JP2003093083A

JP2003093083A - 新規変異型カルバモイルリン酸シンセターゼ、及びカルバモイルリン酸より誘導される化合物の製造方法

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Publication number: JP2003093083A
Application number: JP2002221111A
Authority: JP
Inventors: Leonid Romanovich Ptitsyn; ロマノヴィッチプチツィンレオニド; Sergey Vasil'evich Smirnov; ヴァシリエヴィッチスミルノフセルゲイ; Irina Borisovna Altman; ボリソヴナアリトマンイリナ; Evgenievna Novikova Anna; エヴゲニエヴナノヴィコヴァアンナ; Alexandrovna Kotoriuyarova Veronica; アレクサンドロヴナコトリゥャロヴァヴェロニカ; Mikhail Markovich Gusyatiner; マルコヴィッチグシャチネルミハイル; Yulia Georgievna Rostova; ゲオルギエヴナロストヴァユリヤ; Tatyana Abramovna Yampolskaya; アブラモヴナヤンポリスカヤタチヤナ
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2001-08-03
Filing date: 2002-07-30
Publication date: 2003-04-02
Anticipated expiration: 2022-07-30
Also published as: RU2264459C2; JP4207484B2; BR0202976A; US20030129708A1; US20060035343A1; US6991924B2; US7211419B2

Abstract

(57)【要約】【課題】フィードバック阻害が脱感作され、かつ、高
い活性を維持する変異型カルバモイルリン酸シンセター
ゼ、及びそれを保持するエシェリヒア属細菌を提供す
る。【解決手段】野生型カルバモイルリン酸シンセターゼ
における９４７位〜９５１位に相当するアミノ酸配列
が、配列番号１〜９のアミノ酸配列のいずれかと置換さ
れ、かつ、ウリジン５'−一リン酸によるフィードバッ
ク阻害が脱感作された変異型カルバモイルリン酸シンセ
ターゼを保持するエシェリヒア属細菌を培地で培養し、
同培地中に前記化合物を生成、蓄積させ、該培養液より
前記化合物を回収することにより、Ｌ−アルギニン、シ
トルリン及びピリミジン誘導体を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は微生物工業、特にカ
ルバモイルリン酸より誘導される化合物に関わる。特
に、アルギニン、シトルリン、及び、オロト酸、ウリジ
ン、ウリジン５’−一リン酸（ＵＭＰ）、シチジン、シ
チジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）を含むピリミジン誘導
体のような、カルバモイルリン酸シンセターゼより誘導
される化合物を生産するエシェリヒア・コリ（E. col
i）菌株の、アルギニン及びピリミジンの生合成経路に
関与する新規フィードバック耐性酵素の利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】エシェリヒア・コリ（E. coli）のカル
バモイルリン酸シンセターゼ（ＣＰＳａｓｅ）は、重炭
酸、グルタミン及び２分子のＭｇ−ＡＴＰからカルバモ
イルリン酸（ＣＰ）を合成し、グルタミン酸、燐酸、及
び２分子のＭｇ−ＡＤＰを放出する複合反応を触媒する
（Meister A., Advan. Enzymol.Mol.Biol., vol. 62,
p.315-374, 1989）。

【０００３】ＣＰの合成は、２つの生合成経路、すなわ
ちピリミジンヌクレオチド及びアルギニンの合成経路の
中間体である。前者の経路においては、ＣＰはアスパラ
ギン酸カルバモイルトランスフェラーゼ（ＡＴＣａｓ
ｅ）に結合し、結果として２段階でオロト酸を生成す
る。オロト酸は、ウラシルのようなピリミジン；オロチ
ジン、ウリジン、及びシチジンのようなピリミジンヌク
レオシド；ならびにオロチジン５’−一リン酸（ＯＭ
Ｐ）、ＵＭＰ、及びＣＭＰのようなピリミジンヌクレオ
チドを含むピリミジン誘導体の生合成に重要な代謝中間
体である。多くの細菌では、発酵の間、培養液中にオロ
ト酸が存在すると、ピリミジン誘導体、すなわちウラシ
ルの生成と蓄積を適度に補助することが示されている
（米国特許3,214,344）。後者の経路では、ＣＰは、オ
ルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＴＣａｓ
ｅ）を介してオルニチンに結合し、アルギニン生合成経
路においてグルタミン酸から始まる６番目の段階を構成
する。

【０００４】ＣＰＳａｓｅはオルチニン及びＩＭＰ（プ
リンヌクレオチドの前駆体の一つ）により活性化され、
そしてＵＭＰにより不活性化される。カルバモイルリン
酸シンセターゼは、２つのサブユニットからなってい
る。コリネ型細菌（EP1026247A1）、エシェリヒア（Esc
herichia）属及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属
する細菌については、これらのサブユニットはｃａｒＡ
及びｃａｒＢ遺伝子によりコードされていることが知ら
れている。ｃａｒＡＢオペロンの転写は、両経路の最終
産物により集積的に抑制される（Charlier D., et al.,
J. Mol. Biol.,vol.226, p.367-386, 1992; Wang H.,
et al., J. Mol. Biol., vol.277, p805-824, 1998; Gl
ansdorff N., et al., Paths to Pyrimidines, vol.6,
p. 53-62,1998）。

【０００５】天然のエシェリヒア・コリのＣＰＳａｓｅ
は、それぞれｃａｒＡ遺伝子及びｃａｒＢ遺伝子により
コードされる41,270Daの小サブユニットと117,710Daの
大サブユニットからなるヘテロダイマーである。小サブ
ユニットはグルタミンの加水分解を触媒し、ＣＰ合成が
実際に起こる大サブユニットへのNH₃の移動に関与す
る。大サブユニットは、基質、すなわち重炭酸、アンモ
ニアに対する結合部位、Ｍｇ−ＡＴＰａｓｅに対する異
なる２つの結合部位、及び、調節ドメインを構成する18
kDaのカルボキシ末端を含む（Rubio V., et al.,Bioche
mistry, vol.30,p.1068-1075, 1991; Cervera I., et a
l., Biochemistry, vol. 35, p.7247-7255, 1996）。ま
た、大サブユニットは、単独でカルバモイルリン酸の合
成反応を触媒する活性を有することが示唆されている
（Stephen D. Rubino et al., J. Biol. Chem., 206, 4
382-4386, 1987）。

【０００６】ＣＰＳａｓｅのアロステリックに活性化さ
れた形態の結晶構造が、最近報告されている（Thoden
J., et al., Biochemistry, vol.36, p. 6305-6316, 19
97; Thoden J., et al., Acta Crystallogr.Sec.D., vo
l. 55, p. 8-24, 1999）。大サブユニットの中のＡ、
Ｂ、Ｃと名付けられた最初の３つの個々のドメインは、
構造が非常に類似している。しかし４つ目のドメインは
全く異なっている。このＤドメイン（９３７〜１０７３
位）は、結合と、ＩＭＰ、ＵＭＰ及びオルニチンの各因
子によるアロステリックな制御に関与している。また、
セリン９４８及びスレオニン１０４２の２つの残基も、
ＣＰＳａｓｅのアロステリックな制御に重要と考えられ
ることが示されている（Delannary S., et al., J. Mo
l. Biol., vol.286, p.1217-1228, 1999）。セリン９４
８がフェニルアラニンで置換されると、当該酵素はＵＭ
Ｐ及びＩＭＰに非感受性となるが、活性化の程度は減少
するものの、オルニチンにより依然として活性化され
る。Ｔ１０４２Ｉ変異を有する酵素は、オルニチンによ
る活性化が大きく減少する。

【０００７】大抵、酵素のフィードバック耐性（ｆｂ
ｒ）表現形は、アミノ酸配列における単一又は２、３箇
所のアミノ酸残基が他の残基に置換されることにより生
じ、これらの置換は酵素活性の減少につながる。例え
ば、エシェリヒア・コリのセリンアセチルトランスフェ
ラーゼ（ＳＡＴ）（ｃｙｓＥ遺伝子）における天然メチ
オニン−２５６が、他の１９アミノ酸のいずれかで置換
されると、大抵の場合ｆｂｒ表現形に至るが、変異型Ｓ
ＡＴタンパクは天然ＳＡＴの活性レベルを維持しない
（Nakamori S et al. AEM, vol.64, p.1607-1611, 199
8）。したがって、これらの方法で得られる変異型酵素
の不利な点は、野生型酵素と比較して活性が低いという
ことである。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、エシェリヒ
ア・コリにおけるピリミジン及びアルギニン又はシトル
リンの生合成において重要な役割を果たす、フィードバ
ック耐性及び高活性な酵素の構築に関する。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明においては、ｃａ
ｒＢ遺伝子断片の完全無作為化法（full rondomizatio
n）を用いて変異型ｃａｒＢ遺伝子の大集合を合成する
新規な手法が、提案される。アミノ酸配列断片におけ
る、ｆｂｒ突然変異が集中する位置でのいくつかのアミ
ノ酸前記の同時置換によれば、酵素の三次元構造のより
適切な一致によって、天然のものに近い活性を保持する
変異型タンパク質を製造することができる。かくして本
発明は完成された。

