JP4207484B2 - 新規変異型カルバモイルリン酸シンセターゼ、及びカルバモイルリン酸より誘導される化合物の製造方法 - Google Patents
新規変異型カルバモイルリン酸シンセターゼ、及びカルバモイルリン酸より誘導される化合物の製造方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物工業、特にカルバモイルリン酸より誘導される化合物に関わる。特に、アルギニン、シトルリン、及び、オロト酸、ウリジン、ウリジン５’−一リン酸（ＵＭＰ）、シチジン、シチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）を含むピリミジン誘導体のような、カルバモイルリン酸シンセターゼより誘導される化合物を生産するエシェリヒア・コリ（E. coli）菌株の、アルギニン及びピリミジンの生合成経路に関与する新規フィードバック耐性酵素の利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エシェリヒア・コリ（E. coli）のカルバモイルリン酸シンセターゼ（ＣＰＳａｓｅ）は、重炭酸、グルタミン及び２分子のＭｇ−ＡＴＰからカルバモイルリン酸（ＣＰ）を合成し、グルタミン酸、燐酸、及び２分子のＭｇ−ＡＤＰを放出する複合反応を触媒する（Meister A., Advan. Enzymol.Mol.Biol., vol. 62, p.315-374, 1989）。
【０００３】
ＣＰの合成は、２つの生合成経路、すなわちピリミジンヌクレオチド及びアルギニンの合成経路の中間体である。前者の経路においては、ＣＰはアスパラギン酸カルバモイルトランスフェラーゼ（ＡＴＣａｓｅ）に結合し、結果として２段階でオロト酸を生成する。オロト酸は、ウラシルのようなピリミジン；オロチジン、ウリジン、及びシチジンのようなピリミジンヌクレオシド；ならびにオロチジン５’−一リン酸（ＯＭＰ）、ＵＭＰ、及びＣＭＰのようなピリミジンヌクレオチドを含むピリミジン誘導体の生合成に重要な代謝中間体である。多くの細菌では、発酵の間、培養液中にオロト酸が存在すると、ピリミジン誘導体、すなわちウラシルの生成と蓄積を適度に補助することが示されている（米国特許3,214,344）。後者の経路では、ＣＰは、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＴＣａｓｅ）を介してオルニチンに結合し、アルギニン生合成経路においてグルタミン酸から始まる６番目の段階を構成する。
【０００４】
ＣＰＳａｓｅはオルチニン及びＩＭＰ（プリンヌクレオチドの前駆体の一つ）により活性化され、そしてＵＭＰにより不活性化される。カルバモイルリン酸シンセターゼは、２つのサブユニットからなっている。コリネ型細菌（EP1026247A1）、エシェリヒア（Escherichia）属及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌については、これらのサブユニットはｃａｒＡ及びｃａｒＢ遺伝子によりコードされていることが知られている。ｃａｒＡＢオペロンの転写は、両経路の最終産物により集積的に抑制される（Charlier D., et al., J. Mol. Biol., vol.226, p.367-386, 1992; Wang H., et al., J. Mol. Biol., vol.277, p805-824, 1998; Glansdorff N., et al., Paths to Pyrimidines, vol.6, p. 53-62, 1998）。
【０００５】
天然のエシェリヒア・コリのＣＰＳａｓｅは、それぞれｃａｒＡ遺伝子及びｃａｒＢ遺伝子によりコードされる41,270Daの小サブユニットと117,710Daの大サブユニットからなるヘテロダイマーである。小サブユニットはグルタミンの加水分解を触媒し、ＣＰ合成が実際に起こる大サブユニットへのNH3の移動に関与する。大サブユニットは、基質、すなわち重炭酸、アンモニアに対する結合部位、Ｍｇ−ＡＴＰａｓｅに対する異なる２つの結合部位、及び、調節ドメインを構成する18kDaのカルボキシ末端を含む（Rubio V., et al.,Biochemistry, vol.30, p.1068-1075, 1991; Cervera I., et al., Biochemistry, vol. 35, p.7247-7255, 1996）。
また、大サブユニットは、単独でカルバモイルリン酸の合成反応を触媒する活性を有することが示唆されている（Stephen D. Rubino et al., J. Biol. Chem., 206, 4382-4386, 1987）。
【０００６】
ＣＰＳａｓｅのアロステリックに活性化された形態の結晶構造が、最近報告されている（Thoden J., et al., Biochemistry, vol.36, p. 6305-6316, 1997; Thoden J., et al., Acta Crystallogr.Sec.D., vol. 55, p. 8-24, 1999）。大サブユニットの中のＡ、Ｂ、Ｃと名付けられた最初の３つの個々のドメインは、構造が非常に類似している。しかし４つ目のドメインは全く異なっている。このＤドメイン（９３７〜１０７３位）は、結合と、ＩＭＰ、ＵＭＰ及びオルニチンの各因子によるアロステリックな制御に関与している。また、セリン９４８及びスレオニン１０４２の２つの残基も、ＣＰＳａｓｅのアロステリックな制御に重要と考えられることが示されている（Delannary S., et al., J. Mol. Biol., vol.286, p.1217-1228, 1999）。セリン９４８がフェニルアラニンで置換されると、当該酵素はＵＭＰ及びＩＭＰに非感受性となるが、活性化の程度は減少するものの、オルニチンにより依然として活性化される。Ｔ１０４２Ｉ変異を有する酵素は、オルニチンによる活性化が大きく減少する。
【０００７】
大抵、酵素のフィードバック耐性（ｆｂｒ）表現形は、アミノ酸配列における単一又は２、３箇所のアミノ酸残基が他の残基に置換されることにより生じ、これらの置換は酵素活性の減少につながる。例えば、エシェリヒア・コリのセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）（ｃｙｓＥ遺伝子）における天然メチオニン−２５６が、他の１９アミノ酸のいずれかで置換されると、大抵の場合ｆｂｒ表現形に至るが、変異型ＳＡＴタンパクは天然ＳＡＴの活性レベルを維持しない（Nakamori S et al. AEM, vol.64, p.1607-1611, 1998）。したがって、これらの方法で得られる変異型酵素の不利な点は、野生型酵素と比較して活性が低いということである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、エシェリヒア・コリにおけるピリミジン及びアルギニン又はシトルリンの生合成において重要な役割を果たす、フィードバック耐性及び高活性な酵素の構築に関する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明においては、ｃａｒＢ遺伝子断片の完全無作為化法（full rondomization）を用いて変異型ｃａｒＢ遺伝子の大集合を合成する新規な手法が、提案される。アミノ酸配列断片における、ｆｂｒ突然変異が集中する位置でのいくつかのアミノ酸前記の同時置換によれば、酵素の三次元構造のより適切な一致によって、天然のものに近い活性を保持する変異型タンパク質を製造することができる。かくして本発明は完成された。
【００１０】
本発明はすなわち、
（１）配列番号２０の９４７位〜９５１位に相当するアミノ酸配列が、配列番号１〜９のアミノ酸配列のいずれかと置換され、かつ、ウリジン５'−一リン酸によるフィードバック阻害が脱感作されたカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニット；
（２）野生型カルバモイルリン酸シンセターゼがエシェリヒア・コリ由来である(1)のカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニット；
（３）配列番号２０の９４７位〜９５１位のアミノ酸配列が配列番号１〜９のアミノ酸配列のいずれかと置換され、ウリジン５'−一リン酸によりフィードバック阻害が脱感作された、(1)のカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニット；
（４）９４７位〜９５１位以外の一または複数の位置における、一または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を有し、かつ、ウリジン５'−一リン酸によるフィードバック阻害が脱感作された、(1)のカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニット；
（５）(1)〜(4)のいずれかの変異型カルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットを含む、カルバモイルリン酸シンセターゼ；
