JP5118646B2 - アンモニア特異的5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体 - Google Patents
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Description
本発明は、向上した活性の5’−キサンチル酸(XMP)アミナーゼ変異体の製造方法、その方法によって製造された5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体、およびその変異体を用いて5’−グアニル酸(GMP)を向上した収率で製造する方法に関し、さらに詳しくは、アンモニアに特異的に反応する5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の製造方法、その方法によって製造されたアンモニア特異的5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体、およびそのアンモニア特異的5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を用いて高収率で5’−グアニル酸を製造する方法に関する。
5’−グアニル酸(GMP)は、5’−イノシン酸(IMP)と共に食品調味添加剤として広く用いられている物質である。5’−グアニル酸は、そのままで茸の味を出すものと知られているが、主にグルタミン酸1ナトリウム(MSG)の風味を強化するものと知られている。このような性質は、特に5’−イノシン酸と共に使われるときに強く現れる。
↑
5’−キサンチル酸アミナーゼ
2)5’−キサンチル酸+ATP+L-グルタミン → GMP+AMP+PPi+L-グルタミン ↑
5’−キサンチル酸アミナーゼ
5’−キサンチル酸アミナーゼは、グルタミンアミドトランスフェラーゼ(glutamine amidotrasnferase)の一種である。グルタミンアミドトランスフェラーゼは、グルタミンのγ−アミド部位を加水分解してアンモニアを発生させ、これをアミノ酸、核酸、糖、補酵素などに重合反応を経て導入する。グルタミンアミドトランスフェラーゼの対象物質は非常に多様であるが、グルタミンを加水分解してアンモニアを得る方式は進化的によく保存されてきた。グルタミンアミドトランスフェラーゼはさらにclassIとclassIIに分けられるが、classIの場合はアントラニル酸シンダーゼ(anthranilate synthase)、カルバモイルリン酸シンテターゼ(carbamoyl phosphate synthetase)、CTPシンテターゼ、ホルミルグリシンアミジンシンテターゼ(formylglycinamidine synthetase)、5’−キサンチル酸アミナーゼ、イミダゾールグリセロールリン酸シンターゼ(Imidazole glycerol phosphate synthase)、アミノデオキシコリスミ酸シンターゼ(aminodeoxychorismate synthase)、p−アミノベンゾ酸シンターゼ(p-aminobenzoate synthase)などを含む。これらは共にグルタミンの他に外部のアンモニアをアミン供与体(amine donor)として用いることができる(Cell MoI. Life Sci. 54, 205- 222, 1998)。この際、アンモニアは、グルタミンから遊離されたアンモニアが基質に伝達される方式とは異なり、トランスフェラーゼに直接伝達されるものと思われる。
したがって、本発明の目的は、野生型または活性が増進された5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体にアンモニア特異的な性質を与えることにより、活性が増進されたアンモニア特異的5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を提供することにある。
一つの様態として、本発明は、活性が増進されたアンモニア特異的5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を提供する。前記アンモニア特異的5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体は、好ましくは大腸菌由来の野生型5’−キサンチル酸アミナーゼまたはその活性が増進された変異体から製造できる。
5’−キサンチル酸アミナーゼの遺伝子に突然変異誘発型重合酵素連鎖反応(error-prone PCR)を行ってランダムな突然変異を誘発することにより、多様な5’−キサンチル酸アミナーゼ突然変異を次のように製造した。
配列番号24:5’CTAGTCTAGATCATTCCCACTCAATGGT3’
PCR反応液は、それぞれ0.4mMの前記N−プライマーおよびC−プライマー、鋳型として前記組み換えプラスミドpG1 5ng、10mMトリス緩衝液(Tris−HCl、pH8.3)、50mM KCl、7mM MgCl2、0.1m MnCl2、0.2mM dATP、0.2mM dGTP、1mM dCTP、1mM dTTPおよびTaq重合酵素の5酵素単位を含むように50mLを調製した。PCRは、94℃で1分、50℃で1分および72℃で1分の反応を1サイクルとしてこれを25サイクル行い、最後に72℃で7分の反応を行った。
実施例1で製造された5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体のライブラリを0.5%バクトトリプトン、1%酵母抽出物、1%NaCl、1.5%寒天および0.2mM IPTGを含むLB平板培地に塗抹した。次いで、成長した大腸菌コロニーをディープウェルマイクロプレート(deep well microplate)内のLB培地で培養した後、細胞の成長度合いに応じて100mLに希釈した。各ウェルにキシレン5mLを添加し、37℃で30分間処理した後、42℃で予熱した基質混合物を100mL添加し、42℃で20分間反応させた。基質混合物は30mM XMP、13mM ATP、16mM MgSO4・7H2O、40mM(NH4)2SO4を16mMのTrizma HCl緩衝液(pH8.6)に溶かした反応液である。3.5%の過塩素酸800mLを添加して反応を終了させた後、200mLをUV測定用96ウェルプレートに移して波長290nmにおける吸光度を測定した。5’−グアニル酸の生成量を測定し、酵素活性を比較して、活性が増進された5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を持つ大腸菌JM105形質転換体を獲得した。
実施例1および2で製造された5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の遺伝子配列は、Applied Biosystem社のautomatic sequencer ABI3730xlを用いて決定した。それぞれの塩基配列は配列番号3(G3)、配列番号5(F12)、配列番号7(F63)、配列番号9(G3−1)、配列番号11(F12−1)、および配列番号13(F63−1)と確認されたところ、それぞれのアミノ酸配列を推定して配列番号4(G3)、配列番号6(F12)、配列番号8(F63)、配列番号10(G3−1)、配列番号12(F12−1)および配列番号14(F63−1)で表した。また、前記G3、F12、F63、G3−1、F12−1およびF63−1をそれぞれ含むプラスミド地図を図3〜図8にそれぞれ示した。
