggtggaa atgtatgttg cagatctgga agcagcagca 60
agcggttgga tggataaata tggttttagc gttgcaagca ccgatcgtag cgcagatcat 120
cgtagcgtta ccctgcgtca gggtccgatt gcactggttc tgaccgaacc gaccagcgat 180
cgtcatccgg cagcaaccta tctgcagacc catggtgatg gtgttgccga tattgcactg 240
cgtaccagtg atgttgcagc agcatttgaa gcagccgttc gtgccggtgc acagccgatt 300
ctggaaccgg gtgaacgtgc agaaggtgtt attaccgcaa ccgttggtgg ttttggtgat 360
gttgttcata ccctgattca gcgtgatacc gttgaaagtc cggaagcatt tcgtggtcgt 420
ggtggtattg atctgctggc aattgatcat tttgccgttt gtctgaatgc cggtgatctg 480
ggtccgaccg ttgattatta tgaacgtgcc ctgggtttca aacaaatctt tgaagaacat 540
attgttgttg gtgcccaggc aatgaatagc accgttgttc agagcgcaag cggtgaagtt 600
accctgaccc tgattgaacc ggataaaacc gcagatccgg gtcagattga tgattttatc 660
aaagaacatc atggtgccgg tgttcagcat attgcattta ccagcgcaga tgcagttcgt 720
gcagttaaag aactgagcgc acgtggtgtt gaatttctga aaacaccgga tacctattat 780
gacctgctgg gtgaacgcat tcagctggaa acccatagcc tggatgacct gcgtgaaacc 840
aaactgctgg cagatgaaga tcatggtggt cagctgtttc agatttttac cgcaagcacc 900
catccgcgta aaaccatctt ttttgaaatt attgaacgtc agggtgcagg cacctttggt 960
agcagcaaca ttaaagcact gtatgaagca gttgaactgg aacgtaccgg tcagagcaaa 1020
ctgggtccgg cacgtcgttg a 1041
<210> 14
<211> 346
<212> PRT
<213> 东方拟无枝酸菌
<400> 14
Met Gln Asn Phe Glu Ile Asp Gln Val Glu Met Tyr Val Ala Asp Leu
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ala Ser Gly Trp Met Asp Lys Tyr Gly Phe Ser Val Ala
20 25 30
Ser Thr Asp Arg Ser Ala Asp His Arg Ser Val Thr Leu Arg Gln Gly
35 40 45
Pro Ile Ala Leu Val Leu Thr Glu Pro Thr Ser Asp Arg His Pro Ala
50 55 60
Ala Thr Tyr Leu Gln Thr His Gly Asp Gly Val Ala Asp Ile Ala Leu
65 70 75 80
Arg Thr Ser Asp Val Ala Ala Ala Phe Glu Ala Ala Val Arg Ala Gly
85 90 95
Ala Gln Pro Ile Leu Glu Pro Gly Glu Arg Ala Glu Gly Val Ile Thr
100 105 110
Ala Thr Val Gly Gly Phe Gly Asp Val Val His Thr Leu Ile Gln Arg
115 120 125
Asp Thr Val Glu Ser Pro Glu Ala Phe Arg Gly Arg Gly Gly Ile Asp
130 135 140
Leu Leu Ala Ile Asp His Phe Ala Val Cys Leu Asn Ala Gly Asp Leu
145 150 155 160
Gly Pro Thr Val Asp Tyr Tyr Glu Arg Ala Leu Gly Phe Lys Gln Ile
165 170 175
Phe Glu Glu His Ile Val Val Gly Ala Gln Ala Met Asn Ser Thr Val
180 185 190
Val Gln Ser Ala Ser Gly Glu Val Thr Leu Thr Leu Ile Glu Pro Asp
195 200 205
Lys Thr Ala Asp Pro Gly Gln Ile Asp Asp Phe Ile Lys Glu His His
210 215 220
Gly Ala Gly Val Gln His Ile Ala Phe Thr Ser Ala Asp Ala Val Arg
225 230 235 240
Ala Val Lys Glu Leu Ser Ala Arg Gly Val Glu Phe Leu Lys Thr Pro
245 250 255
Asp Thr Tyr Tyr Asp Leu Leu Gly Glu Arg Ile Gln Leu Glu Thr His
260 265 270
Ser Leu Asp Asp Leu Arg Glu Thr Lys Leu Leu Ala Asp Glu Asp His
275 280 285
Gly Gly Gln Leu Phe Gln Ile Phe Thr Ala Ser Thr His Pro Arg Lys
290 295 300
Thr Ile Phe Phe Glu Ile Ile Glu Arg Gln Gly Ala Gly Thr Phe Gly
305 310 315 320
Ser Ser Asn Ile Lys Ala Leu Tyr Glu Ala Val Glu Leu Glu Arg Thr
325 330 335
Gly Gln Ser Lys Leu Gly Pro Ala Arg Arg
340 345
<210> 15
<211> 1116
<212> DNA
<213> 天蓝色链霉菌
<400> 15
atgctgcctc cgtttccgtt tctgcattgg cgtgcagcaa tgcctccgag cgatattgca 60
tatgccgaac tgtatgttgc agatgatcgt gaagcaagcg gttttctggt tgatagcctg 120
ggttttgttc cgctggcagt tgcaggtccg gcaaccggca cccatgatcg tcgtagcacc 180
gttctgcgta gcggtgaagt taccctggtt gttacccagg cactggcacc ggatacaccg 240
gttgcacgtt atgttgaacg tcatggtgat agcattgcag atctggcatt tggttgtgat 300
gatgttcgta gctgttttga tcgtgcagtt ctggcaggcg cagaagcact gcaggcaccg 360
accccgagcc atcgtgcagg tcaggatgca tggtttgcaa ccgttagcgg ttttggtgat 420
attcgtcata cactggttcc ggcagcagat ggtgatggtg caggtctgct gccaccggat 480
cgtgattggg cactgctgcc tgcagcaacc ggtcgcacag gtccgcgtcc gctgctggat 540
catgttgcag tttgtctgga aagcggcacc ctgcgtagta ccgcagaatt ttatgaagca 600
gcatttgata tgccgtatta cagcagcgaa tatattgaag ttggtgaaca ggcaatggat 660
agtattgttg ttcgtaatgc cggtggtggt attaccttta ccctgattga accggatgat 720
acccgtgttc cgggtcagat tgatcagttt ctgagcgcac atgatggtcc gggtgttcag 780
catctggcct ttctggtgga tgatattgtt ggtagcgttc gtagtctggg tgatcgtggt 840
gttgcatttc tgcgtacacc gggtgcatat tatgatctgc tgaccgaacg tgttggtgca 900
atggcagatg caattgaaga tctgcgtgaa accaatgttc tggccgatcg tgatgaatgg 960
ggttatctgc tgcagatttt tacccgtagc ccgtatccgc gtggcaccct gttttatgaa 1020
tatatccagc gtaatggtgc acgtggtttt ggtagcagca acattaaagc actgtatgaa 1080
gccgttgaac gtgaacgcga agttgccggt cgttga 1116
<210> 16
<211> 371
<212> PRT
<213> 天蓝色链霉菌
<400> 16
Met Leu Pro Pro Phe Pro Phe Leu His Trp Arg Ala Ala Met Pro Pro
1 5 10 15
Ser Asp Ile Ala Tyr Ala Glu Leu Tyr Val Ala Asp Asp Arg Glu Ala
20 25 30
Ser Gly Phe Leu Val Asp Ser Leu Gly Phe Val Pro Leu Ala Val Ala
35 40 45
Gly Pro Ala Thr Gly Thr His Asp Arg Arg Ser Thr Val Leu Arg Ser
50 55 60
Gly Glu Val Thr Leu Val Val Thr Gln Ala Leu Ala Pro Asp Thr Pro
65 70 75 80
Val Ala Arg Tyr Val Glu Arg His Gly Asp Ser Ile Ala Asp Leu Ala
85 90 95
Phe Gly Cys Asp Asp Val Arg Ser Cys Phe Asp Arg Ala Val Leu Ala
100 105 110
Gly Ala Glu Ala Leu Gln Ala Pro Thr Pro Ser His Arg Ala Gly Gln
115 120 125
Asp Ala Trp Phe Ala Thr Val Ser Gly Phe Gly Asp Ile Arg His Thr
130 135 140
Leu Val Pro Ala Ala Asp Gly Asp Gly Ala Gly Leu Leu Pro Pro Asp
145 150 155 160
Arg Asp Trp Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gly Arg Thr Gly Pro Arg
165 170 175
Pro Leu Leu Asp His Val Ala Val Cys Leu Glu Ser Gly Thr Leu Arg
180 185 190
Ser Thr Ala Glu Phe Tyr Glu Ala Ala Phe Asp Met Pro Tyr Tyr Ser
195 200 205
Ser Glu Tyr Ile Glu Val Gly Glu Gln Ala Met Asp Ser Ile Val Val
210 215 220
Arg Asn Ala Gly Gly Gly Ile Thr Phe Thr Leu Ile Glu Pro Asp Asp
225 230 235 240
Thr Arg Val Pro Gly Gln Ile Asp Gln Phe Leu Ser Ala His Asp Gly
245 250 255
Pro Gly Val Gln His Leu Ala Phe Leu Val Asp Asp Ile Val Gly Ser
260 265 270
Val Arg Ser Leu Gly Asp Arg Gly Val Ala Phe Leu Arg Thr Pro Gly
275 280 285
Ala Tyr Tyr Asp Leu Leu Thr Glu Arg Val Gly Ala Met Ala Asp Ala
290 295 300
Ile Glu Asp Leu Arg Glu Thr Asn Val Leu Ala Asp Arg Asp Glu Trp
305 310 315 320
Gly Tyr Leu Leu Gln Ile Phe Thr Arg Ser Pro Tyr Pro Arg Gly Thr
325 330 335
Leu Phe Tyr Glu Tyr Ile Gln Arg Asn Gly Ala Arg Gly Phe Gly Ser
340 345 350
Ser Asn Ile Lys Ala Leu Tyr Glu Ala Val Glu Arg Glu Arg Glu Val
355 360 365
Ala Gly Arg
370
<210> 17
<211> 1110
<212> DNA
<213> 丰加链霉菌
<400> 17
atgggtaccg tgatgagcga actggccatg gcggccgatc cgctggccga tctgtcggtg 60
gactatgtgg agatgtatgt ggaaaacctt gaggcggcag ccctgacgtg ggtggacaag 120
tatgcgttca ccgttgttgg ctccggcgat tttgcggatc atcgcagcac agcgcttcgg 180
catgggcgca ttactctggt actcacggaa gctacctccg atgaacacgt cgctagcaca 240
tacgttgcct cgcatggtga cggagttgct gacattgcgc tgcgcactgc tgatgttacg 300
gcggcatttg acgcagcagt agccaatggt gcgcgtgtgc atcggcctcc gaccccgcat 360
ggtggcgacg gtccggcggt cacagcagtt ctgcatggct tcggtgacgt cgtgcacacg 420
ctggtacaac gtgcacctgg agaagaaccg gggttaccag cagggttttc tccgattagt 480
cgtaccggcg atgggccagc tggtgtggat ctgctggatc tcgaccacat cgccgtgtgc 540
ttgaacactg gcgatttaga cccgacagtc gatcactatt tgacggcatt cggctttcgt 600
cgcattttcg aggaacgcat tgtggtcggt cgccaggcca tggaatccgc ggtagttcag 660
agtccgagtg gaagcgtgac cttgactctc atccaacccg atccttctgc cgatccgggt 720
