WO2006075486A1 - ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質 - Google Patents

ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質 Download PDF

Info

Publication number
WO2006075486A1
WO2006075486A1 PCT/JP2005/023400 JP2005023400W WO2006075486A1 WO 2006075486 A1 WO2006075486 A1 WO 2006075486A1 JP 2005023400 W JP2005023400 W JP 2005023400W WO 2006075486 A1 WO2006075486 A1 WO 2006075486A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mutant
variant
amino acid
protein
acid residues
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/023400
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Isao Abe
Rie Takeshita
Seiichi Hara
Sonoko Suzuki
Kenzo Yokozeki
Masakazu Sugiyama
Shunichi Suzuki
Kunihiko Watanabe
Nobuhisa Shimba
Takefumi Nakamura
Uno Tagami
Yuya Kodama
Hiromi Onoye
Reiko Yuuji
Eiichiro Suzuki
Tatsuki Kashiwagi
Ningchun Xu
Yuko Kai
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co., Inc. filed Critical Ajinomoto Co., Inc.
Priority to BRPI0519172-6A priority Critical patent/BRPI0519172A2/pt
Priority to JP2006552869A priority patent/JPWO2006075486A1/ja
Priority to CA002592309A priority patent/CA2592309A1/en
Priority to EP05820283A priority patent/EP1829968A4/en
Publication of WO2006075486A1 publication Critical patent/WO2006075486A1/ja
Priority to US11/765,926 priority patent/US20070292916A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a mutant protein having peptide-forming activity, and more particularly to a mutant protein having excellent peptide-forming activity, a method for producing a peptide using this protein, and the like.
  • L-ara-L-L-glutamine is more stable and more soluble in water than L-glutamine, so it is widely used as a component in infusion solutions and serum-free media! / Speak.
  • Patent Documents 1 and 2 methods for producing peptides using enzymes have also been developed (for example, Patent Documents 1 and 2).
  • the conventional method for producing a peptide using an enzyme leaves room for improvement in that the peptide production rate is extremely slow and the peptide production yield is low.
  • development of an industrially efficient production method for these peptides has been desired.
  • Patent Document 1 European Patent Application Publication No. 278787
  • Patent Document 2 European Patent No. 359399 Specification
  • Patent Document 3 International Publication No. 2004Z011653 Pamphlet
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-040037
  • Patent Document 5 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2005-058212
  • Patent Document 6 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2005-168405
  • An object of the present invention is to provide a more excellent peptide-generating protein, an efficient method for producing a peptide, and the like.
  • the present inventors have further modified the amino acid sequence or base sequence of a protein having peptide-forming activity derived from a bacterium belonging to the genus Sphingopacterium to further increase the peptide-forming activity.
  • the inventors have found that an excellent protein can be obtained and completed the present invention. That is, the present invention provides the following protein and a method for producing a peptide using the protein.
  • a mutant protein having an amino acid sequence containing one or more mutations of any of the following mutants 1 to 68 with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • mutant protein in the mutant protein according to [1] above, substitution, deletion, or insertion in a site other than the mutation site in the amino acid sequence containing one or more mutations of any one of the mutant types 1 to 68
  • a mutant protein having an amino acid sequence further comprising a mutation of one or several amino acids selected from the group consisting of addition and inversion force, and having peptide-forming activity.
  • mutant protein according to [1] or [2] above, comprising at least mutant type 2.
  • mutant protein according to any one of [1] to [3] above, which comprises at least mutant 14.
  • a variant protein having an amino acid sequence containing one or more mutations of any one of the following variants 239 to 290 and 324 to 377 with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • mutant protein according to [5] or [6] above, comprising at least mutant 260.
  • mutant protein according to any one of [5] to [7] above, comprising at least mutant 286.
  • a recombinant polynucleotide comprising the polynucleotide according to [9] above.
  • a method for producing a mutant protein comprising culturing the transformed microorganism according to the above [11] in a medium, and accumulating the mutant protein in the medium and in Z or the microorganism. .
  • a method for producing a peptide comprising performing a peptide generation reaction in the presence of the mutant protein according to any one of [1] to [8].
  • a mutant protein in which at least one amino acid residue at the position where the amino acid residue at 447 is present is substituted, inserted or deleted, and has peptide-forming activity.
  • the three-dimensional structure of the protein and the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 209 is similar as a result of the determination by the trending method, and the alignment obtained at the time of the determination Self [J number 209 [amino acids listed here [J-67-70, 72-88, 100, 102, 103, 106, 107, 113-117, 130, 155-163, 165, 166, 180] —188, 190—195, 200—235, 259, 273, 276, 278, 292—294, 296, 298, 299, 300—304, 325—328, 330—340, and 437—447 amino acid residues
  • a mutant protein in which at least one or more amino acid residues are substituted, inserted or deleted in the three-dimensional structure at the position where the amino acid residue corresponding to is present, and has peptide-forming activity.
  • a variant protein of a protein having peptide-forming activity which is an alignment between the protein and the primary sequence of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 209, or the protein and SEQ ID NO: 209
  • the alignment with the three-dimensional structure of the protein having the amino acid sequence of No. 209 has a homology of primary sequence of 25% or more, 67-70, 72 -8 8, 100, 102, 103, 106, 107, 113—117, 130, 155—163, 165, 166, 180 — 188, 190—195, 200—235, 259, 273, 276, 278, 292— 294, 296, 298, 299, 300-304, 325-328, 330-340, and 437-447.
  • a mutant protein of a protein having peptide-forming activity wherein the protein and the three-dimensional structure of the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 209 are similar as a result of determination by the trending method
  • a variant having peptide-forming activity in which one or more changes selected from the following () to () are selected. protein.
  • a variant protein of a protein having peptide-forming activity which is an alignment between the protein and the primary sequence of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 209, or the protein and SEQ ID NO: 209
  • the homology of the primary sequence is 25% or more, and the following (a ") to (i ⁇ )
  • a mutant protein that has 1 or 2 or more changes, and that has peptide-forming activity.
  • a mutant protein in which at least one or more amino acid residues at positions where 1 and 446 amino acid residues are present are substituted, inserted or deleted, and have peptide-forming activity.
  • mutant protein in the mutant protein according to [20] above, substitution, deletion, or insertion in a site other than the mutation site in the amino acid sequence containing any one or more mutations of the mutant L1 to L335
  • a mutant protein having an amino acid sequence further comprising a mutation of one or several amino acids selected from the group consisting of addition and inversion force, and having peptide-forming activity.
  • mutant protein according to [27] or [28] above, comprising at least mutant L124 or mutant L125.
  • mutant protein according to any one of [30], wherein the mutant protein includes at least mutant L12.
  • mutant protein according to any one of [27] to [32] above, comprising at least a mutant L195 or L199.
  • mutant protein according to any one of [27] to [35] above, comprising at least a mutant L316.
  • mutant protein according to any one of [27] to [37] above, comprising at least a mutant L15 or L16.
  • mutant protein according to any one of [27] to [39] above, comprising at least a mutant L284.
  • mutant protein according to any one of [27] to [40] above, comprising at least a mutant L191.
  • mutant protein according to any one of [27] to [41] above, comprising at least a mutant L65.
  • mutant protein according to any one of [27] to [42] above, comprising at least a mutant L265.
  • mutant protein according to any one of [27] to [44] above, comprising at least a mutant L255.
  • mutant protein according to any one of [27] to [45] above, comprising at least a mutant L52.
  • mutant protein according to any one of [27] to [46] above, comprising at least a mutant L155.
  • mutant protein according to any one of [27] to [47] above, comprising at least a mutant L298.
  • mutant protein according to any one of [27] to [49] above, comprising at least a mutant L145.
  • mutant protein according to any one of [27] to [50] above, comprising at least a mutant L170.
  • mutant protein according to any one of [27] to [52] above, comprising at least a mutant L60.
  • mutant protein according to any one of [27] to [53] above, comprising at least a mutant L110.
  • mutant protein in the mutant protein according to [55] above, substitution, deletion, or insertion at a site other than the mutation site in the amino acid sequence containing any one or two or more mutations of the mutant Ml to M642
  • a mutant protein having an amino acid sequence further comprising a mutation of one or several amino acids selected from the group consisting of addition and inversion force, and having peptide-forming activity.
  • mutant protein according to any one of [55] to [56] above, comprising at least a mutant M241.
  • mutant protein according to any one of [55] to [57] above, comprising at least a mutant M340.
  • mutant protein according to any one of [55] to [58] above, comprising at least a mutant M412.
  • mutant protein according to any one of [55] to [59] above, comprising at least a mutant M491.
  • mutant protein according to any one of [55] to [60] above, comprising at least a mutant M496.
  • mutant protein according to any one of [55] to [62] above, comprising at least a mutant M582.
  • mutant protein according to any one of [55] to [63] above, comprising at least a mutant M594.
  • a recombinant polynucleotide comprising the polynucleotide according to [65] above.
  • a transformed microorganism comprising the recombinant polynucleotide according to [66].
  • a method for producing a mutant protein comprising culturing the transformed microorganism according to [67] in a medium, and accumulating the mutant protein in the medium and in Z or the microorganism.
  • a method for producing a peptide comprising performing a peptide production reaction in the presence of the mutant protein according to any one of [18] to [64].
  • the transformed microorganism described in [67] above is cultured in a medium, and the mutant protein is accumulated in the medium and in Z or the transformed microorganism to perform a peptide production reaction, A method for producing a peptide.
  • the transformed microorganism according to [67] above is cultured in a medium, and the mutant protein is accumulated in the medium and in Z or the transformed microorganism, so that L-aspartic acid-a, j8-diester And a method for producing a-L-asvaltylu L-ferulalanin ⁇ ester, which comprises reacting L-ferulalanin with L-ferulalanin.
  • Protein having peptide-forming activity of the present invention (mutant protein based on the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2)
  • the protein of the present invention is a mutant protein having an amino acid sequence in which any one or two or more mutations of the following mutant types 1 to 68 are introduced into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and has peptide-forming activity. (Hereinafter also referred to as “(1) mutant protein”). Variants 1 to 68 are shown in Tables 11 and 12.
  • each variant is specified from the abbreviations of amino acid residues as shown in Tables 11 and 12 and the site in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • “F207V” of variant 1 indicates that the 207th amino acid residue ferranin in the sequence of SEQ ID NO: 2 was replaced with palin. That is, the notation of the mutant type is the amino acid residue type of the wild type (amino acid specified by SEQ ID NO: 2); the position of the amino acid residue in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2; Indicates the type. The same applies to other variants.
  • Mutations of variants 1 to 68 may be introduced alone or in combination of two or more.
  • mutations 1 to 68 include one or more of mutations other than those shown in Table 1-1 and Table 1-2, such as V184N, Q229P, Q229L, Q229G, Q229I, I 228G. , I228L, I228D, I228S, I230D, I230V, I230S, S256C, A301G, L6 6F, E80K, Y81A, I157L, V178G, A182G, A182S, P183A, V184P, T18 5F, T185A, T185K, T185T185D, T185C, T185S , T185N, T21 OL, V213A, P214T, P214H, A245S, L263M, K314R, S315R, Y328F, K484I, and A515V may also be introduced in combination with one or more selected.
  • mutations other than those shown in Table 1-1 and Table 1-2 such as V184N, Q
  • a mutant protein containing at least mutant 2: Q441E and a mutant protein containing at least mutant 14: T72A are preferred for improving peptide production activity.
  • a mutant protein containing a combination of M7-35 and M35-4 + V184A (Al) is also suitable for improving peptide bioactivity.
  • each of the mutant proteins of the present invention is a peptide having a reaction rate or yield in producing a peptide from a specific carboxy component and an amine component, or substrate specificity, pH characteristics, temperature stability, etc.
  • the mutant protein of the present invention can be suitably used in industrial production of peptides.
  • the peptide production concentration by the wild type protein is “1”
  • the peptide production concentration force by the mutant protein preferably 1.3 times or more, more preferably Is exemplified by those having the ability to produce 1.5 times or more, more preferably 2 times or more.
  • peptide generating activity refers to an activity of forming a peptide bond from two or more substances to generate a new compound having a peptide bond, and more specifically. Specifically, it has the activity of producing a peptide compound having at least one increased peptide bond from, for example, two amino acids or esters thereof.
  • Mutations 1 to 68, mutations 239 to 290 and 324 to 377 are introduced by a specific site of a gene encoding a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example, by site-directed mutagenesis. It is obtained by modifying the nucleotide sequence so that the amino acid is substituted.
  • the nucleotide sequence corresponding to the mutation site in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 can be easily confirmed by referring to SEQ ID NO: 1.
  • a polypeptide encoded by the modified base sequence as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment.
  • Mutation treatment includes, for example, in vitro treatment of DNA encoding the protein (A) with hydroxylamine, a method of introducing mutation by error-prone PCR, and the DNA in a host deficient in a mutation repair system. And a method for recovering the DNA into which the mutation has been introduced.
  • a protein substantially the same as the mutant protein containing one or two or more mutations shown in the above mutants 1 to 68 and mutants 239 to 290 and 324 in 377 is also provided. That is, the present invention relates to a mutant protein containing one or more of mutant types 1 to 68, and mutant types 239 to 290 and 324 to 377, and is substituted with a site other than the mutant site.
  • a mutant protein having an amino acid sequence further comprising a mutation of one or several amino acids selected from the group consisting of deletion, insertion, addition and inversion force, and having peptide generation activity hereinafter referred to as ⁇ ( II) mutant protein "! /, U).
  • mutant protein of the present invention allows mutations at sites other than the amino acid mutants 1 to 68 shown in SEQ ID NO: 2, and mutation sites 239 to 290 and 324 to 377. Therefore, when mutations such as deletions and insertions are introduced at sites other than mutation types 1 to 68 and mutation types 239 to 290 and 324 to 377, mutation types 1 to 68 and variants 239 to 290 And the site force specified by 324 to 377 7 It may be different from the state before introduction.
  • “several” means a range that does not greatly impair the three-dimensional structure and activity of the amino acid residue protein, although it varies depending on the position and type of the three-dimensional structure of the amino acid residue protein. Specifically, 2 to 50, preferably 2 to 30, more preferably 2 to 10. However, in the case of mutant proteins containing mutation sites other than variants 1 to 68 and variants 239 to 290 and 324 to 377, variants 1 to 68 and variants are obtained at 50 ° C and pH 8. More than half of the protein containing one or more mutations of 239 to 290 and 324 to 377 (i.e. (I) mutant protein), more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, It is particularly desirable that the peptide-forming activity be maintained at 95% or more.
  • Mutations other than variants 1 to 68, and variants other than variants 239 to 290 and 324 to 377 are substituted or deleted at specific sites in the gene encoding this protein, for example, by site-directed mutagenesis. It can be obtained by modifying the base sequence so that it is inserted, added, inverted.
  • the polypeptide encoded by the modified base sequence as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment. Mutation treatment involves in vitro treatment of DNA encoding the mutant protein (I) with hydroxylamine, etc., and Escherichia bacteria carrying the DNA encoding the mutant protein (I) by ultraviolet irradiation. Alternatively, N methyl N'-troen N-trosoguanidine (NTG) or a method of treatment with a mutation agent usually used for artificial mutation such as nitrous acid can be mentioned.
  • mutations such as base substitution, deletion, insertion, addition, and inversion as described above include naturally occurring mutations such as differences between microorganism species and strains.
  • DNA having the mutation as described above in an appropriate cell and examining the enzyme activity of the expression product DNA encoding a protein substantially identical to the protein described in SEQ ID NO: 2 can be obtained.
  • the present inventor has found that a mutant peptide having excellent peptide-generating activity can be designed and produced by adding a mutation to the above-described mutant protein.
  • a mutant peptide having excellent peptide-generating activity can be obtained by mutating the mutation to M35-4ZV184A mutant (A1) (mutant 286; see Table 1-3), a mutant peptide exhibiting remarkable peptide-forming activity can be obtained.
  • the present invention also provides a method for designing and producing a mutant protein based on such M35-4ZV184A mutant (A1).
  • amino acid sequence corresponding to M35-4ZV184A is as shown in SEQ ID NO: 208 in the sequence listing. That is, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 208 is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, and 11 amino acid residues corresponding to the M35-4ZV184A mutant (see Table 1-3) are other amino acid residues. Has been replaced.
  • the design and production of the mutant protein can be performed based on the determination of the three-dimensional structure of the protein by X-ray crystal structure analysis and the determined structural information. That is, based on the three-dimensional structure obtained by analyzing the X-ray crystal structure of the protein, the substrate binding site is estimated, and at least a part of the substrate binding site of the protein is changed, whereby the peptide-forming activity is increased. Design and produce a mutant protein with
  • Determination of the three-dimensional structure of a protein by X-ray crystal structure analysis can be performed, for example, according to the following procedure.
  • Crystallize the protein is indispensable for determining the three-dimensional structure, but it also has industrial utility as a high-purity purification method for proteins and a stable storage method with high density and strong protease resistance. .
  • Diffraction data is collected by irradiating the prepared crystal with X-rays.
  • protein crystals are damaged by X-ray irradiation and their diffraction performance deteriorates.
  • low-temperature measurement technology that rapidly cools crystals to about 173 ° C and collects diffraction data in that state has recently become widespread.
  • synchrotron radiation with high brightness is used to collect high-resolution data used for structure determination.
  • phase information is required in addition to diffraction data.
  • the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 209 is known as the S20 5A mutant of ex amino acid ester hydrolase (Protein Data Bank entry number: 1NX9) as the crystal structure of a related protein.
  • the structure can be determined by molecular replacement. Using the phase determined in this way Fit the protein model to the calculated electron density map. This process is performed on computer graphics using programs such as QUANTA from MSI (USA). After this, the structure is refined using a program such as MSI's CNX, and the structural analysis is completed.
  • the substrate binding site of the protein can be estimated.
  • the substrate binding site means a site where a substrate on the protein surface (for example, in the case of a protein having a peptide generating activity, an amino acid, an amino acid ester, etc.) interacts, and generally around the active center of the protein. Exists.
  • a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 208 is used as an object for crystal structure analysis.
  • the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 208 means the mutant protein M35-4ZV18 4A as described above. That is, in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 208, 11 amino acid residues corresponding to M35-4ZV184A described in Table 1-3 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 are the predetermined amino acid residues. Other than being replaced with the same.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 209 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 208 have very high homology, and only 4 amino acid residues are substituted. Therefore, a crystal structure analysis of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 209 is carried out, and the substrate binding site of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 208 is estimated with reference to the resulting structure. Can do.
  • the substrate binding site of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 208 was determined from serine (SEQ ID NO: SEQ ID NO:) as a result of structural analysis of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 209 described above.
  • the 158th amino acid sequence described in 208 is sometimes abbreviated as “Serl58.” (See “Active Site” in FIG. 5) The region was estimated to be within 15 A.
  • a variant having improved peptide-generating activity can be obtained by causing a change in at least a part of the substrate binding site estimated as described above.
  • to cause a change in at least a part of the substrate binding site means that, among the amino acid residues constituting the substrate binding site, provided that the mutant protein after the change has a peptide-forming activity.
  • Modify one or more residues means substitution, insertion or deletion, preferably substitution with another amino acid residue.
  • the number of amino acids to be modified varies depending on the position and type of amino acid residues, but can be determined as appropriate as long as the three-dimensional structure and activity of the obtained mutant protein are not significantly impaired.
  • a mutant protein having a peptide generating activity from a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 208, at least a part within 15A from the active residue Serl 58 of the protein, ie, 67-70, 72-88, 100, 102, 103, 106, 107, 113-117, 130, 155-16, 3, 165, 166, 180-188, 190-195 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 208 , 200—235, 259, 273, 276, 278, 292 — 294, 296, 298, 299, 300—304, 325—328, 330—340, and 437—447, at least one of the positions where amino acid residues are present It can be based on a structure in which the above amino acid residues are substituted, inserted, or deleted. Specifically, a desired mutant protein can be obtained by substituting at least one of the above-mentioned amino acid residues with another amino acid residue.
  • amino acid residues force S A mutant protein in which at least one or more amino acid residues at the existing position are substituted, inserted or deleted, and has peptide-forming activity Has a high peptide-forming activity, particularly an AMP-generating activity. Specifically, the yield improvement probability of AMP for A1 mutant protein is 30% or more.
  • the designed mutant protein preferably has a certain degree of homology with the A1 mutant protein in its primary sequence (ie, amino acid sequence).
  • the degree of homology can be, for example, 25% or more, more preferably 50% or more, still more preferably 80% or more, and particularly preferably 90% or more.
  • a mutant with further improved activity can be obtained by applying random mutation to several residues that are contiguous to that site in the three-dimensional structure. It is also possible to obtain.
  • a mutant protein having peptide-generating activity by changing at least a part of the position constituting the surface that is continuous with the three-dimensional structure of the amino acid residue that brings about the improvement in peptide-forming activity. Can be obtained.
  • the surface of a protein is an envelope surface of a portion exposed to a solvent when each constituent atom is expressed as a sphere having a van der Waals radius.
  • a surface filling diagram as shown in FIG. Can be illustrated.
  • the position that constitutes a continuous surface with the position of the three-dimensional structure of the amino acid residue that brings about the improvement of peptide-forming activity is, for example, SEQ ID NO: 208 Of the amino acid sequences described, 67-70, 72-88, 100, 102, 103, 106, 107, 113-117, 130, 155-163, 165, 16 6, 180-188, 190-195, 200-235, 259, 273, 276, 278, 292-294, 296, 298, 299, 300-304, 325-328, 330-340, and 437-447
  • a mutant protein having peptide-forming activity can be obtained by causing one or more changes in the three-dimensional structure in which the following (a) to (i) are selected.
  • the three-dimensional structure of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 209 obtained by the X-ray crystal structure analysis described above is the design of a mutant protein from a protein other than the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 208. It can also be applied to production.
  • the present invention also provides a mutant protein having a peptide-forming activity similar to or higher than that of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 208 derived from such other protein.
  • the design and production of a mutated protein from a protein other than the protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 208 is performed on the three-dimensional structure of the protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 209 by a threading method. By performing alignment, the same amino acid mutation as that of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 208 is performed. As described above, the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 208 and the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 209 differ only in the three amino acid residues. Yes, it can be considered that the three-dimensional structure is almost the same.
  • the target protein for mutagenesis using the treading method is a protein other than the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 208, and is particularly preferably a protein having peptide production activity. Furthermore, it is preferable to use a protein having a known amino acid sequence.
  • the protein to be mutated preferably has a similar three-dimensional structure when the three-dimensional structure thereof is compared with the three-dimensional structure of the mutant protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 209. .
  • that the three-dimensional structure is similar means that the two-dimensional structure and three-dimensional structure of the protein are similar. Specifically, the distance between amino acid residues, the main chain and the side constituting the peptide. It means the similarity of chain angle.
  • Protein strength other than the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 208 To determine whether or not the protein has a similar three-dimensional structure as the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 209, a threading method is used. Can be used. The treading method is a known structure in a database that describes the three-dimensional structure of an amino acid sequence. This is a method for evaluating and predicting the similarity with the three-dimensional structure (Science, No. 253, pp. 164 to 170 (1991)).
  • the determination and evaluation of the similarity of the three-dimensional structure by the treading method is carried out by placing the amino acid sequence of the target protein on the three-dimensional structure of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 209 to easily obtain a secondary structure. For example, an objective function for quantifying the goodness of fit between the two can be calculated, and the results can be compared and examined.
  • the data (coordinates) of the three-dimensional structure (three-dimensional structure) of the protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 209 the data described in FIGS. 6-1 to 6-134 can be used. .
  • the treading method can be executed by a program such as INSIGHT II or LIBRA.
  • INSIGHT II can be purchased from Accelrys, USA.
  • SeqFold module you can use the SeqFold module in the program.
  • LIBRA can access and use the DDBJ website address (http: / Z www.ddbj.nig.ac.jpzsearch / libra ⁇ —j.html) using the Internet.
  • SeqFold (LIB) P—Value ⁇ SeqFold (LIB) P -Value, SeqFold (LEN) P—Value, SeqFold (LOW) P -Value, SeqFold (High) P -Value , SeqFold Total Score (raw), SeqFold Alignment Score (raw) and other various evaluation values are calculated.
  • SeqFold Total Score (bits) is a comprehensive evaluation value calculated by combining all of these evaluation values. This means that the larger the value of SeqFold Total Score (bits), the higher the similarity in the three-dimensional structure of the two proteins.
  • the protein when the trending method is performed using INSIGHT II, the protein has a three-dimensional structure similar to the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 209.
  • a threshold for judgment a value of about 90 is considered appropriate as the value of SeqFold Total Score (bits). That is, if SeqFold Total Score (bits) is 90 or more, it can be determined that the three-dimensional structure of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 209 is similar to the three-dimensional structure of another protein.
  • a more preferable threshold is 110 or more, more preferably 130 or more, and particularly preferably 150 or more in terms of SeqFold Total Score.
  • the protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 209 in the amino acid sequence of the other protein An amino acid residue corresponding to an amino acid residue present within 15A within 15A from Serl58 is identified.
  • the target amino acid residue is identified in the three-dimensional structure of the target protein and the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 209, which is obtained in the process of determining the similarity of the three-dimensional structure by the above-described trending method. Can be done by alignment.
  • the number of amino acids to be modified can be appropriately determined within a range that does not significantly impair the three-dimensional structure and activity of the mutant protein obtained depending on the position and type of amino acid residues.
  • IJ No. 209 Amino Acids IJ 67-70, 72-88, 100, 102, 103, 10 6, 107, 113—117, 130, 155—163, 165, 166, 180—188, 190—195, 200 — 235, 259, 273, 276, 278, 292—294, 296, 298, 299, 300— At least one or more amino acid residues were substituted, inserted, or deleted in the three-dimensional structure where amino acid residues corresponding to amino acid residues 304, 325-328, 330-340, and 437-447 exist.
  • the designed mutant protein preferably has a certain degree of homology with the mutant protein of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 207 in its primary sequence.
  • the degree of homology can be, for example, 25% or more, more preferably 50% or more, further preferably 80% or more, and particularly preferably 90% or more.
  • a mutant with further improved activity can be obtained by applying random mutation to several residues that are contiguous to that site in the three-dimensional structure. It is also possible to obtain.
  • a mutant protein having peptide-generating activity by changing at least a part of the position constituting the surface that is continuous with the three-dimensional structure of the amino acid residue that brings about the improvement in peptide-forming activity. It is also possible to obtain
  • the position on the steric structure of the amino acid residue that brings about the improvement in peptide-forming activity and the position constituting the continuous surface are the relevant Alignment of the protein with the three-dimensional structure of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 209 is performed by the trending method.
  • amino acid residue force S corresponding to the residue S means the position that constitutes the counter force surface (plane) in the direction of the substrate binding site (Serl 58), based on the positions where they exist.
  • a mutant protein having peptide-forming activity can be obtained by causing one or more changes selected from the following (a ′) to (r).
  • Protein having peptide-forming activity of the present invention (mutant protein based on the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 208)
  • the protein of the present invention is designed according to the design and production method described in items 2 and 3 above.
  • the mutant protein specifically, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 208 from the following mutant L1 Any one or more mutations of L335, or a mutant protein having an amino acid sequence introduced with the following mutants Ml to M642, and having peptide-forming activity (hereinafter referred to as “( ⁇ ) It is also referred to as a protein mutant protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 208).
  • the variants L1 to L335 and variants Ml to M642 are shown in Tables 2-1 to 2-19.
  • variant L1 indicates that the asparagine at the 67th amino acid residue in the sequence of SEQ ID NO: 208 was substituted with lysine.
  • variant type designation is M35-4ZV184A variant (sequence The amino acid residue type of the amino acid residue of SEQ ID NO: 208; the amino acid residue type after mutagenesis. Is the same.
  • Mutations of mutant types L1 to L335 may be introduced alone or in combination of two or more.
  • mutations of mutant types L1 to L335 one or more of them are selected as mutants other than those in Tables 2-1 to 2-7, for example, the mutants shown in Table 33 described later. May be introduced in combination with one or more.
  • combinations Ml to M642 as shown in Tables 2-8 to 2-19 above are preferable.
  • the mutant protein of the present invention has excellent peptide-forming activity. That is, it has superior performance in terms of the ability to catalyze the peptide production reaction, compared with the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 208 (M35-4ZV184 mutant protein). More specifically, the mutant proteins of the present invention each have a reaction rate or yield in producing a specific carboxy component and amino-component peptide, or substrate specificity, pH property, temperature stability, etc. The performance is improved over the protein shown in SEQ ID NO: 208 with respect to some characteristics required for carrying out the peptide-forming reaction (specifically, see the Examples below). Therefore, the mutant protein of the present invention can be suitably used in industrial production of peptides.
  • Mutant L1 to Mutant L335 and Mutant Ml to M642 are introduced by, for example, site-specific mutagenesis at a specific site of the gene encoding the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 208. It is obtained by modifying the base sequence so that an amino acid is substituted.
  • the nucleotide sequence corresponding to the mutation site in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 208 can be easily confirmed by referring to SEQ ID NO: 207.
  • the present invention there is also provided a protein substantially the same as the mutant protein containing one or more mutations shown in the mutant L1 to the mutant L335 or the mutant Ml to M642.
  • the present invention relates to a mutant protein comprising one or more of mutant L1 to mutant L335, or mutant Ml to M642, and the mutant L1 to mutant L335.
  • mutant protein having an amino acid sequence containing the peptide and having peptide-forming activity (hereinafter also referred to as “mutant protein of a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 208 of ( ⁇ )”) It is. That is, the mutant protein of the present invention allows mutations at sites other than the mutation sites of the amino acid variants L1 to L335 or variants Ml to M642 of SEQ ID NO: 208. Yes.
  • mutant L1 to mutant L335, mutant Ml to M642 mutant L1 to mutant L335, mutant Ml to M642
  • mutant L1 to mutant L335, mutant Ml to M642 The number of amino acid residues up to the N-terminal or C-terminal of the site force specified by can be different from the state before mutagenesis.
  • “several” means a range that does not greatly impair the three-dimensional structure and activity of the amino acid residue protein, although it differs depending on the position and type of the three-dimensional structure of the amino acid residue protein. Specifically, 2 to 50, preferably 2 to 30, more preferably 2 to 10. However, a mutant protein of a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 208 of ( ⁇ ) containing one or more mutations from mutant L1 to mutant L335, or mutant Ml to M642 ), More preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more.
  • Mutations other than mutant L1 to mutant L335 and mutants Ml to M642 are also replaced, deleted, or inserted at a specific site of the gene encoding this protein by, for example, site-specific mutagenesis. It can be obtained by modifying the base sequence so as to be added or reversed. A polypeptide encoded by the modified base sequence as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment. The meaning of mutation such as mutation treatment, base substitution, deletion, insertion, addition, and inversion can be carried out by the method exemplified in item 1 above. By expressing the DNA having the above mutation in an appropriate cell and examining the enzyme activity of the expression product, a DNA encoding a protein substantially identical to the protein of SEQ ID NO: 208 is obtained. It is done.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the mutant protein of the present invention. There may be multiple base sequences that define one amino acid sequence due to degeneracy of codons. That is, the polynucleotide of the present invention includes the following polynucleotides.
  • mutant protein in the amino acid sequence containing one or more mutations of any one of the mutant types 1 to 68 and mutant types 239 to 290 and 324 to 377 , Having an amino acid sequence further comprising one or several amino acid mutations selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, addition and inversion force at a site other than the mutation site, and having a peptide generating activity.
  • amino acid sequence further comprising one or several amino acid mutations selected from the group consisting of substitution, deletion, insertion, addition and inversion force at a site other than the mutation site, and having a peptide generating activity.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is encoded by the base sequence described in SEQ ID NO: 1, for example.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the protein mutant protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 208 of the present invention. There may be multiple base sequences that define one amino acid sequence due to codon degeneracy. That is, the polynucleotide of the present invention includes the following polynucleotides.
  • mutant protein in the amino acid sequence containing one or more mutations of L1 to L335 and mutant Ml to M642, substitution to a site other than the mutation site, A polynucleotide encoding a mutant protein having an amino acid sequence further comprising a mutation of one or several amino acids selected from the group consisting of deletion, insertion, addition and inversion force, and having peptide-forming activity.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 208 is encoded by the base sequence described in SEQ ID NO: 207, for example.
  • Examples of the polynucleotide substantially the same as the DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 include the following polynucleotides. Prepared from a polynucleotide encoding the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a cell having the same, from a polynucleotide having the same base sequence ability as the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the same base sequence By isolating a polynucleotide encoding a protein having a peptide-generating activity that is hybridized under stringent conditions Thus, a polynucleotide substantially identical to the polynucleotide having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is obtained.
  • a polynucleotide substantially identical to the DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 207 encodes the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 208 as in the case of the DNA shown in SEQ ID NO: 1. It can be obtained by isolating from a polynucleotide or a cell retaining the same in the same manner.
  • the present invention provides a polynucleotide shown in the following (iii) or (iv) that is substantially the same as the polynucleotide encoding the mutant protein of the present invention.
  • the present invention provides a polynucleotide shown in the following ( ⁇ ) or ( ⁇ ), which is substantially the same as the polynucleotide encoding the mutant protein of the present invention.
  • ( ⁇ ) hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of the polynucleotide ( ⁇ ) above, and the L1 force L335 and one of the mutant types Ml to M642 or A polynucleotide encoding a protein that retains two or more mutations and has peptide-generating activity.
  • ( ⁇ ′) Hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of the polynucleotide ( ⁇ ) above, and the L1 force L335, and one of mutants Ml to M642 or A polynucleotide encoding a protein that retains two or more mutations and has peptide-generating activity.
  • Probes for obtaining substantially identical polynucleotides are based on, for example, the base sequences set forth in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 207, or base sequences encoding mutant proteins. Therefore, it can be produced by a conventional method. Further, a method for isolating a target polynucleotide by picking up a polynucleotide that hybridizes with the probe using a probe may be performed according to a conventional method. For example, a DNA probe can be prepared by amplifying a base sequence cloned in a plasmid or phage vector, cutting out and extracting the base sequence to be used as a probe with a restriction enzyme. The cut-out location can be adjusted according to the target DNA.
  • stringent conditions refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • highly homologous DNAs for example, 50% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably Is a condition that DNAs having a homology of 95% or more hybridize to each other, and DNAs having lower homology to each other do not hybridize! 60 ° C, 1 X SSC that, 0. 1 0/0 SDS, or preferably ⁇ , 0. 1 X SSC, 0. 1 0/0 SDS to Ne th person to Roh at a salt concentration include Iburidizu conditions . Some of the genes that hybridize under these conditions include those with stop codons generated in the middle, and those that have lost activity due to mutations in the active center. And can be easily removed by measuring the enzyme activity of the expression product by the method described below.
  • the protein encoded by them under the conditions of 50 ° C and pH 8 above It is desirable to retain a peptide-forming activity of about half or more of the mutant protein of I), more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more.
  • the polynucleotides (i), ( ⁇ ) and ( ⁇ ) half of the mutant protein of (I) above under the conditions of the protein force encoded by them at 22 ° C and pH 8.5. It is desirable that the peptide-forming activity is maintained at a degree or higher, more preferably 80% or higher, and still more preferably 90% or higher.
  • mutant protein of (I) and the amino acid set forth in SEQ ID NO: 208 of ( ⁇ ) A mutant protein of the protein having the sequence can be obtained by modifying the proteins having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 208, respectively.
  • the protein that is the basis of the protein of the present invention will be described.
  • the mutant protein of the present invention is not limited by the origin of the protein.
  • the DNA having SEQ ID NO: 1 and the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, and the DNA having SEQ ID NO: 207 and the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 208 are Terium 'Multibolum FERM BP— 10 163 strains (denoted by the depositor for identification: 3 1 ⁇ 3 ⁇ 40 & 61 "0 ⁇ 1 multivorum AJ2458).
  • the strain with the FERM number is independent National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1st, Tsukuba 1-chome, Ibaraki, Japan, 1st, 6th, postal number 305-8566) Can receive
  • a protein of the same type as the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 208 can be isolated from Sphingobataterium sp. FERM BP-8124.
  • Sphingobata terium 'SP FERM BP-8124 strain a protein in which the leucine, which is the 439th amino acid residue in the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, is substituted with palin is isolated.
  • Sphingobacterium sp. FERM BP— 8124 strain (indication for identification given by the depositor: Sphingoba cterium sp. AJ 110003) was issued on July 22, 2002 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • the strain with the FERM number is deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center (1st, 1st, Tsukuba, Higashi, Ibaraki, Japan, 1st 6th (Zip 305-8566)). You can receive a lot by referring to the accession number.
  • the strain of Sphingobacteria 'multiborum was identified as Sphingobataterium multiborum by the following classification experiment.
  • the above strains are Neisseria gonorrhoeae (0.6-0.7 X 1.2-2. Shape, glossy, yellow, grown at 30 ° C, catalase positive, oxidase positive, OF test (glucose) negative Identified as a bacterium belonging to Furthermore, nitrate reduction negative, indole production negative, acid production from darcos acid negative, arginine dihydrolase negative, urease positive, esculin carolysis positive, gelatin hydrolysis negative, ⁇ -galactosidase positive, glucose utilization positive, L-arabinose Positive, D mannose assimilation positive, D mann-toll assimilation negative
  • the DNA consisting of the nucleotide sequence of nucleotide numbers 61 to 1917 described in SEQ ID NO: 1 is a coding sequence (CDS) portion.
  • the base sequences of base numbers 61 to 1917 include a signal sequence region and a mature protein region.
  • the signal sequence region is a region having base numbers 61 to 120
  • the mature protein region is a region having base numbers 121 to 1917.
  • the present invention provides both a peptide enzyme protein gene containing a signal sequence and a peptide enzyme protein gene as a mature protein.
  • the signal sequence contained in the sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a kind of leader sequence, and it is assumed that the main function of the leader peptide encoded in the leader sequence region is to secrete it from the cell membrane to the outside of the cell membrane. Is done.
  • the protein encoded by base numbers 121 to 1917, that is, the site excluding the leader peptide is a mature protein, and is presumed to exhibit high peptide production activity.
  • the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is obtained from a chromosomal DNA of Sphingobataterium multiborum or a DNA library by PCR (polymerase chain reaction, White, TJ et al; Trends Genet., 5, 185 (1989)) or by hybridization.
  • Primers used for PCR can be designed based on an internal amino acid sequence determined based on, for example, a purified protein having peptide-forming activity.
  • a probe for hybridization can be designed, or can be isolated using a probe.
  • the entire coding region of the protein can be amplified.
  • the 5 ′ primer is SEQ ID NO: 1.
  • the primer 3′-side primer having the base sequence in the region upstream from base number 61 include a primer having a sequence complementary to the base sequence in the region downstream from base number 1917.
  • the primer can be synthesized, for example, using a DNA synthesizer model 380B manufactured by Applied Biosystems, using the phosphoramidite method (see Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859) according to a conventional method.
  • the PCR reaction can be performed, for example, using Gene Amp PCR System 9600 (manufactured by PE RKIN ELMER) and TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit (manufactured by Takara Shuzo) according to the method specified by the supplier such as each manufacturer.
  • the transformant that expresses the mutant protein is, for example, a recombinant DNA such as an expression vector having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and mutants 1 to 68, and mutants 239 to 290 and 324.
  • a mutant protein having peptide-forming activity can be produced.
  • a transformant expressing a mutant protein of the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 208 is transformed into a recombinant DNA such as an expression vector having the base sequence shown in SEQ ID NO: 207 from the mutant L1.
  • a mutant protein having peptide-forming activity can be produced by introducing a mutation corresponding to either L335 or mutant M1 force M642, introducing the mutation into an appropriate host, and expressing it.
  • Examples of a host for expressing a mutant protein specified by the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 207 include Escherichia bacteria such as Escherichia coli, and Empedopacter. Genus Bacteria, Sphingocataterium spp.
  • Various prokaryotic cells including S. cerevisiae, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis, and Aspergillus oryzae Eukaryotic cells can be used.
  • Recombinant DNA used for introducing foreign DNA into a host is inserted into a vector corresponding to the type of host to be expressed in a form that allows expression of the protein encoded by the DNA. Can be prepared.
  • a promoter for protein expression if a gene-specific promoter that encodes the peptide-forming protein of Empedobacter brevis functions in the host cell, it can be used. . If necessary, another promoter that works in the host cell may be linked to the DNA encoding the mutant protein and expressed under the control of the promoter!
  • Transformation methods for introducing recombinant DNA into host cells include DM Morrison's method (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) or recipient cells treated with chlorinated chloride and permeation of DNA. The method (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol, 53, 159 (1970)) etc. which increase property is mentioned.
  • a form in which the protein associates in a transformant producing the protein and forms an inclusion body of the protein is also preferable.
  • Advantages of this expression production method include that the target protein is protected against digestion by proteases present in the cells, and that the target protein can be easily purified by centrifugation following cell disruption.
  • the protein inclusion bodies obtained in this way are solubilized by a protein denaturing agent, and after undergoing an activity regeneration operation mainly by removing the denaturing agent, the physiologically active protein correctly folded. Is converted to For example, there are many examples such as activity regeneration of human interleukin-2 (Japanese Patent Laid-Open No. 61-257931).
  • the mature protein region does not contain a leader sequence even if DNA encoding a precursor protein including the leader sequence is incorporated as a protein coding sequence.
  • the enzyme can be selected as appropriate depending on the production conditions, form, usage conditions, etc. of the enzyme to be prepared by incorporating only the DNA.
  • a promoter for expressing a DNA encoding a mutant protein a promoter usually used for heterologous protein production in E. coli can be used, for example, T7 promoter, lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter. Strong promoters such as lambda phage PR promoter and PL promoter.
  • the vector it is possible to use P UC19, pUC18, pBR322, pHSG299 , pHSG298, pHSG 399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 and the like.
  • phage DNA vectors can be used.
  • an expression vector containing a promoter and capable of expressing the inserted DNA sequence can also be used.
  • a gene that codes another protein is linked upstream or downstream of the mutant protein.
  • a fusion protein gene Any gene encoding such other proteins can be used as long as it increases the accumulation of the fusion protein and enhances the solubility of the fusion protein after the denaturation 'regeneration step.
  • the folate reductase gene, interferon ⁇ gene, interleukin 2 gene, prochymosin gene, and the like are listed as candidates.
  • a terminator which is a transcription termination sequence, downstream of the fusion protein gene.
  • the terminator include T7 terminator, fd phage terminator, T4 terminator, tetracycline resistance gene terminator, E. coli trpA gene terminator, and the like.
  • a vector for introducing a gene encoding a mutant protein or a fusion protein of a mutant protein with another protein into E. coli the so-called multi-copy type is preferred.
  • a plasmid having a point for example, a pUC-type plasmid, a PBR322-type plasmid, or a derivative thereof.
  • the “derivative” means one obtained by modifying a plasmid by base substitution, deletion, insertion, addition and Z or inversion.
  • the modification includes modification by mutation treatment with a mutagen, UV irradiation, or natural mutation.
  • the vector has the best ability such as an ampicillin resistance gene.
  • expression vectors having a strong promoter are commercially available (pUC system (Takara Shuzo Co., Ltd.), pPROK system (Clontech), pKK233-2 (Clontech)).
  • the mutant protein or a fusion protein of the mutant protein and another protein is expressed and produced.
  • a host to be transformed a strain usually used for expression of a heterologous gene can be used, but Escherichia coli JM109 strain of Escherichia coli K12 strain is preferred. Method of performing transformation, and methods of selecting transformants Molecular Cloning, 2 nd edition, is described in Cold Spring Harbor Press (1989) and the like.
  • a restriction protease that does not exist in the peptide-generating enzyme such as blood coagulation factor Xa or kallikrein is used as a recognition sequence. It may be possible to cut out the tide-producing enzyme.
  • the production medium a medium usually used for culturing Escherichia coli such as M9-casamino acid medium and LB medium may be used. Culture conditions and production induction conditions are appropriately selected according to the type of marker, promoter, host fungus, etc. used.
  • mutant protein or a fusion protein of a mutant protein and another protein can be recovered, then disrupted or lysed, and used as a crude enzyme solution. Furthermore, if necessary, the mutant protein or its fusion protein can be purified and used by conventional techniques such as precipitation, filtration, column chromatography, and the like. In this case, a purification method using an antibody of a mutant protein or a fusion protein can also be used.
  • a protein inclusion body When a protein inclusion body is formed, it is solubilized with a denaturing agent. Although it may be soluble together with the bacterial cell protein, it is preferable to take out the inclusion body and make it soluble after considering the subsequent purification operation.
  • a conventionally known method may be used. For example, the cells are destroyed and the inclusion bodies are collected by centrifugation or the like.
  • denaturing agents that solubilize protein inclusion bodies include guanidine hydrochloride (eg, 6M, pH 5-8) and urea (eg, 8M).
  • the dialysis solution used for the prayer may be a concentration of 20 mM to 0.5 M and a pH of 5 to 8 if Tris-HCl buffer or phosphate buffer is used.
  • the protein concentration during the regeneration step is preferably suppressed to about 500 ⁇ gZml or less.
  • the dialysis temperature is preferably 5 ° C or lower.
  • the denaturant removal method includes a dilution method, an ultrafiltration method, and the like, and regeneration of activity can be expected by using any of them.
  • the method for producing a peptide of the present invention is to produce a peptide using the mutant protein. That is, in the peptide production method of the present invention, the amine component and the carboxy component are added in the presence of at least one of the proteins shown in the following (I) and (II). React to produce peptide.
  • mutant protein in the mutant protein described in (I) above, substitution with a site other than one of the mutant types 1 to 68 and mutant types 239 to 290 and 324 to 377, or two or more mutation sites, A mutant protein having an amino acid sequence further comprising a mutation of one or several amino acids selected from the group consisting of deletion, insertion, addition and inversion force, and having peptide-forming activity.
  • a peptide in the method for producing a peptide of the present invention, can be generated using a mutant protein of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 208. That is, in the method for producing a peptide of the present invention, a peptide component is produced by reacting an amine component and a carboxy component in the presence of at least one of the following proteins ( ⁇ ) and (1 ⁇ ).
  • mutant protein in the mutant protein according to (I) above, substitution, deletion, or insertion into a site other than the one or two or more mutation sites of any one of the mutant types L1 to L335 and the mutant types Ml to M642
  • a mutant protein having an amino acid sequence further comprising a mutation of one or several amino acids selected from the group consisting of addition and inversion force, and having peptide-forming activity.
  • the mutant protein may be present in the peptide production reaction system.
  • the above mutant protein is, for example, a mixture containing (I) and Z or ( ⁇ ), or ( ⁇ ) and Z or ( ⁇ protein in a biochemically acceptable medium (hereinafter referred to as “mutant protein”). May be supplied as the inclusion “t ⁇ ⁇ )! More specifically, for example, a culture of a microorganism transformed to express the mutant protein of the present invention, separated from the culture Of microbial cells and microorganisms Use one or more selected from the group consisting of processed bacterial cells to produce an amine component, a carboxylic component and a power peptide.
  • the "mutant protein-containing product” may be a specific form as long as it contains the mutant protein of the present invention.
  • a culture of a microorganism that produces the mutant protein may be used. , Microbial cells isolated from the culture, treated cells, and the like.
  • a microbial culture is a product obtained by culturing a microorganism. More specifically, a microbial cell, a medium used for culturing the microorganism, and a substance produced by the cultured microorganism. It means a mixture.
  • the microbial cells may be washed and used as washed cells.
  • the processed bacterial cells include those obtained by crushing, lysing, and lyophilizing the bacterial cells.
  • the purified protein partially purified proteins obtained by various purification methods may be used, or immobilized proteins obtained by immobilizing these by the covalent bond method, the adsorption method, the inclusion method, etc. are used. May be.
  • immobilized proteins obtained by immobilizing these by the covalent bond method, the adsorption method, the inclusion method, etc. are used. May be.
  • some microorganisms are lysed during culturing, and in this case, the culture supernatant can also be used as a variant protein-containing substance.
  • a genetically recombinant strain expressing the mutant protein may be used, or a treated product of cells such as acetone-treated cells or freeze-dried cells. They may be used, or fixed bacterium cells or fixed bacterium cells treated by fixing them by a covalent bond method, an adsorption method, a comprehensive method or the like may be used.
  • a cultured cell In the case of using a culture, a cultured cell, a washed cell, or a cell-treated product obtained by crushing or lysing a cell, an enzyme that degrades the produced peptide without involving in the production of the peptide exists.
  • a metal protease inhibitor such as ethylenediamintetraacetic acid (EDTA).
  • the addition amount is in the range of 0. ImM to 300 mM, preferably ImM to lOOmM.
  • the mutant protein or its content, the carboxy component, and the amine component may be mixed. More specifically, the mutant protein of the present invention or the content thereof is added to a solution containing a carboxy component and an amine component and reacted. May be used, or when using a microorganism producing a mutant protein, the microorganism producing the mutant protein is cultured, and the enzyme is produced and accumulated in the microorganism or in the culture medium of the microorganism. For example, a method of adding a carboxy component and an ammine component to the culture solution may be used. The produced peptide can be recovered by a conventional method and purified as necessary.
  • microbial cells that is, microbial cells
  • they are cultured and grown in an appropriate medium according to the type of the microorganism.
  • the medium for this purpose is a normal medium containing a normal carbon source, nitrogen source, phosphorus source, sulfur source, inorganic ions, and if necessary, an organic nutrient source as long as the microorganism can grow. Good.
  • any of the above microorganisms can be used, and specifically, sugars such as glucose, fructose, maltose and amylose, alcohols such as sorbitol, ethanol and glycerol, Organic acids such as fumaric acid, citrate, acetic acid and propionic acid and salts thereof, carbohydrates such as norafine or a mixture thereof can be used.
  • sugars such as glucose, fructose, maltose and amylose
  • alcohols such as sorbitol, ethanol and glycerol
  • Organic acids such as fumaric acid, citrate, acetic acid and propionic acid and salts thereof
  • carbohydrates such as norafine or a mixture thereof
  • Nitrogen sources include ammonium salts of inorganic acids such as ammonium sulfate and ammonium chloride, ammonium salts of organic acids such as ammonium fumarate and ammonium quenate, sodium nitrate, potassium nitrate Organic nitrogen compounds such as nitrates such as peptone, yeast extract, meat extract, corn steep liquor, or mixtures thereof can be used.
  • nutrient sources used in normal media such as inorganic salts, trace metal salts, vitamins, and the like, can be used by appropriately mixing them.
  • the culture conditions There are no particular restrictions on the culture conditions.
  • the pH is 5 to 9 and the temperature is about 15 under aerobic conditions.
  • the culture should be performed for about 12 to 48 hours while appropriately limiting the pH and temperature in the range of ⁇ 55 ° C.
  • Preferable form of the peptide production method of the present invention is a method of culturing the transformed microorganism in the medium and accumulating the mutant protein in the medium and Z or microorganism. Can be mentioned. By using the transformant, a large amount of mutant protein can be easily produced in large quantities, so that peptides can be produced in large quantities and quickly. [0135]
  • the amount of the mutant protein or its content used should be an amount that exhibits the desired effect (effective amount), and this effective amount can be easily determined by a person skilled in the art by a simple preliminary experiment. For example, when using an enzyme, it is about 0.01 to 100 units (U), and when using a washed cell, it is about 0.1 to 500 gZL.
  • Any carboxy component may be used as long as it can be condensed with an amine component, which is another substrate, to produce a peptide.
  • the carboxy component include L-amino acid ester, D-amino acid ester, L-amino acid amide, D-amino acid amide, and organic acid ester having no amino group.
  • amino acid esters include non-natural amino acids corresponding to natural amino acids and amino acid esters corresponding to derivatives thereof.
  • Amino acid esters alpha - Other amino acid esters, different bonding sites of Amino groups, beta, gamma -, omega - like esters of amino acids, such as is also illustrated.
  • amino acid esters include amino acid methyl ester, ethyl ester, ⁇ -propyl ester, iso-propyl ester, n-butyl ester, iso-butyl ester, tert-butyl ester and the like.
  • any component can be used as long as it can be condensed with a carboxy component, which is another substrate, to produce a peptide.
  • the amine component include L-amino acid, C-protected L amino acid, D amino acid, C-protected D amino acid, and amine.
  • amines include non-natural amines derived from natural amines or derivatives thereof.
  • amino acids include not only natural amino acids but also non-natural amino acids or derivatives thereof.
  • amino acids such as ⁇ -, ⁇ ichi , ⁇ -, etc., which differ in the binding position of the amino group are exemplified.
  • Concentrations of the starting carboxy component and amine component are ImM to: L0M, preferably 0.05M to 2M.
  • L0M preferably 0.05M to 2M.
  • the reaction is inhibited when the concentration of the substrate is high, it can be added successively at a concentration that does not inhibit these during the reaction.
  • Peptide synthesis is possible at a reaction temperature of 0 to 60 ° C, preferably 5 to 40 ° C. Further, the peptide can be synthesized at a reaction pH of pH 6.5 to L0.5, preferably pH 7.0 to L0. It is.
  • Peptides include: a-L Asvaltylu L-Fe-Luralanin 13 Methyl ester (ie, — L— ( ⁇ — ⁇ — Methyl aspartyl) —L-phenylalanine (abbreviation: — AMP) L—End Lani Lou L Glutamine ( Ala-Gin), L-Faral L-Ferulalanin (Ala-Phe), L-Fuerarara-Lu L-methionine (Phe-Met), L Mouth Issiloo L-methionine (Leu-M et) , L-Isoguchi L-methionine (lie-Met), L-methionol L-methionine (Met-Met), L-prolyl L-methionine (Pro-Met), L-tryptophan-L-L-methio Nin (Tr
  • Tripeptides such as glycyl glycyl L ferular L methionine (GGFM), pentapeptides such as L-tyrosinole-glycyl-glycyl-L-fe-norella-norele L methionine (YGGFM) it can.
  • GGFM glycyl glycyl L ferular L methionine
  • YGGFM L-tyrosinole-glycyl-glycyl-L-fe-norella-norele L methionine
  • the method for producing a peptide of the present invention is, for example, as follows: a L-subtiltyl L ferulalanine j8-methinoreestenole (ie, a-L- (j8-0-methyl aspartyl) -L-phenylalanine (abbreviation: a-AMP A-AMP is an important intermediate for the production of a-L aspartyl-L ferro-alanine-a-methyl ester (product name: aspartame). is there.
  • the target gene encoding a protein with peptide-generating activity is amplified by PCR using the chromosome DNA of strain Sphingobata terumum FERM BP—10163 as a template and the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 5 and 6 as primers. did.
  • the amplified DNA fragment was treated with NdelZXbal, and the obtained DNA fragment was ligated with the NdelZXbal-treated product of pTrpT.
  • Escherichia coli JM109 was transformed with this ligation solution, a strain having the target plasmid was selected using ampicillin resistance as an index, and this plasmid was named pTrpT-Sm-Aet.
  • Escherichia coli JM109 carrying pTrpT-Sm-Aet is also referred to as pTrpT-Sm-AetZjM109 strain.
  • the gene of interest was amplified by PCR using the plasmid as a saddle and the oligonucleotide shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 as primers.
  • This DNA fragment was treated with EcoRl / Pst I, and the resulting DNA fragment was ligated with EcoRlZPstl-treated product of pKF18k2 (Takara Shuzo).
  • Escherichia coli JM109 was transformed with this ligation solution, a strain having the target plasmid was selected using kanamycin resistance as an indicator, and this plasmid was named pKF-Sm-Aet.
  • Escherichia coli JM109 having pKF-Sm-Aet is also referred to as pKF-Sm-AetZjM109 strain.
  • the pKF-Sm-Aet plasmid was used as a variant of the site-specific mutagenesis method using the ODA method. Mutations were introduced using Takara Shuzo (Japan) “Site Directed Mutagenesis System Mutabuper Express Kit” using primers (SEQ ID NOs: 12 to 33) corresponding to various mutant enzymes according to the manufacturer's protocol. The primer used was T4 Polynucleotide Kinase from Takara Shuzo Co., Ltd., with one end phosphorylated.
  • Primer phosphate conditions are: 100 molDN A (primer) and 10 units of T4 Polynucleotide Kinase 10 mM ATP 0.5 mM, magnesium chloride 10 mM and DTT 5 mM 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) 20 1 The mixture was added and incubated at 37 ° C for 30 minutes, and then heated at 70 ° C for 5 minutes to phosphorylate. 1 ⁇ 1 (5 pmol) of this reaction solution was used for mutagenesis PCR.
  • PCR conditions were as follows: Template ds DN A (pKF—Sm—Aet plasmid) 10 ng, Selection Primer as primer and 5, as previously shown, 5 pmol of phosphorylated Mutagenic oligonucleotide each and 40 units of LA—Ta q dD, Add dGTP and dTTP 250 ⁇ each LA— Taq buffe ⁇ ( ⁇ 8 2+ ⁇ 1 ⁇ 5) 50 / ⁇ 1 and add 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 3 minutes A PCR reaction was performed in which the cycle was repeated 25 times.
  • the Escherichia coli MV1184 strain was transformed using the obtained DNA, and a strain having the target plasmid containing the mutant Aet gene: pKF-Sm-AetM was selected using kanamycin resistance as an index.
  • the Escherichia coli MV1184 strain having pKF-Sm-AetM is also referred to as pKF-Sm-AetMZMV1184 strain.
  • pKF-Sm-AetMZMV1184 strain when pKF-Sm-AetM is shown as a specific mutant type, as in pKF-Sm-F207V, the “AetM” part may be replaced with the content of the mutant type. If two or more mutations are included, the mutant types may be separated by “Z” and listed.
  • pKF_Sm_F207V / Q441E is obtained by introducing F207V and Q441E mutations into the Aet gene carried by the pKF-Sm-Aet plasmid.
  • the target gene was amplified by PCR using the pTrpT-Sm-Aet plasmid as a saddle and the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 as primers.
  • This DNA fragment was treated with EcoRl / Pst I, and the obtained DNA fragment and pHSG298 (Takara Shuzo Co., Ltd.) treated with EcoRlZPstl were ligated.
  • Escherichia coli MV1184 was transformed with this ligation solution, a strain having the target plasmid was selected using kanamycin resistance as an indicator, and this plasmid was named pHSG-Sm-Aet.
  • the Escherichia coli MV1184 strain having pHSG-Sm-Aet is also referred to as pHSG-Sm-AetZMV1184 strain.
  • LB agar medium (lOgZl yeast extract, lOgZl peptone, 5gZl salted sodium sodium, 20gZl agar, PH7.0)
  • the cells were precultured at 30 ° C for 24 hours.
  • Each bacterial cell obtained in the pre-culture was transferred to a normal test tube containing 3 ml of LB medium (containing 0. ImM IPTG and 20 mg / l kanamycin in the above medium except agar). Then, main culture was carried out at 25 ° C and 150 reciprocating Z minutes for 20 hours.
  • Example 2 400 ⁇ l of the culture solution obtained in (4) was centrifuged to recover the bacterial cells, which contained 10 mM EDTA, 50 mM aspartic acid dimethyl ester, and lOOmM ferulalanin. The suspension was suspended in 200 L of mM borate buffer (pH 9.0) and reacted at 25 ° C for 30 minutes.
  • Table 3 shows the concentration of ⁇ -AMP produced in the wild-type enzyme-expressing strain (hereinafter referred to as the wild strain) by this reaction.
  • mutant strains For the production of dipeptides in various mutant enzyme expression strains (hereinafter referred to as mutant strains), Table 3 shows the ratio of the production concentration of the dipeptide to the wild strain.
  • Example 2 Centrifugation of 100 ⁇ 1 of the culture solution obtained in Example 2 (4) was carried out to collect the cells, and lOOmM borate buffer solution (PH9.0) containing 10 mM EDTA, lOOmM L-alanine methyl ester, 200 mM glutamine. Suspended in L and reacted at 25 ° C for 30 minutes.
  • Table 3 shows the concentrations of L-lar L-glutamine (hereinafter referred to as Ala-Gin) produced in the wild-type strain by this reaction.
  • Table 3 shows the ratio of the production concentration of dipeptide to that of the wild type.
  • Example 2 800 ⁇ l of the culture solution obtained in (4) was centrifuged to recover the bacterial cells, and 10 mM EDTA and 50 mM L-ferulalanin methyl ester hydrochloride or L-narrow isine methyl ester hydrochloride, lOOmM L —Suspended in 400 L of lOOmM borate buffer (pH 9.0) containing methionine and reacted at 25 ° C. for 20 minutes.
  • Table 3 shows the concentrations of L-pheninoreala-norre L-methionine (hereinafter referred to as Phe-Met) or L-oriental L-methionine (hereinafter referred to as Leu-Met) produced in the wild strain by this reaction.
  • Table 3 shows the ratio of the concentration of dipeptide produced with respect to the wild type for dipeptide production in various mutant strains.
  • mutant Aet the pTrpT—Sm—Aet plasmid was used as a variant of random mutagenesis using the Error prone PCR method. Mutation was performed using the “GeneMorph PCR Mutagenesis Kit” from Stratagene (USA) according to the manufacturer's protocol.
  • PCR was performed using the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 5 and 6 in the sequence listing as primers.
  • Template ds DNA (pTrp—Sm—Aet or pTrp Sm F207V 95) Add 500 ng, 125 ng of each primer, and 2.5 units of Mutazyme DNA polymerase to 50 ⁇ 1 of Mutazyme reaction buffer containing 200 ⁇ each of dATP ⁇ dCTP, dGTP, and dTTP. C for 30 seconds, 52. C for 30 seconds, 72.
  • a PCR reaction was performed in which a 2 minute cycle of C was repeated 30 times.
  • the product of the PCR reaction was treated with NdelZXbal, and the obtained DNA fragment was ligated with the NdelZXbal-treated product of pTrpT.
  • Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) was transformed by a conventional method. This was plated on LB agar medium containing 100 gZml of ampicillin to prepare a random mutagenesis library.
  • Production medium containing ampicillin 100 / z gZml of Escherichia coli JM109 strain into which plasmids (pTrpT—Sm—AetM) containing each mutant Aet gene were introduced and Escherichia coli JM109 strain into which a plasmid containing wild type Aet was introduced 2 gZl glucose, 10 g / 1 yeast extract, lOg / 1 casamino acid, 5 gZl ammonium sulfate, lg / 1 potassium dihydrogen phosphate, 3 gZl dipotassium hydrogen phosphate, 0.5 g / l magnesium sulfate heptahydrate , PH 7.5, lOOmg / 1 ampicidin
  • 150 1 (dispensed into 96-well plate) and cultured with shaking at 25 ° C for 16 hours.
  • the culture was carried out using a TITEC bioshaker (MZBR-1212 FP) with shaking at 1000
  • Example 3 Primary screening was performed using the culture solution obtained in Example 3 (9), and selection was performed as follows. First, to 5 ⁇ 1 of the obtained culture solution, 10 mM Phenol, 6 mM AP, 5 mM Asp (OMe), 7.5 mM Phe, 3.6 U / ml peroxidase, 0.16 U / ml alcho
  • the obtained culture broth (25 ⁇ l) was suspended in 500 L of lOOmM borate buffer (pH 8.5 or pH 9.0) containing 10 mM EDTA, 50 mM dimethyl ester formate, and 75 mM ferrolanine, and 20 ° C or 25 The reaction was carried out at ° C for 10 or 15 minutes, and the amount of AMP produced was measured. From the secondary screening selection strains, we performed the mutation analysis for the upper strains with improved specific activity and identified the following mutation points. From the library with the wild strain as the parent strain (type IV) From the library with mutants 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16 from the library with the F207V mutant as the parent strain Mutants with mutants 17, 18, 19, 20 were obtained.
  • the concentration of AMP produced in the wild type strain by the above reaction is shown in Table 4 (reaction time 10 minutes), and the concentration of AMP produced in the F207 V mutant strain is shown in Table 5 (reaction time 15 minutes).
  • Tables 4 and 5 show the ratio of dipeptide production concentration to the parent strain for dipeptide production in various mutant strains. Other conditions for the AMP production reaction were the same as in Example 2 (5) above.
  • Example 3 (12) The mutation point obtained in Example 3 (12) was combined with the already constructed pKF_Sm—F207VZQ441E to construct a triple mutant. Mutagenesis is pKF_Sm_F207V / Q44
  • Example 2 This was carried out in the same manner as in Example 2 (2) using IE, and introduced using primers corresponding to various mutant enzymes (SEQ ID NOs: 34 to 44 and 77 in the sequence listing). Obtained stock and existing structure The established strain was cultured in the same manner as in Example 2 (4).
  • Example 4 Centrifugation of 500 ⁇ l of the culture solution obtained in Example 4 (14) was carried out to collect the cells, and 100 mM borate buffer (pH 8.5 or 10 mM EDTA, 50 mM aspartic acid dimethyl ester, lOOmM ferulalanin) Suspended at pH 9.0 (500 / z L) and reacted at 25 ° C for 30 minutes.
  • Table 6 shows the concentration of AMP produced in the wild type strain by this reaction.
  • Table 6 shows the ratio of the production concentration of dipeptides to the wild type.
  • Example 4 Centrifugation of 100 ⁇ 1 of the culture solution obtained in Example 4 (14) was carried out to recover the bacterial cells, and an lOOmM borate buffer solution (PH8.5 or pH9 containing 10 mM EDTA, lOOmM L-alanine methyl ester, 200 mM glutamine) 0) Suspended in 1000 L and reacted at 25 ° C for 10 minutes.
  • Table 6 shows the concentration of Ala-Gin produced in the wild type strain by this reaction.
  • Table 6 shows the ratio of dipeptide production concentration to the wild type.
  • Example 4 Centrifugation of 800 ⁇ 1 of the culture solution obtained in Example 4 (14) was carried out to recover the bacterial cells, and 10 mM EDTA and 50 mM L-ferulalanine methyl ester hydrochloride or L-narrow isine methyl ester hydrochloride, lOOmM L —400 U of lOOmM borate buffer solution (pH 8.5 or pH 9.0) containing methionine was reacted at 25 ° C. for 20 minutes.
  • Table 6 shows the concentrations of Phe-Met and Leu-Met produced in the wild strain by this reaction.
  • Table 6 shows the ratio of the production concentration of dipeptides to the wild type.
  • the pHSG-Sm__Aet plasmid was used as a variant of the random mutagenesis method using the Error prone PCR method. Mutation was performed using “GeneMorph PCR Mutagenesis Kit” from Stratagene (USA) according to the manufacturer's protocol.
  • PCR was performed using the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 in the sequence listing as primers. PCR conditions are as follows: Template ds DNA (pHSG—Sm—Aet plasmid) 100 ng, primers 1, 2 (see SEQ ID NOs: 3 and 4) each 1.25 pmol and Mutazyme DNA polymerase 2.5 units dATP ⁇ dCTP, dGTP, dTTP Add to Mutazy me reaction buffer 1 containing 200 M each, heat at 95 ° C for 30 seconds, repeat cycle of 95 ° C for 30 seconds, 52 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 2 minutes 25 times Reaction was performed.
  • Random mutagenesis library was prepared by plating on 10gZl of zamino acid and 15gZD agar. At that time, in order to simplify the subsequent screening, it was applied so that there were about 100 pieces per plate.
  • the above ⁇ 5 * M9 '' is Na HPO 7 ⁇ O 64g / L
  • the Phe-pNA hydrolysis activity of each transformant was examined.
  • the transformant growth plate prepared in Example 5 (18) was overlaid with 5 ml of the reaction solution (10 mM Phe—pNA, 10 mM OPT, 20 mM Tris—HCl (pH 8.2), 0.8% agar), Phe —
  • the color development of pNA caused by the hydrolysis of pNA was examined (the cells were colored yellow due to the release of pNA). Colonies showing strong color development were selected as strains with increased activity.
  • the selected strain was cultured on LB agar medium at 30 ° C for 24 hours.
  • Each microbial cell was inoculated into a standard test tube containing 3 ml of LB medium (containing 0. ImM IPTG and 50 mg Zl chloramphenicol in a medium excluding agar from the above medium) at 25 ° C.
  • the main culture was performed at 150 round-trip Z minutes for 20 hours.
  • Culture broth 400 1 obtained in Example 5 (20) was collected and 10 mM EDTA and 50 mM were collected.
  • the culture broth 800 / zl obtained in Example 5 (20) was centrifuged to recover the bacterial cells, and 10 mM EDTA and 2 Suspend in lOOmM borate buffer solution (pH 9.0) containing 5 mM L phenylalanine methyl ester hydrochloride or leucine methyl ester hydrochloride, 50 mM L-methionine, and react at 25 ° C for 20 minutes It was.
  • Table 7 shows the concentration of Phe-Met or Leu-Met produced in the wild strain by this reaction.
  • Table 7 shows the ratio of the production concentration of dipeptides to the wild type.
  • an expression plasmid was constructed in which a mature promoter gene derived from Sphingopacterium was linked downstream of the modified promoter of enteropacter aerogenes acid phosphatase and the signal sequence.
  • pTrpT-Sm-Aet plasmid (Example 1) as cage type, Esp-S1 (5'-CCG TAA GGA GGA ATG TAG ATG AAA AAT ACA ATT TCG TGC C; SEQ ID NO: 121) and S-AS1 as primers (5,-GGC TGC AGT TTG CGG GAT GGA AGG CCG GC; SEQ ID NO: 122) Oligonucleotide 0.4 mM and KOD plus buffer (TOYOBO), dATP, dCTP, dGTP, dTTP 0.2 mM, sulfuric acid
  • Magnesium lmM and KOD plus polymerase (manufactured by TOYOBO) 50 1 reaction solution containing 1 unit, after heat treatment at 94 ° C for 30 seconds, 94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 68 PCR was repeated 25 ° C for 2 minutes and 30 seconds, and the peptide-forming enzyme gene portion was
  • PEAP130 plasmid see Reference Example 1 below. Related patent application; Application 2004- 83481
  • E- Sl (5,-CCT CTA GAA TTT TTT CA A TGT GAT TT; SEQ ID NO: 123)
  • Esp-ASl (5'-GCA GGA AAT TGT A TT TTT CAT CTA CAT TCC TCC TTA CGG TGT TAT; SEQ ID NO: 124)
  • PCR was performed using the oligonucleotide under the same conditions to amplify the acid phosphatase promoter and signal sequence.
  • the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, and each amplified DNA fragment was recovered using a Microspin column (manufactured by Amersham-Fanoremacia Biotech).
  • the amplified fragment mixture was shaped into a bowl, using E-S1 and S-AS1 oligonucleotides as primers, and 94 ° C for 15 seconds and 55 ° C for 30 seconds in a reaction solution having the same composition.
  • PCR was performed by repeating a cycle of 68 ° C for 2 minutes and 30 seconds 25 times to construct a chimeric enzyme gene.
  • Each amplified DNA fragment was recovered using a Microspin column (manufactured by Amersham, Pharmacia Biotech) and digested with Xba I and Pst I. This was ligated to the Xba I—Pst I site of the pUC 18 plasmid.
  • DNA Sequencing kit Dye Terminator Determines the nucleotide sequence using the 310 Genetic analyzer (ABI) by the Dye Terminator method using Cyle Sequencing Ready Reaction (manufactured by PERKIN ELMER) and confirms that the target gene has been introduced. sure, this plasmid was designated as P SF- Sm- Aet plasmid.
  • pSF—Sm—Aet was used as a variant of site-directed mutagenesis using PCR.
  • For mutation use the “Quik change Site- Dirted Mutagenesis Kit” of Stmtagene (America) and respond to various mutant enzymes according to the manufacturer's protocol. It introduced using the primer (sequence number 45-78).
  • the product of the PCR reaction was used to transform Escherichia coli JM109, and a strain having the target plasmid was selected using ampicillin resistance as an index.
  • the Escherichia coli JM109 strain having pSF-Sm-Aet is also referred to as pSF-Sm-AetZjM109 strain.
  • Example 6 Various mutant strains obtained in Example 6 (24) were pre-cultured on LB agar medium at 25 ° C for 16 hours. Ordinary test with various enzyme expression strains in 2ml terrific medium (12gZl tryptone, 24gZl yeast extract, 2.3g Zl potassium dihydrogen phosphate, 12.5gZl dipotassium hydrogen phosphate, 4gZl glycerol, 10OmgZl ampicillin) One platinum ear was inoculated into the tube, and main culture was performed at 25 ° C, 150 round-trip Z minutes for 18 hours.
  • 2ml terrific medium (12gZl tryptone, 24gZl yeast extract, 2.3g Zl potassium dihydrogen phosphate, 12.5gZl dipotassium hydrogen phosphate, 4gZl glycerol, 10OmgZl ampicillin
  • the above culture broth 251 was mixed with 10 mM EDTA and 25 mM L-ferro-aminomethyl ester hydrochloride or L-mouth icin methyl ester hydrochloride, 50 mM L-methionine-containing lOO mM borate buffer solution (pH 8.5 or pH 9). 0) 500 [Suspension, 25 0 C [trowel 15 minutes].
  • Table 8 shows the concentration of Phe-Met or Leu-Met produced in the wild strain by this reaction.
  • Table 8 shows the ratio of dipeptide production concentration to wild strains.
  • PSF—Sm_Aet was used as a variant of site-directed mutagenesis using PCR to construct strains that combine various mutations.
  • PCR conditions were 50 ng Template ds DNA (pSF_Sm-one Aet plasmid), 50–100 ng each of the 5′-phosphorylated Mutagenic oligonucleotides shown above as primers (100 ng for up to 3 primers combined, 4 For more than 50 types, use 50 ng Add), Quik solution 0. 375 ⁇ 1 and Quik change Multi enzyme blend 1.25 units to Quik change Multi reaction buffer 12.5 / zl containing dNTP Mix 0.5 1 and 95. C for 1 minute, 53.5. C for 1 minute, 65. A PCR reaction was performed in which a 10 minute cycle of C was repeated 30 times.
  • Escherichia coli JM109 strain was transformed with the reaction mixture 21 containing 5 units of Dpnl added to the PCR product (total amount 12.5 ⁇ 1) and treated at 37 ° C for 1 hour.
  • the transformed cells were plated on LB medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin to obtain a random combination strain library as an ampicillin resistant strain.
  • Escherichia coli JM109 introduced with a plasmid (pSF—Sm—AetM) containing each mutant Aet gene and Escherichia coli JM109 introduced with a plasmid containing wild type Aet were produced in a production medium 150 1 (100 ⁇ g Zml of ampicillin). Inoculated into a 96-well plate) and cultured with shaking at 25 ° C for 16 hours. The culture was carried out using a TITEC bioshaker (MZBR-1212FP) with shaking at 1000 rpm. Using the obtained culture broth, screening was performed for selection.
  • a production medium 150 1 100 ⁇ g Zml of ampicillin
  • the obtained bacterial solution 5 1 was mixed with 10 mM Phenol, 6 mM AP, 5 mM Asp (OMe), 7.5
  • the selected strain is cultured by the method described in Example 6 (25), and the culture broth 10 1 or 50 1 contains 10 mM EDTA, 50 mM Asp (0 Me) and 75 mM Phe. lOOmM borate buffer (pH 8.5) suspended in 1 ml, 20.
  • the reaction was carried out at 25 ° C for 10 minutes, the amount of AMP produced was measured, and a strain with a large amount produced was selected. The selected strain identified the combination of mutation points by sequence. Table 9 shows the acquired strains and the primer combinations used to acquire them. Table 9]
  • the combination strain obtained above was evaluated.
  • the above culture broth 251 contains lOmM EDTA, 50 mM aspartic acid dimethyl ester, 75 mM ferulanine It was suspended in lOOmM borate buffer (pH 8.5) 500 / z L and reacted at 20 ° C for 15 minutes.
  • Table 10 shows the concentration of AMP produced in the wild strain by this reaction.
  • the production of dipeptides when the specific activity of the wild strain is set to 1 * strain.
  • Table 10 shows the ratio of the specific activity to the active ratio to the ratio of the Ikuno ratio.
  • Example 6 Culture broth 25 ⁇ 1 cultured by the method described in (25) was mixed with 25 mM L-amino acid methyl ester hydrochloride (X—OMe′HCl), 50 mM L-methionine, 10 mM EDTA shown in Table 11. In addition to 500 1 boric acid buffer ( ⁇ 8.5) containing, the mixture was reacted at 25 ° C for 15 minutes for 3 hours. Table 11 1 and Table 112 show the production amounts of various peptides produced by this reaction in the wild strain.
  • the dipeptides marked with + are those in which the HPLC area value of 8000 is assumed to be lmg / L, and the reference value of the expected peak is shown as the production volume.
  • the ratio of the production concentration of dipeptide to the wild strain is shown in Table 11 1 and Table 112.
  • the obtained bacterial solution 5 1 was added to 10 mM Phenol, 6 mM AP, 5 mM Asp (OMe), 5 mM.
  • Example 9 The strains selected in Example 9 (36) and (37) were cultured in the same manner as in Example 6 (25), and the culture broth 501 was mixed with lOmM EDTA, 50 mM Asp (OMe), 50 mM Ala.
  • the reaction was performed at 0 ° C for 10 minutes, the AMP production yield was measured, and the strain with high yield was selected. Mutant 21 was selected as an effective mutation point.
  • the mutation point V184A obtained in (Example 9) was introduced into pSF-Sm-Aet. It was also introduced into the existing pSF-Sm-M35-4. A V184 X strain was also constructed in which V184 was replaced with another amino acid. Mutagenesis is carried out by the same method as in (2), and pSF-Sm-Aet or pSF-Sm-M35-4 is used for the saddle type, and primers corresponding to various mutant enzymes (SEQ ID NO: 79 ⁇ 98). The obtained strain was cultured by the method described in Example 6 (25).
  • Example 6 A culture broth 25 ⁇ 1 cultured by the method described in (24) was added to an lOO mM borate buffer solution ( ⁇ 8.5 or pH 9.0) containing 10 mM EDTA, 5 OmM aspartic acid dimethyl ester, 75 mM ferro-alanine. It was suspended in 500 and reacted at 20 ° C for 10 minutes.
  • Table 12 shows the concentration of AMP produced in the wild strain by this reaction.
  • Table 12 shows the ratio of dipeptide production concentration to the wild strain.
  • the culture broth cultured by the method described in Example 6 (25) was suspended in lOOmM borate buffer (PH8.5 or pH9.0) containing 10 mM EDTA, 50 mM aspartic acid dimethyl ester, 75 mM phenylalanin (PH8.5 or pH 9.0). 2. The reaction was performed at 20 ° C, 2UZml reaction solution. Table 13 shows the yields of AMP produced by this reaction for wild strains and various mutant strains.
  • the product was quantified by the following high performance liquid chromatography.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