【００１０】本発明はすなわち、（１）配列番号２０の９４７位〜９５１位に相当するア
ミノ酸配列が、配列番号１〜９のアミノ酸配列のいずれ
かと置換され、かつ、ウリジン５'−一リン酸によるフ
ィードバック阻害が脱感作されたカルバモイルリン酸シ
ンセターゼの大サブユニット；（２）野生型カルバモイルリン酸シンセターゼがエシェ
リヒア・コリ由来である(1)のカルバモイルリン酸シン
セターゼの大サブユニット；（３）配列番号２０の９４７位〜９５１位のアミノ酸配
列が配列番号１〜９のアミノ酸配列のいずれかと置換さ
れ、ウリジン５'−一リン酸によりフィードバック阻害
が脱感作された、(1)のカルバモイルリン酸シンセター
ゼの大サブユニット；（４）９４７位〜９５１位以外の一または複数の位置に
おける、一または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入ま
たは付加を有し、かつ、ウリジン５'−一リン酸による
フィードバック阻害が脱感作された、(1)のカルバモイ
ルリン酸シンセターゼの大サブユニット；（５）(1)〜(4)のいずれかの変異型カルバモイルリン酸
シンセターゼの大サブユニットを含む、カルバモイルリ
ン酸シンセターゼ；（６）(1)〜(5)のいずれかのウリジン５'−一リン酸に
よるフィードバック阻害が脱感作された変異型カルバモ
イルリン酸シンセターゼの大サブユニットをコードする
ＤＮＡ；（７）(1)〜(4)のいずれか一項に記載のウリジン５'−
一リン酸によるフィードバック阻害が脱感作されたカル
バモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットと、エシ
ェリヒア・コリのカルバモイルリン酸シンセターゼの小
サブユニットをコードするＤＮＡ。（８）(6)又は(7)のＤＮＡを保持するエシェリヒア属細
菌。（９）Ｌ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘導
体からなる群より選択される化合物を生産する能力を有
する(8)の細菌。（１０）ピリミジン誘導体がオロト酸、ウリジン、ウリ
ジン５'−一リン酸、シチジン及びシチジン５'−一リン
酸である、(9)の細菌。（１１）(8)〜(10)いずれかの細菌を培地で培養し、同
培地中にＬ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘
導体からなる群より選択される化合物を生成、蓄積さ
せ、該培養液より前記化合物を回収する、Ｌ−アルギニ
ン、シトルリン及びピリミジン誘導体からなる群より選
択される化合物の製造方法。（１２）前記ピリミジン誘導体が、オロト酸、ウリジ
ン、ウリジン５'−一リン酸、シチジン及びシチジン５'
−一リン酸である、(11)の製造方法。

【００１１】本発明において、用語「ＣＰＳａｓｅ活
性」は、重炭酸、グルタミン及び２分子のＭｇ−ＡＴＰ
からのカルバモイルリン酸の複合合成の反応を触媒する
活性を意味する。また、本発明の「ＣＰＳａｓｅ」は、
ＣＰＳａｓｅ活性を有する限り、大サブユニットのみか
らなる単独のポリペプチドでもよいし、大サブユニット
及び小サブユニットからなるヘテロダイマーであっても
よい。以下、このような大サブユニット及びヘテロダイ
マーを総称して、「ＣＰＳａｓｅ」と称することがあ
る。さらに、大サブユニット及び小サブユニットをコー
ドするＤＮＡは、「ｃａｒＡＢ」と称する。また、前記
のｆｂｒ変異のいずれかを持つＣＰＳａｓｅは「変異型
ＣＰＳａｓｅ」と称する。また、変異型ＣＰＳａｓｅを
コードするＤＮＡは、態様に応じて「変異型ｃａｒＢ遺
伝子」、又は「変異型ｃａｒＡＢ遺伝子」と称する。ま
た、変異のないＣＰＳａｓｅは「野生型ＣＰＳａｓｅ」
と称する。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１３】＜１＞変異型ＣＰＳａｓｅ及び変異型ｃａ
ｒＢ遺伝子発現ベクター中にｃａｒＡＢオペロンとしてクローニン
グされた種々の変異型ｃａｒＢ遺伝子を持つ組換えクロ
ーンの選択及びスクリーニングにより、様々のレベルの
生物学的活性を持つ変異型ＣＰＳａｓｅのｆｂｒ変異体
を選択することができる。S. Delannay et al.により得
られたデータによれば、エシェリヒア・コリのカルバモ
イルリン酸シンセターゼの変異体（Ｓ９４８Ｆ）はＵＭ
Ｐに非感受性である（Delannay S., et al., J. Mol. B
iol., v.286, 1217-1228, 1999）。これらのデータをも
とに、ＣＰＳａｓｅの９４８位を含む範囲が改変のター
ゲットとして選択された。

【００１４】変異型ＣＰＳａｓｅ及び変異型ｃａｒＢ遺
伝子は、ランダム化断片による突然変異誘発により得ら
れた。ｃａｒＢにおける多くの変異を得るために、配列
番号２０のアミノ酸配列のロイシン９４７からグルタミ
ン酸９５１残基の領域をコードするｃａｒＢ遺伝子の１
５−ヌクレオチド断片のランダム化が行われた（以下を
参照）。ランダム化された１５ヌクレオチドの断片は、
４¹²すなわち１．５×１０⁷近くの異なるＤＮＡ配列を
もたらし、これは５ｍｅｒのペプチド中で４×１０⁵の
異なるアミノ酸残基をコードし得る。これらの配列中に
インフレームでストップコドンが導入されない可能性
は、およそ０．９５、すなわち９５％である。したがっ
て、９４７位〜９５１位のアミノ酸残基のペプチドをコ
ードするｃａｒＢ遺伝子断片のランダム化は、ＣＰＳａ
ｓｅ構造におけるこのペプチド断片において、多様性を
有するおよそ４×１０⁵の異なるアミノ酸配列をもたら
すはずである。発現ベクター中にクローニングされた変
異型ｃａｒＢ遺伝子を持つリ組換えクローンの選択とス
クリーニングにより、様々のレベルの生物学的活性を持
つ変異型ＣＰＳａｓｅのｆｂｒ変異体を選択することが
できる。

【００１５】ＣＰＳａｓｅのｆｂｒ表現形に適した変異
型ＣＰＳａｓｅのアミノ酸配列は、本発明により明確に
される。したがって、変異型ＣＰＳａｓｅは、その配列
に基づいて、通常の手法を用いて野生型ｃａｒＢ遺伝子
に突然変異を導入することにより得られる。野生型ｃａ
ｒＢとして、エシェリヒア・コリのｃａｒＢ遺伝子が挙
げられる（GenBank Accession AE000113 U00096中、ヌ
クレオチド番号１０１５８から１３３７９：配列番号１
９の配列）。尚、ｃａｒＡ遺伝子は、前記GenBank Acce
ssion AE000113 U00096の塩基配列において、ヌクレオ
チド番号８９９２〜１０１４０に相当する。

【００１６】変異型ＣＰＳａｓｅをコードするＤＮＡを
取得する材料としてｃａｒＢ遺伝子を用いれば、変異型
ＣＰＳａｓｅの大サブユニットをコードする変異型ｃａ
ｒＢ遺伝子が得られる。また、前記材料としてｃａｒＡ
Ｂ遺伝子を用いれば、変異型ＣＰＳａｓｅの大サブユニ
ットとともに及び小サブユニットをコードする変異型ｃ
ａｒＡＢ遺伝子が得られる。

【００１７】本発明の変異型ＣＰＳａｓｅにおける９４
７位から９５１位のアミノ酸配列は、配列番号１〜９の
配列のいずれかである。９４８位のセリンがフェニルア
ラニンで置換された既知のｆｂｒＣＰＳａｓｅ、及び
エシェリヒア・コリの野生型ＣＰＳａｓｅの対応するア
ミノ酸配列を、表１に示す。

【００１８】

【表１】

【００１９】変異型ＣＰＳａｓｅは、ＣＰＳａｓｅ活性
が損なわれない限り、９４７位〜９５１位以外の一また
は複数の位置で、一または複数のアミノ酸の欠失、置
換、挿入、もしくは付加を含んでいてもよい。「複数」
のアミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造中のアミノ
酸残基の位置またはタイプにより異なる。これは以下の
理由による。すなわち、いくつかのアミノ酸は互いに高
い相同性を有し、そのようなアミノ酸の相違はタンパク
質の三次元構造に大きな影響を与えない。したがって、
本発明の変異型ＣＰＳａｓｅは、ＣＰＳａｓｅを構成す
る全アミノ酸残基に関して３０〜５０％以上、好ましく
は５０〜７０％の相同性を有し、かつ、ｆｂｒＣＰＳ
ａｓｅ活性を有するものものであってもよい。尚、変異
型ＣＰＳａｓｅは、ウリジン５’−一リン酸非存在下で
の酵素活性が、野生型ＣＰＳａｓｅの活性の２５％以
上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上
の活性を保持していることが好ましい。

【００２０】本発明において、「９４７位〜９５１位の
配列に相当するアミノ酸配列」とは、配列番号２０のア
ミノ酸配列における９４７位〜９５１位のアミノ酸配列
に相当するアミノ酸配列を意味する。アミノ酸残基の位
置は、変化し得る。例えば、あるアミノ酸残基がＮ−末
端位に挿入されると、９４７位に本来位置していたアミ
ノ酸残基は９４８位になる。その様な場合、最初の９４
７位に相当するアミノ酸残基は、本発明において９４７
位のアミノ酸残基として示される。

【００２１】用語「ウリジン５’−一リン酸によるフィ
ードバック阻害が脱感作された」とは、フィードバック
阻害の程度が低下したことを意味する。フィードバック
阻害の程度の低下は、ウリジン５’−一リン酸存在下で
のＣＰＳａｓｅ活性の低下を測定し、配列番号２０のア
ミノ酸配列を有するタンパク質のそれと比較することで
決定することができる。さらに、用語「ウリジン５’−
一リン酸によるフィードバック阻害が脱感作された」
は、実質的に阻害が脱感作されていればよく、完全に脱
感作されることは必須ではない。

【００２２】具体的には、変異型ＣＰＳａｓｅは、５ｍ
Ｍのグルタミンを基質としたときに、ウリジン５’−一
リン酸非存在下の活性に対する、１０ｍＭのウリジン
５’−一リン酸存在下での活性の割合が、５０％以上、
好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上であ
ることが好ましい。