cagatcgacg agtttctgaa agcgcatcag ggtgccggcg ttcagcattt ggcgttttca 780
tcacccgatg cagtccgctc agtccgcgcg ttagcagatc gtggcgttac ctttcttacg 840
actccgcagg cttactacga tcttctgggt gagcgcattg ccctgtcgga atctcgcgta 900
gacgatctgc gcgctaccaa tgtgctggtc gatgaggatc atggcgggca gctgtttcag 960
atctttaccg ccagcaccca cttacgccac accctgttct tcgaagtgat tgaacgtcaa 1020
ggcgcggaaa cgttcggaag cgcgaacatc aaagcgctgt atgaggccgt agaactcgaa 1080
cgtaccggcc aacgtggccc acgtcaataa 1110
<210> 18
<211> 369
<212> PRT
<213> 丰加链霉菌
<400> 18
Met Gly Thr Val Met Ser Glu Leu Ala Met Ala Ala Asp Pro Leu Ala
1 5 10 15
Asp Leu Ser Val Asp Tyr Val Glu Met Tyr Val Glu Asn Leu Glu Ala
20 25 30
Ala Ala Leu Thr Trp Val Asp Lys Tyr Ala Phe Thr Val Val Gly Ser
35 40 45
Gly Asp Phe Ala Asp His Arg Ser Thr Ala Leu Arg His Gly Arg Ile
50 55 60
Thr Leu Val Leu Thr Glu Ala Thr Ser Asp Glu His Val Ala Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Val Ala Ser His Gly Asp Gly Val Ala Asp Ile Ala Leu Arg Thr
85 90 95
Ala Asp Val Thr Ala Ala Phe Asp Ala Ala Val Ala Asn Gly Ala Arg
100 105 110
Val His Arg Pro Pro Thr Pro His Gly Gly Asp Gly Pro Ala Val Thr
115 120 125
Ala Val Leu His Gly Phe Gly Asp Val Val His Thr Leu Val Gln Arg
130 135 140
Ala Pro Gly Glu Glu Pro Gly Leu Pro Ala Gly Phe Ser Pro Ile Ser
145 150 155 160
Arg Thr Gly Asp Gly Pro Ala Gly Val Asp Leu Leu Asp Leu Asp His
165 170 175
Ile Ala Val Cys Leu Asn Thr Gly Asp Leu Asp Pro Thr Val Asp His
180 185 190
Tyr Leu Thr Ala Phe Gly Phe Arg Arg Ile Phe Glu Glu Arg Ile Val
195 200 205
Val Gly Arg Gln Ala Met Glu Ser Ala Val Val Gln Ser Pro Ser Gly
210 215 220
Ser Val Thr Leu Thr Leu Ile Gln Pro Asp Pro Ser Ala Asp Pro Gly
225 230 235 240
Gln Ile Asp Glu Phe Leu Lys Ala His Gln Gly Ala Gly Val Gln His
245 250 255
Leu Ala Phe Ser Ser Pro Asp Ala Val Arg Ser Val Arg Ala Leu Ala
260 265 270
Asp Arg Gly Val Thr Phe Leu Thr Thr Pro Gln Ala Tyr Tyr Asp Leu
275 280 285
Leu Gly Glu Arg Ile Ala Leu Ser Glu Ser Arg Val Asp Asp Leu Arg
290 295 300
Ala Thr Asn Val Leu Val Asp Glu Asp His Gly Gly Gln Leu Phe Gln
305 310 315 320
Ile Phe Thr Ala Ser Thr His Leu Arg His Thr Leu Phe Phe Glu Val
325 330 335
Ile Glu Arg Gln Gly Ala Glu Thr Phe Gly Ser Ala Asn Ile Lys Ala
340 345 350
Leu Tyr Glu Ala Val Glu Leu Glu Arg Thr Gly Gln Arg Gly Pro Arg
355 360 365
Gln
<210> 19
<211> 1074
<212> DNA
<213> 椿象红球菌
<400> 19
atgcagaact tcgaaatcga ctatgtggag atgtacgttg aaaaccttga agtagcagca 60
ttttcttggg tggataagta tgcctttgca gttgctggca cgagtcgttc cgccgatcac 120
cgcagcattg cacttcgtca gggtcaagtg accctggtgc tgacagaacc gacttcggat 180
cgccatccgg cagctgcgta tttacagacg catggcgatg gtgtggcgga tattgccatg 240
gcgacctcag atgtcgcggc ggcgtatgaa gcagccgttc gtgctggtgc cgaagctgtc 300
cgtgctcctg gacagcactc agaagccgct gtcacgaccg cgacaattgg cggctttggg 360
gacgttgtgc acactctgat tcaacgcgac ggtacatctg cggaactgcc acccggtttt 420
accggctcca tggatgtaac gaaccatggc aaaggggatg tcgatttgct gggtatcgac 480
cactttgcga tttgcctgaa tgcgggcgat ttaggcccga ctgtggagta ctatgaacgt 540
gcgctgggtt ttcgccagat cttcgacgaa cacatcgtag ttggcgccca agcgatgaac 600
agcaccgtcg ttcagagcgc ctctggtgcg gtgacgttaa ccctgattga acctgatcgc 660
aatgccgatc cagggcagat tgacgagttc ctgaaagatc atcaaggtgc cggagtgcag 720
cacattgcgt tcaatagcaa cgatgcagta cgcgccgtta aagccctgag tgagcgtggc 780
gtggaatttc tgaaaacacc gggagcgtat tacgacttgc tgggtgagcg cattacgctc 840
cagacccata gcctcgatga ccttcgtgcg accaatgtct tggcagatga ggaccatgga 900
ggccaactgt ttcagatctt cactgcgtcg acccatccgc ggcataccat cttcttcgaa 960
gtgattgagc gccaaggggc cgggacgttt ggctcgtcca acatcaaagc tctctacgaa 1020
gctgttgaac tggaacgcac cggtcagagt gaatttggcg cagcacgccg gtaa 1074
<210> 20
<211> 357
<212> PRT
<213> 椿象红球菌
<400> 20
Met Gln Asn Phe Glu Ile Asp Tyr Val Glu Met Tyr Val Glu Asn Leu
1 5 10 15
Glu Val Ala Ala Phe Ser Trp Val Asp Lys Tyr Ala Phe Ala Val Ala
20 25 30
Gly Thr Ser Arg Ser Ala Asp His Arg Ser Ile Ala Leu Arg Gln Gly
35 40 45
Gln Val Thr Leu Val Leu Thr Glu Pro Thr Ser Asp Arg His Pro Ala
50 55 60
Ala Ala Tyr Leu Gln Thr His Gly Asp Gly Val Ala Asp Ile Ala Met
65 70 75 80
Ala Thr Ser Asp Val Ala Ala Ala Tyr Glu Ala Ala Val Arg Ala Gly
85 90 95
Ala Glu Ala Val Arg Ala Pro Gly Gln His Ser Glu Ala Ala Val Thr
100 105 110
Thr Ala Thr Ile Gly Gly Phe Gly Asp Val Val His Thr Leu Ile Gln
115 120 125
Arg Asp Gly Thr Ser Ala Glu Leu Pro Pro Gly Phe Thr Gly Ser Met
130 135 140
Asp Val Thr Asn His Gly Lys Gly Asp Val Asp Leu Leu Gly Ile Asp
145 150 155 160
His Phe Ala Ile Cys Leu Asn Ala Gly Asp Leu Gly Pro Thr Val Glu
165 170 175
Tyr Tyr Glu Arg Ala Leu Gly Phe Arg Gln Ile Phe Asp Glu His Ile
180 185 190
Val Val Gly Ala Gln Ala Met Asn Ser Thr Val Val Gln Ser Ala Ser
195 200 205
Gly Ala Val Thr Leu Thr Leu Ile Glu Pro Asp Arg Asn Ala Asp Pro
210 215 220
Gly Gln Ile Asp Glu Phe Leu Lys Asp His Gln Gly Ala Gly Val Gln
225 230 235 240
His Ile Ala Phe Asn Ser Asn Asp Ala Val Arg Ala Val Lys Ala Leu
245 250 255
Ser Glu Arg Gly Val Glu Phe Leu Lys Thr Pro Gly Ala Tyr Tyr Asp
260 265 270
Leu Leu Gly Glu Arg Ile Thr Leu Gln Thr His Ser Leu Asp Asp Leu
275 280 285
Arg Ala Thr Asn Val Leu Ala Asp Glu Asp His Gly Gly Gln Leu Phe
290 295 300
Gln Ile Phe Thr Ala Ser Thr His Pro Arg His Thr Ile Phe Phe Glu
305 310 315 320
Val Ile Glu Arg Gln Gly Ala Gly Thr Phe Gly Ser Ser Asn Ile Lys
325 330 335
Ala Leu Tyr Glu Ala Val Glu Leu Glu Arg Thr Gly Gln Ser Glu Phe
340 345 350
Gly Ala Ala Arg Arg
355
<210> 21
<211> 1062
<212> DNA
<213> 替考游动放线菌
<400> 21
atgaccatga cgggccactt tcaggacctg acagtggatc atgtccgcat ttactgcgca 60
gacctggacc ccttgattgc acagtttggc tcctatggtc tggatgtccg tgccgaaggt 120
gtaggcccgg gagcagagca tagcgtggtc ttgggccatg gggacattcg cctggttctg 180
acacggccgg gtactggcga tcaccctggt ggcatgtata ccgcccaaca tggctacgga 240
gtttcggaca ttgcattagg cacagcggat gctgcgggcg cttttcacga ggcggtacgt 300
cgtggggcac gtccgattgc ggcgccagag cgtaccgccg gtgtggttac ggccagtgtt 360
gcgggttttg gcgatgtgat ccataccttt gtacagcgtg aaccaggagg cccttggtcg 420
ctcccgggtc tgaatccggt gcatcgcccg ggtactccgg ggattggact gcgcctggtg 480
gatcactttg ccgtttgtgt cgaagcaggg cgcttaaccg aagtggtgga acactacgaa 540
cgcgttttcg gcttttctgc catcttcacc gaacgcatcg tggttggaga acaagcgatg 600
gattcccagg tggttcaaag tgccggtggg gctgtgacct taacggtcat tgcgccggat 660
accacacgcc gtccgggtca gatcgatacc ttcctgaagg atcatggcgg tcccggtgtc 720
cagcacattg cgtttgaaac ggatgatgtc acccgttcag ttggcgccat gtctgacgct 780
ggtattgagt tccttacgac tccagcagcg tactatgagc ggcttcgcga tcgccttcaa 840
ctcacgcgcc atagcgtgac cgaactgagc cgcctgaacg tattggctga cgaagatcac 900
gacggccaac tctatcagat tttcacgaaa agcactcatc ctcgcgggac cctgttcttt 960
gagatcatcg aacgtgtagg tgcccgcact ttcggttcag gcaacatcaa agcgctgtat 1020
gaagcggtgg aactggacca ggctgccgcg gatggccgtt aa 1062
<210> 22
<211> 353
<212> PRT
<213> 替考游动放线菌
<400> 22
Met Thr Met Thr Gly His Phe Gln Asp Leu Thr Val Asp His Val Arg
1 5 10 15
Ile Tyr Cys Ala Asp Leu Asp Pro Leu Ile Ala Gln Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Gly Leu Asp Val Arg Ala Glu Gly Val Gly Pro Gly Ala Glu His Ser
35 40 45
