ES2476425T3 - Mutante de aminasa 5'-xmp específico de amoníaco - Google Patents

Abstract

Un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco, preparado sustituyendo cisteína en la posición 86 de aminasa 5'-XMP con alanina, serina o glicina, en el que la aminasa 5'-XMP tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO.: 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14.

Description

Mutante de aminasa 5'-xmp específico de amoníaco

Campo técnico

La presente invención se refiere, en general, a un procedimiento de preparación de un mutante de aminasa de ácido 5'-xant�lico (XMP) que tiene una actividad potenciada, un mutante de aminasa 5'-XMP preparado de acuerdo con el procedimiento, y un procedimiento para producir ácido 5'-guan�lico (GMP) con eficacia potenciada y, más en particular, a un procedimiento de preparación de un mutante de aminasa 5'-XMP específicamente reactivo para amoníaco, un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco preparado de acuerdo con el procedimiento, y un procedimiento de producción de 5'-GMP con alto rendimiento usando el mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco.

T�cnica anterior

El ácido 5'-guan�lico (GMP) compite con al ácido 5'-inos�nico (IMP) como el potenciador del sabor más ampliamente usado. El 5'-GMP es una de las sustancias responsables del gusto de las setas. Por s� solo, el 5'-GMP no tiene mucho gusto, pero su efecto es notable cuando se usa en combinación con 1-glutamato de monosodio (MSG). El 5'-GMP crea un efecto potenciador del sabor sin�rgico en combinación con el 5'-IMP.

Son conocidos varios procedimientos para producir 5'-GMP, incluyendo: (1) la extracción de ARN de levadura y la digestión enzim�tica del mismo, (2) fermentación microbiana para la producción directa del mismo, (3) fermentación microbiana para formar guanosina, seguido de fosforilaci�n química de guanosina, (4) fermentación microbiana para formar guanosina, seguido de fosforilaci�n microbiana de guanosina, (5) fermentación microbiana para la producción de 5'-XMP, seguido de la conversión de 5'-XMP a 5'-GMP usando Corynebacterium spp, o (6) fermentación microbiana para la producción de 5'-XMP, seguido de la conversión de 5'-XMP a 5'-GMP por E. coli. De estos procedimientos, el procedimiento (1) tiene problemas relacionados con el suministro de material y la economía, y el procedimiento (2) sufre la desventaja de tener un bajo rendimiento de producción debido a que las membranas celulares son impermeables a 5'-GMP. Por estos motivos, en la industria se aplican típicamente los otros procedimientos.

In vivo, para la conversión de 5'-XMP a 5'-GMP, como en el caso de los procedimientos (5) y (6), la aminasa 5'-XMP es la responsable, que cataliza las siguientes reacciones (Pantel et al. (1975), J. Biol. Sei., 250(7), 2609-2613).

1) 5'-XMP + ATP + NH3 → 5'-GMP + AMP + PPi ↑ Aminasa 5'-XMP

2) 5'-XMP + ATP + L-Glutamina → 5'-GMP + AMP + PPi + ácido L-glut�mico ↑ Aminasa 5'-XMP

La aminasa 5'-XMP es un miembro de la superfamilia de glutamina amidotransferasas. Las glutamina amidotransferasas hidrolizan la glutamina en el grupo gamma-amida grupo para generar amoníaco. El amoníaco libre resultante se asimila en amino�cidos, nucleótidos, azúcares, coenzimas, y similares por medio de reacciones de polimerizaci�n. Las glutamina amidotransferasas tienen muchas sustancias objetivo diversas, pero el procedimiento por el que se hidroliza la glutamina para formar amoníaco se ha conservado bien durante la evolución. Las glutamina amidotransferasas se han dividido en dos subfamilias: clase I y clase II. Las enzimas de clase I incluyen antranilato sintasa, carbamoil fosfato sintetasa, CTP sintetasa, formilglicinamidina sintetasa, ácido 5'-xant�lico aminasa, imidazol glicerol fosfato sintasa, aminodesoxicorismato sintasa, y p-aminobenzoato sintasa. Todas estas enzimas usan, además de glutamina, amoníaco externo como dador de amina (Cell Mol. Life Sei. 54, 205-222, 1998). A diferencia de cómo se transfiere el amoníaco, libre de glutamina, a un sustrato, se considera que el amoníaco externo se transfiere directamente a la transferasa.

En el contexto de la estructura de la proteína, la aminasa 5'-XMP se puede separar en dos dominios bien definidos: uno que tiene actividad glutaminasa responsable de la hidrólisis catalítica de la glutamina y el otro dominio que tiene actividad transferasa (Nat. Str. Biol. 3(1), 74-86, 1996). El dominio N-terminal con actividad glutaminasa es estructuralmente similar a la carbamoil fosfato sintetasa, que ha sido bien estudiada. La actividad glutaminasa se logra principalmente por una tr�ada catalítica de residuos ciste�na, histidina y glutamato, lo que es similar al mecanismo catalítico de la ciste�na proteasa (Cell Mol. Life Sei. 54, 205-222, 1998). En particular, en E. coli, la ciste�na 86, la histidina 181 y el ácido glut�mico 183 forman una tr�ada catalítica. En el mecanismo enzim�tico de la glutaminasa, el residuo de ciste�na catalítico forma un enlace tio�ster gamma-glutamilo con glutamina, sirviendo la histidina como base para la hidrólisis de glutamina en ácido glut�mico y amoníaco (Fukuyama et al. Biochemistry 3, 1448-1492, 1964; von der Saal et al. Biochemistry 24, 5343-5350, 1985). Por medio de un canal formado en la enzima, este amoníaco participa en la conversión del ácido 5'-xant�lico en ácido 5r-guan�lico (Raushel et al. Biochemistry, 38(25), 7891-7899, 1999).

La conversión catalizada por aminasa XMP de 5'-XMP en 5'-GMP usando amoníaco muestra el mismo mecanismo que el de la reacción usando L-glutamina, pero es ligeramente diferente en sus propiedades. La aminasa 5'-XMP, aunque es óptima a pH 8,3 para ambos sustratos, presenta dos o más veces como mucho actividad catalítica para la L-glutamina que para el amoníaco (Pantel et al. (1975), J. Biol. Sei., 250(7), 2609-2613). La diferencia se incrementa a medida que el pH de la reacción se aproxima al neutro, lo que implica que la aminasa 5'-XMP no emplea una fase de solución de amoníaco (NH3), pero se aprovecha de la L-glutamina en la conversión de 5'-XMP en 5'-GMP in vivo.

Cuando se trata con el reactivo sulfhidrilo reactivo con ciste�na yodoacetamida o con el derivado de glutamina clorocetona o acivicina, la actividad de aminasa 5'-XMP disminuye con L-glutamina, pero permanece sin cambios con amoníaco, lo que indica que el residuo ciste�na en el sitio activo de la glutaminasa es esencial para la actividad dependiente de glutamina de la aminasa 5'-XMP, pero no para la actividad dependiente de amoníaco de la aminasa 5'-XMP (Zalkin y Truitt, J. Biol. Sei. 252(15), 5431-5436, 1977; Massiere y Badet-Denisot, Cell Mol. Life Sei. 54, 205-222, 1998).