【００２３】上記の変異型ＣＰＳａｓｅと実質的に同一
のタンパクをコードするＤＮＡは、例えばヌクレオチド
配列を改変すること、例えば、ある特定の部位で一また
は複数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、または付加
されるように部位特異的突然変異誘発法により、取得す
ることができる。上記のように改変されたＤＮＡは、通
常知られる突然変異処理法で取得され得る。突然変異処
理法としては、例えば、変異型ｃａｒＢ遺伝子を含むＤ
ＮＡを、インビトロでヒドロキシルアミンで処理する方
法、及び、例えば変異型ｃａｒＢ遺伝子を保持するエシ
ェリヒア属細菌を、紫外線照射、またはその様な処理に
通常使われるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン（ＮＴＧ）及び亜硝酸のような突然変異誘発
物質で処理する方法が挙げられる。

【００２４】上記のようなヌクレオチドの置換、欠失、
挿入、または付加はまた、自然に起こる変異（mutant又
はvariant）、例えば、ＣＰＳａｓｅを持つ個体の違い
または種もしくは属の違いによる変異を含む。変異型Ｃ
ＰＳａｓｅと実質的に同一のタンパク質をコードするＤ
ＮＡは、突然変異処理された変異型ＣＰＳａｓｅを保持
する細胞から、プローブとして既知のｃａｒＢ遺伝子配
列またはその一部を持つＤＮＡとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、かつ、ＣＰＳａｓｅ活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによ
り得られる。

【００２５】ここでいう用語「ストリンジェントな条
件」は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非
特異なハイブリッドが形成されない条件を意味する。こ
の条件を、正確に数値を用いて表すことは困難である
が、例えばストリンジェントな条件は、高いホモロジー
を有するＤＮＡ、例えば互いに５０％以上のホモロジー
を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それよりも低
いホモロジーを有するＤＮＡは互いにハイブリダイズし
ないような条件が挙げられる。あるいは、ストリンジェ
ントな条件としては、サザンハイブリダイゼーションに
おける通常の洗いの条件に相当する塩濃度でＤＮＡ同士
が互いにハイブリダイズする条件、例えば６０℃、１×
ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。

【００２６】上記の条件下でハイブリダイズし得る遺伝
子の中には、遺伝子のコード領域内に終止コドンを有す
るもの、及び、活性中心の変異により活性を持たないも
のが含まれる。しかし、そのような不都合は、市販の発
現ベクターに遺伝子を連結し、発現したタンパク質のＣ
ＰＳａｓｅ活性を調べることで、簡単に除くことができ
る。

【００２７】本発明のＣＰＳａｓｅが、変異型の大サブ
ユニットと小サブユニットからなるヘテロダイマーであ
る場合、小サブユニットとしては、エシェリヒア・コリ
の野生型ＣＰＳａｓｅの小サブユニットが挙げられる。
報告されている小サブユニット遺伝子（ｃａｒＡ）の塩
基配列及びＣａｒＡのアミノ酸配列（GenBank Accessio
n AE000113 U00096）を、配列番号３２及び３３に示
す。本発明においては、大サブユニットとともにＣＰＳ
ａｓｅ活性を有している限り、小サブユニットは、一ま
たは複数の位置で、一または複数のアミノ酸の欠失、置
換、挿入、もしくは付加を含んでいてもよい。「複数」
の意味は、前記大サブユニットと同様である。上記のよ
うな小サブユニットと実質的に同一のポリペプチドをコ
ードするＤＮＡとして具体的には、ｃａｒＡまたはその
一部を持つＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズするＤＮＡが挙げられる。「ストリンジェント
な条件」の意味は、前記と同様である。

【００２８】＜２＞本発明のエシェリヒア属細菌本発明のエシェリヒア属細菌は、上記の変異型ｃａｒＢ
遺伝子が導入されたエシェリヒア属細菌である。エシェ
リヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリが挙げられ
る。変異型ｃａｒＢ遺伝子は、例えば、エシェリヒア属
細菌で機能するベクター及び変異型ｃａｒＢ遺伝子を含
む組換えＤＮＡでエシェリヒア属細菌を形質転換するこ
とで得られる。変異型ｃａｒＢ遺伝子は、染色体上のｃ
ａｒＢ遺伝子を変異型ｃａｒＢ遺伝子と置換することに
よっても得ることができる。

【００２９】変異型ｃａｒＢ遺伝子の導入に使われるベ
クターとしては、pBR322、pMW118、pUC19等のようなプ
ラスミドベクター、l1059、lBF101、M13mp9等のような
ファージベクター、及びMu、Tn10、Tn5等のようなトラ
ンスポゾンが挙げられる。

【００３０】エシェリヒア属細菌へのＤＮＡの導入は、
例えば、D. A. Morrisonの方法（Methods in Enzymolog
y, 68, 326(1979)）、または受容菌を塩化カルシウムで
処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel, M., and
Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159, (1970)）等により
行うことができる。

【００３１】Ｌ−アルギニン、シトルリン及びピリミジ
ン誘導体のようなカルバモイルリン酸から誘導される化
合物の生産量は、上記のようなエシェリヒア属に属する
生産菌に変異型ｃａｒＢを導入することで上昇させるこ
とができる。また、Ｌ−アルギニン、シトルリン及びピ
リミジン誘導体のような化合物の生産能は、あらかじめ
変異型ｃａｒＢ遺伝子が導入された細菌に付与してもよ
い。上記ピリミジン誘導体としては、オロト酸、ウリジ
ン、ＵＮＰ、シチジン及びＣＭＰが挙げられる。

【００３２】Ｌ−アルギニン生産能を有するエシェリヒ
ア属細菌としては、エシェリヒア・コリAJ11531及びAF1
1538（特開昭56-106598号）、AJ11593（FERM P-5616）
及びAJ11594（FERM P-5617）（特開昭57-5693号）、VKP
M B-7925（ロシア特許出願第2000117677号）が挙げられ
る。VKPM B-7925は、２０００年４月１０日より、ルシ
アン・ナショナル・コレクション・フォー・インダスト
リアル・マイクロオーガニズムス（ＶＫＰＭ）に寄託さ
れている。

【００３３】エシェリヒア属に属するＬ−シトルリン生
産菌、エシェリヒア属に属するオロト酸生産菌、及びエ
シェリヒア属に属する５’−一リン酸（ＵＭＰ）生産菌
は現在知られていない。

【００３４】Ｌ−シトルリン生産能を有するバチルス属
細菌としては、バチルス・ズブチリス（B. subtilis）K
-X-1 A-1株（ATCC No 15561）及びK-1 A-9株（ATCC No
15562）（米国特許第3,282,794号）、バチルス sp. cit
-70株（特開平08-089269号）が例示される。Ｌ−シトル
リン生産能を有するブレビバクテリウム（Brevibacteri
a）属細菌としては、ブレビバクテリウム・フラバム（B
revibacterium flavum）AJ3408株（FERM P-1645）（米
国特許第5,164,307号）、及びAJ11677株（特開昭57-163
488号）が挙げられる。Ｌ−シトルリン生産能を持つコ
リネバクテリウム属細菌としては、コリネバクテリウム
・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）AJ1158
8株（FERM P-5643）（米国特許第5,164,307号）が挙げ
られる。

【００３５】オロト酸生産能を有するバチルス属細菌と
しては、オロト酸フォスフォリボシルトランスフェラー
ゼを欠損したバチルス・ズブチリスFERM P11402（特開
平04-004891号）が挙げられる。ＵＭＰ生産能を持つコ
リネバクテリウム属細菌としては、５−フルオロウラシ
ル耐性のコリネバクテリウム・グルタミカム T-26株（F
ERM BP-1487）、５−フルオロウラシル及びトリメトプ
リムに耐性なT-29株（FERM BP-1487）、ならびに５−フ
ルオロウラシル及びスルファグアニジンに耐性なT-30株
（FERM BP-1489）（欧州特許EP0312912）が挙げられ
る。

【００３６】ＵＭＰ生産能を有するコリネバクテリアと
しては、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Cory
nebacterium ammoniagenes）LK 40-2株（VKPM B-781
1）、LK75-15（VKPM B-7812）、及びLK 75-66（VKPM B-
7813）（ロシア特許出願第99122774号）が挙げられる。

【００３７】＜３＞Ｌ−アルギニン、シトルリン及びピ
リミジン誘導体の製造方法Ｌ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘導体のよ
うな化合物は、変異型ｃａｒＢ遺伝子が導入され、同化
合物を生産する能力を有する細菌を培地で培養し、同化
合物を培地中に生成、蓄積させ、それらを培地から回収
することにより、効率よく生産することができる。上記
ピリミジン誘導体としては、オロト酸、ウリジン、ＵＭ
Ｐ、シチジン及びＣＭＰが挙げられる。

【００３８】本発明の方法において、エシェリヒア属細
菌の培養、液体培地からの化合物の回収と精製は、細菌
を用いた発酵によるＬ−アルギニン生産のための通常の
方法と同様にして行うことができる。培養に使用される
培地は、炭素源及び窒素、無機質ならびに、必要に応じ
て、細菌の成長に必要な適量の栄養分を含む限り、合成
培地または天然培地のいずれでもよい。炭素源として
は、使用する細菌の資化能によって、グルコース及びス
クロースのような種々の炭水化物、及び種々の有機酸が
挙げられる。エタノール及びグリセロールのようなアル
コールも使用することができる。窒素源としては、アン
モニア、種々のアンモニウム塩、アミンのよう他の窒素
化合物、ペプトンのような天然の窒素源、ダイズ水解物
及び醗酵性微生物の消化物が使用される。無機質として
は、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムが使用され
る。

【００３９】培養は、好ましくは振盪、通気及び撹拌培
養のような好気的な状態下で行われる。培養は、通常２
０℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３８℃の間で行われ
る。培養は、通常５〜９、好ましくは６．５〜７．２の
間のｐＨで行われる。培養液のｐＨは、アンモニア、炭
酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基、及び緩衝液で調
整することができる。通常、１日〜３日の培養で、培養
液中に化合物が蓄積する。