　本発明は、優れたペプチド生成タンパク質、および効率の良いペプチドの製造方法等を提供することを課題とする。 　すなわち、下記（Ｉ）および（II）に示すタンパク質のうち少なくとも一方の存在下で、アミン成分とカルボキシ成分とを反応させてペプチドを生成させるものである。 （Ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対し変異型１から６８、変異型２３９から２９０、および３２４から３７７のうちのいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質 （II）配列番号２０８に記載のアミノ酸配列に対し変異型Ｌ１からＬ３３５およびＭ１からＭ６４２のうちのいずれか１種または２種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質

Description

明 細 書
ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質
技術分野
[0001] 本発明は、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質に関し、より詳しくは、優れ たペプチド生成活性を有する変異型タンパク質およびこのタンパク質を用いたぺプ チドの製造方法等に関する。
背景技術
[0002] ペプチドは、医薬品、食品等のさまざまな分野で利用されている。例えば、 L—ァラ -ル— L—グルタミンは L -グルタミンに比べ安定かつ水溶性も高 ヽことから、輸液や 無血清培地の成分として広く用いられて！/ヽる。
[0003] ペプチドの製造法としては従来力 化学合成法が知られている力 その製造法は 必ずしも簡便さ、効率性の点で満足の!/、くものではなかった。
他方、酵素を用いたペプチドの製造方法も開発されてきた (例えば特許文献 1、 2な ど)。し力しながら、従来の酵素を用いたペプチドの製造方法では、ペプチド生成速 度が極めて遅!、、ペプチド生成収率が低!、などの点で改善の余地が残されるもので あった。このような背景の下、これらペプチドの工業的にも効率の良い製造法の開発 が望まれていた。
[0004] 本発明者らは、既にペプチド生成活性に優れた酵素としてスフインゴバタテリゥムに 由来する酵素を見出して 、る (特許文献 3— 6)。
[0005] 特許文献 1：欧州特許出願公開第 278787号明細書
特許文献 2：欧州特許第 359399号明細書
特許文献 3：国際公開第 2004Z011653号パンフレット
特許文献 4：特開 2005 - 040037号公報
特許文献 5 :特開 2005— 058212号公報
特許文献 6：特開 2005— 168405号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0006] 本発明は、より優れたペプチド生成タンパク質、および効率の良いペプチドの製造 方法等を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは鋭意研究の結果、スフインゴパクテリゥム属に属する細菌に由来する ペプチド生成活性を有するタンパク質のアミノ酸配列または塩基配列の特定部位を 改変させることにより、さらにペプチド生成活性に優れたタンパク質が得られることを 見出し本発明を完成させた。すなわち、本発明は、下記タンパク質およびこのタンパ ク質を用いたペプチドの製造方法等を提供するものである。
[0008] 〔1〕配列番号 2に記載のアミノ酸配列に対し下記変異型 1から 68のいずれか 1種また は 2種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質。
変異型 1 F207V、変異型 2 Q441E、変異型 3 K83A、変異型 4 A301V、変異 型 5 V257I、変異型 6 A537G、変異型 7 A324V、変異型 8 N607K、変異型 9
D313E、変異型 10 Q229H、変異型 11 M208A、変異型 12 E551K、変異 型 13 F207H、変異型 14 T72A、変異型 15 A137S、変異型 16 L439V、変 異型 17 G226S、変異型 18 D619E、変異型 19 Y339H、変異型 20 W327G 、変異型 21 V184A、変異型 22 V184C、変異型 23 V184G、変異型 24 V18 41、変異型 25 V184L、変異型 26 V184M、変異型 27 V184P、変異型 28 VI 84S、変異型 29 V184T、変異型 30 Q441K、変異型 31 N K、変異型 32 D203N、変異型 33 D203S、変異型 34 F207A、変異型 35 F207S、変異型 3
6 Q441N、変異型 37 F207T、変異型 38 F207I、変異型 39 T210K、変異型 40 W187A、変異型 41 S209A、変異型 42 F211A、変異型 43 F211V、変異 型 44 V257A、変異型 45 V257G、変異型 46 V257H、変異型 47 V257M, 変異型 48 V257N、変異型 49 V257Q、変異型 50 V257S、変異型 51 V257 T、変異型 52 V257W、変異型 53 V257Y、変異型 54 K47G、変異型 55 K47 E、変異型 56 N442F、変異型 57 N607R、変異型 58 P214T、変異型 59 Q2 02E、変異型 60 Y494F、変異型 61 R117A、変異型 62 F207G、変異型 63 S209D、変異型 64 S209G、変異型 65 Q441D、変異型 66 R445D、変異型 6
7 R445F、変異型 68 N442D。 〔2〕 上記〔1〕に記載の変異型タンパク質において、前記変異型 1から 68のいずれ 力 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異部位以外の部位に置換、 欠失、挿入、付加および逆位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異 を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク 質。
〔3〕 少なくとも変異型 2を含むことを特徴とする、上記〔1〕または〔2〕に記載の変異 型タンパク質。
〔4〕 少なくとも変異型 14を含むことを特徴とする、上記〔1〕から〔3〕のいずれかに記 載の変異型タンパク質。
[5] 配列番号 2に記載のアミノ酸配列に対し下記変異型 239から 290、および 324 から 377のうちのいずれか 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変 異型タンパク質。
変異型 239 F207V/Q441E
変異型 240 F207V/K83A
変異型 241 F207V/E551K
変異型 242 K83A/Q441E
変異型 243 M208A/E551K
変異型 244 V257I/Q441E
変異型 245 V257I/A537G
変異型 246 F207V/S209A
変異型 247 K83A/S209A
変異型 248 K83A/F207V/Q441E
変異型 249 L439V/F207V/Q441E
変異型 250 A537G/F207V/Q441E
変異型 251 A301V/F207V/Q441E
変異型 252 G226S/F207V/Q441E
変異型 253 V257I/F207V/Q441E
変異型 254 D619E/F207V/Q441E 変異型 255 Y339H/F207V/Q441E
変異型 256 N607K/F207V/Q441E
変異型 257 A324V/F207V/Q441E
変異型 258 Q229H/F207V/Q441E
変異型 259 W327G/F207V/Q441E
変異型 260 A301V/L439V/A537G/N607K
G/N607K
K
変異型 263 Q229H/A301V/A324V/Q441E/A537G/N607K G/N607K 変異型 266 T72A/A137S/A301V/Q441E/A537G/N607K
/N607K
/A537G/N607K
変異型 269 T72A/ Q229H/V2571/ A301 V/D313E/ A324 V/L439 V/Q441E/A537G/N607K
変異型 270 T72A/ Q229H/V257I/A301V/D313E/A324V/Q441 E/A537G/N607K
/N607K /vu/ O ooszosooifcld/-0900iAV 9
\ § ΉN \\。^o^ wv Ή N
\\。^o^ wv Ή N
\\。^o^ wv Ή N
\\。^ο^ wv Ή Ν
\\。^ο^ wv Ή Ν
Figure imgf000007_0001
\\。^o^ wv Ή N
\\。^ο^ wv Ή Ν
\\。^ο^ wv Ή Ν /L439V/Q441E/A537G/N607K
変異型 288
Figure imgf000008_0001
/L439V/Q441E/A537G/N607K
変異型 289
Figure imgf000008_0002
/L439V/Q441E/A537G/N607K
変異型 290
Figure imgf000008_0003
/L439V/Q441E/A537G/N607K
変異型 324 V184A/V257Y
変異型 325 V184A/W187A
変異型 326 V184A/N442D
変異型 327 V184P/N442D
変異型 328 V184A/N442D/L439V
変異型 329 A301V/L439V/A537G/N607K/V184A 変異型 330 A301V/L439V/A537G/N607K/V184P 変異型 331 A301V/L439V/A537G/N607K/V257Y 変異型 332 A301V/L439V/A537G/N607K/W187A 変異型 333 A301V/L439V/A537G/N607K/F211A 変異型 334 A301 V/L439 V/A537G/N607K/Q441 E 変異型 335 A301V/L439V/A537G/N607K/N442D 変異型 336 A301V/L439V/A537G/N607K/V184A/F207V 変異型 337 A301V/L439V/A537G/N607K/V184A/A182G
/A537G/N607K/V184A/N442D
/A537G/N607K/V184A/N442D/T185F
/Q441E/A537G/N607K/V184A/K83A
Figure imgf000009_0001
IZ9SA/d6SSb/SZSIV/VSZ 99ε薩
PVS9S1/V^8IA/¾Z09N/OZS9V/ 3 Z
Figure imgf000009_0002
i 9SA/d6ssb/s sxv/vs 9ε薩
H^ISd/V^8IA/¾ 09N/O S9V/ai^b/ S9^V/V^8IA/¾ 09N/O S9V/ai^b/ VSISA/V^8IA/¾ 09N/O S9V/ai^b/ I^8ra/V^8IA/¾ 09N/O S9V/ai^b/ H9ISS/V^8IA/¾ 09N/O S9V/ai^b/
J991/V^8IA/¾ 09N/O S9V/ai^b/ A9I9V/V^8IA/¾Z09N/OZS9V/ai^b/ H^IS¾/V^8IA/¾ 09N/O S9V/ai^b/ OS8IV/V^8IA/¾ 09N/O S9V/ai^b/ V98I /V^8IA/¾ 09N/O S9V/ai^b/ O8 IA/V^8IA/¾ 09N/O S9V/ai^b/ VI IS J/V^8IA/¾ 09N/O S9V/ai^b/ V 8I /V^8IA/¾ 09N/O S9V/ai^b/
00l7CZ0/S00Zdf/X3d L 9817S.0/900Z OAV /Q441E/A537G/N607K/V184A/P 183 A
/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185K
/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185D
/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185C
/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185S
/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185F
/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185P
/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185N
Figure imgf000010_0001
変異型 365 T72A/A137S/Q229P/V257I /A301V/A324V/L439V 変異型 366 T72A/A137S/Q229P/V257I /A301V/A324V/L439V
Figure imgf000010_0002
P214H/L263M/Y328F
変異型 368 T72A/A137S/Q229P/V257I /A301V/A324V/L439V P214H/L263M/Y328F
Figure imgf000011_0001
T210L/L263M/Y328F
変異型 370 A301 V/L439 V/A537G/N607K/Q441K
変異型 371
Figure imgf000011_0002
/Q441E/A537G/N607K/V184A/I157L
変異型 372
Figure imgf000011_0003
/Q441E/A537G/N607K/V184A/G161A
変異型 373
Figure imgf000011_0004
/Q441E/A537G/N607K/V184A/Y328F
変異型 374 F207V/G226S
変異型 375 F207V/W327G
変異型 376 F207V/Y339H
変異型 377 F207V/D619E
〔6〕 上記〔5〕に記載の変異型タンパク質にお 、て、前記変異型 239から 290、およ び 324から 377のうちのいずれ力 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列中、 変異部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位力 なる群より選ばれる 1 または数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活 性を有する、変異型タンパク質。
〔7〕 少なくとも変異型 260を含むことを特徴とする、上記〔5〕または〔6〕に記載の変 異型タンパク質。
〔8〕 少なくとも変異型 286を含むことを特徴とする、上記〔5〕から〔7〕のいずれかに 記載の変異型タンパク質。
〔9〕 上記〔1〕〜〔8〕の 、ずれかに記載の変異型タンパク質が有するアミノ酸配列を コードするポリヌクレオチド。
〔10〕 上記〔9〕に記載のポリヌクレオチドを含む組換えポリヌクレオチド。 〔1 1〕 上記〔10〕に記載の組換えポリヌクレオチドを含む形質転換微生物。
〔12〕 上記〔1 1〕に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および Zまた は微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させることを特徴とする、変異型タンパク 質の製造方法。
〔13〕 上記〔1〕から〔8〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、ぺ プチド生成反応を行うことを特徴とする、ペプチドの製造方法。
〔14〕 上記〔1 1〕に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および Zまた は形質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させてペプチド生成反応を行う ことを特徴とする、ペプチドの製造方法。
〔15〕 上記〔1〕から〔8〕のいずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、 L —ァスパラギン酸一 α , β—ジエステルと L フエ-ルァラニンとの反応を行うことを 特徴とする、 a Lーァスバルチルー L フエ-ルァラニン 13 エステルの製造方 法。
〔16〕 上記〔1 1〕に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および Zまた は形質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させて、 L—ァスパラギン酸— a , j8—ジエステルと L フエ-ルァラニンとの反応を行うことを特徴とする、 a— L— ァスバルチルー L—フエ-ルァラニン β エステルの製造方法。
〔 17] 配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を X線結晶構造解析 して得られた立体構造を基にして、当該タンパク質の基質結合部位を推定し、基質 結合部位に位置するアミノ酸残基の置換、挿入または削除をすることによりペプチド 生成活性を有する変異型タンパク質を設計'作製する方法。
〔18〕 配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、 当該配列中 67— 70、 72 - 88, 100、 102、 103、 106、 107、 1 13— 1 17、 130、 1
55— 163、 165、 166、 180—188、 190—195、 200— 235、 259、 273、 276、 27
8、 292— 294、 296、 298、 299、 300— 304、 325— 328、 330— 340、及び 437
—447のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿 入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
〔19〕 ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タン パク質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質との 3次元構造とが 、トレッデイング法による判定の結果類似しており、該判定の際に得られるァラインメ ン卜【こお ヽて、酉己歹 [J番号 209【こ記載のアミノ酸酉己歹 [J中 67— 70、 72— 88、 100、 102 、 103、 106、 107、 113— 117、 130、 155— 163、 165、 166、 180—188、 190— 195、 200— 235、 259、 273、 276、 278、 292— 294、 296、 298、 299、 300— 3 04、 325— 328、 330— 340、及び 437— 447のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残 基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入 または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
〔20〕 ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タン パク質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の一次配列とのァラ インメントもしくは当該タンパク質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタン パク質の 3次元構造とのアラインメントを行なったときに、一次配列の相同性が 25% 以上であるものにおいて、配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 67— 70、 72- 8 8、 100、 102、 103、 106、 107、 113— 117、 130、 155— 163、 165、 166、 180 — 188、 190—195、 200— 235、 259、 273、 276、 278、 292— 294、 296、 298、 299、 300— 304、 325— 328、 330— 340及び 437— 447のアミノ酸残基に対応す るアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基が 置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。 〔21〕 配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造において 、以下の（a)〜 (i)の中力 選ばれる 1または 2以上の立体構造の変化が生じており、 かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
(a)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 79— 82のアミノ酸残基が存在する位置の 少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(b)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 84、 88、 89及び 92のアミノ酸残基が存在 する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(c)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 72、 75及び 77のアミノ酸残基が存在する 位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(d)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 159、 161、 162、 184、 187及び 276の アミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または 削除
(e)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 70、 106、 113、 115、 193、 207、 209- 212、 216及び 259のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残 基の置換、挿入または削除
(f)配列番号 208に記載のア 酸配列中 200、 202— 205、 207及び 228のア 酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(g)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 233、 234、及び 439のアミノ酸残基が存 在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(h)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 328、 339、 340、 445、及び 446のァミノ 酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(i)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 87、 155、 157、及び 160のアミノ酸残基 が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
[22] ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タン パク質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質との 3次元構造とが 、トレッデイング法による判定の結果類似しており、かつ、該判定の際に得られるァラ インメントにお 、て、以下の（ ）〜（ ）の中力 選ばれる 1または 2以上の変化が生 じている、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 79— 82のアミノ酸残基に対応するアミ ノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換 、挿入または削除
( ）配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 84、 88、 89及び 92のアミノ酸残基に 対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のァミノ 酸残基の置換、挿入または削除
( ）配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 72、 75及び 77のアミノ酸残基に対応 するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残 基の置換、挿入または削除
( 配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 159、 161、 162、 184、 187及び 276 のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくと も一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(e 配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 70、 106、 113、 115、 193、 207、 20 9— 212、 216及び 259のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立 体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(Γ)配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 200、 202— 205、 207、及び 228のァ ミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一 以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(g 酉己歹 U番号 209【こ記載の ミノ酸酉己歹 U中、 233、 234、及び 439の ミノ酸残基【こ 対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち少なくとも一以上のアミノ酸 残基の置換、挿入または削除
( ）配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 328、 339、 340、 445、及び 446のァ ミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一 以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(i')配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 87、 155、 157、及び 160のアミノ酸残 基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のァ ミノ酸残基の置換、挿入または削除
〔23〕 ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タン パク質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の一次配列とのァラ インメントもしくは当該タンパク質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタン パク質の 3次元構造とのアラインメントを行ったときに、一次配列の相同性が 25%以 上であるものにぉ 、て、以下の（a")〜（i~)の中力も選ばれる 1または 2以上の変化 が生じており、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
(a' ' )配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 79— 82のアミノ酸残基に対応するァ ミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置 換、挿入または削除
(b~)配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 84、 88、 89及び 92のアミノ酸残基に 対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のァミノ 酸残基の置換、挿入または削除
( 配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 72、 75及び 77のアミノ酸残基に対応 するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残 基の置換、挿入または削除
(dつ配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 159、 161、 162、 184、 187及び 27 6のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なく とも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(eつ配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 70、 106、 113、 115、 193、 207、 20 9— 212、 216及び 259のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立 体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(ΓΊ配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 200、 202— 205、 207、及び 228の アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも 一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(g~)配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 233、 234、及び 439のアミノ酸残基 に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち少なくとも一以上のァミノ 酸残基の置換、挿入または削除
(hつ配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 328、 339、 340、 445、及び 446の アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも 一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(门配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 87、 155、 157、及び 160のアミノ酸残 基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のァ ミノ酸残基の置換、挿入または削除
〔24〕 配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、 当該配列中 67、 69, 70、 72- 85, 103、 106、 107、 113— 116、 165, 182, 183 、 185、 187、 188、 190、 200、 202、 204— 206、 209— 211、 213— 235、 301、 328、 338— 340、 440—442、及び 446のアミノ酸残基力 S存在する位置の少なくと も一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有 する変異型タンパク質。 〔25〕 配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、 当該配列中 67、 69, 70、 72 - 84, 106、 107、 114、 116、 183, 185, 187, 188
、 202、 204— 206、 209、 211、 213— 233、 235、 328、 338—442、及び 446の アミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または 削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
〔26〕 配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、 当該配列中 67、 70、 72 - 75, 77— 79、 81 - 84, 114、 116、 185, 188, 202, 2
04、 206、 209、 211、 213— 215、 218— 224、 226— 233、 235、 328、 338—44
1、及び 446のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置 換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
[27] 配列番号 208に記載のアミノ酸配列に対し下記変異型 L1から L335のいず れカ 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質。 変異型 LI N67K
変異型 L2 N67L
変異型 L3 N67S
変異型 L4 T69I
変異型 L5 T69M
変異型 L6 T69Q
変異型 L7 T69R
変異型 L8 T69V
変異型 L9 P70G
変異型 L10 P70N
変異型 Ll l P70S
変異型 L 12 P70T
変異型 L 13 P70V
変異型 L14 A72C
変異型 L15 A72D
変異型 L 16 A72E 変異型 LI 7 A72I 変異型 LI 8 A72L 変異型 LI 9 A72M 変異型 L20 A72N 変異型 L21 A72Q 変異型 L22 A72S 変異型 L23 A72V 変異型 L24 V73A 変異型 L25 V73I 変異型 L26 V73L 変異型 L27 V73M 変異型 L28 V73N 変異型 L29 V73S 変異型 L30 V73T 変異型 L31 S74A 変異型 L32 S74F 変異型 L33 S74K 変異型 L34 S74N 変異型 L35 S74T 変異型 L36 S74V 変異型 L37 P75A 変異型 L38 P75D 変異型 L39 P75L 変異型 L40 P75S 変異型 L41 Y76F 変異型 L42 Y76H 変異型 L43 Y76I 変異型 L44 Y76V 変異型 L45 Y76W 変異型 L46 G77A 変異型 L47 G77F 変異型 L48 G77K 変異型 L49 G77M 変異型 L50 G77N 変異型 L51 G77P 変異型 L52 G77S 変異型 L53 G77T 変異型 L54 Q78F 変異型 L55 Q78L 変異型 L56 N79D 変異型 L57 N79L 変異型 L58 N79R 変異型 L59 N79S 変異型 L60 E80D 変異型 L61 E80F 変異型 L62 E80L 変異型 L63 E80P 変異型 L64 E80S 変異型 L65 Y81A 変異型 L66 Y81C 変異型 L67 Y81D 変異型 L68 Y81E 変異型 L69 Y81F 変異型 L70 Y81H 変異型 L71 Y81K 変異型 L72 Y81L 変異型 L73 Y81N 変異型 L74 Y81S 変異型 L75 Y81T 変異型 L76 Y81W 変異型 L77 K82D 変異型 L78 K82L 変異型 L79 K82P 変異型 L80 K82S 変異型 L81 K83D 変異型 L82 K83F 変異型 L83 K83L 変異型 L84 K83P 変異型 L85 K83S 変異型 L86 K83V 変異型 L87 S84D 変異型 L88 S84F 変異型 L89 S84K 変異型 L90 S84L 変異型 L91 S84N 変異型 L92 S84Q 変異型 L93 L85F 変異型 L94 L85I 変異型 L95 L85P 変異型 L96 L85V 変異型 L97 N87E 変異型 L98 N87Q 変異型 L99 F88E 変異型 LlOO V103I 変異型 L101 V103L 変異型 L102 K106A 変異型 L103 K106F 変異型 L 104 K106L 変異型 L105 K106Q 変異型 L106 K106S 変異型 L107 W107A 変異型 L108 W107Y 変異型 L109 F113A 変異型 L110 F113W 変異型 L111 F113Y 変異型 L112 E114A 変異型 L113 E114D 変異型 L114 D115E 変異型 L115 D115Q 変異型 L116 D115S 変異型 L117 I116F 変異型 L118 I116K 変異型 L119 I116L 変異型 L 120 I116M 変異型 L121 I116N 変異型 L122 I116T 変異型 L123 I116V 変異型 L 124 I157K 変異型 L125 I157L 変異型 L 126 Y159G 変異型 L127 Y159N 変異型 L 128 Y159S 変異型 L129 P160G 変異型 LI 30 G161A 変異型 L131 F162L 変異型 L132 F162Y 変異型 L133 Y163I 変異型 L 134 T165V 変異型 L135 Q181F 変異型 L136 A182G 変異型 L137 A182S 変異型 L138 P183A 変異型 L139 P183G 変異型 L140 P183S 変異型 L141 T185A 変異型 L142 T185G 変異型 L143 T185V 変異型 L 144 W187A 変異型 L145 W187F 変異型 L146 W187H 変異型 L147 W187Y 変異型 L148 Y188F 変異型 L149 Y188L 変異型 L 150 Y188W 変異型 L151 G190A 変異型 L152 G190D 変異型 L153 F193W 変異型 L 154 H194D 変異型 L155 F200A 変異型 L156 F200L 変異型 L157 F200S 変異型 L158 F200V 変異型 L159 L201Q 変異型 L 160 L201S 変異型 L161 Q202A 変異型 L162 Q202D 変異型 L163 Q202F 変異型 L 164 Q202S 変異型 L165 Q202T 変異型 L166 Q202V 変異型 L167 D203E 変異型 L168 A204G 変異型 L169 A204L 変異型 L 170 A204S 変異型 L171 A204T 変異型 L172 A204V 変異型 L173 F205L 変異型 L 174 F205Q 変異型 L175 F205V 変異型 L 176 F205W 変異型 L177 T206F 変異型 L 178 T206K 変異型 L179 T206L 変異型 L 180 F207I 変異型 L181 F207W 変異型 L182 F207Y 変異型 L183 M208A 変異型 L 184 M208L 変異型 L185 S209F 変異型 L186 S209K 変異型 L187 S209L 変異型 L188 S209N 変異型 L189 S209V 変異型 L 190 T210A 変異型 L191 T210L 変異型 L192 T210Q 変異型 L193 T210V 変異型 L 194 F211A 変異型 L195 F211I 変異型 L196 F211L 変異型 L197 F211M 変異型 L198 F211V 変異型 L199 F211W 変異型 L200 F211Y 変異型 L201 G212A 変異型 L202 V213D 変異型 L203 V213F 変異型 L204 V213K 変異型 L205 V213S 変異型 L206 P214D 変異型 L207 P214F 変異型 L208 P214K 変異型 L209 P214S 変異型 L210 R215A 変異型 L211 R215I 変異型 L212 R215K 変異型 L213 R215Q 変異型 L214 R215S 変異型 L215 R215T 変異型 L216 R215Y 変異型 L217 P216D 変異型 L218 P216K 変異型 L219 K217D 変異型 L220 P218F 変異型 L221 P218L 変異型 L222 P218Q 変異型 L223 P218S 変異型 L224 I219D 変異型 L225 I219F 変異型 L226 I219K 変異型 L227 T220A 変異型 L228 T220D 変異型 L229 T220F 変異型 L230 T220K 変異型 L231 T220L 変異型 L232 T220S 変異型 L233 P221A 変異型 L234 P221D 変異型 L235 P221F 変異型 L236 P221K 変異型 L237 P221L 変異型 L238 P221S 変異型 L239 D222A 変異型 L240 D222F 変異型 L241 D222L 変異型 L242 D222R 変異型 L243 Q223F 変異型 L244 Q223K 変異型 L245 Q223L 変異型 L246 Q223S 変異型 L247 F224A 変異型 L248 F224D 変異型 L249 F224G 変異型 L250 F224K 変異型 L251 F224L 変異型 L252 K225D 変異型 L253 K225G 変異型 L254 K225S 変異型 L255 G226A 変異型 L256 G226F 変異型 L257 G226L 変異型 L258 G226N 変異型 L259 G226S 変異型 L260 K227D 変異型 L261 K227F 変異型 L262 K227S 変異型 L263 I228A 変異型 L264 I228F 変異型 L265 I228K 変異型 L266 I228S 変異型 L267 P229A 変異型 L268 P229D 変異型 L269 P229K 変異型 L270 P229L 変異型 L271 P229S 変異型 L272 I230A 変異型 L273 I230F 変異型 L274 I230K 変異型 L275 I230S 変異型 L276 K231F 変異型 L277 K231L 変異型 L278 K231S 変異型 L279 E232D 変異型 L280 E232F 変異型 L281 E232G 変異型 L282 E232L 変異型 L283 E232S 変異型 L284 A233D 変異型 L285 A233F 変異型 L286 A233H 変異型 L287 A233K 変異型 L288 A233L 変異型 L289 A233N 変異型 L290 A233S 変異型 L291 D234L 変異型 L292 D234S 変異型 L293 K235D 変異型 L294 K235F 変異型 L295 K235L 変異型 L296 K235S 変異型 L297 F259Y 変異型 L298 R276A 変異型 L299 R276Q 変異型 L300 A298S 変異型 L301 D300N 変異型 L302 V301M 変異型 L303 Y328F 変異型 L304 Y328H 変異型 L305 Y328M 変異型 L306 Y328W 変異型 L307 W332H 変異型 L308 E336A 変異型 L309 N338A 変異型 L310 N338F 変異型 L311 Y339K 変異型 L312 Y339L 変異型 L313 Y339T 変異型 L314 L340A 変異型 L315 L340I 変異型 L316 L340V 変異型 L317 V439P 変異型 L318 I440F 変異型 L319 I440V 変異型 L320 E441F 変異型 L321 E441M 変異型 L322 E441N 変異型 L323 N442A 変異型 L324 N442L 変異型 L325 R443S
変異型 L326 T444W
変異型 L327 R445G
変異型 L328 R445K
変異型 L329 E446A
変異型 L330 E446F
変異型 L331 E446Q
変異型 L332 E446S
変異型 L333 E446T
変異型 L334 Y447L
変異型 L335 Y447S
〔28〕 上記〔20〕に記載の変異型タンパク質において、前記変異型 L1から L335の いずれか 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異部位以外の部位に 置換、欠失、挿入、付加および逆位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の 変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タン パク質。
〔29〕 少なくとも変異型 L124もしくは変異型 L125を含むことを特徴とする、上記〔2 7]または〔28〕に記載の変異型タンパク質。
〔30〕 少なくとも変異型 L303を含むことを特徴とする、上記〔27〕力も〔29〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
〔31〕 少なくとも変異型 L12を含むことを特徴とする、上記〔27〕力も〔30〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
〔32〕 少なくとも変異型 L127を含むことを特徴とする、上記〔27〕力も〔31〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
〔33〕 少なくとも変異型 L195もしくは L199を含むことを特徴とする、上記〔27〕から〔 32]の 、ずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔34〕 少なくとも変異型 L130を含むことを特徴とする、上記〔27〕力も〔33〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。 〔35〕 少なくとも変異型 L115を含むことを特徴とする、上記〔27〕力も〔34〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
〔36〕 少なくとも変異型 L316を含むことを特徴とする、上記〔27〕から〔35〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
〔37〕 少なくとも変異型 L99を含むことを特徴とする、上記〔27〕力も〔36〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
〔38〕 少なくとも変異型 L15もしくは L16を含むことを特徴とする、上記〔27〕から〔37 〕の 、ずれか一項に記載の変異型タンパク質。
〔39〕 少なくとも変異型 L131を含むことを特徴とする、上記〔27〕力も〔38〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
〔40〕 少なくとも変異型 L284を含むことを特徴とする、上記〔27〕から〔39〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
〔41〕 少なくとも変異型 L191を含むことを特徴とする、上記〔27〕から〔40〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
〔42〕 少なくとも変異型 L65を含むことを特徴とする、上記〔27〕から〔41〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
〔43〕 少なくとも変異型 L265を含むことを特徴とする、上記〔27〕から〔42〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
〔44〕 少なくとも変異型 L317を含むことを特徴とする、上記〔27〕力も〔43〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
〔45〕 少なくとも変異型 L255を含むことを特徴とする、上記〔27〕から〔44〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
〔46〕 少なくとも変異型 L52を含むことを特徴とする、上記〔27〕から〔45〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
〔47〕 少なくとも変異型 L155を含むことを特徴とする、上記〔27〕から〔46〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
〔48〕 少なくとも変異型 L298を含むことを特徴とする、上記〔27〕から〔47〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。 〔49〕 少なくとも変異型 L201を含むことを特徴とする、上記〔27〕から〔48〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
〔50〕 少なくとも変異型 L145を含むことを特徴とする、上記〔27〕から〔49〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
[51] 少なくとも変異型 L170を含むことを特徴とする、上記〔27〕から〔50〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
〔52〕 少なくとも変異型 L87を含むことを特徴とする、上記〔27〕力も〔51〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
[53] 少なくとも変異型 L60を含むことを特徴とする、上記〔27〕から〔52〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
〔54〕 少なくとも変異型 L110を含むことを特徴とする、上記〔27〕から〔53〕のいずれ か一項に記載の変異型タンパク質。
〔55〕 配列番号 208に記載のアミノ酸配列に対し下記の変異型 Mlから M642のい ずれ力 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質。 変異型 Ml T69N/I157L
変異型 M2 T69Q/I157L
変異型 M3 T69S/I157L
変異型 M4 P70A/I157L
変異型 M5 P70G/I157L
変異型 M6 P70I/I157L
変異型 M7 P70L/I157L
変異型 M8 P70N/I157L
変異型 M9 P70S/I157L
変異型 M10 P70T/I157L
変異型 Mi l P70T/T210L
変異型 M12 P70T/Y328F
変異型 M13 P70V/I157L
変異型 M14 A72E/G77S 変異型 Ml 5 A72E/E80D 変異型 Ml 6 A72E/Y81A 変異型 Ml 7 A72E/S84D 変異型 Ml 8 A72E/F113W 変異型 Ml 9 A72E/I157L 変異型 M20 A72E/G161A 変異型 M21 A72E/F162L 変異型 M22 A72E/A184G 変異型 M23 A72E/W187F 変異型 M24 A72E/F200A 変異型 M25 A72E/A204S 変異型 M26 A72E/T210L 変異型 M27 A72E/F211L 変異型 M28 A72E/F211W 変異型 M29 A72E/G226A 変異型 M30 A72E/I228K 変異型 M31 A72E/A233D 変異型 M32 A72E/Y328F 変異型 M33 A72S/I157L 変異型 M34 A72V/Y328F 変異型 M35 V73A/I157L 変異型 M36 V73I/I157L 変異型 M37 S74A/I157L 変異型 M38 S74N/I157L 変異型 M39 S74T/I157L 変異型 M40 S74V/I157L 変異型 M41 G77A/I157L 変異型 M42 G77F/I157L 変異型 M43 G77M/I157L 変異型 M44 G77P/I157L 変異型 M45 G77S/E80D 変異型 M46 G77S/Y81A 変異型 M47 G77S/S84D 変異型 M48 G77S/F113W 変異型 M49 G77S/I157L 変異型 M50 G77S/Y159N 変異型 M51 G77S/Y159S 変異型 M52 G77S/G161A 変異型 M53 G77S/F162L 変異型 M54 G77S/A184G 変異型 M55 G77S/W187F 変異型 M56 G77S/F200A 変異型 M57 G77S/A204S 変異型 M58 G77S/T210L 変異型 M59 G77S/F211L 変異型 M60 G77S/F211W 変異型 M61 G77S/I228K 変異型 M62 G77S/A233D 変異型 M63 G77S/R276A 変異型 M64 G77S/Y328F 変異型 M65 E80D/Y81A 変異型 M66 E80D/F113W 変異型 M67 E80D/I157L 変異型 M68 E80D/Y159N 変異型 M69 E80D/G161A 変異型 M70 E80D/A184G 変異型 M71 E80D/F211W 変異型 M72 E80D/Y328F 変異型 M73 E80S/I157L 変異型 M74 Y81A/F113W 変異型 M75 Y81A/I157L 変異型 M76 Y81A/Y159N 変異型 M77 Y81A/Y159S 変異型 M78 Y81A/G161A 変異型 M79 Y81A/A184G 変異型 M80 Y81A/W187F 変異型 M81 Y81A/F200A 変異型 M82 Y81A/T210L 変異型 M83 Y81A/F211W 変異型 M84 Y81A/F211Y 変異型 M85 Y81A/G226A 変異型 M86 Y81A/I228K 変異型 M87 Y81A/A233D 変異型 M88 Y81A/Y328F 変異型 M89 Y81H/I157L 変異型 M90 Y81N/I157L 変異型 M91 K83P/I157L 変異型 M92 S84A/I157L 変異型 M93 S84D/F113W 変異型 M94 S84D/I157L 変異型 M95 S84D/Y159N 変異型 M96 S84D/G161A 変異型 M97 S84D/A184G 変異型 M98 S84D/Y328F 変異型 M99 S84E/I157L 変異型 MIOO S84F/I157L 変異型 M101 S84K/I157L 変異型 M102 L85F/I157L 変異型 M103 L85I/I157L 変異型 M104 L85P/I157L 変異型 M105 L85V/I157L 変異型 M106 N87A/I157L 変異型 M107 N87D/I157L 変異型 M108 N87E/I157L 変異型 M109 N87G/I157L 変異型 Ml 10 N87Q/I157L 変異型 Ml 11 N87S/I157L 変異型 Ml 12 F88A/I157L 変異型 Ml 13 F88D/I157L 変異型 Ml 14 F88E/I157L 変異型 Ml 15 F88E/Y328F 変異型 Ml 16 F88L/I157L 変異型 Ml 17 F88T/I157L 変異型 Ml 18 F88V/I157L 変異型 Ml 19 F88Y/I157L 変異型 M120 K106H/I157L 変異型 Ml 21 K106L/I157L 変異型 M122 K106M/I157L 変異型 M123 K106Q/I157L 変異型 Ml 24 K106R/I157L 変異型 M125 K106S/I157L 変異型 M126 K106V/I157L 変異型 M127 W107A/I157L 変異型 M128 W107A/Y328F 変異型 M129 W107Y/I157L 変異型 M130 W107Y/T206Y 変異型 Ml 31 W107Y/K217D 変異型 Ml 32 W107Y/P218L 変異型 Ml 33 W107Y/T220L 変異型 M134 W107Y/P221D 変異型 Ml 35 W107Y/Y328F 変異型 M136 F113A/I157L 変異型 Ml 37 F113H/I157L 変異型 M138 F113N/I157L 変異型 Ml 39 F113V/I157L 変異型 M140 F113W/I157L 変異型 M141 F113W/Y159N 変異型 M142 F113W/Y159S 変異型 M143 F113W/G161A 変異型 M144 F113W/F162L 変異型 M145 F113W/A184G 変異型 M146 F113W/W187F 変異型 M147 F113W/F200A 変異型 M148 F113W/T206Y 変異型 M149 F113W/T210L 変異型 M150 F113W/F211L 変異型 Ml 51 F113W/F211W 変異型 Ml 52 F113W/F211Y 変異型 Ml 53 F113W/V213D 変異型 M154 F113W/K217D 変異型 Ml 55 F113W/T220L 変異型 M156 F113W/P221D 変異型 Ml 57 F113W/G226A 変異型 M158 F113W/I228K 変異型 Ml 59 F113W/A233D 変異型 M160 F113W/R276A 変異型 M161 F113Y/I157L 変異型 M162 F113Y/F211W 変異型 M163 E114D/I157L 変異型 M164 D115A/I157L 変異型 M165 D115E/I157L 変異型 M166 D115M/I157L 変異型 M167 D115N/I157L 変異型 M168 D115Q/I157L 変異型 M169 D115S/I157L 変異型 M170 D115V/I157L 変異型 Ml 71 I157L/Y159I 変異型 M172 I157L/Y159L 変異型 M173 I157L/Y159N 変異型 Ml 74 I157L/Y159S 変異型 M175 I157L/Y159V 変異型 M176 I157L/P160A 変異型 M177 I157L/P160S 変異型 M178 I157L/G161A 変異型 M179 I157L/F162L 変異型 M180 I157L/F162M 変異型 M181 I157L/F162N 変異型 M182 I157L/F162Y 変異型 M183 I157L/T165L 変異型 M184 I157L/T165V 変異型 M185 I157L/Q181A 変異型 M186 I157L/Q181F 変異型 M187 I157L/Q181N 変異型 M188 I157L/A184G 変異型 M189 I157L/A184L 変異型 M190 I157L/A184M 変異型 Ml 91 I157L/A184S 変異型 Ml 92 I157L/A184T 変異型 Ml 93 I157L/W187F 変異型 M194 I157L/W187Y 変異型 Ml 95 I157L/F193H 変異型 M196 I157L/F193I 変異型 Ml 97 I157L/F193W 変異型 M198 I157L/F200A 変異型 Ml 99 I157L/F200H 変異型 M200 I157L/F200L 変異型 M201 I157L/F200Y 変異型 M202 I157L/A204G 変異型 M203 I157L/A204I 変異型 M204 I157L/A204L 変異型 M205 I157L/A204S 変異型 M206 I157L/A204T 変異型 M207 I157L/A204V 変異型 M208 I157L/F205A 変異型 M209 I157L/F207I 変異型 M210 I157L/F207M 変異型 M211 I157L/F207V 変異型 M212 I157L/F207W 変異型 M213 I157L/F207Y 変異型 M214 I157L/M208A 変異型 M215 I157L/M208K 変異型 M216 I157L/M208L 変異型 M217 I157L/M208T 変異型 M218 I157L/M208V 変異型 M219 I157L/S209F 変異型 M220 I157L/S209N 変異型 M221 I157L/T210A 変異型 M222 I157L/T210L 変異型 M223 I157L/F211I 変異型 M224 I157L/F211L 変異型 M225 I157L/F211V 変異型 M226 I157L/F211W 変異型 M227 I157L/G212A 変異型 M228 I157L/G212D 変異型 M229 I157L/G212S 変異型 M230 I157L/R215K 変異型 M231 I157L/R215L 変異型 M232 I157L/R215T 変異型 M233 I157L/R215Y 変異型 M234 I157L/T220L 変異型 M235 I157L/G226A 変異型 M236 I157L/G226F 変異型 M237 I157L/I228K 変異型 M238 I157L/A233D 変異型 M239 I157L/R276A 変異型 M240 I157L/Y328A 変異型 M241 I157L/Y328F 変異型 M242 I157L/Y328H 変異型 M243 I157L/Y328I 変異型 M244 I157L/Y328L 変異型 M245 I157L/Y328P 変異型 M246 I157L/Y328V 変異型 M247 I157L/Y328W 変異型 M248 I157L/L340F 変異型 M249 I157L/L340I 変異型 M250 I157L/L340V 変異型 M251 I157L/V439A 変異型 M252 I157L/V439P 変異型 M253 I157L/R445A 変異型 M254 I157L/R445F 変異型 M255 I157L/R445G 変異型 M256 I157L/R445K 変異型 M257 I157L/R445V 変異型 M258 Y159N/G161A 変異型 M259 Y159N/A184G 変異型 M260 Y159N/A204S 変異型 M261 Y159N/T210L 変異型 M262 Y159N/F211W 変異型 M263 Y159N/F211Y 変異型 M264 Y159N/G226A 変異型 M265 Y159N/I228K 変異型 M266 Y159N/A233D 変異型 M267 Y159N/Y328F 変異型 M268 Y159S/G161A 変異型 M269 Y159S/F211W 変異型 M270 G161A/F162L 変異型 M271 G161A/A184G 変異型 M272 G161A/W187F 変異型 M273 G161A/F200A 変異型 M274 G161A/A204S 変異型 M275 G161A/T210L 変異型 M276 G161A/F211L 変異型 M277 G161A/F211W 変異型 M278 G161A/G226A 変異型 M279 G161A/I228K 変異型 M280 G161A/A233D 変異型 M281 G161A/Y328F 変異型 M282 F162L/A184G 変異型 M283 F162L/F211W 変異型 M284 F162L/A233D 変異型 M285 P183A/Y328F 変異型 M286 A184G/W187F 変異型 M287 A184G/F200A 変異型 M288 A184G/A204S 変異型 M289 A184G/T210L 変異型 M290 A184G/F211L 変異型 M291 A184G/F211W 変異型 M292 A184G/I228K 変異型 M293 A184G/A233D 変異型 M294 A184G/R276A 変異型 M295 V184G/Y328F 変異型 M296 T185A/Y328F 変異型 M297 T185N/Y328F 変異型 M298 W187F/F211W 変異型 M299 W187F/Y328F 変異型 M300 F193W/F211W 変異型 M301 F200A/F211W 変異型 M302 F200A/Y328F 変異型 M303 L201Q/Y328F 変異型 M304 L201S/Y328F 変異型 M305 A204S/F211W 変異型 M306 A204S/Y328F 変異型 M307 T210L/F211W 変異型 M308 T210L/Y328F 変異型 M309 F211L/A233D 変異型 M310 F211L/Y328F 変異型 M311 F211W/I228K 変異型 M312 F211W/A233D 変異型 M313 F211W/Y328F 変異型 M314 R215A/Y328F 変異型 M315 R215L/Y328F 変異型 M316 T220L/A233D 変異型 M317 T220L/D300N 変異型 M318 P221L/A233D 変異型 M319 P221L/Y328F 変異型 M320 F224A/A233D 変異型 M321 G226A/Y328F 変異型 M322 G226F/A233D 変異型 M323 G226F/Y328F 変異型 M324 I228K/Y328F 変異型 M325 A233D/K235D 変異型 M326 A233D/Y328F 変異型 M327 R276A/Y328F 変異型 M328 Y328F/Y339F 変異型 M329 A27T/Y81A/S84D 変異型 M330 P70T/A72E/I157L 変異型 M331 P70T/G77S/I157L 変異型 M332 P70T/E80D/F88E 変異型 M333 P70T/Y81A/I157L 変異型 M334 P70T/S84D/I157L 変異型 M335 P70T/F88E/Y328F 変異型 M336 P70T/F 113W/1157L 変異型 M337 P70T/I157L/A204S 変異型 M338 P70T/1157L/T210L 変異型 M339 P70T/I157L/A233D 変異型 M340 P70T/1157L/Y328F 変異型 M341 P70T/I157L/V439P 変異型 M342 P70T/I157L/I440F 変異型 M343 P70T/G 161A/T21 OL 変異型 M344 P70T/G 161A/Y328F 変異型 M345 P70T/A184G/W187F 変異型 M346 P70T/A204S/Y328F 変異型 M347 P70T/F211W/Y328F 変異型 M348 P70V/A72E/I157L 変異型 M349 A72E/S74T/I157L 変異型 M350 A72E/G77S/Y328F 変異型 M351 A72E/E80D/Y328F 変異型 M352 A72E/Y81H/I157L 変異型 M353 A72E/K83P/I157L 変異型 M354 A72E/S84D/Y328F 変異型 M355 A72E/L85P/I157L 変異型 M356 A72E/F 113W/1157L 変異型 M357 A72E/F113W/Y328F 変異型 M358 A72E/F113Y/1157L 変異型 M359 A72E/D 115Q/1157L 変異型 M360 A72E/1157L/G 161 A 変異型 M361 A72E/1157L/F 162L 変異型 M362 A72E/1157L/A184G 変異型 M363 A72E/I157L/F200A 変異型 M364 A72E/I157L/A204S 変異型 M365 A72E/I157L/A204T 変異型 M366 A72E/1157L/T21 OL 変異型 M367 A72E/I157L/F211W 変異型 M368 A72E/I157L/G226A 変異型 M369 A72E/I157L/A233D 変異型 M370 A72E/I157L/Y328F 変異型 M371 A72E/I157L/L340V 変異型 M372 A72E/I157L/V439P 変異型 M373 A72E/G 161A/Y328F 変異型 M374 A72E/F162L/Y328F 変異型 M375 A72E/A184G/Y328F 変異型 M376 A72E/W187F/Y328F 変異型 M377 A72E/F200A/Y328F 変異型 M378 A72E/A204S/Y328F 変異型 M379 A72E/T210L/Y328F 変異型 M380 A72E/I228K/Y328F 変異型 M381 A72E/A233D/Y328F 変異型 M382 A72E/Y328F/Y159N 変異型 M383 A72E/Y328F/F211W 変異型 M384 A72E/Y328F/F211Y 変異型 M385 A72E/Y328F/G226A 変異型 M386 A72V/Y81A/Y328F 変異型 M387 A72V/G 161A/Y328F 変異型 M388 G77M/I157L/T210L 変異型 M389 G77P/I157L/F162L 変異型 M390 G77P/I157L/A184G 変異型 M391 G77P/F211W/Y328F 変異型 M392 G77S/Y81A/Y328F 変異型 M393 G77S/S84D/I157L 変異型 M394 G77S/F88E/I157L 変異型 M395 G77S/F113W/I157L 変異型 M396 G77S/F113Y/I157L 変異型 M397 G77S/D115Q/I157L 変異型 M398 G77S/I157L/G161A 変異型 M399 G77S/I157L/F200A 変異型 M400 G77S/I157L/A204S 変異型 M401 G77S/I157L/T210L 変異型 M402 G77S/I157L/F211W 変異型 M403 G77S/I157L/G226A 変異型 M404 G77S/I157L/A233D 変異型 M405 G77S/I157L/L340V 変異型 M406 G77S/I157L/V439P 変異型 M407 G77S/G161A/Y328F 変異型 M408 E80D/Y81A/Y328F 変異型 M409 Y81A/S84D/Y328F 変異型 M410 Y81A/F113W/Y328F 変異型 M411 Y81A/1157L/T21 OL 変異型 M412 Y81A/1157L/Y328F 変異型 M413 Y81A/G 161A/Y328F 変異型 M414 Y81A/F 162L/Y328F 変異型 M415 Y81A/A184G/Y328F 変異型 M416 Y81A/W187F/Y328F 変異型 M417 Y81A/A204S/Y328F 変異型 M418 Y81A/T210L/Y328F 変異型 M419 Y81A/I228K/Y328F 変異型 M420 Y81A/A233D/Y328F 変異型 M421 Y81A/Y328F/Y159N 変異型 M422 Y81A/Y328F/Y159S 変異型 M423 Y81A/Y328F/F211W 変異型 M424 Y81A/Y328F/F211Y 変異型 M425 Y81A/Y328F/G226A 変異型 M426 Y81A/Y328F/R276A 変異型 M427 K83P/I157L/A184G 変異型 M428 K83P/1157L/T21 OL 変異型 M429 K83P/F211W/Y328F 変異型 M430 S84D/F113W/1157L 変異型 M431 S84D/I157L/T210L 変異型 M432 F88E/1157L/F 162L 変異型 M433 F88E/I157L/A184G 変異型 M434 F88E/I157L/F200A 変異型 M435 F88E/I157L/T210L 変異型 M436 F88E/I157L/Y328F 変異型 M437 F88E/I157L/Y328Q 変異型 M438 F88E/I157L/L340V 変異型 M439 F88E/T210L/Y328F 変異型 M440 F88E/F211W/Y328F 変異型 M441 F113W/I157L/G161A 変異型 M442 F 113W/1157L/A 184G 変異型 M443 F 113W/1157L/W 187F 変異型 M444 F 113W/1157L/F200A 変異型 M445 F 113W/1157L/A204S 変異型 M446 F 113W/1157L/A204T 変異型 M447 F 113W/1157L/T210L 変異型 M448 F 113W/1157L/F211W 変異型 M449 F113W/I157L/G226A 変異型 M450 F 113W/1157L/A233D 変異型 M451 F 113W/1157L/Y328F 変異型 M452 F 113W/1157L/L340V 変異型 M453 F 113W/1157L/V439P 変異型 M454 F 113W/G 161A/T21 OL 変異型 M455 F 113W/G 161A/Y328F 変異型 M456 F 113W/A184G/W187F 変異型 M457 F 113Y/1157L/T210L 変異型 M458 F 113Y/1157L/Y328F 変異型 M459 F 113Y/G 161A/T21 OL 変異型 M460 D 115Q/1157L/T21 OL 変異型 M461 D115Q/I157L/Y328F 変異型 M462 I157L/Y159N/T21 OL 変異型 M463 I157L/Y159N/Y328F 変異型 M464 I157L/G161A/W187F 変異型 M465 1157L/G 161A/F200A 変異型 M466 1157L/G 161A/A204S 変異型 M467 1157L/G 161A/T21 OL 変異型 M468 1157L/G 161A/A233D 変異型 M469 I157L/G161A/Y328F 変異型 M470 I157L/F162L/A184G 変異型 M471 1157L/F 162L/T21 OL 変異型 M472 1157L/F 162L/L 340 V 変異型 M473 I157L/A184G/W187F 変異型 M474 I157L/A184G/F200A 変異型 M475 1157L/A184G/A204T 変異型 M476 1157L/A 184G/T210L 変異型 M477 I157L/A184G/F211W 変異型 M478 I157L/A184G/L340V 変異型 M479 1157L/W 187F/T21 OL 変異型 M480 1157L/W 187F/Y328F 変異型 M481 1157L/F200A/T21 OL 変異型 M482 I157L/F200A/Y328F 変異型 M483 1157L/A204S/T21 OL 変異型 M484 I157L/A204S/Y328F 変異型 M485 1157L/A204T/T21 OL 変異型 M486 1157L/A204T/Y328F 変異型 M487 I157L/T210L/F211W 変異型 M488 1157L/T21 OL/G 212 A 変異型 M489 I157L/T210L/G226A 変異型 M490 I157L/T21 OL/A233D 変異型 M491 I157L/T210L/Y328F 変異型 M492 I157L/T210L/L340V 変異型 M493 I157L/T210L/V439P 変異型 M494 I157L/F211W/Y328F 変異型 M495 I157L/G226A/Y328F 変異型 M496 I157L/A233D/Y328F 変異型 M497 1157L/Y328F/L340V 変異型 M498 I157L/Y328F/V439P 変異型 M499 Y159N/F211W/Y328F 変異型 M500 G161A/A184G/W187F 変異型 M501 G161A/T210L/Y328F 変異型 M502 G161A/F211W/Y328F 変異型 M503 A182G/P183A/Y328F 変異型 M504 A182S/P183A/Y328F 変異型 M505 A184G/W187F/F200A 変異型 M506 A184G/W187F/A204S 変異型 M507 A184G/W187F/F211W 変異型 M508 A184G/W187F/I228K 変異型 M509 A184G/W187F/A233D 変異型 M510 F200A/F211W/Y328F 変異型 M511 A204S/F211W/Y328F 変異型 M512 A204T/F211W/Y328F 変異型 M513 F211W/Y328F/L340V 変異型 M514 P70T/A72E/I157L/Y328F 変異型 M515 P70T/A72E/T210L/Y328F 変異型 M516 P70T/G77M/I157L/Y328F 変異型 M517 P70T/Y81 A,1157L/T210L 変異型 M518 P70T/Y81A/I157L/Y328F 変異型 M519 P70T/S84D/I157L/Y328F 変異型 M520 P70T/F88E/I157L/Y328F 変異型 M521 P70T/F88E/T210L/Y328F 変異型 M522 P70T/F 113W/1157L/T210L 変異型 M523 P70T/F113W/G161A/Y328F 変異型 M524 P70T/F 113Y/1157L/Y328F 変異型 M525 P70T/D 115Q/I157L/T210L 変異型 M526 P70T/D115Q/I157L/Y328F 変異型 M527 P70T/1157L/G161A/T21 OL 変異型 M528 P70T/I157L/A184G/W187F 変異型 M529 P70T/I157L/A184G/T210L 変異型 M530 P70T/I157L/W187F/T210L 変異型 M531 P70T/I157L/W187F/Y328F 変異型 M532 P70T/1157L/A204T/T21 OL 変異型 M533 P70T/1157L/A204T/Y328F 変異型 M534 P70T/1157L/A204T/T21 OL 変異型 M535 P70T/1157L/T210L/F211W 変異型 M536 P70T/I157L/T210L/G226A 変異型 M537 P70T/I157L/T210L/A233D 変異型 M538 P70T/1157L/T210L/Y328F 変異型 M539 P70T/1157L/T210L/L340V 変異型 M540 P70T/I157L/T210L/V439P 変異型 M541 P70T/I157L/Y328F/V439P 変異型 M542 P70T/G161A/T210L/Y328F 変異型 M543 P70T/G161A/A233D/Y328F 変異型 M544 A72E/S74T/I157L/Y328F 変異型 M545 A72E/G77S/F113W/I157L 変異型 M546 A72E/Y81H/I157L/Y328F 変異型 M547 A72E/K83P/I157L/Y328F 変異型 M548 A72E/F88E/F113W/1157L 変異型 M549 A72E/F88E/I157L/Y328F 変異型 M550 A72E/F88E/G161A/Y328F 変異型 M551 A72E/F113W/1157L/Y328F 変異型 M552 A72E/F113W/G161A/Y328F 変異型 M553 A72E/F113Y/1157L/Y328F 変異型 M554 A72E/F113Y/G161A/Y328F 変異型 M555 A72E/F113Y/G226A/Y328F 変異型 M556 A72E/I157L/G161A/Y328F 変異型 M557 A72E/I157L/F162L/Y328F 変異型 M558 A72E/I157L/A184G/Y328F 変異型 M559 A72E/I157L/F200A/Y328F 変異型 M560 A72E/I157L/A204T/Y328F 変異型 M561 A72E/I157L/F211W/Y328F 変異型 M562 A72E/I157L/F211Y/Y328F 変異型 M563 A72E/I157L/A233D/Y328F 変異型 M564 A72E/I157L/Y328F/L340V 変異型 M565 A72E/G 161A/A204T/Y328F 変異型 M566 A72E/G 161A/T210L/Y328F 変異型 M567 A72E/G 161A/F211W/Y328F 変異型 M568 A72E/G 161A/F211Y/Y328F 変異型 M569 A72E/G161A/A233D/Y328F 変異型 M570 A72E/G161A/Y328F/L340V 変異型 M571 A72E/A184G/W187F/Y328F 変異型 M572 A72E/T210L/Y328F/L340V 変異型 M573 A72V/1157L/W187F/Y328F 変異型 M574 G77P/I157L/T210L/Y328F 変異型 M575 Y81A/S84D/I157L/Y328F 変異型 M576 Y81A/F88E/1157L/Y328F 変異型 M577 Y81A/F 113W/1157L/Y328F 変異型 M578 Y81A/I157L/G161A/Y328F 変異型 M579 Y81A/1157L/W187F/Y328F 変異型 M580 Y81A/I157L/A204S/Y328F 変異型 M581 Y81A/1157L/T210L/Y328F 変異型 M582 Y81A/I157L/A233D/Y328F 変異型 M583 Y81A/I157L/Y328F/V439P 変異型 M584 Y81A/A184G/W187F/Y328F 変異型 M585 F88E/I157L/T210L/Y328F 変異型 M586 F88E/I157L/A233D/Y328F 変異型 M587 F 113W/1157L/A204T/T210L 変異型 M588 F 113W/1157L/T210L/Y328F 変異型 M589 1157L/G 161A/A184G/W187F 変異型 M590 I157L/G161A/T210L/Y328F 変異型 M591 1157L/A 184G/W 187F/T21 OL 変異型 M592 1157L/A204S/T210L/Y328F 変異型 M593 1157L/A204T/T210L/Y328F 変異型 M594 I157L/T210L/A233D/Y328F 変異型 M595 G161A/A184G/W187F/Y328F 変異型 M596 P70T/A72E/S84D/I157L/Y328F 変異型 M597 P70T/A72E/A204S/I157L/Y328F 変異型 M598 P70T/A72E/T210L/I157L/Y328F 変異型 M599 P70T/A72E/G226A/I157L/Y328F 変異型 M600 P70T/A72E/A233D/I157L/Y328F 変異型 M601 P70T/Y81A/1157L/T210L/Y328F 変異型 M602 P70T/Y81A/I157L/A233D/Y328F 変異型 M603 P70T/Y81A/I157L/T210L/Y328F 変異型 M604 P70T/Y81A/A233D/I157L/Y328F 変異型 M605 P70T/S84D/1157L/T21 OL/Y328F 変異型 M606 P70T/F 113W/1157L/T210L/Y328F 変異型 M607 P70T/I157L/A184G/W187F/A233D 変異型 M608 P70T/1157L/W 187F/T210L/Y328F 変異型 M609 P70T/1157L/A204S/T210L/Y328F 変異型 M610 P70T/G 161A/A 184G/W 187F/Y328F 変異型 M611 P70V/A72E/F 113Y/1157L/Y328F 変異型 M612 P70V/A72E/I157L/F211W/Y328F 変異型 M613 A72E/S74T/F 113Y/1157L/Y328F 変異型 M614 A72E/S74T/1157L/F211W/Y328F 変異型 M615 A72E/Y81H/I157L/F211W/Y328F 変異型 M616 A72E/K83P/F 113Y/1157L/Y328F 変異型 M617 A72E/W17F/F 113Y/1157L/Y328F 変異型 M618 A72E/F113Y/D115Q/I157L/Y328F 変異型 M619 A72E/F113Y/1157L/Y328F/L340V 変異型 M620 A72E/F113Y/1157L/Y328F/V439P 変異型 M621 A72E/F113Y/G161A/I157L/Y328F 変異型 M622 A72E/F113Y/A204S/I157L/Y328F 変異型 M623 A72E/F 113Y/A204T/1157L/Y328F 変異型 M624 A72E/F113Y/T21 OL/1157L/Y328F 変異型 M625 A72E/F113Y/A233D/I157L/Y328F 変異型 M626 A72E/I157L/G161A/F162L/Y328F 変異型 M627 A72E/I157L/W187F/F211W/Y328F 変異型 M628 A72E/I157L/A204S/F211W/Y328F 変異型 M629 A72E/I157L/A204T/F211W/Y328F 変異型 M630 A72E/I157L/F211W/Y328F/L340V 変異型 M631 A72E/I157L/F211W/Y328F/V439P