Val Val Leu Gly His Gly Asp Ile Arg Leu Val Leu Thr Arg Pro Gly
50 55 60
Thr Gly Asp His Pro Gly Gly Met Tyr Thr Ala Gln His Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Val Ser Asp Ile Ala Leu Gly Thr Ala Asp Ala Ala Gly Ala Phe His
85 90 95
Glu Ala Val Arg Arg Gly Ala Arg Pro Ile Ala Ala Pro Glu Arg Thr
100 105 110
Ala Gly Val Val Thr Ala Ser Val Ala Gly Phe Gly Asp Val Ile His
115 120 125
Thr Phe Val Gln Arg Glu Pro Gly Gly Pro Trp Ser Leu Pro Gly Leu
130 135 140
Asn Pro Val His Arg Pro Gly Thr Pro Gly Ile Gly Leu Arg Leu Val
145 150 155 160
Asp His Phe Ala Val Cys Val Glu Ala Gly Arg Leu Thr Glu Val Val
165 170 175
Glu His Tyr Glu Arg Val Phe Gly Phe Ser Ala Ile Phe Thr Glu Arg
180 185 190
Ile Val Val Gly Glu Gln Ala Met Asp Ser Gln Val Val Gln Ser Ala
195 200 205
Gly Gly Ala Val Thr Leu Thr Val Ile Ala Pro Asp Thr Thr Arg Arg
210 215 220
Pro Gly Gln Ile Asp Thr Phe Leu Lys Asp His Gly Gly Pro Gly Val
225 230 235 240
Gln His Ile Ala Phe Glu Thr Asp Asp Val Thr Arg Ser Val Gly Ala
245 250 255
Met Ser Asp Ala Gly Ile Glu Phe Leu Thr Thr Pro Ala Ala Tyr Tyr
260 265 270
Glu Arg Leu Arg Asp Arg Leu Gln Leu Thr Arg His Ser Val Thr Glu
275 280 285
Leu Ser Arg Leu Asn Val Leu Ala Asp Glu Asp His Asp Gly Gln Leu
290 295 300
Tyr Gln Ile Phe Thr Lys Ser Thr His Pro Arg Gly Thr Leu Phe Phe
305 310 315 320
Glu Ile Ile Glu Arg Val Gly Ala Arg Thr Phe Gly Ser Gly Asn Ile
325 330 335
Lys Ala Leu Tyr Glu Ala Val Glu Leu Asp Gln Ala Ala Ala Asp Gly
340 345 350
Arg
<210> 23
<211> 1146
<212> DNA
<213> 阿维菌素链霉菌
<400> 23
atgacacaaa ccacccatca cacgcctgat actgcgcgtc aagcggatcc gtttccggtg 60
aaagggatgg acgcggttgt ctttgccgtt gggaatgcga aacaagcggc tcactattat 120
agcactgcct ttggtatgca gttagtcgcg tatagtggcc cggaaaacgg ctctcgtgaa 180
accgcgagct atgtgctgac aaatggtagt gctcgctttg tactcacttc cgtgattaag 240
ccggccacac catggggtca ctttctggct gaccatgtgg ctgagcatgg tgatggcgtg 300
gttgatctgg ccattgaggt acctgatgcc cgtgccgctc acgcgtatgc gattgaacat 360
ggcgcgcgct ccgttgcaga gccgtatgaa ctgaaagacg aacatgggac ggtcgtactt 420
gcggcgatcg caacctacgg gaaaacccgc catactctgg ttgatcgcac gggctatgat 480
ggtccgtact tgccaggcta tgtcgcagca gcaccgatcg tagaaccgcc agcccatcgt 540
acctttcagg cgattgatca ctgcgtgggg aatgttgaac tgggtcgcat gaacgaatgg 600
gtgggtttct acaacaaagt gatgggattc accaacatga aagagtttgt tggtgacgac 660
attgccaccg agtactcagc actgatgtcg aaagtggtag ctgacggcac tctgaaagtg 720
aaattcccca ttaacgaacc cgctttagcc aagaagaaaa gccaaatcga cgaatatctg 780
gagttctacg gtggagcggg cgttcagcat attgcgctca ataccggcga tattgtcgaa 840
accgttcgca cgatgcgtgc agcaggcgtc cagtttctgg ataccccgga ttcgtactac 900
gatacattgg gtgaatgggt cggtgatacg cgtgtgcctg tggatacgct gcgggagttg 960
aaaatcttag cagatcgcga cgaagatggc tatctgcttc agatctttac caaaccagtc 1020
caggaccgtc cgacggtgtt cttcgaaatc atcgaacgcc acggctctat gggcttcgga 1080
aagggcaact tcaaagccct ctttgaagcc attgaacgcg aacaggagaa acggggaaat 1140
ctgtaa 1146
<210> 24
<211> 381
<212> PRT
<213> 阿维菌素链霉菌
<400> 24
Met Thr Gln Thr Thr His His Thr Pro Asp Thr Ala Arg Gln Ala Asp
1 5 10 15
Pro Phe Pro Val Lys Gly Met Asp Ala Val Val Phe Ala Val Gly Asn
20 25 30
Ala Lys Gln Ala Ala His Tyr Tyr Ser Thr Ala Phe Gly Met Gln Leu
35 40 45
Val Ala Tyr Ser Gly Pro Glu Asn Gly Ser Arg Glu Thr Ala Ser Tyr
50 55 60
Val Leu Thr Asn Gly Ser Ala Arg Phe Val Leu Thr Ser Val Ile Lys
65 70 75 80
Pro Ala Thr Pro Trp Gly His Phe Leu Ala Asp His Val Ala Glu His
85 90 95
Gly Asp Gly Val Val Asp Leu Ala Ile Glu Val Pro Asp Ala Arg Ala
100 105 110
Ala His Ala Tyr Ala Ile Glu His Gly Ala Arg Ser Val Ala Glu Pro
115 120 125
Tyr Glu Leu Lys Asp Glu His Gly Thr Val Val Leu Ala Ala Ile Ala
130 135 140
Thr Tyr Gly Lys Thr Arg His Thr Leu Val Asp Arg Thr Gly Tyr Asp
145 150 155 160
Gly Pro Tyr Leu Pro Gly Tyr Val Ala Ala Ala Pro Ile Val Glu Pro
165 170 175
Pro Ala His Arg Thr Phe Gln Ala Ile Asp His Cys Val Gly Asn Val
180 185 190
Glu Leu Gly Arg Met Asn Glu Trp Val Gly Phe Tyr Asn Lys Val Met
195 200 205
Gly Phe Thr Asn Met Lys Glu Phe Val Gly Asp Asp Ile Ala Thr Glu
210 215 220
Tyr Ser Ala Leu Met Ser Lys Val Val Ala Asp Gly Thr Leu Lys Val
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Lys Phe Pro Ile Asn Glu Pro Ala Leu Ala Lys Lys Lys Ser Gln Ile
245 250 255
Asp Glu Tyr Leu Glu Phe Tyr Gly Gly Ala Gly Val Gln His Ile Ala
260 265 270
Leu Asn Thr Gly Asp Ile Val Glu Thr Val Arg Thr Met Arg Ala Ala
275 280 285
Gly Val Gln Phe Leu Asp Thr Pro Asp Ser Tyr Tyr Asp Thr Leu Gly
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Lys Ile Leu Ala Asp Arg Asp Glu Asp Gly Tyr Leu Leu Gln Ile Phe
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Thr Lys Pro Val Gln Asp Arg Pro Thr Val Phe Phe Glu Ile Ile Glu
340 345 350
Arg His Gly Ser Met Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Lys Ala Leu Phe
355 360 365
Glu Ala Ile Glu Arg Glu Gln Glu Lys Arg Gly Asn Leu
370 375 380
<210> 25
<211> 1077
<212> DNA
<213> 恶臭假单胞菌
<400> 25
atggcggatc tgtacgaaaa tccgatgggc ctgatggggt ttgagttcat tgaactcgct 60
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<211> 358
<212> PRT
<213> 恶臭假单胞菌
<400> 26
Met Ala Asp Leu Tyr Glu Asn Pro Met Gly Leu Met Gly Phe Glu Phe
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Ile Glu Leu Ala Ser Pro Thr Pro Asn Thr Leu Glu Pro Ile Phe Glu
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Ile Met Gly Phe Thr Lys Val Ala Thr His Arg Ser Lys Asp Val His
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Leu Tyr Arg Gln Gly Ala Ile Asn Leu Ile Leu Asn Asn Glu Pro His
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65 70 75 80
Met Ala Phe Arg Val Lys Asp Ser Gln Lys Ala Tyr Lys Arg Ala Leu
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100 105 110
Asn Leu Pro Ala Ile Lys Gly Ile Gly Gly Ala Pro Leu Tyr Leu Ile
115 120 125
Asp Arg Phe Gly Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Asp Ile Asp Phe Val Phe
130 135 140
Leu Glu Gly Val Asp Arg His Pro Val Gly Ala Gly Leu Lys Ile Ile
145 150 155 160
Asp His Leu Thr His Asn Val Tyr Arg Gly Arg Met Ala Tyr Trp Ala
165 170 175
Asn Phe Tyr Glu Lys Leu Phe Asn Phe Arg Glu Ile Arg Tyr Phe Asp
180 185 190
Ile Lys Gly Glu Tyr Thr Gly Leu Thr Ser Lys Ala Met Thr Ala Pro
195 200 205
Asp Gly Met Ile Arg Ile Pro Leu Asn Glu Glu Ser Ser Lys Gly Ala
210 215 220
Gly Gln Ile Glu Glu Phe Leu Met Gln Phe Asn Gly Glu Gly Ile Gln
225 230 235 240
His Val Ala Phe Leu Ser Asp Asp Leu Ile Lys Thr Trp Asp His Leu
245 250 255
Lys Ser Ile Gly Met Arg Phe Met Thr Ala Pro Pro Asp Thr Tyr Tyr
260 265 270
Glu Met Leu Glu Gly Arg Leu Pro Asn His Gly Glu Pro Val Gly Glu
275 280 285
Leu Gln Ala Arg Gly Ile Leu Leu Asp Gly Ser Ser Glu Ser Gly Asp
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Lys Arg Leu Leu Leu Gln Ile Phe Ser Glu Thr Leu Met Gly Pro Val
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Gly Val Leu Ser Thr Asp
355
<210> 27
<211> 1182
<212> DNA
<213> 恶臭假单胞菌
<400> 27
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<210> 28
<211> 393
<212> PRT
<213> 恶臭假单胞菌
<400> 28
Met Ser Arg Asn Leu Phe Asn Val Glu Asp Tyr Arg Lys Leu Ala Gln