【００４０】化合物の単離は、培養の後に遠心分離や濾
過により細胞のような固形物を培養液から取り除き、続
いてイオン交換、濃縮及び結晶分画法により化合物を回
収及び精製することで、行うことができる。

【００４１】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００４２】

【実施例１】エシェリヒア・コリの野生型ｃａｒＡＢ遺
伝子を持つプラスミドpBScarAB-13を、あらかじめBamHI
及びPstIで消化したpBluescript II SK(+)ベクター（Fe
rmentas, Lithuania）に、エシェリヒア・コリ染色体か
らのAvaIII-BglIIＤＮＡ断片（４９１１ｂｐ）をクロー
ニングすることにより構築した。

【００４３】プラスミドpET22-b(+)（Novagen, USA）
は、T7プロモーターをlacプロモーターで置換するよう
に改変した。lacプロモーターは、pUC18プラスミドをテ
ンプレートとして、オリゴヌクレオチド 5'-accagatctgcggcagtgagcgcaacgc-3'（配列番号２
１）、及び 5'-gtttctagatcctgtgtgaaattgttatccgc-3'（配列番号２
２）をプライマーとして用いて、ＰＣＲ増幅により取得し
た。得られたlacプロモーターを含む断片（0.14kb）
は、制限酵素BglII及びXbaIで消化し、同じ酵素で処理
したpET21-b(+)ベクター中にクローニングした。得られ
たプラスミドpET-Placは、プラスミドpBScarAB-13から
プロモーターを持たないｃａｒＡＢ遺伝子をクローニン
グするのに用いた。

【００４４】ｃａｒＡ遺伝子の５’末端（1.18kb）は、
pBScarAB-13をテンプレートとして、オリゴヌクレオチ
ド 5'-cctctagaaataaagtgagtgaatattc-3'（配列番号２
３）、及び 5'-cttagcggttttacggtactgc-3'（配列番号２４）をプライマーとして用いて、ＰＣＲ増幅により取得し
た。得られた断片はXbaI及びDraIIIで消化し、ｃａｒＡ
遺伝子の５’−末端配列を含むXbaI-DraIII断片（0.61k
b）をアガロース電気泳動により精製した。この断片、p
BScarAB-13プラスミドより得たDraIII-SacI断片（ｃａ
ｒＡ遺伝子及びｃａｒＢ遺伝子の３’−末端配列を含ん
でいる）及びpET-Plac/XbaI-SacIベクターの混合物を連
結し、エシェリヒア・コリＴＧ１細胞を形質転換した。
得られた組換えプラスミドpEL-carAB-wtは、lacプロモ
ーターの制御下で、野生型ｃａｒＡＢオペロンの配列を
持っている。

【００４５】ＰＣＲ増幅に用いたTaKaRa La DNA Polyme
raseは、宝酒造(株)（日本）より入手し、推奨される条
件で使用した。

【００４６】＜１＞ランダム化断片による突然変異誘発プラスミドpBScarAB-13をテンプレートとして用い、セ
ンスプライマーＰ１：5'-ggtcgtgcgctgNN(T/C)N(T/C)CN
N(T/C)NNN(G/A)NNggcgataaagaacgcgtggtg-3'（配列番号
２５）（４８塩基）をｃａｒＢ遺伝子のヌクレオチド配
列に基づいてデザインし、標準Ｍ１３ダイレクトシーク
エンスプライマーを、アンチセンスプライマーとして用
いた。プライマーＰ１の固定された５’末端１２ヌクレ
オチド、及び固定された３’末端２１ヌクレオチドは、
ｃａｒＢ遺伝子のＧｌｕ９５１コドンの下流、及びＬｅ
ｕ９４７コドンの上流の配列にそれぞれ相同性を有す
る。

【００４７】0.75kbp ＤＮＡ断片（ｃａｒＢ遺伝子の
３’末端）が、ランダム化された１５ヌクレオチドとＰ
１プライマーを用いて、１段目のＰＣＲで増幅された。
１段目のＰＣＲは以下のようにして行った。100ngのpBS
carAB-13を、10pmol濃度の２つのプライマーそれぞれを
含むＰＣＲ溶液に、テンプレートとして加えた。2400 D
NAサーマルサイクラー（Perkin-Elmer Co., Foster Cit
y, Calif.）を用いて15PCRサイクル（94℃で15秒、52℃
で20秒、72℃で１分）を行った。

【００４８】二回目の増幅として、次の15サイクル（94
℃で１分、35℃で１分、72℃で２分）を行った。その
際、増幅断片の（−）鎖が遺伝子全長を得るためにそれ
を伸長させるための「プライマー」として機能させた。

【００４９】三段目の増幅として、反応混合液の10μl
分を、100pmolのセンスプライマー：Ｍ１３ダイレクト
シークエンスプライマー、及びアンチセンスとしてプラ
イマーＰ２：5'-ccacttcctcgatgacgcgg-3'（配列番号２
６）を含む新鮮な90μlの反応混合液に添加し、さらに1
5サイクル（94℃で0.5分、55℃で20秒、72℃で２分）を
行った。

【００５０】ｃａｒＢ遺伝子の３’末端断片の様々な変
異体のプールをコードする1.32kbのDNA断片を、アガロ
ースゲル電気泳動で精製し、次いでAflII及びSacIで消
化した後、あらかじめ同じ制限酵素で消化したpEL-carA
B-wtベクターに連結し、pEL-carAB-NNを得た。

【００５１】後の実験で、約150ngの連結されたＤＮＡ
を、エシェリヒア・コリＴＧ１（supE hsdΔ5 thiΔ(la
c-proAB)F'[traD36 proAB⁺lac^qlacZΔM15]）（J. Sam
brooket al., Molecular Cloning, 1989）受容細胞の形
質転換に用い、約2000の組換えクローンが得られた。組
換えプラスミド（pEL-carAB-NN）のプールを精製し、活
性ＣａｒＡＢ酵素を持つ組換えプラスミドpEL-carAB-NN
を選択するために用いたエシェリヒア・コリVKPM B-696
9（car:Tn10）を形質転換した。

【００５２】＜２＞部位特異的突然変異誘発単一変異Ser948Pheを導入するために、プラスミドpBSca
rAB-13をテンプレートとして、ｃａｒＢ遺伝子のヌクレ
オチド配列に基づいて設計したセンスプライマー5'-cgt
gcgctgcttttcgtgcgcgaaggcgataaag-3'（３４塩基）（配
列番号２７）、及び、アンチセンスプライマーとして標
準Ｍ１３ダイレクトシークエンスプライマーを用いて、
ＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅及び断片のクローニング
は、上記のようにして行った。

【００５３】単一変異を持つｃａｒＢ遺伝子の３’末端
断片をコードする1.32kbpのDNA断片をアガロースゲル電
気泳動で精製し、AflII及びSacIで消化し、次いで同じ
制限酵素であらかじめ消化したpEL-carAB-wtベクターに
連結した。およそ100ngの得られたＤＮＡプラスミド
を、エシェリヒア・コリVKPM B-6969の形質転換に用
い、単一置換Ser948Pheを有する活性ＣａｒＡＢ酵素を
コードするｃａｒＡＢ遺伝子を保持するリコンビナント
プラスミドpEL-carAB-6を選択した。

【００５４】

【実施例２】新規ｃａｒＢ変異体の単離及び触媒特性に
対するＣＰＳａｓｅのアミノ酸配列置換の効果初めに、４０株の組換えB-6969（pEL-carAB-NN）クロー
ンで、ＣａｒＡＢ活性及びそのＵＭＰに対するフィード
バック耐性を、ＣａｒＡＢ及びＡｒｇＩ（オルニチンカ
ルバモイルトランスフェラーゼ）酵素により触媒され
る、オルニチンからのシトルリン生合成の反応において
評価した。反応の概要は以下の通りである。

【００５５】

【化１】 CarAB+ArgI NH₃+ HCO₃ ^-+ 2 MgATP + Orn Cit + 2MgADP + 2Pi

【００５６】この反応中、カルバモイルリン酸シンセタ
ーゼは、遊離のＮＨ₄ ⁺を基質として用いる。

【００５７】４０株のB-6969（pEL-carAB-NN）及びＴＧ
１（pUC18-argI）の細胞のタンパク質抽出物を、(NH₄)₂
SO₄（75％飽和）を用いた沈殿により、超音波処理を行
った粗細胞抽出液から調製した。タンパク質の沈殿物
は、以下の組成の緩衝液に溶解された。Tris-HCl(50m
M), pH7.5、2-メルカプトエタノール（2mM）。

【００５８】テスト系は、B-6969(pEL-carAB-NN）株及
びＴＧ１（pUC18-argI）のタンパク抽出物、及び、以下
の試薬を含む。ATP（8mM）、MgSO₄（8mM）、(NH4)₂SO₄
（200mM）、Na₂CO₃（8mM）及びオルニチン（1mM）、（p
H7.5）。

【００５９】反応混合液中のオルニチン及びシトルリン
含有量は、以下の組成の液相を用いてＴＬＣで解析し
た。イソプロパノール／酢酸エチル／水酸化アンモニウ
ム／Ｈ ₂Ｏ＝40/20/13/27（v/v）。

【００６０】活性を有し、かつＵＭＰに対するフィード
バック耐性である変異型ＣＰＳａｓｅを発現する９クロ
ーン、及び、単一置換Ｓｅｒ９４８Ｐｈｅを有するＣＰ
Ｓａｓｅを発現する１クローンを、変異酵素活性の計測
に用いた。

【００６１】前記１０クローンのプラスミドを精製し、
ダイデオキシチェーンターミネーション法を用いて、ｃ
ａｒＢ遺伝子のランダム化断片の配列を決定した（表
１）。次いで、これら９クローンのB-6969（pEL-carAB-
NN）及び１クローンのB-6969（pEL-carAB-6）のタンパ
ク抽出物を、グルタミン及びアンモニアからのカルバモ
イルリン酸（ＣＰ）合成反応における変異型ＣＰＳａｓ
ｅの活性及びｆｂｒを評価するために用いた。