En el caso de la antranilato sintasa, que pertenece a la misma clase que la aminasa 5'-XMP, se informa de que la sustitución del residuo de ciste�na conservado con glicina suprime la actividad de antranilato sintasa dependiente de glutamina pero no la actividad dependiente de NH3 de la enzima (Paluh et al., J. Biol. Chem. 260, 1889-8601, 1985). Además, cuando el residuo de ciste�na conservado de la para-aminobenzoato sintasa se reemplaza por serina, la producción del aducto de tio�ster de γ-glutamilo se aten�a, lo que da lugar a una disminución en la producción de aminodesoxicorismato (Roux et al., Biochemistry, 32, 3763-3768, 1993). Al igual que para la carbamoil fosfato sintetasa, su actividad dependiente de glutamina también desaparece cuando el residuo de ciste�na conservado se reemplaza con serina o glicina (Rubino et al., J. Biol. Chem., 261, 11320-11327, 1986).

T�picamente, puesto que las enzimas nativas han evolucionado hasta tener una actividad adecuada para las células, a menudo presentan propiedades inadecuadas para aplicaciones industriales debido a su baja actividad. Para superar este problema, se han estudiado típicamente en la técnica la clonaci�n g�nica de una enzima de interés y la sobreexpresi�n de la misma. En la práctica, se aisl� exitosamente un gen de aminasa 5'-XMP (guaA) a partir de Escherichia coli natural y se clon� en un pl�smido de expresión inducible que se puede aplicar para la producción de 5'-GMP de 5'-XMP (Biosci. Biotech. Biochem. 61(5), 840-845, 1997).

Otro procedimiento de incremento de la expresión de proteínas de bacterias naturales usando resistencia a fármacos se describe en la publicación de patente coreana abierta a inspección pública n.� 2000-004 0840. En esta publicación, se proporciona una cepa mutante que tiene una actividad potenciada de aminasa 5'-XMP, que se prepara impartiendo resistencia a decoyinina a una cepa de Escherichia coli natural, para incrementar la expresión de un gen de interés.

Los vectores de expresión inducible para uso general requieren inductores de expresión caros tales como IPTG, y por tanto no son adecuados para aplicaciones industriales que impliquen la producción de proteínas en una gran escala. Un sistema de expresión constitutiva surge como solución a este problema. Se ha informado de un gran número de sistemas de expresión constitutiva. En particular, se desarroll� un promotor de expresión constitutiva novedoso para Corynebacterium ammoniagenes conocida porque es adecuada para la producción fermentativa de ácidos nucleicos (solicitud de patente coreana n.� 2004-107215). Los sistemas de expresión constitutiva son útiles porque mantienen la expresión de una proteína introducida durante un periodo de cultivo de células huésped sin el uso de un inductor de expresión. Sin embargo, cuando la sobreexpresi�n de una proteína introducida afecta al crecimiento de células huésped, las células dejan de crecer, o se retira un vector introducido en las células, dando como resultado una baja eficacia de expresión. Se ha informado de los mismos resultados para la aminasa 5'-XMP (Biosci. Biotech. Biochem. 61(5), 840-845, 1997).

La detención del crecimiento o la retirada del vector en el sistema de expresión constitutiva de la aminasa 5'-XMP es atribuible, en la opinión de los presentes inventores, a la citotoxicidad del producto sobreexpresado constitutivamente. Como solución para eludir este problema, los presentes inventores suprimieron la actividad glutaminasa de 5'-XMP. Como se menciona anteriormente, puesto que la aminasa 5'-XMP utiliza la L-glutamina para convertir 5'-XMP en 5'-GMP dentro de las células, un mutante de aminasa 5'-XMP con actividad L-glutaminasa suprimida tiene una actividad disminuida en, y por tanto baja toxicidad para, las células. Además, el mutante de aminasa 5'-XMP retiene la actividad dependiente de amoníaco aunque pierde su actividad dependiente de glutamina, de modo que es aplicable para la conversión industrial de 5'-XMP en 5'-GMP. Por medio de un examen riguroso del mecanismo bioquímico de la aminasa 5'-XMP, los presentes inventores han desarrollado una aminasa 5'-XMP específica de amoníaco con glutaminasa suprimida y se han dado cuenta exitosamente de su actividad potenciada en el fluido de cultivo, dando lugar a la presente invención.

Divulgaci�n de la invención

Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar un mutante de la aminasa ácido 5'-xant�lico (XMP) específico de amoníaco que tenga una actividad potenciada, que se prepara impartiendo especificidad por amoníaco a una aminasa 5'-XMP natural o a un mutante de aminasa 5'-XMP que tenga una actividad potenciada.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento de preparación de un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco que tenga una actividad potenciada.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar una molécula de ácido nucleico que codifique un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco.

Es otro objetivo más de la presente invención proporcionar un vector de expresión que lleve una molécula de ácido nucleico que codifique un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco.

Es otro objetivo más de la presente invención proporcionar un transformante transformado con el vector de expresión anterior.

Es otro objetivo más de la presente invención proporcionar un procedimiento de conversión de 5'-XMP a 5'-GMP usando un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco.

Breve descripción de los dibujos

El anterior y otros objetivos, características y otras ventajas de la presente invención se comprenderán más claramente a partir de la siguiente descripción detallada tomada conjuntamente con los dibujos adjuntos, en los que:

La FIG. 1 muestra esquemáticamente un procedimiento para producir un mutante de aminasa 5'-XMP, que comprende la construcción de una colección de mutantes de aminasa 5'-XMP por mutag�nesis aleatoria y el cribado de la colección de mutantes para seleccionar mutantes de aminasa 5'-XMP altamente activos;

La FIG. 2 muestra esquemáticamente un procedimiento para introducir un gen mutado aleatoriamente que codifica el mutante de aminasa 5'-XMP altamente activo en un vector de expresión constitutivo;

La FIG. 3 es una vista esquemática que muestra un vector de expresión que lleva un gen que codifica un mutante de aminasa 5'-XMP altamente activo, G3;

La FIG. 4 es una vista esquemática que muestra un vector de expresión pF12 que lleva un gen que codifica un mutante de aminasa 5'-XMP altamente activo, F12;

La FIG. 5 es una vista esquemática que muestra un vector de expresión pF63 que lleva un gen que codifica un mutante de aminasa 5'-XMP altamente activo, F63;

La FIG. 6 es una vista esquemática que muestra un vector de expresión pCJ-G3-1 que lleva un gen que codifica un mutante de aminasa 5'-XMP altamente activo, G3-1;

La FIG. 7 es una vista esquemática que muestra un vector de expresión pCJ-F12-1 que lleva un gen que codifica un mutante de aminasa 5'-XMP altamente activo, F12-1;

La FIG. 8 es una vista esquemática que muestra un vector de expresión pCJ-F63-1 que lleva un gen que codifica un mutante de aminasa 5'-XMP altamente activo, F63-1;

La FIG. 9 es una vista esquemática que muestra un vector de expresión pCJ1-G1 que lleva un gen que codifica una aminasa 5'-XMP natural, G1;

La FIG. 10 es una vista esquemática que muestra un vector de expresión pCJ1-G3-1 que lleva un gen que codifica un mutante de aminasa 5'-XMP altamente activo, G3-1;

La FIG. 11 es una vista esquemática que muestra un vector de expresión pCJ1-F12-1 que lleva un gen que codifica un mutante de aminasa 5'-XMP altamente activo, F12-1;

La FIG. 12 es una vista esquemática que muestra un vector de expresión pCJ1-F63-1 que lleva un gen que codifica un mutante de aminasa 5'-XMP altamente activo, F63-1;

La FIG. 13 es una vista esquemática que muestra un vector de expresión pCJ1-G1C que lleva un gen que codifica un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco, G1C;

La FIG. 14 es una vista esquemática que muestra un vector de expresión pCJ1-G3C que lleva un gen que codifica un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco, G3C;

La FIG. 15 es una vista esquemática que muestra un vector de expresión pCJ1-F12C que lleva un gen que codifica un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco, F12C;