（６）(1)〜(5)のいずれかのウリジン５'−一リン酸によるフィードバック阻害が脱感作された変異型カルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットをコードするＤＮＡ；
（７）(1)〜(4)のいずれか一項に記載のウリジン５'−一リン酸によるフィードバック阻害が脱感作されたカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットと、エシェリヒア・コリのカルバモイルリン酸シンセターゼの小サブユニットをコードするＤＮＡ。
（８）(6)又は(7)のＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌。
（９）Ｌ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘導体からなる群より選択される化合物を生産する能力を有する(8)の細菌。
（１０）ピリミジン誘導体がオロト酸、ウリジン、ウリジン５'−一リン酸、シチジン及びシチジン５'−一リン酸である、(9)の細菌。
（１１）(8)〜(10)いずれかの細菌を培地で培養し、同培地中にＬ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘導体からなる群より選択される化合物を生成、蓄積させ、該培養液より前記化合物を回収する、Ｌ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘導体からなる群より選択される化合物の製造方法。
（１２）前記ピリミジン誘導体が、オロト酸、ウリジン、ウリジン５'−一リン酸、シチジン及びシチジン５'−一リン酸である、(11)の製造方法。
【００１１】
本発明において、用語「ＣＰＳａｓｅ活性」は、重炭酸、グルタミン及び２分子のＭｇ−ＡＴＰからのカルバモイルリン酸の複合合成の反応を触媒する活性を意味する。また、本発明の「ＣＰＳａｓｅ」は、ＣＰＳａｓｅ活性を有する限り、大サブユニットのみからなる単独のポリペプチドでもよいし、大サブユニット及び小サブユニットからなるヘテロダイマーであってもよい。以下、このような大サブユニット及びヘテロダイマーを総称して、「ＣＰＳａｓｅ」と称することがある。さらに、大サブユニット及び小サブユニットをコードするＤＮＡは、「ｃａｒＡＢ」と称する。
また、前記のｆｂｒ変異のいずれかを持つＣＰＳａｓｅは「変異型ＣＰＳａｓｅ」と称する。また、変異型ＣＰＳａｓｅをコードするＤＮＡは、態様に応じて「変異型ｃａｒＢ遺伝子」、又は「変異型ｃａｒＡＢ遺伝子」と称する。また、変異のないＣＰＳａｓｅは「野生型ＣＰＳａｓｅ」と称する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
＜１＞変異型ＣＰＳａｓｅ及び変異型ｃａｒＢ遺伝子
発現ベクター中にｃａｒＡＢオペロンとしてクローニングされた種々の変異型ｃａｒＢ遺伝子を持つ組換えクローンの選択及びスクリーニングにより、様々のレベルの生物学的活性を持つ変異型ＣＰＳａｓｅのｆｂｒ変異体を選択することができる。
S. Delannay et al.により得られたデータによれば、エシェリヒア・コリのカルバモイルリン酸シンセターゼの変異体（Ｓ９４８Ｆ）はＵＭＰに非感受性である（Delannay S., et al., J. Mol. Biol., v.286, 1217-1228, 1999）。これらのデータをもとに、ＣＰＳａｓｅの９４８位を含む範囲が改変のターゲットとして選択された。
【００１４】
変異型ＣＰＳａｓｅ及び変異型ｃａｒＢ遺伝子は、ランダム化断片による突然変異誘発により得られた。ｃａｒＢにおける多くの変異を得るために、配列番号２０のアミノ酸配列のロイシン９４７からグルタミン酸９５１残基の領域をコードするｃａｒＢ遺伝子の１５−ヌクレオチド断片のランダム化が行われた（以下を参照）。ランダム化された１５ヌクレオチドの断片は、４12すなわち１．５×１０7近くの異なるＤＮＡ配列をもたらし、これは５ｍｅｒのペプチド中で４×１０5の異なるアミノ酸残基をコードし得る。これらの配列中にインフレームでストップコドンが導入されない可能性は、およそ０．９５、すなわち９５％である。したがって、９４７位〜９５１位のアミノ酸残基のペプチドをコードするｃａｒＢ遺伝子断片のランダム化は、ＣＰＳａｓｅ構造におけるこのペプチド断片において、多様性を有するおよそ４×１０5の異なるアミノ酸配列をもたらすはずである。発現ベクター中にクローニングされた変異型ｃａｒＢ遺伝子を持つリ組換えクローンの選択とスクリーニングにより、様々のレベルの生物学的活性を持つ変異型ＣＰＳａｓｅのｆｂｒ変異体を選択することができる。
【００１５】
ＣＰＳａｓｅのｆｂｒ表現形に適した変異型ＣＰＳａｓｅのアミノ酸配列は、本発明により明確にされる。したがって、変異型ＣＰＳａｓｅは、その配列に基づいて、通常の手法を用いて野生型ｃａｒＢ遺伝子に突然変異を導入することにより得られる。野生型ｃａｒＢとして、エシェリヒア・コリのｃａｒＢ遺伝子が挙げられる（GenBank Accession AE000113 U00096中、ヌクレオチド番号１０１５８から１３３７９：配列番号１９の配列）。尚、ｃａｒＡ遺伝子は、前記GenBank Accession AE000113 U00096の塩基配列において、ヌクレオチド番号８９９２〜１０１４０に相当する。
【００１６】
変異型ＣＰＳａｓｅをコードするＤＮＡを取得する材料としてｃａｒＢ遺伝子を用いれば、変異型ＣＰＳａｓｅの大サブユニットをコードする変異型ｃａｒＢ遺伝子が得られる。また、前記材料としてｃａｒＡＢ遺伝子を用いれば、変異型ＣＰＳａｓｅの大サブユニットとともに及び小サブユニットをコードする変異型ｃａｒＡＢ遺伝子が得られる。
【００１７】
本発明の変異型ＣＰＳａｓｅにおける９４７位から９５１位のアミノ酸配列は、配列番号１〜９の配列のいずれかである。９４８位のセリンがフェニルアラニンで置換された既知のｆｂｒ ＣＰＳａｓｅ、及びエシェリヒア・コリの野生型ＣＰＳａｓｅの対応するアミノ酸配列を、表１に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】
変異型ＣＰＳａｓｅは、ＣＰＳａｓｅ活性が損なわれない限り、９４７位〜９５１位以外の一または複数の位置で、一または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、もしくは付加を含んでいてもよい。「複数」のアミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造中のアミノ酸残基の位置またはタイプにより異なる。これは以下の理由による。すなわち、いくつかのアミノ酸は互いに高い相同性を有し、そのようなアミノ酸の相違はタンパク質の三次元構造に大きな影響を与えない。したがって、本発明の変異型ＣＰＳａｓｅは、ＣＰＳａｓｅを構成する全アミノ酸残基に関して３０〜５０％以上、好ましくは５０〜７０％の相同性を有し、かつ、ｆｂｒ ＣＰＳａｓｅ活性を有するものものであってもよい。
尚、変異型ＣＰＳａｓｅは、ウリジン５’−一リン酸非存在下での酵素活性が、野生型ＣＰＳａｓｅの活性の２５％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上の活性を保持していることが好ましい。
【００２０】
本発明において、「９４７位〜９５１位の配列に相当するアミノ酸配列」とは、配列番号２０のアミノ酸配列における９４７位〜９５１位のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を意味する。アミノ酸残基の位置は、変化し得る。例えば、あるアミノ酸残基がＮ−末端位に挿入されると、９４７位に本来位置していたアミノ酸残基は９４８位になる。その様な場合、最初の９４７位に相当するアミノ酸残基は、本発明において９４７位のアミノ酸残基として示される。
【００２１】
用語「ウリジン５’−一リン酸によるフィードバック阻害が脱感作された」とは、フィードバック阻害の程度が低下したことを意味する。フィードバック阻害の程度の低下は、ウリジン５’−一リン酸存在下でのＣＰＳａｓｅ活性の低下を測定し、配列番号２０のアミノ酸配列を有するタンパク質のそれと比較することで決定することができる。さらに、用語「ウリジン５’−一リン酸によるフィードバック阻害が脱感作された」は、実質的に阻害が脱感作されていればよく、完全に脱感作されることは必須ではない。
【００２２】
具体的には、変異型ＣＰＳａｓｅは、５ｍＭのグルタミンを基質としたときに、ウリジン５’−一リン酸非存在下の活性に対する、１０ｍＭのウリジン５’−一リン酸存在下での活性の割合が、５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上であることが好ましい。
【００２３】