【００６２】粗細胞抽出液は、0.5mlのバッファーＡ（2
00mM K₂HPO₄/KH₂PO₄、pH8.0、1mM EDTA、1mM PMSF、1mM
DTT）に懸濁した20mg湿細胞ペレットを超音波処理する
ことで調製し、６５％飽和に達する固形硫酸アンモニウ
ムで処理した。10分間４℃でインキュベートした後、懸
濁液を13,000rpmで10分間遠心し、沈殿物を１mlのバッ
ファーＢ（20mM K₂HPO₄/KH₂PO₄，pH8.0、50mM KCl、1mM
PMSF、1mM DTT）に溶解させた。得られたタンパク質抽
出物を、ＣＰＳａｓｅ活性の評価に用いた。反応の概要
は、以下のとおりである：

【００６３】

【化２】I. Gln + CO₂+ 2MgATP + H₂O → NH₂COOPO₃
^2-+ 2MgADP + Glu + Pi II. NH₃+ CO₂+ 2MgATP + H₂O → NH₂COOPO₃ ^2-+ 2MgA
DP + Pi

【００６４】50μlの各反応混合液は、以下のものを含
む。反応I：20mM tris-HCl、pH8.0、100mM KCl、5mM Na₂C
O₃、10mM ATP、10mM MgCl₂、5mMグルタミン、10μlタン
パク質抽出物、反応II：20mM tris-HCl、pH8.0、100mM KCl、5mM Na₂CO
₃、10mM ATP、10mM MgCl ₂、200mM (NH₄)₂SO₄、10μlタ
ンパク質抽出物。

【００６５】また、反応Iの系列を、ＣＰＳａｓｅのフ
ィードバック阻害レベルを評価するため、10mM UTP存在
下で行った。10分間37℃でインキュベーションを行った
後、等量のＥｔＯＨを加えて反応を停止させ、10分間-2
0℃に冷やし、室温で１分間13,000rpmで遠心を行った。
上清は-20℃に冷却した。

【００６６】反応混合液中のＣＰ含有量は、キャピラリ
ーゾーン電気泳動で解析した。分離は、Quanta 4000Eキ
ャピラリー電気泳動システム（「Waters」、ＵＳＡ）上
で、254nmのＵＶ非直接検出で行った。インジェクショ
ンは。静水圧で２５秒間行った。分離は、コートしてい
ない融合シリカキャピラリー（７５ｕ I.D．*60cm、有
効長53cm）で行い、-25kVの電位で操作した。温度は20
℃に維持した。分離緩衝液は、50mM Tris base、25mM安
息香酸（非直接検出の場合）pH8.5、0.25mM TTAB（tetr
adecyl-trimethyl-ammonium bromide）（電気浸透流の
逆流用）からなる。ＣＰ合成の反応における変異型ＣＰ
Ｓａｓｅの活性の測定値及びｆｂｒのデータを、表２に
示す。

【００６７】

【表２】表２変異ＣＰＳａｓｅの活性 ───────────────────────────────── 活性、（ＣＰ、nmol/mg^xmin）クローン──────────────────────────── 番号基質：5mM 基質：200mM 基質：5mM Gln；Ｇｌｎ (NH₄)₂SO₄ アロステリック因子：10mM UMP ───────────────────────────────── ｗｔ１３５０４２５１７０６３２０２２０３２０１０６９０２２５６２５１２５４０９５５４０１３３５０６０３５０２７７３０４００６７０３１１１２０３７５８１０３３５１０１５０５１０３４７６５３４５７６５３６３９０９０３９０３７４７５２０５４７５ ─────────────────────────────────

【００６８】このように、変異型ＣＰＳａｓｅは、本質
的にＵＭＰに非感受性であるが、単一変異は、酵素活性
を顕著に低下させた。これらの結果は、９４７位〜９５
１位のアミノ酸残基からなるペプチド断片は、ＵＭＰに
よるＣＰＳａｓｅのフィードバック阻害に関与し、変異
型ＣＰＳａｓｅの触媒効率のレベルにもまた関与してい
ることを示している。野生型ＣａｒＡＢ及び変異型Ｃａ
ｒＡＢ−３４をコードする遺伝子を、プラスミドpMW119
中にクローニングした。この目的のため、プラスミドpE
L-carAB-wt及びpEL-carAB-34を、制限酵素SacI及びＸba
Iで消化し（これらのプラスミドが２つのXbaIサイトを
持つため、部分処理した）、ｃａｒＡＢ遺伝子をコード
する断片を、あらかじめ同じ制限酵素で処理したpMW119
ベクター中にクローニングした。その結果、lacプロモ
ーター制御下にあるｃａｒＡＢ遺伝子を持つ、低コピー
数のpMW119carAB-wt及びpMW119carAB-34プラスミドが得
られた。

【００６９】

【実施例３】変異型ｃａｒＡＢ遺伝子を持つ株を用いた
オロト酸の生産３１１株は、ａｒｇＡ遺伝子にＴｎ１０が挿入されたエ
シェリヒア・コリＫ１２（VKPM B-3853）から、６−ア
ザウラシル（1mg/ml）耐性変異株として誘導された。３
１１株は、ルシアン・ナショナル・コレクション・フォ
ー・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（ＶＫ
ＰＭ）に、２００１年３月５日より受託番号VKPM B-808
5として寄託され、２００２年７月１７日にブダペスト
条約の規定にしたがって国際寄託に移管されている。

【００７０】３１１株を、pMW119carAB-wt及びpMW119ca
rAB-34プラスミドで形質転換し、得られた組換え株オロ
ト酸生産を、異なる濃度のウリジン存在下で調べた。

【００７１】以下の条件で試験管発酵を行った。1/20希
釈の一夜培養液、60g/Lグルコース、25g/L硫酸アンモニ
ウム、2g/L KH₂PO₄、1g/L MgSO₄、0.1mg/Lチアミン、5g
/Lイーストエクストラクト（Difco）、25 g/L炭酸カル
シウム、以上1Lの水道水中（pH7.2）。グルコース及び
炭酸カルシウムは別個に滅菌した。2mlの培地を試験管
に入れ、32℃で３日間振盪しながら培養を行った。オロ
ト酸生産のレベルは、HPLCにより評価した（表３）。

【００７２】

【表３】表３ 311(pMW119)、311(pMW119carAB-wt)、311(pMW119carAB-34)株におけるオロト酸生産レベル ──────────────────────────────────── 菌株ウリシ゛ン100 mg/L ウリシ゛ン300 mg/L ウリシ゛ン1000 mg/L A₅₅₀, オロト酸 A₅₅₀, オロト酸 A₅₅₀, オロト酸 o.u. 生合成 o.u. 生合成 o.u. 生合成 g/L g/L g/L ──────────────────────────────────── 311(pMW119) 13.1 0.12 13.8 0.11 9.0 0.01 311(pMW-CarAB-wt) 11.4 0.27 12.2 0.18 9.8 0.03 311(pMW-CarAB-34) 12.6 0.66 12.7 0.40 10.3 0.11 ────────────────────────────────────

【００７３】表３に示すように、変異ｃａｒＡＢ遺伝子
を保持する311（pMW119carAB-34）株は、親株311(pMW11
9)株及び野生型ｃａｒＡＢ遺伝子を保持する311(pMW119
carAB-wt)株に比べ、多くのオロト酸を生産した。

【００７４】

【実施例４】変異ｃａｒＡＢ遺伝子を保持する株を用い
たアルギニン及び／又はシトルリンの生産アルギニン生産株である３３３株及び３７４株は、トラ
ンスポゾンTn5がilvA遺伝子に挿入されたエシェリヒア
・コリ５７株（VKPM B-7386）の誘導体から、６−アザ
ウラシル（1mg/ml）に耐性な変異株として選択された。
３３３株及び３７４株は、ルシアン・ナショナル・コレ
クション・フォー・インダストリアル・マイクロオーガ
ニズムスロシア（ＶＫＰＭ）に、２００１年３月５日よ
り、それぞれ受託番号VKPM B-8084及びVKPM B-8086とし
て寄託され、各々２００２年７月１７日にブダペスト条
約の規定にしたがって国際寄託に移管されている。

【００７５】３３３株及び３７４株を、プラスミドpMWc
arAB-wt及びpMWcarAB-34で形質転換し、それらの組換え
株のアルギニン及びシトルリンの生産を調べた。試験管
発酵は、実施例３と同じ方法で行った。100mg/Lのウリ
ジンを含む合成培地での333(pMWcarAB-wt)株及び333(pM
WcarAB-34)株のアルギニン及び／又はシトルリンの生産
量を、表４に示す。

【００７６】

【表４】表４ 333(pMWcarAB-wt)株及び333(pMWcarAB-34)株によるアルギニン及び／またはシトルリンの生産レベル ──────────────────────────────────── 菌株吸光度, アルキ゛ニンシトルリンアルキ゛ニン＋シトルリン A₅₆₀, u. 生合成レヘ゛ル生合成レヘ゛ル g/L g/L g/L ──────────────────────────────────── 333(pMW-CarABwt) 24.1 0.60 0.39 0.99 333(pMW-CarAB-34) 20.5 1.01 0.51 1.52 ────────────────────────────────────

【００７７】100mg/Lのウリジンを含む合成培地での374
(pMWcarAB-wt)株及び374(pMWcarAB-34)株によるシトル
リン生産レベルを、表５に示す。

【００７８】

【表５】表５ 374(pMWcarAB-wt)株及び374(pMWcarAB-34)株によるシトルリン産生レベル ──────────────────────────────── 菌株吸光度 A560, u. シトルリン生合成レヘ゛ル, g/L ──────────────────────────────── 374(pMW-CarABwt) 22.3 <0.01 374(pMW-CarAB-34) 15.5 0.26 ────────────────────────────────