変異型 M632 A72E/I157L/G226A/F211W/Y328F
変異型 M633 A72E/I157L/A233D/F211W/Y328F
変異型 M634 Y81A/S84D/I157L/T210L/Y328F
変異型 M635 Y81A/1157L/A 184G/W 187F/ Y328F
変異型 M636 Y81A/1157L/A184G/W187F/T21 OL
変異型 M637 Y81A/1157L/A233D/T21 OL/Y328F
変異型 M638 F88E/1157L/A184G/W187F/T21 OL
変異型 M639 F 113Y/1157L/Y159N/F211 W/Y328F
変異型 M640 1157L/A 184G/W 187F/T21 OL/ Y328F
変異型 M641 P70T/1157L/A 184G/W 187F/T210L/Y328F 変異型 M642 Y81A/1157L/A184G/W187F/T21 OL/Y328F
〔56〕 上記〔55〕に記載の変異型タンパク質において、前記変異型 Mlから M642 のいずれか 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異部位以外の部位 に置換、欠失、挿入、付加および逆位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸 の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タ ンパク質。
[57] 少なくとも変異型 M241を含むことを特徴とする、上記〔55〕から〔56〕のいず れか一項に記載の変異型タンパク質。
[58] 少なくとも変異型 M340を含むことを特徴とする、上記〔55〕から〔57〕のいず れか一項に記載の変異型タンパク質。
〔59〕 少なくとも変異型 M412を含むことを特徴とする、上記〔55〕から〔58〕のいず れか一項に記載の変異型タンパク質。
〔60〕 少なくとも変異型 M491を含むことを特徴とする、上記〔55〕から〔59〕のいず れか一項に記載の変異型タンパク質。
〔61〕 少なくとも変異型 M496を含むことを特徴とする、上記〔55〕から〔60〕のいず れか一項に記載の変異型タンパク質。
〔62〕 少なくとも変異型 M581を含むことを特徴とする、上記〔55〕から〔61〕のいず れか一項に記載の変異型タンパク質。
〔63〕 少なくとも変異型 M582を含むことを特徴とする、上記〔55〕から〔62〕のいず れか一項に記載の変異型タンパク質。
〔64〕 少なくとも変異型 M594を含むことを特徴とする、上記〔55〕から〔63〕のいず れか一項に記載の変異型タンパク質。
〔65〕 上記〔18〕から〔64〕の 、ずれか一項に記載の変異型タンパク質が有するアミ ノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
〔66〕 上記〔65〕に記載のポリヌクレオチドを含む組換えポリヌクレオチド。
〔67〕 上記〔66〕に記載の組換えポリヌクレオチドを含む形質転換微生物。
〔68〕 上記〔67〕に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および Zまた は微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させることを特徴とする、変異型タンパク 質の製造方法。
〔69〕 上記〔18〕から〔64〕の 、ずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、 ペプチド生成反応を行うことを特徴とする、ペプチドの製造方法。
〔70〕 上記〔67〕に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および Zまた は形質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させてペプチド生成反応を行う ことを特徴とする、ペプチドの製造方法。
〔71〕 上記〔18〕から〔64〕の 、ずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、 Lーァスパラギン酸一 α , βージエステルと L—フエ-ルァラニンとの反応を行うことを 特徴とする、 a Lーァスバルチルー L フエ-ルァラニン 13 エステルの製造方 法。
[72] 上記〔67〕に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および Zまた は形質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させて、 L—ァスパラギン酸— a , j8—ジエステルと L フエ-ルァラニンとの反応を行うことを特徴とする、 a— L— ァスバルチルー L—フエ-ルァラニン β エステルの製造方法。
発明の効果
本発明によれば、ペプチド生成活性に優れたタンパク質および効率のよ!、ペプチド の製造方法が提供される。 発明を実施するための最良の形態
[0010] 以下、本発明の実施の形態についてその最良の形態と共に説明する。
なお、以下に挙げる種々の遺伝子工学的な技法については、 Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)、細胞工学ハンドブック、黒木登 志夫ら編、羊土社 (1992)、新遺伝子工学ハンドブック改訂第 3版、村松ら編、羊土社 (1999)など、多くの標準的な実験マニュアルがあり、これらの文献を参考にすること により当業者であれば実施可能である。
[0011] 本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、核酸、塩基配列などの略号による表示は、 IU PAC (International Union of Pure and Applied Chemistryノま 7こ ίま IUBMB (Intern ational Union of Biochemistry and Molecular Biology)による規疋、「塩基酉己歹 U 又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編） および当該分野における慣用記号に従うものとする。また、本明細書において、配列 番号を示すものは、特に断りのない限り、配列表中の配列番号を示すものとする。尚 、グリシン以外のアミノ酸に関し、 D—アミノ酸または Lアミノ酸であることを明記しない 場合、 L アミノ酸を示すものとする。
[0012] 1.本発明のペプチド生成活性を有するタンパク質 (配列番号 2に記載のアミノ酸配 列に基づく変異型タンパク質）
本発明のタンパク質は、配列番号 2に記載のアミノ酸配列に対し下記変異型 1から 68のいずれか 1種または 2種以上の変異が導入されたアミノ酸配列を有する変異型 タンパク質であり、ペプチド生成活性を有する（以下、「(1)の変異型タンパク質」とも いう）。変異型 1から 68の各変異型は表 1 1及び表 1 2に示すとおりである。
[0013] [表 1-1]
Figure imgf000057_0001
l7Ci0/S00Zdf/X3d 99 9817S.0/900Z OAV [0014] [表 1-2]
表 1一 2 :変異型
Figure imgf000058_0001
[0015] 本明細書において各変異型は、表 1 1及び表 1 2に示すようにアミノ酸残基の 略号および配列番号 1または 2に示すアミノ酸配列中の部位より特定する。例えば、 変異型 1の「F207V」とは、配列番号 2の配列の第 207番目のアミノ酸残基フエ-ル ァラニンをパリンに置換したことを示す。すなわち、変異型の表記は、野生型 (配列番 号 2で特定されるアミノ酸)のアミノ酸残基の種類;配列番号 2に記載のアミノ酸配列 におけるアミノ酸残基の位置;変異導入後のアミノ酸残基の種類を示す。他の変異型 の表記も同様である。 [0016] 変異型 1から 68の変異は 1種のみを導入しても、 2種以上を組み合わせて導入して もよい。また、変異型 1から 68の変異は、そのうちの 1種または 2種以上を、表 1—1及 び表 1—2以外の変異型、例えば、 V184N, Q229P, Q229L, Q229G, Q229I, I 228G、 I228L, I228D, I228S, I230D、 I230V、 I230S、 S256C, A301G、 L6 6F、 E80K、 Y81A、 I157L、 V178G、 A182G、 A182S、 P183A、 V184P、 T18 5F、 T185A、 T185K、 T185T185D, T185C、 T185S、 T185P、 T185N、 T21 OL、 V213A、 P214T、 P214H、 A245S、 L263M、 K314R、 S315R、 Y328F、 K484I、及び A515Vの変異力も選ばれる 1種または 2種以上と組み合わせて導入し てもよい。具体的には下記表 1 3及び表 1 4に示すような組み合わせが好適であ る。また少なくとも変異型 2 : Q441Eを含む変異型タンパク質、少なくとも変異型 14 : T72Aを含む変異型タンパク質がペプチド生成活性を向上させる上で好適である。 更に、 M7— 35、及び M35—4+V184A (Al)の組み合わせを含む変異型タンパ ク質も、ペプチド生性活性を向上させる上で好適である。
[0017] [表 1-3]
Figure imgf000060_0001
Figure imgf000060_0002
00l7CZ0/S00Zdf/X3d 89 98^S.0/900Z OAV 表 1 _ 4 :変異型（2種以上の組み合わせ)
Figure imgf000061_0001
M7-35 A301V+L439V+A537G+N607K
M35-4/V184A =A1 T72A+A137S+Q229P+V2571 +A301V+A324V+L439V+Q441 E +A537G+N607K+V184A 本発明の変異型タンパク質は、優れたペプチド生成活性を有する。すなわち、配列 番号 2のアミノ酸配列を有する野生型のタンパク質と比べ、ペプチド生成反応を触媒 する能力について優れた性能を有する。より具体的には、本発明の変異型タンパク 質はそれぞれ、特定のカルボキシ成分及びアミン成分からペプチドを生成する際の 反応速度または収率、あるいは基質特異性、 pH特性、温度安定性など、ペプチド生 成反応を行うために求められる何らかの特性について、野生型タンパク質よりも性能 が向上している（具体的には下記実施例参照)。そのため本発明の変異型タンパク 質は、ペプチドの工業的生産において好適に用い得る。好ましい変異型タンパク質 の一形態として、例えば、野生型タンパク質によるペプチド生成濃度を「1」とした場合 の変異型タンパク質によるペプチド生成濃度力 好ましくは 1. 3倍以上、より好ましく は 1. 5倍以上、さらに好ましくは 2倍以上生成させる能力を有するものが例示される。
[0020] なお、本明細書にお!、て、ペプチド生成活性とは、 2つ以上の物質から、ペプチド 結合を形成させてペプチド結合を有する新たな化合物を生成する活性であり、より具 体的には、例えば 2つのアミノ酸またはそのエステルなどから、少なくとも 1つペプチド 結合を増やしたペプチドィ匕合物を生成する活性を 、う。
[0021] 変異型 1から 68、変異型 239から 290および 324から 377に示す変異の導入は、 例えば部位特異的変異法によって、配列番号 2のアミノ酸配列を有するタンパク質を コードする遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換されるように塩基配列を改変するこ とによって得られる。配列番号 2のアミノ酸配列における変異部位に対応する塩基配 列は、配列番号 1を参照することにより容易に確認できる。また、上記のような改変さ れた塩基配列によりコードされるポリペプチドは、従来知られている突然変異処理に よっても取得され得る。突然変異処理としては、例えば (A)のタンパク質をコードする DNAをヒドロキシルァミン等でインビトロ処理する方法、 Error— prone PCRにより 変異を導入する方法、及び変異修復系の欠損した宿主中で該 DNAを増幅し、変異 の導入された DNAを回収する方法などが挙げられる。
[0022] また、本発明により、上記変異型 1から 68、並びに変異型 239から 290および 324 力も 377に示す 1種または 2種以上の変異を含む変異型タンパク質と実質的に同じタ ンパク質も提供される。すなわち、本発明は、変異型 1から 68、並びに変異型 239か ら 290および 324から 377の変異型を 1種または 2種以上含む変異型タンパク質にお いて、前記変異部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位力 なる群よ り選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ぺプ チド生成活性を有する変異型タンパク質 (以下、「 (II)の変異型タンパク質」とも!/、う） も提供するものである。すなわち、本発明の変異型タンパク質は、配列番号 2に示す アミノ酸の変異型 1から 68、並びに変異型 239から 290および 324から 377の変異部 位以外の部位における変異を許容する。したがって、変異型 1から 68、並びに変異 型 239から 290および 324から 377の変異部位以外の部位に欠失、挿入などの変異 が導入された場合、変異型 1から 68、並びに変異型 239から 290および 324から 37 7によって特定される部位力もの N末端または C末端までのアミノ酸残基数は、変異 導入前の状態とは異なることがあり得る。
[0023] ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類に よっても異なるが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない 範囲のものであり、具体的には、 2〜50個、好ましくは 2〜30個、さらに好ましくは 2〜 10個である。ただし、異型 1から 68、並びに変異型 239から 290および 324から 377 以外の変異部位を含む変異型タンパク質の場合には、 50°C、 pH8の条件下で、変 異型 1から 68、並びに変異型 239から 290および 324から 377の 1種または 2種以上 の変異を含むタンパク質 (すなわち (I)の変異型タンパク質)の半分程度以上、より好 ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上のペプチド 生成活性を保持して ヽることが望ま 、。
[0024] 変異型 1から 68、並びに変異型 239から 290および 324から 377以外の変異も、例 えば部位特異的変異法によって、本タンパク質をコードする遺伝子の特定の部位の アミノ酸が置換、欠失、挿入、付加、逆位などされるように塩基配列を改変することに よって得られる。また、上記のような改変された塩基配列によりコードされるポリべプチ ドは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理として は、（I)の変異型タンパク質をコードする DNAをヒドロキシルァミン等でインビトロ処理 する方法、及び (I)の変異型タンパク質をコードする DNAを保持するェシエリヒア属 細菌を、紫外線照射または N メチル N' -トロー N -トロソグァ-ジン (NTG) もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方 法が挙げられる。
[0025] また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、および逆位等の変異には、微 生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異 を有する DNAを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより 、配列番号 2に記載のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードする DNAが 得られる。
[0026] 2.配列番号 208に記載のアミノ酸配列に基づく変異型タンパク質の設計'作製
本発明者は、上記した変異型タンパク質に更に変異を加えることにより、ペプチド生 成活性に優れる変異型ペプチドを設計、作製することができることを見出した。特に、 M35— 4ZV184A変異型 (A1) (変異型 286；表 1— 3参照）に更に変異をカ卩えるこ とにより、顕著なペプチド生成活性を発揮する変異型ペプチドを得られることを見出 した。本発明は、このような M35— 4ZV184A変異型 (A1)に基づく変異型タンパク 質の設計'作製方法についても提供するものである。
[0027] M35—4ZV184Aに対応するアミノ酸配列は、配列表の配列番号 208に示すと おりである。すなわち、配列番号 208記載のアミノ酸配列は、配列番号 2記載のァミノ 酸配列において、 M35— 4ZV184A変異型 (表 1— 3参照）に対応する 11箇所のァ ミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたものである。
[0028] 変異型タンパク質の設計'作製は、 X線結晶構造解析によるタンパク質の立体構造 決定と、決定された構造情報に基づいて行なうことができる。すなわちタンパク質を X 線結晶構造解析して得られた立体構造を基にして、基質結合部位を推定し、当該タ ンパク質の基質結合部位の少なくとも一部分に変化を生じさせることにより、ペプチド 生成活性を有する変異型タンパク質を設計'作製を行なう。
[0029] X線結晶構造解析によるタンパク質の立体構造決定は、例えば、以下の手順に沿 つて行うことができる。
[0030] ( 1)蛋白質を結晶化する。結晶化は、立体構造決定のためには欠力せないが、それ 以外にも、蛋白質の高純度の精製法、高密度でプロテアーゼ抵抗性の強い安定な 保存法として産業上の有用性もある。
[0031] (2)作製した結晶に X線を照射して回折データを収集する。なお、蛋白質結晶は X線 照射によりダメージを受け回折能が劣化するケースが多々ある。その場合、結晶を急 激にー 173°C程度に冷却し、その状態で回折データを収集する低温測定技術が最 近普及してきた。なお、最終的に、構造決定に利用する高分解能データを収集する ために、輝度の高いシンクロトロン放射光が利用される。
[0032] (3)続いて、結晶構造解析を行なう。結晶構造解析を行うには、回折データに加えて 、位相情報が必要になる。例えば、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタン パク質は、類縁の蛋白質の結晶構造として exアミノ酸エステル加水分解酵素の S20 5A変異体（Protein Data Bankのエントリー番号： 1NX9)が公知であるため、分 子置換法で構造決定することが可能である。このようにして決定された位相を用いて 計算した電子密度図に蛋白質のモデルをフィットさせる。このプロセスは、コンビユー ターグラフィックス上で、 MSI社 (アメリカ）の QUANTA等のプログラムを用いて行わ れる。この後、 MSI社の CNX等のプログラムを用いて、構造精密化を行い、構造解 析は完了する。
上述の処理の結果解析された立体構造に基づき、蛋白質の基質結合部位を推定 することができる。ここで、基質結合部位とは、タンパク質表面上の基質 (例えば、ぺ プチド生成活性を有する蛋白質の場合、アミノ酸やアミノ酸エステルなど）が相互作 用する部位を意味し、一般にタンパク質の活性中心の周囲に存在する。
[0033] 本発明の設計 ·作成方法においては、結晶構造解析の対象として、配列番号 208 に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を用いる。配列番号 208に記載のアミノ酸 配列を有するタンパク質とは、既に述べたように、変異型タンパク質 M35— 4ZV18 4Aを意味する。すなわち、配列番号 208記載のアミノ酸配列は、前述の配列番号 2 に記載のアミノ酸配列中、表 1— 3に記載される M35— 4ZV184Aに対応する 11箇 所のアミノ酸残基が所定のアミノ酸残基に置換されたほかは同様のものである。
[0034] 一方、配列番号 209に記載のアミノ酸配列と配列番号 208に記載のアミノ酸配列の 相同性は非常に高ぐ 4個のアミノ酸残基が置換されているにすぎない。従って、配 列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を結晶構造解析し、得られる立 体構造を参考にして、配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の基 質結合部位を推定することができる。配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタ ンパク質の基質結合部位は、上述の配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタ ンパク質の構造解析の結果から、活性残基であるセリン (配列番号 208に記載のアミ ノ酸配列の 158番目、以下「Serl58」と略記することがある。図 5中の「活性部位」参 照)から 15 A以内の領域と推定された。
[0035] 本発明の設計 ·作成方法においては、上述のようにして推定された基質結合部位 の少なくとも一部分に変化を生じさせることにより、ペプチド生成活性の向上した変異 体をを得ることができる。ここで、基質結合部位の少なくとも一部分に変化を生じさせ るとは、変化を生じさせた後の変異型タンパク質がペプチド生成活性を有することを 条件として、基質結合部位を構成するアミノ酸残基のうちの一残基以上を改変するこ と、特に、置換、挿入または削除すること、好ましくは他のアミノ酸残基に置換すること を意味する。改変の対象となるアミノ酸の数は、アミノ酸残基の位置や種類によっても 異なるが、得られる変異型タンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲で 適宜定めることができる。
[0036] 例えば、配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質から、ペプチド生 成活性を有する変異型タンパク質を得るためには、当該タンパク質の活性残基 Serl 58から 15A以内の少なくとも一部分、すなわち、配列番号 208に記載のアミノ酸配 列中 67— 70、 72— 88、 100、 102、 103、 106、 107、 113— 117、 130、 155 - 16 3、 165、 166、 180—188、 190—195、 200— 235、 259、 273、 276、 278、 292 — 294、 296、 298、 299、 300— 304、 325— 328、 330— 340、及び 437— 447の アミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基を置換、挿入または 削除させた構造とすることによることができる。具体的には、上述のアミノ酸残基のうち の少なくとも一残基について他のアミノ酸残基に置換することにより、所望の変異型タ ンノク質を得ることができる。
[0037] 特【こ、酉己歹 U番号 208【こ記載のアミノ酸酉己歹 U中 67、 69、 70、 72— 85、 103、 106、 1 07、 113— 116、 165、 182、 183、 185、 187、 188、 190、 200、 202、 204— 206 、 209— 211、 213— 235、 301、 328、 338— 340、 440—442、及び 446のァミノ 酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除さ れた変異型タンパク質は、ペプチド生成活性が高ぐ特に AMP生成活性が向上して いる。具体的には、 A1変異型タンパク質に対する AMPの収率向上確率で 20%以 上である。
[0038] また、配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 67、 69、 70、 72— 84、 106、 107、 1 14、 116、 183、 185、 187、 188、 202、 204— 206、 209、 211、 213— 233、 235 、 328、 338— 442、及び 446のアミノ酸残基力 S存在する位置の少なくとも一以上の アミノ酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型 タンパク質は、ペプチド生成活性が高ぐ特に AMP生成活性が向上している。具体 的には、 A1変異型タンパク質に対する AMPの収率向上確率で 30%以上である。
[0039] 更【こ、酉己歹 U番号 208【こ記載のアミノ酸酉己歹 U中 67、 70、 72— 75、 77— 79、 81— 84 、 114、 116、 185、 188、 202、 204、 206、 209、 211、 213— 215、 218— 224、 2 26— 233、 235、 328、 338—441、及び 446のアミノ酸残基力存在する位置の少な くとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性 を有する変異型タンパク質は、ペプチド生成活性が高ぐ特に AMP生成活性が向上 している。具体的には、 A1変異型タンパク質の AMPの収率向上確率で 40%以上 である。
[0040] 尚、設計される変異型タンパク質は、その一次配列（すなわち、アミノ酸配列）にお いて、 A1変異型タンパク質とある程度の相同性を有することが好ましい。相同性の程 度は、例えば 25%以上、より好ましくは 50%以上、さらに好ましくは 80%以上、特に 好ましくは 90%以上とすることができる。
[0041] 上記した範囲のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一部分を変化させること、 すなわち、アミノ酸残基の一つを置換することにより、ペプチド生成活性の向上した変 異型タンパク質を見出すことができる。また、活性の向上をもたらした個々の変異を組 み合わせることにより、それらの相乗効果によって、更に活性の向上した変異型タン ノ^質^ ilj出することができる。一方で、変異によるペプチド生成活性の向上の程度 は、アミノ酸残基の側鎖が 1原子分変化しただけでも劇的な変化が生じる場合があり 、その最適化には様々な可能性がある。例えば、ある一部位の変異により活性の向 上した部位が発見されたならば、立体構造上でその部位に連続する数残基にランダ ム変異をかけることにより、更に活性の向上した変異体を得ることも可能である。すな わち、ペプチド生成活性の向上をもたらすアミノ酸残基の立体構造上の位置と連続し た表面を構成する位置のうちの少なくとも一部分を変化させることにより、ペプチド生 成活性を有する変異型タンパク質を得ることができる。
[0042] タンパク質の表面は、構成各原子をその van der Waals半径の球として表したと きに、溶媒に露出している部分の包絡面であり、例えば図 4に示すような空間充填図 によって図示できる。ここで、配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質 中、ペプチド生成活性の向上をもたらすアミノ酸残基の立体構造上の位置と連続し た表面を構成する位置とは、例えば、配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 67— 70 、 72— 88、 100、 102、 103、 106、 107、 113— 117、 130、 155— 163、 165、 16 6、 180—188、 190—195、 200— 235、 259、 273、 276、 278、 292— 294、 296 、 298、 299、 300— 304、 325— 328、 330— 340、及び 437— 447のうちのいず れかのアミノ酸残基が存在する位置のうちの 2以上の位置のように、上記に説明した タンパク質表面上で連続したパッチを形成する部分である。具体的には例えば、配 列番号 208に記載のアミノ酸配列中 79— 82のアミノ酸残基が存在する位置は、図 4 中の灰色で示した部分に相当する。具体的には、以下の（a)〜(i)の中力も選ばれる 1または 2以上の立体構造の変化を生じさせることによりペプチド生成活性を有する 変異型タンパク質を得ることができる。
(a)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 79— 82のアミノ酸残基が存在する位置の 少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(b)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 84、 88、 89及び 92のアミノ酸残基が存在 する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(c)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 72、 75及び 77のアミノ酸残基が存在する 位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(d)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 159、 161、 162、 184、 187及び 276の アミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または 削除
(e)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 70、 106、 113、 115、 193、 207、 209 - 212、 216及び 259のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残 基の置換、挿入または削除
(f)配列番号 208に記載のア 酸配列中 200、 202— 205、 207及び 228のア 酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(g)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 233、 234、及び 439のアミノ酸残基が存 在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(h)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 328、 339、 340、 445、及び 446のァミノ 酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(i)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 87、 155、 157、及び 160のアミノ酸残基 が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除 [0043] 3.配列番号 208記載の変異型タンパク質以外のタンパク質力もの変異型タンパク質 の設計、作製
上述した X線結晶構造解析によって得られた配列番号 209に記載のアミノ酸配列 を有するタンパク質の立体構造は、配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタン パク質以外のタンパク質からの変異型タンパク質の設計、作製にも応用できる。本発 明は、このような他のタンパク質に由来する配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有 するタンパク質と同様またはそれ以上のペプチド生成活性を有する変異型タンパク 質をも提供するものである。
[0044] 配列番号 208記載のアミノ酸配列を有するタンパク質以外のタンパク質からの変異 型タンパク質の設計、作製は、トレッデイング (Threading)法により、配列番号 209に 記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 3次元構造に対するアラインメントを行ない 、配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と同様のアミノ酸変異を施 すことによる。尚、既に述べたように、配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタ ンパク質と、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、 3箇所のアミ ノ酸残基が異なっているだけであり、その 3次元構造は殆ど同一であると考えてよい。
[0045] トレッデイング法を利用した変異導入の対象となるタンパク質は、配列番号 208に記 載のアミノ酸配列を有するタンパク質以外のタンパク質であり、特に、ペプチド生成活 性を有するタンパク質であることが好ましい。更に、アミノ酸配列が既知のタンパク質 を用いることが好ましい。また、変異導入の対象となるタンパク質は、その立体構造を 、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有する変異型タンパク質の立体構造と比較 した場合に、類似の立体構造を有するものであることが好ましい。ここで、立体構造が 類似するとは、タンパク質の 2次元構造、 3次元構造が類似していることを意味し、具 体的には、アミノ酸残基間の距離、ペプチドを構成する主鎖や側鎖の角度の類似を 意味する。
[0046] 配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質以外のタンパク質力 配列 番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と類似の立体構造を有するか否 かの判定には、トレッデイング (Threading)法を利用することができる。トレッデイング 法とは、あるアミノ酸配列がどのような立体構造をとるかを、データベース中の既知の 立体構造との類似性で評価し、予測する方法である（Science第 253卷、第 164〜 170頁（1991) )。
[0047] トレッデイング法による立体構造の類似性の判断及び評価は、対象タンパク質のァ ミノ酸配列を、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造に 乗せて、二次構造のとり易さ等に関して、両者の適合度を定量ィ匕する目的関数を算 出し、その結果を比較検討して行うことができる。ここで、配列番号 209に記載のアミ ノ酸配列を有するタンパク質の立体構造（3次元構造)のデータ (座標）としては、図 6 — 1〜図 6— 134に記載のデータを用いることができる。
[0048] トレッデイング法は、 INSIGHT II、 LIBRAなどのプログラムにより実行が可能であ る。 INSIGHT IIは、米国 Accelrys社より購入可能である。 INSIGHT IIでトレツ ディング法を実施するには、同プログラム中の SeqFoldモジュールを利用することが できる。一方、 LIBRAは、インターネットを使って、 DDBJのホームページのアドレス（ http： / Z www. ddbj. nig. ac. jpz search/ libra― ι— j. html)にフクセスして 使用することができる。
[0049] あるタンパク質が配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構 造と類似性を有するカゝ否かを判定する基準としては、例えば INSIGHT II-SeqFo Idを用いる場合には、トレッデイング法による評価関数をすベて総合して算出した総 合評価値（SeqFold Total Score (bits) )を用いることが好ましい。 SeqFold Tot al Score (bits)を算出することにより、タンパク質の立体構造が全体的に類似して V、るかどうかを判定することができる。プログラム SeqFoldを用いてトレッデイング法を 実施すると、 SeqFold (LIB) P— Valueゝ SeqFold (LIB) P -Value, SeqFold ( LEN) P— Value、 SeqFold (LOW) P -Value, SeqFold (High) P -Value, SeqFold Total Score (raw)、 SeqFold Alignment Score (raw)等の各種の 評価値が算出されるが、 SeqFold Total Score (bits)は、これらの評価値をすベ て総合して算出した総合評価値であり、 SeqFold Total Score (bits)の値が大き V、ほど、対比して 、る 2つのタンパク質の立体構造の類似性が高 、ことを意味する。 例えば、 INSIGHT IIを用いてトレッデイング法を実施した場合、配列番号 209に記 載のアミノ酸配列を有するタンパク質と類似した立体構造を有するタンパク質であると 判断する際の閾値としては、 SeqFold Total Score (bits)の値にして、 90程度が 妥当と考えられる。すなわち、 SeqFold Total Score (bits)が 90以上であれば、 配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造と他のタンパク質 の立体構造が類似性を有していると判定できる。より好ましい閾値としては、 SeqFol d Total Scoreの値にして 110以上、更に好ましくは 130以上であり、特に好ましく は 150以上である。
[0050] 他のタンパク質が配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と類似の 立体構造を有すると判定された場合、他のタンパク質のアミノ酸配列において、配列 番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の活性残基 Serl58から 15A以 内に存在するアミノ酸残基に対応する、アミノ酸残基を特定する。 目的とするアミノ酸 残基の特定は、前記したトレッデイング法による 3次元構造の類似性の判定の過程で 得られる、 目的のタンパク質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク 質の 3次元構造に対するアラインメントによって、行なうことができる。
[0051] 本発明の設計 ·作成方法においては、配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有す るペプチド以外のペプチドの場合にも同様に、上記のようにして推定された基質結合 部位の少なくとも一部分に変化を生じさせることにより、ペプチド合成活性の向上した 変異型タンパク質を見出すことができる。活性の向上した個々の変異を組み合わせ ることにより、その相乗効果によって、更に活性の向上した変異体を創出することがで きる。ここで、基質結合部位の少なくとも一部分に変化を生じさせるとは、変化を生じ させた後の変異型タンパク質がペプチド生成活性を有することを条件として、基質結 合部位を構成するアミノ酸残基のうちの一残基以上を改変すること、特に、置換、挿 入または削除すること、好ましくは他のアミノ酸残基に置換することを意味する。改変 の対象となるアミノ酸の数は、アミノ酸残基の位置や種類によっても異なる力 得られ る変異型タンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲で適宜定めることが できる。
[0052] 例えば、当該タンパク質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質 との 3次元構造とが、トレッデイング法による判定の際に得られるアラインメントにおい て、酉己歹 IJ番号 209【こ記載のアミノ酸酉己歹 IJ中 67— 70、 72— 88、 100、 102、 103、 10 6、 107、 113— 117、 130、 155— 163、 165、 166、 180—188、 190—195、 200 — 235、 259、 273、 276、 278、 292— 294、 296、 298、 299、 300— 304、 325- 328、 330— 340、及び 437— 447のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在す る位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除 された構造とすること〖こよることができる。具体的には、アラインメントの結果上述のァ ミノ酸残基に対応する（重なり合う）位置のアミノ酸残基のうちの少なくとも一残基につ いて他のアミノ酸残基に置換することにより、所望の変異型タンパク質を得ることがで きる。
[0053] 尚、設計される変異型タンパク質は、その一次配列において、配列番号 207に記 載のアミノ酸配列を有するタンパク質の変異型タンパク質とある程度の相同性を有す ることが好ましい。相同性の程度は、例えば 25%以上、より好ましくは 50%以上、さら に好ましくは 80%以上、特に好ましくは 90%以上とすることができる。
[0054] 上記した範囲のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一部分を変化させること、 すなわち、アミノ酸残基の一つを置換することにより、ペプチド生成活性の向上した変 異型タンパク質を見出すことができる。また、活性の向上をもたらした個々の変異を組 み合わせることにより、それらの相乗効果によって、更に活性の向上した変異型タン ノ^質^ ilj出することができる。一方で、変異によるペプチド生成活性の向上の程度 は、アミノ酸残基の側鎖が 1原子分変化しただけでも劇的な変化が生じる場合があり 、その最適化には様々な可能性がある。例えば、ある一部位の変異により活性の向 上した部位が発見されたならば、立体構造上でその部位に連続する数残基にランダ ム変異をかけることにより、更に活性の向上した変異体を得ることも可能である。すな わち、ペプチド生成活性の向上をもたらすアミノ酸残基の立体構造上の位置と連続し た表面を構成する位置のうちの少なくとも一部分を変化させることにより、ペプチド生 成活性を有する変異型タンパク質を得ることも可能である。
[0055] ここで、配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質以外のタンパク質 における、ペプチド生成活性の向上をもたらすアミノ酸残基の立体構造上の位置と 連続した表面を構成する位置とは、当該タンパク質と配列番号 209に記載のアミノ酸 配列を有するタンパク質の 3次元構造とのアラインメントをトレッデイング法により行つ たときに、酉己歹 IJ番号 209に記載のアミノ酸酉己歹 IJ中 67— 70、 72— 88、 100、 102、 10 3、 106、 107、 113— 117、 130、 155— 163、 165、 166、 180—188、 190—195 、 200— 235、 259、 273、 276、 278、 292— 294、 296、 298、 299、 300— 304、 325— 328、 330— 340、及び 437— 447のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基力 S 存在する位置同士を基準として、基質結合部位 (Serl 58)方向に向力 表面 (平面） を構成する位置を意味する。具体的には、下の（a')〜(r)の中から選ばれる 1また は 2以上の変化を生じさせることにより、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質 を得ることができる。
配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 79— 82のアミノ酸残基に対応するアミ ノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換 、挿入または削除
( ）配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 84、 88、 89及び 92のアミノ酸残基に 対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のァミノ 酸残基の置換、挿入または削除
( ）配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 72、 75及び 77のアミノ酸残基に対応 するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残 基の置換、挿入または削除
( 配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 159、 161、 162、 184、 187及び 276 のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくと も一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(e 配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 70、 106、 113、 115、 193、 207、 20 9— 212、 216及び 259のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立 体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(Γ)配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 200、 202— 205、 207、及び 228のァ ミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一 以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(g 酉己歹 U番号 209【こ記載の ミノ酸酉己歹 U中、 233、 234、及び 439の ミノ酸残基【こ 対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち少なくとも一以上のアミノ酸 残基の置換、挿入または削除
( ）配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 328、 339、 340、 445、及び 446のァ ミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一 以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(i')配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 87、 155、 157、及び 160のアミノ酸残 基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のァ ミノ酸残基の置換、挿入または削除
また、当該タンパク質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 一次配列とのアラインメントもしくは当該タンパク質と配列番号 209に記載のアミノ酸 配列を有するタンパク質の 3次元構造とのアラインメントを行ったときに、一次配列の 相同性が 25%以上であるものにおいて、以下の（a~)〜（ΓΊの中力 選ばれる 1ま たは 2以上の変化を生じさせることによつても、ペプチド生成活性を有する変異型タン ノ ク質を得ることがでさる。
(a' ' )配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 79— 82のアミノ酸残基に対応するァ ミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置 換、挿入または削除
(b~)配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 84、 88、 89及び 92のアミノ酸残基に 対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のァミノ 酸残基の置換、挿入または削除
( 配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 72、 75及び 77のアミノ酸残基に対応 するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残 基の置換、挿入または削除
(dつ配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 159、 161、 162、 184、 187及び 27 6のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なく とも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(eつ配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 70、 106、 113、 115、 193、 207、 20 9— 212、 216及び 259のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立 体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除 (ΓΊ配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 200、 202— 205、 207、及び 228の アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも 一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(g~)配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 233、 234、及び 439のアミノ酸残基 に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち少なくとも一以上のァミノ 酸残基の置換、挿入または削除
(hつ配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 328、 339、 340、 445、及び 446の アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも 一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(门配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 87、 155、 157、及び 160のアミノ酸残 基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のァ ミノ酸残基の置換、挿入または削除
[0057] 4.本発明のペプチド生成活性を有するタンパク質 (配列番号 208記載のアミノ酸配 列に基づく変異型タンパク質）
本発明のタンパク質は、上記項目 2, 3にて説明した設計 ·作製方法により設計 '作 成される変異型タンパク質、具体的には、配列番号 208に記載のアミノ酸配列に対し 下記変異型 L1から L335のいずれか 1種または 2種以上の変異、もしくは、下記変異 型 Mlから M642が導入されたアミノ酸配列を有する変異型タンパク質であり、ぺプ チド生成活性を有する（以下、「 (Γ)の配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有する タンパク質の変異型タンパク質」ともいう）。変異型 L1から L335、および変異型 Mlか ら M642の各変異型は表 2— 1〜2— 19に示すとおりである。
[0058] [表 2-1] 表 2-1
変異型 異体 変異型 L1 N67K 変異型し 2 N67L 変異型 L3 N67S 変異型し 4 T69I 変異型し 5 T69M 変異型し 6 T69Q 変異型 L7 T69R 変異型 L8 T69V 変異型 L9 P70G 変異型 L10 P70N 変異型 L1 1 P70S 変異型 L12 P70T 変異型 L13 P70V 変異型 L14 A72C 変異型 L15 A72D 変異型 L16 A72E 変異型 L1 7 A72I 変異型 L18 A72L 変異型 L19 A72M 変異型 L20 A72N 変異型 L21 A72Q
A72S 変異型 L23 A72V 変異型 L24 V73A 変異型 L25 V73I 変異型 L26 V73L 変異型 L27 V73M 変異型 L28 V73N 変異型 L29 V73S 変異型 L30 V73T 変異型 L31 S74A 変異型 L32 S74F 変異型し 33 S74K 変異型 L34 S74N 変異型 L35 S74T 変異型 L36 S74V 変異型 L37 P75A 変異型し 38 P75D 変異型 L39 P75L 変異型 L40 P75S 変異型し 41 Y76F 変異型 L42 Y76H 変異型 L43 丫 761 変異型 L44 Y76V 変異型 L45 Y76W 異型|_46 G77A 変異型 L47 G77F 変異型 L48 G77K 変異型 L49 G77M 変異型 L50 G77N 変異型 L51 G77P 変異型 L52 G77S 変異型 L53 G77T [0059] [表 2- 2]
表 2-2
変異型 変異体 変異型し 54 Q78F 変異型 L55 Q78L 変異型 L56 N79D 変異型 L57 N79L 変異型 L58 N79R 変異型 L59 N79S 変異型 L60 E80D 変異型 L61 E80F 変異型 L62 E80L 変異型 L63 E80P 変異型し 64 E80S 変異型 L65 Y81 A 変異型 L66 Y81 C 変異型 L67 Y81 D 変異型 L68 Y81 E 変異型し 69 Y81 F 変異型し 70 Y81 H 変異型し 71 Y81 K 変異型 L72 Y81 L 変異型 L73 Y81 N 変異型 L74 Y81 S 変異型し 75 Y81 T 変異型し 76 Y81 W 変異型 L77 K82D 変異型 L78 K82L 変異型し 79 K82P 変異型 L80 K82S 変異型 L81 K83D 変異型 L82 K83F 変異型 L83 K83L 変異型 L84 K83P 変異型 L85 K83S 変異型 L86 K83V 変異型 L87 S84D 変異型 L88 S84F 変異型 L89 S84K 変異型し 90 S84L 変異型し 91 S84N 変異型 L92 S84Q 変異型 L93 L85F 変異型 L94 L85I 変異型 L95 L85P 変異型し 96 L85V 変異型 L97 N87E 変異型し 98 N87Q 変異型 L99 F88E 変異型 L100 V103I 変異型 L101 V103L 変異型 L102 K106A 変異型 L103 K106F 変異型 L104 K106L 変異型 L105 K106Q 変異型 L106 K106S 変異型 L107 W107A [0060] [表 2- 3]
2 - 3
変異型 変異体 変異型 L108 W107Y 変異型 L109 F113A 変異型 L110 F113W 変異型 L111 F113Y 変異型 L112 E114A 変異型 L113 E114D 変異型 L114 D115E 変異型 L115 D115Q 変異型 L116 D115S
¾=S¾L117 I116F 変異型 L118 I116K 変異型 L119 I116L 変異型 L120 I116M 変異型し 121 I116N 変異型 L122 I116T 変異型 L123 I116V 変異型 L124 I157K 変異型 L125 I157L 変異型 L126 Y159G 変異型 L127 Y159N 変異型 L128 Y159S 変異型 L129 P160G 変異型 L130 G161A 変異型 L131 F162L 変異型 L132 F162Y 変異型 L133 Y163I 変異型 L134 T165V 変異型 L135 Q181F 変異型 L136 A182G 変異型 L137 A182S 変異型 L138 P183A 変異型 L139 P183G 変異型 L140 P183S 変異型 L141 T185A 変異型 L142 T185G 変異型 L143 T185V 変異型 L144 W187A 変異型 L145 W187F 変異型 L146 W187H 変異型 L147 W187Y 変異型 L148 Y188F 変異型 L149 Y188L 変異型 L150 Y188W 変異型 L151 G190A 変異型 L152 G190D 変異型 L153 F193W 変異型 L154 H194D 変異型 L155 F200A 変異型 L156 F200L 変異型 L157 F200S 変異型 L158 F200V 変異型 L159 L201Q 変異型 L160 L201S 変異型 L161 Q202A [0061] [表 2-4]
表 2- 4
変異型 変異体 変異型 L162 Q202D 変異型 L163 Q202F 変異型 L164 Q202S 変異型 L165 Q202T 変異型 L166 Q202V 変異型 L167 D203E 変異型 L168 A204G 変異型 L169 A204L 変異型 L170 A204S 変異型 L171 A204T 変異型 L172 A204V 変異型 L173 F205L 変異型 L174 F205Q 変異型 L175 F205V 変異型 L176 F205W 変異型 L177 T206F 変異型 L178 T206K 変異型 L179 T206L 変異型 L180 F207I 変異型 L181 F207W 変異型 L182 F207Y 変異型 L183 M208A 変異型 L184 M208L 変異型 L185 S209F 変異型 L186 S209K 変異型し 187 S209L 変異型 L188 S209N 変異型 L189 S209V 変異型 L190 T210A 変異型 L191 T210L 変異型 L192 T210Q 変異型 L193 T210V 変異型 L194 F21 1 A 変異型 L195 F21 II 変異型 L196 F21 1.L 変異型 L197 F21 1 M 変異型 L198 F21 1 V 変異型 L199 F21 1 W 変異型 L200 F21 1Y 変異型 L201 G212A 変異型 L202 V213D 変異型 L203 V213F 変異型 L204 V213K 変異型 L205 V213S 変異型 L206 P214D 変異型 L207 P214F 変異型し 208 P214K 変異型 L209 P214S 変異型 L210 R215A 変異型 L21 1 R215I 変異型 L212 R215K 変異型 L213 R215Q 変異型 L214 R215S 変異型し 215 R215T [0062] [表 2- 5]
表 2- 5
変異型 変異体 変異型 L216 R215Y 変異型 L217 P216D 変異型 L218 P216K 変異型 L219 K217D 変異型 L220 P218F 変異型 L221 P218L 変異型 L222 P218Q 変異型 L223 P218S 変異型 L224 1219D 変異型 L225 1219F 変異型 L226 1219K 変異型 L227 T220A 変異型 L228 T220D 変異型 L229 T220F 変異型 L230 T220K 変異型 L231 T220L 変異型 L232 T220S 変異型 L233 P221A 変異型 L234 P221 D 変異型 L235 P221 F 変異型 L236 P221 K 変異型 L237 P221 L 変異型 L238 P221 S 変異型 L239 D222A 変異型 L240 D222F 変異型 L241 D222L 変異型 L242 D222R 変異型 L243 Q223F 変異型 L244 Q223K 変異型 L245 Q223L 変異型 L246 Q223S 変異型 L247 F224A 変異型 L248 F224D 変異型し 249 F224G 変異型 L250 F224K 変異型 L251 F224L 変異型 L252 K225D 変異型 L253 K225G 変異型 L254 K225S 変異型 L255 G226A 変異型 L256 G226F 変異型 L257 G226L 変異型 L258 G226N 変異型 L259 G226S 変異型 L260 K227D 変異型 L261 K227F 変異型 L262 K227S 変異型し 263 I228A 変異型し 264 I228F 変異型 L265 I228K 変異型 L266 I228S 変異型 L267 P229A 変異型 L268 P229D 変異型 L269 P229K [0063] [表 2-6]
表 2-6
変異型 変異体 変異型 L270 P229L 変異型 L271 P229S 変異型 L272 I230A 変異型 L273 I230F 変異型し 274 I230K 変異型 L275 I230S 変異型し 276 K231 F 変異型し 277 K231 L 変異型し 278 K231 S 変異型 L279 E232D 変異型 L280 E232F 変異型し 281 E232G 変異型 L282 E232L 変異型し 283 E232S 変異型 L284 A233D 変異型 L285 A233F 変異型し 286 A233H 変異型 L287 A233K 変異型 L288 A233L 変異型 L289 A233N 変異型し 290 A233S 変異型し 291 D234L 変異型 L292 D234S 変異型 L293 K235D 変異型 L294 K235F 変異型 L295 K235L 変異型 L296 K235S 変異型 L297 F259Y 変異型 L298 R276A 変異型 L299 R276Q 変異型 L300 A298S 変異型 L301 D300N 変異型 L302 V301 M 変異型 L303 Y328F 変異型 L304 Y328H 変異型 L305 Y328M 変異型 L306 Y328W 変異型 L307 W332H 変異型 L308 E336A 変異型 L309 N338A 変異型 L310 N338F 変異型 L31 1 Y339K 変異型 L312 Y339L 変異型 L313 Y339T 変異型 L314 L340A 変異型 L315 L340I 変異型 L316 L340V 変異型 L317 V439P 変異型 L318 I440F 変異型 L319 I440V 変異型 L320 E441 F 変異型 L321 E441 M 変異型 L322 E441 N 変異型 L323 N442A [0064] [表 2- 7]
表 2 - 7
Figure imgf000087_0001
[0065] [表 2-8]
表 2- 8
変異型 変異 変異型 M1 T69N I157L
変異型 M2 T69Q I157L
変異型 M3 T69S I157L
変異型 M4 P70A I157L
変異型 M5 P70G I157L
変異型 M6 P70I I157L
変異型 M7 P70L I157L
変異型 M8 P70N I157L
変異型 M9 P70S I157L
変異型 M10 P70T I157L
変異型 M1 1 P70T T210L
変異型 M12 P70T Y328F
変異型 M13 P70V I157L
変異型 M14 A72E G77S
変異型 M15 A72E E80D
変異型 M16 A72E Y81 A
変異型 M17 A72E S84D
変異型 M18 A72E F1 13W
変異型 M19 A72E I157L
変異型 M20 A72E G161 A
変異型 M21 A72E F162L
変異型 M22 A72E A184G
変異型 M23 A72E W187F
変異型 M24 A72E F200A
変異型 M25 A72E A204S
変異型 M26 A72E T210L
変異型 M27 A72E F21 1 L
変異型 M28 A72E F21 1W
変異型 M29 A72E G226A
変異型 M30 A72E I228K
変異型 M31 A72E A233D
変異型 M32 A72E Y328F
変異型 M33 A72S I157L
変異型 M34 A72V Y328F
変異型 M35 V73A I157L
変異型 M36 V73I I157L
変異型 M37 S74A 1157L
変異型 M38 S74N I157L
変異型 M39 S74T I157L
変異型 M40 S74V I157L
変異型 M41 G77A I157L
変異型 M42 G77F I157L
変異型 M43 G77 I157L
変異型 M44 G77P I157L
変異型 M45 G77S E80D
変異型 M46 G77S Y81A
変異型 M47 G77S S84D
変異型 M48 G77S F1 13W
変異型 M49 G77S I157L
変異型 M50 G77S Y159N
変異型 M51 G77S Y159S
変異型 M52 G77S G161 A
変異型 M53 G77S F162L [0066] [表 2- 9]
表 2-9 里型 変異 変異型 M54 G77S A184G
変異型 M55 G77S W187F
変異型 M56 G77S F200A
変異型 M57 G77S A204S
変異型 M58 G77S T210L
変異型 M59 G77S F211L
変異型 M60 G77S F211W
変異型 M61 G77S I228K
変異型 M62 G77S A233D
変異型 M63 G77S R276A
変異型 M64 G77S Y328F
変異型 M65 E80D Y81A
変異型 M66 E80D F113W
変異型 M67 E80D I157L
変異型 M68 E80D Y159N
変異型 M69 E80D G161A
変異型 M70 E80D A184G
変異型 M71 E80D F211W
変異型 M72 E80D Y328F
変異型 M73 E80S I157L
変異型 M74 Y81A F113W
変異型 M75 Y81A I157L
変異型 M76 Y81A Y159N
変異型 M77 Y81A Y159S
変異型 M78 Y81A G161A
変異型 M79 Y81A A184G
変異型 M80 Y81A W187F
変異型 M81 Y81A F200A
変異型 M82 Y81A T210L
変異型 M83 Y81A F211W
変異型 M84 Y81A F211Y
変異型 M85 Y81A G226A
変異型 M86 Y81A I228K
変異型 M87 Y81A A233D
変異型 M88 Y81A Y328F
変異型 M89 Y81H 1157L
変異型 M90 Y81N I157L
変異型 M91 K83P I157L
変異型 M92 S84A I157L
変異型 M93 S84D F113W
変異型 M94 S84D I157L
変異型 M95 S84D Y159N
変異型 M96 S84D G161A
変異型 M97 S84D A184G
変異型 M98 S84D Y328F
変異型 M99 S84E I157L
変異型 M100 S84F I157L
変異型 M101 S84K I157L
変異型 M102 L85F I157L
変異型 M103 L85I I157L
変異型 M104 L85P I157L
変異型 M105 L85V M57L
変異型 M106 N87A M57L
変異型 M107 N87D I157L
[Ol-Z 900] l7CZ0/S00Zdf/X3d 68 98^S .0/900Z OAV 表 2- 10
変異型 変異 変異型 M108 N87E I157L
変異型 M109 N87G I157L
変異型 M110 N87Q I157L
変異型 M111 N87S I157L
変異型 M112 F88A I157L
変異型 M113 F88D I157L
変異型 M114 F88E I157L
変異型 M115 F88E Y328F
変異型 M116 F88L I157L
変異型 M117 F88T I157L
変異型 M118 F88V I157L
変異型 M119 F88Y I157L
変異型 M120 K106H I157L
変異型 M121 K106L I157L
変異型 M122 K106M I157L
変異型 M123 K106Q I157L
変異型 M124 K106R I157L
変異型 M125 K106S I157L
変異型 M126 K106V 1157し
変異型 M127 W107A I157L
変異型 M128 W107A Y328F
変異型 M129 W107Y I157L
変異型 M130 W107Y T206Y
変異型 M131 W107Y K217D
変異型 M132 W107Y P218L
変異型 M133 W107Y T220L
変異型 M134 W107Y P221D
変異型 M135 W107Y Y328F
変異型 M136 F113A I157L
変異型 M137 F113H I157L
変異型 Ml 38 F113N I157L
変異型 M139 F113V I157L
変異型 M140 F113W I157L
変異型 M141 F113W Y159N
変異型 M142 F113W Y159S
変異型 M143 F113W G161A
変異型 M144 F113W F162L
変異型 M145 F113W A184G
変異型 M146 F113W W187F
変異型 M147 F113W F200A
変異型 M148 F113W T206Y
変異型 M149 F113W T210L
変異型 M150 F113W F211L
変異型 M151 F113W F211W
変異型 M152 F113W F211Y
変異型 M153 F113W V213D
変異型 Ml 54 F113W K217D
変異型 M155 F113W T220L
変異型 M156 F113W P221D
変異型 M157 F113W G226A
変異型 M158 F113W I228K
変異型 M159 F113W A233D
変異型 M160 F113W R276A
変異型 M161 F113Y I157L [0068] [表 2- 11]
- 11
変異型 変異 変異型 M162 F113Y F211W
変異型 M163 E114D I157L
変異型 M164 D115A I157L
変異型 Ml 65 D115E I157L
変異型 M166 D115M I157L
変異型 M167 D115N I157L
変異型 M168 D115Q I157L
変異型 M169 D115S I157L
変異型 M170 D115V I157L
変異型 M171 I157L Y159I
変異型 M172 I157L Y159L
変異型 Ml 73 I157L Y159N
変異型 M174 1157L Y159S
変異型 M175 I157L Y159V
変異型 M176 I157L P160A
変異型 M177 I157L P160S
変異型 M178 I157L G161A
変異型 M179 I157L F162L
変異型 M180 I157L F162M
変異型 M181 I157L F162N
変異型 M182 I157L F162Y
変異型 M183 I157L T165L
変異型 M184 I157L T165V
変異型 M 185 I157L Q181A
変異型 M186 I157L Q181F
変異型 M187 I157L Q181N
変異型 M188 I157L A184G
変異型 M189 I157L A184L
変異型 M190 I157L A184
変異型 M191 I157L A184S
変異型 M192 I157L A184T
変異型 M193 I157L W187F
変異型 M194 I157L W187Y
変異型 M195 I157L F193H
変異型 M196 I157L F193I
変異型 M197 1157L F193W
変異型 M198 I157L F200A
変異型 M199 I157L F200H
変異型 M200 I157L F200L
変異型 M201 I157L F200Y
変異型 M202 I157L A204G
変異型 M203 I157L A204I
変異型 M204 I157L A204L
変異型 M205 I157L A204S
変異型 M206 I157L A204T
変異型 M207 I157L A204V
変異型 M208 1157し F205A
変異型 M209 I157L F207I
変異型 M210 I157L F207M
変異型 M211 I157L F207V
変異型 M212 I157L F207W
変異型 M213 I157L F207Y
変異型 M214 I157L 208A
変異型 M215 I157L M208K [0069] [表 2- 12]
表 2- 12
変異型 変異 変異型 M216 I157L M208L
変異型 M217 I157L 208T
変異型 M218 I157L M208V
変異型 M219 I157L S209F
変異型 M220 I157L S209N
変異型 M221 I157L T210A
変異型 M222 I157L T210L
変異型 M223 I157L F21 1 I
変異型 M224 I157L F21 1 L
変異型 M225 I157L F21 1 V
変異型 M226 I157L F21 1 W
変異型 M227 I157L G212A
変異型 M228 I157L G212D
変異型 M229 I157L G212S
変異型 M230 I157L R215K
変異型 M231 I157L R215L
変異型 M232 I157L R215T
変異型 M233 I157L R215Y
変異型 M234 I157L T220L
変異型 M235 I157L G226A
変異型 M236 I157L G226F
変異型 M237 I157L I228K
変異型 M238 I157L A233D
変異型 M239 I157L R276A
変異型 M240 I157L Y328A
変異型 M241 I157L Y328F
変異型 M242 I157L Y328H
変異型 M243 I157L Y328I
変異型 M244 I157L Y328L
変異型 M245 I157L Y328P
変異型 M246 H 57L Y328V
変異型 M247 H 57L Y328W
変異型 M248 I157L L340F
変異型 M249 I157L L340I
変異型 M250 I157L L340V
変異型 M251 I157L V439A
変異型 M252 I157L V439P
変異型 M253 I157L R445A
変異型 M254 I157L R445F
変異型 M255 I157L R445G
変異型 M256 I157L R445K
変異型 M257 I157L R445V
変異型 M258 Y159N G161 A
変異型 M259 Y159N A184G
変異型 M260 Y159N A204S
変異型 M261 Y159N T210L
変異型 M262 Y159N F21 1 W
変異型 M263 Y159N F21 1 Y
変異型 M264 Y159N G226A
変異型 M265 Y159N I228K
変異型 M266 Y159N A233D
変異型 M267 Y159N Y328F
変異型 M268 Y159S G161 A
変異型 M269 Y159S F21 1 W [0070] [表 2- 13]
表 2-13
変異型 変異 変異型 M270 G161A F162L
変異型 M271 G161A A184G
変異型 M272 G161A W187F
変異型 M273 G161A F200A
変異型 M274 G161A A204S
変異型 M275 G161A T210L
変異型 M276 G161A F211L
変異型 M277 G161A F211W
変異型 M278 G161A G226A
変異型 M279 G161A I228K
変異型 M280 G161A A233D
変異型 M281 G161A Y328F
変異型 M282 F162L A184G
変異型 M283 F162L F211W
変異型 M284 F162L A233D
変異型 M285 P183A Y328F
変異型 M286 A184G W187F
変異型 M287 A184G F200A
変異型 M288 A184G A204S
変異型 M289 A184G T210L
変異型 M290 A184G F211L
変異型 M291 A184G F211W
変異型 M292 A184G I228K
変異型 M293 A184G A233D
変異型 M294 A184G R276A
変異型 M295 V184G Y328F
変異型 M296 T185A Y328F
変異型 M297 T185N Y328F
変異型 M298 W187F F211W
変異型 M299 W187F Y328F
変異型 M300 F193W F211W
変異型 M301 F200A F211W
変異型 M302 F200A Y328F
変異型 M303 L201Q Y328F
変異型 M304 L201S Y328F
変異型 M305 A204S F211W
変異型 M306 A204S Y328F
変異型 M307 T210L F211W
変異型 M308 T210L Y328F
変異型 M309 F211L A233D
変異型 M310 F211L Y328F
変異型 M311 F211W I228K
変異型 M312 F211W A233D
変異型 M313 F211W Y328F
変異型 M314 R215A Y328F
変異型 M315 R215L Y328F
変異型 M316 T220L A233D
変異型 M317 T220L D300N
変異型 M318 P221L A233D
変異型 M319 P221L Y328F
変異型 M320 F224A A233D
変異型 M321 G226A Y328F
変異型 M322 G226F A233D
変異型 M323 G226F Y328F [0071] [表 2- 14]
表 2-14
変異型 変異 変異型 M324 I228K Y328F
変異型 M325 A233D K235D
変異型 M326 A233D Y328F
変異型 M327 R276A Y328F
変異型 M328 Y328F Y339F
変異型 M329 A27T Y81A S84D 変異型 M330 P70T A72E I157L 変異型 M331 P70T G77S I157L 変異型 M332 P70T E80D F88E 変異型 M333 P70T Y81 A I157L 変異型 M334 P70T S84D I157L 変異型 M335 P70T F88E Y328F 変異型 M336 P70T F1 13W I157L 変異型 M337 P70T I157L A204S 変異型 M338 P70T I157L T210L 変異型 M339 P70T I157L A233D 変異型 M340 P70T I157L Y328F 変異型 M341 P70T I157L V439P 変異型 M342 P70T I157L I440F 変異型 M343 P70T G161 A T210L 変異型 M344 P70T G161A Y328F 変異型 M345 P70T A184G W187F 変異型 M346 P70T A204S Y328F 変異型 M347 P70T F211W Y328F 変異型 M348 P70V A72E I157L 変異型 M349 A72E S74T I157L 変異型 M350 A72E G77S Y328F 変異型 M351 A72E E80D Y328F 変異型 M352 A72E Y81 H I157L 変異型 M353 A72E K83P I157L 変異型 M354 A72E S84D Y328F 変異型 M355 A72E L85P I157L 変異型 M356 A72E F1 13W I157L 変異型 M357 A72E F1 13W Y328F 変異型 M358 A72E F113Y I157L 変異型 M359 A72E D1 15Q I157L 変異型 M360 A72E I157L G161A 変異型 M361 A72E I157L F162L 変異型 M362 A72E I157L A184G 変異型 M363 A72E I157L F200A 変異型 M364 A72E I157L A204S 変異型 M365 A72E I157L A204T 変異型 M366 A72E I157L T210L 変異型 M367 A72E I157L F21 1 W 変異型 M368 A72E I157L G226A 変異型 M369 A72E I157L A233D 変異型 M370 A72E I157L Y328F 変異型 M371 A72E I157L L340V 変異型 M372 A72E I157L V439P 変異型 M373 A72E G161 A Y328F 変異型 M374 A72E F162L Y328F 変異型 M375 A72E A184G Y328F 変異型 M376 A72E W187F Y328F 変異型 M377 A72E F200A Y328F [0072] [表 2- 15]
表 2-15
変異型 変異 変異型 M378 A72E A204S Y328F 変異型 M379 A72E T210L Y328F 変異型 M380 A72E I228K Y328F 変異型 M381 A72E A233D Y328F 変異型 M382 A72E Y328F Y159N 変異型 M383 A72E Y328F F21 1 W 変異型 M384 A72E Y328F F21 1Y 変異型 M385 A72E Y328F G226A 変異型 M386 A72V Y81 A Y328F 変異型 M387 A72V G161 A Y328F 変異型 M388 G77M I157L T210L 変異型 M389 G77P I157L F162L 変異型 M390 G77P I157L A184G 変異型 M391 G77P F21 1W Y328F 変異型 M392 G77S Y81 A Y328F 変異型 M393 G77S S84D I157L 変異型 M394 G77S F88E I157L 変異型 M395 G77S F1 13W I157L 変異型 M396 G77S F1 13Y I157L 変異型 M397 G77S D115Q I157L 変異型 M398 G77S I157L G161 A 変異型 M399 G77S I157L F200A 変異型 M400 G77S I157L A204S 変異型 M401 G77S I157L T210L 変異型 M402 G77S I157L F21 1 W 変異型 M403 G77S I157L G226A 変異型 M404 G77S I157L A233D 変異型 M405 G77S I157L L340V 変異型 M406 G77S I157L V439P 変異型 M407 G77S G161 A Y328F 変異型 M408 E80D Y81 A Y328F 変異型 M409 Y81A S84D Y328F 変異型 M410 Y81 A F1 13W Y328F 変異型 M411 Y81 A I157L T210L 変異型 M412 Y81 A I157L Y328F 変異型 M413 Y81 A G161 A Y328F 変異型 M414 Y81 A F162L Y328F 変異型 M415 Y81A A184G Y328F 変異型 M416 Y81A W187F Y328F 変異型 M417 Y81A A204S Y328F 変異型 M418 Y81A T210L Y328F 変異型 M419 Y81 A I228K Y328F 変異型 M420 Y81A A233D Y328F 変異型 M421 Y81A Y328F Y159N 変異型 M422 Y81A Y328F Y159S 変異型 M423 Y81A Y328F F21 1W 変異型 M424 Y81A Y328F F21 1Y 変異型 M425 Y81A Y328F G226A 変異型 M426 Y81A Y328F R276A 変異型 M427 K83P I157L A184G 変異型 M428 K83P I157L T210L 変異型 M429 K83P F21 1W Y328F 変異型 M430 S84D F1 13W I157L 変異型 M431 S84D I157L T210L [0073] [表 2- 16]