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Lys Arg Leu Pro Lys Met Val Tyr Asp Tyr Leu Glu Gly Gly Ala Glu
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Asp Glu Tyr Gly Val Lys His Asn Arg Asp Val Phe Gln Gln Trp Arg
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Gly Leu Asn Gly Ala Leu Trp Pro Lys Gly Asp Leu Ala Leu Ala Gln
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Met Ser Ile Glu Asp Leu Ala Arg Gln Cys Asp Gly Asp Leu Trp Phe
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Gln Leu Tyr Val Ile His Arg Glu Ile Ala Gln Gly Met Val Leu Lys
130 135 140
Ala Leu His Ser Gly Tyr Thr Thr Leu Val Leu Thr Thr Asp Val Ala
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Val Asn Gly Tyr Arg Glu Arg Asp Leu His Asn Arg Phe Lys Met Pro
165 170 175
Met Ser Tyr Thr Pro Lys Val Met Leu Asp Gly Cys Leu His Pro Arg
180 185 190
Trp Ser Leu Asp Leu Val Arg His Gly Met Pro Gln Leu Ala Asn Phe
195 200 205
Val Ser Ser Gln Thr Ser Ser Leu Glu Met Gln Ala Ala Leu Met Ser
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Arg Gln Met Asp Ala Ser Phe Asn Trp Glu Ala Leu Arg Trp Leu Arg
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Asp Leu Trp Pro His Lys Leu Leu Val Lys Gly Leu Leu Ser Ala Glu
245 250 255
Asp Ala Asp Arg Cys Ile Ala Glu Gly Ala Asp Gly Val Ile Leu Ser
260 265 270
Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp Cys Ala Val Ser Pro Met Glu Val
275 280 285
Leu Ala Gln Ser Val Ala Lys Thr Gly Lys Pro Val Leu Ile Asp Ser
290 295 300
Gly Phe Arg Arg Gly Ser Asp Ile Val Lys Ala Leu Ala Leu Gly Ala
305 310 315 320
Glu Ala Val Leu Leu Gly Arg Ala Thr Leu Tyr Gly Leu Ala Ala Arg
325 330 335
Gly Glu Thr Gly Val Gly Glu Val Leu Thr Leu Leu Lys Ala Asp Ile
340 345 350
Asp Arg Thr Leu Ala Gln Ile Gly Cys Pro Asp Ile Thr Ser Leu Ser
355 360 365
Pro Asp Tyr Leu Gln Ser Glu Gly Val Thr Asn Thr Ala Pro Val Asp
370 375 380
His Leu Ile Gly Lys Gly Thr His Ala
385 390
<210> 29
<211> 1587
<212> DNA
<213> 恶臭假单胞菌
<400> 29
atggcaagcg ttcatggcac cacctatgaa ctgctgcgtc gtcagggtat tgataccgtt 60
tttggtaatc cgggtagcaa tgaactgccg tttctgaaag attttccgga agattttcgt 120
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ccgtttccga cccgtcatcc gtgttttcgt ggtctgatgc ctgcaggtat tgccgcaatt 780
agccagctgc tggaaggtca tgatctggtt ctggttattg gtgcaccggt gtttcgttat 840
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ccggaacctg caaaagtgga tcaggatgca ggtcgtctgc atccggaaac cgtgtttgat 1080
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gaacagctga aaggtagcct gcaagaggca ctgagcgcaa aaggtccggt tctgattgaa 1560
gttagcaccg ttagtccggt taaatga 1587
<210> 30
<211> 528
<212> PRT
<213> 恶臭假单胞菌
<400> 30
Met Ala Ser Val His Gly Thr Thr Tyr Glu Leu Leu Arg Arg Gln Gly
1 5 10 15
Ile Asp Thr Val Phe Gly Asn Pro Gly Ser Asn Glu Leu Pro Phe Leu
20 25 30
Lys Asp Phe Pro Glu Asp Phe Arg Tyr Ile Leu Ala Leu Gln Glu Ala
35 40 45
Cys Val Val Gly Ile Ala Asp Gly Tyr Ala Gln Ala Ser Arg Lys Pro
50 55 60
Ala Phe Ile Asn Leu His Ser Ala Ala Gly Thr Gly Asn Ala Met Gly
65 70 75 80
Ala Leu Ser Asn Ala Trp Asn Ser His Ser Pro Leu Ile Val Thr Ala
85 90 95
Gly Gln Gln Thr Arg Ala Met Ile Gly Val Glu Ala Leu Leu Thr Asn
100 105 110
Val Asp Ala Ala Asn Leu Pro Arg Pro Leu Val Lys Trp Ser Tyr Glu
115 120 125
Pro Ala Ser Ala Ala Glu Val Pro His Ala Met Ser Arg Ala Ile His
130 135 140
Met Ala Ser Met Ala Pro Gln Gly Pro Val Tyr Leu Ser Val Pro Tyr
145 150 155 160
Asp Asp Trp Asp Lys Asp Ala Asp Pro Gln Ser His His Leu Phe Asp
165 170 175
Arg His Val Ser Ser Ala Val Arg Leu Asn Asp Gln Asp Leu Glu Ile
180 185 190
Leu Val Lys Ala Leu Asn Ser Ala Ser Asn Pro Ala Ile Val Leu Gly
195 200 205
Pro Asp Val Asp Ala Ala Asn Ala Asn Ala Asp Cys Val Gln Leu Ala
210 215 220
Glu Arg Leu Lys Ala Pro Val Trp Val Ala Pro Ser Ala Pro Arg Cys
225 230 235 240
Pro Phe Pro Thr Arg His Pro Cys Phe Arg Gly Leu Met Pro Ala Gly
245 250 255
Ile Ala Ala Ile Ser Gln Leu Leu Glu Gly His Asp Leu Val Leu Val
260 265 270
Ile Gly Ala Pro Val Phe Arg Tyr His Gln Tyr Asp Pro Gly Gln Tyr
275 280 285
Leu Lys Pro Gly Thr Arg Leu Ile Ser Val Thr Cys Asp Pro Leu Glu
290 295 300
Ala Ala Arg Ala Pro Met Gly Asp Ala Ile Val Ala Asp Ile Gly Ala
305 310 315 320
Met Ala Ser Ala Leu Ala Asn Ser Val Glu Glu Cys Ser Arg Pro Leu
325 330 335
Pro Thr Ala Ala Pro Glu Pro Ala Lys Val Asp Gln Asp Ala Gly Arg
340 345 350
Leu His Pro Glu Thr Val Phe Asp Thr Leu Asn Asp Met Ala Pro Glu
355 360 365
Asn Ala Ile Tyr Leu Asn Glu Ser Thr Ser Thr Thr Ala Gln Met Trp
370 375 380
Gln Arg Leu Asn Met Arg Asn Pro Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ala Ala
385 390 395 400
Gly Gly Leu Gly Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ile Gly Val Gln Leu Ala
405 410 415
Glu Pro Glu Arg Gln Val Ile Ala Val Ile Gly Asp Gly Ser Ala Asn
420 425 430
Tyr Ser Ile Ser Ala Leu Trp Thr Ala Ala Gln Tyr Asn Ile Pro Thr
435 440 445
Ile Phe Val Ile Met Asn Asn Gly Thr Tyr Gly Ala Leu Arg Trp Phe
450 455 460
Ala Gly Val Leu Glu Ala Glu Asn Val Pro Gly Leu Asp Val Pro Gly
465 470 475 480
Ile Asp Phe Cys Ala Leu Ala Lys Gly Tyr Gly Val Gln Ala Leu Lys
485 490 495
Ala Asn Asn Leu Glu Gln Leu Lys Gly Ser Leu Gln Glu Ala Leu Ser
500 505 510
Ala Lys Gly Pro Val Leu Ile Glu Val Ser Thr Val Ser Pro Val Lys
515 520 525
<210> 31
<211> 1419
<212> DNA
<213> 雷氏普罗威登斯菌
<400> 31
atgaaaatct cgagaagaaa gctattatta ggggttggtg ctgctggtgt tttagcaggg 60
ggtgctgcgg ttgttcctat gatcaatcgt gaaggtcgtt ttgaatcgac taaatcacgt 120
gtaccagctg ttgctggcac agaaggcaaa ttaccagagt ctgcagatgc agtcatcatc 180
ggtgccggcc ttcaagggat catgactgca attaaccttg ctgaaaaagg tcttaatgtt 240
gttatctgtg aaaaaggtgt tgtcggtggt gagcaatcag gccgtgcata tagccaaatt 300
atcagttata agacttcccc agctattttc cctttacacc attacggaaa aattcaatgg 360
cttggcatga acgaaaaaat cggtgctgat accagctacc gtgttcaagg ccgtgttgaa 420
gtaccttcaa gcgaagaaga tttagaaatt tcaagagcct ggattaaatc tgcatctgaa 480
aacccaggtt tcgatacacc tttacgtacc cgtatgattg aaggaactga actggcgaat 540
cgtctggttg atgcacaaac tccatggaaa atcggtggat ttgaagaaga ctcaggtagc 600
cttgaccctg aagttgtcac accaaccatg gcaaactacg caaaatcaat cggtattcgc 660
atctacacca attgcgcagt acgtggtatt gaaacggcgg gcggcaaaat ttctgatgtt 720
gtcacagaaa aaggtgcaat caaaacttct cgtgttgttc tgacgggcgg tatttggtcg 780
cgtctgttca tgggtaactt aggcattgat gttccaacac tgaacgttta cctatcacaa 840
cagcgtatta ctggcgtacc aggcgcacca aaaggtaacg tccacttacc taacggtatt 900
cacttccgtg aacaagctga tggtacctac gccgttgcgc cacgtatctt tactagctct 960
atcgtaaaag acagcttcct gttaggacca agattcctac acgtattagg cggcggggaa 1020
ttaccattag agttctctct tggtaaagat ttattcaact ccttcatgat ggcaacgtct 1080
tggaacttag acgagaaaac accttttgaa gagttccgta ccgcaactaa tacaccaaac 1140
aacgaacact tagatggcgt tctggaaaga ctgagaaaag aattcccagt atttaaagag 1200
tctaaagtgg ttgaacgttg gggtggtacc gttgcaccaa cggatgatga aattccaatt 1260
atttcaacaa tcgagcagta tccaggacta gtcatcaaca ccgccacagg ctggggtatg 1320
acggaaagcc ctgcatctgg tcgattaacg gcagaattgt taatgggcga aacaccattt 1380
attgatccta cgccgtataa actttcccgt tttagctaa 1419
<210> 32
<211> 1071
<212> DNA
<213> Amycolatopsis balhimycina
<400> 32