上記の変異型ＣＰＳａｓｅと実質的に同一のタンパクをコードするＤＮＡは、例えばヌクレオチド配列を改変すること、例えば、ある特定の部位で一または複数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、または付加されるように部位特異的突然変異誘発法により、取得することができる。上記のように改変されたＤＮＡは、通常知られる突然変異処理法で取得され得る。突然変異処理法としては、例えば、変異型ｃａｒＢ遺伝子を含むＤＮＡを、インビトロでヒドロキシルアミンで処理する方法、及び、例えば変異型ｃａｒＢ遺伝子を保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射、またはその様な処理に通常使われるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）及び亜硝酸のような突然変異誘発物質で処理する方法が挙げられる。
【００２４】
上記のようなヌクレオチドの置換、欠失、挿入、または付加はまた、自然に起こる変異（mutant又はvariant）、例えば、ＣＰＳａｓｅを持つ個体の違いまたは種もしくは属の違いによる変異を含む。変異型ＣＰＳａｓｅと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、突然変異処理された変異型ＣＰＳａｓｅを保持する細胞から、プローブとして既知のｃａｒＢ遺伝子配列またはその一部を持つＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＣＰＳａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することにより得られる。
【００２５】
ここでいう用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異なハイブリッドが形成されない条件を意味する。この条件を、正確に数値を用いて表すことは困難であるが、例えばストリンジェントな条件は、高いホモロジーを有するＤＮＡ、例えば互いに５０％以上のホモロジーを有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それよりも低いホモロジーを有するＤＮＡは互いにハイブリダイズしないような条件が挙げられる。あるいは、ストリンジェントな条件としては、サザンハイブリダイゼーションにおける通常の洗いの条件に相当する塩濃度でＤＮＡ同士が互いにハイブリダイズする条件、例えば６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳが挙げられる。
【００２６】
上記の条件下でハイブリダイズし得る遺伝子の中には、遺伝子のコード領域内に終止コドンを有するもの、及び、活性中心の変異により活性を持たないものが含まれる。しかし、そのような不都合は、市販の発現ベクターに遺伝子を連結し、発現したタンパク質のＣＰＳａｓｅ活性を調べることで、簡単に除くことができる。
【００２７】
本発明のＣＰＳａｓｅが、変異型の大サブユニットと小サブユニットからなるヘテロダイマーである場合、小サブユニットとしては、エシェリヒア・コリの野生型ＣＰＳａｓｅの小サブユニットが挙げられる。報告されている小サブユニット遺伝子（ｃａｒＡ）の塩基配列及びＣａｒＡのアミノ酸配列（GenBank Accession AE000113 U00096）を、配列番号３２及び３３に示す。
本発明においては、大サブユニットとともにＣＰＳａｓｅ活性を有している限り、小サブユニットは、一または複数の位置で、一または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、もしくは付加を含んでいてもよい。「複数」の意味は、前記大サブユニットと同様である。
上記のような小サブユニットと実質的に同一のポリペプチドをコードするＤＮＡとして具体的には、ｃａｒＡまたはその一部を持つＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。「ストリンジェントな条件」の意味は、前記と同様である。
【００２８】
＜２＞本発明のエシェリヒア属細菌
本発明のエシェリヒア属細菌は、上記の変異型ｃａｒＢ遺伝子が導入されたエシェリヒア属細菌である。エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリが挙げられる。変異型ｃａｒＢ遺伝子は、例えば、エシェリヒア属細菌で機能するベクター及び変異型ｃａｒＢ遺伝子を含む組換えＤＮＡでエシェリヒア属細菌を形質転換することで得られる。変異型ｃａｒＢ遺伝子は、染色体上のｃａｒＢ遺伝子を変異型ｃａｒＢ遺伝子と置換することによっても得ることができる。
【００２９】
変異型ｃａｒＢ遺伝子の導入に使われるベクターとしては、pBR322、pMW118、pUC19等のようなプラスミドベクター、l1059、lBF101、M13mp9等のようなファージベクター、及びMu、Tn10、Tn5等のようなトランスポゾンが挙げられる。
【００３０】
エシェリヒア属細菌へのＤＮＡの導入は、例えば、D. A. Morrisonの方法（Methods in Enzymology, 68, 326(1979)）、または受容菌を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel, M., and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159, (1970)）等により行うことができる。
【００３１】
Ｌ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘導体のようなカルバモイルリン酸から誘導される化合物の生産量は、上記のようなエシェリヒア属に属する生産菌に変異型ｃａｒＢを導入することで上昇させることができる。また、Ｌ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘導体のような化合物の生産能は、あらかじめ変異型ｃａｒＢ遺伝子が導入された細菌に付与してもよい。上記ピリミジン誘導体としては、オロト酸、ウリジン、ＵＮＰ、シチジン及びＣＭＰが挙げられる。
【００３２】
Ｌ−アルギニン生産能を有するエシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリAJ11531及びAF11538（特開昭56-106598号）、AJ11593（FERM P-5616）及びAJ11594（FERM P-5617）（特開昭57-5693号）、VKPM B-7925（ロシア特許出願第2000117677号）が挙げられる。VKPM B-7925は、２０００年４月１０日より、ルシアン・ナショナル・コレクション・フォー・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（ＶＫＰＭ）に寄託されている。
【００３３】
エシェリヒア属に属するＬ−シトルリン生産菌、エシェリヒア属に属するオロト酸生産菌、及びエシェリヒア属に属する５’−一リン酸（ＵＭＰ）生産菌は現在知られていない。
【００３４】
Ｌ−シトルリン生産能を有するバチルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス（B. subtilis）K-X-1 A-1株（ATCC No 15561）及びK-1 A-9株（ATCC No 15562）（米国特許第3,282,794号）、バチルス sp. cit-70株（特開平08-089269号）が例示される。Ｌ−シトルリン生産能を有するブレビバクテリウム（Brevibacteria）属細菌としては、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）AJ3408株（FERM P-1645）（米国特許第5,164,307号）、及びAJ11677株（特開昭57-163488号）が挙げられる。Ｌ−シトルリン生産能を持つコリネバクテリウム属細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）AJ11588株（FERM P-5643）（米国特許第5,164,307号）が挙げられる。
【００３５】
オロト酸生産能を有するバチルス属細菌としては、オロト酸フォスフォリボシルトランスフェラーゼを欠損したバチルス・ズブチリスFERM P11402（特開平04-004891号）が挙げられる。ＵＭＰ生産能を持つコリネバクテリウム属細菌としては、５−フルオロウラシル耐性のコリネバクテリウム・グルタミカム T-26株（FERM BP-1487）、５−フルオロウラシル及びトリメトプリムに耐性なT-29株（FERM BP-1487）、ならびに５−フルオロウラシル及びスルファグアニジンに耐性なT-30株（FERM BP-1489）（欧州特許EP0312912）が挙げられる。
【００３６】
ＵＭＰ生産能を有するコリネバクテリアとしては、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）LK 40-2株（VKPM B-7811）、LK 75-15（VKPM B-7812）、及びLK 75-66（VKPM B-7813）（ロシア特許出願第99122774号）が挙げられる。
【００３７】
＜３＞Ｌ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘導体の製造方法