表 2— 16
変異型 変異 変異型 M432 F88E I157L F162L 変異型 M433 F88E I157L A184G 変異型 M434 F88E I157L F200A 変異型 M435 F88E I157L T210L 変異型 M436 F88E I157L Y328F 変異型 M437 F88E I157L Y328Q 変異型 M438 F88E I157L L340V 変異型 M439 F88E T210L Y328F 変異型 M440 F88E F211W Y328F 変異型 M441 F113W I157L G161A 変異型 M442 F113W I157L A184G 変異型 M443 F113W I157L W187F 変異型 M444 F113W I157L F200A 変異型 M445 F113W I157L A204S 変異型 M446 F113W I157L A204T 変異型 M447 F113W I157L T210L 変異型 M448 F113W I157L F211W 変異型 M449 F113W H57L G226A 変異型 M450 F113W I157L A233D 変異型 M451 F113W I157L Y328F 変異型 M452 F113W I157L L340V 変異型 M453 F113W I157L V439P 変異型 M454 F113W G161A T210L 変異型 M455 F113W G161A Y328F 変異型 M456 F113W A184G W187F 変異型 M457 F113Y I157L T210L 変異型 M458 F113Y I157L Y328F 変異型 M459 F113Y G161A T210L 変異型 M460 D115Q I157L T210L 変異型 M461 D115Q I157L Y328F 変異型 M462 I157L Y159N T210L 変異型 M463 I157L Y159N Y328F 変異型 M464 I157L G161A W187F 変異型 M465 I157L G161A F200A 変異型 M466 I157L G161A A204S 変異型 M467 I157L G161A T210L 変異型 M468 I157L G161A A233D 変異型 M469 I157L G161A Y328F 変異型 M470 I157L F162L A184G 変異型 M471 I157L F162L T210L 変異型 M472 I157L F162L L340V 変異型 M473 1157L A184G W187F 変異型 M474 I157L A184G F200A 変異型 M475 I157L A184G A204T 変異型 M476 I157L A184G T210L 変異型 M477 I157L A184G F211W 変異型 M478 I157L A184G L340V 変異型 M479 I157L W187F T210L 変異型 M480 I157L W187F Y328F 変異型 M481 I157L F200A T210L 変異型 M482 I157L F200A Y328F 変異型 M483 I157L A204S T210L 変異型 M484 I157L A204S Y328F 変異型 M485 I157L A204T T210L [0074] [表 2- 17]
表 2- 17
変異型 変異 変異型 M486 I157L A204T Y328F 変異型 M487 I157L T210L F21 1 W 変異型 M488 I157L T210L G212A 変異型 M489 I157L T210L G226A 変異型 M490 I157L T210L A233D 変異型 M491 I157L T210L Y328F 変異型 M492 1157L T210L L340V 変異型 M493 I157L T210L V439P 変異型 M494 I157L F21 1 W Y328F 変異型 M495 I157L G226A Y328F 変異型 M496 I157L A233D Y328F 変異型 M497 I157L Y328F L340V 変異型 M498 I157L Y328F V439P 変異型 M499 Y159N F21 1 W Y328F 変異型 M500 G1 61A A184G W187F 変異型 M501 G1 61A T210L Y328F 変異型 M502 G161 A F21 1W Y328F 変異型 M503 A182G P183A Y328F 変異型 M504 A182S P183A Y328F 変異型 M505 A184G W187F F200A 変異型 M506 A184G W187F A204S 変異型 M507 A184G W187F F21 1 W 変異型 M508 A184G W187F I228K 変異型 M509 A184G W187F A233D 変異型 M510 F200A F21 1 W Y328F 変異型 M51 1 A204S F21 1W Y328F 変異型 M512 A204T F21 1W Y328F 変異型 M513 F21 1 W Y328F L340V 変異型 M514 P70T A72E I157L Y328F 変異型 M515 P70T A72E T210L Y328F 変異型 M516 P70T G77 I157L Y328F 変異型 M517 P70T Y81 A I157L T210L 変異型 M518 P70T Y81 A I157L Y328F 変異型 M519 P70T S84D I157L Y328F 変異型 M520 Pフ 0T F88E I157L Y328F 変異型 M521 P70T F88E T210L Y328F 変異型 M522 P70T F1 13W I157L T210L 変異型 M523 P70T F1 13W G161 A Y328F 変異型 M524 P70T F1 13Y I157L Y328F 変異型 M525 P70T D1 15Q I157L T210L 変異型 M526 P70T D1 15Q I157L Y328F 変異型 M527 P70T I157L G161 A T210L 変異型 M528 P70T I157L A184G W187F 変異型 M529 P70T I157L A184G T210L 変異型 M530 P70T I157L W187F T210L 変異型 M531 P70T I157L W187F Y328F 変異型 M532 P70T I157L A204T T210L 変異型 M533 P70T I157L A204T Y328F 変異型 M534 P70T I157L A204T T210L 変異型 M535 P70T I157L T210L F21 1 W 変異型 M536 P70T I157L T210L G226A 変異型 M537 P70T I157L T210L A233D 変異型 M538 P70T I157L T210L Y328F 変異型 M539 P70T I157L T210L L340V [0075] [表 2-18]
表 2-18
変異型 変異 変異型 M540 P70T 1157L T210L V439P 変異型 M541 P70T 1157L Y328F V439P 変異型 M542 P70T G161 A T210し Y328F 変異型 M543 P70T G161 A A233D Y328F 変異型 M544 A72E S74T I157L Y328F 変異型 M545 A72E G77S F1 13W I157L 変異型 M546 A72E Y81 H I157L Y328F 変異型 M547 A72E K83P I157L Y328F 変異型 M548 A72E F88E F1 13W I157L 変異型 M549 A72E F88E I157L Y328F 変異型 M550 A72E F88E G161 A Y328F 変異型 M551 A72E F1 13W 115フ L Y328F 変異型 M552 A72E F1 13W G161 A Y328F 変異型 M553 A72E F1 13Y I157L Y328F 変異型 M554 A72E F1 13Y G161 A Y328F 変異型 M555 A72E F1 13Y G226A Y328F 変異型 M556 A72E I157L G161 A Y328F 変異型 M557 A72E I157L F162L Y328F 変異型 M558 A72E I157L A184G Y328F 変異型 M559 A72E I157L F200A Y328F 変異型 M560 A72E I157L A204T Y328F 変異型 M561 A72E I157L F21 1W Y328F 変異型 M562 A72E I157L F21 1 Y Y328F 変異型 M563 A72E I157L A233D Y328F 変異型 M564 A72E I157L Y328F L340V 変異型 M565 A72E G161 A A204T Y328F 変異型 M566 A72E G161A T210L Y328F 変異型 M567 A72E G161A F21 1W Y328F 変異型 M568 A72E G161 A F21 1Y Y328F 変異型 M569 A72E G161A A233D Y328F 変異型 M570 A72E G161 A Y328F L340V 変異型 M571 A72E A184G W187F Y328F 変異型 M572 A72E T210L Y328F L340V 変異型 M573 A72V I157L W187F Y328F 変異型 M574 G77P I157L T210L Y328F 変異型 M575 Y81 A S84D I157L Y328F 変異型 M576 Y81 A F88E I157L Y328F 変異型 M577 Y81 A F1 13W I157L Y328F 変異型 M578 Y81A I157L G161A Y328F 変異型 M579 Y81 A I157L W187F Y328F 変異型 M580 Y81 A I157L A204S Y328F 変異型 M581 Y81 A I157L T210L Y328F 変異型 M582 Y81 A I157L A233D Y328F 変異型 M583 Y81 A I157L Y328F V439P 変異型 M584 Y81 A A184G W187F Y328F 変異型 M585 F88E I157L T210L Y328F 変異型 M586 F88E I157L A233D Y328F 変異型 M587 F1 13W I157L A204T T210L 変異型 M588 F1 13W I157L T210L Y328F 変異型 M589 I157L G161A A184G W187F 変異型 M590 I157L G161A T210L Y328F 変異型 M591 I157L A184G W187F T210L 変異型 M592 I157L A204S T210L Y328F 変異型 M593 I157L A204T T210L Y328F 表 2- 19]
表 2-19
変異型 変異
変異型 M594 I157L T210L A233D Y328F
変異型 M595 G161A A184G W187F Y328F
変異型 M596 P70T A72E S84D I157L Y328F 変異型 M597 P70T A72E A204S I157L Y328F 変異型 M598 P70T A72E T210L I157L Y328F 変異型 M599 P70T A72E G226A I157L Y328F 変異型 M600 P70T A72E A233D I157L Y328F 変異型 M601 P70T Y81A I157L T210L Y328F 変異型 M602 P70T Y81A I157L A233D Y328F 変異型 M603 P70T Y81A 1157し T210L Y328F 変異型 M604 P70T Y81A A233D I157L Y328F 変異型 M605 P70T S84D I157L T210L Y328F 変異型 M606 P70T F113W I157L T210L Y328F 変異型 M607 P70T I157L A184G W187F A233D 変異型 M608 P70T I157L W187F T210L Y328F 変異型 M609 P70T I157L A204S T210L Y328F 変異型 M610 P70T G161A A184G W187F Y328F 変異型 M611 P70V A72E F113Y I157L Y328F 変異型 M612 P70V A72E I157L F211W Y328F 変異型 M613 A72E S74T F113Y I157L Y328F 変異型 M614 A72E S74T I157L F211W Y328F 変異型 M615 A72E Y81H I157L F211W Y328F 変異型 M616 A72E K83P F113Y I157L Y328F 変異型 M617 A72E W17F F113Y I157L Y328F 変異型 M618 A72E F113Y D115Q I157L Y328F 変異型 M619 A72E F113Y I157L Y328F L340V 変異型 M620 A72E F113Y I157L Y328F V439P 変異型 M621 A72E F113Y G161A I157L Y328F 変異型 M622 A72E F113Y A204S I157L Y328F 変異型 M623 A72E F113Y A204T I157L Y328F 変異型 M624 A72E F113Y T210L I157L Y328F 変異型 M625 A72E F113Y A233D I157L Y328F 変異型 M626 A72E I157L G161A F162L Y328F 変異型 M627 A72E I157L W187F F211W Y328F 変異型 M628 A72E I157L A204S F211W Y328F 変異型 M629 A72E I157L A204T F211W Y328F 変異型 M630 A72E I157L F211W Y328F L340V 変異型 M631 A72E I157L F211W Y328F V439P 変異型 M632 A72E I157L G226A F211W Y328F 変異型 M633 A72E I157L A233D F211W Y328F 変異型 M634 Y81A S84D I157L T210L Y328F 変異型 M635 Y81A I157L A184G W187F Y328F 変異型 M636 Y81A I157L A184G W187F T210L 変異型 M637 Y81A I157L A233D T210し Y328F 変異型 M638 F88E I157L A184G W187F T210L 変異型 M639 F113Y I157L Y159N F211W Y328F 変異型 M640 I157L A184G W187F T210L Y328F 変異型 M641 P70T I157L A184G W187F T210L Y328F 変異型 M642 Y81A I157L A184G W187F T210L Y328F [0077] 本明細書において各変異型は、前述の配列番号 2記載のアミノ酸配列に基づく変 異型タンパク質と同様に、表 2— 1〜表 2— 19に示すようなアミノ酸残基の略号およ び配列番号 208に示すアミノ酸配列中の部位より特定する。例えば、変異型 L1の「 N67KJとは、配列番号 208の配列の第 67番目のアミノ酸残基ァスパラギンをリジン に置換したことを示す。すなわち、変異型の表記は、 M35— 4ZV184A変異型 (配 列番号 208で特定されるアミノ酸)のアミノ酸残基の種類；配列番号 208に記載のアミ ノ酸配列におけるアミノ酸残基の位置;変異導入後のアミノ酸残基の種類を示す。他 の変異型の表記も同様である。
[0078] 変異型 L1から L335の変異は 1種のみを導入しても、 2種以上を組み合わせて導 入してもよい。また、変異型 L1から L335の変異は、そのうちの 1種または 2種以上を 、表2—1〜2— 7以外の変異型、例えば、後述の表 33に示される変異型の中力 選 ばれる 1種または 2種以上と組み合わせて導入してもよ 、。具体的には上述の表 2— 8〜2— 19に示すような組み合わせ Mlから M642が好適である。また少なくとも変異 型 L125:I157L、少なくとち変異型 L124:I157K：、少なくとち変異型 L303:Y328F 、少なくとも変異型 L12:P70T、少なくとも変異型 L127:Y159N、少なくとも変異型 L199:F211W、少なくとも変異型 L195:F211I、少なくとも変異型 L130:G161A 、少なくとも変異型 115:0115<3、少なくとも変異型 L316:L340V、少なくとも変異 型 L99:F88E、少なくとも変異型 L16:A72E、少なくとも変異型 L15:A72D、少な くとも変異型 L131:F162L、少なくとも変異型 L284:A233D、少なくとも変異型 L1 91:T210L、少なくとも変異型 L65:Y81A、少なくとも変異型 L265:I228K、少なく とも変異型 L317:V439P、少なくとも変異型 L255:G226A、少なくとも変異型 L52 ： G77S、少なくとち変異型 L155:F200A、少なくとち変異型 L298:R276A、少なく とも変異型 L201:G212A、少なくとも変異型 L145:W187F、少なくとも変異型 L17 0:A204S、少なくとち変異型 L87:S84D、少なくとち変異型 L60:E80D、少なくとち 変異型 L110:F113W、少なくとも変異型 M241:I157LZY328F、少なくとも変異 型 M340： P70T/1157L/Y328F,少なくとも変異型 M412： Y81A/1157L/Y 328F、少なくとち変異型 M491:I157L/T210L/Y328F、少なくとち変異型 M4 96:I157L/A233D/Y328F,少なくとも変異型 M581： Y81AZI157LZT210 L/Y328F,少なくとも変異型 M582 :Y81AZI157LZA233DZY328F、少なく とも変異型 M594 :I157L/T210L/A233D/Y328F、を含む変異型タンパク質 がペプチド生成活性を向上させる上で好適である。
[0079] 本発明の変異型タンパク質は、優れたペプチド生成活性を有する。すなわち、配列 番号 208のアミノ酸配列を有するタンパク質（M35—4ZV184変異型タンパク質）と 比べ、ペプチド生成反応を触媒する能力について優れた性能を有する。より具体的 には、本発明の変異型タンパク質はそれぞれ、特定のカルボキシ成分及びアミノ成 分力 ペプチドを生成する際の反応速度または収率、あるいは基質特異性、 pH特 性、温度安定性など、ペプチド生成反応を行うために求められる何らかの特性につ いて、配列番号 208に示すタンパク質よりも性能が向上している（具体的には下記実 施例参照)。そのため本発明の変異型タンパク質は、ペプチドの工業的生産におい て好適に用い得る。
[0080] 変異型 L1から変異型 L335、変異型 Mlから M642に示す変異の導入は、例えば 部位特異的変異法によって、配列番号 208のアミノ酸配列を有するタンパク質をコー ドする遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換されるように塩基配列を改変することに よって得られる。配列番号 208のアミノ酸配列における変異部位に対応する塩基配 列は、配列番号 207を参照することにより容易に確認できる。
[0081] また、本発明により、上記変異型 L1から変異型 L335、または、変異型 Mlから M6 42に示す 1種または 2種以上の変異を含む変異型タンパク質と実質的に同じタンパ ク質も提供される。すなわち、本発明は、変異型 L1から変異型 L335、または、変異 型 Mlから M642の変異型を 1種または 2種以上含む変異型タンパク質にお 、て、前 記変異型 L1から変異型 L335、変異型 Mlから M642の 、ずれか 1種または 2種以 上の変異部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位力 なる群より選ば れる 1または数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生 成活性を有する変異型タンパク質 (以下、「（ΙΓ)の配列番号 208に記載のアミノ酸配 列を有するタンパク質の変異型タンパク質」ともいう）も提供するものである。すなわち 、本発明の変異型タンパク質は、配列番号 208に示すアミノ酸の変異型 L1から変異 型 L335、もしくは、変異型 Mlから M642の変異部位以外の部位における変異を許 容する。したがって、変異型 L1から変異型 L335、もしくは、変異型 Mlから M642の 変異部位以外の部位に欠失、挿入などの変異が導入された場合、変異型 L1から変 異型 L335、変異型 Mlから M642によって特定される部位力 の N末端または C末 端までのアミノ酸残基数は、変異導入前の状態とは異なることがあり得る。
[0082] ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類に よっても異なるが、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない 範囲のものであり、具体的には、 2〜50個、好ましくは 2〜30個、さらに好ましくは 2〜 10個である。ただし、変異型 L1から変異型 L335、もしくは、変異型 Mlから M642 の 1種または 2種以上の変異を含むタンパク質 (すなわち（Γ)の配列番号 208に記載 のアミノ酸配列を有するタンパク質の変異型タンパク質)の半分程度以上、より好まし くは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上のペプチド生 成活性を保持して ヽることが望ま 、。
[0083] 変異型 L1から変異型 L335、変異型 Mlから M642以外の変異も、例えば部位特 異的変異法によって、本タンパク質をコードする遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置 換、欠失、挿入、付加、逆異などされるように塩基配列を改変することによって得られ る。また、上記のような改変された塩基配列によりコードされるポリペプチドは、従来知 られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理、塩基の置換、欠 失、挿入、付加、および逆位等の変異の意味については、前述の項目 1において例 示したような方法で行うことができる。上記のような変異を有する DNAを適当な細胞 で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより、配列番号 208に記載のタン ノ ク質と実質的に同一のタンパク質をコードする DNAが得られる。
[0084] 4.本発明のポリヌクレオチド
本発明は、上記本発明の変異型タンパク質が有するアミノ酸配列をコードするポリ ヌクレオチドを提供する。コドンの縮重により、 1つのアミノ酸配列を規定する塩基配 列は複数あり得る。すなわち、本発明のポリヌクレオチドには、下記ポリヌクレオチドが 含まれる。
(i)配列番号 2に記載のアミノ酸配列に対し前記変異型 1から 68、並びに変異型 239 力も 290および 324から 377のいずれ力 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配 列を有する変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(ii)上記 (I)に記載の変異型タンパク質において、前記変異型 1から 68、並びに変異 型 239から 290および 324から 377のいずれ力 1種または 2種以上の変異を含むアミ ノ酸配列中、変異部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位力 なる群 より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ぺ プチド生成活性を有する、変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
配列番号 2のアミノ酸配列は、例えば配列番号 1に記載の塩基配列によってコード される。
[0085] また、本発明は、上記本発明の配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパ ク質の変異型タンパク質が有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを提供す る。コドンの縮重により、 1つのアミノ酸配列を規定する塩基配列は複数あり得る。す なわち、本発明のポリヌクレオチドには、下記ポリヌクレオチドが含まれる。
(Π配列番号 208に記載のアミノ酸配列に対し前記 L1から L335、および変異型 M 1力 M642のいずれ力 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異 型タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
( )上記 (Γ)に記載の変異型タンパク質において、前記 L1から L335、および変異 型 Mlから M642のいずれ力 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異 部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位力 なる群より選ばれる 1また は数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を 有する、変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
また、配列番号 208のアミノ酸配列は、例えば配列番号 207に記載の塩基配列に よってコードされる。
[0086] 配列番号 1に示す塩基配列を有する DNAと実質的に同一のポリヌクレオチドとして 次のようなポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有する タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれを保持する細胞などから、配列番 号 1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列力 なるポリヌクレオチドもしくは同塩基 配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ、ぺ プチド生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離することによ つて、配列番号 1に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドと実質的に同一のポリ ヌクレオチドが得られる。
一方、配列番号 207に示す塩基配列を有する DNAと実質的に同一のポリヌクレオ チドも、上記配列番号 1に示す DNAの場合と同様に、配列番号 208に記載のァミノ 酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれを保持する細胞な どから、同様に単離することによって得ることができる。
[0087] 同様に、本発明は、本発明の変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチドと実質 的に同一である、下記 (iii)または (iv)に示すポリヌクレオチドを提供する。
(iii)上記 (i)のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオ チドとストリンジ工ントな条件下においてハイブリダィズし、変異型 1から 68、並びに変 異型 239から 290および 324から 377の 1種または 2種以上の変異が保持され、かつ 、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(iv)上記 (ii)のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオ チドとストリンジ工ントな条件下においてハイブリダィズし、変異型 1から 68、並びに変 異型 239から 290および 324から 377の 1種または 2種以上の変異が保持され、かつ 、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[0088] 同様に、本発明は、本発明の変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチドと実質 的に同一である、下記 (ίΓ)または (ίνΊに示すポリヌクレオチドを提供する。
(ίϋ')上記 (Γ)のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレ ォチドとストリンジヱントな条件下においてハイブリダィズし、前記 L1力 L335、およ び変異型 Mlから M642の 1種または 2種以上の変異が保持され、かつ、ペプチド生 成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(ίν')上記 (Γ)のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレ ォチドとストリンジヱントな条件下においてハイブリダィズし、前記 L1力 L335、およ び変異型 Mlから M642の 1種または 2種以上の変異が保持され、かつ、ペプチド生 成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[0089] 実質的に同一のポリヌクレオチドを得るためのプローブは、例えば配列番号 1や配 列番号 207に記載の塩基配列、または変異型タンパク質をコードする塩基配列に基 づいて定法により作製することができる。また、プローブを用いてこれとハイブリダィズ するポリヌクレオチドをつり上げ、 目的とするポリヌクレオチドを単離する方法も、定法 に従って行えばよい。例えば、 DNAプローブはプラスミドやファージベクターにクロ 一ユングされた塩基配列を増幅し、プローブとして用いたい塩基配列を制限酵素に より切り出し、抽出して調製することができる。切り出す箇所は、 目的とする DNAに応 じて調節することができる。
[0090] ここで 、う「ストリンジェントな条件」とは、 、わゆる特異的なハイブリッドが形成され、 非特異的なハイブリッドが形成されな 、条件を 、う。この条件を明確に数値ィ匕するこ とは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い DNA同士、例えば 50%以上、より 好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上の相同 性を有する DNA同士がハイブリダィズし、それより相同性が低い DNA同士がハイブ リダィズしな!/、条件、あるいは通常のサザンハイブリダィゼーシヨンの洗!、の条件であ る 60°C、 1 X SSC、 0. 10/0SDS、好ましく ίま、 0. 1 X SSC、 0. 10/0SDSにネ目当する 塩濃度でノ、イブリダィズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダィズする 遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性 を失ったものも含まれる力 それらについては、市販の発現ベクターにつなぎ、適当 な宿主で発現させて、発現産物の酵素活性を後述の方法で測定することによって容 易に取り除くことができる。
[0091] なお、上記のように、上記 (ii)、（iii)および (iv)のポリヌクレオチドの場合には、それ らによってコードされるタンパク質力 50°C、 pH8の条件下で、上記 (I)の変異型タン パク質の半分程度以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上のぺプ チド生成活性を保持していることが望ましい。一方、上記 (i ）、（ίΓ)および (ίνΊの ポリヌクレオチドの場合には、それらによってコードされるタンパク質力 22°C、 pH8. 5の条件下で、上記 (I)の変異型タンパク質の半分程度以上、より好ましくは 80%以 上、さらに好ましくは 90%以上のペプチド生成活性を保持していることが望ましい。
[0092] 5.本発明の配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、及び配列番号 20 8に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
上記のとおり、 (I)の変異型タンパク質及び (Γ)の配列番号 208に記載のアミノ酸 配列を有するタンパク質の変異型タンパク質は、それぞれ配列番号 2及び配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を改変することにより得ることができる。 以下、本発明のタンパク質の元となったタンパク質について説明する。なお、本発明 の変異型タンパク質はタンパク質の由来によって限定されるものではない。
[0093] 配列番号 1に記載の DNAおよび配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパ ク質、ならびに配列番号 207に記載の DNAおよび配列番号 208に記載のアミノ酸 配列を有するタンパク質は、スフインゴバタテリゥム 'マルチボラム FERM BP— 10 163株（寄託者が付した識別のための表示：3 1^¾0 & 61"0^1 multivorum AJ2458 )に由来する。 FERM番号が記載されている菌株は、独立行政法人産業技術総合 研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 (郵 便番号 305-8566) )に寄託されており、受託番号を参照して分譲を受けることができる
[0094] なお、配列番号 2や配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と同種 のタンパク質をスフインゴバタテリゥム 'エスピー FERM BP— 8124株から単離す ることができる。スフインゴバタテリゥム 'エスピー FERM BP— 8124株力 は、配 列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質における第 439番目のアミノ酸残 基であるロイシンがパリンに置換されたタンパク質が単離される。スフインゴバクテリウ ム.エスピー FERM BP— 8124株（寄託者が付した識別のための表示： Sphingoba cterium sp. AJ 110003)は、 2002年 7月 22日に独立行政法人産業技術総合研究 所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号が付与された。 FERM番号が記載 されている菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日 本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566) )に寄託されて おり、受託番号を参照して分譲を受けることができる。
[0095] なお上記スフインゴバクテリウム'マルチボラムの菌株は、以下の分類実験によって スフインゴバタテリゥム.マルチボラムであると同定されたものである。上記菌株は、桿 菌（0. 6〜0. 7 X 1. 2〜1. 5 m)、グラム陰性、胞子形成なし、運動性なし、コ口- 一形態は円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、黄色、 30°Cで生育、カタラーゼ陽性 、ォキシダーゼ陽性、 OFテスト（グルコース）陰性の性質より、スフインゴバタテリゥム に属する細菌と同定された。更に、硝酸塩還元陰性、インドール産生陰性、ダルコ一 スからの酸生成陰性、アルギニンジヒドロラーゼ陰性、ゥレアーゼ陽性、エスクリンカロ 水分解陽性、ゼラチン加水分解陰性、 β ガラクトシダーゼ陽性、グルコース資化陽 性、 Lーァラビノース資化陽性、 D マンノース資化陽性、 D マン-トール資化陰性
、 Ν ァセチルー D—ダルコサミン資化陽性、マルトース資化陽性、ダルコン酸カリウ ム資化陰性、 η—力プリン酸資化陰性、アジピン酸資化陰性、 dl リンゴ酸資化陰性
、クェン酸ナトリウム資化陰性、酢酸フエ二ル資化陰性、チトクロームォキシダーゼ陽 性の性質より、スフインゴパクテリゥム 'マルチボラムの性状に類似することが判明した
。更に 16SrRNA遺伝子の塩基配列のホモロジ一解析の結果、スフインゴバクテリウ ム'マルチボラムと最も高いホモロジ一（98. 5%)を示し、本菌株をスフインゴバタテリ ゥム ·マノレテホフム (Sphingobactenum multivorum)と同定し 7こ。
[0096] 配列番号 1に記載の塩基番号 61〜1917の塩基配列からなる DNAは、コードシー ケンス（CDS)部分である。塩基番号 61〜1917の塩基配列には、シグナル配列領 域と成熟タンパク質領域とが含まれて 、る。シグナル配列領域は塩基番号 61〜 120 の領域であり、成熟タンパク質領域は塩基番号 121〜1917の領域である。すなわち
、本発明は、シグナル配列を含むペプチド酵素タンパク質遺伝子と、成熟したタンパ ク質としてのペプチド酵素タンパク質遺伝子の双方を提供する。配列番号 1に記載の 配列に含まれるシグナル配列は、リーダー配列の類であり、当該リーダー配列領域 にコードされるリーダーペプチドの主たる機能は、細胞膜内から細胞膜外に分泌させ ることにあると推定される。塩基番号 121〜1917でコードされるタンパク質、すなわち リーダーペプチドを除く部位が成熟タンパク質であり、高いペプチド生成活性を示す と推定される。
[0097] 配列番号 1の塩基配列を有する DNAは、スフインゴバタテリゥム 'マルチボラムの染 色体 DNA、もしくは DNAライブラリーから、 PCR (polymerase chain reaction, Whi te, T. J. et al ； Trends Genet., 5, 185(1989)参照）またはハイブリダィゼーショ ンによって取得することができる。 PCRに用いるプライマーは、例えばペプチド生成 活性を有する精製タンパク質に基づいて決定された内部アミノ酸配列に基づいて設 計することができる。また、配列番号 1に記載された塩基配列に基づいてプライマー またはハイブリダィゼーシヨン用のプローブを設計することもでき、あるいはプローブ を使って単離することもできる。 PCR用のプライマーとして、 5'非翻訳領域及び 3'非 翻訳領域に対応する配列を有するプライマーを用いると、本タンパク質のコード領域 全長を増幅することができる。配列番号 1に記載された、リーダー配列および成熟タ ンパク質コード領域の双方を含む領域を増幅する場合を例にとると、具体的には、 5' 側プライマーとしては配列番号 1にお 、て塩基番号 61よりも上流の領域の塩基配列 を有するプライマーカ 3'側プライマーとしては塩基番号 1917よりも下流の領域の塩 基配列に相補的な配列を有するプライマーが挙げられる。
[0098] プライマーの合成は、例えば、 Applied Biosystems社製 DNA合成機 model 380B を使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859参照 )常法に従って合成できる。 PCR反応は、例えば Gene Amp PCR System 9600 (PE RKIN ELMER社製）及び TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit (宝酒造社製）を 用い、各メーカーなど供給者により指定された方法に従って行うことができる。
[0099] 6.本発明の変異型タンパク質の製造方法
次に本発明のタンパク質の製造方法、並びにこれに用いられる組換え体および形 質転換体の作製方法について説明する。
[0100] 上記変異型タンパク質を発現する形質転換体は、例えば、配列番号 1に示される 塩基配列を有する発現ベクターなどの組換え DNAに変異型 1から 68、並びに変異 型 239から 290および 324から 377のいずれかに該当する変異を導入し、適切な宿 主に導入し、発現させることによってペプチド生成活性を有する変異型タンパク質を 生成することができる。一方、配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク 質の変異型タンパク質を発現する形質転換体は、配列番号 207に示される塩基配列 を有する発現ベクターなどの組換え DNAに変異型 L1から変異型 L335、変異型 M 1力 M642のいずれかに該当する変異を導入し、適切な宿主に導入し、発現させる ことによってペプチド生成活性を有する変異型タンパク質を生成することができる。配 列番号 1または配列番号 207の塩基配列を有する DNAにより特定される変異型タン パク質を発現させるための宿主としては、例えばェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) 等のェシエリヒア属細菌、ェンぺドパクター属細菌、スフインゴバタテリゥム属細菌、フ ラボバタテリゥム属細菌、及びバチルス'ズブチリス（Bacillus subtilis)をはじめとする 種々の原核細胞、サッカロマイセス ·セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae)、ピヒア · スティピテイス（Pichia stipitis)、ァスペルギルス ·ォリゼ（Aspergillus oryzae)をはじ めとする種々の真核細胞を用いることができる。
[0101] 外来 DNAを宿主に導入するために用いる組換え DNAは、発現させようとする宿主 の種類に応じたベクターに、所定の DNAを、該 DNAがコードするタンパク質が発現 可能な形態で挿入することで調製可能である。タンパク質を発現させるためのプロモ ータとしては、ェンぺドバクタ一'ブレビスのペプチド生成タンパク質をコードする遺伝 子固有のプロモータが宿主細胞で機能する場合には、そのプロモータを使用するこ とができる。また、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロモータを、変異型タンパク質 をコードする DNAに連結し、そのプロモータ制御下で発現させるようにしてもよ!、。
[0102] 組換え DNAを宿主細胞に導入するための形質転換法としては、 D. M. Morrison の方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979))あるいは受容菌細胞を塩化力 ルシゥムで処理して DNAの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa, A., J. Mol . Biol, 53, 159(1970))等が挙げられる。
[0103] タンパク質を組換え DNA技術を用いて大量生産する場合、該タンパク質を生産す る形質転換体内で該タンパク質が会合し、タンパク質の封入体 (inclusion body)を形 成させる形態も好まし 、一実施形態として挙げられる。この発現生産方法の利点は、 目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化力も保護する点およ び目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等 である。
[0104] このようにして得られるタンパク質封入体は、タンパク質変性剤により可溶化され、 主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生 理的に活性なタンパク質に変換される。例えば、ヒトインターロイキン— 2の活性再生 (特開昭 61— 257931号公報)等多くの例がある。
[0105] タンパク質封入体力ゝら活性型タンパク質を得るためには、可溶化'活性再生等の一 連の操作が必要であり、直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が複雑に なる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大量に生産さ せる場合は、不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影 響を抑えることができる。
[0106] 目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制 御下、 目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られて いるタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。
[0107] 以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて変異型タンパク質を製造する 方法を例として、より具体的に説明する。なお、大腸菌などの微生物に変異型タンパ ク質を作製させる場合、タンパク質のコード配列として、リーダー配列を含む前駆タン ノ ク質をコードする DNAを組み込んでも、リーダー配列を含まな 、成熟タンパク質領 域の DNAのみを組み込んでもよぐ作製しょうとする酵素の製造条件、形態、使用条 件などにより適宜選択することができる。
[0108] 変異型タンパク質をコードする DNAを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌 における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、 T7プロモータ、 lacプロモータ、 trpプロモータ、 trcプロモータ、 tacプロモータ、ラム ダファージの PRプロモータ、 PLプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。また 、ベクターとしては、 PUC19、 pUC18、 pBR322、 pHSG299、 pHSG298、 pHSG 399、 pHSG398、 RSF1010、 pMW119、 pMW118、 pMW219、 pMW218等を 用いることができる。他にもファージ DNAのベクターも利用できる。さらに、プロモー タを含み、挿入 DNA配列を発現させることができる発現ベクターを使用することもで きる。
[0109] 変異型タンパク質を融合タンパク質封入体として生産させるためには、変異型タン ノ ク質の上流あるいは下流に、他のタンパク質、好ましくは親水性であるペプチドをコ ードする遺伝子を連結して、融合タンパク質遺伝子とする。このような他のタンパク質 をコードする遺伝子としては、融合タンパク質の蓄積量を増加させ、変性'再生工程 後に融合タンパク質の溶解性を高めるものであればよぐ例えば、 T7gene 10、 β ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロン γ遺伝 子、インターロイキン 2遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
[0110] これらの遺伝子と変異型タンパク質をコードする遺伝子とを連結する際には、コドン の読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、ある V、は適当な配列の合成 DNAを利用すればょ 、。
[0111] また、生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配 列であるターミネータを連結することが好ま 、場合がある。このターミネータとしては 、 T7ターミネータ、 fdファージターミネータ、 T4ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺 伝子のターミネータ、大腸菌 trpA遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
[0112] 変異型タンパク質または変異型タンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質をコ ードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー 型のものが好ましぐ ColEl由来の複製開始点を有するプラスミド、例えば pUC系の プラスミドや PBR322系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導 体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および Zまたは逆位などによってプラスミド に改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤や UV照射などに よる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
[0113] また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマ 一力一を有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ 発現ベクターが市販されて 、る (pUC系（宝酒造 (株)製）、 pPROK系（クローンテツ ク製）、 pKK233— 2 (クローンテック製）ほ力 。
[0114] プロモータ、変異型タンパク質または変異型タンパク質と他のタンパク質との融合タ ンパク質をコードする遺伝子、場合によってはターミネータの順に連結した DNA断 片と、ベクター DNAとを連結して組換え DNAを得る。
[0115] 得られた組換え DNAを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、変 異型タンパク質または変異型タンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質が発現 生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用 することができるが、大腸菌 K12株亜種のェシエリヒア'コリ JM109株などが好まし い。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法は Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press (1989)等に記載されている。
[0116] 融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子 Xa、カリクレインなどの、ぺプ チド生成酵素内に存在しな 、配列を認識配列とする制限プロテア一ゼを用 、てぺプ チド生成酵素を切り出せるようにしてもょ ヽ。
[0117] 生産培地としては、 M9—カザミノ酸培地、 LB培地など、大腸菌を培養するために 通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクター のマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
[0118] 変異型タンパク質または変異型タンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質を 回収するには、以下の方法などがある。変異型タンパク質あるいはその融合タンパク 質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌さ せ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムク 口マトグラフィ一等の手法により変異型タンパク質あるいはその融合タンパク質を精製 して用いることも可能である。この場合、変異型タンパク質あるいは融合タンパク質の 抗体を利用した精製法も利用できる。
[0119] タンパク質封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパ ク質とともに可溶ィ匕してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して 、これを可溶ィ匕するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方 法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収す る。タンパク質封入体を可溶ィ匕させる変性剤としては、グァ-ジン塩酸 (例えば、 6M 、 pH5〜8)や尿素（例えば 8M)などが挙げられる。
[0120] これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパク質として再生される。透 祈に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよぐ 濃度としては 20mM〜0. 5M、 pHとしては 5〜8が挙げられる。
[0121] 再生工程時のタンパク質濃度は、 500 μ gZml程度以下に抑えるのが好ま 、。再 生したペプチド生成酵素が自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は 5°C以下 であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、 限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
[0122] 7.ペプチドの製造方法
本発明のペプチドの製造方法は、上記変異型タンパク質を用いて、ペプチドを生 成させるものである。すなわち、本発明のペプチド製造方法では、下記 (I)および (II) に示すタンパク質のうち少なくとも一方の存在下で、ァミン成分とカルボキシ成分とを 反応させてペプチドを生成せしめる。
(I)配列番号 2に記載のアミノ酸配列に対し前記変異型 1から 68、並びに変異型 239 力も 290および 324から 377のいずれ力 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配 列を有する変異型タンパク質。
(II)上記 (I)に記載の変異型タンパク質において、前記変異型 1から 68、並びに変異 型 239から 290および 324から 377のいずれか 1種または 2種以上の変異部位以外 の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位力 なる群より選ばれる 1または数個の アミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、 変異型タンパク質。
[0123] また、本発明のペプチドの製造方法は、上記配列番号 208に記載のアミノ酸配列 を有するタンパク質の変異型タンパク質を用いてペプチドを生成させることもできる。 すなわち、本発明のペプチド製造方法では、下記 (Γ)および (1广）に示すタンパク質 のうち少なくとも一方の存在下で、ァミン成分とカルボキシ成分とを反応させてぺプチ ドを生成せしめる。
(I)配列番号 208に記載のアミノ酸配列に対し前記変異型 L1から L335、及び変異 型 Mlから M642のいずれ力 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する 変異型タンパク質。
(II)上記 (I)に記載の変異型タンパク質において、前記変異型 L1から L335、および 変異型 Mlから M642のいずれ力 1種または 2種以上の変異部位以外の部位に置換 、欠失、挿入、付加および逆位力もなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異 を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク 質。
[0124] 本発明のペプチドの製造方法では、ペプチド生成反応系内に変異型タンパク質が 存在するようにすればよい。上記変異型タンパク質は、例えば、生化学的に許容され る媒体中に (I)および Zまたは（Π)、あるいは (Γ)および Zまたは（πΊのタンパク質 を含有する混合物 (以下、「変異型タンパク質含有物」 t ヽぅ）として供給されてもよ!、 。さらに具体的には、例えば、本発明の変異型タンパク質を発現するように形質転換 された微生物の培養物、当該培養物より分離した微生物菌体および当該微生物の 菌体処理物からなる群より選ばれる 1種または 2種以上を用い、ァミン成分とカルボキ シ成分と力 ペプチドを生成せしめてもょ 、。
[0125] 本明細書において「変異型タンパク質含有物」とは、本発明の変異型タンパク質を 含有するものであればよぐ具体的形態としては、変異型タンパク質を生産する微生 物の培養物、当該培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。 微生物の培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、微 生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成され た物質の混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用い てもよい。また、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなどが含ま れ、さらに菌体などを処理して回収される粗精製タンパク質、さらに精製した精製タン ノ^質なども含まれる。精製処理されたタンパク質としては、各種精製法によって得ら れる部分精製タンパク質等を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括 法等によって固定ィ匕した固定ィ匕タンパク質を使用してもよい。また、使用する微生物 によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清も変 異型タンパク質含有物として利用できる。
[0126] また、本発明の変異型タンパク質を含む微生物としては、変異型タンパク質を発現 した遺伝子組換え株を用いてもよいし、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌体等の菌体 処理物を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定ィ匕 した固定ィ匕菌体、固定ィ匕菌体処理物を使用してもよい。
[0127] なお、培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物 を用いる場合には、ペプチドの生成に関与せずに生成ペプチドを分解する酵素が存 在することが多ぐこの場合には、エチレンジァミン四酢酸 (EDTA)のような金属プロ テアーゼ阻害剤を添加するほうが好ましい場合がある。添加量は、 0. ImMから 300 mMの範囲で、好ましくは ImMから lOOmMである。
[0128] 変異型タンパク質またはその含有物を、カルボキシ成分とァミン成分に作用せしめ る方法としては、当該変異型タンパク質またはその含有物、カルボキシ成分、および ァミン成分を混合すればよい。より具体的には、本発明の変異型タンパク質またはそ の含有物を、カルボキシ成分とァミン成分を含む溶液中に添加して反応せしめる方 法を用いてもよいし、変異型タンパク質を生産する微生物を用いる場合には、変異型 タンパク質を生産する微生物を培養し、微生物中または微生物の培養液中に当該酵 素を生成 '蓄積せしめ、培養液中にカルボキシ成分とァミン成分を添加する方法など を用いてもよい。生成されたペプチドは、定法により回収し、必要に応じて精製するこ とがでさる。
[0129] 微生物の菌体 (すなわち、微生物の細胞）を得るには、微生物の種類に応じて適当 な培地で培養増殖せしめるとよ 、。このための培地はその微生物が増殖し得るもの であれば特に制限はなぐ通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更 に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
[0130] 例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であれば ヽずれも使用でき、具体 的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、ェ タノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クェン酸、酢酸、プロピオン酸 などの有機酸類及びこれらの塩類、ノラフィンなどの炭水化物類あるいはこれらの混 合物などを使用することができる。
[0131] 窒素源としては、硫酸アンモ-ゥム、塩化アンモ-ゥムなどの無機酸のアンモ-ゥム 塩、フマル酸アンモニゥム、クェン酸アンモニゥムなどの有機酸のアンモニゥム塩、硝 酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンス ティープリカ一などの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができ る。
[0132] 他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜 混合して用いることができる。
[0133] 培養条件にも格別の制限はなぐ例えば、好気的条件下にて pH5〜9、温度約 15
〜55°Cの範囲で pHおよび温度を適当に制限しつつ 12〜48時間程度培養を行え ばよい。
[0134] 本発明のペプチド製造方法の好ま U、形態としては、上記、形質転換された微生 物を培地中で培養し、培地中および Zまたは微生物中に、変異型タンパク質を蓄積 させる方法が挙げられる。形質転換体を用いることにより、変異型タンパク質を簡便に 大量生成できるため、ペプチドの生成も大量に速く行うことができる。 [0135] 変異型タンパク質またはその含有物の使用量は、 目的とする効果を発揮する量 (有 効量)であればよぐこの有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求 められるが、例えば酵素を用いる場合には、 0. 01から 100ユニット (U)程度、洗浄 菌体を用いる場合は 0. l〜500gZL程度である。
[0136] カルボキシ成分としては、もう一つの基質であるアミン成分と縮合してペプチドを生 成できるものであれば、いかなるものを使用してよい。カルボキシ成分としては、例え ば、 L—アミノ酸エステル、 D—アミノ酸エステル、 L—アミノ酸アミド、 D—アミノ酸アミ ド、更にはァミノ基の有さない有機酸エステル等が挙げられる。また、アミノ酸エステ ルとしては、天然型のアミノ酸に対応するアミノ酸エステルだけでなぐ非天然型のァ ミノ酸もしくはその誘導体に対応するアミノ酸エステルなども例示される。また、ァミノ 酸エステルとしては、 α—アミノ酸エステルの他、ァミノ基の結合位置の異なる、 β 、 γ—、 ω—等のアミノ酸のエステルなども例示される。アミノ酸エステルの代表例と しては、アミノ酸のメチルエステル、ェチルエステル、 η-プロピルエステル、 iso-プロピ ルエステル、 n-ブチルエステル、 iso-ブチルエステル、 tert-ブチルエステル等が例示 される。
[0137] ァミン成分としては、もう一つの基質であるカルボキシ成分と縮合してペプチドを生 成できるものであれば、いかなるものも使用してよい。ァミン成分としては、例えば、 L —アミノ酸、 C保護 L アミノ酸、 D アミノ酸、 C保護 D アミノ酸、ァミン等が挙げら れる。また、ァミンとしは、天然型ァミンだけでなぐ非天然型のアミンもしくはその誘 導体などが例示される。また、アミノ酸としては、天然型アミノ酸だけではなく非天然 型アミノ酸もしくはその誘導体も例示される。 0C アミノ酸の他、ァミノ基の結合位置 の異なる、 β —、 Ύ 一、 ω—等のアミノ酸なども例示される。
[0138] 出発原料であるカルボキシ成分およびアミン成分の濃度は各々 ImM〜： L0M、好 ましくは 0. 05M〜2Mである力 カルボキシ成分に対してァミン成分を等量以上添 カロしたほうが好ましい場合がある。また、基質が高濃度だと反応を阻害するような場 合には、反応中にこれらを阻害しない濃度にして逐次添加することができる。
[0139] 反応温度は 0〜60°Cでペプチド合成可能であり、好ましくは 5〜40°Cである。また 反応 pHは pH6. 5〜： L0. 5でペプチド合成可能であり、好ましくは pH7. 0〜： L0. 0 である。
本発明のペプチド製造方法は、各種のペプチドの製造方法として好適である。ぺ プチドとしては、 a—L ァスバルチルー L—フエ-ルァラニン— 13 メチルエステル (i.e. , — L— ( β—Ο— methyl aspartyl)—L— phenylalanine (略称： — AMP) L―了ラニ ルー L グルタミン（Ala- Gin)、 L -ァラ-ル L フエ-ルァラニン（Ala- Phe)、 L - フエ-ルァラ -ル一 L—メチォニン（Phe- Met)、 L 口イシルー L—メチォニン（Leu- M et)、 L—イソ口イシルー L—メチォニン（lie- Met)、 L—メチォ-ル L—メチォニン（M et- Met)、 L—プロリル L—メチォニン（Pro- Met)、 L—トリプトファ-ルー L—メチォ ニン（Trp- Met)、 L ノ リル一 L—メチォニン（Va Met)、 L—ァスパラギニル一 L—メ チォニン（Asn- Met)、 L システイ-ルー L—メチォニン（Cys- Met)、 L グルタミル —L—メチォニン（Gin- Met)、グリシルー L—メチォニン（Gly- Met)、 L—セリル一 L— メチォニン（Ser- Met)、 L—スレオ-ルー L—メチォニン（Thr- Met)、 L—チロシェル — L—メチォニン（Tyr- Met)、 L—ァスパルチル一 L—メチォニン（Asp- Met)、 L—ァ ルギニル一 L—メチォニン（Arg- Met)、 L—ヒスチジル L—メチォニン（His- Met)、 L —リジル一 L—メチォニン（Lys- Met)、 L—ァラ -ル一グリシン (Ala- Gly)、： L ァラ- ルー L—スレオニン（Ala- Thr)、 L—ァラ -ル一 L—グルタミン酸 (Ala- Glu)、 L—ァラ -ル L ァラニン (Ala- Ala)ゝ L -ァラ-ル L ァスパラギン酸 (Ala-Asp)、 L—ァ ラ-ル L セリン (Ala- Ser)、 L—ァラ -ル一 L—メチォニン (Ala- Met)、： L ァラ- ルー L—パリン（Ala- Val)、 L ァラ-ルー L リジン（Ala- Lys)、 L—ァラ -ル— L— ァスパラギン (Ala- Asn)、 L—ァラ -ル一 L システィン（Ala- Cys)、 L—ァラ -ル一 L —チロシン（Ala- Tyr)、 L—ァラ -ル— L—イソロイシン（Ala- Ile)、 L—アルギニル— L —グルタミン (Arg- Gin)、グリシル— L セリン（Gly- Ser)、グリシル— L— (t—ブチル )セリン½1 -361"0：8 ）、 (2S, 3R, 4S)— 4 ヒドロキシルイソロイシル—フエ-ルァ ラ-ン（HIL- Phe)等のジペプチド、 L -ァラ-ル L フエ-ルァラ-ル L—了ラニ ン（AFA)、 L—ァラ -ル一グリシルー L—ァラニン (AGA)、 L—ァラ -ル一 L—ヒスチ ジル一 L ァラニン（AHA)、 L—ァラ -ル一 L ロイシル一 L ァラニン（ALA)、 L -ァラ-ル L ァラ-ル L ァラニン (AAA)、 L -ァラ-ル L ァラ-ル一グリ シン (AAG)、 L—ァラ -ル— L ァラ -ル— L プロリン（AAP)、 L—ァラ -ル— L -ァラ-ル L グルタミン（ AAQ)、 L -ァラ-ル L ァラ-ル L チロシン ( A AY)、グリシル一 L フエ-ルァラ -ル一 L ァラニン（GFA)、 L—ァラ -ル一グリシ ル—グリシン (AGG)、 L—トレオ-ル―グリシル—グリシン (TGG)、グリシル―グリシ ル グリシン（GGG)、 L -ァラ-ル L フエ-ルァラ-ル -グリシン ( AFG)等のト リペプチド、グリシル グリシル L フエ-ルァラ-ル L メチォニン（GGFM)等 のテトラペプチド、 L -チロシノレ -グリシル -グリシル -L -フエ-ノレァラ-ノレ L メ チォニン (YGGFM)等のペンタペプチドを挙げることができる。
本発明のペプチド製造方法は、例えば、 a Lーァスバルチルー L フエ-ルァラ ニン一 j8—メチノレエステノレ (i.e. , a—L—( j8—0— methyl aspartyl)—L— phenylalanine ( 略称： a— AMP)の製造方法としても好適である。 a— AMPは、甘味料として大き な需要がある a—L ァスパルチル— L フエ-ルァラニン— a—メチルエステル（ 製品名：アスパルテーム)製造の重要な中間体である。
実施例
[0141] 以下、本発明について実施例を示しより詳細に説明するが、本発明は下記実施例 に制限されるものではな 、。
[0142] (実施例 1) ペプチド生成酵素遺伝子の大腸菌における発現
スフインゴバタテリゥム.マルチボラム FERM BP— 10163株の染色体 DN Aを铸 型として配列番号 5, 6に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして PCRにより、ぺプ チド生成活性を有するタンパク質をコードする目的遺伝子を増幅した。増幅した DN A断片を NdelZXbalにて処理し、得られた DNA断片と pTrpTの NdelZXbal処理 物をライゲーシヨンした。このライゲーシヨン溶液でェシエリヒア'コリ JM109を形質 転換し、アンピシリン耐性を指標として目的のプラスミドを有する株を選択し、このブラ スミドを pTrpT— Sm— Aetと命名した。なお、 pTrpT— Sm— Aetを保有するェシェ リヒア 'コリ JM109を pTrpT— Sm— AetZjM109株とも表す。
[0143] pTrpT— Sm— AetZjM109株を 3mlの培地（2gZlグルコース、 lOgZl酵母ェキ ス、 lOgZlカザミノ酸、 5gZl硫酸アンモ-ゥム、 3gZlリン酸二水素カリウム、 ig/iy ン酸水素二カリウム、 0. 5gZl硫酸マグネシウム七水和物、 lOOmgZlアンピシリン） を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し、 25°C、 20時間の本培養を行った。培 養液 lmlあたり 2. 1Uの AMP生成活性を有しており、クローユングした遺伝子がェシ エリヒア'コリで発現したことを確認した。なお、対照として pTrpTのみを導入した形質 転換体には、活性は検出されなかった。
[0144] (実施例 2) pKFベクターを用いたラショナル変異株の構築
(1) pKF_Sm_Aetの構築
丁卬丁—3111—八61;プラスミドを铸型として配列番号3、 4に示すォリゴヌクレォチド をプライマーとして PCRにより目的遺伝子を増幅した。この DNA断片を EcoRl/Pst Iにて処理し、得られた DNA断片と pKF18k2 (宝酒造社製）の EcoRlZPstl処理物 をライゲーシヨンした。このライゲーシヨン溶液でェシエリヒア'コリ JM109を形質転 換し、カナマイシン耐性を指標として目的のプラスミドを有する株を選択し、このブラ スミドを pKF— Sm— Aetと命名した。なお、 pKF— Sm— Aetを有するェシエリヒア' コリ JM109を pKF— Sm— AetZjM109株とも表す。
[0145] (2) pKF— Sm— Aetラショナル変異導入
変異型 Aetを構築するために、 pKF— Sm— Aetプラスミドを、 ODA法を用いる部 位特異的突然変異誘発法の铸型として使用した。変異は宝酒造社（日本)の「Site Directed Mutagenesis System Mutan buper Express Km it」を使用し、製造兀 のプロトコールに従って、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列番号 12〜33 )を用いて導入した。プライマーは、宝酒造社製の T4 Polynucleotide Kinaseを 用いて 5， 一末端をリン酸ィ匕して用いた。プライマーリン酸ィ匕条件は、 100 molDN A (プライマー）及び T4 Polynucleotide Kinase 10ユニットを ATP 0. 5mM、 塩化マグネシウム 10mM及び DTT 5mMを含む 50mM トリス—塩酸緩衝液（p H8. 0) 20 1〖こ添加し、 37°Cで 30分保温後、 70°Cで 5分加熱し、リン酸化した。本 反応液 1 μ 1 (5pmol)を変異導入 PCRに用いた。 PCR条件は、 Template ds DN A (pKF— Sm— Aetプラスミド） 10ng、プライマーとして Selection Primer及び先 に示した 5，リン酸化済みの Mutagenic オリゴヌクレオチド 各 5pmol及び LA—Ta q 40ユニットを dATPゝ dCTP、 dGTP、 dTTP各 250 μ Μを含む LA— Taq buffe ΓΠ (Μ8 2+ρ1ιΐ5) 50 /ζ 1に添加し、 94°Cを 1分、 55°Cを 1分、 72°Cを 3分のサイクルを 2 5回繰り返す PCR反応を行った。変異導入 PCR後、エタノール沈殿により DNA断片 を回収し、得られた DNAを用いてェシエリヒア'コリ MV1184株を形質転換し、カナ マイシン耐性を指標として、変異型 Aet遺伝子を含む目的のプラスミド: pKF—Sm— AetMを有する株を選択した。
[0146] なお、本明細書において、 pKF—Sm— AetMを有するェシエリヒア'コリ MV118 4株を、 pKF— Sm— AetMZMV1184株とも表す。また、 pKF— Sm— AetMにつ いてその具体的な変異型を示す場合、 pKF— Sm— F207Vのように、「AetM」の部 分を変異型の内容で置き換えて表示する場合がある。また、 2種以上の変異を含む 場合変異型を「Z」で区切り、列挙する場合がある。例えば、 pKF_Sm_F207V/ Q441Eは、 pKF—Sm— Aetプラスミドが搭載する Aet遺伝子に F207Vおよび Q44 1Eの変異が導入されたものである。
[0147] (3) pHSG— Sm— Aetの構築
pTrpT—Sm— Aetプラスミドを铸型として配列番号 3、 4に示すオリゴヌクレオチド をプライマーとして PCRにより目的遺伝子を増幅した。この DNA断片を EcoRl/Pst Iにて処理し、得られた DNA断片と pHSG298 (宝酒造社製）の EcoRlZPstl処理 物をライゲーシヨンした。このライゲーシヨン溶液でェシエリヒア'コリ MV1184株を 形質転換し、カナマイシン耐性を指標として目的のプラスミドを有する株を選択し、こ のプラスミドを pHSG— Sm— Aetと命名した。なお、 pHSG— Sm— Aetを有するェ シエリヒア'コリ MV1184株を、 pHSG— Sm— AetZMV1184株とも表す。
[0148] (4)菌体の取得 A
pKF— Sm— AetZjM109株、 pKF— Sm— AetMZMVl 184株および pHSG — Sm— AetZMVl 184株をそれぞれ LB寒天培地（lOgZl酵母エキス、 lOgZlぺ プトン、 5gZl塩ィ匕ナトリウム、 20gZl寒天、 PH7. 0) )上で 30°C、 24時間前培養した 。前培養で得られた各種菌体を、 3mlの LB培地（上記培地より寒天を除いた培地に 0. ImM IPTG、 20mg/lカナマイシンを含む）を張り込んだ普通試験管に一白金 耳植菌し、 25°C、 150往復 Z分で 20時間の本培養を行った。
[0149] (5)微生物菌体を用いるペプチドの生産 く AMPの生成〉
実施例 2 (4)で得られた培養液 400 μ 1を遠心して菌体を回収し、 10mM EDTA と 50mM ァスパラギン酸ジメチルエステル、 lOOmM フエ-ルァラニンを含む 100 mMホウ酸緩衝液 (pH9. 0) 200 Lに懸濁し、 25°Cにて 30分反応を行った。この 反応で野性型酵素発現株（以下、野生株と称する）において生成した α— AMPの 濃度を表 3に示した。また、各種変異型酵素発現株 (以下、変異株と称する）におけ るジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表 3 に示した。
[0150] (6)微生物菌体を用いるペプチドの生産 <Ala— Gin生成 >
実施例 2 (4)で得られた培養液 100 μ 1を遠心して菌体を回収し、 10mM EDTA と lOOmM L—ァラニンメチルエステル、 200mMグルタミンを含む lOOmMホウ酸 緩衝液 (PH9. 0) 200 Lに懸濁し、 25°Cにて 30分反応を行った。この反応で野生 株にお 、て生成した L ァラ-ル L グルタミン（以下、 Ala— Gin)の濃度を表 3に 示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジ ペプチドの生成濃度の比率を表 3に示した。
[0151] (7)微生物菌体を用いるペプチドの生産 く Phe— Met、： Leu— Met >
実施例 2 (4)で得られた培養液 800 μ 1を遠心して菌体を回収し、 10mM EDTA と 50mM L—フエ-ルァラニンメチルエステル塩酸塩又は L一口イシンメチルエステ ル塩酸塩、 lOOmM L—メチォニンを含む lOOmMホウ酸緩衝液（pH9. 0) 400 Lに懸濁し、 25°Cにて 20分反応を行った。この反応で野生株において生成した L— フエニノレアラ-ノレ L メチォニン（以下、 Phe— Met)又は L 口イシノレ L メチォ ニン (以下 Leu— Met)の濃度を表 3に示した。また、各種変異株におけるジペプチド 生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表 3に示した。
[0152] [表 3]
3
Figure imgf000132_0001
*野生株のジペプチド生成濃度を「1」とした場合の、
各種変異株のジペプチド生成濃度比率
[0153] (実施例 3)ランダムスクリーニング 1
(8) pTrpT—Sm—Aetランダムライブラリーの作製
変異型 Aetを構築するために、 pTrpT— Sm— Aetプラスミドを、 Error prone PCR法を用いるランダム変異誘発法の铸型として使用した。変異はストラタ ジーン（Stratagene)社（アメリカ）の「GeneMorph PCR Mutagenesis Kit」を 使用し、製造元のプロトコールに従って行った。
[0154] 配列表の配列番号 5、 6に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて PCRを 行った。 Template ds DNA(pTrp— Sm— Aetまたは pTrp Sm F207Vプラ スミド） 500ng、プライマー各 125ng及び Mutazyme DNA polymerase 2. 5 ユニットを dATPゝ dCTP、 dGTP、 dTTP各 200 μ Μを含む Mutazyme reaction buffer 50 μ 1に添加し、 95。Cを 30秒、 52。Cを 30秒、 72。Cを 2分のサイクルを 30 回繰り返す PCR反応を行った。
[0155] PCR反応の生成物を NdelZXbalにて処理し、得られた DNA断片と pTrpTの Nd elZXbal処理物をライゲーシヨンした。このライゲーシヨン溶液を用いて常法によりェ シヱリヒア'コリ JM109 (宝酒造製）を形質転換した。これを 100 gZmlのアンピシ リンを含む LB寒天培地上にプレーティングし、ランダム変異導入ライブラリーを作製 した。
[0156] (9) pTrpT—Sm—Aetランダムライブラリーからのスクリーニング A
それぞれの変異型 Aet遺伝子を含むプラスミド (pTrpT— Sm— AetM)を導入した ェシエリヒア'コリ JM109株及び野生型 Aetを含むプラスミドを導入したェシエリヒア' コリ JM109株をアンピシリン 100 /z gZmlを含む生産培地（2gZl グルコース、 10 g/1 酵母エキス、 lOg/1 カザミノ酸、 5gZl 硫酸アンモ-ゥム、 lg/1 リン酸二 水素カリウム、 3gZl リン酸水素二カリウム、 0. 5g/l 硫酸マグネシウム七水和物、 pH7. 5、 lOOmg/1 アンピシジン） 150 1 (96穴プレー卜に分注）に接種し、 25°C で 16時間振とう培養した。培養には TITEC社のバイオシェーカー（MZBR— 1212 FP)を用い、 1000回転 Z分で振とう培養した。
[0157] (10)—次スクリーニング
実施例 3 (9)で得られた培養液を用いて一次スクリーニングを実施し、次のようにし て選抜を行った。まず、得られた培養液 5 μ 1に、 10mM Phenol, 6mM AP、 5m M Asp (OMe) 、 7. 5mM Phe、 3. 6U/ml peroxidase, 0. 16U/ml alcho
2
1 oxidase, lOmM EDTA、 lOOmM Borateを含む反応液（pH8. 2) ^200 μ 1 添加し、 25°Cにて約 20分反応させた。反応後 500nmの吸光度を測定し、メタノール 放出量を算出した。ここではメタノールの放出量が多いものは AMP生成活性が高い 酵素として選抜した。
[0158] (11)菌体の取得
1次スクリーニングにて採取された選抜株を、 LB寒天培地で 25°C、 16時間前培養 した。各種酵素発現株を 2mlの terrific培地（12gZl トリプトン 、 24gZl 酵母ェ キス、 2. 3g/l リン酸酸二水素カリウム、 12. 5g/l リン酸水素二カリウム、 4g/l グリセロール、 lOOmg/1 アンピシリン)を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し 、 25°C、 150往復 Z分で 18時間の本培養を行った。
[0159] (12)二次スクリーニング
得られた培養ブロス 25 μ 1を、 10mM EDTAと 50mM ァスパラギン酸ジメチルェ ステル、 75mM フエ-ルァラニンを含む lOOmMホウ酸緩衝液（pH8. 5又は pH9. 0) 500 Lに懸濁し、 20°C又は 25°Cにて 10分又は 15分間反応を行い、 AMP生成 量を測定した。 2次スクリーニング選抜株より、比活性が向上した上位株について変 異点解析を実施し、以下の変異点を特定した。野生株を親株 (铸型)としたライブラリ 一より、変異型 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 14、 15、 16を備える変異株、 F207V変異株 を親株としたライブラリーより変異型 17、 18、 19、 20を備える変異株を取得した。
[0160] (13)微生物菌体を用いるペプチドの生産
上記反応で野生株において生成した AMPの濃度を表 4 (反応時間 10分）、 F207 V変異株において生成した AMPの濃度を表 5 (反応時間 15分）に示した。また、各 種変異株におけるジペプチド生成については、親株に対するジペプチドの生成濃度 の比率を表 4、 5に示した。 AMP生成反応の他の条件は上記実施例 2 (5)と同様とし た。
[0161] [表 4]
生成ジペプチド名 AMP
反応 pH 8.5 9.0 cont生株対すプ'野るにシトチrol酵素シ Vプチ 生成量 (mM) 4.6 1.1
*濃成度生比 Q441 E 1.3
A301 V 1.3 1.7
V257I 1.4 2.9
A537G 1.4 1.8
A324V 1.2 1.4
N607K 1.1 1.3
D31 3E 1.3 1.4
Q229H 1.3 1.6
T72A 1.7 2.2
A137S 1.4 1.5
*野生株のジペプチド生成濃度を「1 Jとした場合の、
各種変異株のジペプチド生成濃度比率
表 5]
表 5
Figure imgf000135_0001
*親株 (F207V変異株）のジペプチド生成濃度を「1」とした場合の、 各種変異株のジペプチド生成濃度比率
(実施例 4)特定した変異点の pKFへの載せかえによる評価
(14)特定した変異点の pKFへの載せかえ株の構築
実施例 3 (12)で得られた変異点を既構築 pKF_Sm— F207VZQ441Eと組合 わせ、 3重変異株を構築した。変異導入は、铸型として pKF_Sm_F207V/Q44