La FIG. 16 es una vista esquemática que muestra un vector de expresión pCJ1-F63C que lleva un gen que codifica un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco, F63C;

La FIG. 17 es un gráfico que muestra las actividades por unidad de una aminasa 5'-XMP natural (G1) derivada de E. coli, mutantes de 5'-XMP (G3-1, F12-1, F63-1) preparados por medio de mutag�nesis aleatoria , y mutantes específicos de amoníaco (G1C, G3C, F12C, F63C) en medio de cultivo que contiene amoníaco o L-glutamina como sustrato, en el que Ammo significa amoníaco y Gln significa glutamina; y

La FIG. 18 es un gráfico que compara la estabilidad intracelular entre un vector de expresión que lleva un gen (G1) que codifica la aminasa 5'-XMP natural y un vector de expresión que lleva un gen (G1C) que codifica una aminasa 5'-XMP específica de amoníaco, en el que el residuo de ciste�na en la posición 86 del gen G1 est� sustituido con alanina.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

De acuerdo con un aspecto, se proporciona un mutante de aminasa de ácido 5'-xant�lico (XMP) específico de amoníaco que tiene una actividad potenciada. Preferentemente, se puede preparar el mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco a partir de amilasa natural derivada de Escherichia coli o un mutante de la misma que tenga actividad potenciada.

Con mayor detalle, la mutag�nesis dirigida a sitio para impartir especificidad por amoníaco se lleva a cabo en una aminasa 5'-XMP que tenga una secuencia de amino�cidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO.: 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14 para preparar un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco, derivado de Escherichia coli, que, por tanto, tiene actividad potenciada adicional.

En un modo de realización, para obtener un vector que exprese la aminasa 5'-XMP, se prepar� un vector que lleva un de 1,578 pb de longitud (SEQ ID NO.: 1) que codifica la aminasa 5'-XMP derivada de Escherichia coli K12, seguido una reacción en cadena de polimerizaci�n que induce mutantes (PCR propensa a error) con el vector como molde. Como resultado, se obtuvieron moléculas de ADN de mutante de aminasa 5'-XMP, dentro de las que se introdujeron aleatoriamente mutaciones. Se insertaron las moléculas de ADN de mutante en un vector de expresión adecuado para expresar mutantes de aminasa 5'-XMP. Se transformaron los vectores resultantes en una cepa de E. coli deficiente en el gen de aminasa 5'-XMP para construir una colección de mutantes.

Puesto que la E. coli deficiente en el gen de aminasa 5'-XMP sólo puede crecer cuando se transforma con un vector que expresa un mutante que tiene actividad de aminasa 5'-XMP, sólo se obtuvieron mutantes activos de aminasa 5'-XMP a partir de la colección de mutantes.

Para seleccionar clones de E. coli clones transformados con un vector que expresa una forma mutante altamente activa de aminasa 5'-XMP a partir de colonias cultivadas de E. coli, se realizó la conversión de 5'-XMP en 5'-GMP en microplacas de 98 pocillos. Después de que se terminara la reacción, se seleccionaron los clones de E. coli que producen aminasa 5'-XMP con una actividad incrementada comparando los valores de absorbancia con un control.

Se determinaron las secuencias de nucleótidos de mutantes de aminasa 5' -XMP con una actividad potenciada usando un procedimiento conocido. La comparación de las secuencias de nucleótidos entre mutantes de aminasa 5'-XMP y aminasa 5'-XMP natural divulgó que seis mutantes seleccionados de aminasa 5'-XMP tuvieron nuevas secuencias de amino�cidos cada una alterada en dos, dos, cuatro, cuatro, tres y seis residuos aminoac�dicos, y se designaron como "aminasa 5'-XMP G3", "aminasa 5'-XMP F12", "aminasa 5'-XMP F63", "aminasa 5'-XMP G3-1", "aminasa 5'-XMP F12-1" y "aminasa 5'-XMP F63-1", respectivamente.

Cada mutante tiene una alteración en su secuencia de amino�cidos en comparación con la de una aminasa 5'-XMP natural, como se describe en detalle a continuación. El mutante G3 tiene una secuencia de amino�cidos (SEQ ID NO.: 4) en la que los residuos aminoac�dicos en las posiciones 52 y 191 est�n reemplazados por ciste�na y treonina, respectivamente. El mutante F12 tiene una secuencia de amino�cidos (SEQ ID NO.: 6) en la que los residuos aminoac�dicos en las posiciones 93 y 152 est�n reemplazados por valina y prolina, respectivamente. El mutante F63 tiene un residuo valina en la posición 93, un residuo alanina en la posición 113, un residuo treonina en la posición 191, y un residuo glicina en la posición 467 en la secuencia de amino�cidos (SEQ ID NO.: 8). Al igual que para el mutante G3-1, su secuencia de amino�cidos (SEQ ID NO.: 10) caracteriza un residuo ciste�na en la posición 52, un residuo treonina en la posición 191, un residuo arginina en la posición 253, y un residuo isoleucina en la posición 454. El mutante F12-1 tiene una secuencia de amino�cidos (SEQ ID NO.: 12) en la que los residuos aminoac�dicos en las posiciones 93, 152 y 454 est�n reemplazados por valina, prolina y isoleucina, respectivamente. En el mutante F63-1 (SEQ ID NO.: 14), valina se encuentra en la posición 93, isoleucina en la posición 100, alanina en la posición 113, treonina en la posición 191, isoleucina en la posición 454, y glicina en la posición 467.

Posteriormente, para preparar aminasa 5'-XMP específica de amoníaco, la aminasa 5'-XMP natural derivada de Escherichia coli y los mutantes G3-1, F12-1 y F63-1 con actividad potenciada se sometieron a mutag�nesis dirigida a sitio preparar reemplazar el residuo ciste�na en la posición 86 dentro del sitio activo de glutaminasa con alanina. Después de la mutag�nesis dirigida a sitio, los mutantes resultantes se designaron como G1C (SEQ ID NO.: 16), G3C (SEQ ID NO.: 18), F12C (SEQ ID NO.: 20), y F63C (SEQ ID NO.: 22), respectivamente. Se determinaron las secuencias de nucleótidos de estos mutantes de aminasa 5'-XMP usando un procedimiento de secuenciaci�n de bases conocido. Se descubrió que los mutantes resultantes utilizaban, como dador de amina, glutamina con una eficacia muy baja, pero amoníaco externo con una gran eficacia.

De acuerdo con un modo de realización preferente de este aspecto de la presente invención, por tanto, se proporciona un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco que tiene la secuencia de amino�cidos de SEQ ID NO.: 16, 18, 20 o 22.

En la siguiente sección de ejemplos, sólo se describen los procedimientos de preparación de los mutantes de aminasa 5'-XMP específicos de amoníaco que tienen SEQ ID NO.: 16, 18, 20 y 22, junto con sus actividades, pero se entender� por completo por los expertos en la técnica que los mutantes de aminasa 5'-XMP específicos de amoníaco que tienen una actividad potenciada se pueden preparar fácilmente impartiendo especificidad por amoníaco a los mutantes de aminasa 5'-XMP de actividad potenciada de SEQ ID NO.: 4, 6 y 8.

Adem�s, sólo los mutantes de 5'-XMP que tienen secuencias de amino�cidos en las que el residuo ciste�na en la posición 86 est� reemplazado por alanina se describen en la siguiente sección de ejemplos, pero los expertos en la técnica entenderán por completo que los mutantes de aminasa 5'-XMP específicos de amoníaco se pueden obtener fácilmente cuando un residuo aminoac�dico, tal como serina o glicina, en lugar de alanina, se introduce usando una técnica de mutag�nesis dirigida a sitio.