Ｌ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘導体のような化合物は、変異型ｃａｒＢ遺伝子が導入され、同化合物を生産する能力を有する細菌を培地で培養し、同化合物を培地中に生成、蓄積させ、それらを培地から回収することにより、効率よく生産することができる。上記ピリミジン誘導体としては、オロト酸、ウリジン、ＵＭＰ、シチジン及びＣＭＰが挙げられる。
【００３８】
本発明の方法において、エシェリヒア属細菌の培養、液体培地からの化合物の回収と精製は、細菌を用いた発酵によるＬ−アルギニン生産のための通常の方法と同様にして行うことができる。培養に使用される培地は、炭素源及び窒素、無機質ならびに、必要に応じて、細菌の成長に必要な適量の栄養分を含む限り、合成培地または天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、使用する細菌の資化能によって、グルコース及びスクロースのような種々の炭水化物、及び種々の有機酸が挙げられる。エタノール及びグリセロールのようなアルコールも使用することができる。窒素源としては、アンモニア、種々のアンモニウム塩、アミンのよう他の窒素化合物、ペプトンのような天然の窒素源、ダイズ水解物及び醗酵性微生物の消化物が使用される。無機質としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムが使用される。
【００３９】
培養は、好ましくは振盪、通気及び撹拌培養のような好気的な状態下で行われる。培養は、通常２０℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３８℃の間で行われる。培養は、通常５〜９、好ましくは６．５〜７．２の間のｐＨで行われる。培養液のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基、及び緩衝液で調整することができる。通常、１日〜３日の培養で、培養液中に化合物が蓄積する。
【００４０】
化合物の単離は、培養の後に遠心分離や濾過により細胞のような固形物を培養液から取り除き、続いてイオン交換、濃縮及び結晶分画法により化合物を回収及び精製することで、行うことができる。
【００４１】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００４２】
【実施例１】
エシェリヒア・コリの野生型ｃａｒＡＢ遺伝子を持つプラスミドpBScarAB-13を、あらかじめBamHI及びPstIで消化したpBluescript II SK(+)ベクター（Fermentas, Lithuania）に、エシェリヒア・コリ染色体からのAvaIII-BglIIＤＮＡ断片（４９１１ｂｐ）をクローニングすることにより構築した。
【００４３】
プラスミドpET22-b(+)（Novagen, USA）は、T7プロモーターをlacプロモーターで置換するように改変した。lacプロモーターは、pUC18プラスミドをテンプレートとして、オリゴヌクレオチド
5'-accagatctgcggcagtgagcgcaacgc-3'（配列番号２１）、及び
5'-gtttctagatcctgtgtgaaattgttatccgc-3'（配列番号２２）
をプライマーとして用いて、ＰＣＲ増幅により取得した。得られたlacプロモーターを含む断片（0.14kb）は、制限酵素BglII及びXbaIで消化し、同じ酵素で処理したpET21-b(+)ベクター中にクローニングした。得られたプラスミドpET-Placは、プラスミドpBScarAB-13からプロモーターを持たないｃａｒＡＢ遺伝子をクローニングするのに用いた。
【００４４】
ｃａｒＡ遺伝子の５’末端（1.18kb）は、pBScarAB-13をテンプレートとして、オリゴヌクレオチド
5'-cctctagaaataaagtgagtgaatattc-3'（配列番号２３）、及び
5'-cttagcggttttacggtactgc-3'（配列番号２４）
をプライマーとして用いて、ＰＣＲ増幅により取得した。得られた断片はXbaI及びDraIIIで消化し、ｃａｒＡ遺伝子の５’−末端配列を含むXbaI-DraIII断片（0.61kb）をアガロース電気泳動により精製した。この断片、pBScarAB-13プラスミドより得たDraIII-SacI断片（ｃａｒＡ遺伝子及びｃａｒＢ遺伝子の３’−末端配列を含んでいる）及びpET-Plac/XbaI-SacIベクターの混合物を連結し、エシェリヒア・コリＴＧ１細胞を形質転換した。得られた組換えプラスミドpEL-carAB-wtは、lacプロモーターの制御下で、野生型ｃａｒＡＢオペロンの配列を持っている。
【００４５】
ＰＣＲ増幅に用いたTaKaRa La DNA Polymeraseは、宝酒造(株)（日本）より入手し、推奨される条件で使用した。
【００４６】
＜１＞ランダム化断片による突然変異誘発
プラスミドpBScarAB-13をテンプレートとして用い、センスプライマーＰ１：5'-ggtcgtgcgctgNN(T/C)N(T/C)CNN(T/C)NNN(G/A)NNggcgataaagaacgcgtggtg-3'（配列番号２５）（４８塩基）をｃａｒＢ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいてデザインし、標準Ｍ１３ダイレクトシークエンスプライマーを、アンチセンスプライマーとして用いた。プライマーＰ１の固定された５’末端１２ヌクレオチド、及び固定された３’末端２１ヌクレオチドは、ｃａｒＢ遺伝子のＧｌｕ９５１コドンの下流、及びＬｅｕ９４７コドンの上流の配列にそれぞれ相同性を有する。
【００４７】
0.75kbp ＤＮＡ断片（ｃａｒＢ遺伝子の３’末端）が、ランダム化された１５ヌクレオチドとＰ１プライマーを用いて、１段目のＰＣＲで増幅された。
１段目のＰＣＲは以下のようにして行った。100ngのpBScarAB-13を、10pmol濃度の２つのプライマーそれぞれを含むＰＣＲ溶液に、テンプレートとして加えた。2400 DNAサーマルサイクラー（Perkin-Elmer Co., Foster City, Calif.）を用いて15PCRサイクル（94℃で15秒、52℃で20秒、72℃で１分）を行った。
【００４８】
二回目の増幅として、次の15サイクル（94℃で１分、35℃で１分、72℃で２分）を行った。その際、増幅断片の（−）鎖が遺伝子全長を得るためにそれを伸長させるための「プライマー」として機能させた。
【００４９】
三段目の増幅として、反応混合液の10μl分を、100pmolのセンスプライマー：Ｍ１３ダイレクトシークエンスプライマー、及びアンチセンスとしてプライマーＰ２：5'-ccacttcctcgatgacgcgg-3'（配列番号２６）を含む新鮮な90μlの反応混合液に添加し、さらに15サイクル（94℃で0.5分、55℃で20秒、72℃で２分）を行った。
【００５０】
ｃａｒＢ遺伝子の３’末端断片の様々な変異体のプールをコードする1.32kbのDNA断片を、アガロースゲル電気泳動で精製し、次いでAflII及びSacIで消化した後、あらかじめ同じ制限酵素で消化したpEL-carAB-wtベクターに連結し、pEL-carAB-NNを得た。
【００５１】
後の実験で、約150ngの連結されたＤＮＡを、エシェリヒア・コリＴＧ１（supE hsdΔ5 thiΔ(lac-proAB)F'[traD36 proAB+ lacq lacZΔM15]）（J. Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989）受容細胞の形質転換に用い、約2000の組換えクローンが得られた。組換えプラスミド（pEL-carAB-NN）のプールを精製し、活性ＣａｒＡＢ酵素を持つ組換えプラスミドpEL-carAB-NNを選択するために用いたエシェリヒア・コリVKPM B-6969（car:Tn10）を形質転換した。
【００５２】
＜２＞部位特異的突然変異誘発
単一変異Ser948Pheを導入するために、プラスミドpBScarAB-13をテンプレートとして、ｃａｒＢ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計したセンスプライマー5'-cgtgcgctgcttttcgtgcgcgaaggcgataaag-3'（３４塩基）（配列番号２７）、及び、アンチセンスプライマーとして標準Ｍ１３ダイレクトシークエンスプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅及び断片のクローニングは、上記のようにして行った。
【００５３】
単一変異を持つｃａｒＢ遺伝子の３’末端断片をコードする1.32kbpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、AflII及びSacIで消化し、次いで同じ制限酵素であらかじめ消化したpEL-carAB-wtベクターに連結した。およそ100ngの得られたＤＮＡプラスミドを、エシェリヒア・コリVKPM B-6969の形質転換に用い、単一置換Ser948Pheを有する活性ＣａｒＡＢ酵素をコードするｃａｒＡＢ遺伝子を保持するリコンビナントプラスミドpEL-carAB-6を選択した。
【００５４】
【実施例２】
新規ｃａｒＢ変異体の単離及び触媒特性に対するＣＰＳａｓｅのアミノ酸配列置換の効果