atgacgagcg atagcactgt gcagaatttc gagatcgatt acgttgaaat gtacgtggaa 60
aacctcgaag cagctacctt cacctgggtg gacaaatatg cctttgccgt tgcgggtact 120
gatcgctcgg cagaccatcg ctcggtgacc ttacgtcagg gcccgatcaa actggtcttg 180
accgaaccga cctcagaccg tcatccagcc gcggcgtatt tgcagagcca tggggatgga 240
gtagccgata ttgctcttcg cacaccggat gtcacggcgg cttttgaagc ggcggtgcgt 300
ggtggagccg cagcagtgcg cgaaccagtt cgtctggcag gcgggccgat tgtcacggca 360
acgattggcg ggtttggcga tgtcgtgcat accctgattc agtccggtga agcgacagcc 420
gctgcgcctg aaaccaccgg tcaaggtggc ggcgatgtga acctgttggg tctggaccac 480
ttcgccgttt gcctgaacag tggcgatctg ggtccgactg tcgcgttcta tgagcgggca 540
tttggctttc gccagatctt tgaagaacac atcgtcgttg gccgtcaggc catgaacagc 600
acagtagtgc aatctgcaag tggcgaagtt actctgaccc ttatcgaacc cgattcgaat 660
gccgatcccg gccaaatcga tgagtttctg aaagcgcacc agggcgctgg agtgcaacac 720
attgcgttca atgcagacga cgctgtacgt gcagtacgcg ctctttccgg acgtggcgtt 780
gagttcctca aaacgccggg tacctattac gacatgctgg gtgagcgcat tacattagaa 840
acgcatacgc tcgacgattt acggtctacc aatgtgctgg cggatgagga ccatggtggc 900
cagctgtttc agattttcgc ggcctcaacg catcctcgcc acaccatttt ctttgagatt 960
atcgaacgcc aaggtgcggg gacctttggg tccagcaaca ttaaggcgct gtatgaagcc 1020
gttgagctgg aacgcactgg ccagagtgaa tttggtgcgg cccgtcgcta a 1071
<210> 33
<211> 356
<212> PRT
<213> Amycolatopsis balhimycina
<400> 33
Met Thr Ser Asp Ser Thr Val Gln Asn Phe Glu Ile Asp Tyr Val Glu
1 5 10 15
Met Tyr Val Glu Asn Leu Glu Ala Ala Thr Phe Thr Trp Val Asp Lys
20 25 30
Tyr Ala Phe Ala Val Ala Gly Thr Asp Arg Ser Ala Asp His Arg Ser
35 40 45
Val Thr Leu Arg Gln Gly Pro Ile Lys Leu Val Leu Thr Glu Pro Thr
50 55 60
Ser Asp Arg His Pro Ala Ala Ala Tyr Leu Gln Ser His Gly Asp Gly
65 70 75 80
Val Ala Asp Ile Ala Leu Arg Thr Pro Asp Val Thr Ala Ala Phe Glu
85 90 95
Ala Ala Val Arg Gly Gly Ala Ala Ala Val Arg Glu Pro Val Arg Leu
100 105 110
Ala Gly Gly Pro Ile Val Thr Ala Thr Ile Gly Gly Phe Gly Asp Val
115 120 125
Val His Thr Leu Ile Gln Ser Gly Glu Ala Thr Ala Ala Ala Pro Glu
130 135 140
Thr Thr Gly Gln Gly Gly Gly Asp Val Asn Leu Leu Gly Leu Asp His
145 150 155 160
Phe Ala Val Cys Leu Asn Ser Gly Asp Leu Gly Pro Thr Val Ala Phe
165 170 175
Tyr Glu Arg Ala Phe Gly Phe Arg Gln Ile Phe Glu Glu His Ile Val
180 185 190
Val Gly Arg Gln Ala Met Asn Ser Thr Val Val Gln Ser Ala Ser Gly
195 200 205
Glu Val Thr Leu Thr Leu Ile Glu Pro Asp Ser Asn Ala Asp Pro Gly
210 215 220
Gln Ile Asp Glu Phe Leu Lys Ala His Gln Gly Ala Gly Val Gln His
225 230 235 240
Ile Ala Phe Asn Ala Asp Asp Ala Val Arg Ala Val Arg Ala Leu Ser
245 250 255
Gly Arg Gly Val Glu Phe Leu Lys Thr Pro Gly Thr Tyr Tyr Asp Met
260 265 270
Leu Gly Glu Arg Ile Thr Leu Glu Thr His Thr Leu Asp Asp Leu Arg
275 280 285
Ser Thr Asn Val Leu Ala Asp Glu Asp His Gly Gly Gln Leu Phe Gln
290 295 300
Ile Phe Ala Ala Ser Thr His Pro Arg His Thr Ile Phe Phe Glu Ile
305 310 315 320
Ile Glu Arg Gln Gly Ala Gly Thr Phe Gly Ser Ser Asn Ile Lys Ala
325 330 335
Leu Tyr Glu Ala Val Glu Leu Glu Arg Thr Gly Gln Ser Glu Phe Gly
340 345 350
Ala Ala Arg Arg
355
<210> 34
<211> 1044
<212> DNA
<213> 荒漠拟孢囊菌
<400> 34
atgtacgtgg agaacctcga agtcgcggcc ttctcgtggg tggacaagta tgcatttgcg 60
gttgctggta cctcacgctc agcagaccat cgcagtattg cattacgtca gggacaggtt 120
acgttagtgc tgaccgaacc gactagcgac cgtcatcccg ccgcagcgta cttgcagacc 180
catggcgatg gtgttgccga tattgcgtta gccacatcgg atgtcgctgc cgtctatcaa 240
gccgcagtac gtgccggagc ggaagcggtt cgtgctcccg gtcgccatac cgatgcggaa 300
gtcgttactg ccacgattgg tggctttggc gatgtggtac acaccctgat tcagcgtgat 360
ggcgctactc cggcgttgcc accgggcttt acaggctcct tggacgtcac gcattatggc 420
cgtggggatg tcgatctgct tggcattgat cactttgcca tctgcttacc ggctggtgat 480
ctgggcccta ccgttgagta ctatgaacgc gcgctgggct ttcggcagat tttcgaggag 540
cacattgtag tgggtgcgca agcgatgaac agcaccgttg tgcagtctgc gagtgcagcg 600
gtaacgctga ctctgatcga accggataag aatgcggacc cagggcagat tgacgagttt 660
ctgaaagacc accaaggagc aggcgtgcaa catgtggcgt tcagcagcaa tgatgccgtc 720
ggagcagtta aagctctgag tcaacgtggg gtggaatttc tgaaaacccc ggggacctat 780
tacgacatgc tgggtgagcg catcaaactc cagacacact ctcttgacga tctgcgcgca 840
accaatgtgc ttgcggatga agatcacggt gggcagctgt tccagatttt caccgcctcc 900
acacatcctc gccatacgat cttcttcgaa gtgatcgaac gccaaggtgc gggcaccttt 960
ggtagcgcaa acatcaaagc tctctatgaa gccgtagaac tggaacggac gggccagtcg 1020
gaatttggtg ccacgcgccg ctaa 1044
<210> 35
<211> 347
<212> PRT
<213> 荒漠拟孢囊菌
<400> 35
Met Tyr Val Glu Asn Leu Glu Val Ala Ala Phe Ser Trp Val Asp Lys
1 5 10 15
Tyr Ala Phe Ala Val Ala Gly Thr Ser Arg Ser Ala Asp His Arg Ser
20 25 30
Ile Ala Leu Arg Gln Gly Gln Val Thr Leu Val Leu Thr Glu Pro Thr
35 40 45
Ser Asp Arg His Pro Ala Ala Ala Tyr Leu Gln Thr His Gly Asp Gly
50 55 60
Val Ala Asp Ile Ala Leu Ala Thr Ser Asp Val Ala Ala Val Tyr Gln
65 70 75 80
Ala Ala Val Arg Ala Gly Ala Glu Ala Val Arg Ala Pro Gly Arg His
85 90 95
Thr Asp Ala Glu Val Val Thr Ala Thr Ile Gly Gly Phe Gly Asp Val
100 105 110
Val His Thr Leu Ile Gln Arg Asp Gly Ala Thr Pro Ala Leu Pro Pro
115 120 125
Gly Phe Thr Gly Ser Leu Asp Val Thr His Tyr Gly Arg Gly Asp Val
130 135 140
Asp Leu Leu Gly Ile Asp His Phe Ala Ile Cys Leu Pro Ala Gly Asp
145 150 155 160
Leu Gly Pro Thr Val Glu Tyr Tyr Glu Arg Ala Leu Gly Phe Arg Gln
165 170 175
Ile Phe Glu Glu His Ile Val Val Gly Ala Gln Ala Met Asn Ser Thr
180 185 190
Val Val Gln Ser Ala Ser Ala Ala Val Thr Leu Thr Leu Ile Glu Pro
195 200 205
Asp Lys Asn Ala Asp Pro Gly Gln Ile Asp Glu Phe Leu Lys Asp His
210 215 220
Gln Gly Ala Gly Val Gln His Val Ala Phe Ser Ser Asn Asp Ala Val
225 230 235 240
Gly Ala Val Lys Ala Leu Ser Gln Arg Gly Val Glu Phe Leu Lys Thr
245 250 255
Pro Gly Thr Tyr Tyr Asp Met Leu Gly Glu Arg Ile Lys Leu Gln Thr
260 265 270
His Ser Leu Asp Asp Leu Arg Ala Thr Asn Val Leu Ala Asp Glu Asp
275 280 285
His Gly Gly Gln Leu Phe Gln Ile Phe Thr Ala Ser Thr His Pro Arg
290 295 300
His Thr Ile Phe Phe Glu Val Ile Glu Arg Gln Gly Ala Gly Thr Phe
305 310 315 320
Gly Ser Ala Asn Ile Lys Ala Leu Tyr Glu Ala Val Glu Leu Glu Arg
325 330 335
Thr Gly Gln Ser Glu Phe Gly Ala Thr Arg Arg
340 345
<210> 36
<211> 1071
<212> DNA
<213> 科克斯野野村氏菌
<400> 36
atggaatcac tgccgaccct tgccgttgat tatgtggaga tgtatgtagc cgatctccaa 60
gtcgcaacgt taccgtggac cgaacagtat ggcttcgccg tcgtaggcac agcggatacg 120
gcgggtcgcc gctcagtcgc actgcgtcaa ggtcgcatca cccttgtctt aacacaggcc 180
acaagcgacc gtcatccggc gtcagcgtat gtgcggaccc atggcgatgg tgtggctgat 240
attgcgttgc gtaccccgga tgtagacgct gtctttacgc acgctgttgc tgcgggtgca 300
cggccggttc gcagtccgag ccgtcatcca ggtcccggac cagcttgctc ggcagcgatt 360
ggtggttttg gtgacctcct gcataccctg gtacaacgcg aaccaggcgc gggcccggga 420
cttcctgtgg gtttctctga tgcccctcct gccgggacct ctggcgcgga tgccggggaa 480
ctcctggata ttgaccactt tgcagtgtgt ctgccgactg gagaactgga catcatcacc 540
gacttctaca tcgccaccct gggctttagc gaaacgttca aagaacgcat tgaagttggg 600
actcaggcga tggagtccaa agtggttcag agtgctagtg gcgacgtcac cctgacgctc 660
attgagcccg atccgttagc cgatagtggg cagattgaca tgttcctgga acgtcatgca 720
ggagcgggcg tgcagcacgt ggcgttttcc tcggcagatg ccgtgcgtgc cgtatcgacc 780