IEを用いて実施例 2 (2)と同様の方法で行い、各種変異型酵素に対応するプライマ 一（配列表の配列番号 34〜44および 77)を用いて導入した。得られた株及び既構 築株は実施例 2 (4)と同様の方法で培養した。
[0164] (15)微生物菌体を用いるペプチドの生産 く AMP>
実施例 4 (14)で得られた培養液 500 μ 1を遠心して菌体を回収し、 10mM EDTA と 50mMァスパラギン酸ジメチルエステル、 lOOmMフエ-ルァラニンを含む 100m Mホウ酸緩衝液 (pH8. 5又は pH9. 0) 500 /z Lに懸濁し、 25°Cにて 30分反応を行 つた。この反応で野生株において生成した AMPの濃度を表 6に示した。また、各種 変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度 の比率を表 6に示した。
[0165] (16)微生物菌体を用いるペプチドの生産 <Ala— Gln>
実施例 4 (14)で得られた培養液 100 μ 1を遠心して菌体を回収し、 10mM EDTA と lOOmM L—ァラニンメチルエステル、 200mMグルタミンを含む lOOmMホウ酸 緩衝液 (PH8. 5又は pH9. 0) 1000 Lに懸濁し、 25°Cにて 10分反応を行った。こ の反応で野生株において生成した Ala— Ginの濃度を表 6に示した。また、各種変異 株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比 率を表 6に示した。
[0166] (17)微生物菌体を用いるペプチドの生産 く Phe— Met, Leu- Met >
実施例 4 (14)で得られた培養液 800 μ 1を遠心して菌体を回収し、 10mM EDTA と 50mM L—フエ-ルァラニンメチルエステル塩酸塩又は L一口イシンメチルエステ ル塩酸塩、 lOOmM L—メチォニンを含む lOOmM ホウ酸緩衝液（pH8. 5又は p H9. 0) 400 Uこ懸濁し、 25°Cにて 20分反応を行った。この反応で野生株におい て生成した Phe— Met、 Leu— Metの濃度を表 6に示した。また、各種変異株におけ るジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表 6 に示した。
[0167] [表 6] 表 6
Figure imgf000137_0001
*野生株のジペプチド生成濃度を「1」とした場合の、各種変異株のジペプチド生成濃度比率
[0168] (実施例 5)ランダムスクリーニング 2
(18) pSTV—Sm_Aetランダムライブラリーの作製
変異型 Aetを構築するために、 pHSG— Sm__Aetプラスミドを、 Error prone P CR法を用いるランダム変異誘発法の铸型として使用した。変異はストラタジーン (Str atagene)社（アメリカ）の「GeneMorph PCR Mutagenesis Kit」を使用し、製造 元のプロトコールに従って行った。
[0169] 配列表の配列番号 3、 4に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて PCRを 行った。 PCR条件は、 Template ds DNA (pHSG— Sm—Aet プラスミド） 100 ng、プライマー 1, 2 (配列番号 3、 4参照）各 1. 25pmol及び Mutazyme DNA po lymerase2. 5ユニットを dATPゝ dCTP、 dGTP、 dTTP各 200 Mを含む Mutazy me reaction buffer 1に添加し、 95°Cで 30秒加熱後、 95°Cを 30秒、 52°C を 30秒、 72°Cを 2分のサイクルを 25回繰り返す PCR反応を行った。
[0170] PCR反応の生成物を EcoRl/Pstlにて処理し、得られた DNA断片と pSTV28 ( 宝酒造社)の EcolZPstl処理物をライゲーシヨンした。このライゲーシヨン溶液を用い て常法によりェシエリヒア'コリ JM109 (宝酒造製)を形質転換した。これを 50 gZ mlのクロラムフエ-コール、 0. ImM IPTGを含む M9寒天培地上（5 * M9 200m 1/1、 0. 1M CaCl lml/l、 1M MgSO lml/l、 50%Glucose 10ml/l、力
2 4
ザミノ酸 10gZl、寒天 15gZDにプレーティングし、ランダム変異導入ライブラリーを 作製した。その際、その後のスクリーニングを簡便にするため、 1プレート 100コ口- 一程度になるように塗布した。なお、上記「5 * M9」は、 Na HPO · 7Η O 64g/L
2 4 2
, KH PO 15g/L, NaCl 2. 5g/L, NH CI 5gZLの溶液である。
2 4 4
[0171] (19) pSTV系ランダムライブラリーからの一次スクリーニング
得られた形質転換体 (変異型酵素発現株ライブラリー)から効率的に活性向上株を 選抜するため、各形質転換体の Phe— pNA加水分解活性を調べた。実施例 5 (18) にて作製した形質転換体生育プレートに、反応液（10mM Phe— pNA、 10mM OPT, 20mM Tris— HCl (pH8. 2)、 0. 8%agar) 5mlを重層し、 Phe— pNAの 加水分解により生じる pNAの発色を調べた (pNAの遊離により菌体が黄色く着色)。 強く発色が見られるコロニーを活性上昇株として選抜した。
[0172] (20)菌体の取得
選抜した株は LB寒天培地上で 30°C、 24時間培養した。この各種菌体を、 3mlの L B培地（上記培地より寒天を除いた培地に 0. ImM IPTG、50mgZl クロラムフエ 二コールを含む)を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し、 25°C、 150往復 Z分 で 20時間の本培養を行った。
[0173] (21)二次スクリーニング
実施例 5 (20)で得られた培養ブロス 400 1を集菌し、 10mM EDTA と 50mM
Phe— OMe、 lOOmM Metを含む lOOmM ホウ酸緩衝液（pH9. 0) 400 1に 懸濁し、 25°Cにて 30分反応を行い、 Phe— Met生成量を測定し、反応初速度の早 い株を選抜した。そこで選抜した活性が向上した株について、変異点解析を実施し、 変異点 11、 12を特定した。
[0174] (22)微生物菌体を用いるペプチドの生産 く Phe— Met, Leu- Met >
実施例 5 (20)で得た培養液 800 /z lを遠心して菌体を回収し、 10mM EDTAと 2 5mM L フエ二ルァラニンメチルエステル塩酸塩又はし ロイシンメチルエステル 塩酸塩、 50mM L—メチォニンを含む lOOmMホウ酸緩衝液（pH9. 0) 400 しに 懸濁し、 25°Cにて 20分反応を行った。この反応で野生株において生成した Phe— Met又は Leu— Metの濃度を表 7に示した。また、各種変異株におけるジペプチド 生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表 7に示した。
[表 7]
表 7
Figure imgf000139_0001
*野生株のジペプチド生成濃度を「1」とした場合の、
各種変異株のジペプチド生成濃度比率
[0176] (実施例 6) pSF— Sm— Aetでのペプチド生成酵素遺伝子の高発現
(23)高発現プラスミドの構築
PCRにより、ェンテロパクタ一'ァエロゲネス由来酸性フォスファターゼの改変プロ モータおよびシグナル配列の下流にスフインゴパクテリゥム属由来の成熟型ペプチド 生成酵素遺伝子を連結した発現プラスミドを構築した。
[0177] 铸型として pTrpT—Sm—Aetプラスミド（実施例 1)、プライマーとして Esp— S1 (5' - CCG TAA GGA GGA ATG TAG ATG AAA AAT ACA ATT TCG TGC C ;配列番号 121)及び S— AS1 (5，- GGC TGC AGT TTG CGG GAT GGA AGG CCG GC ;配列番号 122)オリゴヌクレオチド各 0. 4mM並びに KOD plus 用緩衝液 (TOYOBO社製）、 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP各 0. 2mM、硫酸マグ ネシゥム lmM、及び KOD plusポリメラーゼ (TOYOBO社製） 1ユニットを含む 50 1の反応液で、 94°C、 30秒の熱処理の後、 94°Cを 15秒、 55°Cを 30秒、 68°Cを 2 分 30秒のサイクルを 25回繰り返す PCRを行 ヽ、ペプチド生成酵素遺伝子部分を増 幅した。また、铸型として PEAP130プラスミド (下記参考例 1参照。関連特許出願;特 願 2004— 83481)、プライマーとして E— Sl (5，— CCT CTA GAA TTT TTT CA A TGT GAT TT;配列番号123)及びEsp—ASl (5'-GCA GGA AAT TGT A TT TTT CAT CTA CAT TCC TCC TTA CGG TGT TAT;配列番号 124) オリゴヌクレオチドを用い同条件にて PCRを行い、酸性フォスファターゼのプロモータ 及びシグナル配列部分を増幅した。反応液をァガロース電気泳動に供し、増幅され た各 DNA断片を Microspin column (アマシャム ·ファノレマシア ·バイオテク社製） を用いて回収した。
[0178] 次いで、該増幅断片混合物を铸型とし、プライマーとして E— S1及び S— AS1オリ ゴヌクレオチドを用い、同様の組成の反応液で 94°Cを 15秒、 55°Cを 30秒、 68°Cを 2 分 30秒のサイクルを 25回繰り返す PCRを行い、キメラ型酵素遺伝子を構築した。増 幅された各 DNA断片を Microspin column (アマシャム ·フアルマシア ·バイオテク 社製）を用いて回収し、これを Xba Iと Pst Iで消化した。これを pUC 18プラスミドの Xba I— Pst Iサイトに連結した。 DNA Sequencing kit Dye Terminator C ycle Sequencing Ready Reaction (PERKIN ELMER社製）を用いた Dye Terminator法により、 310 Genetic analyzer (ABI)にて塩基配列を決定し、 目 的の遺伝子が導入されて ヽることを確認し、本プラスミドを PSF— Sm— Aetプラスミド と命名した。
[0179] (24) pSF— Sm— Aetラショナル変異導入株の構築
変異型 Aetを構築するために、 pSF— Sm— Aetを、 PCRを用いる部位特異的突 然変異誘発法の铸型として使用した。変異はストラタジーン (Stmtagene)社 (ァメリ 力）の「クイックチェンジ部位特異的突然変異誘発キット（Quik change Site— Dir ected Mutagenesis Kit)」を使用し、製造元のプロトコールに従って、各種変異 型酵素に対応するプライマー（配列番号 45〜78)を用いて導入した。 PCR反応の生 成物を用いて、ェシエリヒア'コリ JM109を形質転換し、アンピシリン耐性を指標とし て目的のプラスミドを有する株を選択した。なお、 pSF— Sm— Aetを有するェシエリヒ ァ'コリ JM109株を、 pSF— Sm— AetZjM109株とも表す。
[0180] (25)菌体の取得
実施例 6 (24)で取得した各種変異株を LB寒天培地で 25°C、 16時間前培養した。 各種酵素発現株を 2mlの terrific培地（12gZlトリプトン、 24gZl酵母エキス、 2. 3g Zlリン酸酸二水素カリウム、 12. 5gZlリン酸水素二カリウム、 4gZlグリセロール、 10 OmgZlアンピシリン)を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し、 25°C、 150往復 Z分で 18時間の本培養を行った。
[0181] (26)微生物菌体を用いるペプチドの生産 <Ala— Gln>
(25)で得られた培養ブロス 5 μ 1を、 50mMの Lーァラニンメチルエステル塩酸塩（ Ala— OMe 'HCl)、 lOOmMの L—グルタミン、 10mMの EDTAを含む 500 1のホ ゥ酸緩衝液 (ρΗ8. 5又は ρΗ9. 0)に加え、 25°Cにて 10分反応した。この反応で野 生株において生成した Ala— Ginの濃度を表 8に示した。また、各種変異株における ジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表 8に 示した。
[0182] (27)微生物菌体を用いるペプチドの生産 <AMP>
上記培養ブロス 25 μ 1を、 10mM EDTAと 50mMァスパラギン酸ジメチルエステ ル、 75mMフエ-ルァラニンを含む lOOmMホウ酸緩衝液（pH8. 5又は pH9. 0) 50 O /z Lに懸濁し、 20°C又は 25°Cにて 15分間反応を行った。この反応で野生株にお いて生成した AMPの濃度を表 8に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生 成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表 8に示した。
[0183] (28)微生物菌体を用いるペプチドの生産 く Phe— Met, Leu- Met >
上記培養ブロス 25 1を、 10mM EDTAと 25mM L—フエ-ルァラ -ンメチルェ ステル塩酸塩又は L一口イシンメチルエステル塩酸塩、 50mM L—メチォニンを含 む lOOmMホウ酸緩衝液（pH8. 5又 ίま pH9. 0) 500 【こ懸淘し、 250C【こて 15分 反応を行った。この反応で野生株において反応で生成した Phe— Met又は Leu— M etの濃度を表 8に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野 生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表 8に示した。
[0184] [表 8] 表 8
Figure imgf000142_0001
*野生株のジペプチド生成濃度を「1」とした場合の、各種変異株のジペプチド生成濃度比率
[0185] (実施例 7)変異の組み合わせにより高活性株の構築
(29)ランダムスクリーニング変異点組合せ株の構築
様々な変異を組合わせた株を構築するため、 pSF— Sm_Aetを、 PCRを用いる 部位特異的突然変異誘発法の铸型として使用した。
[0186] 変異はストラタジーン（Stratagene)社（アメリカ）の「Quik change Multi」を使 用し、製造元のプロトコールに従って、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列 番号 99〜120)を用いて導入した。プライマーは、宝酒造社製の T4 Polynucleoti de Kinaseを用いて 5'—末端をリン酸ィ匕して用いた。プライマーリン酸ィ匕条件は、 1 OO /z molDNA (プライマー）及び T4Polynucleotide Kinase 10ユニットを ATP 0. 5mM、塩化マグネシウム 10mM及び DTT5mMを含む 50mMトリス—塩酸緩衝 液 (pH8. 0) 20 1に添加し、 37°Cで 30分保温後、 70。Cで 5分加熱し、リン酸ィ匕した
[0187] PCR条件は、 Template ds DNA(pSF_Sm一 Aetプラスミド） 50ng、プライマ 一として先に示した 5'リン酸化済みの Mutagenicオリゴヌクレオチド各 50— 100ng ( 組合わせるプライマーが 3種類までは 100ng、 4種類以上の場合は 50ngを反応系に 添加)、 Quik solution 0. 375 μ 1及び Quik change Multi enzyme blend 1. 25ユニットを dNTP Mix 0. 5 1を含む Quik change Multi reaction bu ffer 12. 5 /z lに添加し、 95。Cを 1分、 53. 5。Cを 1分、 65。Cを 10分のサイクルを 30 回繰り返す PCR反応を行った。
[0188] PCR産物（全量 12. 5 ^ 1)に Dpnl 5ユニット添カ卩し、 37°Cで 1時間処理した反応 液 2 1を用いて、エシ リヒア 'コリ JM109株を形質転換した。形質転換した菌体を 100 μ g/mlのアンピシリンを含む LB培地上にプレーティングし、アンピシリン耐性 株としてランダムな組み合わせ株ライブラリーを得た。
[0189] (30)組合わせ変異ライブラリーからのスクリーニング
それぞれの変異型 Aet遺伝子を含むプラスミド (pSF— Sm— AetM)を導入したェ シエリヒア'コリ JM109及び野生型 Aetを含むプラスミドを導入したェシエリヒア'コリ JM109をアンピシリン 100 μ gZmlを含む生産培地 150 1 (96穴プレートに分注） に接種し、 25°Cで 16時間振とう培養した。培養には TITEC社のバイオシェーカー（ MZBR— 1212FP)を用い、 1000回転 Z分で振とう培養した。得られた培養液を用 いて、スクリーニングを実施し選抜を行った。
[0190] (31)—次スクリーニング
得られた菌液 5 1に、 10mM Phenol, 6mM AP、 5mM Asp (OMe) 、7. 5
2 mM Phe、 3. 6UZ ml peroxidase ^ 0. Ib v / ml alchol oxidase^ lOmM E DTA、 lOOmM Borateを含む反応液（pH8. 2)を 200 1添加し、 25。Cにて約 20 分反応後 500nmの吸光度を測定し、メタノール放出量を算出した。メタノールの放 出量が多!、ものは AMP生成活性が高 、酵素として選抜した。
[0191] (32)二次スクリーニング
上記方法で一次スクリーニングしたのち、選抜した株を実施例 6 (25)に記載した方 法で培養し、その培養ブロス 10 1又は 50 1を 10mM EDTA と 50mM Asp (0 Me) 、 75mM Pheを含む lOOmM ホウ酸緩衝液（pH8. 5) lmlに懸濁し、 20。C
2
又は 25°Cにて 10分反応を行い、 AMP生成量を測定し、生成量の多い株を選抜し た。選抜株はシーケンスにより変異点の組み合わせを特定した。取得された株と、そ れを取得するのに用いたプライマーの組み合わせを表 9に示した。 表 9]
表 9
Figure imgf000144_0001
(33)微生物菌体を用いるペプチドの生産
上記で得られた組合わせ株の評価を行った。上記培養ブロス 25 1を、 lOmM E DTAと 50mM ァスパラギン酸ジメチルエステル、 75mM フエ-ルァラニンを含む lOOmMホウ酸緩衝液 (pH8.5) 500/z Lに懸濁し、 20°Cにて 15分間反応を行った 。この反応で野生株において生成した AMPの濃度を表 10に示した。また、各種変 異株におけるジペプチド生成については、野生株の比活性を 1とした場合のジぺプ チドの生成 *株°。成濃度生対する "ド生野比にシチフへ比活性の比率を表 10に示した。
[表 10]
表 10 20°C
生成ジペプチド名 AMP
反応 pH 8.5
Cell量 5%
control酵素シへノチト 生成量 (mM) 7.8
M7-35 4.8
M7-46 3.7
M7-54 1.9
M7-63 5.3
M7-95 4.0
M9-9 6.1
M9-10 6.3
M11-2 6.0
M11-3 6.0
M12-1 6.4
M12-3 5.4
M21-18 5.7
M21-22 5.3
M21-25 3.7
M22-25 4.7
M24-1 6.7
M24-2 6.3
M24-5 7.2
M26-3 5.9
M26-5 7.6
M29-3 5.3
M33-1 5.5
M35-4 6.6
M37-5 7.2
M39-4 6.1
M41-2 5.8 [0195] (実施例 8)基質特異性の把握
(34)変異型酵素を用いた基質特異性の把握
カルボキシ成分に各種の L—アミノ酸メチルエステル、ァミン成分に L メチォニン を用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例 6 (25)に記載した方法で培養した 培養ブロス 25 μ 1を、表 11に示す 25mMの L—アミノ酸メチルエステル塩酸塩 (X— OMe'HCl)、 50mMの L—メチォニン、 10mMの EDTAを含む 500 1のホウ酸緩 衝液 (ρΗ8. 5)に加え、 25°Cにて 15分、 3時間反応した。この反応で野生株におい て反応で生成した各種ペプチドの生産量を表 11 1および表 11 2に示した。表中 +印の示されたジペプチドは、 HPLCのエリア値 8000を lmg/Lと仮に定め、予想 されるピークの参考値を生産量として示したものである。また、各種変異株におけるジ ペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表 11 1 および表 11 2に示した。
[0196] [表 11- 1]
表 11- 1
Figure imgf000147_0001
*野生株のジペプチド生成濃度を π」とした場合の、各種変異株のジペプチド生成濃度比率 表 11一 2]
〔〕0198
Figure imgf000148_0002
Figure imgf000148_0001
[0199] (36)—次スクリーニング A
得られた菌液 5 1に、 10mM Phenol, 6mM AP、 5mM Asp (OMe) 、 5mM
2
Ala— OEt、 7. 5mM Phe、 3. 6U/ml peroxidase, 0. 16U/ml alchol o xidase、 lOmM EDTA、 lOOmM Borateを含む反応液（pH8. 2)を 200 ΐ添カロ し、 25°Cにて約 20分反応後 500nmの吸光度を測定し、メタノール放出量を算出し た。ここではメタノールの放出量が多いものは Ala - Pheよりも AMPがより生成しやす い酵素として選抜した。
[0200] (37)—次スクリーニング B
同様に、得られた菌液 5 1に、 lOmM Phenol、 6mM AP、 5mM Asp (OMe) 、 5mM A(M) , 3. 6U/ml peroxidase, 0. 16U/ml alchol oxidase, 10
2
mM EDTA、 lOOmM Borateを含む反応液（pH8. 2)を 200 1添加し、 25。Cに て約 20分反応後 500nmの吸光度を測定し、メタノール放出量を算出した。ここでは メタノールの放出量が少ないものは AM (AM)ができにくい酵素として選抜した。
[0201] (38)二次スクリーニング
実施例 9 (36)および（37)にて選抜した株は、実施例 6 (25)と同様な方法で培養し 、その培養ブロス 50 1を lOmM EDTA と 50mM Asp (OMe) 、 50mM Ala
2
— OMe、 75mM Pheを含む lOOmM ホウ酸緩衝液（pH8. 5) lmlに懸濁し、 20 °Cにて 10分反応を行い、 AMP、 Ala— Phe生成量を測定し、反応初速度の早い株 を選抜した。又、同様に培養した培養ブロス 50 μ 1を 10mM EDTA と 50mM As p (OMe) 、 75mM Pheを含む lOOmM ホウ酸緩衝液（pH9. 0) lmlに懸濁し、 2
2
0°Cにて 10分反応を行い、 AMP生成収率を測定し、収率の高い株を選抜した。有 効変異点として変異型 21を選抜した。
[0202] (実施例 10)特定した変異点の pSFへの載せかえによる評価
(39)V184への変異導入
(実施例 9)で得られた変異点 V184Aを pSF— Sm— Aetに導入した。また、既構 築 pSF— Sm— M35— 4にも導入した。また、 V184を別のアミノ酸に置換した V184 X株も構築した。変異導入は（2)と同様の方法で行い、铸型は pSF— Sm— Aet又は pSF— Sm— M35— 4を用い、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列番号 79 〜98)を用いて導入した。得られた株は実施例 6 (25)に記載の方法で培養した。
[0203] (40)微生物菌体を用いるペプチドの生産 <AMP>
実施例 6 (24)に記載した方法で培養した培養ブロス 25 μ 1を、 10mM EDTAと 5 OmM ァスパラギン酸ジメチルエステル、 75mM フエ-ルァラニンを含む lOOmM ホウ酸緩衝液（ρΗ8. 5又は pH9. 0) 500 に懸濁し、 20°Cにて 10分間反応を行 つた。この反応で野生株において生成した AMPの濃度を表 12に示した。また、各種 変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度 の比率を表 12に示した。
[0204] [表 12]
表 12
Figure imgf000150_0001
*野生株のジペプチド生成濃度を「1 Jとした場合の、各種
変異株のジペプチド生成濃度比率 [0205] (41)微生物菌体を用いるペプチドの生産 <AMP >
実施例 6 (25)に記載した方法で培養した培養ブロスを、 10mM EDTAと 50mM ァスパラギン酸ジメチルエステル、 75mM フエ二ルァラニンを含む lOOmMホウ酸 緩衝液 (PH8. 5又は pH9. 0)に懸濁し（2. 2UZml反応液）、 20°Cにて反応を行つ た。この反応で野生株及び各種変異株にお!、て生成した AMP収率を表 13に示した
[0206] [表 13]
表 13
Figure imgf000151_0001
[0207] (実施例 11)変異型酵素の性質の変化
(42)酵素の pH安定性
酵素をある pHで一定時間インキュベーション後、 Lーァスパラギン酸ジメチルエス テル塩酸塩と L—フエ二ルァラニン力 AMPを生成する反応を行い、 pH安定性を検 討した。実施例 6 (25)に記載した方法で培養した培養ブロス 10 μ 1を 20°Cにて各 pH (8. 5、 9. 0、 9. 5) (Μ9— 9、 M12— 1に関して ίま 8. 0も実施）のノ ッファー 190 1 と混合し、 30分インキュベーション後、 75mM L—ァスパラギン酸ジメチルエステル 、 112. 5mM L—フエ二ルァラニン、 15mM EDTAを含む 450mMのホウ酸緩衝 液 (pH8. 5) 400 /z lにカ卩え、 20°Cにて 20分間反応させ、生成した AMPの濃度を図 1に示した。
[0208] (43)酵素の至適反応温度
L ァスパラギン酸ジメチルエステル塩酸塩と L フエ-ルァラニンから AMPを生 成する反応における反応温度の影響を検討した。 50mM Lーァスパラギン酸ジメチ ルエステル、 75mM L フエ-ルァラニン、 10mM EDTAを含む lOOmMのホウ 酸緩衝液 (PH8. 5) 980 1〖こ、実施例 6 (25)に記載した方法で培養した培養ブロス 20 1加え、各温度（20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60。C)にて 5分間反応させ 、生成した AMP濃度を図 2に示した。結果、本酵素の至適温度は 2458 : 35°C、 M9 9 :45°C、 M12— 1 : 50°Cであった。
[0209] (44)酵素の温度安定性
酵素をある温度で一定時間インキュベーション後、 Lーァスパラギン酸ジメチルエス テル塩酸塩と L フエ二ルァラニン力 AMPを生成する反応を行 、、温度安定性を 検討した。菌液を各温度（35°C、 40°C、 45°C、 50°C、 55°C、 60°C)にて 30分インキ ュベーシヨン後、 50mM L—ァスパラギン酸ジメチルエステル、 lOOmM L フエ- ルァラニン、 10mM EDTAを含む lOOmMのホウ酸緩衝液（ρΗ8. 5) 980 1に実 施例 6 (25)に記載した方法で培養した培養ブロス 20 1加え、 20°Cにて 5分間反応 させた。このとき生成した AMPの濃度を図 3に示した。
[0210] <生成物の分析 >
上記実施例において、生成物は以下に示す高速液体クロマトグラフィーにて定量し た。カラム： InertsiL ODS - 3 (GLサイエンス社製）、溶離液： i) 5. OmM 1—オタ タンスルホン酸ナトリウムを含むリン酸水溶液（pH2. 1)：メタノール = 100 : 15〜50、 ii) 5. OmM 1—オクタンスルホン酸ナトリウムを含むリン酸水溶液（pH2. 1) :ァセト ニトリル= 100 : 15〜30、流量：1. OmL/分、検出 210nm。
[0211] く参考例 1 :pEAP 130プラスミドの作製一ェンテロバクタ一'ァエロゲネス由来酸性 フォスファターゼ遺伝子のプロモータ配列の改変 >
Journal of Bioscience and Bioengineenng (2001) Vol. 92, No.l, 50- 54 の通り（もしくは特開平 10— 201481号公報）、ェンテロバクタ一'ァエロゲネス（Ente robacter aerogenes) IFO 12010菌株の染色体 DNAより、酸性フォスファターゼ 遺伝子領域を含む、制限酵素 Sailと制限酵素 Kpnlで切り出される 1. 6kbpの DNA 断片を単離し、 PUC118に連結したプラスミド DNAを構築し、 pEAP120と命名した 。 pEAP120は、酸性フォスファターゼのプロモータ及びシグナルペプチドをコードす る塩基配列が組み込まれたプラスミドである。なお、 IFO番号が記載されているもの は、財団法人発酵研究所（日本国大阪府大阪市淀川区十三本町 2丁目 17— 85)に 寄託されたものであるが、平成 14年 6月 30日以降、その業務は独立行政法人製品 評価技術基盤機構 (NITE) 'バイオテクノロジー本部 (DOB) '生物遺伝資源部門（ NBRC)に移管され、 NBRCより上記 IFO番号を参照して分譲を受けることができる。
[0212] 続いて、本遺伝子の上流に存在するプロモータ配列を一部改変し、活性向上を試 みた。 Quik change site Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE社 製)を用いて部位特異的変異を導入し、酸性フォスファターゼ遺伝子推定プロモータ 配列の― 10領域を AAAAATカゝら TATAATへ置換した。変異導入用にデザインし た PCR用オリゴヌクレオチプライマー EM1 (5，- CTT ACA GAT GAC TAT AAT
GTG ACT AAA AAC ;配列番号 125)および EMR1 (5，- GTT TTT AGT CA C ATT ATA GTC ATC TGT AAG;配列番号 126)を合成した。説明書の方法 に従って、 ρΕΑΡ 120を铸型に変異導入を行った。 DNA Sequencing kit Dye
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PERKIN ELMER社 製）を用いた Dye Terminator法により、 310 Genetic analyzer (ABI)にて塩基 配列を決定し、 目的の変異が導入されていることを確認し、本プラスミドを PEAP130 と命名した。 pEAP130は、酸性フォスファターゼの N末端領域に由来するシグナル ペプチドをコードする塩基配列、および、改変されたプロモータを有するプラスミドで ある。
[0213] (実施例 12) pSFNベクターを用いたラショナル変異株の構築
(45) pSFN— Sm— Aet株の構築
Aet酵素遺伝子部分のみを制限酵素処理により切り出し可能なプラスミド、 pSFN —Sm— Aetを構築するために、 pSF— Sm— Aet (実施例 6)を、 PCRを用いる部位 特異的突然変異誘発法の铸型として使用した。変異はストラタジーン (Stmtagene) 社 (アメリカ）の「クイックチェンジ部位特異的突然変異誘発キット (Quik change Si te- Directed Mutagenesis Kit)」を使用し、製造元のプロトコールに従って、各 種プライマーを用いて導入した。まず、配列番号 127, 128に示すオリゴヌクレオチド をプライマーとした変異導入により、 pSF— Sm— Aetプラスミド上 4587番目の塩基 を置換し (a→g)、 Ndelサイトを欠失した。次に、配列番号 129, 130に示すオリゴヌ クレオチドをプライマーとした変異導入により、 pSF—Sm— Aetプラスミド上 2363番 目の塩基を置換し (tag→atg)、 Ndelサイトを導入した。 PCR反応の生成物を用いて 、ェシエリヒア'コリ JM109を形質転換し、アンピシリン耐性を指標として目的のブラ スミド、 pSFN— Sm— Aetを有する株を選択した。
[0214] (46) pKF— Sm— Aetラショナル変異導入
変異型 Aetを構築するために、 pKF_Sm_Aetプラスミド (実施例 2 (1) )を、 OD A法を用いる部位特異的突然変異誘発法の铸型として使用した。変異は実施例 2 (2 )と同様の方法で、各種変異型酵素に対応するプライマー (配列番号 131〜 137)を 用いて導入し、変異型 Aet遺伝子を含む目的のプラスミド: pKF— Sm— AetMを有 する株を選択した。
[0215] (47) pSFN— Sm— Aetへの載せ変え
変異型 Aet遺伝子を含むプラスミド： pKF— Sm— AetMを铸型として配列番号 12 9, 122に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして PCRにより目的遺伝子を増幅し た。この DNA断片を NdelZPstlにて処理し、得られた DNA断片と pSFN—Sm— Aetの NdelZPstl処理物をライゲーシヨンした。このライゲーシヨン溶液でェシエリヒ ァ 'コリ JM109を形質転換し、アンピシリン耐性を指標として目的のプラスミドを有す る株を選択した。得られた株及び既構築株は、実施例 6 (25)に記載の方法で培養し た。
[0216] (48)微生物菌体を用いるペプチドの生産 く X—Met>
(47)にて得た培養ブロス 40 μ 1を、 10mM EDTAと 50mM 各種アミノ酸メチル エステル、 lOOmM Metを含む lOOmM ホウ酸緩衝液（pH8. 5又は 9. 0) 400 ^ Lに懸濁し、 20°Cにて 1時間反応を行った。この反応で野生株において生成した各 種ジペプチドの濃度を表 14に示した。また、各種変異型酵素発現株 (以下、変異株 と称する）におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃 度の比率を表 14に示した。
[0217] [表 14]
表 14
Figure imgf000155_0001
*野生株のシ プチト'生成濃度 (mM)を「1」とした場合の、
各種変異株のシ 'ヘプチト'生成濃度比率
[0218] (実施例 13)各種ラショナル変異株の基質特異性把握
(49)微生物菌体を用いたジペプチド生産 <Ala— X>
カルボキシ成分にァラニンメチルエステル、ァミン成分に L—アミノ酸を用いた場合 のペプチド生産を検討した。変異型酵素は、実施例 7 (32)、実施例 10 (39)、実施 例 12 (47)で作製した変異株を用いた。実施例 6 (25)に記載した方法で培養した培 養ブロス 20 1を、 50mMのァラニンメチルエステル塩酸塩 (Ala— OMe'HCl)、 10 OmMの L—アミノ酸、 10mMの EDTAを含む 400 /z lのホウ酸緩衝液（ρΗ8. 5)に 加え、 20°Cにて反応した。この反応で野生株において生成した各種ジペプチドの濃 度 (mM)を表 15に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、 野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表 15に示した。尚、表 15中、 Ala— Gly及び Ala— Thrの測定結果は反応時間 10分時のものであり、その他のジぺプチ ドにつ！/ヽては反応時間 15分時の結果を示した。
[0219] [表 15]
Figure imgf000156_0002
Figure imgf000156_0001
チルエステル、 lOOmM L—アミノ酸を含む lOOmM ホウ酸緩衝液（pH8. 5) 400 Lに懸濁し、 20°Cにて 15分反応を行った。この反応で野生株において生成した各 種ジペプチドの濃度 (mMZO. D. )を表 16に示した。また、各種変異株におけるジ ペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表 16に 示した。
[表 16]
表 1 6
Figure imgf000158_0001
*野生株のシ Vフ。チド生成濃度 (mM/O.D.)を「1」とした場合の、各種変異株の'：/へ ° チド生成濃度比率
[0222] (実施例 14)変異の組合せによる高活性株の構築 A
(51) pSF— Sm— Aetラショナル変異導入株の構築
変異型 Aetを構築するために、 pSF— Sm— Aetを PCRを用いる部位特異的突然 変異誘発法の铸型として使用した。変異導入は実施例 12 (45)と同様の方法で行い 、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列番号 138— 157, 160— 167)を用い て導入した。 PCR反応の生成物を用いて、ェシエリヒア'コリ JM109を形質転換し、 アンピシリン耐性を指標として目的のプラスミドを有する株を選択した。得られた株及 び既構築株（実施例 10 (39) )は、実施例 6 (25)に記載した方法で培養した。
[0223] (52)微生物菌体を用いるペプチドの生産 <Ala— X>
(51)で得られた培養ブロス 20 μ 1を、 50mMの Lーァラニンメチルエステル塩酸塩 (Ala— OMe 'HCl)、 lOOmMの L—アミノ酸、 10mMの EDTAを含む 400 1のホ ゥ酸緩衝液 (ρΗ8. 5)に加え、 20°Cにて 15分反応した。この反応で野生株において 生成したジペプチド (Ala— X)の濃度 (mMZO. D. )を表 17に示した。また、各種 変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度 の比率を表 17に示した。
[0224] [表 17]
Figure imgf000160_0002
Figure imgf000160_0003
Figure imgf000160_0001
(53)微生物菌体を用いるペプチドの生産 <Ala— X>
(52)で効果のあった変異点 V184A及び V184Pを pSF— Sm— M7— 35に導入 した。また、 V257Yは pSF— Sm— M7— 35及び pSF— Sm— V184Aに導入した。 変異導入は（45)と同様の方法で行い、铸型は pSF Sm M7— 35又は pSF S m— V184Aを用い、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列番号 79, 80、 93 , 94、 156, 157)を用いて導入した。得られた株は実施例 6 (25)に記載の方法で培 し 7こ。
[0226] (54)微生物菌体を用いるペプチドの生産 <Ala— X>
実施例 8 (34)表 11及び実施例 13 (50)表 16で効果のあった変異点 W187A, F2 11A, Q441E, Q441K, N442Dを既構築 pSF— Sm— M7— 35に導入した。また 、 pSF_Sm_V184A/W187A, V184A/N442D, V184A/N442D/L43 9Vの二重置換体、三重置換体も構築した。更に、 F207Vを pSF— Sm— M7— 35 ZV184Aに導入した変異株も構築した。変異導入は、実施例 12 (45)と同様の方法 で、铸型は pSF— Sm— M7— 35又は pSF— Sm— V184A、 pSF_Sm_M7- 35 ZV184Aを用い、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列番号 131, 158、 13 4, 159、 14, 170、 168, 169等）を用いて行った。得られた株及び既構築株は実施 例 6 (25)に記載の方法で培養した。
[0227] (55)微生物菌体を用いるペプチドの生産 <Ala— X>
(53)、 (54)で得られた培養ブロス 20 μ 1を、 50mMの Lーァラニンメチルエステル 塩酸塩 (Ala— OMe 'HCl)、 lOOmMの L—アミノ酸、 10mMの EDTAを含む 400 1のホウ酸緩衝液 (PH8. 5)に加え、 20°Cにて 15分反応した。この反応で野生株 において生成したジペプチド (Ala— X)の濃度 (mMZO. D. )を表 18に示した。ま た、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの 生成濃度の比率を表 18に示した。
[0228] [表 18]
Figure imgf000162_0002
Figure imgf000162_0003
Figure imgf000162_0001
(56)微生物菌体を用いるペプチドの生産 <Ala— X>
実施例 14 (49)で効果のあった変異点 K83A, W187A, F211A, N442Dを pSF — Sm— M35— 4ZV184Aに導入した。また、変異点 N442Dを pSF— Sm— V18 4Pに導入した二重置換体も構築した。変異導入は (45)と同様の方法で行い、铸型 は pSF Sm M35— 4ZV184A又は pSF Sm V184Pを用い、各種変異型 酵素に対応するプライマーを用いて導入した。得られた株は実施例 6 (25)に記載の 方法で培養した。
[0230] (57)微生物菌体を用いるペプチドの生産 <Ala— X〉
(56)で得られた培養ブロス 20 1を、 50mMの Lーァラニンメチルエステル塩酸塩 (Ala— OMe 'HCl)、 lOOmMの L—アミノ酸、 10mMの EDTAを含む 400 1のホ ゥ酸緩衝液 (ρΗ8. 5)に加え、 20°Cにて 15分反応した。この反応で野生株において 生成したジペプチド (Ala— X)の濃度 (mM)を表 19に示した。また、各種変異株に おけるジペプチド生成については、野生株に対するジペプチドの生成濃度の比率を 表 19に示した。
[0231] [表 19]
表 1 9
Figure imgf000163_0001
*野生株のシ'へ'プチト'生成濃度 (mM)を「1 Jとした場合の、各種変異株のシ'へ °フ°チト'生成濃度比率 ※M35- 4/V184A内の Q441 E変異は、 E→Qに戻っている株
[0232] (実施例 15)ランダムスクリーニング
(58) pTrpT—Sm—Aetランダムライブラリーの作製
変異型 Aetを構築するために、 pTrpT— Sm— Aetまたは pSF— Sm— M35—4
V184Aプラスミドを、 Error prone PCR法を用いるランダム変異誘発法の铸型と して使用した。変異導入ライブラリ一は実施例 3 (8)と同様の方法で作製した。
[0233] (59) pSFN—Sm— Aetランダムライブラリーからのスクリーニング
(58)で作製したライブラリーを、実施例 3 (9)と同様に培養して得られた培養液を 用いて、以下に示す一次スクリーニング (A)〜（C)のうちから選択された 2種類のスク リー-ングを実施し (AZBあるいは AZC)、選抜を行った。
[0234] (60)—次スクリーニング A 得られた菌液 5 1に、 10mM Phenol, 6mM AP、 5mM Asp (OMe) 、 5mM
2
Ala— OEt、 7. 5mM Phe、 3. 6U/ml peroxidase, 0. 16U/ml alchol o xidase、 lOmM EDTA、 lOOmM Borateを含む反応液（pH8. 2)を 200 ΐ添カロ し、 25°Cにて約 20分反応後 500nmの吸光度を測定し、メタノール放出量を算出し た。ここではメタノールの放出量が多いものは Ala - Pheよりも AMPがより生成しやす い酵素として選抜した。
[0235] (61)—次スクリーニング B
(60)と同様に、得られた菌液 5 1に、 10mM Phenol, 6mM AP、 5mM Asp (OMe) 、 5mM A (M)、3. 6U/ml peroxidase, 0. 16U/ml alchol oxida
2
se、 10mM EDTA、 lOOmM Borateを含む反応液（pH8. 2)を 200 1添加し、 25°Cにて約 20分反応後 500nmの吸光度を測定し、メタノール放出量を算出した。 ここではメタノールの放出量が少な 、ものは AM (AM)が生成しにく!/、酵素として選 抜した。
[0236] (62)—次スクリーニング C
(60)と同様に、得られた菌液 5 1に、 10mM Phenol, 6mM AP、 5mM Asp (OMe) 、 3. 6U/ml peroxidase, 0. 16U/ml alchol oxidase, lOmM E
2
DTA、 lOOmM Borateを含む反応液（pH8. 2)を 200 1添加し、 25。Cにて約 20 分反応後 500nmの吸光度を測定し、メタノール放出量を算出した。ここではメタノー ルの放出量が少ないものは Asp (OMe) を分解しにくい酵素として選抜した。
2
[0237] (63)二次スクリーニング
(60)および (61) , (62)にて選抜した株は、実施例 6 (25)と同様な方法で培養し、 その培養ブロス 50 1を 10mM EDTA と 50mM Asp (OMe) 、 50mM Ala—
2
OMe、 75mM Pheを含む lOOmM ホウ酸緩衝液（pH8. 5) lmlに懸濁し、 20°C にて 10分反応を行い、 AMP、 Ala— Phe生成量を測定し、反応初速度の早い株を 選抜した。
[0238] また、同様に培養した培養ブロスを 10mM EDTA と 50mM Asp (OMe) 、 75
2 mM Pheを含む lOOmM ホウ酸緩衝液（pH9. 0)に懸濁し（2. 2UZml反応液） 、 20°Cにて反応を行い、 AMP生成収率を測定し、生成収率上位株について変異点 解析を実施し、以下の変異点を特定した。 pTrpT— Sm— Aetを铸型としたライブラリ 一より、変異型 21, 22, 23 (P214T, Q202E, Y494F)を備える変異株、 pSF— S m— M35— 4ZV184Aを铸型としたライブラリーより、変異型 345, 346, 347, 350 , 351, 352, 343, 354, 348, 349, 353 (M35— 4ZV184Aに対し、それぞれ A 182G, K314R, A515V, K484I, V213A, A245S, V178G, L263M, L66F, S315R, P214Hの各変異を組み合わせたもの）を備える変異株を取得した。この反 応での、反応開始後 20分、 40分及び 70分後における AMP収率を各変異株につい て表 20—1及び表 20— 2に示した。尚、 M35— 4ZV184Aを、以下「A1」と表すこ とがあるちのとする。
[0239] [表 20- 1]
Figure imgf000165_0001
[0240] [表 20- 2]
表 20- 2
Figure imgf000165_0002
(実施例 16)ラショナル変異株の構築
(64)A182, P183, T185への変異導入
V184A変異を持つ株において、収率向上効果があったことから、周辺変異株を構 築した。変異導入は (45)と同様の方法で行い、铸型は pSF— Sm— M35— 4ZV1 84Aを用い、各種変異型酵素に対応するプライマー（配列番号 171— 192)を用い て導入した。
[0242] (65)微生物菌体を用いるペプチドの生産 <AMP>
実施例 15 (63)及び上記（64)で得られた株は実施例 6 (25)に記載の方法で培養 した n培養ブロスを、 400mM Asp (OMe)塩酸塩、 600mM Pheを含む lOOmM
2
ホウ酸緩衝液 (ρΗ8. 5)に懸濁し（lOUZml反応液）、 NaOHを用いて pH8. 5に 維持しながら 25°Cにて反応を行い、反応開始後 20分、 40分、 80分後における AM P生成収率を測定した。この反応での AMP収率を表 21に示した。
[0243] [表 21]
表 21
Figure imgf000166_0001
[0244] (66)微生物菌体を用いるペプチドの生産 く Ala— X>
実施例 15 (63)及び上記（64)で得られた株は実施例 6 (25)に記載の方法で培養 した。培養ブロス 20 1を、 50mMの Ala— OMe 'HCl、 lOOmMの L—アミノ酸、 10 mMの EDTAを含む 400 /z lのホウ酸緩衝液（pH8. 5)に加え、 20°Cにて 15分反応 した。この反応で pSF— Sm— M35— 4/V184Aにおいて生成したジペプチド (Ala —X)の濃度 (mM)を表 22に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成に ついては、 M35— 4ZV184Aに対するジペプチドの生成濃度の比率を表 22に示し た。
[0245] [表 22] 表 22
Figure imgf000167_0001
*M35- W184A酵素のシ Vフ '升'生成濃度 (mM)を Γ 1」とした場合の、
各種変異株のシ'へ' チト'生成濃度比率
[0246] (実施例 17)変異組合せによる高活性株の構築 B
(67)組合せ変異株の構築
実施例 16 ( 66)で M 35— 4Z V 184 A ( A 1 )と組み合わせた場合に効果のあつた変 異点 T185F, A182Gを pSF— Sm— M35— 4ZV184A, pSF— Sm— M7— 35 /V184A, pSF— Sm— M35— 4ZV184AZN442Dに導入した。変異導入は（4 5)と同様の方法で行い、各種変異型酵素に対応するプライマー (配列番号 185, 18 6、 193, 194、 199, 200)を用いて導入した。得られた株は実施例 6 (25)に記載の 方法で培養した。
[0247] (68)微生物菌体を用いるペプチドの生産 <Ala— X>
(67)で得られた培養ブロス 20 ΐを、 50mMの Ala— OMe'HCl、 lOOmMの L— アミノ酸、 10mMの EDTAを含む 400 1のホウ酸緩衝液（pH8. 5)に加え、 20。Cに て 15分反応した。この反応で野生株にぉ 、て生成したジペプチド (Ala— X)の濃度（ mM)を表 23に示した。また、各種変異株におけるジペプチド生成については、野生 株に対するジペプチドの生成濃度の比率を表 23に示した。
[0248] [表 23]
Figure imgf000168_0001
(69)基質増加時のジペプチド生産 <Ala— X>
pSF_Sm_Aet, pSF— Sm— M35—4/V184A, pSF— Sm— M7— 35/V1 4AZA182Gを実施例 6 (25)で示した方法で培養した。培養ブロス 5又は 20 a 1を 、 50mMの Ala— OMe'HCl、 100— 400mMの L—アミノ酸、 lOmMの EDTAを含 む 400 1のホウ酸緩衝液 (pH8. 5)に加え、 20°Cにて 1時間反応した。この反応で 生成したジペプチド (Ala— X)の濃度（mM)を表 24に示した。
[表 24]
表 24
Figure imgf000169_0001
[0251] (実施例 18)基質特異性の把握
(70)変異型酵素を用いた各種ジペプチド生産
カルボキシ成分に各種の L -アミノ酸メチルエステル、ァミン成分に L -アミノ酸を 用いた場合のペプチド生産を検討した。実施例 6 (25)に記載した方法で培養した培 養ブロス 20又は 40 μ 1を、表 25に示す 50mMの L—アミノ酸メチルエステル塩酸塩（ X— OMe'HCl)、 lOOmMの L—アミノ酸、 10mMの EDTAを含む 400 1のホウ酸 緩衝液 (PH8. 5又は 9. 0)に加え、 20°Cにて反応した。この反応で生成した各種ジ ペプチドの生産量を表 25に示した。なお、酵素は pSF— Sm— Aet, pSF_Sm_M 12- 1 (実施例 7 (32) ) , pSF— Sm一 Μ35— 4ZV184A (実施例 10 (39) )を用い 、 Val-Met, Met— Met生成反応においては pSF— Sm— F207V (実施例 6 (24) ) , pSF— Sm一 M35— 4ZV184AZF207Vも用いた。
[0252] [表 25] 表 25
Figure imgf000170_0001
F207V
M35-4/V184A/F207V
Asp(OMe)2
[0253] (実施例 19) Arg— Gin生産
(71)微生物菌体を用 、るペプチドの生産 < Arg— Gin >
pSF— Sm— Aet, pSF— Sm— M35— 4ZV184Aを、実施例 6 (25)に記載した 方法で培養した。培養ブロス lmlを、 lOmM EDTAと 100, 200mM アルギニンメ チルエステル、 150— 300mM Ginを含む lOOmMホウ酸緩衝液（pH9. 0) 9mlに 懸濁し、 20°Cにて 3時間反応を行った。なお、反応に伴って pHが低下するため、 25 %NaOH溶液にて、 pH9. 0に維持しながら反応した。この反応で生成した Arg— G1 n濃度及び収率を表 26に示した。
[0254] [表 26] 表 26
ArgOMe Gin PH strain broth Arg-Gln
(mM) (mM) vol. (mM) yield(%)
100 150 9.0 control 10% 1.3 1.3
9.0 M35-4+V184A 10% 80.5 80.1
200 200 9.0 M35-4+V184A 10% 127.3 61.9
300 9.0 35-4+V184A 10% 144.0 70.8
Reaction time； 180min
[0255] (実施例 20)精製酵素を用いたペプチドの生産
(72)酵素の精製
野生株、 pSF_Sm_M35 -4/V184A, pSF_Sm_M7- 35/V184A/A 182G株は、 LBプレートにてリフレッシュし、 terrific broth 50mlに一白金耳植菌 し、 25°Cにて 18時間培養した。培養液は集菌し、菌体を lOOmM KPB (pH6. 5) にて懸濁後、ソ-ケ一ターにて破砕した（180WZ30分)。溶液を回収し、 200, 000 g、 20分、 4°Cの超遠心分離により、上清を可溶性画分とした。以下の操作は特に明 記しない場合には、 4°Cあるいは氷上で操作を行った。また、下記カラムによる分画 操作は、 AKTAexplorerlOOを使用した。
[0256] 得られた可溶性画分を、あらかじめ lOOmM KPB (pH6. 5)にて平衡化した CH T5—I (5ml、 10 X 64mm)に供し、流速lmlZ分の条件にて100mM KPB緩衝 液で非吸着タンパク質を溶出した後、カラム容量の 25倍での 100— 500mM KPB 緩衝液の直線的濃度勾配にて吸着タンパクを溶出した。
ノ、イドロキシアパタイトクロマトグラフィーにて分離した活性画分を、終濃度 2M硫酸 アンモ-ゥムとなるように調整し、あらかじめ lOOmM KPB (pH6. 5)、 2M硫酸アン モ -ゥムにて平衡化した Hie— resourse— Phe (lml)に供し、流速 lmlZ分の条件 にて非吸着タンパク質を溶出した後、カラム容量の 60倍での 2M— 0M硫酸アンモ- ゥムを含む KPB緩衝液の直線的濃度勾配にて溶出した。
[0257] 疎水クロマトグラフィーにて分離した画分を、あらかじめ 20mM Hepes (pH6. 5) 、 500mM NaClで平衡ィ匕した HiLoad 16/60 Supderdex— 200pg (カラム体 積 120ml、 16mm X 600mm)に供した。流速 0. 75mlZ分の条件にてタンパク質を 溶出させ、活性画分を回収した。活性画分は濃縮後、 20mMHepes (pH6. 5)に対 して透析した。以下に示す Unitは、 Ala— Gin生成反応時の Unitを示す。 [0258] (73)精製酵素を用いたペプチドの生産 く HIL— Phe>
pSF— Sm— M35— 4ZV184A精製酵素 0. 84又は 4. 2U (1, 5 /z l)を、 50mM の HIL ( (2S, 3R, 4S)— 4— Hydroxyisoleucine)がラタトン化したもの、 lOOmM
Pheゝ 10mMの EDTAを含む 150 1のホウ酸緩衝液（pH9. 0)にカロえ、 20。Cにて 1時間反応した。この反応で生成した HIL - Pheの濃度を表 27に示した。
[0259] [表 27] 表 27
U/系 Reac. HIL-Phe
time Cone.
(min) (mM)
4.20 15 0.21
1 20 1.77
0.84 15 0.02
120 0.33
[0260] (74)精製酵素を用いたペプチドの生産 < Gly— Ser (tBu) >
pSF— Sm— M35— 4ZV184A精製酵素 0. 84又は 4. 2U (1, 5 /z l)を、 50mM の Gly— OMeゝ lOOmM Ser (tBu)、 lOmMの EDTAを含む 150 1のホウ酸緩衝 液 (ρΗ8. 5)に加え、 20°Cにて反応した。この反応で生成した Gly—Ser (tBu)の濃 度を Gly— Ser換算で表 28に示した。
[0261] [表 28]
表 28
U/系 Reac. Gly-Ser(tBu)
time Cone.
(mm) (mM)
0.84 15 7.6
60 21.4
120 28.2
4.2 15 24.7
60 28.9
120 27.8
*Gly-Ser換算
[0262] (75)精製酵素を用いたトリペプチドの生産 <Ala— X— X>
pSF_Sm_M35-4/V184AX«pSF_Sm_M7- 35/V184A/A182G 精製酵素 O. 84又は 4. 2U (1, 5 1)を、 50mMの Ala— OMe、 lOOmM X— X、 1 OmMの EDTAを含む 150 /z lのホウ酸緩衝液（pH9. 0)〖こカロえ、 20°Cにて反応した 。この反応で生成したトリペプチド (Ala— X—X)の濃度を表 29に示した。
[表 29]
表 29
Figure imgf000173_0001
[0264] (76)精製酵素を用いたトリペプチドの生産
pSF— Sm— M35— 4ZV184A精製酵素 0. 84又は 4. 2U (1, 5 /z l)を、 50mM の Ala— OMe、 50mM X— X、 lOmMの EDTAを含む 150 1のホウ酸緩衝液（p H9. 0)に加え、 20°Cにて反応した。この反応で生成したトリペプチドの濃度を表 30 に示した。
[0265] [表 30]
表 30
Figure imgf000173_0002
substrate 50mM XOMe + 50m M XX
(77)精製酵素を用いたペプチドの生産 <Ala— X— X>
pSF— Sm— M35— 4ZV184A精製酵素 0. 84又は 4. 2U (1, 5 /z l)を、 lOOm Mの Ala— OMe、 lOOmM X— X、 lOmMの EDTAを含む 150 1のホウ酸緩衝液 (pH9. 0)に加え、 20°Cにて反応した。この反応で生成したトリペプチド (Ala X)の濃度を表 31に示した。
[0267] [表 31]
表 31
Figure imgf000174_0001
Substrate 100m AlaOMe + 100mM XX
[0268] (78)精製酵素を用いたテトラペプチドの生産 < GGFM>
pSF— Sm— M35— 4ZV184A精製酵素 4. 2U (5 /z l)を、 lOOmMの Gly— OM e、40mM GFM、 lOmMの EDTAを含む 150 1のホウ酸緩衝液（pH9. 0)にカロ え、 20°Cにて反応した。この反応で生成したテトラペプチド (GGFM)の濃度を表 32 に示した。
[0269] [表 32]
表 32
Figure imgf000174_0002
[0270] (79)精製酵素を用いたペンタペプチドの生産 く Met— Enkephalin >
pSF— Sm— M35— 4ZV184A精製酵素 4. 2U (5 /z l)を、 50mMの Tyr— OMe 、 5mM GGFM, lOmMの EDTAを含む 150 1のホウ酸緩衝液（pH8. 5)にカロえ 、 20°Cにて反応した。この反応で生成したペンタペプチド (YGGFM)の濃度を表 33 に示した。
[0271] [表 33] 表 33
Figure imgf000175_0001
[0272] (実施例 21)X線結晶構造解析
(1) 配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を高発現させたエシ リヒア 'コリ（E. coli)JM109株を 1L培養し、その菌体から、下記の手順で同タンパク 質を精製した。
[0273] (1 - 1) ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
上記の菌体を「100mM リン酸カリウム緩衝液 (pH6. 5)」（バッファー A)中で破砕 し、その可溶性画分 100mlを、ノ ッファー Aで平衡化したハイドロキシアパタイトカラ ム Bio— Scale CHT— I (バイオラッド製、 CV= 5ml)に供して担体に吸着させた。リ ン酸カリウム緩衝液の濃度を lOOmMから 500mMまで直線的に変化させて（25CV ) ,吸着したタンパク質の溶出を行った。 280nmの吸光度により、タンパク質のピーク を検出し、その画分を分取した。
[0274] (1 2)疎水性クロマトグラフィー
(1 - 1)で分取した画分を、 5倍量の「2M硫酸アンモ-ゥムを添カ卩した lOOmM リン酸カリウム緩衝液 (pH6. 5)」（バッファー B)と、混合した。この溶液をバッファー Bで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラム RESOURCE PHE (アマシャム製、 CV= lml)に供した。この操作により目的タンパク質は担体に吸着した。続いて、硫 酸アンモ-ゥムの濃度を 2M力 OMまで直線勾配で減少させ（60CV)、タンパク質 を溶出させ、その画分を分取した。
[0275] (1 - 3) 陽イオン交換クロマトグラフィー ： Resource S
(1— 2)で分取した画分を、「20mM 酢酸ナトリウム緩衝液 (pH5. 0)」（バッファー C)に対して、一晩透析した。この溶液をバッファー Cで平衡ィ匕した陽イオン交換カラ ム RESOURCE S (アマシャム製、 CV= lml)に供した。塩化ナトリウム濃度を Om Mから 500mMまで直線的に変化させて（50CV)、吸着したタンパク質の溶出を行 つた。 280nmの吸光度により、タンパク質のピークを検出し、その画分を分取した。
[0276] 精製各段階の画分を SDS— PAGEにより確認したところ、（1— 3)の後に得られた 精製タンパク質は、約 70kDaの位置に CBB染色でほぼ単一なバンドとして検出され た。取得したタンパク質溶液は、 20mM HEPES緩衝液 (pH7. 0)に対して 4°Cで 一晩透析した。上記の操作により、約 30mgの精製タンパク質を取得した。
[0277] (2)配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の結晶化
( 1)で得られた精製タンパク質溶液を、限外ろ過器 AmiconUltm (ミリポア製、分 画分子量 lOkDa)を用いて 4°Cで 40mgZml程度にまで濃縮した。得られた濃縮タ ンパク質溶液を用いて、タンパク質濃度、沈殿剤、 pH、温度、添加剤等の様々なパ ラメータを変化させ、結晶化条件を探索した。その結果、を 12— 18% PEG6000、 0. 1M Tris -HCl (pH 8. 0)の組成の沈殿剤溶液に対して、タンパク質溶液 1 μ L, 0. 2%< Octyl β D— glucopyranosideを含む沈殿剤溶液 1 Lを混合 したドロップレットを、 20°Cで平衡化した、 hanging drop蒸気拡散法により、 1週間 程度で 0. 2mm X 0. 2mm X 0. 2mmにまで成長する六角柱状晶を取得した。
[0278] (3)配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の X線結晶構造解析 タンパク質の結晶は、常温測定では、 X線損傷により結晶が劣化し、徐々に分解能 が下がるため、低温条件下での X線回折強度測定を行った。結晶を、 20% グリセ口 ール、 20% PEG6000、0. 1M Tris -HCl (pH 8. 0)、及び 0. 4% Octyl j8 D— glucopyranosideを含む溶液に移した後、— 173°Cの窒素ガスを吹き付け 、急速冷却した。大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構 (つくば巿） 放射光研究施設のビームライン 5に設置された ADSC社製の 315型 CCD検出器を 用いて、結晶の X線回折データを収集した。 X線の波長は 1. 0Aに設定し、結晶から CCD検出器までの距離は 450mmとした。 1フレームの画像データに対しては振動 角 1. 0° で 20秒間露光し、 150フレーム分のデータを集めた。結晶学的パラメータ は、空間群力 SP6 22、格子定数力 104. 324A、 c = 615. 931 Aとなった。 対
5
称単位に 2個のタンパク質分子が含まれているとすると、結晶の水分含有率は 65% である。結晶は 3. OA程度まで回折した。プログラム HKL2000 (Methods Enzym ol. ,第 276卷 第 307〜326頁（1997) )を用いて、データを処理した。データの質 の指標である R の値は， 50. 0〜3. OA分解能で 0. 106、最外郭シェルの 3. 11
merge
〜3. 00A分解能で 0. 450となった。データの完全率は、 50. 0〜3. OA分解能で 97. 2%、最外郭シェルの 3. 11-3. 00A分解能で 81. 1 %となった。
[0279] 分子置換法によって構造解析を行った。タンパク質構造解析プログラムパッケージ CCP4 (Acta Crystallogr. Sect. D、第 50卷、第 760〜763頁（1994) )に含 まれる分子置換法用プログラム AMORE (Acta Crystallogr. Sect. A、第 50卷 、第 157〜163頁（1994) )を用いた。参照構造としては、 αアミノ酸エステル加水分 解酵素の S205A変異体（protein Data Bankのエントリー番号： 1NX9)を利用し た。 αアミノ酸エステル加水分解酵素は 4量体構造をとつているのに対し、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は 2量体構造をとつている。 aアミノ酸 エステル加水分解酵素の単量体構造をモデルとした場合には、有望な解は見い出 せなかった。 αアミノ酸エステル加水分解酵素 4量体からは、 3種類の 2量体構造を 切り出すことが出来る。そこで、この 3種の 2量体を用いた分子置換法を試みた。その 結果、 1NX9坐標データ中の A、 D分子力もなる 2量体をモデルとした場合に、幾つ 力の観点 (第一解のコントラストの良さ、空間群による差が明確、分子間のぶっかりが 無い等)から、有望な解が見出された。得られた初期位相に基づき、 3. 0Α分解能の 電子密度図を計算し、 Accelrys社製のコンピュータグラフィクスプログラム QUANT A上で、電子密度図を描いた。同グラフィックス上での分子モデルの修正と、 Accelr ys社製のプログラム CNXを用いての精密化を繰り返し、構造解析を進めた。
[0280] (4) Lys残基を還元ジメチルイ匕した配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタン パク質の結晶化
タンパク質の Lys残基を還元ジメチルイ匕すると、結晶性が改善される場合があること が報告されている（Biochemistry、第 32卷、第 9851〜9858頁（1993) )。同法に 従い、水素化ホウ素ナトリウム、ホルムアルデヒドを用いて、上記で得られた精製タン ノ ク質溶液の Lys残基を還元ジメチルイ匕し、結晶化実験に供した。その結果、 15% PEG6000、0. 1M Tris— HC1 (pH 8. 0)の組成の沈殿剤溶液に対して、タン パク質溶液: L レ 0. 2%の Octyl β D— glucopyranosideを含む沈殿剤溶液 1 μ Lを混合したドロップレットを平衡ィ匕した、 hanging drop蒸気拡散法により、 1週 間程度で 0. 4mm X O. 2mm X O. 1mmにまで成長する板状晶を取得した。
[0281] (5) Lys残基を還元ジメチルイ匕した配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタン パク質の X線結晶構造解析
結晶を、 20% グリセロール、 20% PEG6000、 0. 1M Tris— HC1 (pH 8. 0 )、及び 0. 4% Octyl β D— glucopyranosideを含む溶液に移した後、— 173 °Cの窒素ガスを吹き付け、急速冷却した。財団法人高輝度光科学研究センター (兵 庫県佐用郡）のシンクロトロン放射光施設 SPring— 8のビームライン 24XUに設置さ れたリガク製の R— AXIS V型イメージングプレート検出器を用いて、結晶の X線回 折データを収集した。 X線の波長は 0. 827 Aに設定し、結晶からイメージングプレー ト検出器までの距離は 500mmとした。 1フレームの画像データに対しては振動角 1. 0° で 90秒間露光し、 180フレーム分のデータ^^めた。結晶学的パラメータは、空 間群力 SP2、格子定数力 a= 74. 476A、 b = 213. 892A、 c = 90. 427Aとなった 。非対称単位に 4個のタンパク質分子が含まれているとすると、結晶の水分含有率は 53%である。結晶は 3. 0A程度まで回折した。リガク製のプログラム CrystalClearを 用いて、データを処理した。データの質の指標である R の値は， 40. 0〜3. 0A
merge
分解能で。. 097、最外郭シェルの 3. 11〜3. 00 A分解能で。. 309となった。デー タの完全率は、 40. 0〜3. OA分解能で 96. 8%、最外郭シェルの 3. 11〜3. ΟθΑ 分解能で 95. 8%となった。
[0282] 分子置換法によって構造解析を行った。タンパク質構造解析プログラムパッケージ CCP4 (Acta Crystallogr. Sect. D、第 50卷、第 760〜763頁（1994) )に含まれ る分子置換法用プログラム AMORE (Acta Crystallogr. Sect. A、第 50卷、第 1 57〜163頁（1994) )を用いた。参照構造としては、 αアミノ酸エステル加水分解酵 素の S205A変異体（protein Data Bankのエントリー番号： 1NX9)を利用した。 aアミノ酸エステル加水分解酵素の単量体構造をモデルとした場合には、有望な解 は見い出せな力つた。そこで、 αアミノ酸エステル加水分解酵素 4量体力も切り出さ れる 3種の 2量体を用いて、分子置換法を試みた。その結果、上記と同様、 1NX9座 標データ中の A、 D分子カゝらなる 2量体をモデルとした場合に、解が見出された。この 結果は、分子置換法の成功を示すと共に、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有 するタンパク質の 2量体構造が明らかにされたことを意味している。得られた初期位 相に基づき、 3. OA分解能の電子密度図を計算し、 Accelrys社製のコンピュータグ ラフイクスプログラム QUANTA上で、電子密度図を描いた。同グラフィックス上での 分子モデルの修正と、 Accelrys社製のプログラム CNXを用いての精密化を繰り返し 、構造解析を進めた。本結晶構造の原子座標を、図 4及び図 5に示した。尚、図 4中 、位置 79— 82の残基を濃い灰色で、その他の残基を薄い灰色で表示し、図 5中、 oc —L ァスパルチル— L フエ-ルァラニン— 13—メチルエステル（i.e. , a ~L~( β - Ο- methyl aspartyl)-L- phenylalanine (略称： a -AMP)を AMP (グレー； baU- and- s tick表示）、力タリティックトライアドを活性部位 (CPK表示）として表示した。
(実施例 22) 立体構造情報を用いたラショナル変異株の作製
配列番号 208に記載された全アミノ酸配列のうち、活性部位に近接する 134残基（ 黒色）に関して、下記の実施例 22に記載したようにラショナル変異にて改変体を作製 した。
( 1)立体構造情報に基づいたラショナル変異法
AMPの生成量を向上させるため、立体構造情報に基づ!/ヽて配列番号 208に記載 のアミノ酸配列（以下 pAlと表記）に対して部位特異的変異を導入することにした。配 列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と配列番号 208に記載のァミノ 酸配列を有するタンパク質の相同性は高く、 4個の置換が施されて 、るにすぎな 、。 そこで、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質から pAlの発現する 変異型ペプチド生成酵素（以下 A1と表記)の立体構造情報を推定し、活性中心であ る力タリティックトライアドの Serl 58から 15A以内に位置する 134個のアミノ酸残基（ 図 5の黒色部分）：67— 70、 72— 88、 100、 102、 103、 106、 107、 113— 117、 1 30、 155— 163、 165、 166、 180—188、 190—195、 200— 235、 259、 273、 27 6、 278、 292— 294、 296、 298、 299、 300— 304、 325— 328、 330— 340、 437 447を AMP生成に寄与する残基と予測し、これらの残基に対して部位特異的変 異を導入することにした。各残基にぉ 、て置換したアミノ酸の種類にっ 、ては表 34 1及び 34— 2に示した。 [0284] [表 34- 1]
Figure imgf000181_0001
OOW O/SOOZdf/ェ：) d 61V 98^SZ.0/900r OAV [0285] [表 34-2]
表 34-2
Figure imgf000183_0001
[0286] (2) 各シングル変異株の作製
変異型 A1を作製するため、 PCRに用いる部位特異的突然変異誘発法の铸型とし て pAlを使用した。変異はストラタジーン（Stratagene)社 (アメリカ）の「クイックチェ ンジ部位特異的突然変異誘発キット（Quik change Site - Directed Mutagen esis Kit)」を使用し、製造元のプロトコールに従った。各残基における部位特異的 変異の導入には、変異コドンを中央に含み、前後に 15merをカ卩えた、合計 33merの プライマーを用いた。各変異点において用いたプライマーを表 46に示した。尚、表 4 6中の各プライマーを構成する塩基配列は配列表にも示されており、表の上段力 下 段の方向へ、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの順に、配列番号 210 力ら 483に対応する。各プライマーの配列の中央部の変異コドン「xxx」（配列番号 2 10から 483の塩基配列中の「nnn」部分）には、置換する各アミノ酸残基の種類に対 応するコドンが導入される。すなわち、すなわち、導入したいアミノ酸残基の種類に応 じて、各プライマー配列中の「XXX」の部分に対応するコドンの配列を導入したものを 用いた。アミノ酸残基に対応する各コドンは、表 44に示すとおりである。 PCR反応の 生成物を用いて、ェシエリヒア'コリ JM109を形質転換し、アンピシリン耐性を指標とし て目的のプラスミドを有する株を選択した。
[0287] (3) 菌体の取得
各変異株を 2mlの terrific培地（12gZlトリプトン、 24gZl酵母エキス、 2. 3g/lU ン酸酸二水素カリウム、 12. 5gZlリン酸水素二カリウム、 4gZlグリセロール、 lOOmg Zlアンピシリン)を張り込んだ普通試験管に一白金耳植菌し、 25°C、 150往復 Z分 で 18時間の本培養を行った。
[0288] (4) 各変異株における比活性の測定
lmLの低濃度反応液（50mMァスパラギン酸ジメチルエステル、 75mMフエ-ル ァラニン)に 50 μ Lの各変異株のブロスを添カ卩し、温度 20°C、初期 pH8. 5で反応を 行った。反応開始 15分後の AMP生成量を HPLCにより定量し、各シングル変異株 の比活性 (UZmL)を算出した。なお、酵素のユニット数 (U)は、 1分間に生成物 A MPを 1 μ mol作ることができる酵素の量を 1Uと定義した。
[0289] (5) 低濃度反応液における各シングル変異株 AMP収率の測定 まず、得られた比活性のデータをもとに各変異株を 2Uにするのに必要なブロス量 を算出した。次に、算出したブロス量を ImLの低濃度反応液に添加し、温度 20°C、 初期 pH8. 5で反応を行った。反応開始 25分および 45分後の AMP生成量を HPL Cにより定量し、 A1よりも収量が高い変異体を表 35— 1〜35— 7にまとめた。これら は、 AMP生成反応に寄与する重要な変異体と判明した。
[表 35-1]
35— 1
変異型 変異体 収率（％) 変異型 L1 N67K 54.9 変異型 L2 N67L 54.1 変異型し 3 N67S 55.1 変異型し 4 T69I 55.3 変異型 L5 T69M 54.6 変異型し 6 T69Q 58.2 変異型 L7 T69R 56.0 変異型し 8 T69V 54.6 変異型し 9 P70G 54.6 変異型 L10 P70N 59.9 変異型 L1 1 P70S 59.5 変異型 L12 P70T 59.5 変異型 L13 P70V 57.5 変異型 L14 A72C 59.4 変異型 L15 A72D 58.6 変異型 L16 A72E 61.8 変異型 L17 A72I 56.3 変異型 L18 A72L 55.6 変異型 L19 A72 57.3 変異型 L20 A72N 60.8 変異型し 21 A72Q 55.1 変異型 L22 A72S 58.4 変異型 L23 A72V 55.1 変異型 L24 V73A 54.4 変異型 L25 V73I 57.0 変異型 L26 V73L 58.4 変異型し 27 V73M 57.9 変異型 L28 V73N 57.6 変異型 L29 V73S 56.1 変異型し 30 V73T 57.7 変異型し 31 S74A 58.4 変異型 L32 S74F 58.5 変異型 L33 S74K 54.0 変異型 L34 S74N 58.6 変異型 L35 S74T 59.6 変異型 L36 S74V 56.8 変異型 L37 P75A 59.4 変異型 L38 P75D 54.8 変異型 L39 P75L 55.1 変異型 L40 P75S 54.6 変異型 L41 Y76F 54.9 変異型 L42 Y76H 56.5 変異型 L43 Y76I 55.9 変異型し 44 Y76V 58.5 変異型 L45 Y76W 54.3 変異型 L46 G77A 59.7 変異型 L47 G77F 56.4 変異型 L48 G77K 57.2 変異型 L49 G77M 54.5 変異型 L50 G77N 59.1 変異型 L51 G77P 55.2 変異型 L52 G77S 57.8 変異型 L53 G77T 55.4 [0291] [表 35- 2]
35-2
変異型 変異体 収率（％) 変異型 L54 Q78F 54.5 変異型 L55 Q78L 58.0 変異型 L56 N79D 55.8 変異型 L57 N79L 54.4 変異型 L58 N79R 56.0 変異型 L59 N79S 55.7 変異型 L60 E80D 56.1 変異型 L61 E80F 56.9 変異型 L62 E80L 59.7 変異型 L63 E80P 57.9 変異型 L64 E80S 57.5 変異型し 65 Y81 A 58.7 変異型 L66 Y81 C 57.2 変異型し 67 Y81 D 57.3 変異型し 68 Y81 E 59.9 変異型 L69 Y81 F 57.9 変異型 L70 Y81 H 59.7 変異型 L71 Y81 K 60.8 変異型 L72 Y81 L 56.2 変異型 L73 Y81 N 59.0 変異型 L74 Y81 S 56.7 変異型 L75 Y81T 56.1 変異型 L76 Y81 W 57.7 変異型 L77 K82D 55.2 変異型 L78 K82L 57.5 変異型 L79 K82P 56.6 変異型 L80 K82S 54.3 変異型 L81 K83D 55.8 変異型 L82 K83F 58.0 変異型 L83 K83L 56.4 変異型 L84 K83P 59.8 変異型 L85 K83S 56.7 変異型 L86 K83V 54.8 変異型 L87 S84D 56.7 変異型 L88 S84F 56.4 変異型し 89 S84K 56.6 変異型し 90 S84L 54.3 変異型 L91 S84N 55.5 変異型 L92 S84Q 56.2 変異型し 93 L85F 60.1 変異型 L94 L85I 59.5 変異型 L95 L85P 57.6 変異型し 96 L85V 59.2 変異型し 97 N87E 58.7 変異型 L98 N87Q 58.5 変異型 L99 F88E 62.7 変異型 L100 V103I 57.3 変異型 L101 V103L 56.7 変異型 L102 K106A 57.7 変異型し 103 K106F 59.3 変異型 L104 K106L 57.3 変異型 L105 K106Q 59.1 変異型 L106 K106S 58.9 変異型 L107 W107A 57.3 [0292] [表 35- 3]
35-3
変異型 変異体 収率（％) 変異型 L108 W107Y 55.3 変異型 U 09 F113A 55.4 変異型 L110 F113W 58.0 変異型 L111 F113Y 57.6 変異型 L112 E114A 57.6 変異型 L113 E114D 58.8 変異型 L114 D115E 54.2 変異型 L115 D115Q 55.0 変異型 L116 D115S 54.6 変異型 L117 I116F 57.0 変異型 L118 I116K 56.1 変異型 L119 I116L 58.3 変異型 L120 I116 57.1 変異型し 121 11欄 56.1 変異型し 122 I116T 54.8 変異型 L123 I116V 54.8 変異型 L124 I157K 60.1 変異型 L125 I157L 63.3 変異型 L126 Y159G 55.6 変異型 L127 Y159N 58.5 変異型 L128 Y159S 56.4 変異型 L129 P160G 58.3 変異型 L130 G161A 58.9 変異型 L131 F162L 58.7 変異型 L132 F162Y 63.0 変異型 L133 Y163I 56.1 変異型 L134 T165V 54.6 変異型 L135 Q181F 57.2 変異型 L136 A182G 61.4 変異型 L137 A182S 55.6 変異型 L138 P183A 55.3 変異型 L139 P183G 54.1 変異型 L140 P183S 54.9 変異型 L141 T185A 57.4 変異型 L142 T185G 54.7 変異型 L143 T185V 55.0 変異型 L144 W187A 54.3 変異型 L145 W187F 57.3 変異型 L146 W187H 55.3 変異型 L147 W187Y 61.9 変異型 L148 Y188F 54.5 変異型 L149 Y188L 57.9 変異型 L150 Y188W 54.2 変異型 L151 G190A 57.7 変異型 L152 G190D 55.8 変異型 L153 F193W 56.7 変異型し 154 H194D 55.0 変異型 L155 F200A 57.4 変異型 L156 F200L 57.6 変異型 L157 F200S 55.3 変異型 L158 F200V 57.3 変異型 L159 L201Q 54.3 変異型 L160 L201S 59.6 変異型 L161 Q202A 57.1 [0293] [表 35-4]
35- 4