初めに、４０株の組換えB-6969（pEL-carAB-NN）クローンで、ＣａｒＡＢ活性及びそのＵＭＰに対するフィードバック耐性を、ＣａｒＡＢ及びＡｒｇＩ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）酵素により触媒される、オルニチンからのシトルリン生合成の反応において評価した。
反応の概要は以下の通りである。
【００５５】
【化１】
【００５６】
この反応中、カルバモイルリン酸シンセターゼは、遊離のＮＨ4 +を基質として用いる。
【００５７】
４０株のB-6969（pEL-carAB-NN）及びＴＧ１（pUC18-argI）の細胞のタンパク質抽出物を、(NH4)2SO4（75％飽和）を用いた沈殿により、超音波処理を行った粗細胞抽出液から調製した。タンパク質の沈殿物は、以下の組成の緩衝液に溶解された。Tris-HCl(50mM), pH7.5、2-メルカプトエタノール（2mM）。
【００５８】
テスト系は、B-6969(pEL-carAB-NN）株及びＴＧ１（pUC18-argI）のタンパク抽出物、及び、以下の試薬を含む。ATP（8mM）、MgSO4（8mM）、(NH4)2SO4（200mM）、Na2CO3（8mM）及びオルニチン（1mM）、（pH7.5）。
【００５９】
反応混合液中のオルニチン及びシトルリン含有量は、以下の組成の液相を用いてＴＬＣで解析した。イソプロパノール／酢酸エチル／水酸化アンモニウム／Ｈ2Ｏ＝40/20/13/27（v/v）。
【００６０】
活性を有し、かつＵＭＰに対するフィードバック耐性である変異型ＣＰＳａｓｅを発現する９クローン、及び、単一置換Ｓｅｒ９４８Ｐｈｅを有するＣＰＳａｓｅを発現する１クローンを、変異酵素活性の計測に用いた。
【００６１】
前記１０クローンのプラスミドを精製し、ダイデオキシチェーンターミネーション法を用いて、ｃａｒＢ遺伝子のランダム化断片の配列を決定した（表１）。
次いで、これら９クローンのB-6969（pEL-carAB-NN）及び１クローンのB-6969（pEL-carAB-6）のタンパク抽出物を、グルタミン及びアンモニアからのカルバモイルリン酸（ＣＰ）合成反応における変異型ＣＰＳａｓｅの活性及びｆｂｒを評価するために用いた。
【００６２】
粗細胞抽出液は、0.5mlのバッファーＡ（200mM K2HPO4/KH2PO4、pH8.0、1mM EDTA、1mM PMSF、1mM DTT）に懸濁した20mg湿細胞ペレットを超音波処理することで調製し、６５％飽和に達する固形硫酸アンモニウムで処理した。10分間４℃でインキュベートした後、懸濁液を13,000rpmで10分間遠心し、沈殿物を１mlのバッファーＢ（20mM K2HPO4/KH2PO4，pH8.0、50mM KCl、1mM PMSF、1mM DTT）に溶解させた。得られたタンパク質抽出物を、ＣＰＳａｓｅ活性の評価に用いた。反応の概要は、以下のとおりである：
【００６３】
【化２】
I. Gln + CO2 + 2MgATP + H2O → NH2COOPO3 2- + 2MgADP + Glu + Pi
II. NH3 + CO2 + 2MgATP + H2O → NH2COOPO3 2- + 2MgADP + Pi
【００６４】
50μlの各反応混合液は、以下のものを含む。
反応I：20mM tris-HCl、pH8.0、100mM KCl、5mM Na2CO3、10mM ATP、10mM MgCl2、5mMグルタミン、10μlタンパク質抽出物、
反応II：20mM tris-HCl、pH8.0、100mM KCl、5mM Na2CO3、10mM ATP、10mM MgCl2、200mM (NH4)2SO4、10μlタンパク質抽出物。
【００６５】
また、反応Iの系列を、ＣＰＳａｓｅのフィードバック阻害レベルを評価するため、10mM UTP存在下で行った。
10分間37℃でインキュベーションを行った後、等量のＥｔＯＨを加えて反応を停止させ、10分間-20℃に冷やし、室温で１分間13,000rpmで遠心を行った。上清は-20℃に冷却した。
【００６６】
反応混合液中のＣＰ含有量は、キャピラリーゾーン電気泳動で解析した。分離は、Quanta 4000Eキャピラリー電気泳動システム（「Waters」、ＵＳＡ）上で、254nmのＵＶ非直接検出で行った。インジェクションは。静水圧で２５秒間行った。分離は、コートしていない融合シリカキャピラリー（７５ｕ I.D．*60cm、有効長53cm）で行い、-25kVの電位で操作した。温度は20℃に維持した。分離緩衝液は、50mM Tris base、25mM安息香酸（非直接検出の場合）pH8.5、0.25mM TTAB（tetradecyl-trimethyl-ammonium bromide）（電気浸透流の逆流用）からなる。ＣＰ合成の反応における変異型ＣＰＳａｓｅの活性の測定値及びｆｂｒのデータを、表２に示す。
【００６７】
【表２】
【００６８】
このように、変異型ＣＰＳａｓｅは、本質的にＵＭＰに非感受性であるが、単一変異は、酵素活性を顕著に低下させた。これらの結果は、９４７位〜９５１位のアミノ酸残基からなるペプチド断片は、ＵＭＰによるＣＰＳａｓｅのフィードバック阻害に関与し、変異型ＣＰＳａｓｅの触媒効率のレベルにもまた関与していることを示している。野生型ＣａｒＡＢ及び変異型ＣａｒＡＢ−３４をコードする遺伝子を、プラスミドpMW119中にクローニングした。この目的のため、プラスミドpEL-carAB-wt及びpEL-carAB-34を、制限酵素SacI及びＸbaIで消化し（これらのプラスミドが２つのXbaIサイトを持つため、部分処理した）、ｃａｒＡＢ遺伝子をコードする断片を、あらかじめ同じ制限酵素で処理したpMW119ベクター中にクローニングした。その結果、lacプロモーター制御下にあるｃａｒＡＢ遺伝子を持つ、低コピー数のpMW119carAB-wt及びpMW119carAB-34プラスミドが得られた。
【００６９】
【実施例３】
変異型ｃａｒＡＢ遺伝子を持つ株を用いたオロト酸の生産
３１１株は、ａｒｇＡ遺伝子にＴｎ１０が挿入されたエシェリヒア・コリＫ１２（VKPM B-3853）から、６−アザウラシル（1mg/ml）耐性変異株として誘導された。３１１株は、ルシアン・ナショナル・コレクション・フォー・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（ＶＫＰＭ）に、２００１年３月５日より受託番号VKPM B-8085として寄託され、２００２年７月１７日にブダペスト条約の規定にしたがって国際寄託に移管されている。
【００７０】
３１１株を、pMW119carAB-wt及びpMW119carAB-34プラスミドで形質転換し、得られた組換え株オロト酸生産を、異なる濃度のウリジン存在下で調べた。
【００７１】
以下の条件で試験管発酵を行った。1/20希釈の一夜培養液、60g/Lグルコース、25g/L硫酸アンモニウム、2g/L KH2PO4、1g/L MgSO4、0.1mg/Lチアミン、5g/Lイーストエクストラクト（Difco）、25 g/L炭酸カルシウム、以上1Lの水道水中（pH7.2）。グルコース及び炭酸カルシウムは別個に滅菌した。2mlの培地を試験管に入れ、32℃で３日間振盪しながら培養を行った。オロト酸生産のレベルは、HPLCにより評価した（表３）。
【００７２】
【表３】
【００７３】
表３に示すように、変異ｃａｒＡＢ遺伝子を保持する311（pMW119carAB-34）株は、親株311(pMW119)株及び野生型ｃａｒＡＢ遺伝子を保持する311(pMW119carAB-wt)株に比べ、多くのオロト酸を生産した。
【００７４】
【実施例４】
変異ｃａｒＡＢ遺伝子を保持する株を用いたアルギニン及び／又はシトルリンの生産
アルギニン生産株である３３３株及び３７４株は、トランスポゾンTn5がilvA遺伝子に挿入されたエシェリヒア・コリ５７株（VKPM B-7386）の誘導体から、６−アザウラシル（1mg/ml）に耐性な変異株として選択された。３３３株及び３７４株は、ルシアン・ナショナル・コレクション・フォー・インダストリアル・マイクロオーガニズムスロシア（ＶＫＰＭ）に、２００１年３月５日より、それぞれ受託番号VKPM B-8084及びVKPM B-8086として寄託され、各々２００２年７月１７日にブダペスト条約の規定にしたがって国際寄託に移管されている。
【００７５】
３３３株及び３７４株を、プラスミドpMWcarAB-wt及びpMWcarAB-34で形質転換し、それらの組換え株のアルギニン及びシトルリンの生産を調べた。試験管発酵は、実施例３と同じ方法で行った。100mg/Lのウリジンを含む合成培地での333(pMWcarAB-wt)株及び333(pMWcarAB-34)株のアルギニン及び／又はシトルリンの生産量を、表４に示す。
【００７６】
【表４】
【００７７】
100mg/Lのウリジンを含む合成培地での374(pMWcarAB-wt)株及び374(pMWcarAB-34)株によるシトルリン生産レベルを、表５に示す。
【００７８】
【表５】
【００７９】
表４に示されるように、変異型ｃａｒＡＢ遺伝子を保持する333(pMWcarAB-34)株は、野生型ｃａｒＡＢ遺伝子を保持する株に比べて、多くのアルギニン及びシトルリンを生産した。また、表５に示されるように、374(pMWcarAB-34)株は、野生型ｃａｒＡＢ遺伝子を保持する株よりも多くのシトルリンを生産した。