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agccgcattc tgatccgtga tcacacggtt gatgaactgc gcgcgacagg cttgttagcc 900
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acgctgttct ttgaggtgat tgagcgccgt ggggcccgca cttttggcgg tgcaaacatt 1020
aaggcgttgt atgaggcagt tgaagtggca cgctctcagc aacgcgcgta a 1071
<210> 37
<211> 356
<212> PRT
<213> 科克斯野野村氏菌
<400> 37
Met Glu Ser Leu Pro Thr Leu Ala Val Asp Tyr Val Glu Met Tyr Val
1 5 10 15
Ala Asp Leu Gln Val Ala Thr Leu Pro Trp Thr Glu Gln Tyr Gly Phe
20 25 30
Ala Val Val Gly Thr Ala Asp Thr Ala Gly Arg Arg Ser Val Ala Leu
35 40 45
Arg Gln Gly Arg Ile Thr Leu Val Leu Thr Gln Ala Thr Ser Asp Arg
50 55 60
His Pro Ala Ser Ala Tyr Val Arg Thr His Gly Asp Gly Val Ala Asp
65 70 75 80
Ile Ala Leu Arg Thr Pro Asp Val Asp Ala Val Phe Thr His Ala Val
85 90 95
Ala Ala Gly Ala Arg Pro Val Arg Ser Pro Ser Arg His Pro Gly Pro
100 105 110
Gly Pro Ala Cys Ser Ala Ala Ile Gly Gly Phe Gly Asp Leu Leu His
115 120 125
Thr Leu Val Gln Arg Glu Pro Gly Ala Gly Pro Gly Leu Pro Val Gly
130 135 140
Phe Ser Asp Ala Pro Pro Ala Gly Thr Ser Gly Ala Asp Ala Gly Glu
145 150 155 160
Leu Leu Asp Ile Asp His Phe Ala Val Cys Leu Pro Thr Gly Glu Leu
165 170 175
Asp Ile Ile Thr Asp Phe Tyr Ile Ala Thr Leu Gly Phe Ser Glu Thr
180 185 190
Phe Lys Glu Arg Ile Glu Val Gly Thr Gln Ala Met Glu Ser Lys Val
195 200 205
Val Gln Ser Ala Ser Gly Asp Val Thr Leu Thr Leu Ile Glu Pro Asp
210 215 220
Pro Leu Ala Asp Ser Gly Gln Ile Asp Met Phe Leu Glu Arg His Ala
225 230 235 240
Gly Ala Gly Val Gln His Val Ala Phe Ser Ser Ala Asp Ala Val Arg
245 250 255
Ala Val Ser Thr Leu Ser Gly Arg Gly Val Arg Phe Leu Ser Thr Pro
260 265 270
Asp Ser Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Ser Arg Ile Leu Ile Arg Asp His
275 280 285
Thr Val Asp Glu Leu Arg Ala Thr Gly Leu Leu Ala Asp Glu Asp His
290 295 300
Ala Gly Gln Leu Phe Gln Ile Phe Thr Ala Ser Thr His Pro Arg Glu
305 310 315 320
Thr Leu Phe Phe Glu Val Ile Glu Arg Arg Gly Ala Arg Thr Phe Gly
325 330 335
Gly Ala Asn Ile Lys Ala Leu Tyr Glu Ala Val Glu Val Ala Arg Ser
340 345 350
Gln Gln Arg Ala
355
<210> 38
<211> 963
<212> DNA
<213> 直线游动放线菌
<400> 38
atggacacgc gtgcggaagg tgcgggtccg ggtgctgagc actctgtggt tctcggtcac 60
gacgatatcc gcctcgttct gactcgccca ggcactggcg atcatccggg agaaatgtat 120
gcgacccaac atgggtatgg cgtttccgac attgcgttag gcaccgcgga tgctgctggt 180
gcgtttcacg aagcggttcg tcgcggcgca cgtcccattg ccgcaccgca acgggatggc 240
gcagtagtga ccgcgtctgt tggcgggttt ggggatgtca ttcacacctt tgtccaacgc 300
gatccgggag gtgaatggtc actgccaggt ctgaccccgg ttcatcgtag cggcacaccg 360
ggtattgggc tgcggttggt agaccatttt gccgtatgcg tggaagcggg ccgtttagac 420
gaagttgtcg aacactacga gcgtgtgttc gatttcgcca tggtgtttac tgagcgcatt 480
gtcgtgggcg aacaagcgat ggattcccag gtggttcaga gtgcgggtgg tgcagtgacc 540
ctgaccctga ttgcacccga cacgacacgc cgtcctgggc agatcgacac gtttctgaag 600
gagcatggcg gagctggtgt acagcacatt gcattcgaaa cgggcgacat tattcgtagc 660
gtgggagcca tgagcgatgc tggcgtggag tttctgagta ccccggatgc ctactatggc 720
cgcatgggcg atcgcttaac gctgacccgc catacagtag ccgaactgcg tgggttgaat 780
gtcctggcag atgaggatca tgacggtcag ctttaccaga tcttcaccaa atcgacccat 840
ccacgcggaa cgctgttctt cgagatcatc gaacgcgtcg gtgcccgcac ttttggctcg 900
ggtaacatca aagccttgta tgaagccgtg gaacttgatc aggcggaacc tgatggccgc 960
taa 963
<210> 39
<211> 320
<212> PRT
<213> 直线游动放线菌
<400> 39
Met Asp Thr Arg Ala Glu Gly Ala Gly Pro Gly Ala Glu His Ser Val
1 5 10 15
Val Leu Gly His Asp Asp Ile Arg Leu Val Leu Thr Arg Pro Gly Thr
20 25 30
Gly Asp His Pro Gly Glu Met Tyr Ala Thr Gln His Gly Tyr Gly Val
35 40 45
Ser Asp Ile Ala Leu Gly Thr Ala Asp Ala Ala Gly Ala Phe His Glu
50 55 60
Ala Val Arg Arg Gly Ala Arg Pro Ile Ala Ala Pro Gln Arg Asp Gly
65 70 75 80
Ala Val Val Thr Ala Ser Val Gly Gly Phe Gly Asp Val Ile His Thr
85 90 95
Phe Val Gln Arg Asp Pro Gly Gly Glu Trp Ser Leu Pro Gly Leu Thr
100 105 110
Pro Val His Arg Ser Gly Thr Pro Gly Ile Gly Leu Arg Leu Val Asp
115 120 125
His Phe Ala Val Cys Val Glu Ala Gly Arg Leu Asp Glu Val Val Glu
130 135 140
His Tyr Glu Arg Val Phe Asp Phe Ala Met Val Phe Thr Glu Arg Ile
145 150 155 160
Val Val Gly Glu Gln Ala Met Asp Ser Gln Val Val Gln Ser Ala Gly
165 170 175
Gly Ala Val Thr Leu Thr Leu Ile Ala Pro Asp Thr Thr Arg Arg Pro
180 185 190
Gly Gln Ile Asp Thr Phe Leu Lys Glu His Gly Gly Ala Gly Val Gln
195 200 205
His Ile Ala Phe Glu Thr Gly Asp Ile Ile Arg Ser Val Gly Ala Met
210 215 220
Ser Asp Ala Gly Val Glu Phe Leu Ser Thr Pro Asp Ala Tyr Tyr Gly
225 230 235 240
Arg Met Gly Asp Arg Leu Thr Leu Thr Arg His Thr Val Ala Glu Leu
245 250 255
Arg Gly Leu Asn Val Leu Ala Asp Glu Asp His Asp Gly Gln Leu Tyr
260 265 270
Gln Ile Phe Thr Lys Ser Thr His Pro Arg Gly Thr Leu Phe Phe Glu
275 280 285
Ile Ile Glu Arg Val Gly Ala Arg Thr Phe Gly Ser Gly Asn Ile Lys
290 295 300
Ala Leu Tyr Glu Ala Val Glu Leu Asp Gln Ala Glu Pro Asp Gly Arg
305 310 315 320
<210> 40
<211> 1056
<212> DNA
<213> Actinoplanes subtropicus
<400> 40
atgacagggc actttcagaa tctgaccgtg gatcacgtgc gcatctattg cgaggagctg 60
gacccgttga tcgcgcagtt tgggtgctat ggtctggatg tgcgcgcaga aggcgctggc 120
ccaggtgccg aacaatccat cgttttaggt catggtgaca ttcgcctggt gttgacccaa 180
ccaggcactg gcgatcatcc cggtgccatg tacaccagtc agcatgggca cggcgtatca 240
gacattgcgc tcggcaccga tgatgcagcc ggtgcgttcc atgaagccgt gcgtcgtggt 300
gcacgtccaa ttgtagctcc cgaacgcaat gcgggactcg taacggccag cgtaggtggc 360
tttggggacg tgattcacac gtttgtggaa cgggaaccgg gtggttcgtg gtcattaccg 420
ggtttagtcc cggttcaacg ccctggtaca cctggggtga acttgcgcct gattgatcat 480
tttgcggtgt gtgtagagcc gggacgtctt gaagaggtcg ttgagcatta tgagcgtgtc 540
tttgatttct cgatgatctt tactgaacgc atcgtggttg gcgaacaagc aatggacagc 600
caggtcgtcc aatctgctgg aggagccgtt acgctgacgg tgattgcgcc ggataccact 660
cgtcgtccgg ggcagattga caccttcctg aaggatcatg gcggcgcggg tgtccagcac 720
gttgcgttcg aaacggatga tgcgattcgc tctgtgggcg tcatgtcgga agccggcatt 780
ggctttctcc acaccccggc aagctattac gaactgatgc ggcatcgcct gcaactgact 840
cgccacagtg ttgcggaact tagctcctta aacgttcttg cagatcagga ccatgacggt 900
cagctgtatc agatcttcac caaatccacg catcctcgtg gcaccctgtt cttcgagatt 960
atcgaacgcg ttggagcacg tacatttggc agcggcaaca tcaaagccct gtacgaagct 1020
gtggaactgg atcagagtgc ggctgatggc cgctaa 1056
<210> 41
<211> 351
<212> PRT
<213> Actinoplanes subtropicus
<400> 41
Met Thr Gly His Phe Gln Asn Leu Thr Val Asp His Val Arg Ile Tyr
1 5 10 15
Cys Glu Glu Leu Asp Pro Leu Ile Ala Gln Phe Gly Cys Tyr Gly Leu
20 25 30
Asp Val Arg Ala Glu Gly Ala Gly Pro Gly Ala Glu Gln Ser Ile Val
35 40 45
Leu Gly His Gly Asp Ile Arg Leu Val Leu Thr Gln Pro Gly Thr Gly
50 55 60
Asp His Pro Gly Ala Met Tyr Thr Ser Gln His Gly His Gly Val Ser
65 70 75 80
Asp Ile Ala Leu Gly Thr Asp Asp Ala Ala Gly Ala Phe His Glu Ala
85 90 95
Val Arg Arg Gly Ala Arg Pro Ile Val Ala Pro Glu Arg Asn Ala Gly
100 105 110
Leu Val Thr Ala Ser Val Gly Gly Phe Gly Asp Val Ile His Thr Phe
115 120 125
Val Glu Arg Glu Pro Gly Gly Ser Trp Ser Leu Pro Gly Leu Val Pro
130 135 140
Val Gln Arg Pro Gly Thr Pro Gly Val Asn Leu Arg Leu Ile Asp His
145 150 155 160
Phe Ala Val Cys Val Glu Pro Gly Arg Leu Glu Glu Val Val Glu His