Adem�s, el mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco de la presente invención no quiere decir sólo las proteínas que tienen cada una la secuencia de amino�cidos de SEQ ID NO. 16, 18, 20 o 22, sino que también incluye un equivalente funcional que ejerce la actividad idéntica a estas proteínas mutantes. El término "equivalente funcional", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína que tiene una secuencia diferente de una secuencia de amino�cidos del mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco de la presente invención, por una deleci�n, una inserción, una sustitución conservadora o no conservadora o combinaciones de las mismas en uno o más residuos aminoac�dicos, y que ejerce la actividad de aminasa 5'-XMP específica de amoníaco de forma casi exactamente tan alta como la de la aminasa 5' -XMP específica de amoníaco de la presente invención. Los intercambios de amino�cidos en proteínas y p�ptidos, que, en general, no alteran la actividad de las proteínas o p�ptidos, son conocidos en la técnica (H. Neurath, R. L. Hill, The proteins, Academic Press, Nueva York, 1979).

Se descubrió que, cuando los mutantes de aminasa 5'-XMP específicos de amoníaco de la presente invención se expresan usando un sistema de expresión constitutiva, como se describir� después, tienen mayor actividad por solución de reacción que la forma nativa. En detalle, se mide la actividad incrementada hasta una cantidad de 1,6 veces para el mutante de aminasa 5'-XMP G1C, 1,4 veces para el mutante de aminasa 5'-XMP G3C, 1,4 veces para el mutante de aminasa 5'-XMP F12C, y 1,45 veces para el mutante de aminasa 5'-XMP F63C, en comparación con la forma nativa. Por lo tanto, los mutantes de aminasa 5'-XMP específicos de amoníaco pueden ser altamente útiles en la producción de 5'-GMP.

Los mutantes de aminasa 5'-XMP específicos de amoníaco de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por un procedimiento de síntesis química (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156, 1963), o por un procedimiento recombinante de ADN (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2� ed., 1989). Cuando se usa una técnica de recombinación genética, se puede obtener un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco insertando una secuencia de ácido nucleico que codifica el mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco en un vector de expresión adecuado, transformando el vector de expresión recombinante en una célula huésped, cultivando la célula huésped para expresar el mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco, y recuperando el mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco de la célula huésped.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, por tanto, se proporciona un procedimiento para preparar un mutante de 5'-XMP específico de amoníaco que tiene actividad potenciada. Con mayor detalle, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco desprovisto de actividad glutaminasa, que presente una actividad in vivo mínima y por tanto, se reduce considerablemente en citotoxicidad, pero con una actividad dependiente de amoníaco que permanece sin cambios, pudiendo de este modo convertir eficazmente 5'-XMP a 5'-GMP.

En la presente invención, el residuo ciste�na en la posición 86 dentro del sitio activo de glutaminasa de aminasa 5'-XMP derivada de E. coli se reemplaza por alanina, serina o glicina por medio de mutag�nesis dirigida a sitio, de modo que el nuevo amino�cido en la posición 86 no puede formar un enlace tio�ster de γ-glutamilo con el ácido glut�mico en 183, suprimiendo de este modo la actividad dependiente de glutamina pero conservando la actividad dependiente de amoníaco. En un modo de realización preferente, el procedimiento para preparar un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco se efectúa reemplazando el residuo ciste�na en la posición 86 de aminasa 5'-XMP derivada de Escherichia coli con alanina.

En este aspecto de la presente invención, el mutante de 5'-XMP específico de amoníaco se prepara reemplazando el residuo ciste�na en la posición 86 de una secuencia de amino�cidos por el mutante de aminasa 5'-XMP que tiene una secuencia de amino�cidos representada por SEQ ID NO.: 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14 con alanina, glicina o serina, proporcionada de acuerdo con los modos de realización de la presente invención, que tiene una actividad potenciada.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifique un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco.

En un modo de realización preferente de este aspecto de la presente invención, el mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco G1C de SEQ ID NO.: 16 se codifica por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO.: 15, el mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco G3C de SEQ ID NO.: 18 por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO.: 17, el mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco F12C de SEQ ID NO.: 20 por la molécula de

�cido nucleico de SEQ ID NO.: 19, y el mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco F63C de SEQ ID NO.: 22 por la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO.: 21. Las secuencias de las moléculas de ácido nucleico pueden ser monocatenarias o bicatenarias, y se pueden formar por ARN (ARNm) por sustitución de uracilo (U) con timina (T) en una molécula o secuencia de ADN.

La secuencia de ácido nucleico que codifica el mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco de la presente invención se puede introducir en un vector para expresar el mutante para que se exprese como una proteína.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un vector de expresión que lleva una molécula de ácido nucleico que codifica el mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco.

Como se usa en el presente documento, el término "vector de expresión" que describe un vector que puede expresar una proteína en una célula huésped adecuada, se refiere a una construcción genética que comprende elementos reguladores esenciales a los que se une de forma funcional un inserto de gen de tal forma que se exprese en una célula huésped.

Por el término "unido de forma funcional", como se usa en el presente documento, se quiere decir que existe un enlace funcional entre una secuencia de control de expresión de ácidos nucleicos y una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína diana de tal forma que permita funciones generales. Por ejemplo, se puede enlazar de forma funcional un promotor a un ácido nucleico que codifica una proteína, y puede afectar a la expresión de la secuencia de ácido nucleico codificante. El enlace funcional a un vector recombinante se puede preparar usando una técnica de recombinación genética que es bien conocida en la técnica, y la escisión y ligación de ADN específica de sitio se puede lograr usando enzimas conocidas generalmente en la técnica. Los promotores útiles en un vector de expresión pueden ser los disponibles de las células huésped Escherichia spp. o Bacillus spp. Los ejemplos de promotores útiles en Escherichia spp. incluyen promotor trc, promotor trp, promotor lac, promotor recA, promotor λPL, promotor lpp y promotor T7. Al igual que para la especie Bacillus como células huésped, los promotores útiles obtenidos a partir de las mismas se pueden ejemplificar por promotor SP01, promotor SP02 y promotor penP. Los codones de iniciación y detención son necesarios para que sean funcionales en un individuo al que se le ha administrado una construcción genética, y deben estar en fase con la secuencia codificante. Un vector de expresión también puede incluir un marcador seleccionable que permite la selección de célula huésped que contienen el vector. Un vector de expresión replicable puede incluir un origen de replicaci�n.

En una práctica de la presente invención, se construyeron vectores de expresión, pCJ1-G1C, pCJ1-G3C, pCJ1-F12C y pCJ1-F63C, llevando cada uno un gen que codifica un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco, de los que las estructuras se muestran en diagramas esquemáticos de las FIG. 13, 14, 15 y 16, respectivamente. Estos vectores de expresión se introdujeron individualmente en Escherichia coli DH5α para obtener Escherichia coli transformada. Los transformantes as� producidos se designaron como “Escherichia coli DH5α/pCJ1-G1C", "Escherichia coli DH5α/pCJ1-G3C", "Escherichia coli DH5α/pCJ1-F12C" y "Escherichia coli DH5 a/pCJ1-F63C", respectivamente, y se depositaron en el Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) el 2 de diciembre de 2005, con los números de acceso KCCM-10715P, KCCM-10717P, KCCM-10721P y KCCM-10720, respectivamente.

Por lo tanto, aún en otro aspecto, la presente invención proporciona un transformante transformado con uno de los vectores de expresión.