【００８０】
【発明の効果】
本発明により、フィードバック阻害が脱感作され、かつ、高い活性を維持する変異型カルバモイルリン酸シンセターゼが提供される。同酵素を保持するエシェリヒア属細菌は、発酵法によるＬ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘導体の効率的な製造に好適に利用することができる。
【００８１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミドpEL-carAB-wtの構築のスキームを示す。
【図２】 変異型ｃａｒＢ遺伝子のプールの構築のスキームを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物工業、特にカルバモイルリン酸より誘導される化合物に関わる。特に、アルギニン、シトルリン、及び、オロト酸、ウリジン、ウリジン５’−一リン酸（ＵＭＰ）、シチジン、シチジン５’−一リン酸（ＣＭＰ）を含むピリミジン誘導体のような、カルバモイルリン酸シンセターゼより誘導される化合物を生産するエシェリヒア・コリ（E. coli）菌株の、アルギニン及びピリミジンの生合成経路に関与する新規フィードバック耐性酵素の利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エシェリヒア・コリ（E. coli）のカルバモイルリン酸シンセターゼ（ＣＰＳａｓｅ）は、重炭酸、グルタミン及び２分子のＭｇ−ＡＴＰからカルバモイルリン酸（ＣＰ）を合成し、グルタミン酸、燐酸、及び２分子のＭｇ−ＡＤＰを放出する複合反応を触媒する（Meister A., Advan. Enzymol.Mol.Biol., vol. 62, p.315-374, 1989）。
【０００３】
ＣＰの合成は、２つの生合成経路、すなわちピリミジンヌクレオチド及びアルギニンの合成経路の中間体である。前者の経路においては、ＣＰはアスパラギン酸カルバモイルトランスフェラーゼ（ＡＴＣａｓｅ）に結合し、結果として２段階でオロト酸を生成する。オロト酸は、ウラシルのようなピリミジン；オロチジン、ウリジン、及びシチジンのようなピリミジンヌクレオシド；ならびにオロチジン５’−一リン酸（ＯＭＰ）、ＵＭＰ、及びＣＭＰのようなピリミジンヌクレオチドを含むピリミジン誘導体の生合成に重要な代謝中間体である。多くの細菌では、発酵の間、培養液中にオロト酸が存在すると、ピリミジン誘導体、すなわちウラシルの生成と蓄積を適度に補助することが示されている（米国特許3,214,344）。後者の経路では、ＣＰは、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＴＣａｓｅ）を介してオルニチンに結合し、アルギニン生合成経路においてグルタミン酸から始まる６番目の段階を構成する。
【０００４】
ＣＰＳａｓｅはオルチニン及びＩＭＰ（プリンヌクレオチドの前駆体の一つ）により活性化され、そしてＵＭＰにより不活性化される。カルバモイルリン酸シンセターゼは、２つのサブユニットからなっている。コリネ型細菌（EP1026247A1）、エシェリヒア（Escherichia）属及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌については、これらのサブユニットはｃａｒＡ及びｃａｒＢ遺伝子によりコードされていることが知られている。ｃａｒＡＢオペロンの転写は、両経路の最終産物により集積的に抑制される（Charlier D., et al., J. Mol. Biol., vol.226, p.367-386, 1992; Wang H., et al., J. Mol. Biol., vol.277, p805-824, 1998; Glansdorff N., et al., Paths to Pyrimidines, vol.6, p. 53-62, 1998）。
【０００５】
天然のエシェリヒア・コリのＣＰＳａｓｅは、それぞれｃａｒＡ遺伝子及びｃａｒＢ遺伝子によりコードされる41,270Daの小サブユニットと117,710Daの大サブユニットからなるヘテロダイマーである。小サブユニットはグルタミンの加水分解を触媒し、ＣＰ合成が実際に起こる大サブユニットへのNH3の移動に関与する。大サブユニットは、基質、すなわち重炭酸、アンモニアに対する結合部位、Ｍｇ−ＡＴＰａｓｅに対する異なる２つの結合部位、及び、調節ドメインを構成する18kDaのカルボキシ末端を含む（Rubio V., et al.,Biochemistry, vol.30, p.1068-1075, 1991; Cervera I., et al., Biochemistry, vol. 35, p.7247-7255, 1996）。
また、大サブユニットは、単独でカルバモイルリン酸の合成反応を触媒する活性を有することが示唆されている（Stephen D. Rubino et al., J. Biol. Chem., 206, 4382-4386, 1987）。
【０００６】
ＣＰＳａｓｅのアロステリックに活性化された形態の結晶構造が、最近報告されている（Thoden J., et al., Biochemistry, vol.36, p. 6305-6316, 1997; Thoden J., et al., Acta Crystallogr.Sec.D., vol. 55, p. 8-24, 1999）。大サブユニットの中のＡ、Ｂ、Ｃと名付けられた最初の３つの個々のドメインは、構造が非常に類似している。しかし４つ目のドメインは全く異なっている。このＤドメイン（９３７〜１０７３位）は、結合と、ＩＭＰ、ＵＭＰ及びオルニチンの各因子によるアロステリックな制御に関与している。また、セリン９４８及びスレオニン１０４２の２つの残基も、ＣＰＳａｓｅのアロステリックな制御に重要と考えられることが示されている（Delannary S., et al., J. Mol. Biol., vol.286, p.1217-1228, 1999）。セリン９４８がフェニルアラニンで置換されると、当該酵素はＵＭＰ及びＩＭＰに非感受性となるが、活性化の程度は減少するものの、オルニチンにより依然として活性化される。Ｔ１０４２Ｉ変異を有する酵素は、オルニチンによる活性化が大きく減少する。
【０００７】
大抵、酵素のフィードバック耐性（ｆｂｒ）表現形は、アミノ酸配列における単一又は２、３箇所のアミノ酸残基が他の残基に置換されることにより生じ、これらの置換は酵素活性の減少につながる。例えば、エシェリヒア・コリのセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）（ｃｙｓＥ遺伝子）における天然メチオニン−２５６が、他の１９アミノ酸のいずれかで置換されると、大抵の場合ｆｂｒ表現形に至るが、変異型ＳＡＴタンパクは天然ＳＡＴの活性レベルを維持しない（Nakamori S et al. AEM, vol.64, p.1607-1611, 1998）。したがって、これらの方法で得られる変異型酵素の不利な点は、野生型酵素と比較して活性が低いということである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、エシェリヒア・コリにおけるピリミジン及びアルギニン又はシトルリンの生合成において重要な役割を果たす、フィードバック耐性及び高活性な酵素の構築に関する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明においては、ｃａｒＢ遺伝子断片の完全無作為化法（full rondomization）を用いて変異型ｃａｒＢ遺伝子の大集合を合成する新規な手法が、提案される。アミノ酸配列断片における、ｆｂｒ突然変異が集中する位置でのいくつかのアミノ酸前記の同時置換によれば、酵素の三次元構造のより適切な一致によって、天然のものに近い活性を保持する変異型タンパク質を製造することができる。かくして本発明は完成された。
【００１０】
本発明はすなわち、
（１）配列番号２０の９４７位〜９５１位に相当するアミノ酸配列が、配列番号１〜９のアミノ酸配列のいずれかと置換され、かつ、ウリジン５'−一リン酸によるフィードバック阻害が脱感作されたカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニット；
（２）野生型カルバモイルリン酸シンセターゼがエシェリヒア・コリ由来である(1)のカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニット；
（３）配列番号２０の９４７位〜９５１位のアミノ酸配列が配列番号１〜９のアミノ酸配列のいずれかと置換され、ウリジン５'−一リン酸によりフィードバック阻害が脱感作された、(1)のカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニット；
（４）９４７位〜９５１位以外の一または複数の位置における、一または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を有し、かつ、ウリジン５'−一リン酸によるフィードバック阻害が脱感作された、(1)のカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニット；