165 170 175
Tyr Glu Arg Val Phe Asp Phe Ser Met Ile Phe Thr Glu Arg Ile Val
180 185 190
Val Gly Glu Gln Ala Met Asp Ser Gln Val Val Gln Ser Ala Gly Gly
195 200 205
Ala Val Thr Leu Thr Val Ile Ala Pro Asp Thr Thr Arg Arg Pro Gly
210 215 220
Gln Ile Asp Thr Phe Leu Lys Asp His Gly Gly Ala Gly Val Gln His
225 230 235 240
Val Ala Phe Glu Thr Asp Asp Ala Ile Arg Ser Val Gly Val Met Ser
245 250 255
Glu Ala Gly Ile Gly Phe Leu His Thr Pro Ala Ser Tyr Tyr Glu Leu
260 265 270
Met Arg His Arg Leu Gln Leu Thr Arg His Ser Val Ala Glu Leu Ser
275 280 285
Ser Leu Asn Val Leu Ala Asp Gln Asp His Asp Gly Gln Leu Tyr Gln
290 295 300
Ile Phe Thr Lys Ser Thr His Pro Arg Gly Thr Leu Phe Phe Glu Ile
305 310 315 320
Ile Glu Arg Val Gly Ala Arg Thr Phe Gly Ser Gly Asn Ile Lys Ala
325 330 335
Leu Tyr Glu Ala Val Glu Leu Asp Gln Ser Ala Ala Asp Gly Arg
340 345 350
<210> 42
<211> 1098
<212> DNA
<213> 龟裂链霉菌的
<400> 42
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tttaccgtcg tcggcactgg tggctctgcc gatcaccgca gcattgcgtt acgccatggc 180
acgattaccc tggtgctcac gaccgctaca tccgatcgcc atccggcgtc tgtgtatgtg 240
gtagatcacg gcgatggggt tgcggacatt gcactgcgta ccgcggacgt tgaaggcgct 300
ttcgctcatg ccgtcgcaaa tggtgcggaa ccgctgcgcc gtccagcccg tcatggtgga 360
gctggtgcag ccgtgaccgc gaccgtgagt ggctttgggg atgtcgtgca tacccttgtc 420
cagcgtggtc cggaagaagg accgggtttg cctgtggggt ttgtggcgac cctgcaatca 480
cgtcagcccg ttccgtcgga agccgggttg ctggaacttg atcacattgc cgtatgcctg 540
aacaatggcg acttagacgg tacagttgcc tattatcgcc gcgctttggg ctttcaggag 600
atctttgagg aacacattgt agtgggtgcg caagcgatgg actcgaaagt ggtgcagtcg 660
cctacaggac gggtgacgtt aactctgatt gaaccggata caaccgctga tcccggtcag 720
atcgacgact tcctcaaatc acaccaagga gcgggcgtac agcatctggc gttttcgtgt 780
gatgacgcag ttcatgcggt ccgcacgtta actggccgtg gtgtggagtt tctgagcagt 840
ccaagcgcgt attatgatct cctgggcgca cgcatccagt tgtctcaaca cagcctggaa 900
gatctgcgct ccaccagcct cctggcggat caggatcatg gcggccaact gttccagatt 960
ttcaccgcca gtacgcatcc gcgccgtacc atcttctacg agattatcga acgtcaaggt 1020
gcggaaactt tcggtagctc caacatcaaa gcactgtacg aagccgtaga actggagaag 1080
aaaggccagc gggtttaa 1098
<210> 43
<211> 365
<212> PRT
<213> 龟裂链霉菌的
<400> 43
Met Thr Val Ser Asp Ser Ala Ala Ala Thr Ala Ala Val Gly Asp Leu
1 5 10 15
Ala Ile Asp Tyr Ile Glu Met Tyr Val Ala Asp Leu Asp Ala Ala Ala
20 25 30
Phe Ala Trp Val Asp Lys Tyr Ala Phe Thr Val Val Gly Thr Gly Gly
35 40 45
Ser Ala Asp His Arg Ser Ile Ala Leu Arg His Gly Thr Ile Thr Leu
50 55 60
Val Leu Thr Thr Ala Thr Ser Asp Arg His Pro Ala Ser Val Tyr Val
65 70 75 80
Val Asp His Gly Asp Gly Val Ala Asp Ile Ala Leu Arg Thr Ala Asp
85 90 95
Val Glu Gly Ala Phe Ala His Ala Val Ala Asn Gly Ala Glu Pro Leu
100 105 110
Arg Arg Pro Ala Arg His Gly Gly Ala Gly Ala Ala Val Thr Ala Thr
115 120 125
Val Ser Gly Phe Gly Asp Val Val His Thr Leu Val Gln Arg Gly Pro
130 135 140
Glu Glu Gly Pro Gly Leu Pro Val Gly Phe Val Ala Thr Leu Gln Ser
145 150 155 160
Arg Gln Pro Val Pro Ser Glu Ala Gly Leu Leu Glu Leu Asp His Ile
165 170 175
Ala Val Cys Leu Asn Asn Gly Asp Leu Asp Gly Thr Val Ala Tyr Tyr
180 185 190
Arg Arg Ala Leu Gly Phe Gln Glu Ile Phe Glu Glu His Ile Val Val
195 200 205
Gly Ala Gln Ala Met Asp Ser Lys Val Val Gln Ser Pro Thr Gly Arg
210 215 220
Val Thr Leu Thr Leu Ile Glu Pro Asp Thr Thr Ala Asp Pro Gly Gln
225 230 235 240
Ile Asp Asp Phe Leu Lys Ser His Gln Gly Ala Gly Val Gln His Leu
245 250 255
Ala Phe Ser Cys Asp Asp Ala Val His Ala Val Arg Thr Leu Thr Gly
260 265 270
Arg Gly Val Glu Phe Leu Ser Ser Pro Ser Ala Tyr Tyr Asp Leu Leu
275 280 285
Gly Ala Arg Ile Gln Leu Ser Gln His Ser Leu Glu Asp Leu Arg Ser
290 295 300
Thr Ser Leu Leu Ala Asp Gln Asp His Gly Gly Gln Leu Phe Gln Ile
305 310 315 320
Phe Thr Ala Ser Thr His Pro Arg Arg Thr Ile Phe Tyr Glu Ile Ile
325 330 335
Glu Arg Gln Gly Ala Glu Thr Phe Gly Ser Ser Asn Ile Lys Ala Leu
340 345 350
Tyr Glu Ala Val Glu Leu Glu Lys Lys Gly Gln Arg Val
355 360 365
<210> 44
<211> 1101
<212> DNA
<213> 橙色滑柱菌
<400> 44
atgaccagtc cgacttcgct ggataccacc cctcagctgg atgacttcga ttatgttgag 60
ttctatgtgg gtaatgcccg tcaaaccgcc cactttctgc gcacagcgtt cggttttaaa 120
ccgattgcgt atgcgggctt agaaacagga gtacgtgatc gcgcaagcat tctgttgcag 180
caaggtgcca ttcgcctgat cattacggaa gcactcgatc cggaatcccc gattgccgat 240
catgtgaaac tgcatggtga ctccattaag gatatcgcgt ttaccgtggc caacgtgcat 300
agcgcttttg aagccgcagt taaacgggga gctcgtccca tcttagaacc agtaacgatt 360
gaaagtccgc aaggcagcat tatcaaagct accattggga cttatgggga cacgacacac 420
agcctgattc agcgcgtaga tctggcggac aatgcctttc cgcagtttca gccgatcgag 480
aatccagcac acgtcattga tggtggcttt agcgttgtcg atcatgttgc gatctccttg 540
gagccgggtc gcctggctga atgggtggac ttttacatta acgtccttgg cttccaccag 600
tctcacgaag aaaacattgt gactgaatac tctgggatga actcacgtgt ggtgcagaat 660
catgccggta cgatcaaatt ccccatgcag gagccaattc agggcaaacg ccgctcacag 720
gtggaagagt tcttgacctt tcatcatggt gcgggcgctc agcatctggc aatcctcact 780
gacgacatta tccattcgat tcaaacctta cgcgcgaatg gaatcgaatt tgtccgtacc 840
cctgcgacgt actacgaaaa ccttcaagag cgtgttggcc tgattgatga ggacattgcg 900
atgctccgtg atctgcacat cttggtcgat cgcgatagca gtggttatct gcttcagatc 960
tttaccaaac cgttacagtc gcgtcctacg atgttcttcg aaattatcca acggaagaac 1020
gccattggct tcggctctgg gaacatcaaa gcgctgtttg cagcagttga acgcgaacaa 1080
gcgctgcgcg gcaatctgta a 1101
<210> 45
<211> 366
<212> PRT
<213> 橙色滑柱菌
<400> 45
Met Thr Ser Pro Thr Ser Leu Asp Thr Thr Pro Gln Leu Asp Asp Phe
1 5 10 15
Asp Tyr Val Glu Phe Tyr Val Gly Asn Ala Arg Gln Thr Ala His Phe
20 25 30
Leu Arg Thr Ala Phe Gly Phe Lys Pro Ile Ala Tyr Ala Gly Leu Glu
35 40 45
Thr Gly Val Arg Asp Arg Ala Ser Ile Leu Leu Gln Gln Gly Ala Ile
50 55 60
Arg Leu Ile Ile Thr Glu Ala Leu Asp Pro Glu Ser Pro Ile Ala Asp
65 70 75 80
His Val Lys Leu His Gly Asp Ser Ile Lys Asp Ile Ala Phe Thr Val
85 90 95
Ala Asn Val His Ser Ala Phe Glu Ala Ala Val Lys Arg Gly Ala Arg
100 105 110
Pro Ile Leu Glu Pro Val Thr Ile Glu Ser Pro Gln Gly Ser Ile Ile
115 120 125
Lys Ala Thr Ile Gly Thr Tyr Gly Asp Thr Thr His Ser Leu Ile Gln
130 135 140
Arg Val Asp Leu Ala Asp Asn Ala Phe Pro Gln Phe Gln Pro Ile Glu
145 150 155 160
Asn Pro Ala His Val Ile Asp Gly Gly Phe Ser Val Val Asp His Val
165 170 175
Ala Ile Ser Leu Glu Pro Gly Arg Leu Ala Glu Trp Val Asp Phe Tyr
180 185 190
Ile Asn Val Leu Gly Phe His Gln Ser His Glu Glu Asn Ile Val Thr
195 200 205
Glu Tyr Ser Gly Met Asn Ser Arg Val Val Gln Asn His Ala Gly Thr
210 215 220
Ile Lys Phe Pro Met Gln Glu Pro Ile Gln Gly Lys Arg Arg Ser Gln
225 230 235 240
Val Glu Glu Phe Leu Thr Phe His His Gly Ala Gly Ala Gln His Leu
245 250 255
Ala Ile Leu Thr Asp Asp Ile Ile His Ser Ile Gln Thr Leu Arg Ala
260 265 270
Asn Gly Ile Glu Phe Val Arg Thr Pro Ala Thr Tyr Tyr Glu Asn Leu
275 280 285
Gln Glu Arg Val Gly Leu Ile Asp Glu Asp Ile Ala Met Leu Arg Asp
290 295 300
Leu His Ile Leu Val Asp Arg Asp Ser Ser Gly Tyr Leu Leu Gln Ile
305 310 315 320
Phe Thr Lys Pro Leu Gln Ser Arg Pro Thr Met Phe Phe Glu Ile Ile
325 330 335
Gln Arg Lys Asn Ala Ile Gly Phe Gly Ser Gly Asn Ile Lys Ala Leu
340 345 350