La transformación incluye cualquier procedimiento por el que se pueden introducir ácidos nucleicos en microorganismos, células, tejidos u órganos, y, como es conocido en la técnica, se pueden realizar usando al menos una seleccionar de forma adecuada de las técnicas estándar que dependen de células huésped. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, electroporaci�n, fusión de protoplastos, precipitación con fosfato de calcio (CaPO4), precipitación con cloruro de calcio (CaCl2), y agitaci�n con fibra de carburo de silicio, transformación mediada por agrobacterias, y transformación mediada por PEG, sulfato de dextrano, y transformación mediada por lipofectamina.

Las células huésped más adecuadas para los objetivos se pueden seleccionar y usar porque los niveles de expresión, modificación, o similares de las proteínas varían dependiendo de las células huésped en las que se transforma un vector de expresión que expresa el mutante de aminasa 5'-XMP de la presente invención. Las células huésped incluyen, pero sin limitarse a, células procariotas tales como Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Paeudomonas, Proteus mirabilis o Staphylococcus.

Adem�s, como células huésped se pueden utilizar células eucariotas inferiores, tales como hongos (por ejemplo, especie Aspergillus) y levaduras (por ejemplo, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces, Neurospora crassa).

A�n en otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar un mutante de aminasa 5'-XMP, que comprende cultivar el transformante y aislar una proteína mutante de aminasa 5'-XMP del fluido del cultivo.

El cultivo de células huésped (transformantes) transformadas con un vector de expresión que expresa el mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco de la presente invención se puede llevar a cabo bajo condiciones de cultivo

adecuadas para expresar la proteína objetivo, el mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco, usando un procedimiento generalmente conocido por los expertos en la técnica.

Las proteínas de la presente invención, expresadas en células huésped, se pueden purificar por procedimientos convencionales. Por ejemplo, se pueden usar procedimientos de desalado (por ejemplo, precipitación de sulfato de amonio, precipitación de fosfato de sodio, etc.), precipitación de disolvente (por ejemplo, precipitación de fracción de proteína usando acetona, etanol, etc.), di�lisis, filtración de gel, procedimientos de cromatograf�a tales como cromatograf�a de intercambio iónico y cromatograf�a de fase inversa, y ultrafiltraci�n, por separado o en combinación, para purificar las proteína mutantes de aminasa 5'-XMP específicos de amoníaco de la presente invención.

Se puede obtener una mejor comprensión de la presente invención por medio de los siguientes ejemplos, que se exponen para ilustrar, pero no deben interpretarse como límite de la presente invención.

Ejemplo 1: Construcción de la colección de mutantes de aminasa 5'-XMP

Se introdujeron mutaciones aleatorias en un gen de aminasa 5'-XMP por una reacción en cadena de polimerizaci�n que induce mutantes (PCR propensa a error), para preparar varios mutantes de aminasa 5'-XMP como sigue.

En primer lugar, se unió de forma funcional un gen de aminasa 5'-XMP (SEQ ID NO.: 1) de 1,578 pb derivado de Escherichia coli a un vector de expresión, pTrc99a, que incluye un promotor trc y un origen de replicaci�n funcional en Escherichia coli, proporcionando as� un pl�smido recombinante, pGl, como molde para PCR propensa a error. Se realizó esta PCR con un par de un cebador N-terminal, representado por SEQ ID NO.: 23, y un cebador C-terminal, representado por SEQ ID NO.: 24. Se sintetizaron los cebadores en base a la secuencia de nucleótidos del gen de aminasa 5'-XMP derivado de E. coli.

SEQ ID NO: 23: 5' CGCGAATTCATGACGGAAAACATTCATAA 3'

SEQ ID NO: 24: 5' CTAGTCTAGATCATTCCCACTCAATGGT 3'

Se realizó una mezcla de PCR para que contuviera 0,4 mM de N-cebador y de C-cebador de cada uno, 5 ng del pl�smido recombinante pG1, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl2 7 mM, MnCl2 0,1 mM, dATP 0,2 mM, dGTP 0,2 mM, dCTP 1 mM, dTTP 1 mM y 5 unidades de Taq polimerasa, en un volumen final de 50 ml. Se llev� a cabo la PCR propensa a error con 25 ciclos de desnaturalización a 94 �C durante 1 min, alineación a 50 �C durante 1 min, y elongaci�n a 72 �C durante 1 min, seguido de elongaci�n final a 72 �C durante 7 min, para producir genes mutantes.

Se separaron los productos de PCR as� preparados por electroforesis en gel de agarosa. Se digirieron los fragmentos de ADN purificados en gel con EcoRI y HindiII y se insertaron en un vector de expresión, pTrc99a, útil para expresar aminasa 5'-XMP, construyendo as� los pl�smidos recombinantes. Se introdujeron los vectores recombinantes que llevaban los mutantes de genes de aminasa 5'-XMP en Escherichia coli BW (cepa con gen guaA inactivado) para construir una colección de mutantes de aminasa 5'-XMP. Se prepar� una cepa de Escherichia coli BW con gen guaA eliminado usando un procedimiento de biología molecular ordinario (Datsenko KA, 2000, Proc. Natl. Acad. Sei., 97(12), 6640-6645).

Ejemplo 2: Cribado para mutantes de aminasa 5'-XMP

Se unt� un caldo de la colección de mutante de aminasa 5'-XMP preparado en el ejemplo 1 sobre placas LB que contenían bactotriptona al 0,5 %, extracto de levadura al 1 %, NaCl al 1 %, agar al 1,5 % y IPTG 0,2 mM. Se cultivaron las colonias de Escherichia coli crecidas en medio LB en microplacas de pocillos hondos. A continuación, se diluyó el cultivo de acuerdo con el grado de crecimiento hasta dar un volumen final de 100 ml. Se añadieron 5 ml de xileno a cada pocillo de las placas, y se incubaron las placas a 37 �C durante 30 min. Se añadieron 100 ml de una solución de sustrato precalentada hasta 42 �C a cada pocillo antes de la incubaci�n de las placas a 42 �C durante 20 min. La solución de sustrato estaba compuesta de XMP 30 mM, ATP 13 mM, MgSO4�7H2O 16 mM y (NH4)2SO4 40 mM en tampón de HCl Trizma 16 mM (pH 8,6). Después de la adición de 800 ml de ácido percl�rico al 3,5 % a cada pocillo para terminar la reacción, se transfirieron 200 ml de la mezcla de reacción en una microplaca transparente UV de 96 pocillos para medir la absorbancia a 290 nm. Se midió el rendimiento de 5'-GMP y se compararon las actividades enzim�ticas para seleccionar un transformante de Escherichia coli JM105 que expresara un mutante de aminasa 5'-XMP con actividad potenciada.

Se digirieron el pl�smido pG3 as� obtenido, que lleva un gen mutante de aminasa 5'-XMP, y el pl�smido pGl que lleva un gen de aminasa 5'-XMP nativa con enzimas de restricción apropiadas, se ligaron y se sometieron a PCR propensa a error bajo las mismas condiciones que en el ejemplo 1. El cribado para determinar la actividad enzim�tica y la comparación de las actividades dio como resultado la obtención de los pl�smidos pF12, pF63, pCJ-G3-1, pCJ-F12-1 y pCJ-F63-1, que expresaron la aminasa 5'-XMP con actividad potenciada con relación a la enzima original.

La FIG. 1 ilustra esquemáticamente un procedimiento para producir un mutante de aminasa 5'-XMP con actividad potenciada, descrito en los ejemplos 1 y 2.