【００７９】表４に示されるように、変異型ｃａｒＡＢ
遺伝子を保持する333(pMWcarAB-34)株は、野生型ｃａｒ
ＡＢ遺伝子を保持する株に比べて、多くのアルギニン及
びシトルリンを生産した。また、表５に示されるよう
に、374(pMWcarAB-34)株は、野生型ｃａｒＡＢ遺伝子を
保持する株よりも多くのシトルリンを生産した。

【００８０】

【発明の効果】本発明により、フィードバック阻害が脱
感作され、かつ、高い活性を維持する変異型カルバモイ
ルリン酸シンセターゼが提供される。同酵素を保持する
エシェリヒア属細菌は、発酵法によるＬ−アルギニン、
シトルリン及びピリミジン誘導体の効率的な製造に好適
に利用することができる。

【００８１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ajinomoto Co., Inc.（味の素株式会社） <120> New Mutant Carbamoylphosphate Synthetase and Method for Producing Compounds Derived from Carbamoylphosphate <130> P-9995F <140> <141> 2002-07-30 <150> 2001121697 <151> 2001-08-03 <160> 33 <170> PatentIn Ver. 2.10 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence en coded by random sequence <400> 1 Pro Leu Arg Glu Gly 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence en coded by random sequence <400> 2 Ala Val Ala Leu Lys 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence en coded by random sequence <400> 3 Gly Val Phe Leu Met 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence en coded by random sequence <400> 4 Phe Phe Cys Phe Gly 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence en coded by random sequence <400> 5 Pro Thr Gly Arg Arg 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence en coded by random sequence <400> 6 Phe Ala Cys Gly Val 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence en coded by random sequence <400> 7 Val Phe Gly Ser Ser 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence en coded by random sequence <400> 8 Ala Ser Gly Val Glu 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence en coded by random sequence <400> 9 Ala Phe Cys Gly Val 1 5 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: random sequence <400> 10 cctctccgtg agggt 15 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: random sequence <400> 11 gctgtcgctt tgaaa 15 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: random sequence <400> 12 ggtgtcttcc taatg 15 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: random sequence <400> 13 tttttctgtt ttggg 15 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: random sequence <400> 14 cctaccggta ggaga 15 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: random sequence <400> 15 ttcgcctgtg gggtg 15 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: random sequence <400> 16 gttttcggta gtagt 15 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: random sequence ＜４００＞１７ｇｃｔｔｃｃｇｇｃｇｔｔｇａｇ
１５＜２１０＞１８＜２１１＞１５＜２１２＞ＤＮＡ＜２１３＞ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ＜２２０＞＜２２３＞ＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕ
ｅｎｃｅ：ｒａｎｄｏｍｓｅｑｕｅｎｃｅ＜４００＞１８ｇｃｃｔｔｃｔｇｔｇｇｇｇｔｇ
１５＜２１０＞１９＜２１１＞３２２２＜２１２＞ＤＮＡ＜２１３＞Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ＜２２０＞＜２２１＞ＣＤＳ＜２２２＞（１）．．（３２２２）＜４００＞１９ａｔｇｃｃａａａａｃｇｔａｃａｇａｔａｔａａａａａｇｔａｔｃｃｔｇ
ａｔｔｃｔｇｇｇｔｇｃｇｇｇｃｃｃｇａｔｔｇｔｔａｔｃ６０ｇｇｔｃａｇｇｃｇｔｇｔｇａｇｔｔｔｇａｃｔａｃｔｃｔｇｇｃｇｃｇ
ｃａａｇｃｇｔｇｔａａａｇｃｃｃｔｇｃｇｔｇａａｇａｇ１２０ｇｇｔｔａｃｃｇｃｇｔｃａｔｔｃｔｇｇｔｇａａｃｔｃｃａａｃｃｃｇ
ｇｃｇａｃｃａｔｃａｔｇａｃｃｇａｃｃｃｇｇａａａｔｇ１８０ｇｃｔｇａｔｇｃａａｃｃｔａｃａｔｃｇａｇｃｃｇａｔｔｃａｃｔｇｇ
ｇａａｇｔｔｇｔａｃｇｃａａｇａｔｔａｔｔｇａａａａａ２４０ gagctggaac gtcagggcgt gttggaagag ttcggtgtca ccatgattgg tgccactgcc 360 gatgcgattg ataaagcaga agaccgccgt cgtttcgacg tagcgatgaa gaaaattggt 420 ctggaaaccg cgcgttccgg tatcgcacac acgatggaag aagcgctggc ggttgccgct 480 gacgtgggct tcccgtgcat tattcgccca tcctttacca tgggcggtag cggcggcggt 540 atcgcttata accgtgaaga gtttgaagaa atttgcgccc gcggtctgga tctctctccg 600 accaaagagt tgctgattga tgagtcgctg atcggctgga aagagtacga gatggaagtg 660 gtgcgtgata aaaacgacaa ctgcatcatc gtctgctcta tcgaaaactt cgatgcgatg 720 ggcatccaca ccggtgactc catcactgtc gcgccagccc aaacgctgac cgacaaagaa 780 tatcaaatca tgcgtaacgc ctcgatggcg gtgctgcgtg aaatcggcgt tgaaaccggt 840 ggttccaacg ttcagtttgc ggtgaacccg aaaaacggtc gtctgattgt tatcgaaatg 900 aacccacgcg tgtcccgttc ttcggcgctg gcgtcgaaag cgaccggttt cccgattgct 960 aaagtggcgg cgaaactggc ggtgggttac accctcgacg aactgatgaa cgacatcact 1020 ggcggacgta ctccggcctc cttcgagccg tccatcgact atgtggttac taaaattcct 1080 cgcttcaact tcgaaaaatt cgccggtgct aacgaccgtc tgaccactca gatgaaatcg 1140 gttggcgaag tgatggcgat tggtcgcacg cagcaggaat ccctgcaaaa agcgctgcgc 1200 ggcctggaag tcggtgcgac tggattcgac ccgaaagtga gcctggatga cccggaagcg 1260 ttaaccaaaa tccgtcgcga actgaaagac gcaggcgcag atcgtatctg gtacatcgcc 1320 gatgcgttcc gtgcgggcct gtctgtggac ggcgtcttca acctgaccaa cattgaccgc 1380 tggttcctgg tacagattga agagctggtg cgtctggaag agaaagtggc ggaagtgggc 1440 atcactggcc tgaacgctga cttcctgcgc cagctgaaac gcaaaggctt tgccgatgcg 1500 cgcttggcaa aactggcggg cgtacgcgaa gcggaaatcc gtaagctgcg tgaccagtat 1560 gacctgcacc cggtttataa gcgcgtggat acctgtgcgg cagagttcgc caccgacacc 1620 gcttacatgt actccactta tgaagaagag tgcgaagcga atccgtctac cgaccgtgaa 1680 aaaatcatgg tgcttggcgg cggcccgaac cgtatcggtc agggtatcga attcgactac 1740 tgttgcgtac acgcctcgct ggcgctgcgc gaagacggtt acgaaaccat tatggttaac 1800 tgtaacccgg aaaccgtctc caccgactac gacacttccg accgcctcta cttcgagccg 1860 gtaactctgg aagatgtgct ggaaatcgtg cgtatcgaga agccgaaagg cgttatcgtc 1920 cagtacggcg gtcagacccc gctgaaactg gcgcgcgcgc tggaagctgc tggcgtaccg 1980 gttatcggca ccagcccgga tgctatcgac cgtgcagaag accgtgaacg cttccagcat 2040 gcggttgagc gtctgaaact gaaacaaccg gcgaacgcca ccgttaccgc tattgaaatg 2100 gcggtagaga aggcgaaaga gattggctac ccgctggtgg tacgtccgtc ttacgttctc 2160 ggcggtcggg cgatggaaat cgtctatgac gaagctgacc tgcgtcgcta cttccagacg 2220 gcggtcagcg tgtctaacga tgcgccagtg ttgctggacc acttcctcga tgacgcggta 2280 gaagttgacg tggatgccat ctgcgacggc gaaatggtgc tgattggcgg catcatggag 2340 catattgagc aggcgggcgt gcactccggt gactccgcat gttctctgcc agcctacacc 2400 ttaagtcagg aaattcagga tgtgatgcgc cagcaggtgc agaaactggc cttcgaattg 2460 caggtgcgcg gcctgatgaa cgtgcagttt gcggtgaaaa acaacgaagt ctacctgatt 2520 gaagttaacc cgcgtgcggc gcgtaccgtt ccgttcgtct ccaaagccac cggcgtaccg 2580 ctggcaaaag tggcggcgcg cgtgatggct ggcaaatcgc tggctgagca gggcgtaacc 2640 aaagaagtta tcccgccgta ctactcggtg aaagaagtgg tgctgccgtt caataaattc 2700 ccgggcgttg acccgctgtt agggccagaa atgcgctcta ccggggaagt catgggcgtg 2760 ggccgcacct tcgctgaagc gtttgccaaa gcgcagctgg gcagcaactc caccatgaag 2820 aaacacggtc gtgcgctgct ttccgtgcgc gaaggcgata aagaacgcgt ggtggacctg 2880 gcggcaaaac tgctgaaaca gggcttcgag ctggatgcga cccacggcac ggcgattgtg 2940 ctgggcgaag caggtatcaa cccgcgtctg gtaaacaagg tgcatgaagg ccgtccgcac 3000 attcaggacc gtatcaagaa tggcgaatat acctacatca tcaacaccac ctcaggccgt 3060 cgtgcgattg aagactcccg cgtgattcgt cgcagtgcgc tgcaatataa agtgcattac 3120 gacaccaccc tgaacggcgg ctttgccacc gcgatggcgc tgaatgccga tgcgactgaa 3180 aaagtaattt cggtgcagga aatgcacgca cagatcaaat aa 3222 <210> 20 <211> 1074 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 20 Met Pro Lys Arg Thr Asp Ile Lys Ser Ile Leu Ile Leu Gly Ala Gly 1 5 10 15 Pro Ile Val Ile Gly Gln Ala Cys Glu Phe Asp Tyr Ser Gly Ala Gln 20 25 30 Ala Cys Lys Ala Leu Arg Glu Glu Gly Tyr Arg Val Ile Leu Val Asn 35 40 45 Ser Asn Pro Ala Thr Ile Met Thr Asp Pro Glu Met Ala Asp Ala Thr 50 55 60 Tyr Ile Glu Pro Ile His Trp Glu Val Val Arg Lys Ile Ile Glu Lys 65 70 75 80 Glu Arg Pro Asp Ala Val Leu Pro Thr Met Gly Gly Gln Thr Ala Leu 85 90 95 Asn Cys Ala Leu Glu Leu Glu Arg Gln Gly Val Leu Glu Glu Phe Gly 100 105 110 Val Thr Met Ile Gly Ala Thr Ala Asp Ala Ile Asp Lys Ala Glu Asp 115 120 125 Arg Arg Arg Phe Asp Val Ala Met Lys Lys Ile Gly Leu Glu Thr Ala 130 135 140 Arg Ser Gly Ile Ala His Thr Met Glu Glu Ala Leu Ala Val Ala Ala 145 150 155 160 Asp Val Gly Phe Pro Cys Ile Ile Arg Pro Ser Phe Thr Met Gly Gly 165 170 175 Ser Gly Gly Gly Ile Ala Tyr Asn Arg Glu Glu Phe Glu Glu Ile Cys 180 185 190 Ala Arg Gly Leu Asp Leu Ser Pro Thr Lys Glu Leu Leu Ile Asp Glu 195 200 205 Ser Leu Ile Gly Trp Lys Glu Tyr Glu Met Glu Val Val Arg Asp Lys 210 215 220 Asn Asp Asn Cys Ile Ile Val Cys Ser Ile Glu Asn Phe Asp Ala Met 225 230 235 240 Gly Ile His Thr Gly Asp Ser Ile Thr Val Ala Pro Ala Gln Thr Leu 245 250 255 Thr Asp Lys Glu Tyr Gln Ile Met Arg Asn Ala Ser Met Ala Val Leu 260 265 270 Arg Glu Ile Gly Val Glu Thr Gly Gly Ser Asn Val Gln Phe Ala Val 275 280 285 Asn Pro Lys Asn Gly Arg Leu Ile Val Ile Glu Met Asn Pro Arg Val 290 295 300 Ser Arg Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Ala Thr Gly Phe Pro Ile Ala 305 310 315 320 Lys Val Ala Ala Lys Leu Ala Val Gly