Phe Ala Ala Val Glu Arg Glu Gln Ala Leu Arg Gly Asn Leu
355 360 365
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
accggaattc taaggaggaa tgcatatgaa 30
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
accggagctc ttagctaaaa cgggaaagtt 30
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
ctgagaaaag aatttccagt atttaaagag 30
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
ctctttaaat actggaaatt cttttctcag 30
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
aagcggcagg gtcggaacag gagag 25
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
catatgcatt cctccttacg gtgttatatg 30
<210> 52
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
ccgtaaggag gaatgcatat gaccatgacg ggccactttc 40
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
gctagttatt gctcagcgg 19
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
accggagctc attttttcaa tgtgatttta 30
<210> 55
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 55
ccgtaaggag gaatgcatat gagccgcaac ctgtttaacg 40
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
accgggatcc tcatgcatgg gtgcctttac 30
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
accgctcgag attttttcaa tgtgatttta 30
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 58
taatacgact cactataggg 20
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 59
accgctcgag acggccatcc gcggcagcct 30
<210> 60
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 60
acggtcttag cgccggatac cacacgc 27
<210> 61
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 61
cggcgctaag accgttaagg tcacagc 27
<210> 62
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 62
ggcaacgtta aagcgctgta tgaagcg 27
<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 63
cgctttaacg ttgcctgaac cgaaagt 27
<210> 64
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 64
accggagctc agtggtggtg gtggtggtg 29
<210> 65
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 65
gaaccggaat tcattttttc aatgtgattt ta 32
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 66
atggtcatat ggattcctcc ttacggtgtt 30
<210> 67
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
gttttcccag tcacgac 17
<210> 68
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 68
caggaaacag ctatgac 17

Claims (24)

1.生产苯甲醛的方法，所述方法包括下述步骤(A)：
(A)通过使用具有以下四种酶的至少一种微生物生产苯甲醛：氨基酸脱氨酶、4-羟基扁桃酸合酶、(S)-扁桃酸脱氢酶，和苯甲酰甲酸脱羧酶，
其中所述至少一种微生物由独自具有所述四种酶的单一微生物，或者整体具有所述四种酶的多种微生物的组合组成。
2.根据权利要求1的方法，其中通过选自(a)至(c)的方式实施步骤(A)：
(a)培养所述至少一种微生物；
(b)使用所述至少一种微生物的细胞；或者
(c)培养所述多种微生物的一部分和使用所述多种微生物的其余部分的细胞这两种方法的组合。
3.根据权利要求1或2的方法，其中从碳源或L-苯丙氨酸生产苯甲醛。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中通过下述步骤(B)或(C)实施步骤(A):
(B)通过使用所述至少一种微生物从碳源生产苯甲醛；
(C)通过使用所述至少一种微生物将L-苯丙氨酸转化为苯甲醛，
其中步骤(B)中使用的所述至少一种微生物具有L-苯丙氨酸生产能力。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中通过下述步骤(B1)、(C1)或(C2)实施步骤(A):
(B1)在含有碳源的培养基中培养所述至少一种微生物以在所述培养基中生成并积累苯甲醛；
(C1)在含有L-苯丙氨酸的培养基中培养所述至少一种微生物以在所述培养基中生成并积累苯甲醛；
(C2)在反应混合物中允许所述至少一种微生物的细胞与L-苯丙氨酸共存以在所述反应混合物中生成并积累苯甲醛，
其中步骤(B1)中使用的所述至少一种微生物具有L-苯丙氨酸生产能力。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中步骤(A)包含下述步骤(D1)和(D2):
(D1)下述步骤(D1a)或(D1b):
(D1a)从碳源生成苯丙酮酸、(S)-扁桃酸或苯甲酰甲酸；
(D1b)将L-苯丙氨酸转化为苯丙酮酸、(S)-扁桃酸或苯甲酰甲酸；
(D2)将步骤(D1)中生成的苯丙酮酸、(S)-扁桃酸或苯甲酰甲酸转化为苯甲醛，
其中通过使用至少一种微生物实施步骤(D1a)，所述至少一种微生物具有选自所述四种酶的与步骤(D1)对应的一种或多种酶，并具有L-苯丙氨酸生产能力，
其中通过使用至少一种微生物实施步骤(D1b)，所述至少一种微生物具有选自所述四种酶的与步骤(D1)对应的一种或多种酶，和
其中通过使用至少一种微生物实施步骤(D2)，所述至少一种微生物具有选自所述四种酶的与步骤(D2)对应的一种或多种酶。
7.根据权利要求6的方法，
其中通过培养在步骤(D1a)中使用的所述至少一种微生物实施步骤(D1a)，和
其中通过使用在步骤(D1b)和(D2)中使用的相应微生物的细胞，或者通过培养步骤(D1b)和(D2)中使用的相应微生物实施步骤(D1b)和(D2)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中步骤(A)包括下述步骤(E1)和(E2)：
(E1)下述步骤(E1a)或(E1b)：
(E1a)通过使用具有氨基酸脱氨酶、4-羟基扁桃酸合酶和(S)-扁桃酸脱氢酶并具有L-苯丙氨酸生产能力的至少一种微生物从碳源生成苯甲酰甲酸；
(E1b)通过使用具有氨基酸脱氨酶、4-羟基扁桃酸合酶和(S)-扁桃酸脱氢酶的至少一种微生物将L-苯丙氨酸转化为苯甲酰甲酸；
(E2)通过使用具有苯甲酰甲酸脱羧酶的微生物将步骤(E1)中生成的苯甲酰甲酸转化为苯甲醛。
9.根据权利要求8的方法，
其中通过培养在步骤(E1a)中使用的所述至少一种微生物来实施步骤(E1a)，和
其中通过使用在步骤(E1b)和(E2)中使用的相应微生物的细胞，或者通过培养在步骤(E1b)和(E2)中使用的相应微生物来实施步骤(E1b)和(E2)。
10.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中步骤(A)包括下述步骤(F1)和(F2)：
(F1)下述步骤(F1a)或(F1b)：
(F1a)在含有碳源的培养基中培养至少一种微生物以在所述培养基中生成并积累苯甲酰甲酸，所述至少一种微生物具有氨基酸脱氨酶、4-羟基扁桃酸合酶和(S)-扁桃酸脱氢酶并具有L-苯丙氨酸生产能力；
(F1b)在含有L-苯丙氨酸的培养基中培养至少一种微生物以在所述培养基中生成并积累苯甲酰甲酸，或者在反应混合物中允许至少一种微生物的细胞与L-苯丙氨酸共存以在所述反应混合物中生成并积累苯甲酰甲酸，所述至少一种微生物具有氨基酸脱氨酶、4-羟基扁桃酸合酶和(S)-扁桃酸脱氢酶；
(F2)在含有步骤(F1)中生成的苯甲酰甲酸的培养基中培养微生物以在所述培养基中生成并积累苯甲醛，或者在反应混合物中允许微生物的细胞与步骤(F1)中生成的苯甲酰甲酸共存以在所述反应混合物中生成并积累苯甲醛，所述微生物具有苯甲酰甲酸脱羧酶。
11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中步骤(A)包括下述步骤(G1)至(G4)：
(G1)下述步骤(G1a)或(G1b)：
(G1a)通过使用具有氨基酸脱氨酶并具有L-苯丙氨酸生产能力的微生物从碳源生成苯丙酮酸；
(G1b)通过使用具有氨基酸脱氨酶的微生物将L-苯丙氨酸转化为苯丙酮酸；
(G2)通过使用具有4-羟基扁桃酸合酶的微生物将步骤(G1)中生成的苯丙酮酸转化为(S)-扁桃酸；
(G3)通过使用具有(S)-扁桃酸脱氢酶的微生物将步骤(G2)中生成的(S)-扁桃酸转化为苯甲酰甲酸；
(G4)通过使用具有苯甲酰甲酸脱羧酶的微生物将步骤(G3)中生成的苯甲酰甲酸转化为苯甲醛。
12.根据权利要求11的方法，
其中通过培养步骤(G1a)中使用的微生物来实施步骤(G1a)，和
其中通过使用在步骤(G1b)和(G2)至(G4)中使用的相应微生物的细胞，或者通过培养步骤(G1b)和(G2)至(G4)中使用的相应微生物来实施步骤(G1b)和(G2)至(G4)。
13.根据权利要求2至12中任一项的方法，其中所述细胞由所述一种或多种微生物的培养液，从所述培养液收集的细胞，其处理产品，或其组合组成。
14.根据权利要求1至13中任一项的方法，其中所述氨基酸脱氨酶是下述(a)、(b)或(c)中定义的蛋白质：
(a)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，但该氨基酸序列包括1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并具有氨基酸脱氨酶活性的蛋白质；
(c)包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并具有氨基酸脱氨酶活性的蛋白质。
15.根据权利要求1至14中任一项的方法，其中所述4-羟基扁桃酸合酶是下述(a)、(b)、(c)或(d)中定义的蛋白质：
(a)包含SEQ ID NO:14、16、18、20、22、33、36、41、43或45的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包含SEQ ID NO:14、16、18、20、22、33、36、41、43或45的氨基酸序列，但该氨基酸序列包括1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并具有4-羟基扁桃酸合酶活性的蛋白质；
(c)包含与SEQ ID NO:14、16、18、20、22、33、36、41、43或45的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并具有4-羟基扁桃酸合酶活性的蛋白质，
(d)包含(a)、(b)或(c)中定义的蛋白质的氨基酸序列，但具有特定突变的蛋白质，其中所述特定突变由与选自下组的一个或多个氨基酸残基对应的氨基酸残基处的突变组成：T2、M3、G5、Y18、A27、D35、E46、E180、A187、E191、V194、A199、D201、Q206、I217、D220、T222、G255、F319、G327、I336、K337、V343和Q347，
条件是从4-羟基扁桃酸合酶排除由SEQ ID NO:35和39的氨基酸序列组成的蛋白质。
16.根据权利要求15的方法，其中所述特定突变由与选自下组的一种或多种突变对应的突变组成：T2N、M3I、G5R、Y18F、A27V、D35G、E46Q、E180K、A187V、E191K、V194G、A199(S,V)、D201N、Q206R、I217(L,V)、D220(A,N)、T222S、G255D、F319Y、G327(D,S)、I336V、K337Q、V343M和Q347L。
17.根据权利要求15或16的方法，其中所述特定突变由与M3I/A199S/G255D、Y18F/D220N、A27V/E191K、D35G/E46Q/T222S/I336V、E180K/I217V/D220N、A187V/I217V、A199V/I217V/K337Q、D201N/I217V、I217V/F319Y和D220A/Q347L的任一种对应的突变组成。
18.根据权利要求1至17中任一项的方法，其中所述(S)-扁桃酸脱氢酶是下述(a)、(b)或(c)中定义的蛋白质：
(a)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，但该氨基酸序列包括1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并具有(S)-扁桃酸脱氢酶活性的蛋白质；
(c)包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并具有(S)-扁桃酸脱氢酶活性的蛋白质。
19.根据权利要求1至18中任一项的方法，其中所述苯甲酰甲酸脱羧酶是下述(a)、(b)或(c)中定义的蛋白质：
(a)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，但该氨基酸序列包括1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并具有苯甲酰甲酸脱羧酶活性的蛋白质；
(c)包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并具有苯甲酰甲酸脱羧酶活性的蛋白质。
20.根据权利要求1至19中任一项的方法，其中所述微生物或所述多种微生物的每一种是细菌或酵母。
21.根据权利要求1至20中任一项的方法，其中所述微生物或所述多种微生物的每一种是属于肠肝菌科的细菌或棒状杆菌细菌。
22.根据权利要求1至21中任一项的方法，其中所述微生物或所述多种微生物的每一种是属于埃希氏菌属的细菌。
23.根据权利要求1至22中任一项的方法，其中所述微生物或所述多种微生物的每一种是大肠杆菌。
24.根据权利要求1至23中任一项的方法，其中所述方法进一步包括收集苯甲醛。
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