変異型 変異体 収率（"½) 変異型 L162 Q202D 62.8 変異型 L163 Q202F 55.9 変異型 L164 Q202S 55.1 変異型 L165 Q202T 55.0 変異型 L166 Q202V 56.1 変異型 L167 D203E 55.7 変異型 L168 A204G 62.2 変異型 L169 A204L 55.2 変異型 L170 A204S 58.0 変異型 L171 A204T 55.7 変異型 L172 A204V 57.2 変異型 L173 F205L 59.1 変異型し 174 F205Q 55.6 変異型 L175 F205V 54.7 変異型 L176 F205W 64.6 変異型 L177 T206F 57.9 変異型 L178 T206K 54.3 変異型 L179 T206L 60.3 変異型 L180 F207I 55.9 変異型 L181 F207W 58.8 変異型 L182 F207Y 57.5 変異型 L183 M208A 57.4 変異型 L184 M208L 58.9 変異型 L185 S209F 61.7 変異型 L186 S209K 60.5 変異型 L187 S209L 59.9 変異型 L188 S209N 60.3 変異型 L189 S209V 60.1 変異型 L190 T210A 56.6 変異型し 191 T210L 59.3 変異型 L192 T210Q 55.1 変異型 L193 T210V 54.5 変異型 L194 F21 1A 59.3 変異型 L195 F21 1 I 60.6 変異型 L196 F21 1 L 56.3 変異型 L197 F211 54.3 変異型 L198 F21 1 V 57.8 変異型 L199 F21 1 W 58.3 変異型 L200 F21 1 Y 57.8 変異型し 201 G212A 56.8 変異型 L202 V213D 54.9 変異型 L203 V213F 56.0 変異型 L204 V213K 56.1 変異型 L205 V213S 57.3 変異型 L206 P214D 54.0 変異型 L207 P214F 56.3 変異型 L208 P214K 54.9 変異型 L209 P214S 54.1 変異型し 210 R215A 55.6 変異型し 21 1 R215I 57.4 変異型 L212 R215K 56.9 変異型 L213 R215Q 55.4 変異型 L214 R215S 55.6 変異型 L215 R215T 56.9 [0294] [表 35- 5]
35-5
変異型 異体 収率（％) 変異型 L216 R215Y 57.4 変異型 L217 P216D 54.7 変異型し 218 P216K 55.6 変異型し 219 K217D 55.3 変異型 L220 P218F 55.5 変異型 L221 P218L 54.1 変異型 L222 P218Q 54.9 変異型し 223 P218S 54.6 変異型し 224 1219D 57.1 変異型 L225 1219F 54.4 変異型 L226 1219K 55.8 変異型 L227 T220A 54.6 変異型し 228 T220D 54.6 変異型 L229 T220F 55.3 変異型 L230 T220K 55.8 変異型 L231 T220L 54.6 変異型 L232 T220S 54.6 変異型 L233 P221A 57.8 変異型 L234 P221 D 56.7 変異型 L235 P221 F 54.8 変異型 L236 P221 K 58.0 変異型 L237 P221 L 55.2 変異型 L238 P221 S 56.5 変異型 L239 D222A 54.7 変異型し 240 D222F 56.5 変異型 L241 D222L 58.t 変異型し 242 D222R 54.0 変異型 L243 Q223F 54.7 変異型 L244 Q223K 54.8 変異型し 245 Q223L 55.2 変異型 L246 Q223S 57.9 変異型 L247 F224A 55.9 変異型し 248 F224D 55.7 変異型 L249 F224G 54.2 変異型 L250 F224K 55.2 変異型 L251 F224L 54.8 変異型 L252 K225D 54.8 変異型 L253 K225G 54.4 変異型し 254 K225S 55.4 変異型 L255 G226A 56.6 変異型 L256 G226F 55.2 変異型 L257 G226L 55.7 変異型 L258 G226N 55.6 変異型 L259 G226S 54.5 変異型 L260 K227D 55.1 変異型し 261 K227F 57.6 変異型し 262 K227S 61.3 変異型 L263 I228A 54.5 変異型 L264 I228F 59.3 変異型 L265 I228K 58.2 変異型 L266 I228S 54.3 変異型し 267 P229A 54.6 変異型 L268 P229D 57.0 変異型 L269 P229K 54.8 [0295] [表 35-6]
35 - 6
変異型 変異体 収率（％) 変異型 L270 P229L 60.6 変異型 L271 P229S 54.1 変異型 L272 I230A 56.9 変異型し 273 I230F 58.2 変異型 L274 I230K 55.3 変異型 L275 I230S 57.8 変異型し 276 K231 F 56.2 変異型し 277 K231 L 60.4 変異型し 278 K231 S 56.3 変異型 L279 E232D 59.0 変異型 L280 E232F 56.5 変異型 L281 E232G 57.5 変異型 L282 E232L 55.6 変異型 L283 E232S 55.0 変異型 L284 A233D 56.4 変異型 L285 A233F 54.1 変異型 L286 A233H 56.8 変異型し 287 A233K 55.4 変異型 L288 A233L 55.6 変異型 L289 A233N 54.9 変異型 L290 A233S 55.4 変異型 L291 D234L 56.3 変異型し 292 D234S 55.4 変異型 L293 K235D 54.9 変異型 L294 K235F 55.4 変異型 L295 K235L 56.0 変異型し 296 K235S 55.4 変異型し 297 F259Y 55.3 変異型 L298 R276A 57.4 変異型 L299 R276Q 56.2 変異型 L300 A298S 59.0 変異型 L301 D300N 54.5 変異型 L302 V301 56.6 変異型 L303 Y328F 62.4 変異型 L304 Y328H 56.8 変異型 L305 Y328M 55.0 変異型 L306 Y328W 59.3 変異型 L307 W332H 57.6 変異型し 308 E336A 56.5 変異型 L309 N338A 54.0 変異型 L310 N338F 56.4 変異型 L31 1 Y339K 54.7 変異型 L312 Y339し 57.1 変異型 L313 Y339T 55.0 変異型 L314 L340A 54.7 変異型 L315 L340I 54.4 変異型し 316 L340V 55.4 変異型 L317 V439P 56.2 変異型 L318 I440F 56.3 変異型 L319 I440V 56.3 変異型 L320 E441 F 54.1 変異型 L321 E441 M 57.2 変異型し 322 E441 55.1 変異型 L323 N442A 57.3 [0296] [表 35- 7]
表 35-
Figure imgf000197_0001
[0297] (6)収率向上率の算出
シングル変異体 1137種のうち、 A1よりも収率が向上した変異体として 335種取得 した。収率向上率は 335 X 1137 = 0. 29である。一方、各残基ごとに収率向上率を 算出した結果を表 36及び表 37にまとめた。収率向上率は各残基ごとに大きく異なり 、例えば 40%以上の確率で収率が向上する部位は 47箇所存在した。 30%以上で は 59箇所、 20%以上では 71箇所にも達した。収率向上確率として 20%を越える部 位に関しては、非常に高い確率で収率を向上させることが可能であり、産業上極めて 重要な変異点と判断することができる。
[0298] [表 36- 1]
Figure imgf000198_0001
[0299] [表 36- 2]
Figure imgf000200_0001
[0300] [表 37- 1]
Figure imgf000202_0001
[0301] [表 37- 2]
表 37 - 2
Figure imgf000203_0001
[0302] (7) ダブル変異株の作製
さらなる収率向上株の取得を目指し、 AMPの収率が向上した変異点を相互に組 み合わせてダブル変異株を作製した (表 37)。例えば、 AMPの収率が大きく向上し た変異点である I157Lと Y328Fを組み合わせる場合、 pAlZll57Lに対して Y328 Fを導入するために使用したプライマーを用いて、実施例 22の（2)に記載した方法 により PCRおよび形質転換を行い、アンピシリン耐性を指標として目的のプラスミドを 有する株を選択した。
[0303] (8) 各ダブル変異株における比活性の測定
実施例 22の (4)に記載した方法によって、各ダブル変異株の比活性 (UZmL)を 算出し、表 38に示した。
[0304] (9) 低濃度反応液における各ダブル変異株 AMP収率の測定
まず、得られた比活性のデータをもとに各変異株を 2Uにするのに必要なブロス量 を算出した。次に、算出したブロス量を lmLの低濃度反応液に添加し、温度 20°C、 初期 pH8. 5で反応を行った。反応開始 25分および 45分後の AMP生成量を HPL Cにより定量し、 A1よりも収量が高い変異体を表 38にまとめた。これらは、 2残基の変 異を組み合わせることによっても収率が向上する変異であると判明した。
[0305] (10) 多重変異株の作製
より一層の収率向上株の取得を目指し、 AMPの収率が向上した組み合わせ可能 な変異点を相互に組み合わせて多重変異株を作製した (表 38)。例えば、 AMPの 収率が大きく向上した変異点である Y81AZY328Fに対して I157Lを組み合わせる 場合、 PA1ZY81AZY328Fに対して I157Lを導入するために使用したプライマー を用いて、実施例 22の（2)に記載した方法により PCRおよび形質転換を行い、アン ピシリン耐性を指標として目的のプラスミドを有する株を選択した。同様に、反応開始
25分および 45分後の AMP生成量を HPLCにより定量し、 A1よりも収量が高 、変異 体を表 38にまとめた。これらは、 3残基以上の変異を組み合わせることによっても収 率が向上する変異であると判明した。
[表 38- 1]
表 38-1
Figure imgf000205_0001
表 38- 2] 8- 2
変異型 変異 A1比 変異型 M54 G77S A184G 1.07 変異型 M55 G77S W187F 1.10 変異型 M56 G77S F200A 1.00 変異型 M57 G77S A204S 1.00 変異型 M58 G77S T210L 1.03 変異型 M59 G77S F211L 1.16 変異型 M60 G77S F211W 1.13 変異型 M61 G77S I228K 1.06 変異型 M62 G77S A233D 1.11 変異型 M63 G77S R276A 1.11 変異型 M64 G77S Y328F 1.34 変異型 M65 E80D Y81A 1.02 変異型 M66 E80D F113W 1.07 変異型 M67 E80D I157L 1.20 変異型 M68 E80D Y159N 1.19 変異型 M69 E80D G161A 1.08 変異型 M70 E80D A184G 1.12 変異型 M71 E80D F211W 1.07 変異型 M72 E80D Y328F 1.17 変異型 M73 E80S I157L 1.19 変異型 M74 Y81A F113W 1.06 変異型 M75 Y81A I157L 1.17 変異型 M76 Y81A Y159N 1.14 変異型 M77 Y81A Y159S 1.17 変異型 M78 Y81A G161A 1.02 変異型 M79 Y81A A184G 1.08 変異型 M80 Y81A W187F 1.08 変異型 M81 Y81A F200A 1.01 変異型 M82 Y81A T2 0L 1.05 変異型 M83 Y81A F211W 1.14 変異型 M84 Y81A F211Y 1.16 変異型 M85 Y81A G226A 1.06 変異型 M86 Y81A I228K 1.02 変異型 M87 Y81A A233D 1.05 変異型 M88 Y81A Y328F 1.19 変異型 M89 Y81H I157L 1.29 変異型 M90 Y81N I157L 1.24 変異型 M91 K83P I157L 1.23 変異型 M92 S84A I157L 1.23 変異型 M93 S84D F113W 1.04 変異型 M94 S84D I157L 1.19 変異型 M95 S84D Y159N 1.25 変異型 M96 S84D G161A 1.03 変異型 M97 S84D A184G 1.04 変異型 M98 S84D Y328F 1.16 変異型 M99 S84E I157L 1.16 変異型 M100 S84F I157L 1.20 変異型 M101 S84K I157L 1.26 変異型 M102 L85F I157L 1.14 変異型 M103 L85I I157L 1.27 変異型 M104 L85P I157L 1.24 変異型 M105 L85V I157L 1.36 変異型 M106 N87A I157L 1.21 変異型 M107 N87D I157L 1.22 表 38- 3]
表 38 - 3
変異型 変異 A1比 変異型 M108 N87E I157L 1.12 変異型 M109 N87G I157L 1.30 変異型 M110 N87Q I157L 1.18 変異型 M111 N87S I157L 1.17 変異型 M112 F88A I157L 1.11 変異型 M113 F88D I157L 1.08 変異型 M114 F88E I157L 1.40 変異型 M115 F88E Y328F 1.20 変異型 M116 F88L I157L 1.00 変異型 M117 F88T I157L 1.11 変異型 M118 F88V I157L 1.08 変異型 M119 F88Y I157L 1.18 変異型 M120 K106H I157L 1.22 変異型 M121 K106L 1157L 1.22 変異型 M122 K106M I157L 1.17 変異型 M123 K106Q I157L 1.16 変異型 M124 K106R I157L 1.20 変異型 M125 K106S I157L 1.25 変異型 M126 K106V I157L 1.37 変異型 M127 W107A I157L 1.23 変異型 M128 W107A Y328F 1.16 変異型 M129 W107Y I157L 1.24 変異型 M130 W107Y T206Y 1.01 変異型 M131 W107Y K217D 1.04 変異型 M132 W107Y P218L 1.04 変異型 M133 W107Y T220L 1.03 変異型 M134 W107Y P221D 1.02 変異型 M135 W107Y Y328F 1.14 変異型 M136 F113A 1157し 1.12 変異型 M137 F113H I157L 1.26 変異型 M138 F113N I157L 1.14 変異型 M139 F113V I157L 1.06 変異型 M140 F113W 1157L 1.19 変異型 M141 F113W Y159N 1.09 変異型 M142 F113W Y159S 1.12 変異型 M143 F113W G161A 1.08 変異型 M144 F113W F162L 1.13 変異型 M145 F113W A184G 1.10 変異型 Ml 46 F113W W187F 1.05 変異型 M147 F113W F200A 1.0フ 変異型 M148 F113W T206Y 1.02 変異型 M149 F113W T210L 1.08 変異型 M150 F113W F211L 1.00 変異型 M151 F113W F211W 1.15 変異型 M152 F113W F211Y 1.15 変異型 M153 F113W V213D 1.02 変異型 M154 F113W K217D 1.04 変異型 M155 F113W T220L 1.06 変異型 M156 F113W P221D 1.06 変異型 M157 F113W G226A 1.05 変異型 M158 F113W I228K 1.11 変異型 M159 F113W A233D 1.03 変異型 M160 F113W R276A 1.05 変異型 M161 F113Y I157L 1.20 表 38- 4]
表 38-4
変異型 変異 A1比 変異型 M162 F1 13Y F21 1W 1.13 変異型 M163 E1 14D I157L 1.13 変異型 M164 D1 15A I157L 1.15 変異型 M165 D1 15E I157L 1.27 変異型 M166 D115M I157L 1.08 変異型 M167 D1 15N I157L 1.28 変異型 M168 D115Q I157L 1.17 変異型 M169 D115S I157L 1.21 変異型 M170 D1 15V I157L 1.14 変異型 M171 I157L Y159I 1.02 変異型 M 172 I157L Y159L 1.07 変異型 M173 I157L Y159N 1.45 変異型 M174 I157L Y159S 1.30 変異型 M175 I157L Y159V 1.1 1 変異型 M176 I157L P160A 1.03 変異型 M177 I157L P160S 1.13 変異型 M178 I157L G161A 1.28 変異型 M179 I157L F162L 1.23 変異型 M180 I157L F162M 1.34 変異型 M181 I157L F162N 1.14 変異型 M182 I157L F162Y 1.28 変異型 M183 I157L T165L 1.23 変異型 M184 I157L T165V 1.30 変異型 M185 I157L Q181A 1.22 変異型 M186 I157L Q181 F 1.35 変異型 M187 I157L Q181 N 1.34 変異型 M188 I157L A184G 1.35 変異型 M189 I157L A184L 1.08 変異型 M190 I157L A184M 1.04 変異型 M191 I157L A184S 1.16 変異型 M192 I157L A184T 1.22 変異型 M193 I157L W187F 1.27 変異型 M194 I157L W187Y 1.22 変異型 M195 I157L F193H 1.31 変異型 M196 I157L F193I 1.20 変異型 M197 I157L F193W 1.17 変異型 M198 I157L F200A 1.26 変異型 M199 I157L F200H 1.37 変異型 M200 I157L F200L 1.31 変異型 M201 I157L F200Y 1.32 変異型 M202 I157L A204G 1.38 変異型 M203 I157L A204I 1.37 変異型 M204 I157L A204L 1.40 変異型 M205 I157L A204S 1.21 変異型 M206 I157L A204T 1.21 変異型 M207 I157L A204V 1.20 変異型 M208 I157L F205A 1.27 変異型 M209 I157L F207I 1.1 1 変異型 M210 I157L F207M 1.26 変異型 M21 1 I157L F207V 1.09 変異型 M212 I157L F207W 1.19 変異型 M213 I157L F207Y 1.24 変異型 M214 I157L M208A 1.22 変異型 M215 I157L M208K 1.34 38 - 5]
表 38 - 5
変異 A1比 変異型 M216 I157L M208L 1.25 変異型 M217 I157L M208T 1.25 変異型 M218 I157L M208V 1.25 変異型 M219 I157L S209F 1.19 変異型 M220 I157L S209N 1.28 変異型 M221 I157L T210A 1.28 変異型 M222 I157L T210L 1.27 変異型 M223 I157L F21 1 I 1.20 変異型 M224 I157L F21 1 L 1.32 変異型 M225 I157L F21 1V 1.17 変異型 M226 I157L F21 1W 1.63 変異型 M227 I157L G212A 1.16 変異型 M228 I157L G212D 1.28 変異型 M229 I157L G212S 1.17 変異型 M230 I157L R215K 1.18 変異型 M231 I157L R215L 1.17 変異型 M232 I157L R215T 1.20 変異型 M233 I157L R215Y 1.16 変異型 M234 I157L T220L 1.23 変異型 M235 I157L G226A 1.29 変異型 M236 I157L G226F 1.24 変異型 M237 I157L I228K 1.24 変異型 M238 I157L A233D 1.21 変異型 M239 I157L R276A 1.22 変異型 M240 I157L Y328A 1.13 変異型 M241 I157L Y328F 1.37 変異型 M242 I157L Y328H 1.21 変異型 M243 I157L Y328I 1.25 変異型 M244 I157L Y328L 1.24 変異型 M245 I157L Y328P 1.02 変異型 M246 I157L Y328V 1.08 変異型 M247 I157L Y328W 1.10 変異型 M248 I157L L340F 1.12 変異型 M249 I157L L340I 1.33 変異型 M250 I157L L340V 1.31 変異型 M251 I157L V439A 1.27 変異型 M252 1157L V439P 1.26 変異型 M253 I157L R445A 1.14 変異型 M254 I157L R445F 1.06 変異型 M255 I157L R445G 1.15 変異型 M256 I157L R445K 1.17 変異型 M257 I157L R445V 1.14 変異型 M258 Y159N G161A 1.25 変異型 M259 Y159N A184G 1.31 変異型 M260 Y159N A204S 1.22 変異型 M261 Y159N T210L 1.26 変異型 M262 Y159N F21 1W 1.05 変異型 M263 Y159N F21 1Y 1.03 変異型 M264 Y159N G226A 1.33 変異型 M265 Y159N I228K 1.1 7 変異型 M266 Y159N A233D 1.26 変異型 M267 Y159N Y328F 1.25 変異型 M268 Y159S G161A 1.41 変異型 M269 Y159S F21 1W 1.25 表 38 - 6] 表 38 - 6
変異型 変異 A1比 変異型 M270 G161A F162L 1.16 変異型 M271 G161A A184G 1.17 変異型 M272 G161A W187F 1.13 変異型 M273 G161A F200A 1.15 変異型 M274 G161A A204S 1.15 変異型 M275 G161A T210L 1.11 変異型 M276 G161A F211L 1.19 変異型 M277 G161A F211W 1.21 変異型 M278 G161A G226A 1.28 変異型 M279 G161A I228K 1.13 変異型 M280 G161A A233D 1.13 変異型 M281 G161A Y328F 1.27 変異型 M282 F162L A184G 1.11 変異型 M283 F162L F211W 1.09 変異型 M284 F162L A233D 1.01 変異型 M285 P183A Y328F 1.19 変異型 M286 A184G W187F 1.18 変異型 M287 A184G F200A 1.14 変異型 M288 A184G A204S 1.11 変異型 M289 A184G T210L 1.02 変異型 M290 A184G F211L 1.23 変異型 M291 A184G F211W 1.22 変異型 M292 A184G I228K 1.12 変異型 M293 A184G A233D 1.15 変異型 M294 A184G R276A 1.08 変異型 M295 V184G Y328F 1.30 変異型 M296 T185A Y328F 1.11 変異型 M297 T185N Y328F 1.14 変異型 M298 W187F F211W 1.32 変異型 M299 W187F Y328F 1.30 変異型 M300 F193W F211W 1.02 変異型 M301 F200A F211W 1.30 変異型 M302 F200A Y328F 1.24 変異型 M303 L201Q Y328F 1.01 変異型 M304 L201S Y328F 1.14 変異型 M305 A204S F211W 1.22 変異型 M306 A204S Y328F 1.18 変異型 M307 T210L F211W 1.06 変異型 M308 T210L Y328F 1.20 変異型 M309 F211L A233D 1.02 変異型 M310 F211L Y328F 1.23 変異型 M311 F211W I228K 1.19 変異型 M312 F211W A233D 1.10 変異型 M313 F211W Y328F 1.18 変異型 M314 R215A Y328F 1.09 変異型 M315 R215L Y328F 1.11 変異型 M316 T220L A233D 1.03 変異型 M317 T220し D300N 1.03 変異型 M318 P221L A233D 1.02 変異型 M319 P221L Y328F 1.15 変異型 M320 F224A A233D 1.04 変異型 M321 G226A Y328F 1.12 変異型 M322 G226F A233D 1.06 変異型 M323 G226F Y328F 1.11 表 38- 7]
表 38-7
変異型 変異 A1比 変異型 M324 I228K Y328F 1.15 変異型 M325 A233D K235D 1.02 変異型 M326 A233D Y328F 1.40 変異型 M327 R276A Y328F 1.24 変異型 M328 Y328F Y339F 1 .14 変異型 M329 A27T Y81 A S84D 1 .06 変異型 M330 P70T A72E I157L 1 .30 変異型 M331 P70T G77S I157L 1 .35 変異型 M332 P70T E80D F88E 1.1フ 変異型 M333 P70T Y81 A I157L 1 .21 変異型 M334 P70T S84D I157L 1.1フ 変異型 M335 P70T F88E Y328F 1.29 変異型 M336 P70T F113W I157L 1.23 変異型 M337 P70T I157L A204S 1.21 変異型 M338 P70T I157L T210L 1.25 変異型 M339 P70T I157L A233D 1.18 変異型 M340 P70T I157L Y328F 1.34 変異型 M341 P70T I157L V439P 1.23 変異型 M342 P70T I157L I440F 1.25 変異型 M343 P70T G161 A T210L 1.29 変異型 M344 P70T G161 A Y328F 1.32 変異型 M345 P70T A184G W187F 1.20 変異型 M346 P70T A204S Y328F 1.25 変異型 M347 P70T F21 1 W Y328F 1.33 変異型 M348 P70V A72E I157L 1.32 変異型 M349 A72E S74T I157L 1.32 変異型 M350 A72E G77S Y328F 1.24 変異型 M351 A72E E80D Y328F 1.35 変異型 M352 A72E Y81 H I157L 1.28 変異型 M353 A72E K83P I157L 1.35 変異型 M354 A72E S84D Y328F 1.15 変異型 M355 A72E L85P I157L 1.30 変異型 M356 A72E F1 13W 1157L 1.34 変異型 M357 A72E F1 13W Y328F 1.30 変異型 M358 A72E F1 13Y I157L 1.35 変異型 M359 A72E D1 15Q I157L 1.31 変異型 M360 A72E I157L G161 A 1.21 変異型 M361 A72E I157L F162L 1.26 変異型 M362 A72E I157L A184G 1.52 変異型 M363 A72E I157L F200A 1.20 変異型 M364 A72E I1 57L A204S 1.28 変異型 M365 A72E I157L A204T 1.29 変異型 M366 A72E I157L T210L 1.30 変異型 M367 A72E I157L F21 1 W 1.17 変異型 M368 A72E I157L G226A 1.31 変異型 M369 A72E I157L A233D 1.43 変異型 M370 A72E I157L Y328F 1 .39 変異型 M371 A72E I157L L340V 1 .34 変異型 M372 A72E I157L V439P 1.22 変異型 M373 A72E G161 A Y328F 1.45 変異型 M374 A72E F162L Y328F 1.21 変異型 M375 A72E A184G Y328F 1.31 変異型 M376 A72E W187F Y328F 1.30 変異型 M377 A72E F200A Y328F 1.23
[8- 8ε挲] [ειεο] l7CZ0/S00Zdf/X3d 01· S 9817S .0/900Z OAV 8 - 8
変異型 変異 A1比 変異型 M378 A72E A204S Y328F 1.20 変異型 M379 A72E T210L Y328F 1.15 変異型 M380 A72E I228K Y328F 1.12 変異型 M381 A72E A233D Y328F 1.16 変異型 M382 A72E Y328F Y159N 1.26 変異型 M383 A72E Y328F F211W 1.45 変異型 M384 A72E Y328F F211Y 1.22 変異型 M385 A72E Y328F G226A 1.22 変異型 M386 A72V Y81A Y328F 1.01 変異型 M387 A72V G161A Y328F 1.30 変異型 M388 G77M I157L T210L 1.37 変異型 M389 G77P I157L F162L 1.30 変異型 M390 G77P I157L A184G 1.25 変異型 M391 G77P F211W Y328F 1.28 変異型 M392 G77S Y81A Y328F 1.34 変異型 M393 G77S S84D I157L 1.29 変異型 M394 G77S F88E I157L 1.25 変異型 M395 G77S F113W I157L 1.16 変異型 M396 G77S F113Y I157L 1.21 変異型 M397 G77S D115Q I157L 1.22 変異型 M398 G77S I157L G161A 1.21 変異型 M399 G77S I157L F200A 1.33 変異型 M400 G77S I157L A204S 1.30 変異型 M401 G77S I157L T210L 1.20 変異型 M402 G77S I157L F211W 1.49 変異型 M403 G77S I157L G226A 1.38 変異型 M404 G77S I157L A233D 1.39 変異型 M405 G77S I157L L340V 1.38 変異型 M406 G77S I157L V439P 1.33 変異型 M407 G77S G161A Y328F 1.27 変異型 M408 E80D Y81A Y328F 1.19 変異型 M409 Y81A S84D Y328F 1.17 変異型 M410 Y81A F113W Y328F 1.19 変異型 M411 Y81A I157L T210L 1.14 変異型 M412 Y81A I157L Y328F 1.32 変異型 M413 Y81A G161A Y328F 1.17 変異型 M414 Y81A F162L Y328F 1.20 変異型 M415 Y81A A184G Y328F 1.27 変異型 M416 丫 81 A W187F Y328F 1.19 変異型 M417 Y81A A204S Y328F 1.11 変異型 M418 Y81A T210L Y328F 1.22 変異型 M419 Y81A I228K Y328F 1.27 変異型 M420 Y81A A233D Y328F 1.19 変異型 M421 Y81A Y328F Y159N 1.32 変異型 M422 Y81A Y328F Y159S 1.20 変異型 M423 Y81A Y328F F211W 1.24 変異型 M424 Y81A Y328F F211Y 1.30 変異型 M425 Y81A Y328F G226A 1.21 変異型 M426 Y81A Y328F R276A 1.32 変異型 M427 K83P I 57L A184G 1.33 変異型 M428 K83P I157L T210L 1.30 変異型 M429 K83P F211W Y328F 1.24 変異型 M430 S84D F113W I157L 1.34 変異型 M431 S84D I157L T210L 1.33 [0314] [表 38- 9]
8- 9
変異型 変異 A1比 変異型 M432 F88E I157L F162L 1.24 変異型 M433 F88E I157L A184G 1.31 変異型 M434 F88E I157L F200A 1.21 変異型 M435 F88E I157L T210L 1.37 変異型 M436 F88E I157L Y328F 1.32 変異型 M437 F88E I157L Y328Q 1.09 変異型 M438 F88E I157L L340V 1.29 変異型 M439 F88E T210L Y328F 1.19 変異型 M440 F88E F211W Y328F 1.31 変異型 M441 F113W I157L G161A 1.26 変異型 M442 F113W I157L A184G 1.36 変異型 M443 F113W I157L W187F 1.20 変異型 M444 F113W I157L F200A 1.33 変異型 M445 F113W I157L A204S 1.33 変異型 M446 F113W I157L A204T 1.29 変異型 M447 F113W 1157し T210L 1.16 変異型 M448 F113W I157L F211W 1.48 変異型 M449 F113W I157L G226A 1.31 変異型 M450 F113W I157L A233D 1.35 変異型 M451 F113W I157L Y328F 1.26 変異型 M452 F113W I157L L340V 1.34 変異型 M453 F113W I157L V439P 1.33 変異型 M454 F113W G161A T210L 1.11 変異型 M455 F113W G161A Y328F 1.27 変異型 M456 F113W A184G W187F 1.11 変異型 M457 F113Y 1157L T210L 1.26 変異型 M458 F113Y I157L Y328F 1.27 変異型 M459 F113Y G161A T210L 1.08 変異型 M460 D115Q I157L T210L 1.21 変異型 M461 D115Q I157L Y328F 1.24 変異型 M462 1157し Y159N T210L 1.34 変異型 M463 I157L Y159N Y328F 1.49 変異型 M464 I157L G161A W187F 1.19 変異型 M465 I157L G161A F200A 1.01 変異型 M466 1157L G161A A204S 1.20 変異型 M467 I157L G161A T210L 1.20 変異型 M468 I157L G161A A233D 1.22 変異型 M469 I157L G161A Y328F 1.43 変異型 M470 I157L F162L A184G 1.35 変異型 M471 I157L F162L T210L 1.26 変異型 M472 M57L F162L L340V 1.28 変異型 M473 I157L A184G W187F 1.25 変異型 M474 I157L A184G F200A 1.29 変異型 M475 I157L A184G A204T 1.19 変異型 M476 I157L A184G T210L 1.31 変異型 M477 I157L A184G F211W 1.44 変異型 M478 I157L A184G L340V 1.34 変異型 M479 I157L W187F T210L 1.13 変異型 M480 I157L W187F Y328F 1.27 変異型 M481 I157L F200A T210L 1.18 変異型 M482 I157L F200A Y328F 1.31 変異型 M483 I157L A204S T210L 1.22 変異型 M484 I157L A204S Y328F 1.30 変異型 M485 I157L A204T T210L 1.22 表 38-10]
表 38 - 10
変異型 変異 A1比 変異型 M486 I157L A204T Y328F 1.29 変異型 M487 I157L T210L F21 1W 1.25 変異型 M488 I157L T210L G212A 1.18 変異型 M489 I157L T210L G226A 1.20 変異型 M490 I157L T210L A233D 1.22 変異型 M491 I157L T210L Y328F 1.34 変異型 M492 I157L T210L L340V 1.37 変異型 M493 I157L T210L V439P 1.35 変異型 M494 I157L F21 1W Y328F 1.40 変異型 M495 I157L G226A Y328F 1.24 変異型 M496 1157L A233D Y328F 1.26 変異型 M497 I157L Y328F L340V 1.33 変異型 M498 I157L Y328F V439P 1.27 変異型 M499 Y159N F21 1 W Y328F 1.16 変異型 M500 G161A A184G W187F 1.25 変異型 M501 G161A T210L Y328F 1.17 変異型 M502 G161A F21 1W Y328F 1.17 変異型 M503 A182G P183A Y328F 1.90 変異型 M504 A182S P183A Y328F 1.18 変異型 M505 A184G W187F F200A 1.10 変異型 M506 A184G W187F A204S 1.16 変異型 M507 A184G W187F F21 1W 1.15 変異型 M508 A184G W187F I228K 1.14 変異型 M509 A184G W187F A233D 1.16 変異型 M510 F200A F211W Y328F 1.31 変異型 M51 1 A204S F21 1W Y328F 1.35 変異型 M512 A204T F211W Y328F 1.28 変異型 M513 F211W Y328F L340V 1.26 変異型 M514 P70T A72E I157L Y328F 1.65 変異型 M515 P70T A72E T210L Y328F 1.39 変異型 M516 P70T G77M I157L Y328F 1.32 変異型 M517 P70T Y81A I157L T210L 1.19 変異型 M518 P70T Y81 A I157L Y328F 1.35 変異型 M519 P70T S84D I157L Y328F 1.24 変異型 M520 P70T F88E I157L Y328F 1.38 変異型 M521 P70T F88E T210L Y328F 1.34 変異型 M522 P70T F1 13W I157L T210L 1.37 変異型 M523 P70T F1 13W G161 A Y328F 1.17 変異型 M524 P70T F1 13Y I157L Y328F 1.09 変異型 M525 P70T D1 15Q I157L T210L 1.13 変異型 M526 P70T D1 15Q I157L Y328F 1.27 変異型 M527 P70T I157L G161 A T210L 1.26 変異型 M528 P70T I157L A184G W187F 1.33 変異型 M529 P70T I157L A184G T210L 1.43 変異型 M530 P70T I157L W187F T210L 1.34 変異型 M531 P70T I157L W187F Y328F 1.34 変異型 M532 P70T I157L A204T T210L 1.37 変異型 M533 P70T I157L A204T Y328F 1.29 変異型 M534 P70T I157L A204T T210L 1.22 変異型 M535 P70T I157L T210L F21 1W 1.29 変異型 M536 P70T I157L T210L G226A 1.27 変異型 M537 P70T I157L T210L A233D 1.28 変異型 M538 P70T I157L T210L Y328F 1.33 変異型 M539 P70T I157L T210L L340V 1.37 表 38- 11]
表 38-11
変異型 変異 A1比 変異型 M540 P70T I157L T210L V439P 1.27 変異型 M541 P70T I157L Y328F V439P 1.27 変異型 M542 P70T G161A T210L Y328F 1.26 変異型 M543 P70T G161A A233D Y328F 1.20 変異型 M544 A72E S74T I157L Y328F 1.60 変異型 M545 A72E G77S F113W I157L 1.07 変異型 M546 A72E Y81H I157L Y328F 1.59 変異型 M547 A72E 83P I157L Y328F 1.59 変異型 M548 A72E F88E F113W 1157し 1.28 変異型 M549 A72E F88E I157L Y328F 1.59 変異型 M550 A72E F88E G161A Y328F 1.45 変異型 M551 A72E F113W I157L Y328F 1.40 変異型 M552 A72E F113W G161A Y328F 1.54 変異型 M553 A72E F113Y I157L Y328F 1.67 変異型 M554 A72E F113Y G161A Y328F 1.57 変異型 M555 A72E F113Y G226A Y328F 1.49 変異型 M556 A72E I157L G161A Y328F 1.47 変異型 M557 A72E I157L F162L Y328F 1.56 変異型 M558 A72E 1157し A184G Y328F 1.45 変異型 M559 A72E I157L F200A Y328F 1.59 変異型 M560 A72E I157L A204T Y328F 1.37 変異型 M561 A72E I157L F211W Y328F 1.74 変異型 M562 A72E I157L F211Y Y328F 1.47 変異型 M563 A72E I157L A233D Y328F 1.66 変異型 M564 A72E 1157L Y328F L340V 1.60 変異型 M565 A72E G161A A204T Y328F 1.56 変異型 M566 A72E G161A T210L Y328F 1.55 変異型 M567 A72E G161A F211W Y328F 1.57 変異型 M568 A72E G161A F211Y Y328F 1.57 変異型 M569 A72E G161A A233D Y328F 1.54 変異型 M570 A72E G161A Y328F L340V 1.48 変異型 M571 A72E A184G W187F Y328F 1.30 変異型 M572 A72E T210L Y328F L340V 1.23 変異型 M573 A72V I157L W187F Y328F 1.40 変異型 M574 G77P I157L T210L Y328F 1.33 変異型 M575 Y81A S84D I157L Y328F 1.27 変異型 M576 Y81A F88E I157L Y328F 1.24 変異型 M577 Y81A F113W I157L Y328F 1.32 変異型 M578 Y81A I157L G161A Y328F 1.32 変異型 M579 Y81A 1157L W187F Y328F 1.29 変異型 M580 Y81A 】157し A204S Y328F 1.28 变異型 M581 Y81A I157L T210L Y328F 1.36 変異型 M582 Y81A I157L A233D Y328F 1.30 変異型 M583 Y81A I157L Y328F V439P 1.2& 変異型 M584 Y81A A184G W187F Y328F 1.25 変異型 M585 F88E I157L T210L Y328F 1.3ひ 変異型 M586 F88E I157L A233D Y328F 1.25 変異型 M5&7 F113W I157L A204T T210L 1.22 変異型 M588 F113W I157L T210L Y328F 1.29 変異型 M589 I157L G161A A184G W187F 1.34 変異型 M590 I157L G161A T210L Y328F 1.33 変異型 M591 I157L A184G W187F T210L 1.24 変異型 M592 I157L A204S T210L Y328F 1.24 変異型 M593 I157L A204T T210L Y328F 1.34 [0317] [表 38— 12]
表 38-12
Figure imgf000218_0001
[0318] (11) 高濃度反応液における各変異株 AMP収率の測定 まず、得られた比活性のデータをもとに各変異株を 200Uにするのに必要なブロス 量を算出した。次に、算出したブロス量を 5mLにまで濃縮した。 15mLの高濃度反応 液（400mMァスパラギン酸ジメチルエステル、 600mMフエ-ルァラニン）に各変異 株の濃縮したブロスを添加し、温度 22°C、初期 pH8. 5で反応を行った。反応が進む につれて pHが低下するが、 6M NaOHを添加することによって、常時 pH8. 5を維 持した。反応開始 40分、 60分、および 80分後の AMP生成量を HPLCにより定量し 、 A1よりも収率が向上した変異体を表 39及び表 40にまとめた。
[0319] [表 39]
表 39
Figure imgf000219_0001
[0320] [表 40- 1]
Figure imgf000220_0001
OOI^CZO/SOOZdf/XDd 8 9817S.0/900Z OAV [0321] [表 40- 2]
表 40-2
Figure imgf000221_0001
[0322] (実施例 23)
(F1)ラショナル変異を用いたジペプチドの生産
実施例 22にて得られた変異株（Al, A1/I157L, A1/G161A, A1/Y328F) は、実施例 6 (25)に記載の方法で培養した。培養ブロス 5又は 10 1を、 50mMの A la-OMe-HC lOOmMの L—アミノ酸、 lOmMの EDTAを含む 200 /z 1のホウ酸 緩衝液 (PH9. 0)に加え、 20°Cにて 30分反応した。この反応で、反応開始後 5分、 1 0分、及び 30分の時点で生成したジペプチド (Ala— X)の濃度を表 41に示した。
[0323] [表 41] 表 41
Figure imgf000222_0001
substrate 50mM AlaOMe + 100mM X
[0324] (実施例 24)変異の組合せによる高活性株の構築
(F2)ランダムスクリーニング変異点組合せ株の構築
様々な変異を組合わせた株を構築するため、 pSF_Sm_M35— 4ZV184AZI 157L (A1/I157L)を、 PCRを用いる部位特異的突然変異誘発法の铸型として使 用した。
変異導入は実施例 7 (29)と同様の方法で行い、各種変異型酵素に対応するプライ マー（配列番号 193, 195— 198)を用いて導入し、ランダムな組み合わせ株ライブラ リーを得た。
[0325] (F3)組合わせ変異ライブラリ一力ものスクリーニング
(F2)で作製したライブラリーを、実施例 3 (9)と同様に培養し、得られた培養液を用 V、て、 2種類のスクリーニングを実施し（下記 (F4)及び (F5)参照)選抜を行った。
[0326] (F4)—次スクリーニング A
得られた菌液 5 1に、 lOmM Phenol, 6mM AP、 5mM Asp (OMe) 、 30m
2
M Phe、 6. 12U/ml peroxidase, 0. 21U/ml alchol oxidase, lOmM E DTA、 lOOmM Borateを含む反応液（pH8. 2)を 200 1添加し、 25。Cにて約 20 分反応後 500nmの吸光度を測定し、メタノール放出量を算出した。
[0327] (F5)—次スクリーニング B
得られた菌液 5 1に、 lOmM Phenol, 6mM AP、 5mM Asp (OMe) 、 5mM
2
Ala— OEt、 30mM Phe、 6. 12U/ml peroxidase, 0. 21U/ml alchol o xidase、 lOmM EDTA、 lOOmM Borateを含む反応液（pH8. 2)を 200 ΐ添加 し、 25°Cにて約 20分反応後 500nmの吸光度を測定し、メタノール放出量を算出し (F4) , (F5)両方を実施し、（F4)Z(F5)の値が親株 (A1 +I157L)よりも大きいも のは、 Ala— Pheよりも AMPがより生成しやすい酵素として選抜した。
[0328] (F6)二次スクリーニング
上記方法で一次スクリーニングしたのち、選抜した株を実施例 6 (25)に記載した方 法で培養し、その培養ブロス 2U分を 10mM EDTA と 50mM Asp (OMe)
2、75 mM Pheを含む lOOmM ホウ酸緩衝液（pH8. 5)に最終ボリュームが lmlとなるよ うに懸濁し、 20°Cにて AMP生成量を測定した。 AMP生成量の多い株を選抜とし、 選抜株はシーケンスにより変異点の組み合わせを特定し、その変異点を表 34に記載 した。以後、本選抜株を F22と記載し、 F22株の AMP生成量を表 42に示した。
[0329] [表 42]
表 42
Figure imgf000223_0001
[0330] (F7)ラショナル変異株との組合せ
実施例 22において効果のあった変異点 Y328F, Y81A, T210Lを、 F22株へ導 入した。変異導入は (45)と同様の方法で行い、各種変異型酵素に対応するプライマ 一（配列番号 201— 206)を用いて導入した。得られた株は実施例 6 (25)に記載の 方法で培養した。得られた培養ブロスを、 400mM Asp (OMe) モノメチル硫酸塩、
2
400mM Pheを含む溶液に懸濁し（18UZml反応液）、 NH40Hを用いて pH8. 5 に維持しながら 22°Cにて反応を行い、 AMP生成収率を測定した。この反応での A MP収率を表 43に示した。
[0331] [表 43] — ^一 Ί一 Λ( fi ： ^ -^IO
Ί - Λ^^^一 Ί：
^J^^一 Ί一 一 Ί： - s —J ^一 Ί一 -Jp^v ^一 1：
— ^— Ί— / fi ー Ί: ^ - Α ベ-^^ ー 1一 / 一 1： di丄 ベ-^^ 一 1一 ^d jl一 1： - o ベ — Ί— ^^ n . - Ί： ^ ~^\\ -^J-^-f -Ί.- 一 1： sn-^l ベ- ^ — Ί一 / - ェ 一 Ί：
ニ / - -Ί.- 一 Ί： BIV , へ ( — Ί一 - 一 Ί： U10-¾IV エ一 d - —^ ^^Δ -Ί- Λ^Λ^Υ:!. - 1 - » -dWV エ
Figure imgf000224_0001
/^^ ^^- ^ ^一 1： 3^〇— 丄 エ ベ- ό - Ί： a^JO-^IV エ ^エ一 ,、- 一 Ί： ^〇- BIV
Figure imgf000224_0002
Figure imgf000224_0004
Figure imgf000224_0005
Figure imgf000224_0003
l7CZ0/S00idf/X3d zzz 9817S.0/900Z O Thr-Met： Lースレオニル一 L一メチォ二ン
Tyr- Met： L—チロシュルー L一メチォニン
Asp-Met： L -ァスパルチル - L—メチォニン
Arg-Met： L -ァノレギ-ノレ一 L一メチォニン
His-Met： L -ヒスチジノレ一 L一メチォニン
Lys-Met： Lーリジル一 L—メチォニン
Ala- Gly： L -ァラ-ル一グリシン
Ala-Thr： L -ァラニル一 L—スレオニン
Ala-Glu： L -ァラニル一 L—グルタミン酸
Ala-Ala： L一ァラニル一 Lーァラニン
Ala-Asp： L -ァラ-ル一 L—ァスパラギン酸
Ala- Ser： L -ァラニル一 L—セリン
Ala-Met： L -ァラ-ル一 L—メチォニン
Ala-Val： L -ァラ-ル一 L—パリン
Ala-Lys： L -ァラ-ル一 L—リジン
Ala-Asn： L -ァラニル一 L—ァスパラギン
Ala-Cys： L -ァラニル一 L—システィン
Ala-Tyr： L -ァラ-ル一 L—チロシン
Ala— lie： L -ァラニル一 L—イソロイシン
Arg-Gln： L -ァノレギニノレ一 L一グルタミン
Gly- Ser：グリシル一 Lーセリン
Gly-Ser(tBu)：グリシルー L— (t—ブチノレ）セリン
HIL-Phe : (2S, 3R, 4S)—4—ヒドロキシルイソロイシ/レーフエ二ルァラニン
AFA： L一ァラニノレ -L-フエニノレアラニノレ一 L—ァラニン
AGA： L一ァラニル一グリシル -L-ァラニン
AHA： L一ァラエル一 L—ヒスチジル一 L—ァラニン
ALA : L—ァラニル一 L—ロイシル一 L—ァラニン
AAA: L—ァラニルー L—ァラ-ルー L—ァラニン AAG： L -ァラ-ル L ァラ-ル グリシン
AAP :L ァラニルー L ァラニルー L プロリン
AAQ： L -ァラ-ル L ァラ-ル L グルタミン
AAY： L -ァラ-ル L ァラ-ル L チロシン
GFA：グリシル -L-フエニノレアラニノレ Lーァラニン
AGG： L ァラニル グリシル グリシン
TGG： L トレオニノレ グリシノレ グリシン
GGG：グリシノレーグリシノレ グリシン
AFG： L -ァラ-ル L フエ-ルァラ-ル -グリシン
GGFM：グリシル -グリシル -L-フエ-ルァラ-ル L メチォニン
YGGFM： L -チロシル -グリシル -グリシル - L—フエ-ルァラ-ル L メチォ- ン
AM :L ァスパラギン酸一 β—メチルエステル塩酸塩
AM (AM)： L ァスパルチル— L ァスパラギン酸— 13 , β—ジメチルエステル
ΑΡ: 4—ァミノアンチピリン
OPT: 1,10— Phenanthor oline monohydrate
[0333] 本明細書中における変異部位のアミノ酸の一文字表記、並びに各アミノ酸残基へ の変異導入に対応する使用コドンは、以下の表 44の通りである。
[0334] [表 44]
表 44
Figure imgf000227_0001
[0335] 列表フリーテキスト]
[0336] プライマー配列一覧
[0337] [表 45- 1]
表 45-1：プライマ一一覧（表中の Noは配列番号を示す)
Figure imgf000227_0002
[0338] [表 45- 2]
Figure imgf000228_0001
Figure imgf000228_0002
(4 暴 ½2鹿 ΙΟΝΟ)Φ拏）戛一一 ^ ^^-z-^ fr£Z0/S00Zdf/13d 923 98fSL0/900I O
Figure imgf000229_0001
Figure imgf000229_0002
( -^$½#½3ΙίΙ°Ν0)φ¾) 一一 ^： : ε-9^¾
00^£Z0/S00Zdf/X3d L7Z 98^S.0/900i OAV
[s— s 挲] [ εο]
Figure imgf000230_0002
Figure imgf000230_0001
00 CZ0/S00idf/X3d 833 98 SZ.0/900Z OAV [9- s挲] [zno]
Figure imgf000231_0001
(^¾½-#½2Μ$Ι°Ν0)φ¾)Μ一一 L ^:g-9fr¾
^£Z0/S00Zdf/X3d 633 981^0/900 OAV 表 45-6:プライマ一一覧（表中の Noは配列番号を示す)
Figure imgf000232_0001
45-7]
[8- s挲] \_ no]
Figure imgf000233_0001
l7CZ0/S00Zdf/X3d 9817S.0/900Z; OAV 表 45-8:プライマ一一覧（表中の Noは配列番号を示す)
Figure imgf000234_0001
45-9] 表 45- 9:プライマ一一覧（表中の Noは配列番号を示す)
Figure imgf000235_0001
46- 1]
^ §s〔461
Figure imgf000236_0001
_:¾ §s463- 46-2
Figure imgf000237_0001
^〔¾〔03446411 46
Figure imgf000238_0001
46-4
Figure imgf000239_0001
[図 1]図 1は、 pH安定性についての実験結果を示す図である。
[図 2]図 2は、至適反応温度についての実験結果を示す図である。
[図 3]図 3は、温度安定性についての実験結果を示す図である。
[図 4]図 4は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造を 示す図である。
[図 5]図 5は、配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造で ある。
[図 6-1]図 6— 1は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体 構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-2]図 6— 2は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体 構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-3]図 6— 3は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体 構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-4]図 6— 4は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体 構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-5]図 6— 5は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体 構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-6]図 6— 6は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体 構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-7]図 6— 7は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体 構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-8]図 6— 8は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体 構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-9]図 6— 9は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体 構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-10]図 6— 10は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-11]図 6— 11は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-12]図 6— 12は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-13]図 6— 13は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-14]図 6— 14は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-15]図 6— 15は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-16]図 6— 16は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-17]図 6— 17は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-18]図 6— 18は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-19]図 6— 19は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-20]図 6— 20は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-21]図 6— 21は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-22]図 6— 22は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-23]図 6— 23は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-24]図 6— 24は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-25]図 6— 25は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-26]図 6— 26は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-27]図 6— 27は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-28]図 6— 28は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-29]図 6— 29は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-30]図 6— 30は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-31]図 6— 31は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-32]図 6— 32は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-33]図 6— 33は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-34]図 6— 34は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-35]図 6— 35は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-36]図 6— 36は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-37]図 6— 37は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-38]図 6— 38は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-39]図 6— 39は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-40]図 6— 40は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-41]図 6— 41は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-42]図 6— 42は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-43]図 6— 43は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-44]図 6— 44は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-45]図 6— 45は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-46]図 6— 46は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-47]図 6— 47は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-48]図 6— 48は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-49]図 6— 49は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-50]図 6— 50は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-51]図 6— 51は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-52]図 6— 52は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-53]図 6— 53は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-54]図 6— 54は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-55]図 6— 55は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-56]図 6— 56は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-57]図 6— 57は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-58]図 6— 58は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-59]図 6— 59は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-60]図 6— 60は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-61]図 6— 61は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-62]図 6— 62は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-63]図 6— 63は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-64]図 6— 64は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-65]図 6— 65は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-66]図 6— 66は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-67]図 6— 67は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-68]図 6— 68は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-69]図 6— 69は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-70]図 6— 70は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-71]図 6— 71は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-72]図 6— 72は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-73]図 6— 73は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-74]図 6— 74は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-75]図 6— 75は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-76]図 6— 76は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-77]図 6— 77は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-78]図 6— 78は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-79]図 6— 79は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-80]図 6— 80は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-81]図 6— 81は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-82]図 6— 82は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-83]図 6— 83は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-84]図 6— 84は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-85]図 6— 85は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-86]図 6— 86は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-87]図 6— 87は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-88]図 6— 88は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-89]図 6— 89は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-90]図 6— 90は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-91]図 6— 91は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-92]図 6— 92は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-93]図 6— 93は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-94]図 6— 94は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-95]図 6— 95は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-96]図 6— 96は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-97]図 6— 97は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-98]図 6— 98は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-99]図 6— 99は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立 体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-100]図 6— 100は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-101]図 6— 101は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-102]図 6— 102は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-103]図 6— 103は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-104]図 6— 104は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-105]図 6— 105は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-106]図 6— 106は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-107]図 6— 107は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-108]図 6— 108は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-109]図 6— 109は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-110]図 6— 110は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-111]図 6— 111は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-112]図 6— 112は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-113]図 6— 113は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-114]図 6— 114は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-115]図 6— 115は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-116]図 6— 116は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-117]図 6— 117は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-118]図 6— 118は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-119]図 6— 119は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-120]図 6— 120は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-121]図 6— 121は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-122]図 6— 122は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-123]図 6— 123は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-124]図 6— 124は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-125]図 6— 125は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-126]図 6— 126は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-127]図 6— 127は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-128]図 6— 128は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-129]図 6— 129は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-130]図 6— 130は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-131]図 6— 131は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-132]図 6— 132は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-133]図 6— 133は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
[図 6-134]図 6— 134は、配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の 立体構造 (3次元構造)の原子座標を示す図である。
産業上の利用可能性
本発明は、ペプチドの製造法などに関する分野で有用である。 紙面による写し（注意 電子データ力 S原本となります）
[この用紙は、国際出願の一部を構成せず、国際出顔の用紙の妆数に算入しない]
Figure imgf000250_0001
受理官庁記入欄
-4 この用紙は国際出願とともに受理した ί ■
(はい/いいえ〉 し—- 」'
-4-1 権限のある職員 ' 国際事務局記入欄 · -5 この用紙が国際事務局に受理された曰
-5-1 権限のある職員
差替え用紙（規則 26) 請求の範囲
配列番号 2に記載のアミノ酸配列に対し下記変異型 1から 68のいずれか 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質。
変異型 1 F207V
変異型 2 Q441E
変異型 3 K83A
変異型 4 A301V
変異型 5 V257I
変異型 6 A537G
変異型 7 A324V
変異型 8 N607K
変異型 9 D313E
変異型 10 Q229H
変異型 11 M208A
変異型 12 E551K
変異型 13 F207H
変異型 14 T72A
変異型 15 A137S
変異型 16 L439V
変異型 17 G226S
変異型 18 D619E
変異型 19 Y339H
変異型 20 W327G
変異型 21 V184A
変異型 22 V184C
変異型 23 V184G,
変異型 24 VI 841
変異型 25 V184L
差替え用紙（規則 26) 変異型 26 V184M
変異型 27 V184P
変異型 28 V184S
変異型 29 V184T
変異型 30 Q441K
変異型 31 N442K
変異型 32 D203N
変異型 33 D203S
変異型 34 F207A
変異型 35 F207S
変異型 36 Q441N
変異型 37 F207T
変異型 38 F207I
変異型 39 T210K
変異型 40 W187A
変異型 41 S209A
変異型 42 F211A
変異型 43 F211V
変異型 44 V257A
変異型 45 V257G
変異型 46 V257H
変異型 47 V257M
変異型 48 V257N
変異型 49 V257Q
変異型 50 V257S
変異型 51 V257T
変異型 52 V257W
変異型 53 V257Y
差替え用鉞（規則 26) 変異型 54 47G
変異型 55 K47E
変異型 56 N442F
変異型 57 N607R
変異型 58 P214T
変異型 59 Q202E
変異型 60 Y494F
変異型 61 R117A
変異型 62. F207G
変異型 63 S209D
変異型 64 S209G
変異型 65 Q441D
変異型 66 R445D
変異型 67 R445F
変異型 68 N442D
[2] 請求項 1に記載の変異型タンパク質におレ、て、前記変異型 1から 68のレ、ずれか 1 種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変 部位以外の部位に置換、欠失 、揷入、付加および逆位力もなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を更に 含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク質。
[3] ： 少なくとも変異型 2を含むことを特徴とする、請求項 1または 2に記載の変異型タン パク質。
[4] 少なくとも変異型 14を含むことを特徴とする、請求項 1から 3のいずれかに記載の変 異型タンパク質。 · '
[5] 配列番号 2に記載のアミノ酸配列に対し下記変異型 239から 290、.および 324から 377のうちのいずれか 1種または 2種以上の変異 ¾Τ ^むアミノ酸配列を有する変異型 タンパク質。
変異型 239 F207V/Q441E
変異型 240 F207V/K83A
差替え用紙 （規則 26) 変異型 241 F207V/E551K
変異型 242 K83A/Q441E
変異型 243 M208A/E551K
変異型 244 V257I/Q441E
変異型 245 V257I/A537G
変異型 246 F207V/S209A
変異型 247 K83A/S209A
変異型 248 K83A/F207V/Q441E
変異型 249 L439V/F207V/Q441E
変異型 250 A537G/F207V/Q441E
変異型 251 A301V/F207V/Q441E
変異型 252 G226S/F207V/Q441E
変異型 253 V257I F207V/Q441E
変異型 254 D619E/F207V/Q441E
変異型 255 Y339H/F207V/Q441E
変異型 256 N607K/F207V/Q441E
変異型 257 A324V/F207V/Q441E
変異型 258 Q229H/F207V/Q441E
変異型 259 W327G/F207V/Q441E
変異型 260 A301V/L439V/A537G N607K
変異型 261 K83A/Q 229H/A301V/D 313E/A324V/L439V/A537
G/N607K '
変異型 262 Q229H/V257I/A301V/A324V/Q441E/A537G/N607 K
変異型 263 Q229H/A301V/A324V/Q441E/A537G/N607K 変異型 264 Q 229H/V257I/A301 V/D313E/A324V/Q441 E/A537 G/N607K
変異型 265
差替え用紙（規則 26) 変異型 266 T72A/A137S/A301V/Q441E/A537G/N6O7K ZN607K
変異型 268 T72A/A137S/Q229H/A301 V/A324V/L439V/Q441E /A537G/N607K
変異型 269 T72A/ Q 229H/V257I/A301 V/D313E/A324V/L439 V/Q441E/A537G/N607K
変異型 270 T72A/ Q229H/V257I/A301V/D313E/A324V/Q441 E/A537G/N607K
変異型 271
/N607K
変異型 272