Tyr Thr Leu Asp Glu Leu Met 325 330 335 Asn Asp Ile Thr Gly Gly Arg Thr Pro Ala Ser Phe Glu Pro Ser Ile 340 345 350 Asp Tyr Val Val Thr Lys Ile Pro Arg Phe Asn Phe Glu Lys Phe Ala 355 360 365 Gly Ala Asn Asp Arg Leu Thr Thr Gln Met Lys Ser Val Gly Glu Val 370 375 380 Met Ala Ile Gly Arg Thr Gln Gln Glu Ser Leu Gln Lys Ala Leu Arg 385 390 395 400 Gly Leu Glu Val Gly Ala Thr Gly Phe Asp Pro Lys Val Ser Leu Asp 405 410 415 Asp Pro Glu Ala Leu Thr Lys Ile Arg Arg Glu Leu Lys Asp Ala Gly 420 425 430 Ala Asp Arg Ile Trp Tyr Ile Ala Asp Ala Phe Arg Ala Gly Leu Ser 435 440 445 Val Asp Gly Val Phe Asn Leu Thr Asn Ile Asp Arg Trp Phe Leu Val 450 455 460 Gln Ile Glu Glu Leu Val Arg Leu Glu Glu Lys Val Ala Glu Val Gly 465 470 475 480 Ile Thr Gly Leu Asn Ala Asp Phe Leu Arg Gln Leu Lys Arg Lys Gly 485 490 495 Phe Ala Asp Ala Arg Leu Ala Lys Leu Ala Gly Val Arg Glu Ala Glu 500 505 510 Ile Arg Lys Leu Arg Asp Gln Tyr Asp Leu His Pro Val Tyr Lys Arg 515 520 525 Val Asp Thr Cys Ala Ala Glu Phe Ala Thr Asp Thr Ala Tyr Met Tyr 530 535 540 Ser Thr Tyr Glu Glu Glu Cys Glu Ala Asn Pro Ser Thr Asp Arg Glu 545 550 555 560 Lys Ile Met Val Leu Gly Gly Gly Pro Asn Arg Ile Gly Gln Gly Ile 565 570 575 Glu Phe Asp Tyr Cys Cys Val His Ala Ser Leu Ala Leu Arg Glu Asp 580 585 590 Gly Tyr Glu Thr Ile Met Val Asn Cys Asn Pro Glu Thr Val Ser Thr 595 600 605 Asp Tyr Asp Thr Ser Asp Arg Leu Tyr Phe Glu Pro Val Thr Leu Glu 610 615 620 Asp Val Leu Glu Ile Val Arg Ile Glu Lys Pro Lys Gly Val Ile Val 625 630 635 640 Gln Tyr Gly Gly Gln Thr Pro Leu Lys Leu Ala Arg Ala Leu Glu Ala 645 650 655 Ala Gly Val Pro Val Ile Gly Thr Ser Pro Asp Ala Ile Asp Arg Ala 660 665 670 Glu Asp Arg Glu Arg Phe Gln His Ala Val Glu Arg Leu Lys Leu Lys 675 680 685 Gln Pro Ala Asn Ala Thr Val Thr Ala Ile Glu Met Ala Val Glu Lys 690 695 700 Ala Lys Glu Ile Gly Tyr Pro Leu Val Val Arg Pro Ser Tyr Val Leu 705 710 715 720 Gly Gly Arg Ala Met Glu Ile Val Tyr Asp Glu Ala Asp Leu Arg Arg 725 730 735 Tyr Phe Gln Thr Ala Val Ser Val Ser Asn Asp Ala Pro Val Leu Leu 740 745 750 Asp His Phe Leu Asp Asp Ala Val Glu Val Asp Val Asp Ala Ile Cys 755 760 765 Asp Gly Glu Met Val Leu Ile Gly Gly Ile Met Glu His Ile Glu Gln 770 775 780 Ala Gly Val His Ser Gly Asp Ser Ala Cys Ser Leu Pro Ala Tyr Thr 785 790 795 800 Leu Ser Gln Glu Ile Gln Asp Val Met Arg Gln Gln Val Gln Lys Leu 805 810 815 Ala Phe Glu Leu Gln Val Arg Gly Leu Met Asn Val Gln Phe Ala Val 820 825 830 Lys Asn Asn Glu Val Tyr Leu Ile Glu Val Asn Pro Arg Ala Ala Arg 835 840 845 Thr Val Pro Phe Val Ser Lys Ala Thr Gly Val Pro Leu Ala Lys Val 850 855 860 Ala Ala Arg Val Met Ala Gly Lys Ser Leu Ala Glu Gln Gly Val Thr 865 870 875 880 Lys Glu Val Ile Pro Pro Tyr Tyr Ser Val Lys Glu Val Val Leu Pro 885 890 895 Phe Asn Lys Phe Pro Gly Val Asp Pro Leu Leu Gly Pro Glu Met Arg 900 905 910 Ser Thr Gly Glu Val Met Gly Val Gly Arg Thr Phe Ala Glu Ala Phe 915 920 925 Ala Lys Ala Gln Leu Gly Ser Asn Ser Thr Met Lys Lys His Gly Arg 930 935 940 Ala Leu Leu Ser Val Arg Glu Gly Asp Lys Glu Arg Val Val Asp Leu 945 950 955 960 Ala Ala Lys Leu Leu Lys Gln Gly Phe Glu Leu Asp Ala Thr His Gly 965 970 975 Thr Ala Ile Val Leu Gly Glu Ala Gly Ile Asn Pro Arg Leu Val Asn 980 985 990 Lys Val His Glu Gly Arg Pro His Ile Gln Asp Arg Ile Lys Asn Gly 995 1000 1005 Glu Tyr Thr Tyr Ile Ile Asn Thr Thr Ser Gly Arg Arg Ala Ile Glu 1010 1015 1020 Asp Ser Arg Val Ile Arg Arg Ser Ala Leu Gln Tyr Lys Val His Tyr 1025 1030 1035 1040 Asp Thr Thr Leu Asn Gly Gly Phe Ala Thr Ala Met Ala Leu Asn Ala 1045 1050 1055 Asp Ala Thr Glu Lys Val Ile Ser Val Gln Glu Met His Ala Gln Ile 1060 1065 1070 Lys <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 21 accagatctg cgggcagtga gcgcaacgc 29 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 22 gtttctagat cctgtgtgaa attgttatcc gc 32 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 23 cctctagaaa taaagtgagt gaatattc 28 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 24 cttagcggtt ttacggtact gc 22 <210> 25 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <220> <221> unsure <222> (13,14,16,19,20,21,22,23,25,26) <223> n=a or g or c or t <400> 25 ggtcgtgcgc tgnnynycnn ynnnrnnggc gataaagaac gcgtggtg 48 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 26 ccacttcctc gatgacgcgg 20 <210> 27 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 27 cgtgcgctgc ttttcgtgcg cgaaggcgat aaag 34 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence en coded by wild type carB gene <400> 28 Leu Ser Val Arg Glu 1 5 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: partial amino acid sequence en coded by carB gene having single mutation <400> 29 Leu Phe Val Arg Glu 1 5 <210> 30 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 30 ctttccgtgc gcgaa 15 <210> 31 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 31 cttttcgtgc gcgaa 15 <210> 32 <211> 1149 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 32 ttgattaagt cagcgctatt ggttctggaa gacggaaccc agtttcacgg tcgggccata 60 ggggcaacag gttcggcggt tggggaagtc gttttcaata cttcaatgac cggttatcaa 120 gaaatcctca ctgatccttc ctattctcgt caaatcgtta ctcttactta tccccatatt 180 ggcaatgtcg gcaccaatga cgccgatgaa gaatcttctc aggtacatgc acaaggtctg 240 gtgattcgcg acctgccgct gattgccagc aacttccgta ataccgaaga cctctcttct 300 tacctgaaac gccataacat cgtggcgatt gccgatatcg atacccgtaa gctgacgcgt 360 ttactgcgcg agaaaggcgc acagaatggc tgcattatcg cgggcgataa cccggatgcg 420 gcgctggcgt tagaaaaagc ccgcgcgttc ccaggtctga atggcatgga tctggcaaaa 480 gaagtgacca ccgcagaagc ctatagctgg acacaaggga gctggacgtt gaccggtggc 540 ctgccagaag cgaaaaaaga agacgagctg ccgttccacg tcgtggctta tgattttggt 600 gccaagcgca acatcctgcg gatgctggtg gatagaggct gtcgcctgac catcgttccg 660 gcgcaaactt ctgcggaaga tgtgctgaaa atgaatccag acggcatctt cctctccaac 720 ggtcctggcg acccggcccc gtgcgattac gccattaccg ccatccagaa attcctcgaa 780 accgatattc cggtattcgg catctgtctc ggtcatcagc tgctggcgct ggcgagcggt 840 gcgaagactg tcaaaatgaa atttggtcac cacggcggca accatccggt taaagatgtg 900 gagaaaaacg tggtaatgat caccgcccag aaccacggtt ttgcggtgga cgaagcaaca 960 ttacctgcaa acctgcgtgt cacgcataaa tccctgttcg acggtacgtt acagggcatt 1020 catcgcaccg ataaaccggc attcagcttc caggggcacc ctgaagccag ccctggtcca 1080 cacgacgccg cgccgttgtt cgaccacttt atcgagttaa ttgagcagta ccgtaaaacc 1140 gctaagtaa 1149 <210> 33 <211> 382 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 33 Leu Ile Lys Ser Ala Leu Leu Val Leu Glu Asp Gly Thr Gln Phe His 1 5 10 15 Gly Arg Ala Ile Gly Ala Thr Gly Ser Ala Val Gly Glu Val Val Phe 20 25 30 Asn Thr Ser Met Thr Gly Tyr Gln Glu Ile Leu Thr Asp Pro Ser Tyr 35 40 45 Ser Arg Gln Ile Val Thr Leu Thr Tyr Pro His Ile Gly Asn Val Gly 50 55 60 Thr Asn Asp Ala Asp Glu Glu Ser Ser Gln Val His Ala Gln Gly Leu 65 70 75 80 Val Ile Arg Asp Leu Pro Leu Ile Ala Ser Asn Phe Arg Asn Thr Glu 85 90 95 Asp Leu Ser Ser Tyr Leu Lys Arg His Asn Ile Val Ala Ile Ala Asp 100 105 110 Ile Asp Thr Arg Lys Leu Thr Arg Leu Leu Arg Glu Lys Gly Ala Gln 115 120 125 Asn Gly Cys Ile Ile Ala Gly Asp Asn Pro Asp Ala Ala Leu Ala Leu 130 135 140 Glu Lys Ala Arg Ala Phe Pro Gly Leu Asn Gly Met Asp Leu Ala Lys 145 150 155 160 Glu Val Thr Thr Ala Glu Ala Tyr Ser Trp Thr Gln Gly Ser Trp Thr 165 170 175 Leu Thr Gly Gly Leu Pro Glu Ala Lys Lys Glu Asp Glu Leu Pro Phe 180 185 190 His Val Val Ala Tyr Asp Phe Gly Ala Lys Arg Asn Ile Leu Arg Met 195 200 205 Leu Val Asp Arg Gly Cys Arg Leu Thr Ile Val Pro Ala Gln Thr Ser 210 215 220 Ala Glu Asp Val Leu Lys Met Asn Pro Asp Gly Ile Phe Leu Ser Asn 225 230 235 240 Gly Pro Gly Asp Pro Ala Pro Cys Asp Tyr Ala Ile Thr Ala Ile Gln 245 250 255 Lys Phe Leu Glu Thr Asp Ile Pro Val Phe Gly Ile Cys Leu Gly His 260 265 270 Gln Leu Leu Ala Leu Ala Ser Gly Ala Lys Thr Val Lys Met Lys Phe 275 280 285 Gly His His Gly Gly Asn His Pro Val Lys Asp Val Glu Lys Asn Val 290 295 300 Val Met Ile Thr Ala Gln Asn His Gly Phe Ala Val Asp Glu Ala Thr 305 310 315 320 Leu Pro Ala Asn Leu Arg Val Thr His Lys Ser Leu Phe Asp Gly Thr 325 330 335 Leu Gln Gly Ile His Arg Thr Asp Lys Pro Ala Phe Ser Phe Gln Gly 340 345 350 His Pro Glu Ala Ser Pro Gly Pro His Asp Ala Ala Pro Leu Phe Asp 355 360 365 His Phe Ile Glu Leu Ile Glu Gln Tyr Arg Lys Thr Ala Lys 370 375 380