前記得られた高活性の5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を常時発現ベクターを用いて発現させるために、下記の過程を行った。
配列番号26:5’ACGTGGATCCTCATTCCCACTCAATGGTAGC3’
PCR反応液は、それぞれ0.4mMの前記N−プライマーおよびC−プライマー、鋳型としてpG1、pCJ−G3−1、pCJ−F12−1およびpCJ−F63−1それぞれ5ng、10mMトリス緩衝液(Tris−HCl、pH8.3)、50mM KCl、7mM MgCl2、0.2mM dATP、0.2mM dGTP、0.2mM dCTP、0.2mM dTTPおよびPfu重合酵素の5酵素単位を含むように50mLを調製した。PCRは、94℃で1分、50℃で1分および72℃で1分の反応を1サイクルとしてこれを25サイクル行い、最後に72℃で5分の反応を行った。
5’−キサンチル酸アミナーゼの野生型および前記実施例で得た高活性の5’−キサンチル酸突然変異体を用いてアンモニア特異的5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を製造するために、これらタンパク質の86番目のシステインをアラニンに特異的に変異させるためのプライマーを製作し、これを配列番号27および配列番号28で表した。
配列番号28:5’CATGGTCTGCATGCCATATGCAACGCCGAATACCGG3’
前記プライマーの存在下で、部位指定変異導入を、Stratagene社のQuickChangeII XL Site−Directed Mutagenesis kitを用いて、製造社から提供された手続によって行った。得られたコロニーからプラスミドを公知の方法によって抽出し、これを用いて塩基配列を決定した。これにより、5’−キサンチル酸アミナーゼ野生型および前記変異体の突然変異を維持し、さらに86番目のシステインがアラニンで置換された新規の5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を得た。これらをそれぞれG1C、G3C、F12C、およびF63Cと命名した。
5’−キサンチル酸アミナーゼの非活性増加を確認するために、まず、SDS−PAGEゲル上のタンパク質発現量を濃度分析器によって確認した。この際、各変異体の発現量は互いに類似であると確認された。この点から、5’−キサンチル酸アミナーゼ活性の増加が非活性の増加によるものであることが分かった。
0.02%リン酸二水素テトラブチルアンモニム
0.2%リン酸二水素アンモニウム、pH2.4
Eluent B:アセトニトリル
A:B=97:3
測定波長=254nm
流速:1.0mL/min
アンモニアを基質として用いた場合、酵素活性は次の通りである。反応液1mL当り野生型の5’−キサンチル酸アミナーゼは13.61単位活性(U/mL)であり、変異体G3−1は17.62単位活性(U/mL)、変異体F12−1は20.82単位活性(U/mL)、変異体F63−1は16.47(U/mL)であった。アンモニア特異的5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体G1Cは22.64(U/mL)、G3Cは19.30(U/mL)、F12Cは22.76(U/mL)、F63Cは19.62(U/mL)であった。
アンモニア特異的5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体の発現ベクターの細胞内安定性を比較するために、培養後に残っている発現ベクターの量を比較した。
以上説明および立証したように、本発明は、調味成分として有用な5’−グアニル酸を効果的に生産するために、5’−キサンチル酸を5’−グアニル酸に転換させる5’−キサンチル酸アミナーゼの野生型およびその活性が増進されたランダム突然変異によって製造された5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体にアンモニア特異的な性質を与えたアンモニア特異的5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体およびその製造方法を提供する。したがって、本発明に係る5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体は、野生型に比べて活性が増進されるうえ、細胞毒性が減少して細胞内でより安定的に維持されることにより、5’−グアニル酸を生産する生物過程に有用に活用できる。
Claims (7)
- 配列番号2、4、6、8、10、12及び14からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む5’−キサンチル酸アミナーゼの、86番目のシステインをアラニンで置換して製造される、アンモニア特異的5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体。
- 前記アンモニア特異的5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体は、配列番号16、18、20または22のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のアンモニア特異的5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体。
- 請求項1に記載の5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体をコードする核酸分子。
- 請求項3に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項4に記載の発現ベクターで形質転換された原核細胞である形質転換体。
- 請求項1に記載のアンモニア特異的5’−キサンチル酸アミナーゼ変異体を用いて5’−キサンチル酸を5’−グアニル酸に転換させる方法。
- 野生型5’−キサンチル酸アミナーゼである配列番号2のアミノ酸配列、又は、野生型5’−キサンチル酸アミナーゼの変異タンパク質である配列番号4、6、8、10、12及び14からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む5’−キサンチル酸アミナーゼの、86番目のアミノ酸残基であるシステインをアラニンで置換することを含む、グルタミンには反応せず、アンモニアにのみ特異的に反応して増加した活性で5’−キサンチル酸を5’−グアニル酸に転換させるアンモニア特異的5’−キサンチル酸アミナーゼ変異タンパク質の製造方法。
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