/N607K
変異型 273
/N607K
変異型 274
Q441E/A537G/N607K
変異型 275
/A537G/N607K
変異型 276 T72A/A137S//I228L/Q229P/A301V/L439V/Q441E /A537G/N607K
変異型 277 T72A/A137S/I228D/Q229P/A301V/L439V/Q441E A537G/N607K
変異型 278 T72A/A137S/Q229P/I230D/A301V/L439V/Q441E /A537G/N607K
変異型 279 T72A/A137S/Q229P/I230V/A301V/L439V/Q441E /A537G/N607K
変異型 280 T72A/I228S/Q229H/V257I/A301V/D313E/A324V
差替え用紙（規則 26) /L439V/Q441E/A537G/N607K
変異型 281
/L439V/Q441E/A537G/N607K
変異型 282 T72AZA137Sノ Q229PZV257I/A301V/A324VZL439V /Q441E/A537G/N607K
/A537G/N607K
変異型 284 T72A/Q229P/V257I/A301G/D313E/A324V/Q441E /A537G/N607K
変異型 285
/A537G/N607K
変異型 286
/L439V/Q441E/A537G/N607K
変異型 287
/L439V/Q441E/A537G/N607K
変異型 288
/L439V/Q441E/A537G/N607K
変異型 289
/L439V/Q441E/A537G/N607K
変異型 290
/L439V/Q441E/A537G/N607K
変異型 324 V184A/V257Y
変異型 325 V184A/W187A
変異型 326 V184A/N442D
変異型 327 V184P/N442D
変異型 328 V184A/N442D/L439V
変異型 329 A301V/L439V/A537G/N607K/V184A
変異型 330 A301V/L439V/A537G/N607K/V184P
差替え用紙 (規則 26) 変異型 331 A301V/L439V/A537G/N607K/V257Y
変異型 332 A301V/L439V/A537G/N607K/W187A
変異型 333 A301V/L439V/A537G/N607K/F211A
変異型 334 A301V/L439V/A537G/N607K/Q441E
変異型 335 A301V/L439V/A537G/N607K/N442D
変異型 336 A301V/L439V/A537G/N607K/V184A/F207V 変異型 337 A301V/L439V/A537G/N607K/V184A/A182G 変異型 338
/A537G/N607K/V184A/N442D
変異型 339
/A537G/N607K/V184A/N442D/T185F
変異型 340
/Q441E/A537G/N607K/V184A/K83A
変異型 341
/Q441E/A537G/N607K/V184A/W187A
変異型 342
/Q441E/A537G/N607K/V184A/F211A
変異型 343
/Q441E/A537G/N607K/V184A/V178G
変異型 344
ZQ441E/A537G/N607K/V184A/T185A
変異型 345
/Q441E/A537G/N607K/V184A/A182G
変異型 346
/Q441E/A537G/N607K/V184A/K314R
変異型 347 T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V /Q441E/A537G/N607K/V184A/A515V
変異型 348
差替え用紙（規則 26) /Q441E/A537G/N607K/V184A/L66F
変異型 349
/Q441E/A537G/N607K/V184A/S315R
変異型 350 T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V /Q441E/A537G/N607K/V184A/K484I
変異型 351 T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V /Q441E/A537G/N607 /V184A/V213A
変異型 352
/Q441E/A537G/N607 /V184A/A245S
変異型 353
/Q441E/A537G/N607K/V184A/P214H
変異型 354 T72A/A137S/Q229P/V257I /A301V/A324V/L439V /Q441E /A537G/N607K/V184A/L263M
変異型 355 T72A/A137S/Q229P/V257I /A301V/A324V/L439V /Q441E/A537G/N607K/V184A/P183A
/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185K
変異型 357 T72A/A137S/Q229P/'V257I/A301V/A324V/L439V /Q441E/A537G/N607K/V184A/T185D
変異型 358
/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185C
変異型 359
/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185S
変異型 360
/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185F
変異型 361
/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185P
変異型 362
差替え用紙（規則 26) /Q441E/A537G/N607K/V184A/T185N
変異型 363
/Q441E/A537G/N607K/V184A/P183A/A182G
変異型 364 T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V /Q441E/A537G/N607K/V184A/P183A/A182S
変異型 365 T72A/A137S/Q229P/V257I /A301V/A324V/L439V /Q441E/A537G/N607K/V184A/T185F/N442D
変異型 366 T72A/A137S/Q229P/V257I /A301V/A324V/L439V ZQ441 E/A537G/N607K/V184A/L66F/E80K/I157L/A182G/ P214H/L263M
Figure imgf000259_0001
P214H/L263M/Y328F
変異型 368 T72A/A137S/Q229P/V257I /A301V/A324V/L439V ZQ441EZA537G/N60
P214H/L263M/Y328F
Figure imgf000259_0002
T210L/L263M/Y328F
変異型 370 A301V/L439V/A537G/N607K/Q441K /Q441E/A537G/N607K/V184A/I157L
変異型 372 T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V /Q441E/A537G/N607K/V184A/G161A
変異型 373
/Q441E/A537G/N607K/V184A/Y328F
変異型 374 F207V/G226S
変異型 375 F207V/W327G
差替え用紙（細 (126) 変異型 376 F207V/Y339H
変異型 377 F207V/D619E
[6] 請求項 5に記載の変異型タンパク質におレ、て、前記変異型 239から 290、および 3
24から 377のうちのいずれか 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異 部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる 1また は数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、力つ、ペプチド生成活性を 有する、変異型タンパク質。
[7] 少なくとも変異型 260を含むことを特徴とする、請求項 5または 6に記載の変異型タ ンパク質。
[8] 少なくとも変異型 286を含むことを特徴とする、請求項 5から 7のいずれかに記載の 変異型タンパク質。
[9] 請求項 1〜8の！/、ずれかに記載の変異型タンパク質が有するアミノ酸配列をコード. するポリヌクレオチド。
[10] 請求項 9に記載のポリヌクレオチドを含む組換えポリヌクレオチド。
[11] 請求項 10に記載の組換えポリヌクレオチドを含む形質転換微生物。
[12] 請求項 11に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中おょひンまたは微 生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させることを特徴とする、変異型タンパク質の 製造方法。
[13] 請求項 1から 8のいずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、ペプチド生 成反応を行うことを特徴とする、ペプチドの製造方法。
[14] 請求項 11に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および/または形 質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させてペプチド生成反応を行うこと を特徴とする、ペプチドの製造方法。
[15] 請求項 1から 8のいずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、 L—ァスパ ラギン酸—ひ， β—ジエステルと L—フエ二ルァラニンとの反応を行うことを特徴とす る、 a—Lーァスパルチルー L—フエ二ルァラニン— β—エステルの製造方法。
[16] 請求項 11に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および Ζまたは形 質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させて、 L—ァスパラギン酸— a ,
差替え用紙（規則 26) βージエステルと L—フエ二ルァラニンとの反応を行うことを特徴とする、 α— Lーァス パルチルー L—フエ-ルァラニン一 β一エステノレの製造方法。
配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を X線結晶構 军析して得 られた立体構造を基にして、当該タンパク質の基質結合部位を推定し、基質結合部 位に位置するアミノ酸残基の置換、挿入または削除をすることによりペプチド生成活 性を有する変異型タンパク質を設計 '作製する方法。
配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、当該配 列中 67— 70、 72— 88、 100、 102、 103、 106、 107、 113— 117、 130、 155—16 3、 165、 166、 180—188、 190—195、 200— 235、 259、 273、 276、 278、 292 - 294, 296、 298、 299、 300— 304、 325— 328、 330— 340、及ぴ 437— 447の アミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または 削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タンパク 質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質との 3次元構造とが、トレ ッデイング法による判定の結果類似しており、該判定の際に得られるアラインメントに ぉレヽて、酉己歹 (I番号 209【こ記載のアミノ酸酉己歹 IJ中 67— 70、 72— 88、 100、 102、 103 、 106、 107、 113—117、 130、 155—163、 165、 166、 180— 188、 190—195、 200— 235、 259、 273、 276、 278、 292— 294、 296、 298、 299、 300— 304、 3 25— 328、 330— 340、及ぴ 437—447のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存 在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または 削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タンパク 質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の一次配列とのァライン メントを行ったときに、もしくは当該タンパク質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を 有するタンパク質の 3次元構造とのアラインメントを行なったときに、一次配列の相同 性が 25%以上であるものにおいて、配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 67— 7 0、 72—88、 100、 102、 103、 106、 107、 113— 117、 130、 155— 163、 165、 1 66、 180— 188、 190— 195、 200— 235、 259、 273、 276、 278、 292— 294、 29
差替え用紙（規則 26) 6、 298、 299、 300— 304、 325— 328、 330— 340及び 437— 447のアミノ酸残基 に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のァミノ 酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タン パク質。 · —
配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造において、以 下の（a)〜 (i)の中力 選ばれる 1または 2以上の立体構造の変ィ匕が生じており、かつ 、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
(a)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 79— 82のアミノ酸残基が存在する位置の 少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(b)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 84、 88、 89及ぴ 92のアミノ酸残基が存在 する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、揷入または削除
(c)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 72、 75及ぴ 77のアミノ酸残基が存在する 位 gの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、揷入または削除
(d)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 159、 161、 162、 184、 187及ぴ 276の アミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または 削除
(e)酉己歹番号 208に記載のアミノ酸酉己歹 IJ中 70、 106、 113、 115、 193、 207、 209— 212、 216及び 259のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残 基の置換、挿入または削除
(f)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 200、 202— 205、 207及ぴ 228のァミノ 酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(g)配列番号 208.に記載のアミノ酸配列中 233、 234、及ぴ 439のアミノ酸残基が存 在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(h)酉己歹【】番号 208に記載のアミノ酸配歹中 328、 339、 340、 445、及ぴ 446のァミノ 酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(i)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 87、 155、 157、及ぴ 160のアミノ酸残基 が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、揷入または削除
ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タンパク
差替え用紙（規則 26) 質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質との 3次元構造とが、トレ ッデイング法による判定の結果類似しており、かつ、該判定の際に得られるァラインメ ントにお 、て、以下の（ ）〜 ( ）の中から選ばれる 1または 2以上の変化が生じて!/ヽ る、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
(a 配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 79— 82のアミノ酸残基に対応するアミ ノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換 、挿入または削除
( ）配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 84、 88、 89及ぴ 92のアミノ酸残基に 対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のァミノ 酸残基の置換、挿入または削除
( ）配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 72、 75及び 77のアミノ酸残基に対応 するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残 基の置換、挿入または削除
((Γ)酉己歹 (I番号 209に記載のアミノ酸酉己歹中、 159、 161、 162、 184、 187及ぴ 276 のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくと も一以上のアミノ酸残基の置換、揷入または削除
(e一）酉 3歹 (1番号 209ίこ記載のアミノ酸酉 S歹 (I中、 70、 106、 113、 115、 193、 207、 20 9— 212、 216及ぴ 259のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立 体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(Γ)配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 200、 202— 205、 207、及び 228のァ ミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一 以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(g 配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 233、 234、及び 439のアミノ酸残基に 対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち少なくとも一以上のアミノ酸 残基の置換、挿入または削除
( ）配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 328、 339、 340、 445、及ぴ 446のァ ミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一 以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
差替え用紙（規則 26) (Γ)配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 87、 155、 157、及び 160のアミノ酸残 基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のァ ミノ酸残基の置換、挿入または削除
ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タンパク 質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の一次配列とのァライン メントを行ったときに、もしくは当該タンパク質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を 有するタンパク質の 3次元構造とのアラインメントを行ったときに、一次配列の相同性 が 25%以上であるものにお！/、て、以下の (a )〜 (Γ ')の中力 選ばれる 1または 2 以上の変化が生じており、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。, (a' 配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 79— 82のアミノ酸残基に対応するァ ミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置 換、挿入または削除
配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 84、 88、 89及ぴ 92のアミノ酸残基に 対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のァミノ 酸残基の置換、挿入または削除
( Ί配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 72、 75及ぴ 77のアミノ酸残基に対応 するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残 基の置換、挿入または削除
(cT 配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 159、 161、 162、 184、 187及ぴ 27 6のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なく とも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(e )酉 S歹 U番号 209に記載のアミノ酸酉 S列中、 70、 106、 113、 115、 193、 207、 20 9一 212、 216及ぴ 259のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立 体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(ΓΊ酉 S歹' J番号 209に記載のアミノ酸酉 S歹【J中、 200、 202— 205、 207、及ぴ 228の アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも 一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(g一 配列番号 2〇9に記載のアミノ酸配列中、 233、 234,及び439のアミノ酸残基
差替え用鉞（規則 26) に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち少なくとも一以上のァミノ 酸残基の置換、挿入または削除 '
( 配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 328、 339、 340、 445、及び 446の アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも 一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(ΓΊ配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 87、 155、 157、及ぴ 160のアミノ酸残 基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のァ ミノ酸残基の置換、挿入または削除
配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、当該配 列中 67、 69、 70、 72— 85、 103、 106、 107、 113— 116、 165、 182、 183、 185、 187、 188、 190、 200、 202、 204—206、 209— 211、 213— 235、 301、 328、 3 38— 340、 440— 442、及ぴ 446のアミノ酸残基力 S存在する位置の少なくとも一以上 のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異 型タンパク質。
配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、当該配 列中 67、 69、 70、 72— 84、 106、 107、 114、 116、 183、 185、 187、 188、 202、 204— 206、 209、 211、 213— 233、 235、 328、 338—442、及び 446のアミノ酸 残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され 、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、当該配 歹 I冲 67、 70、 72— 75、 77— 79、 81—84、 114、 116、 185、 188、 202、 204、 20 6、 209、 211、 213— 215、 218— 224、 226— 233、 235、 328、 338— 441、及ぴ 446のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、揷入 または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
配列番号 208に記載のアミノ酸配列に対し下記変異型 L1から L335のいずれか 1 種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質。
変異型 LI N67K
変異型 L2 N67L
差替え用紙（規則.26) 変異型 L3 N67S
変異型 L4 T69I
変異型 L5 T69M
変異型 L6 T69Q
変異型 L7 T69R
変異型 L8 T69V
変異型 L9 P70G
変異型 L10 P70N
変異型 L11 P70S
変異型 L12 P70T
変異型 L13 P70V
変異型 L14 A72C
変異型 L15 A72D
変異型 L16 A72E
変異型 L17 A72I
変異型 L18 A72L
変異型 L19 A72M
変異型 L20 A72N
変異型 L21 A72Q
変異型 L22 A72S
変異型 L23 A72V
変異型 L24 V73A
変異型 L25 V73I
変異型 L26 V73L
変異型 L27 V73M
変異型 L28 V73N
変異型 L29 V73S
変異型 L30 V73T
差替え用紙（規則 26) 変異型 L31 S74A
変異型 L32 S74F
変異型 L33 S74K
変異型 L34 S74N
変異型 L35 S74T
変異型 L36 S74V
変異型 L37. P75A
変異型 L38 P75D
変異型 L39 P75し
変異型 L40 P75S
変異型 L41 Y76F
変異型 L42 Y76H
変異型 L43 Y76I
変異型 L44 Y76V
変異型 L45 Y76W
変異型 L46 G77A
変異型 L47 G77F
変異型 L48 G77K
変異型 L49 G77M
変異型 L50 G77N
変異型 L51 G77P
変異型 L52 G77S
変異型 L53 G77T
変異型 L54 Q78F
変異型 L55 Q78L
変異型 L56 N79D
変異型 L57 N79L
変異型 L58 N79R
差替え用弒（規則 26) 変異型 L59 N79S
変異型 L60 E80D
変異型 L61 E80F
変異型 L62 E80し
変異型 L63 E80P
変異型 L64 E80S
変異型 L65 Y81A
変異型 L66 Y81C
変異型 L67 Y81D
変異型 L68 Y81E
変異型 L69 Y81F
変異型 L70 Y81H
変異型 L71 Y81K
変異型 L72 Y81L
変異型 L73 Y81N
変異型 L74 Y81S
変異型 L75 Y81T
変異型 L76 Y81W
変異型 L77 K82D
変異型 L78 K82L
変異型 L79 K82P
変異型 L80 K82S
変異型 L81 K83D
変異型 L82 K83F
変異型 L83 K83L
変異型 L84 K83P
変異型 L85 K83S
変異型 L86 K83V
差替え用紙（規則 26) 変異型 L87 S84D
変異型 L88 S84F
変異型 L89 S84K
変異型 L90 S84L
変異型 L91 S84N
変異型 L92 S84Q
変異型 L93 L85F
変異型 L94 L85I
変異型 L95 L85P
変異型 L96 L85V
変異型 L97 N87E
変異型 L98 N87Q
変異型 L99 F88E
変異型 LlOO V103I
変異型 L101 V103L
変異型 L102 K106A
変異型 L103 K106F
変異型 L104 K106L
変異型 L105 K106Q
変異型 L106 K106S
変異型 L107 W107A
変異型 L108 W107Y
変異型 L109 F113A
変異型 L110 F113W
変異型 Lll l F113Y
変異型 L112 E114A
変異型 L113 E114D
変異型 L114 D115E
差替え用紙 （規則 26) 変異型 LI 15 D115Q
変異型 LI 16 D115S
変異型 LI 17 I116F
変異型 L118 I116K
変異型 L119 I116L
変異型 L120 I116M
変異型 L121 I116N
変異型 L122 I116T
変異型 L123 I116V
変異型 L124 I157K
変異型 L125 I157L
変異型 L126 Y159G
変異型 L127 Y159N
変異型 L128 Y159S
変異型 L129 P160G
変異型 L130 G161A
変異型 L131 F162L
変異型 L132 F162Y
変異型 L133 Y163I
変異型 L134 T165V
変異型 L135 Q181F
変異型 L136 A182G
変異型 L137 A182S
変異型 L138 P183A
変異型 L139 P183G
変異型 L140 P183S
変異型 L141 T185A
変異型 L142 T185G
差替え用紙（規則 26) 変異型 L143 T185V
変異型 L144 W187A
変異型 L145 W187F
変異型 L146 W187H
変異型 L147 W187Y
変異型 L148 Y188F
変異型 L149 Y188L
変異型 L150 Y188W
変異型 L151 G190A
変異型 L152 G190D
変異型 L153 F193W
変異型 L154 H194D
変異型 L155 F200A
変異型 L156 F200L
変異型 L157 F200S
変異型 L158 F200V
変異型 L159 L201Q
変異型 L160 L201S
変異型 L161 Q202A
変異型 L162 Q202D
変異型 L163 Q202F
変異型 L 164 Q202S
変異型 L165 Q202T
変異型 L166 Q202V
変異型 L167 D203E
変異型 L168 A204G
変異型 L169 A204L
変異型 L170 A204S
差替え用紙（規則 26) 変異型 L171 A204T
変異型 LI 72 A204V
変異型 L173 F205L
変異型 L174 F205Q
変異型 L175 F205V
変異型 L176 F205W
変異型 L177 T206F
変異型 L178 T206K
変異型 L179 T206L
変異型 L180 F207I
変異型 L181 F207W
変異型 L182 F207Y
変異型 L183 M208A
変異型 L184 M208L
変異型 L185 S209F
変異型 L186 S209K
変異型 L187 S209L
変異型 L188 S209N
変異型 L189 S209V
変異型 L190 T210A
変異型 L191 T210L
変異型 L192 T210Q
変異型 L193 T210V
変異型 L194 F211A
変異型 L195 F211I
変異型 L196 F211し
変異型 L197 F211M
変異型 L198 F211V
差替え用弒 （規則 26) 変異型 L199 F211W
変異型 L200 F211Y
変異型 L201 G212A
変異型 L202 V213D
変異型 L203 V213F
変異型 L204 V213K
変異型 L205 V213S
変異型 L206 P214D
変異型 L207 P214F
変異型 L208 P214K
変異型 L209 P214S
変異型 L210 R215A
変異型 211 R215I
変異型 L212 R215K
変異型 L213 R215Q
変異型 L214 R215S
変異型 L215 R215T
変異型 L216 R215Y
変異型 L217 P216D
変異型 L218 P216K
変異型 L219 K217D
変異型 L220 P218F
変異型 L221 P218し
変異型 L222 P218Q
変異型 L223 P218S
変異型 L224 I219D
変異型 L225 I219F
変異型 L226 I219K
差替え用弒（規則 26) 変異型 L227 T220A
変異型 L228 T220D
変異型 L229 T220F
変異型 L230 T220K
変異型 L231 T220L
変異型 L232 T220S
変異型 L233 P221A
変異型 L234 P221D
変異型 L235 P221F
変異型 L236 P221K
変異型 L237 P221L
変異型 L238 P221S
変異型 L239 D222A
変異型 L240 D222F
変異型 L241 D222L
変異型 L242 D222R
変異型 L243 Q223F
変異型 L244 Q223K
変異型 L245 Q223L
変異型 L246 Q223S
変異型 L247 F224A
変異型 L248 F224D
変異型 L249 F224G
変異型 L250 F224K
変異型 L251 F224L
変異型 L252 K225D
変異型 L253 K225G
変異型 L254 K225S
差替え用紙 (規則 26) 変異型 L255 G226A
変異型 L256 G226F
変異型 L257 G226L
変異型 L258 G226N
変異型 L259 G226S
変異型 L260 K227D
変異型 L261 K227F
変異型 L262 K227S
変異型 L263 I228A
変異型 L264 I228F
変異型 L265 I228K
変異型 L266 I228S '
変異型 L267 P229A
変異型 L268 P229D
変異型 L269 P229K
変異型 L270 P229し
変異型 L271 P229S
変異型 L272 I230A
変異型 L273 I230F
変異型 L274 I230K
変異型 L275 I230S
変異型 L276 K231F
変異型 L277 K231L
変異型 L278 K231S
変異型 L279 E232D
変異型 L280 E232F
変異型 L281 E232G
変異型 L282 E232L
差替え用紙（規則 26) 変異型 L283 E232S
変異型 L284 A233D
変異型 L285 A233F
変異型 L286 A233H
変異型 L287 A233K
変異型 L288 A233L
変異型 L289 A233N
変異型 L290 A233S
変異型 L291 D234L
変異型 L292 D234S
変異型 L293 K235D
変異型 L294 K235F
変異型 L295 K235L
変異型 L296 K235S
変異型 L297 F259Y
変異型 L298 R276A
変異型 L299 R276Q
変異型 L300 A298S
変異型 L301 D300N
変異型 L302 V301M
変異型 L303 Y328F
変異型 L304 Y328H
変異型 L305 Y328M
変異型 L306 Y328W
変異型 L307 W332H
変異型 L308 E336A
変異型 L309 N338A
変異型 L310 N338F
差替え用紙（規則 2 変異型 L311 Y339K
変異型 L312 Y339L
変異型 L313 Y339T
変異型 L314 L340A
変異型 L315 し 3401
変異型 L316 L340V
変異型 L317 V439P
変異型 L318 I440F
変異型 L319 I440V
変異型 L320 E441F
変異型 L321 E441M
変異型 L322 E441N
変異型 L323 N442A
変異型 L324 N442L
変異型 L325 R443S
変異型 L326 T444W
変異型 L327 R445G
変異型 L328 R445K
変異型 L329 E446A
変異型 L330 E446F
変異型 L331 E446Q
変異型 L332 E446S
変異型 L333 E446T
変異型 L334 Y447し
変異型 L335 Y447S
請求項 20に記載の変異型タンパク質において、前記変異型 L1から L335のいず れか 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異部位以外の部位に置換 、欠失、挿入、付加おょぴ逆位からなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異
差替え用紙（規則 26) を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク 質。
[29] 少なくとも変異型 L124もしくは変異型 L125を含むことを特徴とする、請求項 27ま たは 28に記載の変異型タンパク質。
[30] 少なくとも変異型 L303を含むことを特徴とする、請求項 27から 29のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[31] 少なくとも変異型 L12を含むことを特徴とする、請求項 27から 30のいずれか一項に 記載の変異型タンパク質。
[32] 少なくとも変異型 L127を含むことを特徴とする、請求項 27から 31のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[33] 少なくとも変異型 L195もしくは L199を含むことを特徴とする、請求項 27から 32の いずれか一項に記載の変異型タンパク質。
[34] 少なくとも変異型 L130を含むことを特徴とする、請求項 27から 33のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[35] 少なくとも変異型 L115を含むことを特徴とする、請求項 27から 34の！/、ずれか一項 に記載の変異型タンパク質。 .
[36] 少なくとも変異型 L316を含むことを特徴とする、請求項 27から 35のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[37] 少なくとも変異型 L99を含むことを特徴とする、請求項 27から 36のいずれか一項に 記載の変異型タンパク質。
[38] 少なくとも変異型 L15もしくは L16を含むことを特徴とする、請求項 27から 37のい ずれか一項に記載の変異型タンパク質。
[39] 少なくとも変異型 L131を含むことを特徴とする、請求項 27から 38のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[40] 少なくとも変異型 L284を含むことを特徴とする、請求項 27から 39のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[41] 少なくとも変異型 L191を含むことを特徴とする、請求項 27から 40のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
差替え用紙（規則 26) [42] 少なくとも変異型 L65を含むことを特徴とする、請求項 27から 41のいずれか一項に 記載の変異型タンパク質。
[43] 少なくとも変異型 L265を含むことを特徴とする、請求項 27から 42のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[44] 少なくとも変異型 L317を含むことを特徴とする、請求項 27から 43のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[45] 少なくとも変異型 L255を含むことを特徴とする、請求項 27から 44のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[46] 少なくとも変異型 L52を含むことを特徴とする、請求項 27から 45のいずれか一項に 記載の変異型タンパク質。
[47] 少なくとも変異型 L155を含むことを特徴とする、請求項 27から 46のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[48] 少なくとも変異型 L298を含むことを特徴とする、請求項 27から 47のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[49] 少なくとも変異型 L201を含むことを特徴とする、請求項 27から 48のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[50] 少なくとも変異型 L145を含むことを特徴とする、請求項 27から 49のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[51] 少なくとも変異型 L170を含むことを特徴とする、請求項 27から 50のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[52] 少なくとも変異型 L87を含むことを特徴とする、請求項 27から 51のいずれか一項に 記載の変異型タンパク質。
[53] 少なくとも変異型 L60を含むことを特徴とする、請求項 27から 52のいずれか一項に 記載の変異型タンパク質。 .
[54] 少なくとも変異型 L110を含むことを特徴とする、請求項 27から 53の!/、ずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[55] 配列番号 208に記載のアミノ酸配列に対し下記の変異型 Mlから M642の!/、ずれ
'か 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質。
差替え用紙（規則 26) 変異型 Ml T69N/I157L
変異型 M2 T69Q/I157L
変異型 M3 T69SZI157L
変異型 M4 P70A/I157L
変異型 M5 P70G/I157L
変異型 M6 P70I/I157L
変異型 M7 P70L/I157L
変異型 M8 P70Nノ I157L
変異型 M9 P70S/I157L
変異型 Ml 0 P70T/I157L
変異型 Mi l P70T/T210L
変異型 Ml 2 P70T/Y328F
変異型 Ml 3 P70V/I157L
変異型 M14 A72E/G77S
変異型 Ml 5 A72E/E80D
変異型 Ml 6 A72E/Y81A
変異型 Ml 7 A72E/S84D
変異型 M18 A72E/F113W
変異型 Ml 9 A72E/I157L
変異型 M20 A72E/G161A
変異型 M21 A72E/F162L
変異型 M22 A72E/A184G
変異型 M23 A72E/W187F
変異型 M24 A72E/F200A
変異型 M25 A72E/A204S
変異型 M26 A72E/T210L
変異型 M27 A72E/F211L
変異型 M28 A72E/F211W
差替え用弒（規則 26) 変異型 M29 A72E/G226A
変異型 M30 A72E/I228K
変異型 M31 A72E/A233D
変異型 M32 A72E/Y328F
変異型 M33 A72S/I157L
変異型 M34 A72V/Y328F
変異型 M35 V73A/I157L
変異型 M36 V73I/I157L
変異型 M37 S74A/I157L
変異型 M38 S74N/I157L
変異型 M39 S74T/I157L
変異型 M40 S74V/I157L
変異型 M41 G77A/I157L
変異型 M42 G77F/T157L
変異型 M43 G77M/I157L
変異型 M44 G77P/I157L
変異型 M45 G77S/E80D
変異型 M46 GTTS/YSIA
変異型 M47 G77S/S84D
変異型 M48 G77S/F113W
変異型 M49 G77S/I157L
変異型 M50 G77S/Y159N
変異型 M51 G77S/Y159S'
変異型 M52 G77S/G161A
変異型 M53 G77S/F162L
変異型 M54 G77S/A184G
変異型 M55 G77S/W187F
変異型 M56 G77S/F200A
差替え用紙（規則 ) 変異型 M57 G77S/A204S
変異型 M58 G77S/T210L
変異型 M59 G77S/F211L
変異型 M60 G77S/F211W
変異型 M61 G77S/I228K
変異型 M62 G77S/A233D
変異型 M63 G77S/R276A
変異型 M64 G77S/Y328F
変異型 M65 E80D/Y81A
変異型 M66 E80D/F113W
変異型 M67 E80D/I157L
変異型 M68 E80D/Y159N
変異型 M69 E80D/G161A
変異型 M70 E80D/A184G
変異型 M71 E80D/F211W
変異型 M72 E80D/Y328F
変異型 M73 E80S/I157L
変異型 M74 Y81A/F113W
変異型 M75 Y81A/I157L
変異型 M76 Y81A/Y159N
変異型 M77 Y81A/Y159S
変異型 M78 Y81A/G161A
変異型 M79 Y81A/A184G
変異型 M80 Y81A/W187F
変異型 M81 Y81A/F200A
変異型 M82 Y81A/T210L
変異型 M83 Y81A/F211W
変異型 M84 Y81A/F211Y
差簪ぇ用紙（規則 26) 変異型 M85 Y81A/G226A
変異型 M86 Y81A/I228K
変異型 M87 Y81A/A233D
変異型 M88 Y81A/Y328F
変異型 M89 Y81H/I157L
変異型 M90 Y81N/I157L
変異型 M91 K83P/I157L
変異型 M92 S84A/I157L
変異型 M93 S84D/F113W
変異型 M94 S84D/I157L
変異型 M95 S84D/Y159N
変異型 M96 S84D/G161A
変異型 M97 S84D/A184G
変異型 M98 S84D/Y328F
変異型 M99 S84E/I157L
変異型 Ml 00 S84F/I157L
変異型 M101 S84K/I157L
変異型 M102 L85F/I157L
変異型 M103 L85I/I157L
変異型 Ml 04 L85P/I157L
変異型 M105 L85V/I157L
変異型 M106 N87A/I157L
変異型 M107 N87D/I157L
変異型 M108 N87E/I157L
変異型 M109 N87G/I157L
変異型 Ml 10 N87Q/I157L
変異型 Ml 11 N87S/I157L
変異型 M112 F88A/I157L
差替え用弒（規則 26) P2005/023400
282 変異型 Ml 13 F88D/I157L
変異型 Ml 14 F88E/I157L
変異型 Ml 15 F88E/Y328F
変異'型 Ml 16 F88L/I157L
変異型 Ml 17 F88T/I157L
変異型 Ml 18 F88VZI157L
変異型 Ml 19 F88Y/I157L
変異型 Ml 20 K106H/I157L
変異型 Ml 21 K106L/I157L
変異型 Ml 22 K106M/I157L
変異型 Ml 23 K106Q/I157L
変異型 Ml 24 K106R/I157L
変異型 Ml 25 K106S/I157L
変異型 Ml 26 K106V/I157L
変異型 Ml 27 W107A/I157L
変異型 Ml 28 W107A/Y328F
変異型 Ml 29 W107Y/I157L
変異型 Ml 30 W107Y/T206Y
変異型 Ml 31 W107Y/K217D
変異型 Ml 32 W107Y/P218L
変異型 Ml 33 W107Y/T220L
変異型 Ml 34 W107Y/P221D
変異型 Ml 35 W107Y/Y328F
変異型 Ml 36 F113A/I157L
変異型 Ml 37 F113H/I157L
変異型 Ml 38 F113N/I157L
変異型 Ml 39 F113V/I157L
変異型 M140 F113W/I157L
差替え用紙（規則 26) 05 023400
変異型 M141 F113W/Y159N
変異型 M142 F113W/Y159S
変異型 M143 F113W/G161A
変異型 Ml 44 F113W/F162L
変異型 M145 F113W/A184G
変異型 M146 F113W/W187F
変異型 M147 F113W/F200A
変異型 M148 F113W/T206Y
変異型 M149 F113W/T210L
変異型 Ml 50 F113W/F211L
変異型 Ml 51 F113WZF211W
変異型 Ml 52 F113W/F211Y
変異型 Ml 53 F113W/V213D
変異型 Ml 54 F113W/K217D
変異型 Ml 55 F113W/T220L
変異型 Ml 56 F113W/P221D
変異型 Ml 57 F113W/G226A
変異型 Ml 58 F113W/I228K
変異型 Ml 59 F113W/A233D
変異型 Ml 60 F113W/R276A
変異型 Ml 61 F113YZI157L
変異型 M162 F113Y/F211W
変異型 Ml 63 E114D/I157L
変異型 Ml 64 D115AZI157L
変異型 Ml 65 D115E/I157L
変異型 Ml 66 D115M/I157L
変異型 Ml 67 D115N/I157L
変異型 Ml 68 D115Q/I157L
差替え用弒（規則 26) 23400
284 変異型 M169 D115S/I157L
変異型 M170 D115V/I157L
変異型 M171 I157L/Y159I
変異型 M172 I157L/Y159L
変異型 Ml 73 I157L/Y159N
変異型 Ml 74 I157L/Y159S
変異型 M175 I157L/Y159V
変異型 M176 I157L/P160A
変異型 M177 I157L/P160S
変異型 M178 I157L/G161A
変異型 Ml 79 I157L/F162L
変異型 M180 I157L/F162M
変異型 M181 I157L/F162N
変異型 M182 I157L/F162Y
変異型 M183 I157L/T165L
変異型 Ml 84 I157L/T165V
変異型 M185 I157L/Q181A
変異型 M186 I157L/Q181F
変異型 M187 I157L/Q181N
変異型 M188 I157L/A184G
変異型 M189 I157L/A184L
変異型 M190 I157L/A184M
変異型 M191 I157L/A184S
変異型 M192 I157L/A184T
変異型 Ml 93 I157L/W187F
変異型 M194 I157L/W187Y
変異型 M195 I157L/F193H
変異型 M196 I157L/F193I
差替え用紙（規則 26) 変異型 Ml 97 I157L/F193W
変異型 Ml 98 I157L/F200A
変異型 Ml 99 I157L/F200H
変異型 M200 I157L/F200L
変異型 M201 I157L/F200Y
変異型 M202 I157L/A204G
変異型 M203 I157L/A204I
変異型 M204 I157L/A204L
変異型 M205 I157L/A204S
変異型 M206 I157L/A204T
変異型 M207 I157L/A204V
変異型 M208 I157L/F205A
変異型 M209 I157L/F207I
変異型 M210 I157L/F207M
変異型 M211 I157L/F207V
変異型 M212 I157L/F207W
変異型 M213 I157L/F207Y
変異型 M214 I157L/M208A
変異型 M215 I157L/M208K
変異型 M216 I157L/M208L
変異型 M217 I157L/M208T
変異型 M218 I157L/M208V
変異型 M219 I157L/S209F
変異型 M220 I157L/S209N
変異型 M221 I157L/T210A
変異型 M222 I157L/T210L
変異型 M223 I157L/F211I
変異型 M224 I157L/F211L
差替え用紙（規則 26) 変異型 M225 I157L/F211V
変異型 M226 I157L/F211W
変異型 M227 I157L/G212A
変異型 M228 I157L/G212D
変異型 M229 I157L/G212S
変異型 M230 I157L/R215K
変異型 M231 I157L/R215L
変異型 M232 I157L/R215T
変異型 M233 I157L/R215Y
変異型 M234 I157L/T220L
変異型 M235 I157L/G226A
変異型 M236 I157L/G226F
変異型 M237 I157L/I228K
変異型 M238 I157L/A233D
変異型 M239 I157L/R276A
変異型 M240 I157L/Y328A
変異型 M241 I157L/Y328F
変異型 M242 I157L/Y328H
変異型 M243 I157L/Y328I
変異型 M244 I157L/Y328L
変異型 M245 I157L/Y328P
変異型 M246 I157L/Y328V
変異型 M247 I157L/Y328W
変異型 M248 I157L/L340F
変異型 M249 I157L/L340I
変異型 M250 I157L/L340V
変異型 M251 I157L/V439A
変異型 M252 I157L/V439P
差替え用弒（規則 26) 変異型 M253 I157LZR445A
変異型 M254 I157L/R445F
変異型 M255 I157L/R445G
変異型 M256 I157L/R445K
変異型 M257 I157L/R445V
変異型 M258 Y159N/G161A
変異型 M259 Y159N/A184G
変異型 M260 Y159N/A204S
変異型 M261 Y159N/T210L
変異型 M262 Y159N/F211W
変異型 Μ2δ3 Y159N/F211Y
変異型 Μ264 Y159N/G226A
変異型 Μ265 Y159N/I228K
変異型 Μ266 Y159N/A233D
変異型 Μ267 Y159N/Y328F
変異型 Μ268 Y159S/G161A
変異型 Μ269 Y159S/F211W
変異型 Μ270 G161A/F162L
変異型 M271 G161A/A184G
変異型 Μ272 G161A/W187F
変異型 Μ273 G161A/F200A
変異型 Μ274 G161A/A204S
.変異型 Μ275 G161A/T210L
変異型 Μ276 G161A/F211L
変異型 Μ277 G161A/F211W
変異型 Μ278 G161A/G226A
変異型 Μ279 G161A/I228K
変異型 Μ280 G161A/A233D
差替え用紙 (規則 26) 変異型 M281 G161A/Y328F
変異型 M282 F162L/A184G
変異型 M283 F162L/F211W
変異型 M284 F162L/A233D
変異型 M285 P183A/Y328F
変異型 M286 A184G/W187F
変異型 M287 A184G/F200A
変異型 M288 A184G/A204S
変異型 M289 A184G/T210L
変異型 M290 A184G/F211L
変異型 M291 A184G/F211W
変異型 M292 A184G/I228K
変異型 M293 A184G/A233D
変異型 M294 A184G/R276A
変異型 M295 V184G/Y328F
変異型 M296 T185A/Y328F
変異型 M297 T185N/Y328F
変異型 M298 W187F/F211W
変異型 M299 W187F/Y328F
変異型 M300 F193W/F211W
変異型 M301 F200A/F211W
変異型 M302 F200A/Y328F
変異型 M303 L201Q/Y328F
変異型 M304 L201S/Y328F
変異型 M305 A204S/F211W
変異型 M306 A204S/Y328F
変異型 M307 T210L/F211W
変異型 M308 T210L/Y328F
差替え用紙（規則 26") 変異型 M309 F211L/A233D
変異型 M310 F211L/Y328F
変異型 M311 F211W/I228K
変異型 M312 F211W/A233D
変異型 M313 F211W/Y328F '
変異型 M314 R215A/Y328F
変異型 M315 R215L/Y328F
変異型 M316 T220Lズ A233D
変異型 M317 T220L/D300N
変異型 M318 P221し ZA233D
変異型 M319 P221L/Y328F
変異型 M320 F224A/A233D
変異型 M321 G226A/Y328F
変異型 M322 G226F/A233D
変異型 M323 G226F/Y328F
変異型 M324 I228K/Y328F
変異型 M325 A233D/K235D
変異型 M326 A233D/Y328F
変異型 M327 R276A/Y328F
変異型 M328 Y328F/Y339F
変異型 M329 A27T/Y81A S84D
変異型 M330 P70T/A72E/I157L
変異型 M331 P70T/G77S/I157L
変異型 M332 P70T/E80D/F88E
変異型 M333 P70T/Y81A/I157L
変異型 M334 P70T/S84D/I157L
変異型 M335 P70T/F88E/Y328F 変異型 M336 P70T/F 113W/1157し
差替え用紙（規則 26) 変異型 M337 P70T/I157L/A204S
変異型 M338 P70T/I157L/T210L
変異型 M339 P70T/I157L/A233D
変異型 M340 P70T/I157L/Y328F
変異型 M341 P70T/I157L/V439P
変異型 M342 P70T/I157L/I440F
変異型 M343 P70T/G161AZT210L 変異型 M344 P70T/G161A/Y328F 変異型 M345 P70T/A184G/W187F 変異型 M346 P70T/A204S/Y328F 変異型 M347 P70T/F211W/Y328F 変異型 M348 P70V/A72E/I157L
変異型 M349 A72E/S74T/I157L
変異型 M350 A72E/G77S/Y328F
変異型 M351 A72E/E80D/Y328F
変異型 M352 A72E/Y81H/I157L
変異型 M353 A72E/K83P/I157L
変異型 M354 A72E/S84D/Y328F
変異型 M355 A72E/L85P/I157L
変異型 M356 A72E/F 113W/1157L 変異型 M357 A72E/F 113W/Y328F 変異型 M358 A72E/F113Y/I157L
変異型 M359 A72E/D 115Q/1157L 変異型 M360 A72E/I157L/G161A
変異型 M361 A72E/I157L/F162L
変異型 M362 A72E/I157L/A184G
変異型 M363 A72E/I157L/F200A
変異型 M364 A72E/I157L/A204S
差替え用紙（規則 26) 変異型 M365 A72E/I157L/A204T
変異型 M366 A72E/I157L/T210L
変異型 M367 A72E/I157L/F211W
変異型 M368 A72E/I157L/G226A
変異型 M369 A72E/I157L/A233D
変異型 M370 A72E/I157L/Y328F
変異型 M371 A72E//I157L/L340V
変異型 M372 A72E/I157L/V439P
変異型 M373 A72E/G161A/Y328F
変異型 M374 A72E/F 162L/Y328F
変異型 M375 A72E/A184G/Y328F
変異型 M376 A72E/W187F/Y328F
変異型 M377 A72E/F200A/Y328F
変異型 M378 A72E/A204S/Y328F
変異型 M379 A72E/T210L/Y328F
変異型 M380 A72E/I228K/Y328F
変異型 M381 A72E/A233D/Y328F
変異型 M382 A72E/Y328F/Y159N
変異型 M383 A72E/Y328F/F211W
変異型 M384 A72E/Y328F/F211Y
変異型 M385 A72E/Y328F/G226A
変異型 M386 A72V/Y81 A/Y328F
変異型 M387 A72V/G161A/Y328F
変異型 M388 G77M/I157L/T210L
変異型 M389 G77P/I157L/F162L
変異型 M390 G77P/I157L/A184G
変異型 M391 G77P/F211W/Y328F
変異型 M392 G77S/Y81A/Y328F
差替え用紙 （規則 26) 変異型 M393 G77S/S84D/I157L
変異型 M394 G77S/F88E/I157L
変異型 M395 G77S/F113W/I157L 変異型 M396 G77S/F113Y/I157L 変異型 M397 G77S/D115Q/I157L 変異型 M398 G77S/I157L/G161A 変異型 M399 G77S/I157L/F200A 変異型 M400 G77S/I157L/A204S 変異型 M401 G77S/I157L/T210L 変異型 M402 G77S/I157L/F211W 変異型 M403 G77S/I157L/G226A 変異型 M404 G77S/I157L A233D 変異型 M405 G77S/I157L/L340V 変異型 M406 G77S/I157L/V439P 変異型 M407 G77S/G161A/Y328F 変異型 M408 E80D/Y81A/Y328F 変異型 M409 Y81A/S84D/Y328F 変異型 M410 Y81A/F113W/Y328F 変異型 M411 Y81 A/I 157L/T210L 変異型 M412 Y81A/I157L/Y328F 変異型 M413 Y81A/G161A/Y328F 変異型 M414 Y81A/F162L/Y328F 変異型 M415 Y81A/A184G/Y328F 変異型 M416 Y81 A/W187F/Y328F 変異型 M417 Y81A/A204S/Y328F 変異型 M418 Y81 A/T21 OL/Y328F 変異型 M419 Y81A/I228K/Y328F 変異型 M420 Y81A/A233D/Y328F
差替え用紙（規則 26) 変異型 M421 Y81 A/Y328F/Y159Ν 変異型 Μ422 Y81A/Y328F/Y159S 変異型 Μ423 Y81A/Y328F/F211W
変異型 Μ424 Y81A/Y328F/F211Y
変異型 Μ425 Y81A/Y328F/G226A 変異型 Μ426 Y81A/Y328F/R276A 変異型 Μ427 K83P/I157L/A184G
変異型 Μ428 K83P/I157L/T210L
変異型 Μ429 K83P/F211W/Y328F 変異型 Μ430 S84D/F113W/I157L
変異型 M431 S84D/I157L/T210L
変異型 Μ432 F88E/I157L/F162L
変異型 Μ433 F88E/I157L/A184G
変異型 Μ434 F88E/I157L/F200A
変異型 Μ435 F88E/I157L/T210L
変異型 Μ436 F88E/I157L/Y328F
変異型 Μ437 F88E/I157L/Y328Q
変異型 Μ438 F88Ε/1157L/L340V
変異型 Μ439 F88E/T210L/Y328F
変異型 Μ440 F88E/F211W/Y328F 変異型 M441 F113W/I157L/G161A 変異型 Μ442 Fl 13W/I157L/A184G 変異型 Μ443 F 113W/1157L/W187F 変異型 Μ444 Fl 13W/I157L/F200A 変異型 Μ445 Fl 13W/I157L/A204S 変異型 Μ446 Fl 13W/I157L/A204T 変異型 Μ447 Fl 13W/I157L/T210L 変異型 Μ448 Fl 13W/I157L/F211W
差替え用弒（規則 26) T JP2005/023400
294 変異型 M449 F113W/I157L/G226A
変異型 M450 F113W/I157L/A233D
変異型 M451 F113W/I157L/Y328F
変異型 M452 F113W/I157L/L340V
変異型 M453 F113W/I157L/V439P
変異型 M454 F113W/G161A/T210L
変異型 M455 F113W/G161 A/Y328F
変異型 M456 F113W/A184G/W187F
変異型 M457 F113Y/I157L/T210L
変異型 M458 Fl l 3Y/1157L/Y328F
変異型 M459 F 113Y G 161A/T210L
変異型 M460 D115Q/I157L/T210L
変異型 M461 D115Qノ I157L/Y328F
変異型 M462 I157L/Y159N/T210L
変異型 M463 I157L/Y159N/Y328F
変異型 M464 1157L/G 161A/W187F
変異型 M465 1157L/G 161 A/F200A
変異型 M466 I157L/G161A/A204S
変異型 M467 I157L/G161A/T210L
変異型 M468 I157L/G161A/A233D
変異型 M469 I157L/G161A/Y328F
変異型 M470 I157L/F162L/A184G
変異型 M471 I157L/F162L/T210L
変異型 M472 1157L/F 162L/L340V
変異型 M473 I157L/A184GZW187F
変異型 M474 I157L/A184G/F200A
変異型 M475 I157L/A184G/A204T
変異型 M476 I157L/A184G/T210L
差替え用弒（規則 26) 05 023400
295 変異型 M477 I157L/A184G/F211W
変異型 1VI478 I157L/A184G/L340V
変異型 M479 I157L/W187F/T210L
変異型 M480 I157L/W187F/Y328F
変異型 M481 1157L/F200A/T21 OL
変異型 M482 I157L/F200A/Y328F
変異型 M483 I157L/A204S/T210L
変異型 M484 I157L/A204S/Y328F
変異型 M485 1157L/A204T/T210L
変異型 M486 1157L/A204T/Y328F
変異型 M487 1157L/T210L/F211W
変異型 M488 1157L/T210L/G212A
変異型 M489 I157L/T210LZG226A
変異型 M490 I157L/T210L/A233D
変異型 M491 1157L/T210LZY328F
変異型 M492 1157L/T210L/L340V
変異型 M493 I157L/T210L/V439P
変異型 M494 I157L/F211W/Y328F
変異型 M495 I157L/G226A/Y328F
変異型 M496 I157L/A233D/Y328F
変異型 M497 I157L/Y328F/L340V
変異型 M498 I157L/Y328F/V439P
変異型 M499 Y159N/F211W/Y328F
変異型 M500 G 161A/A 184G/W187F
変異型 M501 G161A/T210L/Y328F
変異型 M502 G161A/F211W/Y328F
変異型 M503 A182G/P183A/Y328F
変異型 M504 A182S/P183A/Y328F
差替え用鈹（規則 26) 変異型 M505 A184G/W187F/F200A 変異型 M506 A184G/W187F/A204S 変異型 M507 Al 84G W187F/F211W 変異型 M508 A184G/W187F/I228K 変異型 M509 A184G W187F/A233D 変異型 M510 F200AZF211W/Y328F 変異型 M511 A204S/F211W/Y328F 変異型 M512 A204T/F211 W/Y328F 変異型 M513 F211W/Y328F/L340V 変異型 M514 P70T/A72E/I157L/Y328F 変異型 M515 P70T/A72E/T210L/Y328F 変異型 M516 P70T/G77M/I157L/Y328F 変異型 M517 P70T/Y81A/I157L/T210L 変異型 M518 P70T/Y81A/I157L/Y328F 変異型 M519 P70T/S84D/I157L/Y328F 変異型 M520 P70T/F88E/I157L/Y328F 変異型 M521 P70T/F88E/T210L/Y328F 変異型 M522 P70T/F113W/I157L/T210L 変異型 M523 P70T/F113W/G161A/Y328F 変異型 M524 P70T/F113Y/I157L/Y328F 変異型 M525 P70T/D115Q/I157L/T210L 変異型 M526 P70T/D115Q/I157L/Y328F 変異型 M527 P70T/I157L/G161A/T210L 変異型 M528 P70T/I157L/A184G/W187F 変異型 M529 P70T/I157L/A184G/T210L 変異型 M530 P 70T/1157L/W187F/T21 OL 変異型 M531 P70T/I157L/W187F/Y328F 変異型 M532 P70T/I157L/A204T/T210L
差替え用紙（規則 26) 変異型 M533 P70T/I157L/A204T/Y328F 変異型 M534 P70T/1157L/A204T/T21 OL 変異型 M535 P70T/I157L 'T210L/F211W 変異型 M536 P70T/I157L/T210L/G226A 変異型 M537 P70T/I157L/T210L/A233D 変異型 M538 P70T/I157L/T210L/Y328F 変異型 M539 P70T/I157L/T210L/L340V 変異型 M540 P70T/I157L/T210L/V439P 変異型 M541 P70T/I157L/Y328F/V439P 変異型 M542 P70T/G161A/T210L/Y328F 変異型 M543 P70T/G161A/A233D/Y328F 変異型 M544 A72E/S74T/I157L/Y328F 変異型 M545 A72E/G77S/F113W/I157L 変異型 M546 A72E/Y81H/I157L/Y328F 変異型 M547 A72E/K83P/ 157L/Y328F 変異型 M548 A72E/F88E/F113W/I157L 変異型 M549 A72E/F88E/I157L/Y328F 変異型 M550 A72E/F88E/G161A/Y328F 変異型 M551 A72E/F 113W/1157L/Y328F 変異型 M552 A72E/F113W/G161A/Y328F 変異型 M553 A72E/F113Y/I157L/Y328F 変異型 M554 A72E/F113YXG161A Y328F 変異型 M555 A72E/F113YZG226A/Y328F 変異型 M556 A72E/I157L/G161A/Y328F 変異型 M557 A72E/I157L/F162L/Y328F 変異型 M558 A72E/I157L/A184G/Y328F 変異型 M559 A72E/1157L/F200A/Y328F 変異型 M560 A72E/1157L/A204T/Y328F
差替え用紙（規則 26) T JP2005/023400
298 変異型 M561 A72E/I157L/F211W/Y328F
変異型 M562 A72E/I157L/F211Y/Y328F
変異型 M563 A72E/I157L/A233D/Y328F
変異型 M564 A72E/I157L/Y328F/L340V
変異型 M565 A72E/G161A//A204T/Y328F
変異型 M566 A72E/G161A/T210L/Y328F
変異型 M567 A72E/G161 A/F211 W/Y328F
変異型 M568 A72E/G161A/F211Y/Y328F- 変異型 M569 A72E/G161A/A233D/Y328F
変異型 M570 A72E/G161A/Y328F/L340V
変異型 M571 A72E/A184G/W187F/Y328F
変異型 M572 A72E/T210L/Y328F/L340V
変異型 M573 A72V/1157L/W187F/Y328F
変異型 M574 G77P/I157L/T210L/Y328F
変異型 M575' Y81A/S84D/I157L/Y328F
変異型 M576 Y81A/F88E/I157L/Y328F
変異型 M577 Y81A/F113W/I157L/Y328F
変異型 M578 Y81A/I157L/G161A/Y328F
変異型 M579 Y81A/I157L/W187F/Y328F
変異型 M580 Y81A/I157L/A204S/Y328F
変異型 M581 Y81 A/I 157L/T210L/Y328F
変異型 M582 Y81 A/1157L/A233D/Y328F
変異型 M583 Y81 A/1157L/Y328F/V439P
変異型 M584 Y81A/A184G/W187F/Y328F
変異型 M585 F88E/I157L/T210L/Y328F
変異型 M5.86 F88E/I157L/A233D/Y328F
変異型 M587 F113W/I157L/A204T/T210L
変異型 M588 F113W/I157L/T210L/Y328F
差替え用弒（規則 26) 変異型 M589 1157L/G 161 A/ Al 84G/W187F 変異型 M590 I157L/G161A/T210L/Y328F 変異型 M591 1157L/A 184G/ W187F/T210L 変異型 M592 I157L/A204S/T210L/Y328F 変異型 M593 1157L/A204T/T210L/Y328F 変異型 M594 I157L/T210L/A233D/Y328F 変異型 M595 G161A/A184G/W187F/Y328F 変異型 M596 P70T/A72E/S84D/I157L/Y328F 変異型 M597 P70T/A72E/A204S/I157L/Y328F 変異型 M598 P70T/A72E/T210L/I157L/Y328F 変異型 M599 P70T/A72E/G226A/I157L/Y328F 変異型 M600 P70T/A72E/A233D/I157L/Y328P 変異型 M601 P70T/Y81A/I157L/T210L/Y328F 変異型 M602 P70T/Y81A/I157L/A233D/Y328F 変異型 M603 P70T/Y81A/I157L/T210L/Y328F 変異型 M604 P70T/Y81 A/A233D/I157L/Y328F 変異型 M605 P70T/S84D/1157L/T21 OL/Y328F 変異型 M606 P70T/F 113W/1157L/T210L/Y328F 変異型 M607 P70T/I157L/A184G/W187F/A233D 変異型 M608 P70T/I157L/W187F/T210L/Y328F 変異型 M609 P70T/1157L/A204S/T210L/Y328F 変異型 M610 P70T/G161A/A184G/W187F/Y328F 変異型 M6U P70V/A72E/F113Y/I157L/Y328F 変異型 M612 P70V/A72E/I157L/F211W/Y328F 変異型 M613 A72E/S 74T/F113Y/1157L/Y328F 変異型 M614 A72E/S 74T/1157L/F211W/Y328F 変異型 M615 A72E/Y81H/I157L/F211W/Y328F 変異型 M616 A72E/K83P/F 113Y/I157L/Y328F
差替え用弒翻 26) P2005/023400
300 変異型 M617 A72E/W17F/F 113 Y/1157L/Y328F
変異型 M618 A72E/F113Y/D115Q/I157L/Y328F
変異型 Μ619 A72E/F113Y/I157L/Y328F/L340V
変異型 Μ620 A72E/F113Y/I157L/Y328F/V439P
変異型 M621 A72E/F113Y/G161A/I157L/Y328F
変異型 Μ622 A72E F113Y/A204S/I157L/Y328F
変異型 Μ623 Α72E/F113Υ/Α204Τ/1157L/Y328F
変異型 Μ624 A72E/F 113Υ/Τ21 OL/l 157L/Y328F
変異型 Μ625 A72E/F113Y/A233D/I157LZY328F
変異型 Μ626 Α72Ε/1157L/G 161A/F 162L/Y328F
変異型 Μ627 A72E/I157L/W187F/F211W/Y328F
変異型 Μ628 A72E/I157L/A20.4S/F211W/Y328F
変異型 Μ629 A72E/I157L/A204T/F211W/Y328F
変異型 Μ630 Α72Ε/1157L/F211W/Y328F/L340V
変異型 Μ631 Α72Ε/1157L/F211W/Y328F/V439P
変異型 Μ632 A72E/I157L/G226A/F211W/Y328F
変異型 Μ633 A72E/I157L/A233D/F211W/Y328F
変異型 Μ634 Y81A/S84D/I157L T210L/Y328F
変異型 Μ635 Υ81A/1157L/A184G/W187F/Y328F
変異型 Μ636 Y81A/I157L/A184G/W187F/T210L
変異型 Μ637 Y81A/I157L/A233D/T210L/Y328F
変異型 Μ638 F88E/I157L/A184G/W187F/T210L
変異型 Μ639 Fl l 3Υ/1157L/Y159N/F211W/Y328F
変異型 Μ640 1157L/A184G/W187F/T210L/Y328F
変異型 M641 P70T/I157L/A184G/W187F/T210L/Y328F 変異型 Μ642 Y81A/I157L/A184G/W187F/T210L/Y328F 請求項 55に記載の変異型タンパク質において、前記変異型 Mlから Μ642のいず れか 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異部位以外の部位に置換
差替え用弒（規則 26) T JP2005/023400
301
、欠失、挿入、付加おょぴ逆位からなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異 を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク 質。
[57] 少なくとも変異型 M241を含むことを特徴とする、請求項 55から 56のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[58] 少なくとも変異型 M340を含むことを特徴とする、請求項 55から 57のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[59] 少なくとも変異型 M412を含むことを特徴とする、請求項 55から 58のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[60] 少なくとも変異型 M491を含むことを特徴とする、請求項 55から 59のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[61] 少なくとも変異型 M496を含むことを特徴とする、請求項 55から 60のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[62] 少なくとも変異型 M581を含むことを特徴とする、請求項 55から 61のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[63] 少なくとも変異型 M582を含むことを特徴とする、請求項 55から 62のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[64] 少なくとも変異型 M594を含むことを特徴とする、請求項 55から 63のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[65] 請求項 18から 64の!/、ずれか一項に記載の変異型タンパク質が有するアミノ酸配列 をコードするポリヌクレオチド。
[66] 請求項 65に記載のポリヌクレオチドを含む組換えポリヌクレオチド。
[67] 請求項 66に記載の組換えポリヌクレオチドを含む形質転換微生物。
[68] 請求項 67に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および/または微 生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させることを特徴とする、変異型タンパク質の 製造方法。
[69] 請求項 18カゝら 64のいずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、ぺプチ ド生成反応を行うことを特徴とする、ペプチドの製造方法。
差替え用紙（規則 26) 0
302
[70] 請求項 67に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および Zまたは形 質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させてペプチド生成反応を行うこと を特徴とする、ペプチドの製造方法。
[71] 請求項 18から 64のいずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、 L—ァス ノ ラギン酸一 α , βージエステルと L—フエエルァラニンとの反応を行うことを特徴と する、 a—Lーァスパルチル— L一フエ二ルァラニン— β一エステルの製造方法。
[72] 請求項 67に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および/または形 質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させて、 L—ァスパラギン酸— α , βージエステルと L—フエュルァラニンとの反応を行うことを特徴とする、 α— Lーァス パルチルー L一フエニルァラエン一 β—エステルの製造方法。
差替え用弒（規則 26)