La escala de la colección de mutantes de aminasa 5'-XMP y

las descripciones de los mutantes preparados en el ejemplo 2 se resumen en la tabla 1, a continuación. Tabla 1 Evolución molecular de aminasa 5'-XMP y mutantes seleccionados

1R

2R

Gen original

Gen guaA nativo Gen nativo y gen mutante G3

Procedimiento de construcción de colección

PCR propensa a error Digestión de enzima de restricción y PCR propensa a error

Escala de colección

> ~10 5 > ~ 1,500

1� cribado

~2x10 3 ~1,500

2� cribado

73 colonias 66 colonias

Mutantes obtenidos

G3 F12, F63, G3-1, F12-1, F63-1

Ejemplo 3: Secuenciaci�n de bases de genes que codifican mutantes de aminasa 5'-XMP

Se analizaron secuencias de nucleótidos de mutantes de aminasa 5'-XMP, preparados en los ejemplos 1 y 2, usando un modelo de secuenciador automático ABI3730xl (Applied Biosystems). Se identificaron las secuencias de nucleótidos como SEQ ID NO.: 3 para el mutante G3, SEQ ID NO.: 5 para el mutante F12, SEQ ID NO.: 7 para el mutante F63, SEQ ID NO.: 9 para el mutante G3-1, SEQ ID NO.: 11 para el mutante F12-1, y SEQ ID NO.: 13 para el mutante F63-1. Además, las secuencias de amino�cidos deducidas de las secuencias de nucleótidos se representan, respectivamente, por SEQ ID NO.: 4 (G3) , SEQ ID NO.: 6 (F12), SEQ ID NO.: 8 (F63) , SEQ ID NO.: 10 (G3-1), SEQ ID NO.: 12 (F12-1), y SEQ ID NO.: 14 (F63-1). Los mapas esquemáticos de los pl�smidos que llevan genes que codifican los mutantes G3, F12, F63, G3-1, F12-1 y F63-1 se dan en las FIG. 3, 4, 5, 6, 7 y 8, respectivamente.

Con mayor detalle, se dedujo la secuencia de amino�cidos del mutante G3 a partir de la secuencia de nucleótidos del gen mutante de aminasa 5'-XMP G3 altamente activo en el pl�smido pG3, y se representa por SEQ ID NO.: 4. Se dedujo la secuencia de amino�cidos del mutante F12 a partir de la secuencia de nucleótidos del gen mutante de aminasa 5'-XMP F12 altamente activo en el pl�smido pF12, y se representa por SEQ ID NO.: 6. Asimismo, se dedujo la secuencia de amino�cidos del mutante F63 a partir de la secuencia de nucleótidos del gen mutante de aminasa 5'-XMP F63 altamente activo en el pl�smido pF63, y se representa por SEQ ID NO.: 8. Se dedujo la secuencia de amino�cidos del mutante G3-1 a partir de la secuencia de nucleótidos del gen mutante de aminasa 5'-XMP G3-1 altamente activo en el pl�smido Pg3-1, y se representa por SEQ ID NO.: 10. Se dedujo la secuencia de amino�cidos del mutante F12-1 a partir de la secuencia de nucleótidos del gen mutante de aminasa 5'-XMP F12-1 altamente activo en el pl�smido pCJ-F12-1, y se representa por SEQ ID NO.: 12. Se dedujo la secuencia de amino�cidos del mutante F63-1 a partir de la secuencia de nucleótidos del gen mutante de aminasa 5'-XMP F63-1 altamente activo en el pl�smido pCJ-F63-1, y se representa por SEQ ID NO.: 14.

Cuando se compararon las secuencias de amino�cidos de los mutantes de aminasa 5'-XMP altamente activos G3, F12, F63, G3-1, F12-1 y F63-1 con la secuencia de amino�cidos de la aminasa 5'-XMP nativa, representada por SEQ ID NO.: 2, se descubrió que tenían sustituciones de amino�cidos para dos, dos, cuatro, cuatro, tres y seis residuos aminoac�dicos, respectivamente.

En detalle, el mutante G3 tiene una secuencia de amino�cidos en la que los residuos aminoac�dicos en las posiciones 52 y 191 est�n reemplazados por ciste�na y treonina, respectivamente. El mutante F12 tiene una secuencia de amino�cidos en la que los residuos aminoac�dicos en las posiciones 93 y 152 est�n reemplazados por valina y prolina, respectivamente. El mutante F63 tiene una secuencia de amino�cidos que caracteriza un residuo valina en la posición 93, un residuo alanina en la posición 113, un residuo treonina en la posición 191 y un residuo glicina en la posición 467. El mutante G3-1 tiene una secuencia de amino�cidos en la que los residuos aminoac�dicos en las posiciones 52, 191, 253 y 454 est�n reemplazados por ciste�na, treonina, arginina e isoleucina, respectivamente. El mutante F12-1 tiene una secuencia de amino�cidos en la que los residuos aminoac�dicos en las posiciones 93, 152 y 454 est�n reemplazados por valina, prolina e isoleucina, respectivamente. El mutante F63-1 tiene una secuencia de amino�cidos en la que existen sustituciones de residuos aminoac�dicos en la posición 93 para valina, posición 100 para isoleucina, posición 113 para alanina, posición 191 para treonina, posición 454 para isoleucina y posición 4 67 para glicina. Los resultados del análisis de las secuencias de amino�cidos y el ensayo de actividad enzim�tica indican que los mutantes G3, F12, F63, G3-1, F12-1 y F63-1 son formas mutantes de aminasa 5'-XMP novedosas, de las que cada una tiene una secuencia de amino�cidos que difiere de la de aminasa 5'-XMP de E. coli nativa y es altamente activa.

Ejemplo 4: Construcción del vector de expresión constitutivo del mutante de 5'-XMP

Se expresaron los mutantes de aminasa 5'-XMP altamente activos preparados anteriormente usando un vector de expresión constitutivo como sigue.

Se unieron de forma funcional los genes mutantes y naturales de aminasa 5'-XMP el vector de expresión constitutivo pECG117-CJl, que incluye un promotor CJ1 y un origen de replicaci�n funcional en Escherichia coli y Corynebacterium ammoniagenes, para producir pl�smidos recombinantes. Se realizó una PCR propensa a error con un conjunto del cebador N-terminal (guaA-f) de SEQ ID NO.: 25 y el cebador C-terminal (guaA-r) de SEQ ID NO.: 26. Se sintetizaron estos cebadores en base a la secuencia de nucleótidos del gen de aminasa 5'-XMP derivado de Escherichia coli.

SEQ ID NO: 25: 5' ACGTGCCGGCATGACGGAAAACATTCATAAGC 3'

SEQ ID NO: 26: 5' ACGTGGATCCTCATTCCCACTCAATGGTAGC 3'

Una mezcla de PCR estaba compuesta de 0,4 mM de N-cebador y C-cebador de cada uno, 5 ng del pl�smido recombinante pG1, pCJ-G3-1, pCJ-F12-1 o pCJ-F63-1, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl2 7 mM, dATP 0,2 mM, dGTP 0,2 mM, dCTP 0,2 mM, dTTP 0,2 mM y 5 unidades de Pfu polimerasa, en un volumen final de 50 ml. Se llev� a cabo la PCR propensa a error con 25 ciclos de desnaturalización a 94 �C durante 1 min, alineación a 50 �C durante 1 min, y elongaci�n a 72 �C durante 1 min, seguido de elongaci�n final a 72 �C durante 5 min.