（５）(1)〜(4)のいずれかの変異型カルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットを含む、カルバモイルリン酸シンセターゼ；
（６）(1)〜(5)のいずれかのウリジン５'−一リン酸によるフィードバック阻害が脱感作された変異型カルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットをコードするＤＮＡ；
（７）(1)〜(4)のいずれか一項に記載のウリジン５'−一リン酸によるフィードバック阻害が脱感作されたカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットと、エシェリヒア・コリのカルバモイルリン酸シンセターゼの小サブユニットをコードするＤＮＡ。
（８）(6)又は(7)のＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌。
（９）Ｌ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘導体からなる群より選択される化合物を生産する能力を有する(8)の細菌。
（１０）ピリミジン誘導体がオロト酸、ウリジン、ウリジン５'−一リン酸、シチジン及びシチジン５'−一リン酸である、(9)の細菌。
（１１）(8)〜(10)いずれかの細菌を培地で培養し、同培地中にＬ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘導体からなる群より選択される化合物を生成、蓄積させ、該培養液より前記化合物を回収する、Ｌ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘導体からなる群より選択される化合物の製造方法。
（１２）前記ピリミジン誘導体が、オロト酸、ウリジン、ウリジン５'−一リン酸、シチジン及びシチジン５'−一リン酸である、(11)の製造方法。
【００１１】
本発明において、用語「ＣＰＳａｓｅ活性」は、重炭酸、グルタミン及び２分子のＭｇ−ＡＴＰからのカルバモイルリン酸の複合合成の反応を触媒する活性を意味する。また、本発明の「ＣＰＳａｓｅ」は、ＣＰＳａｓｅ活性を有する限り、大サブユニットのみからなる単独のポリペプチドでもよいし、大サブユニット及び小サブユニットからなるヘテロダイマーであってもよい。以下、このような大サブユニット及びヘテロダイマーを総称して、「ＣＰＳａｓｅ」と称することがある。さらに、大サブユニット及び小サブユニットをコードするＤＮＡは、「ｃａｒＡＢ」と称する。
また、前記のｆｂｒ変異のいずれかを持つＣＰＳａｓｅは「変異型ＣＰＳａｓｅ」と称する。また、変異型ＣＰＳａｓｅをコードするＤＮＡは、態様に応じて「変異型ｃａｒＢ遺伝子」、又は「変異型ｃａｒＡＢ遺伝子」と称する。また、変異のないＣＰＳａｓｅは「野生型ＣＰＳａｓｅ」と称する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
＜１＞変異型ＣＰＳａｓｅ及び変異型ｃａｒＢ遺伝子
発現ベクター中にｃａｒＡＢオペロンとしてクローニングされた種々の変異型ｃａｒＢ遺伝子を持つ組換えクローンの選択及びスクリーニングにより、様々のレベルの生物学的活性を持つ変異型ＣＰＳａｓｅのｆｂｒ変異体を選択することができる。
S. Delannay et al.により得られたデータによれば、エシェリヒア・コリのカルバモイルリン酸シンセターゼの変異体（Ｓ９４８Ｆ）はＵＭＰに非感受性である（Delannay S., et al., J. Mol. Biol., v.286, 1217-1228, 1999）。これらのデータをもとに、ＣＰＳａｓｅの９４８位を含む範囲が改変のターゲットとして選択された。
【００１４】
変異型ＣＰＳａｓｅ及び変異型ｃａｒＢ遺伝子は、ランダム化断片による突然変異誘発により得られた。ｃａｒＢにおける多くの変異を得るために、配列番号２０のアミノ酸配列のロイシン９４７からグルタミン酸９５１残基の領域をコードするｃａｒＢ遺伝子の１５−ヌクレオチド断片のランダム化が行われた（以下を参照）。ランダム化された１５ヌクレオチドの断片は、４12すなわち１．５×１０7近くの異なるＤＮＡ配列をもたらし、これは５ｍｅｒのペプチド中で４×１０5の異なるアミノ酸残基をコードし得る。これらの配列中にインフレームでストップコドンが導入されない可能性は、およそ０．９５、すなわち９５％である。したがって、９４７位〜９５１位のアミノ酸残基のペプチドをコードするｃａｒＢ遺伝子断片のランダム化は、ＣＰＳａｓｅ構造におけるこのペプチド断片において、多様性を有するおよそ４×１０5の異なるアミノ酸配列をもたらすはずである。発現ベクター中にクローニングされた変異型ｃａｒＢ遺伝子を持つリ組換えクローンの選択とスクリーニングにより、様々のレベルの生物学的活性を持つ変異型ＣＰＳａｓｅのｆｂｒ変異体を選択することができる。
【００１５】
ＣＰＳａｓｅのｆｂｒ表現形に適した変異型ＣＰＳａｓｅのアミノ酸配列は、本発明により明確にされる。したがって、変異型ＣＰＳａｓｅは、その配列に基づいて、通常の手法を用いて野生型ｃａｒＢ遺伝子に突然変異を導入することにより得られる。野生型ｃａｒＢとして、エシェリヒア・コリのｃａｒＢ遺伝子が挙げられる（GenBank Accession AE000113 U00096中、ヌクレオチド番号１０１５８から１３３７９：配列番号１９の配列）。尚、ｃａｒＡ遺伝子は、前記GenBank Accession AE000113 U00096の塩基配列において、ヌクレオチド番号８９９２〜１０１４０に相当する。
【００１６】
変異型ＣＰＳａｓｅをコードするＤＮＡを取得する材料としてｃａｒＢ遺伝子を用いれば、変異型ＣＰＳａｓｅの大サブユニットをコードする変異型ｃａｒＢ遺伝子が得られる。また、前記材料としてｃａｒＡＢ遺伝子を用いれば、変異型ＣＰＳａｓｅの大サブユニットとともに及び小サブユニットをコードする変異型ｃａｒＡＢ遺伝子が得られる。
【００１７】
本発明の変異型ＣＰＳａｓｅにおける９４７位から９５１位のアミノ酸配列は、配列番号１〜９の配列のいずれかである。９４８位のセリンがフェニルアラニンで置換された既知のｆｂｒ ＣＰＳａｓｅ、及びエシェリヒア・コリの野生型ＣＰＳａｓｅの対応するアミノ酸配列を、表１に示す。
【００１８】
【表１】
変異型ＣＰＳａｓｅは、ＣＰＳａｓｅ活性が損なわれない限り、９４７位〜９５１位以外の一または複数の位置で、一または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、もしくは付加を含んでいてもよい。「複数」のアミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造中のアミノ酸残基の位置またはタイプにより異なる。これは以下の理由による。すなわち、いくつかのアミノ酸は互いに高い相同性を有し、そのようなアミノ酸の相違はタンパク質の三次元構造に大きな影響を与えない。したがって、本発明の変異型ＣＰＳａｓｅは、ＣＰＳａｓｅを構成する全アミノ酸残基に関して３０〜５０％以上、好ましくは５０〜７０％の相同性を有し、かつ、ｆｂｒ ＣＰＳａｓｅ活性を有するものものであってもよい。
尚、変異型ＣＰＳａｓｅは、ウリジン５’−一リン酸非存在下での酵素活性が、野生型ＣＰＳａｓｅの活性の２５％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上の活性を保持していることが好ましい。
【００２０】
本発明において、「９４７位〜９５１位の配列に相当するアミノ酸配列」とは、配列番号２０のアミノ酸配列における９４７位〜９５１位のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を意味する。アミノ酸残基の位置は、変化し得る。例えば、あるアミノ酸残基がＮ−末端位に挿入されると、９４７位に本来位置していたアミノ酸残基は９４８位になる。その様な場合、最初の９４７位に相当するアミノ酸残基は、本発明において９４７位のアミノ酸残基として示される。
【００２１】
用語「ウリジン５’−一リン酸によるフィードバック阻害が脱感作された」とは、フィードバック阻害の程度が低下したことを意味する。フィードバック阻害の程度の低下は、ウリジン５’−一リン酸存在下でのＣＰＳａｓｅ活性の低下を測定し、配列番号２０のアミノ酸配列を有するタンパク質のそれと比較することで決定することができる。さらに、用語「ウリジン５’−一リン酸によるフィードバック阻害が脱感作された」は、実質的に阻害が脱感作されていればよく、完全に脱感作されることは必須ではない。
【００２２】
具体的には、変異型ＣＰＳａｓｅは、５ｍＭのグルタミンを基質としたときに、ウリジン５’−一リン酸非存在下の活性に対する、１０ｍＭのウリジン５’−一リン酸存在下での活性の割合が、５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上であることが好ましい。
【００２３】