Claims

請求の範囲
配列番号 2に記載のアミノ酸配列に対し下記変異型 1から 68のいずれか 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質。
変異型 1 F207V
変異型 2 Q441E
変異型 3 K83A
変異型 4 A301V
変異型 5 V257I
変異型 6 A537G
変異型 7 A324V
変異型 8 N607K
変異型 9 D313E
変異型 10 Q229H
変異型 11 M208A
変異型 12 E551K
変異型 13 F207H
変異型 14 T72A
変異型 15 A137S
変異型 16 L439V
変異型 17 G226S
変異型 18 D619E
変異型 19 Y339H
変異型 20 W327G
変異型 21 V184A
変異型 22 V184C
変異型 23 V184G
変異型 24 V184I
変異型 25 V184L 変異型 26 V184M 変異型 27 V184P 変異型 28 V184S 変異型 29 V184T 変異型 30 Q441K 変異型 31 N442K 変異型 32 D203N 変異型 33 D203S 変異型 34 F207A 変異型 35 F207S 変異型 36 Q441N 変異型 37 F207T 変異型 38 F207I 変異型 39 T210K 変異型 40 W187A 変異型 41 S209A 変異型 42 F211A 変異型 43 F211V 変異型 44 V257A 変異型 45 V257G 変異型 46 V257H 変異型 47 V257M 変異型 48 V257N 変異型 49 V257Q 変異型 50 V257S 変異型 51 V257T 変異型 52 V257W 変異型 53 V257Y 変異型 54 K47G
変異型 55 K47E
変異型 56 N442F
変異型 57 N607R
変異型 58 P214T
変異型 59 Q202E
変異型 60 Y494F
変異型 61 R117A
変異型 62 F207G
変異型 63 S209D
変異型 64 S209G
変異型 65 Q441D
変異型 66 R445D
変異型 67 R445F
変異型 68 N442D
[2] 請求項 1に記載の変異型タンパク質において、前記変異型 1から 68のいずれか 1 種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異部位以外の部位に置換、欠失 、挿入、付加および逆位力 なる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異を更に 含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク質。
[3] 少なくとも変異型 2を含むことを特徴とする、請求項 1または 2に記載の変異型タン パク質。
[4] 少なくとも変異型 14を含むことを特徴とする、請求項 1から 3のいずれかに記載の変 異型タンパク質。
[5] 配列番号 2に記載のアミノ酸配列に対し下記変異型 239から 290、および 324から 377のうちのいずれか 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型 タンパク質。
変異型 239 F207V/Q441E
変異型 240 F207V/K83A 変異型 241 F207V/E551K
変異型 242 K83A/Q441E
変異型 243 M208A/E551K
変異型 244 V257I/Q441E
変異型 245 V257I/A537G
変異型 246 F207V/S209A
変異型 247 K83A/S209A
変異型 248 K83A/F207V/Q441E
変異型 249 L439V/F207V/Q441E
変異型 250 A537G/F207V/Q441E
変異型 251 A301V/F207V/Q441E
変異型 252 G226S/F207V/Q441E
変異型 253 V257I/F207V/Q441E
変異型 254 D619E/F207V/Q441E
変異型 255 Y339H/F207V/Q441E
変異型 256 N607K/F207V/Q441E
変異型 257 A324V/F207V/Q441E
変異型 258 Q229H/F207V/Q441E
変異型 259 W327G/F207V/Q441E
変異型 260 A301V/L439V/A537G/N607K
G/N607K
K
変異型 263 Q229H/A301V/A324V/Q441E/A537G/N607K G/N607K
Figure imgf000309_0001
/L439V/Q441E/A537G/N607K
/L439V/Q441E/A537G/N607K
/Q441E/A537G/N607K
/A537G/N607K
/A537G/N607K
/A537G/N607K
/L439V/Q441E/A537G/N607K
/L439V/Q441E/A537G/N607K
/L439V/Q441E/A537G/N607K
/L439V/Q441E/A537G/N607K
/L439V/Q441E/A537G/N607K
変異型 324 V184A/V257Y
変異型 325 V184A/W187A
変異型 326 V184A/N442D
変異型 327 V184P/N442D
変異型 328 V184A/N442D/L439V
変異型 329 A301V/L439V/A537G/N607K/V184A 変異型 330 A301V/L439V/A537G/N607K/V184P 変異型 331 A301V/L439V/A537G/N607K/V257Y 変異型 332 A301V/L439V/A537G/N607K/W187A 変異型 333 A301V/L439V/A537G/N607K/F211A 変異型 334 A301 V/L439 V/A537G/N607K/Q441 E 変異型 335 A301V/L439V/A537G/N607K/N442D 変異型 336 A301V/L439V/A537G/N607K/V184A/F207V 変異型 337 A301V/L439V/A537G/N607K/V184A/A182G
/A537G/N607K/V184A/N442D
/A537G/N607K/V184A/N442D/T185F
/Q441E/A537G/N607K/V184A/K83A
/Q441E/A537G/N607K/V184A/W187A
/Q441E/A537G/N607K/V184A/F211A
/Q441E/A537G/N607K/V184A/V178G
/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185A
/Q441E/A537G/N607K/V184A/A182G
/Q441E/A537G/N607K/V184A/K314R
/Q441E/A537G/N607K/V184A/A515V /Q441E/A537G/N607K/V184A/L66F
/Q441E/A537G/N607K/V184A/S315R
/Q441E/A537G/N607K/V184A/K484I
/Q441E/A537G/N607K/V184A/V213A
/Q441E/A537G/N607K/V184A/A245S
/Q441E/A537G/N607K/V184A/P214H
変異型 354 T72A/A137S/Q229P/V257I /A301V/A324V/L439V /Q441E /A537G/N607K/V184A/L263M
変異型 355 T72A/A137S/Q229P/V257I /A301V/A324V/L439V /Q441E/A537G/N607K/V184A/P 183 A
/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185K
/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185D
/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185C
/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185S
/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185F
/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185P O SS /A OSJ 薩
S9SSO/A 0SJ ε薩
J8SSA/V^8IA/¾ 09N/O S9V/ai^b/
VI9IO/V^8IA/¾Z09N/OZS9V/ai^b/ l 9II/V^8IA/¾ 09N/O S9V/ai^b/
ΉΙ ^^b/¾ 09N/O S 9 V/A6 S V\/ K\ OS V O Sfig ^
Figure imgf000313_0001
Figure imgf000313_0002
IZ9SA/d6SSb/SZSIV/VSZ 89ε薩
Figure imgf000313_0003
Figure imgf000313_0004
IZ9SA/d6SSb/SZSIV/VSZ 99ε薩
Figure imgf000313_0005
IZ9SA/d6SSb/SZSIV/VSZ 99ε薩
Figure imgf000313_0006
N98I /V^8IA/¾ 09N/O S9V/ai^b/ ιιε
00l7CZ0/S00Zdf/X3d 9817S.0/900Z OAV 変異型 376 F207V/Y339H
変異型 377 F207V/D619E
[6] 請求項 5に記載の変異型タンパク質において、前記変異型 239から 290、および 3
24から 377のうちのいずれか 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異 部位以外の部位に置換、欠失、挿入、付加および逆位力 なる群より選ばれる 1また は数個のアミノ酸の変異を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を 有する、変異型タンパク質。
[7] 少なくとも変異型 260を含むことを特徴とする、請求項 5または 6に記載の変異型タ ンパク質。
[8] 少なくとも変異型 286を含むことを特徴とする、請求項 5から 7のいずれかに記載の 変異型タンパク質。
[9] 請求項 1〜8のいずれかに記載の変異型タンパク質が有するアミノ酸配列をコード するポリヌクレオチド。
[10] 請求項 9に記載のポリヌクレオチドを含む組換えポリヌクレオチド。
[11] 請求項 10に記載の組換えポリヌクレオチドを含む形質転換微生物。
[12] 請求項 11に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および Zまたは微 生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させることを特徴とする、変異型タンパク質の 製造方法。
[13] 請求項 1から 8のいずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、ペプチド生 成反応を行うことを特徴とする、ペプチドの製造方法。
[14] 請求項 11に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および Zまたは形 質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させてペプチド生成反応を行うこと を特徴とする、ペプチドの製造方法。
[15] 請求項 1から 8のいずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、 L ァスパ ラギン酸 α , β—ジエステルと L—フエ二ルァラニンとの反応を行うことを特徴とす る、 α Lーァスバルチルー L フエ-ルァラニン β エステルの製造方法。
[16] 請求項 11に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および Ζまたは形 質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させて、 L ァスパラギン酸— a , β—ジエステルと L フエ-ルァラニンとの反応を行うことを特徴とする、 α L ァス バルチルー L フエ-ルァラニン 13 エステルの製造方法。
[17] 配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を X線結晶構造解析して得 られた立体構造を基にして、当該タンパク質の基質結合部位を推定し、基質結合部 位に位置するアミノ酸残基の置換、挿入または削除をすることによりペプチド生成活 性を有する変異型タンパク質を設計'作製する方法。
[18] 配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、当該配 列中 67— 70、 72— 88、 100、 102、 103、 106、 107、 113— 117、 130、 155— 16 3、 165、 166、 180—188、 190—195、 200— 235、 259、 273、 276、 278、 292 — 294、 296、 298、 299、 300— 304、 325— 328、 330— 340、及び 437— 447の アミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または 削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
[19] ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タンパク 質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質との 3次元構造とが、トレ ッデイング法による判定の結果類似しており、該判定の際に得られるアラインメントに ぉ ヽて、酉己歹 U番号 209【こ記載のアミノ酸酉己歹 IJ中 67— 70、 72— 88、 100、 102、 103 、 106、 107、 113— 117、 130、 155— 163、 165、 166、 180—188、 190—195、 200— 235、 259、 273、 276、 278、 292— 294、 296、 298、 299、 300— 304、 3 25— 328、 330— 340、及び 437— 447のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存 在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または 削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
[20] ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タンパク 質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の一次配列とのァライン メントを行ったときに、もしくは当該タンパク質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を 有するタンパク質の 3次元構造とのアラインメントを行なったときに、一次配列の相同 性が 25%以上であるものにおいて、配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 67— 7 0、 72— 88、 100、 102、 103、 106、 107、 113— 117、 130、 155— 163、 165、 1 66、 180—188、 190—195、 200— 235、 259、 273、 276、 278、 292— 294、 29 6、 298、 299、 300— 304、 325— 328、 330— 340及び 437— 447のアミノ酸残基 に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のァミノ 酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タン パク質。
[21] 配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造において、以 下の（a)〜 (i)の中力 選ばれる 1または 2以上の立体構造の変化が生じており、かつ 、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
(a)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 79— 82のアミノ酸残基が存在する位置の 少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(b)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 84、 88、 89及び 92のアミノ酸残基が存在 する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(c)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 72、 75及び 77のアミノ酸残基が存在する 位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(d)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 159、 161、 162、 184、 187及び 276の アミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または 削除
(e)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 70、 106、 113、 115、 193、 207、 209 - 212、 216及び 259のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残 基の置換、挿入または削除
(f)配列番号 208に記載のア 酸配列中 200、 202— 205、 207及び 228のア 酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(g)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 233、 234、及び 439のアミノ酸残基が存 在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(h)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 328、 339、 340、 445、及び 446のァミノ 酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(i)配列番号 208に記載のアミノ酸配列中 87、 155、 157、及び 160のアミノ酸残基 が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
[22] ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タンパク 質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質との 3次元構造とが、トレ ッデイング法による判定の結果類似しており、かつ、該判定の際に得られるァラインメ ントにお 、て、以下の（ ）〜（Γ)の中力も選ばれる 1または 2以上の変化が生じて ヽ る、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 79— 82のアミノ酸残基に対応するアミ ノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換 、挿入または削除
( ）配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 84、 88、 89及び 92のアミノ酸残基に 対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のァミノ 酸残基の置換、挿入または削除
( ）配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 72、 75及び 77のアミノ酸残基に対応 するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残 基の置換、挿入または削除
( 配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 159、 161、 162、 184、 187及び 276 のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくと も一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(e 配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 70、 106、 113、 115、 193、 207、 20 9— 212、 216及び 259のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立 体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(Γ)配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 200、 202— 205、 207、及び 228のァ ミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一 以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(g 酉己歹 U番号 209【こ記載の ミノ酸酉己歹 U中、 233、 234、及び 439の ミノ酸残基【こ 対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち少なくとも一以上のアミノ酸 残基の置換、挿入または削除
( ）配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 328、 339、 340、 445、及び 446のァ ミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一 以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除 (i')配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 87、 155、 157、及び 160のアミノ酸残 基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のァ ミノ酸残基の置換、挿入または削除
ペプチド生成活性を有するタンパク質の変異型タンパク質であって、当該タンパク 質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の一次配列とのァライン メントを行ったときに、もしくは当該タンパク質と配列番号 209に記載のアミノ酸配列を 有するタンパク質の 3次元構造とのアラインメントを行ったときに、一次配列の相同性 が 25%以上であるものにおいて、以下の（a~)〜（ΓΊの中力も選ばれる 1または 2 以上の変化が生じており、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。 (a' ' )配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 79— 82のアミノ酸残基に対応するァ ミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置 換、挿入または削除
(b~)配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 84、 88、 89及び 92のアミノ酸残基に 対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のァミノ 酸残基の置換、挿入または削除
( 配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 72、 75及び 77のアミノ酸残基に対応 するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残 基の置換、挿入または削除
(dつ配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 159、 161、 162、 184、 187及び 27 6のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なく とも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(eつ配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 70、 106、 113、 115、 193、 207、 20 9— 212、 216及び 259のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立 体構造のうちの少なくとも一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(ΓΊ配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 200、 202— 205、 207、及び 228の アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうちの少なくとも 一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(g~)配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 233、 234、及び 439のアミノ酸残基 に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち少なくとも一以上のァミノ 酸残基の置換、挿入または削除
(hつ配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 328、 339、 340、 445、及び 446の アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも 一以上のアミノ酸残基の置換、挿入または削除
(门配列番号 209に記載のアミノ酸配列中、 87、 155、 157、及び 160のアミノ酸残 基に対応するアミノ酸残基が存在する位置の立体構造のうち、少なくとも一以上のァ ミノ酸残基の置換、挿入または削除
[24] 配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、当該配 列中 67、 69、 70、 72— 85、 103、 106、 107、 113— 116、 165、 182、 183、 185、 187、 188、 190、 200、 202、 204— 206、 209— 211、 213— 235、 301、 328、 3 38— 340、 440—442、及び 446のアミノ酸残基力 S存在する位置の少なくとも一以上 のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異 型タンパク質。
[25] 配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、当該配 列中 67、 69、 70、 72— 84、 106、 107、 114、 116、 183、 185、 187、 188、 202、 204— 206、 209、 211、 213— 233、 235、 328、 338—442、及び 446のアミノ酸 残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入または削除され 、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
[26] 配列番号 208に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の立体構造のうち、当該配 列中 67、 70、 72— 75、 77— 79、 81— 84、 114、 116、 185、 188、 202、 204、 20 6、 209、 211、 213— 215、 218— 224、 226— 233、 235、 328、 338—441、及び 446のアミノ酸残基が存在する位置の少なくとも一以上のアミノ酸残基が置換、挿入 または削除され、かつ、ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質。
[27] 配列番号 208に記載のアミノ酸配列に対し下記変異型 L1から L335のいずれか 1 種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質。
変異型 LI N67K
変異型 L2 N67L 変異型 L3 N67S 変異型 L4 T69I 変異型 L5 T69M 変異型 L6 T69Q 変異型 L7 T69R 変異型 L8 T69V 変異型 L9 P70G 変異型 LIO P70N 変異型 Ll l P70S 変異型 L 12 P70T 変異型 L 13 P70V 変異型 L14 A72C 変異型 L15 A72D 変異型 L 16 A72E 変異型 L 17 A72I 変異型 L 18 A72L 変異型 L19 A72M 変異型 L20 A72N 変異型 L21 A72Q 変異型 L22 A72S 変異型 L23 A72V 変異型 L24 V73A 変異型 L25 V73I 変異型 L26 V73L 変異型 L27 V73M 変異型 L28 V73N 変異型 L29 V73S 変異型 L30 V73T 変異型 L31 S74A 変異型 L32 S74F 変異型 L33 S74K 変異型 L34 S74N 変異型 L35 S74T 変異型 L36 S74V 変異型 L37 P75A 変異型 L38 P75D 変異型 L39 P75L 変異型 L40 P75S 変異型 L41 Y76F 変異型 L42 Y76H 変異型 L43 Y76I 変異型 L44 Y76V 変異型 L45 Y76W 変異型 L46 G77A 変異型 L47 G77F 変異型 L48 G77K 変異型 L49 G77M 変異型 L50 G77N 変異型 L51 G77P 変異型 L52 G77S 変異型 L53 G77T 変異型 L54 Q78F 変異型 L55 Q78L 変異型 L56 N79D 変異型 L57 N79L 変異型 L58 N79R 変異型 L59 N79S 変異型 L60 E80D 変異型 L61 E80F 変異型 L62 E80L 変異型 L63 E80P 変異型 L64 E80S 変異型 L65 Y81A 変異型 L66 Y81C 変異型 L67 Y81D 変異型 L68 Y81E 変異型 L69 Y81F 変異型 L70 Y81H 変異型 L71 Y81K 変異型 L72 Y81L 変異型 L73 Y81N 変異型 L74 Y81S 変異型 L75 Y81T 変異型 L76 Y81W 変異型 L77 K82D 変異型 L78 K82L 変異型 L79 K82P 変異型 L80 K82S 変異型 L81 K83D 変異型 L82 K83F 変異型 L83 K83L 変異型 L84 K83P 変異型 L85 K83S 変異型 L86 K83V 変異型 L87 S84D 変異型 L88 S84F 変異型 L89 S84K 変異型 L90 S84L 変異型 L91 S84N 変異型 L92 S84Q 変異型 L93 L85F 変異型 L94 L85I 変異型 L95 L85P 変異型 L96 L85V 変異型 L97 N87E 変異型 L98 N87Q 変異型 L99 F88E 変異型 L100 V103I 変異型 L101 V103L 変異型 L102 K106A 変異型 L103 K106F 変異型 L 104 K106L 変異型 L105 K106Q 変異型 L106 K106S 変異型 L107 W107A 変異型 L108 W107Y 変異型 L109 F113A 変異型 L110 F113W 変異型 L111 F113Y 変異型 L112 E114A 変異型 L113 E114D 変異型 L114 D115E 変異型 LI 15 D115Q 変異型 LI 16 D115S 変異型 LI 17 I116F 変異型 L118 I116K 変異型 L119 I116L 変異型 L 120 I116M 変異型 L121 I116N 変異型 L122 I116T 変異型 L123 I116V 変異型 L 124 I157K 変異型 L125 I157L 変異型 L 126 Y159G 変異型 L127 Y159N 変異型 L 128 Y159S 変異型 L129 P160G 変異型 L 130 G161A 変異型 L131 F162L 変異型 L132 F162Y 変異型 L133 Y163I 変異型 L 134 T165V 変異型 L135 Q181F 変異型 L136 A182G 変異型 L137 A182S 変異型 L138 P183A 変異型 L139 P183G 変異型 L140 P183S 変異型 L141 T185A 変異型 L142 T185G 変異型 L143 T185V 変異型 L 144 W187A 変異型 L145 W187F 変異型 L146 W187H 変異型 L147 W187Y 変異型 L148 Y188F 変異型 L149 Y188L 変異型 L 150 Y188W 変異型 L151 G190A 変異型 L152 G190D 変異型 L153 F193W 変異型 L 154 H194D 変異型 L155 F200A 変異型 L156 F200L 変異型 L157 F200S 変異型 L158 F200V 変異型 L159 L201Q 変異型 L 160 L201S 変異型 L161 Q202A 変異型 L162 Q202D 変異型 L163 Q202F 変異型 L 164 Q202S 変異型 L165 Q202T 変異型 L166 Q202V 変異型 L167 D203E 変異型 L168 A204G 変異型 L169 A204L 変異型 L 170 A204S 変異型 LI 71 A204T 変異型 L172 A204V 変異型 L173 F205L 変異型 L 174 F205Q 変異型 L175 F205V 変異型 L 176 F205W 変異型 L177 T206F 変異型 L 178 T206K 変異型 L179 T206L 変異型 L 180 F207I 変異型 L181 F207W 変異型 L182 F207Y 変異型 L183 M208A 変異型 L 184 M208L 変異型 L185 S209F 変異型 L186 S209K 変異型 L187 S209L 変異型 L188 S209N 変異型 L189 S209V 変異型 L 190 T210A 変異型 L191 T210L 変異型 L192 T210Q 変異型 L193 T210V 変異型 L 194 F211A 変異型 L195 F211I 変異型 L196 F211L 変異型 L197 F211M 変異型 L198 F211V 変異型 L199 F211W 変異型 L200 F211Y 変異型 L201 G212A 変異型 L202 V213D 変異型 L203 V213F 変異型 L204 V213K 変異型 L205 V213S 変異型 L206 P214D 変異型 L207 P214F 変異型 L208 P214K 変異型 L209 P214S 変異型 L210 R215A 変異型 L211 R215I 変異型 L212 R215K 変異型 L213 R215Q 変異型 L214 R215S 変異型 L215 R215T 変異型 L216 R215Y 変異型 L217 P216D 変異型 L218 P216K 変異型 L219 K217D 変異型 L220 P218F 変異型 L221 P218L 変異型 L222 P218Q 変異型 L223 P218S 変異型 L224 I219D 変異型 L225 I219F 変異型 L226 I219K 変異型 L227 T220A 変異型 L228 T220D 変異型 L229 T220F 変異型 L230 T220K 変異型 L231 T220L 変異型 L232 T220S 変異型 L233 P221A 変異型 L234 P221D 変異型 L235 P221F 変異型 L236 P221K 変異型 L237 P221L 変異型 L238 P221S 変異型 L239 D222A 変異型 L240 D222F 変異型 L241 D222L 変異型 L242 D222R 変異型 L243 Q223F 変異型 L244 Q223K 変異型 L245 Q223L 変異型 L246 Q223S 変異型 L247 F224A 変異型 L248 F224D 変異型 L249 F224G 変異型 L250 F224K 変異型 L251 F224L 変異型 L252 K225D 変異型 L253 K225G 変異型 L254 K225S 変異型 L255 G226A 変異型 L256 G226F 変異型 L257 G226L 変異型 L258 G226N 変異型 L259 G226S 変異型 L260 K227D 変異型 L261 K227F 変異型 L262 K227S 変異型 L263 I228A 変異型 L264 I228F 変異型 L265 I228K 変異型 L266 I228S 変異型 L267 P229A 変異型 L268 P229D 変異型 L269 P229K 変異型 L270 P229L 変異型 L271 P229S 変異型 L272 I230A 変異型 L273 I230F 変異型 L274 I230K 変異型 L275 I230S 変異型 L276 K231F 変異型 L277 K231L 変異型 L278 K231S 変異型 L279 E232D 変異型 L280 E232F 変異型 L281 E232G 変異型 L282 E232L 変異型 L283 E232S 変異型 L284 A233D 変異型 L285 A233F 変異型 L286 A233H 変異型 L287 A233K 変異型 L288 A233L 変異型 L289 A233N 変異型 L290 A233S 変異型 L291 D234L 変異型 L292 D234S 変異型 L293 K235D 変異型 L294 K235F 変異型 L295 K235L 変異型 L296 K235S 変異型 L297 F259Y 変異型 L298 R276A 変異型 L299 R276Q 変異型 L300 A298S 変異型 L301 D300N 変異型 L302 V301M 変異型 L303 Y328F 変異型 L304 Y328H 変異型 L305 Y328M 変異型 L306 Y328W 変異型 L307 W332H 変異型 L308 E336A 変異型 L309 N338A 変異型 L310 N338F 変異型 L311 Y339K
変異型 L312 Y339L
変異型 L313 Y339T
変異型 L314 L340A
変異型 L315 L340I
変異型 L316 L340V
変異型 L317 V439P
変異型 L318 I440F
変異型 L319 I440V
変異型 L320 E441F
変異型 L321 E441M
変異型 L322 E441N
変異型 L323 N442A
変異型 L324 N442L
変異型 L325 R443S
変異型 L326 T444W
変異型 L327 R445G
変異型 L328 R445K
変異型 L329 E446A
変異型 L330 E446F
変異型 L331 E446Q
変異型 L332 E446S
変異型 L333 E446T
変異型 L334 Y447L
変異型 L335 Y447S
請求項 20に記載の変異型タンパク質において、前記変異型 L1から L335のいず れカ 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異部位以外の部位に置換 、欠失、挿入、付加および逆位力もなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異 を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク 質。
[29] 少なくとも変異型 L124もしくは変異型 L125を含むことを特徴とする、請求項 27ま たは 28に記載の変異型タンパク質。
[30] 少なくとも変異型 L303を含むことを特徴とする、請求項 27から 29のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[31] 少なくとも変異型 L 12を含むことを特徴とする、請求項 27から 30のいずれか一項に 記載の変異型タンパク質。
[32] 少なくとも変異型 L127を含むことを特徴とする、請求項 27から 31のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[33] 少なくとも変異型 L195もしくは L199を含むことを特徴とする、請求項 27から 32の
Vヽずれか一項に記載の変異型タンパク質。
[34] 少なくとも変異型 L130を含むことを特徴とする、請求項 27から 33のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[35] 少なくとも変異型 L115を含むことを特徴とする、請求項 27から 34のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[36] 少なくとも変異型 L316を含むことを特徴とする、請求項 27から 35のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[37] 少なくとも変異型 L99を含むことを特徴とする、請求項 27から 36のいずれか一項に 記載の変異型タンパク質。
[38] 少なくとも変異型 L15もしくは L16を含むことを特徴とする、請求項 27から 37のい ずれか一項に記載の変異型タンパク質。
[39] 少なくとも変異型 L131を含むことを特徴とする、請求項 27から 38のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[40] 少なくとも変異型 L284を含むことを特徴とする、請求項 27から 39のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[41] 少なくとも変異型 L191を含むことを特徴とする、請求項 27から 40のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。 [42] 少なくとも変異型 L65を含むことを特徴とする、請求項 27から 41のいずれか一項に 記載の変異型タンパク質。
[43] 少なくとも変異型 L265を含むことを特徴とする、請求項 27から 42のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[44] 少なくとも変異型 L317を含むことを特徴とする、請求項 27から 43のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[45] 少なくとも変異型 L255を含むことを特徴とする、請求項 27から 44のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[46] 少なくとも変異型 L52を含むことを特徴とする、請求項 27から 45のいずれか一項に 記載の変異型タンパク質。
[47] 少なくとも変異型 L155を含むことを特徴とする、請求項 27から 46のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[48] 少なくとも変異型 L298を含むことを特徴とする、請求項 27から 47のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[49] 少なくとも変異型 L201を含むことを特徴とする、請求項 27から 48のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[50] 少なくとも変異型 L145を含むことを特徴とする、請求項 27から 49のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[51] 少なくとも変異型 L170を含むことを特徴とする、請求項 27から 50のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[52] 少なくとも変異型 L87を含むことを特徴とする、請求項 27から 51のいずれか一項に 記載の変異型タンパク質。
[53] 少なくとも変異型 L60を含むことを特徴とする、請求項 27から 52のいずれか一項に 記載の変異型タンパク質。
[54] 少なくとも変異型 L110を含むことを特徴とする、請求項 27から 53のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[55] 配列番号 208に記載のアミノ酸配列に対し下記の変異型 Mlから M642のいずれ 力 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列を有する変異型タンパク質。 変異型 Ml T69N/I157L 変異型 M2 T69Q/I157L 変異型 M3 T69S/I157L 変異型 M4 P70A/I157L 変異型 M5 P70G/I157L 変異型 M6 P70I/I157L 変異型 M7 P70L/I157L 変異型 M8 P70N/I157L 変異型 M9 P70S/I157L 変異型 M10 P70T/I157L 変異型 Mi l P70T/T210L 変異型 Ml 2 P70T/Y328F 変異型 Ml 3 P70V/I157L 変異型 M14 A72E/G77S 変異型 Ml 5 A72E/E80D 変異型 Ml 6 A72E/Y81A 変異型 Ml 7 A72E/S84D 変異型 Ml 8 A72E/F113W 変異型 Ml 9 A72E/I157L 変異型 M20 A72E/G161A 変異型 M21 A72E/F162L 変異型 M22 A72E/A184G 変異型 M23 A72E/W187F 変異型 M24 A72E/F200A 変異型 M25 A72E/A204S 変異型 M26 A72E/T210L 変異型 M27 A72E/F211L 変異型 M28 A72E/F211W 変異型 M29 A72E/G226A 変異型 M30 A72E/I228K 変異型 M31 A72E/A233D 変異型 M32 A72E/Y328F 変異型 M33 A72S/I157L 変異型 M34 A72V/Y328F 変異型 M35 V73A/I157L 変異型 M36 V73I/I157L 変異型 M37 S74A/I157L 変異型 M38 S74N/I157L 変異型 M39 S74T/I157L 変異型 M40 S74V/I157L 変異型 M41 G77A/I157L 変異型 M42 G77F/I157L 変異型 M43 G77M/I157L 変異型 M44 G77P/I157L 変異型 M45 G77S/E80D 変異型 M46 G77S/Y81A 変異型 M47 G77S/S84D 変異型 M48 G77S/F113W 変異型 M49 G77S/I157L 変異型 M50 G77S/Y159N 変異型 M51 G77S/Y159S 変異型 M52 G77S/G161A 変異型 M53 G77S/F162L 変異型 M54 G77S/A184G 変異型 M55 G77S/W187F 変異型 M56 G77S/F200A 変異型 M57 G77S/A204S 変異型 M58 G77S/T210L 変異型 M59 G77S/F211L 変異型 M60 G77S/F211W 変異型 M61 G77S/I228K 変異型 M62 G77S/A233D 変異型 M63 G77S/R276A 変異型 M64 G77S/Y328F 変異型 M65 E80D/Y81A 変異型 M66 E80D/F113W 変異型 M67 E80D/I157L 変異型 M68 E80D/Y159N 変異型 M69 E80D/G161A 変異型 M70 E80D/A184G 変異型 M71 E80D/F211W 変異型 M72 E80D/Y328F 変異型 M73 E80S/I157L 変異型 M74 Y81A/F113W 変異型 M75 Y81A/I157L 変異型 M76 Y81A/Y159N 変異型 M77 Y81A/Y159S 変異型 M78 Y81A/G161A 変異型 M79 Y81A/A184G 変異型 M80 Y81A/W187F 変異型 M81 Y81A/F200A 変異型 M82 Y81A/T210L 変異型 M83 Y81A/F211W 変異型 M84 Y81A/F211Y 変異型 M85 Y81A/G226A 変異型 M86 Y81A/I228K 変異型 M87 Y81A/A233D 変異型 M88 Y81A/Y328F 変異型 M89 Y81H/I157L 変異型 M90 Y81N/I157L 変異型 M91 K83P/I157L 変異型 M92 S84A/I157L 変異型 M93 S84D/F113W 変異型 M94 S84D/I157L 変異型 M95 S84D/Y159N 変異型 M96 S84D/G161A 変異型 M97 S84D/A184G 変異型 M98 S84D/Y328F 変異型 M99 S84E/I157L 変異型 M100 S84F/I157L 変異型 M101 S84K/I157L 変異型 M102 L85F/I157L 変異型 M103 L85I/I157L 変異型 M104 L85P/I157L 変異型 M105 L85V/I157L 変異型 M106 N87A/I157L 変異型 M107 N87D/I157L 変異型 M108 N87E/I157L 変異型 M109 N87G/I157L 変異型 Ml 10 N87Q/I157L 変異型 Ml 11 N87S/I157L 変異型 Ml 12 F88A/I157L 変異型 Ml 13 F88D/I157L 変異型 Ml 14 F88E/I157L 変異型 Ml 15 F88E/Y328F 変異型 Ml 16 F88L/I157L 変異型 Ml 17 F88T/I157L 変異型 Ml 18 F88V/I157L 変異型 Ml 19 F88Y/I157L 変異型 M120 K106H/I157L 変異型 Ml 21 K106L/I157L 変異型 M122 K106M/I157L 変異型 M123 K106Q/I157L 変異型 Ml 24 K106R/I157L 変異型 M125 K106S/I157L 変異型 M126 K106V/I157L 変異型 M127 W107A/I157L 変異型 M128 W107A/Y328F 変異型 M129 W107Y/I157L 変異型 M130 W107Y/T206Y 変異型 Ml 31 W107Y/K217D 変異型 Ml 32 W107Y/P218L 変異型 Ml 33 W107Y/T220L 変異型 M134 W107Y/P221D 変異型 Ml 35 W107Y/Y328F 変異型 M136 F113A/I157L 変異型 Ml 37 F113H/I157L 変異型 M138 F113N/I157L 変異型 Ml 39 F113V/I157L 変異型 M140 F113W/I157L 変異型 M141 F113W/Y159N 変異型 M142 F113W/Y159S 変異型 M143 F113W/G161A 変異型 M144 F113W/F162L 変異型 M145 F113W/A184G 変異型 M146 F113W/W187F 変異型 M147 F113W/F200A 変異型 M148 F113W/T206Y 変異型 M149 F113W/T210L 変異型 M150 F113W/F211L 変異型 Ml 51 F113W/F211W 変異型 Ml 52 F113W/F211Y 変異型 Ml 53 F113W/V213D 変異型 M154 F113W/K217D 変異型 Ml 55 F113W/T220L 変異型 M156 F113W/P221D 変異型 Ml 57 F113W/G226A 変異型 M158 F113W/I228K 変異型 Ml 59 F113W/A233D 変異型 M160 F113W/R276A 変異型 M161 F113Y/I157L 変異型 M162 F113Y/F211W 変異型 M163 E114D/I157L 変異型 M164 D115A/I157L 変異型 M165 D115E/I157L 変異型 M166 D115M/I157L 変異型 M167 D115N/I157L 変異型 M168 D115Q/I157L 変異型 M169 D115S/I157L 変異型 M170 D115V/I157L 変異型 Ml 71 I157L/Y159I 変異型 M172 I157L/Y159L 変異型 M173 I157L/Y159N 変異型 Ml 74 I157L/Y159S 変異型 M175 I157L/Y159V 変異型 M176 I157L/P160A 変異型 M177 I157L/P160S 変異型 M178 I157L/G161A 変異型 M179 I157L/F162L 変異型 M180 I157L/F162M 変異型 M181 I157L/F162N 変異型 M182 I157L/F162Y 変異型 M183 I157L/T165L 変異型 M184 I157L/T165V 変異型 M185 I157L/Q181A 変異型 M186 I157L/Q181F 変異型 M187 I157L/Q181N 変異型 M188 I157L/A184G 変異型 M189 I157L/A184L 変異型 M190 I157L/A184M 変異型 Ml 91 I157L/A184S 変異型 Ml 92 I157L/A184T 変異型 Ml 93 I157L/W187F 変異型 M194 I157L/W187Y 変異型 Ml 95 I157L/F193H 変異型 M196 I157L/F193I 変異型 Ml 97 I157L/F193W 変異型 M198 I157L/F200A 変異型 Ml 99 I157L/F200H 変異型 M200 I157L/F200L 変異型 M201 I157L/F200Y 変異型 M202 I157L/A204G 変異型 M203 I157L/A204I 変異型 M204 I157L/A204L 変異型 M205 I157L/A204S 変異型 M206 I157L/A204T 変異型 M207 I157L/A204V 変異型 M208 I157L/F205A 変異型 M209 I157L/F207I 変異型 M210 I157L/F207M 変異型 M211 I157L/F207V 変異型 M212 I157L/F207W 変異型 M213 I157L/F207Y 変異型 M214 I157L/M208A 変異型 M215 I157L/M208K 変異型 M216 I157L/M208L 変異型 M217 I157L/M208T 変異型 M218 I157L/M208V 変異型 M219 I157L/S209F 変異型 M220 I157L/S209N 変異型 M221 I157L/T210A 変異型 M222 I157L/T210L 変異型 M223 I157L/F211I 変異型 M224 I157L/F211L 変異型 M225 I157L/F211V 変異型 M226 I157L/F211W 変異型 M227 I157L/G212A 変異型 M228 I157L/G212D 変異型 M229 I157L/G212S 変異型 M230 I157L/R215K 変異型 M231 I157L/R215L 変異型 M232 I157L/R215T 変異型 M233 I157L/R215Y 変異型 M234 I157L/T220L 変異型 M235 I157L/G226A 変異型 M236 I157L/G226F 変異型 M237 I157L/I228K 変異型 M238 I157L/A233D 変異型 M239 I157L/R276A 変異型 M240 I157L/Y328A 変異型 M241 I157L/Y328F 変異型 M242 I157L/Y328H 変異型 M243 I157L/Y328I 変異型 M244 I157L/Y328L 変異型 M245 I157L/Y328P 変異型 M246 I157L/Y328V 変異型 M247 I157L/Y328W 変異型 M248 I157L/L340F 変異型 M249 I157L/L340I 変異型 M250 I157L/L340V 変異型 M251 I157L/V439A 変異型 M252 I157L/V439P 変異型 M253 I157L/R445A 変異型 M254 I157L/R445F 変異型 M255 I157L/R445G 変異型 M256 I157L/R445K 変異型 M257 I157L/R445V 変異型 M258 Y159N/G161A 変異型 M259 Y159N/A184G 変異型 M260 Y159N/A204S 変異型 M261 Y159N/T210L 変異型 M262 Y159N/F211W 変異型 M263 Y159N/F211Y 変異型 M264 Y159N/G226A 変異型 M265 Y159N/I228K 変異型 M266 Y159N/A233D 変異型 M267 Y159N/Y328F 変異型 M268 Y159S/G161A 変異型 M269 Y159S/F211W 変異型 M270 G161A/F162L 変異型 M271 G161A/A184G 変異型 M272 G161A/W187F 変異型 M273 G161A/F200A 変異型 M274 G161A/A204S 変異型 M275 G161A/T210L 変異型 M276 G161A/F211L 変異型 M277 G161A/F211W 変異型 M278 G161A/G226A 変異型 M279 G161A/I228K 変異型 M280 G161A/A233D 変異型 M281 G161A/Y328F 変異型 M282 F162L/A184G 変異型 M283 F162L/F211W 変異型 M284 F162L/A233D 変異型 M285 P183A/Y328F 変異型 M286 A184G/W187F 変異型 M287 A184G/F200A 変異型 M288 A184G/A204S 変異型 M289 A184G/T210L 変異型 M290 A184G/F211L 変異型 M291 A184G/F211W 変異型 M292 A184G/I228K 変異型 M293 A184G/A233D 変異型 M294 A184G/R276A 変異型 M295 V184G/Y328F 変異型 M296 T185A/Y328F 変異型 M297 T185N/Y328F 変異型 M298 W187F/F211W 変異型 M299 W187F/Y328F 変異型 M300 F193W/F211W 変異型 M301 F200A/F211W 変異型 M302 F200A/Y328F 変異型 M303 L201Q/Y328F 変異型 M304 L201S/Y328F 変異型 M305 A204S/F211W 変異型 M306 A204S/Y328F 変異型 M307 T210L/F211W 変異型 M308 T210L/Y328F 変異型 M309 F211L/A233D 変異型 M310 F211L/Y328F 変異型 M311 F211W/I228K 変異型 M312 F211W/A233D 変異型 M313 F211W/Y328F 変異型 M314 R215A/Y328F 変異型 M315 R215L/Y328F 変異型 M316 T220L/A233D 変異型 M317 T220L/D300N 変異型 M318 P221L/A233D 変異型 M319 P221L/Y328F 変異型 M320 F224A/A233D 変異型 M321 G226A/Y328F 変異型 M322 G226F/A233D 変異型 M323 G226F/Y328F 変異型 M324 I228K/Y328F 変異型 M325 A233D/K235D 変異型 M326 A233D/Y328F 変異型 M327 R276A/Y328F 変異型 M328 Y328F/Y339F 変異型 M329 A27T/Y81A/S84D 変異型 M330 P70T/A72E/I157L 変異型 M331 P70T/G77S/I157L 変異型 M332 P70T/E80D/F88E 変異型 M333 P70T/Y81A/I157L 変異型 M334 P70T/S84D/I157L 変異型 M335 P70T/F88E/Y328F 変異型 M336 P70T/F 113W/1157L 変異型 M337 P70T/I157L/A204S 変異型 M338 P70T/1157L/T210L 変異型 M339 P70T/I157L/A233D 変異型 M340 P70T/1157L/Y328F 変異型 M341 P70T/I157L/V439P 変異型 M342 P70T/I157L/I440F 変異型 M343 P70T/G 161A/T21 OL 変異型 M344 P70T/G 161A/Y328F 変異型 M345 P70T/A184G/W187F 変異型 M346 P70T/A204S/Y328F 変異型 M347 P70T/F211W/Y328F 変異型 M348 P70V/A72E/I157L 変異型 M349 A72E/S74T/I157L 変異型 M350 A72E/G77S/Y328F 変異型 M351 A72E/E80D/Y328F 変異型 M352 A72E/Y81H/I157L 変異型 M353 A72E/K83P/I157L 変異型 M354 A72E/S84D/Y328F 変異型 M355 A72E/L85P/I157L 変異型 M356 A72E/F 113W/1157L 変異型 M357 A72E/F113W/Y328F 変異型 M358 A72E/F113Y/1157L 変異型 M359 A72E/D 115Q/1157L 変異型 M360 A72E/1157L/G 161 A 変異型 M361 A72E/1157L/F 162L 変異型 M362 A72E/1157L/A184G 変異型 M363 A72E/I157L/F200A 変異型 M364 A72E/I157L/A204S 変異型 M365 A72E/I157L/A204T 変異型 M366 A72E/1157L/T21 OL 変異型 M367 A72E/I157L/F211W 変異型 M368 A72E/I157L/G226A 変異型 M369 A72E/I157L/A233D 変異型 M370 A72E/I157L/Y328F 変異型 M371 A72E/I157L/L340V 変異型 M372 A72E/I157L/V439P 変異型 M373 A72E/G 161A/Y328F 変異型 M374 A72E/F162L/Y328F 変異型 M375 A72E/A184G/Y328F 変異型 M376 A72E/W187F/Y328F 変異型 M377 A72E/F200A/Y328F 変異型 M378 A72E/A204S/Y328F 変異型 M379 A72E/T210L/Y328F 変異型 M380 A72E/I228K/Y328F 変異型 M381 A72E/A233D/Y328F 変異型 M382 A72E/Y328F/Y159N 変異型 M383 A72E/Y328F/F211W 変異型 M384 A72E/Y328F/F211Y 変異型 M385 A72E/Y328F/G226A 変異型 M386 A72V/Y81A/Y328F 変異型 M387 A72V/G 161A/Y328F 変異型 M388 G77M/I157L/T210L 変異型 M389 G77P/I157L/F162L 変異型 M390 G77P/I157L/A184G 変異型 M391 G77P/F211W/Y328F 変異型 M392 G77S/Y81A/Y328F 変異型 M393 G77S/S84D/I157L 変異型 M394 G77S/F88E/I157L 変異型 M395 G77S/F113W/I157L 変異型 M396 G77S/F113Y/I157L 変異型 M397 G77S/D115Q/I157L 変異型 M398 G77S/I157L/G161A 変異型 M399 G77S/I157L/F200A 変異型 M400 G77S/I157L/A204S 変異型 M401 G77S/I157L/T210L 変異型 M402 G77S/I157L/F211W 変異型 M403 G77S/I157L/G226A 変異型 M404 G77S/I157L/A233D 変異型 M405 G77S/I157L/L340V 変異型 M406 G77S/I157L/V439P 変異型 M407 G77S/G161A/Y328F 変異型 M408 E80D/Y81A/Y328F 変異型 M409 Y81A/S84D/Y328F 変異型 M410 Y81A/F113W/Y328F 変異型 M411 Y81A/1157L/T21 OL 変異型 M412 Y81A/1157L/Y328F 変異型 M413 Y81A/G 161A/Y328F 変異型 M414 Y81A/F 162L/Y328F 変異型 M415 Y81A/A184G/Y328F 変異型 M416 Y81A/W187F/Y328F 変異型 M417 Y81A/A204S/Y328F 変異型 M418 Y81A/T210L/Y328F 変異型 M419 Y81A/I228K/Y328F 変異型 M420 Y81A/A233D/Y328F 変異型 M421 Y81A/Y328F/Y159N 変異型 M422 Y81A/Y328F/Y159S 変異型 M423 Y81A/Y328F/F211W 変異型 M424 Y81A/Y328F/F211Y 変異型 M425 Y81A/Y328F/G226A 変異型 M426 Y81A/Y328F/R276A 変異型 M427 K83P/I157L/A184G 変異型 M428 K83P/1157L/T21 OL 変異型 M429 K83P/F211W/Y328F 変異型 M430 S84D/F113W/1157L 変異型 M431 S84D/I157L/T210L 変異型 M432 F88E/1157L/F 162L 変異型 M433 F88E/I157L/A184G 変異型 M434 F88E/I157L/F200A 変異型 M435 F88E/I157L/T210L 変異型 M436 F88E/I157L/Y328F 変異型 M437 F88E/I157L/Y328Q 変異型 M438 F88E/I157L/L340V 変異型 M439 F88E/T210L/Y328F 変異型 M440 F88E/F211W/Y328F 変異型 M441 F113W/I157L/G161A 変異型 M442 F 113W/1157L/A 184G 変異型 M443 F 113W/1157L/W 187F 変異型 M444 F 113W/1157L/F200A 変異型 M445 F 113W/1157L/A204S 変異型 M446 F 113W/1157L/A204T 変異型 M447 F 113W/1157L/T210L 変異型 M448 F 113W/1157L/F211W 変異型 M449 F113W/I157L/G226A 変異型 M450 F 113W/1157L/A233D 変異型 M451 F 113W/1157L/Y328F 変異型 M452 F 113W/1157L/L340V 変異型 M453 F 113W/1157L/V439P 変異型 M454 F 113W/G 161A/T21 OL 変異型 M455 F 113W/G 161A/Y328F 変異型 M456 F 113W/A184G/W187F 変異型 M457 F 113Y/1157L/T210L 変異型 M458 F 113Y/1157L/Y328F 変異型 M459 F 113Y/G 161A/T21 OL 変異型 M460 D 115Q/1157L/T21 OL 変異型 M461 D115Q/I157L/Y328F 変異型 M462 I157L/Y159N/T21 OL 変異型 M463 I157L/Y159N/Y328F 変異型 M464 I157L/G161A/W187F 変異型 M465 1157L/G 161A/F200A 変異型 M466 1157L/G 161A/A204S 変異型 M467 1157L/G 161A/T21 OL 変異型 M468 1157L/G 161A/A233D 変異型 M469 I157L/G161A/Y328F 変異型 M470 I157L/F162L/A184G 変異型 M471 1157L/F 162L/T21 OL 変異型 M472 1157L/F 162L/L 340 V 変異型 M473 I157L/A184G/W187F 変異型 M474 I157L/A184G/F200A 変異型 M475 1157L/A184G/A204T 変異型 M476 1157L/A 184G/T210L 変異型 M477 I157L/A184G/F211W 変異型 M478 I157L/A184G/L340V 変異型 M479 1157L/W 187F/T21 OL 変異型 M480 1157L/W 187F/Y328F 変異型 M481 1157L/F200A/T21 OL 変異型 M482 I157L/F200A/Y328F 変異型 M483 1157L/A204S/T21 OL 変異型 M484 I157L/A204S/Y328F 変異型 M485 1157L/A204T/T21 OL 変異型 M486 1157L/A204T/Y328F 変異型 M487 I157L/T210L/F211W 変異型 M488 1157L/T21 OL/G 212 A 変異型 M489 I157L/T210L/G226A 変異型 M490 I157L/T21 OL/A233D 変異型 M491 1157L/T21 OL/Y328F 変異型 M492 I157L/T210L/L340V 変異型 M493 I157L/T210L/V439P 変異型 M494 I157L/F211W/Y328F 変異型 M495 I157L/G226A/Y328F 変異型 M496 I157L/A233D/Y328F 変異型 M497 1157L/Y328F/L340V 変異型 M498 I157L/Y328F/V439P 変異型 M499 Y159N/F211W/Y328F 変異型 M500 G161A/A184G/W187F 変異型 M501 G161A/T210L/Y328F 変異型 M502 G161A/F211W/Y328F 変異型 M503 A182G/P183A/Y328F 変異型 M504 A182S/P183A/Y328F 変異型 M505 A184G/W187F/F200A 変異型 M506 A184G/W187F/A204S 変異型 M507 A184G/W187F/F211W 変異型 M508 A184G/W187F/I228K 変異型 M509 A184G/W187F/A233D 変異型 M510 F200A/F211W/Y328F 変異型 M511 A204S/F211W/Y328F 変異型 M512 A204T/F211W/Y328F 変異型 M513 F211W/Y328F/L340V 変異型 M514 P70T/A72E/I157L/Y328F 変異型 M515 P70T/A72E/T210L/Y328F 変異型 M516 P70T/G77M/I157L/Y328F 変異型 M517 P70T/Y81A/1157L/T210L 変異型 M518 P70T/Y81A/I157L/Y328F 変異型 M519 P70T/S84D/I157L/Y328F 変異型 M520 P70T/F88E/I157L/Y328F 変異型 M521 P70T/F88E/T210L/Y328F 変異型 M522 P70T/F 113W/1157L/T210L 変異型 M523 P70T/F113W/G161A/Y328F 変異型 M524 P70T/F 113Y/1157L/Y328F 変異型 M525 P70T/D 115Q/I157L/T210L 変異型 M526 P70T/D115Q/I157L/Y328F 変異型 M527 P70T/1157L/G161A/T21 OL 変異型 M528 P70T/I157L/A184G/W187F 変異型 M529 P70T/I157L/A184G/T210L 変異型 M530 P70T/I157L/W187F/T210L 変異型 M531 P70T/I157L/W187F/Y328F 変異型 M532 P70T/1157L/A204T/T21 OL 変異型 M533 P70T/1157L/A204T/Y328F 変異型 M534 P70T/1157L/A204T/T21 OL 変異型 M535 P70T/1157L/T210L/F211W 変異型 M536 P70T/I157L/T210L/G226A 変異型 M537 P70T/I157L/T210L/A233D 変異型 M538 P70T/1157L/T210L/Y328F 変異型 M539 P70T/1157L/T210L/L340V 変異型 M540 P70T/I157L/T210L/V439P 変異型 M541 P70T/I157L/Y328F/V439P 変異型 M542 P70T/G161A/T210L/Y328F 変異型 M543 P70T/G161A/A233D/Y328F 変異型 M544 A72E/S74T/I157L/Y328F 変異型 M545 A72E/G77S/F113W/I157L 変異型 M546 A72E/Y81H/I157L/Y328F 変異型 M547 A72E/K83P/I157L/Y328F 変異型 M548 A72E/F88E/F113W/1157L 変異型 M549 A72E/F88E/I157L/Y328F 変異型 M550 A72E/F88E/G161A/Y328F 変異型 M551 A72E/F113W/1157L/Y328F 変異型 M552 A72E/F113W/G161A/Y328F 変異型 M553 A72E/F113Y/1157L/Y328F 変異型 M554 A72E/F113Y/G161A/Y328F 変異型 M555 A72E/F113Y/G226A/Y328F 変異型 M556 A72E/I157L/G161A/Y328F 変異型 M557 A72E/I157L/F162L/Y328F 変異型 M558 A72E/I157L/A184G/Y328F 変異型 M559 A72E/I157L/F200A/Y328F 変異型 M560 A72E/I157L/A204T/Y328F 変異型 M561 A72E/I157L/F211W/Y328F 変異型 M562 A72E/I157L/F211Y/Y328F 変異型 M563 A72E/I157L/A233D/Y328F 変異型 M564 A72E/I157L/Y328F/L340V 変異型 M565 A72E/G 161A/A204T/Y328F 変異型 M566 A72E/G 161A/T210L/Y328F 変異型 M567 A72E/G 161A/F211W/Y328F 変異型 M568 A72E/G 161A/F211Y/Y328F 変異型 M569 A72E/G161A/A233D/Y328F 変異型 M570 A72E/G161A/Y328F/L340V 変異型 M571 A72E/A184G/W187F/Y328F 変異型 M572 A72E/T210L/Y328F/L340V 変異型 M573 A72V/1157L/W187F/Y328F 変異型 M574 G77P/I157L/T210L/Y328F 変異型 M575 Y81A/S84D/I157L/Y328F 変異型 M576 Y81A/F88E/1157L/Y328F 変異型 M577 Y81A/F 113W/1157L/Y328F 変異型 M578 Y81A/I157L/G161A/Y328F 変異型 M579 Y81A/1157L/W187F/Y328F 変異型 M580 Y81A/I157L/A204S/Y328F 変異型 M581 Y81A/1157L/T210L/Y328F 変異型 M582 Y81A/I157L/A233D/Y328F 変異型 M583 Y81A/I157L/Y328F/V439P 変異型 M584 Y81A/A184G/W187F/Y328F 変異型 M585 F88E/I157L/T210L/Y328F 変異型 M586 F88E/I157L/A233D/Y328F 変異型 M587 F 113W/1157L/A204T/T210L 変異型 M588 F 113W/1157L/T210L/Y328F 変異型 M589 1157L/G 161A/A184G/W187F 変異型 M590 I157L/G161A/T210L/Y328F 変異型 M591 1157L/A 184G/W 187F/T21 OL 変異型 M592 1157L/A204S/T210L/Y328F 変異型 M593 1157L/A204T/T210L/Y328F 変異型 M594 I157L/T210L/A233D/Y328F 変異型 M595 G161A/A184G/W187F/Y328F 変異型 M596 P70T/A72E/S84D/I157L/Y328F 変異型 M597 P70T/A72E/A204S/I157L/Y328F 変異型 M598 P70T/A72E/T210L/I157L/Y328F 変異型 M599 P70T/A72E/G226A/I157L/Y328F 変異型 M600 P70T/A72E/A233D/I157L/Y328F 変異型 M601 P70T/Y81A/1157L/T210L/Y328F 変異型 M602 P70T/Y81A/I157L/A233D/Y328F 変異型 M603 P70T/Y81A/1157L/T210L/Y328F 変異型 M604 P70T/Y81A/A233D/I157L/Y328F 変異型 M605 P70T/S84D/1157L/T21 OL/Y328F 変異型 M606 P70T/F 113W/1157L/T210L/Y328F 変異型 M607 P70T/I157L/A184G/W187F/A233D 変異型 M608 P70T/1157L/W 187F/T210L/Y328F 変異型 M609 P70T/1157L/A204S/T210L/Y328F 変異型 M610 P70T/G 161A/A 184G/W 187F/Y328F 変異型 M611 P70V/A72E/F 113Y/1157L/Y328F 変異型 M612 P70V/A72E/I157L/F211W/Y328F 変異型 M613 A72E/S74T/F 113Y/1157L/Y328F 変異型 M614 A72E/S74T/1157L/F211W/Y328F 変異型 M615 A72E/Y81H/I157L/F211W/Y328F 変異型 M616 A72E/K83P/F 113Y/1157L/Y328F 変異型 M617 A72E/W17F/F 113Y/1157L/Y328F 変異型 M618 A72E/F113Y/D 115Q/1157L/Y328F
変異型 M619 A72E/F 113 Y/1157L/ Υ328F/L 340 V
変異型 Μ620 Α72E/F 113 Υ/1157L/ Υ328F/ V439Ρ
変異型 M621 A72E/F113Y/G161A/I157L/Y328F
変異型 Μ622 A72E/F113Y/A204S/I157L/Y328F
変異型 Μ623 A72E/F 113Υ/Α204Τ/1157L/Y328F
変異型 Μ624 A72E/F113Υ/Τ21 OL/1157L/Y328F
変異型 Μ625 A72E/F113Y/A233D/I157L/Y328F
変異型 Μ626 A72E/I157L/G161A/F162L/Y328F
変異型 Μ627 A72E/I157L/W187F/F211W/Y328F
変異型 Μ628 A72E/I157L/A204S/F211W/Y328F
変異型 Μ629 Α72Ε/1157L/A204T/F211W/Y328F
変異型 Μ630 A72E/I157L/F211W/Y328F/L340V
変異型 M631 A72E/I157L/F211W/Y328F/V439P
変異型 Μ632 A72E/I157L/G226A/F211W/Y328F
変異型 Μ633 A72E/I157L/A233D/F211W/Y328F
変異型 Μ634 Y81A/S84D/I157L/T210L/Y328F
変異型 Μ635 Υ81 A/I 157L/ A 184G/W 187F/ Y328F
変異型 M636 Y81A/1157L/A184G/W187F/T21 OL
変異型 M637 Y81A/1157L/A233D/T21 OL/Y328F
変異型 M638 F88E/1157L/A184G/W187F/T21 OL
変異型 M639 F 113 Y/1157L/Y159N/F211 W/Y328F
変異型 M640 1157L/A 184G/W 187F/T21 OL/ Y328F
変異型 M641 P70T/1157L/A 184G/W 187F/T210L/Y328F 変異型 M642 Y81A/1157L/A184G/W187F/T21 OL/Y328F
請求項 55に記載の変異型タンパク質において、前記変異型 Mlから M642のいず れカ 1種または 2種以上の変異を含むアミノ酸配列中、変異部位以外の部位に置換 、欠失、挿入、付加および逆位力もなる群より選ばれる 1または数個のアミノ酸の変異 を更に含むアミノ酸配列を有し、かつ、ペプチド生成活性を有する、変異型タンパク 質。
[57] 少なくとも変異型 M241を含むことを特徴とする、請求項 55から 56のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[58] 少なくとも変異型 M340を含むことを特徴とする、請求項 55から 57のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[59] 少なくとも変異型 M412を含むことを特徴とする、請求項 55から 58のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[60] 少なくとも変異型 M491を含むことを特徴とする、請求項 55から 59のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[61] 少なくとも変異型 M496を含むことを特徴とする、請求項 55から 60のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[62] 少なくとも変異型 M581を含むことを特徴とする、請求項 55から 61のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[63] 少なくとも変異型 M582を含むことを特徴とする、請求項 55から 62のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[64] 少なくとも変異型 M594を含むことを特徴とする、請求項 55から 63のいずれか一項 に記載の変異型タンパク質。
[65] 請求項 18から 64の 、ずれか一項に記載の変異型タンパク質が有するアミノ酸配列 をコードするポリヌクレオチド。
[66] 請求項 65に記載のポリヌクレオチドを含む組換えポリヌクレオチド。
[67] 請求項 66に記載の組換えポリヌクレオチドを含む形質転換微生物。
[68] 請求項 67に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および Zまたは微 生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させることを特徴とする、変異型タンパク質の 製造方法。
[69] 請求項 18力も 64のいずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、ぺプチ ド生成反応を行うことを特徴とする、ペプチドの製造方法。 [70] 請求項 67に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および Zまたは形 質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させてペプチド生成反応を行うこと を特徴とする、ペプチドの製造方法。
[71] 請求項 18力も 64のいずれか一項に記載の変異型タンパク質の存在下で、 L ァス パラギン酸 α , β―ジエステルと L フエ二ルァラニンとの反応を行うことを特徴と する、 α—L ァスバルチルー L—フエ-ルァラニン β エステルの製造方法。
[72] 請求項 67に記載の形質転換微生物を培地中で培養し、培地中および Ζまたは形 質転換微生物中に前記変異型タンパク質を蓄積させて、 L ァスパラギン酸— a , β—ジエステルと L フエ-ルァラニンとの反応を行うことを特徴とする、 α L ァス バルチルー L フエ-ルァラニン β エステルの製造方法。
PCT/JP2005/023400 2004-12-20 2005-12-20 ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質 WO2006075486A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BRPI0519172-6A BRPI0519172A2 (pt) 2004-12-20 2005-12-20 proteÍna mutante, polinucleotÍdeo, microorganismo transformado, e, mÉtodos de produzir uma proteÍna mutante, um peptÍdeo, e alfa-l-aspartil-l-fenilalanina-beta-Éster, e de projetar e produzir uma proteÍna mutante
JP2006552869A JPWO2006075486A1 (ja) 2004-12-20 2005-12-20 ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質
CA002592309A CA2592309A1 (en) 2004-12-20 2005-12-20 Mutant protein having peptide-synthesizing activity
EP05820283A EP1829968A4 (en) 2004-12-20 2005-12-20 PROTEIN MUTANT WITH PEPTIDE PRODUCTION ACTIVITY
US11/765,926 US20070292916A1 (en) 2004-12-20 2007-06-20 Mutant protein having the peptide-synthesizing activity

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004368503 2004-12-20
JP2004-368503 2004-12-20
US63837004P 2004-12-27 2004-12-27
US60/638,370 2004-12-27

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US11/765,926 Continuation US20070292916A1 (en) 2004-12-20 2007-06-20 Mutant protein having the peptide-synthesizing activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006075486A1 true WO2006075486A1 (ja) 2006-07-20

Family

ID=36677517

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/023400 WO2006075486A1 (ja) 2004-12-20 2005-12-20 ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質

Country Status (9)

Country Link
US (2) US20060188976A1 (ja)
EP (1) EP1829968A4 (ja)
JP (1) JPWO2006075486A1 (ja)
KR (1) KR20070087191A (ja)
CN (1) CN101087878A (ja)
BR (1) BRPI0519172A2 (ja)
CA (1) CA2592309A1 (ja)
RU (1) RU2007127719A (ja)
WO (1) WO2006075486A1 (ja)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009088049A1 (ja) 2008-01-10 2009-07-16 Ajinomoto Co., Inc. 発酵法による目的物質の製造法
WO2009091045A1 (ja) 2008-01-18 2009-07-23 Ajinomoto Co., Inc. セリン誘導体の製造方法及びこれに用いるタンパク質
DE112009001080T5 (de) 2008-05-12 2011-03-03 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zum Herstellen von β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon
WO2012017925A1 (ja) * 2010-08-02 2012-02-09 協和発酵キリン株式会社 物質の製造方法
WO2012050125A1 (ja) 2010-10-14 2012-04-19 味の素株式会社 モナティンの製造方法
WO2013051685A1 (ja) 2011-10-07 2013-04-11 味の素株式会社 変異型γ－グルタミルトランスフェラーゼ、及び、γ-グルタミルバリルグリシン又はその塩の製造法
WO2014025023A1 (ja) 2012-08-10 2014-02-13 味の素株式会社 γ－グルタミルバリルグリシン結晶の製造方法
JP2017060496A (ja) * 2010-04-23 2017-03-30 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 小ペプチドを含む細胞培養培地
WO2017122747A1 (en) 2016-01-12 2017-07-20 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing benzaldehyde

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2006261342B2 (en) 2005-06-15 2012-02-02 The Ohio State University Research Foundation Her-2 peptides
US20070190602A1 (en) * 2005-12-27 2007-08-16 Ajinomoto Co., Inc Mutant protein having the peptide-synthesizing activity
US20100234283A1 (en) 2009-02-04 2010-09-16 The Ohio State University Research Foundation Immunogenic epitopes, peptidomimetics, and anti-peptide antibodies, and methods of their use
RU2012129311A (ru) 2012-07-11 2014-01-20 Закрытое акционерное общество " Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Днк, кодирующая дипептид-синтезирующий фермер (варианты), бактерия рода escherichia и способ получения дипептидов с ее использованием
CA3049488C (en) * 2016-12-30 2020-07-28 Innobio Corporation Limited Gene encoding alanyl-glutamine dipeptide biosynthetic enzyme and application thereof
CN116334049B (zh) * 2019-11-20 2023-11-17 珠海联邦制药股份有限公司 人工设计的赖氨酰内切酶及编码序列和发酵方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002090300A2 (en) * 2001-05-04 2002-11-14 Xencor Nucleic acids and proteins with thioredoxin reductase activity
WO2004011653A1 (ja) * 2002-07-26 2004-02-05 Ajinomoto Co., Inc. 新規ペプチド生成酵素遺伝子
WO2004022733A1 (ja) * 2002-07-26 2004-03-18 Ajinomoto Co., Inc. ペプチドを生成する新規酵素およびこれを生産する微生物およびこれらを用いるジペプチドの製造方法
WO2004065610A1 (en) * 2003-01-24 2004-08-05 Ajinomoto Co., Inc. METHOD FOR PRODUCING α- L-ASPARTYL-L-PHENYLALANINE-β-ESTER AND METHOD FOR PRODUCING α-L-ASPARTYL-L-PHENYLALANINE-α-METHYL ESTER
JP2004254621A (ja) * 2003-02-26 2004-09-16 Institute Of Physical & Chemical Research 高度好熱菌由来タンパク質およびその結晶
WO2005028660A1 (ja) * 2003-09-18 2005-03-31 Kikkoman Corporation α−糖化ジペプチドの製造法及びα−糖化ジペプチドの測定法
EP1561810A2 (en) * 2004-02-05 2005-08-10 Ajinomoto Co., Inc. Mutant microorganism and method for producing peptide using the same

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040204577A1 (en) * 2003-01-24 2004-10-14 Ajinomoto Co., Inc. Novel peptide-forming enzyme gene

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002090300A2 (en) * 2001-05-04 2002-11-14 Xencor Nucleic acids and proteins with thioredoxin reductase activity
WO2004011653A1 (ja) * 2002-07-26 2004-02-05 Ajinomoto Co., Inc. 新規ペプチド生成酵素遺伝子
WO2004022733A1 (ja) * 2002-07-26 2004-03-18 Ajinomoto Co., Inc. ペプチドを生成する新規酵素およびこれを生産する微生物およびこれらを用いるジペプチドの製造方法
WO2004065610A1 (en) * 2003-01-24 2004-08-05 Ajinomoto Co., Inc. METHOD FOR PRODUCING α- L-ASPARTYL-L-PHENYLALANINE-β-ESTER AND METHOD FOR PRODUCING α-L-ASPARTYL-L-PHENYLALANINE-α-METHYL ESTER
JP2004254621A (ja) * 2003-02-26 2004-09-16 Institute Of Physical & Chemical Research 高度好熱菌由来タンパク質およびその結晶
WO2005028660A1 (ja) * 2003-09-18 2005-03-31 Kikkoman Corporation α−糖化ジペプチドの製造法及びα−糖化ジペプチドの測定法
EP1561810A2 (en) * 2004-02-05 2005-08-10 Ajinomoto Co., Inc. Mutant microorganism and method for producing peptide using the same

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1829968A4 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2749652A2 (en) 2008-01-10 2014-07-02 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing a target substance by fermentation
WO2009088049A1 (ja) 2008-01-10 2009-07-16 Ajinomoto Co., Inc. 発酵法による目的物質の製造法
WO2009091045A1 (ja) 2008-01-18 2009-07-23 Ajinomoto Co., Inc. セリン誘導体の製造方法及びこれに用いるタンパク質
DE112009001080T5 (de) 2008-05-12 2011-03-03 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zum Herstellen von β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon
US11365389B2 (en) 2010-04-23 2022-06-21 Life Technologies Corporation Cell culture medium comprising small peptides
US10793827B2 (en) 2010-04-23 2020-10-06 Life Technologies Corporation Cell culture medium comprising small peptides
JP2017060496A (ja) * 2010-04-23 2017-03-30 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 小ペプチドを含む細胞培養培地
WO2012017925A1 (ja) * 2010-08-02 2012-02-09 協和発酵キリン株式会社 物質の製造方法
JPWO2012017925A1 (ja) * 2010-08-02 2013-10-03 協和発酵キリン株式会社 物質の製造方法
WO2012050125A1 (ja) 2010-10-14 2012-04-19 味の素株式会社 モナティンの製造方法
WO2013051685A1 (ja) 2011-10-07 2013-04-11 味の素株式会社 変異型γ－グルタミルトランスフェラーゼ、及び、γ-グルタミルバリルグリシン又はその塩の製造法
WO2014025023A1 (ja) 2012-08-10 2014-02-13 味の素株式会社 γ－グルタミルバリルグリシン結晶の製造方法
WO2017122747A1 (en) 2016-01-12 2017-07-20 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing benzaldehyde

Also Published As

Publication number Publication date
US20060188976A1 (en) 2006-08-24
CA2592309A1 (en) 2006-07-20
EP1829968A1 (en) 2007-09-05
EP1829968A4 (en) 2008-09-10
CN101087878A (zh) 2007-12-12
RU2007127719A (ru) 2009-01-27
JPWO2006075486A1 (ja) 2008-06-12
BRPI0519172A2 (pt) 2008-12-30
US20070292916A1 (en) 2007-12-20
KR20070087191A (ko) 2007-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2006075486A1 (ja) ペプチド生成活性を有する変異型タンパク質
US10544409B2 (en) Hexuronate C4-epimerase mutant with improved conversion activity, and method for producing D-tagatose by using same
JP4682454B2 (ja) 新規変異型ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素及びｌ−アルギニンの製造法
ES2340405T3 (es) Metodo para producir l-arginina, l-ornitina o l-citrulina.
CA2495482A1 (en) Novel peptide-forming enzyme gene
RU2264459C2 (ru) Новая мутантная карбамоилфосфатсинтетаза и способ продукции соединений - производных карбамоилфосфата
US10941420B2 (en) Linalool composition and method of producing therefor
RU2006145713A (ru) Способ продукции пуриновых нуклиозидов и нуклиотидов методом ферментации с использованием бактерий, принадлежащих к роду escherichia или bacillus
US20070190602A1 (en) Mutant protein having the peptide-synthesizing activity
KR100951069B1 (ko) γ-글루타밀시스테인 생산 효모
ES2761590T3 (es) Microorganismo de Corynebacterium sp. que tiene una productividad mejorada de L-arginina y procedimiento de producción de L-arginina mediante el uso del mismo
CN112126666A (zh) 核苷高产菌及其构建方法与应用
JP4352877B2 (ja) γ−グルタミルシステインの製造法
CN114574459A (zh) 一种催化活性提高的糖原分支酶突变体及其应用
ES2476425T3 (es) Mutante de aminasa 5&#39;-xmp específico de amoníaco
WO2017186327A1 (en) Bacterial strain and method for high throughput of sugar in the microbial conversion into biosynthetic products
CN1316015C (zh) 新突变型氨甲酰磷酸合成酶以及生产由氨甲酰磷酸衍生的化合物的方法
JP2005168405A (ja) ジペプチドの製造方法
JP4228644B2 (ja) γ−グルタミルシステインの製造法
JP7101362B2 (ja) １，２－ジヒドロキシ－５－（メチルスルフィニル）ペンタン－３－オンの生成能が低い酵母の作出方法
CN106544356A (zh) 一种利用npu基因突变创制光温敏不育系的方法及其应用
JP4935969B2 (ja) 酵母カプロン酸高生産株
Xia et al. The road to the crystal structure of the cytochrome bc 1 complex from the anoxigenic, photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides
JP7475409B2 (ja) Ｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物およびこれを用いたｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリンの生産方法
Lin et al. Isolation, characterization and expression analysis of a leaf-specific phosphoenolpyruvate carboxylase gene in Oryza sativa

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006552869

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005820283

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11765926

Country of ref document: US

Ref document number: 2592309

Country of ref document: CA

Ref document number: 200580043886.7

Country of ref document: CN

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007127719

Country of ref document: RU

Ref document number: 1020077016801

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005820283

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 11765926

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI0519172

Country of ref document: BR