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドpEL-carAB-wtの構築のスキームを
示す。

【図２】変異型ｃａｒＢ遺伝子のプールの構築のスキ
ームを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｐ 19/28 19/28 19/30 19/30 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者イリナボリソヴナアリトマンロシア連邦、119435、モスクワ市、バリシャヤピロゴフスカヤ通り35Ａ番地、62号室 (72)発明者アンナエヴゲニエヴナノヴィコヴァロシア連邦、142432、モスクワ州、ノギンスキ区、チェルノゴロフカ村、ペルヴァヤ通り17／１番地、４号室 (72)発明者ヴェロニカアレクサンドロヴナコトリゥャロヴァロシア連邦、117574、モスクワ市、ヴィリニュスカヤ通り６番地、129号室 (72)発明者ミハイルマルコヴィッチグシャチネルロシア連邦、113646、モスクワ市、セヴェルノエチェルタノヴォ４番地、403号棟、217号室 (72)発明者ユリヤゲオルギエヴナロストヴァロシア連邦、117454、モスクワ市、ヴェルナツキ通り64Ａ番地、40号室 (72)発明者タチヤナアブラモヴナヤンポリスカヤロシア連邦、123364、モスクワ市、ロドチナヤ通り31番地、５号棟、77号室Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA07 BA71 BA80 CA02 CA06 DA06 EA04 FA02 FA17 GA11 GA19 GA25 HA01 4B050 CC04 DD02 FF03E LL02 LL05 4B064 AE24 AE27 AE49 AF22 AF23 CC24 DA10 4B065 AA26X AA26Y AB01 AC14 BA02 BA25 CA17 CA19 CA23

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号２０の９４７位〜９５１位に相
当するアミノ酸配列が、配列番号１〜９のアミノ酸配列
のいずれかと置換され、かつ、ウリジン５'−一リン酸
によるフィードバック阻害が脱感作されたカルバモイル
リン酸シンセターゼの大サブユニット。
【請求項２】野生型カルバモイルリン酸シンセターゼ
がエシェリヒア・コリ由来である請求項１に記載のカル
バモイルリン酸シンセターゼの大サブユニット。
【請求項３】配列番号２０の９４７位〜９５１位のア
ミノ酸配列が配列番号１〜９のアミノ酸配列のいずれか
と置換され、ウリジン５'−一リン酸によりフィードバ
ック阻害が脱感作された、請求項１に記載のカルバモイ
ルリン酸シンセターゼの大サブユニット。
【請求項４】９４７位〜９５１位以外の一または複数
の位置における、一または複数のアミノ酸の欠失、置
換、挿入または付加を有し、かつ、ウリジン５'−一リ
ン酸によるフィードバック阻害が脱感作された、請求項
１に記載のカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユ
ニット。
【請求項５】請求項１〜４のいずれか一項に記載のカ
ルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットを含
む、カルバモイルリン酸シンセターゼ。
【請求項６】請求項１〜４のいずれか一項に記載のウ
リジン５'−一リン酸によるフィードバック阻害が脱感
作されたカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニ
ットをコードするＤＮＡ。
【請求項７】請求項１〜４のいずれか一項に記載のウ
リジン５'−一リン酸によるフィードバック阻害が脱感
作されたカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニ
ットと、エシェリヒア・コリのカルバモイルリン酸シン
セターゼの小サブユニットをコードするＤＮＡ。
【請求項８】請求項６又は７に記載のＤＮＡを保持す
るエシェリヒア属細菌。
【請求項９】Ｌ−アルギニン、シトルリン及びピリミ
ジン誘導体からなる群より選択される化合物を生産する
能力を有する請求項８に記載の細菌。
【請求項１０】ピリミジン誘導体がオロト酸、ウリジ
ン、ウリジン５'−一リン酸、シチジン及びシチジン５'
−一リン酸である、請求項９に記載の細菌。
【請求項１１】請求項８〜１０いずれか一項に記載の
細菌を培地で培養し、同培地中にＬ−アルギニン、シト
ルリン及びピリミジン誘導体からなる群より選択される
化合物を生成、蓄積させ、該培養液より前記化合物を回
収する、Ｌ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘
導体からなる群より選択される化合物の製造方法。
【請求項１２】前記ピリミジン誘導体が、オロト酸、
ウリジン、ウリジン５'−一リン酸、シチジン及びシチ
ジン５'−一リン酸である、請求項１１に記載の製造方
法。