Se separaron los productos de PCR as� preparados por electroforesis en gel de agarosa. Se digirieron los fragmentos de ADN purificados en gel con Nael y BamHI y se insertaron en un vector de expresión, pECG117-CJl, útil para expresar aminasa 5'-XMP, para construir pl�smidos recombinantes (FIG. 2). Los vectores recombinantes que llevan los genes naturales y mutantes de aminasa 5'-XMP se designaron como pCJ1-G1 (natural), pCJ1-G3-1, pCJ1-F12-1 y pCJ1-F63-1, respectivamente, de los que las estructuras se muestran en los diagramas esquemáticos de las FIG. 9, 10, 11 y 12, respectivamente.

Ejemplo 5: Producción de aminasa 5'-XMP específica de amoníaco

Se produjo aminasa 5'-XMP específica de amoníaco aprovechando la aminasa 5'-XMP natural y los mutantes de la aminasa 5'-XMP altamente activa preparados en los ejemplos anteriores. A este respecto, se diseñaron un par de cebadores para introducir una mutación de un residuo ciste�na en la posición 86 a alanina, y se represent� por SEQ ID NO.: 27 y 28

SEQ ID NO: 27: 5 ' CCGGTATTCGGCGTTGCATATGGCATGCAGACCATG 3'

SEQ ID NO: 28: 5 ' CATGGTCTGCATGCCATATGCAACGCCGAATACCGG 3'

En presencia de estos cebadores, se realizó una mutag�nesis dirigida a sitio usando un kit de mutag�nesis dirigida a sitio QuickChange II XL, disponible comercialmente de Stratagene, de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se aislaron pl�smidos de las colonias formadas y se usaron para determinar las secuencias de nucleótidos de los genes as� obtenidos. Como resultado, se obtuvieron mutantes de 5'-XMP novedosos, en los que, en base a la aminasa 5' -XMP natural o a los mutantes de la misma, se sustituyó un residuo de alanina por ciste�na en la posición 86, y se designaron como G1C, G3C, F12C y F63C, respectivamente.

Para examinar si se introdujo la mutación correcta en la posición deseada, se analizaron las secuencias de nucleótidos de mutantes de aminasa 5'-XMP usando un secuenciador automático ABI3730xl, fabricado por Applied Biosystems. Se identificaron las secuencias de nucleótidos como SEQ ID NO.: 15 (G1C), SEQ ID NO.: 17 (G3C), SEQ ID NO.: 19 (F12C), y SEQ ID NO.: 21 (F63C). Se construyeron pl�smidos que llevaban genes que codifican los mutantes de aminasa 5'-XMP y se designaron como pCJ1-G1C, pCJ1-G3C, pCJ1-F12C y pCJ1-F63C, respectivamente, de los que los mapas esquemáticos se dan en las FIG. 13, 14, 15 y 16, respectivamente.

Ejemplo 6: Evaluación de la actividad de los mutantes de aminasa 5'-XMP

Se evalu� la actividad específica de aminasa 5'-XMP como sigue. En primer lugar, se midieron los niveles de expresión de proteína en un gel SDS-PAGE usando un analizador para concentración de proteína. Como resultado, los mutantes de aminasa 5'-XMP presentaron niveles de expresión similares entre s�, lo que indica que la actividad potenciada de los mutantes de aminasa 5'-XMP result� del incremento en la actividad específica.

Se compar� la actividad de los mutantes de aminasa 5'-XMP con la de la forma nativa, como sigue. En primer lugar, se inocularon los transformantes que expresan mutantes en 25 ml de un medio de cultivo que contenía 16 g/l de bactotriptona, 10 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl y 50 mg/l de kanamicina, y se cultiv� a 37 �C durante 12 h. Después de que se recuperaran las células cultivadas, se mezcl� 1 ml de cada fluido de cultivo con 20 ml de xileno y se incub� a 37 �C durante 20 min con agitaci�n a 250 rpm. A continuación, se diluyó la mezcla de reacción 10 veces antes de que se llevaran a cabo los ensayos para determinar la reactividad con amoníaco. A este respecto, se mezclaron 200 ml de la solución de enzima diluida con 800 ml de una solución de sustrato que estaba compuesta de XMP 30 mM, ATP 13 mM, MgSO4�7H2O 16 mM y (NH4)2SO4 10 mM en tampón HCl Trizma 200 mM (pH 8,6), y se incub� a 42 �C

durante 15 min. Se mezclaron 200 ml de la mezcla de reacción resultante con 3,8 ml de TCA al 0,175 % para terminar la reacción, y se sometió a HPLC para determinar la cantidad de 5'-GMP producida. Por separado, para medir la actividad catalítica de los mutantes de aminasa 5'-XMP con glutamina como sustrato, se mezclaron 200 ml de la solución de enzima diluida 10 veces con 800 ml de una solución de sustrato que estaba compuesta de XMP 30 mM, ATP 13 mM, MgSO4�7H2O 16 mM y L-glutamina 5 mM en tampón HCl Trizma 200 mM (pH 8,6), seguido de incubaci�n a 42 �C durante 15 min. Se analizó cuantitativamente el producto 5'-GMP usando HPLC. Se definió una unidad de actividad de aminasa 5'-XMP como la cantidad de enzima que forma un micromol de 5'-GMP por minuto. Se realizó una HPLC bajo las siguientes condiciones.

Eluyente A:

Tetrabutilamonio dihidr�geno fosfato al 0,02 %

amonio hidrógeno fosfato al 0,2 %, pH 2,4

Eluyente B: acetonitrilo

A:B = 97:3

Longitud de onda de medida: 254 nm

Caudal: 1,0 ml/min

Cuando se usa amoníaco como sustrato, se mide la actividad enzim�tica como sigue. Se midieron 13,61 U/ml en la aminasa 5'-XMP natural, 17,62 U/ml en la aminasa G3-1, 20,82 U/ml en el mutante F12-1, y 16,47 U/ml en el mutante F63-1. Al igual que para los mutantes de aminasa 5'-XMP específicos de amoníaco, se midieron 22,64 U/ml en el mutante G1C, 19,30 U/ml en el mutanteG3C, F12C, 22,76 U/ml en el mutanteF12C, y 19,62 U/ml en el mutanteF63C.

Por otra parte, cuando se usa L-glutamina como sustrato, se mide la actividad enzim�tica como sigue. Se analizaron 8,32 U/ml en la cepa natural, 19,15 U/ml en el mutante G3-1, 4,31 U/ml en el mutante F12-1, y 0,54 U/ml en el mutante F63-1. Al igual que para los mutantes 5'-XMP específicos de amoníaco, se descubrió que las actividades enzim�ticas eran de 0,21 U/ml para G1C, 0,16 U/ml para G3C, 0,24 U/ml para F12C, y 0,40 U/ml para F63C.

Como es evidente de los datos anteriores, los mutantes de aminasa 5'-XMP específicos de amoníaco son casi inactivos en la conversión de 5'-XMP a 5'-GMP cuando se usa L-glutamina como sustrato, pero se descubrió que tienen una actividad aproximadamente de 1,4 a 1,7 veces mayor en la conversión de 5'-XMP a 5'-GMP en presencia de amoníaco que los correspondientes mutantes naturales o aleatorios (FIG. 17).

Ejemplo 7: Estabilidad intracelular de los vectores de expresión para los mutantes de aminasa 5'-XMP específicos de amoníaco

Para comparar los vectores de expresión de los mutantes de aminasa 5'-XMP específicos de amoníaco con respecto a la estabilidad intracelular, se midieron cuantitativamente los vectores de expresión restantes tras el cultivo.

Despu�s de la terminación del cultivo, se diluyó el fluido de cultivo hasta 10-5 su concentración original y se unt� sobre placas LB (Bacto-Trypton al 1 %, extracto de levadura al 1 %, NaCl al 0,5 %) que contenían 50 g/ml de kanamicina o bien ningún antibiótico. La incubaci�n a 30 �C durante 16 h se siguió del recuento del número de colonias formadas. Se expresaron los números de colonias como porcentajes del control, y los resultados se representan en la FIG. 18.

Como se observa en la FIG. 18, el número de colonias en las que est� contenido el vector de expresión que lleva el gen que codifica el mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco G1C ascendió a un 54,3 % del control, mientras que en el caso de la aminasa 5'-XMP natural, el número no es mayor de un 36,0 %. Estos datos indican que el vector de expresión que lleva un gen que codifica la aminasa 5'-XMP específica de amoníaco es más estable dentro de la célula, potenciando as� la actividad catalítica.

Aplicabilidad industrial

Como se describe y se demuestra anteriormente en el presente documento, para producir eficazmente 5'-GMP útil como potenciador del sabor, la presente invención proporciona mutantes de aminasa 5'-XMP específicos de amoníaco impartiendo especificidad de amoníaco a la aminasa 5'-XMP natural y mutantes de aminasa 5'-XMP mutados aleatoriamente que tienen actividad potenciada, junto con un procedimiento de preparación del mismo. Además de tener una actividad potenciada con relación a la forma nativa, los mutantes de aminasa 5'-XMP específicos de amoníaco de la presente invención son útiles en un procedimiento biológico para producir 5'-GMP debido a que se pueden mantener de forma estable dentro de las células debido a su baja citotoxicidad.

<110>

CJ Corporation

<120>

Mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco

5

<160> 28

<170>

Kopatentln 1.71

10

<210> <211> <212> <213> 1 1578 ADN Escherichia coli K12

15

<220> <221> <222> <223> gen (1)..(1578) Secuencia de ADN para el gen natural G1 de aminasa XMP (guaA)

20

<220> <221> <222> <223> CDS (1) .. (1575) Secuencia de amino�cidos de G1 natural de aminasa XMP

<210>

2

<211>

525

<212>

PRT

5

<213> Escherichia coli K12

5

<210> <211> <212> <213> 3 1578 ADN Secuencia artificial

<220> <223>

Secuencia de ADN del mutante G3

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1)..(1575) Secuencia de amino�cidos del mutante G3 de aminasa XMP

<210>

4

<211>

525

5

<212> PRT

<213>

Secuencia artificial

<210>

5

<211>

1578

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

5

<220>

<223>

Secuencia artificial

<220>

10

<221> CDS

<222>

(1)..(1575)

<223>

Secuencia de amino�cidos del mutante F12 de aminasa XMP

<210>

6

<211>

525

<212>

PRT

5

<213> Secuencia artificial

5

<210> <211> <212> <213> 7 1578 ADN Secuencia artificial

23

<220> <223>

Secuencia artificial

5

<220> <221> <222> <223> CDS (1)..(1575) Secuencia de amino�cidos del mutante F63 de aminasa XMP

<210>

8

<211>

525

<212>

PRT

5

<213> Secuencia artificial

5

<210> <211> <212> <213> 9 1578 ADN Secuencia artificial

<220> <223>

Secuencia de ADN de G3-1

10

<220> <221> CDS

<222> (1)..(1575)

<223> Amino�cido de G3-1

<210>

10

<211>

525

<212>

PRT

5

<213> Secuencia artificial

5

<210> <211> <212> <213> 11 1578 ADN Secuencia artificial

<220> <223>

Secuencia de ADN de F12-1

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1)..(1575) Secuencia de amino�cidos de F12-1

<210>

12

<211>

525

<212>

PRT

5

<213> Secuencia artificial

5

<210> <211> <212> <213> 13 1578 ADN Secuencia artificial

<220> <223>

Secuencia de ADN de F63-1

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1)..(1575) Secuencia de amino�cidos de F63-1

<211>

525

<212>

PRT

<213>

Secuencia artificial

5

<210> <211> <212> <213> 15 1578 ADN Secuencia artificial

<220> <223>

Secuencia de ADN de G1C

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1) . . (1575) Secuencia de amino�cidos de G1C

5

<210> <211> <212> <213> 16 525 PRT Secuencia artificial

<400>

16

41

5

<210> <211> <212> <213> 17 1578 ADN Secuencia artificial

<220> <223>

Secuencia de ADN de G3C

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1)..(1575) Secuencia de amino�cidos de G3C

<210>

18

<211>

525

<212>

PRT

5

<213> Secuencia artificial

5

<210> <211> <212> <213> 19 1578 ADN Secuencia artificial

<220> <223>

Secuencia de ADN de F12C

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1)..(1575) Secuencia de amino�cidos de F12C

<210>

20

<211>

525

<212>

PRT

5

<213> Secuencia artificial

5

<210> <211> <212> <213> 21 1578 ADN Secuencia artificial

<220> <223>

Secuencia de ADN de F63C

10

<220> <221> <222> <223> CDS (1)..(1575) Secuencia de amino�cidos de F63C

<210>

22

<211>

525

<212>

PRT

5

<213> Secuencia artificial

5

<210> <211> <212> <213> 23 29 ADN Secuencia artificial

<220> <223>

cebador para mutag�nesis de guaA

10

<400> 23 cgcgaattca tgacggaaaa cattcataa 29

15

<210> <211> <212> <213> 24 28 ADN Secuencia artificial

20

<220> <223> cebador para mutag�nesis de guaA <400> 24 ctagtctaga tcattcccac tcaatggt 28

25

<210> <211> <212> <213> 25 32 ADN Secuencia artificial

30

<220> <223> cebador para mutag�nesis de guaA

<400> 25 acgtgccggc atgacggaaa acattcataa gc

32

35

<210> <211> <212> <213> 26 31 ADN Secuencia artificial

40

<220> <223> cebador para mutag�nesis de guaA

45

<400> 26 acgtggatcc tcattcccac tcaatggtag c <210> 27 31

55

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<223> cebador para mutag�nesis de guaA

<400> 27 ccggtattcg gcgttgcata tggcatgcag accatg 36 10

<210> 28

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> cebador para mutag�nesis de guaA

<400> 28 20 catggtctgc atgccatatg caacgccgaa taccgg 36

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco, preparado sustituyendo ciste�na en la posición 86 de aminasa 5'-XMP con alanina, serina o glicina, en el que la aminasa 5'-XMP tiene una secuencia de amino�cidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO.: 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14.

   5 2. El mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la ciste�na en la posición 86 est� sustituida con alanina.
2. 3. El mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una secuencia de amino�cidos representada por SEQ ID NO.: 16, 18, 20 o 22.
3. 4. Una molécula de ácido nucleico que codifica el mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco de la 10 reivindicación 1.

4. 5.

   Un vector de expresión que lleva la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4.

5. 6.

   Un transformante procariota, transformado con el vector de expresión de la reivindicación 5.

6. 7.

   Un procedimiento para convertir 5'-XMP en 5'-GMP, que comprende usar el mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco de una de las reivindicaciones 1 a 3.

   15 8. Un procedimiento para preparar un mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco, que comprende sustituir un residuo ciste�na en la posición 86 de una secuencia de amino�cidos de aminasa 5'-XMP que tiene una secuencia de amino�cidos representada por SEQ ID NO.: 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14, con alanina, glicina o serina, donde el mutante de aminasa 5'-XMP específico de amoníaco es sustancialmente inactivo para glutamina, pero reacciona específicamente con amoníaco para convertir 5'-XMP en 5'-GMP a una eficacia potenciada.

   [Fig. 1]

   Ligaci�n

   [Fig. 2]

   Eliminaci�n del fragmento que contiene el gen GFP

   [FIG. 5]

   [FIG. 18]

   Estabilidad de pl�smido