上記の変異型ＣＰＳａｓｅと実質的に同一のタンパクをコードするＤＮＡは、例えばヌクレオチド配列を改変すること、例えば、ある特定の部位で一または複数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、または付加されるように部位特異的突然変異誘発法により、取得することができる。上記のように改変されたＤＮＡは、通常知られる突然変異処理法で取得され得る。突然変異処理法としては、例えば、変異型ｃａｒＢ遺伝子を含むＤＮＡを、インビトロでヒドロキシルアミンで処理する方法、及び、例えば変異型ｃａｒＢ遺伝子を保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射、またはその様な処理に通常使われるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）及び亜硝酸のような突然変異誘発物質で処理する方法が挙げられる。
【００２４】
上記のようなヌクレオチドの置換、欠失、挿入、または付加はまた、自然に起こる変異（mutant又はvariant）、例えば、ＣＰＳａｓｅを持つ個体の違いまたは種もしくは属の違いによる変異を含む。変異型ＣＰＳａｓｅと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、突然変異処理された変異型ＣＰＳａｓｅを保持する細胞から、プローブとして既知のｃａｒＢ遺伝子配列またはその一部を持つＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＣＰＳａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することにより得られる。
【００２５】
ここでいう用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異なハイブリッドが形成されない条件を意味する。この条件を、正確に数値を用いて表すことは困難であるが、例えばストリンジェントな条件は、高いホモロジーを有するＤＮＡ、例えば互いに５０％以上のホモロジーを有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それよりも低いホモロジーを有するＤＮＡは互いにハイブリダイズしないような条件が挙げられる。あるいは、ストリンジェントな条件としては、サザンハイブリダイゼーションにおける通常の洗いの条件に相当する塩濃度でＤＮＡ同士が互いにハイブリダイズする条件、例えば６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳが挙げられる。
【００２６】
上記の条件下でハイブリダイズし得る遺伝子の中には、遺伝子のコード領域内に終止コドンを有するもの、及び、活性中心の変異により活性を持たないものが含まれる。しかし、そのような不都合は、市販の発現ベクターに遺伝子を連結し、発現したタンパク質のＣＰＳａｓｅ活性を調べることで、簡単に除くことができる。
【００２７】
本発明のＣＰＳａｓｅが、変異型の大サブユニットと小サブユニットからなるヘテロダイマーである場合、小サブユニットとしては、エシェリヒア・コリの野生型ＣＰＳａｓｅの小サブユニットが挙げられる。報告されている小サブユニット遺伝子（ｃａｒＡ）の塩基配列及びＣａｒＡのアミノ酸配列（GenBank Accession AE000113 U00096）を、配列番号３２及び３３に示す。
本発明においては、大サブユニットとともにＣＰＳａｓｅ活性を有している限り、小サブユニットは、一または複数の位置で、一または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、もしくは付加を含んでいてもよい。「複数」の意味は、前記大サブユニットと同様である。
上記のような小サブユニットと実質的に同一のポリペプチドをコードするＤＮＡとして具体的には、ｃａｒＡまたはその一部を持つＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。「ストリンジェントな条件」の意味は、前記と同様である。
【００２８】
＜２＞本発明のエシェリヒア属細菌
本発明のエシェリヒア属細菌は、上記の変異型ｃａｒＢ遺伝子が導入されたエシェリヒア属細菌である。エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリが挙げられる。変異型ｃａｒＢ遺伝子は、例えば、エシェリヒア属細菌で機能するベクター及び変異型ｃａｒＢ遺伝子を含む組換えＤＮＡでエシェリヒア属細菌を形質転換することで得られる。変異型ｃａｒＢ遺伝子は、染色体上のｃａｒＢ遺伝子を変異型ｃａｒＢ遺伝子と置換することによっても得ることができる。
【００２９】
変異型ｃａｒＢ遺伝子の導入に使われるベクターとしては、pBR322、pMW118、pUC19等のようなプラスミドベクター、l1059、lBF101、M13mp9等のようなファージベクター、及びMu、Tn10、Tn5等のようなトランスポゾンが挙げられる。
【００３０】
エシェリヒア属細菌へのＤＮＡの導入は、例えば、D. A. Morrisonの方法（Methods in Enzymology, 68, 326(1979)）、または受容菌を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel, M., and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159, (1970)）等により行うことができる。
【００３１】
Ｌ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘導体のようなカルバモイルリン酸から誘導される化合物の生産量は、上記のようなエシェリヒア属に属する生産菌に変異型ｃａｒＢを導入することで上昇させることができる。また、Ｌ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘導体のような化合物の生産能は、あらかじめ変異型ｃａｒＢ遺伝子が導入された細菌に付与してもよい。上記ピリミジン誘導体としては、オロト酸、ウリジン、ＵＮＰ、シチジン及びＣＭＰが挙げられる。
【００３２】
Ｌ−アルギニン生産能を有するエシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリAJ11531及びAF11538（特開昭56-106598号）、AJ11593（FERM P-5616）及びAJ11594（FERM P-5617）（特開昭57-5693号）、VKPM B-7925（ロシア特許出願第2000117677号）が挙げられる。VKPM B-7925は、２０００年４月１０日より、ルシアン・ナショナル・コレクション・フォー・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（ＶＫＰＭ）に寄託されている。
【００３３】
エシェリヒア属に属するＬ−シトルリン生産菌、エシェリヒア属に属するオロト酸生産菌、及びエシェリヒア属に属する５’−一リン酸（ＵＭＰ）生産菌は現在知られていない。
【００３４】
Ｌ−シトルリン生産能を有するバチルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス（B. subtilis）K-X-1 A-1株（ATCC No 15561）及びK-1 A-9株（ATCC No 15562）（米国特許第3,282,794号）、バチルス sp. cit-70株（特開平08-089269号）が例示される。Ｌ−シトルリン生産能を有するブレビバクテリウム（Brevibacteria）属細菌としては、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）AJ3408株（FERM P-1645）（米国特許第5,164,307号）、及びAJ11677株（特開昭57-163488号）が挙げられる。Ｌ−シトルリン生産能を持つコリネバクテリウム属細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）AJ11588株（FERM P-5643）（米国特許第5,164,307号）が挙げられる。
【００３５】
オロト酸生産能を有するバチルス属細菌としては、オロト酸フォスフォリボシルトランスフェラーゼを欠損したバチルス・ズブチリスFERM P11402（特開平04-004891号）が挙げられる。ＵＭＰ生産能を持つコリネバクテリウム属細菌としては、５−フルオロウラシル耐性のコリネバクテリウム・グルタミカム T-26株（FERM BP-1487）、５−フルオロウラシル及びトリメトプリムに耐性なT-29株（FERM BP-1487）、ならびに５−フルオロウラシル及びスルファグアニジンに耐性なT-30株（FERM BP-1489）（欧州特許EP0312912）が挙げられる。
【００３６】
ＵＭＰ生産能を有するコリネバクテリアとしては、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）LK 40-2株（VKPM B-7811）、LK 75-15（VKPM B-7812）、及びLK 75-66（VKPM B-7813）（ロシア特許出願第99122774号）が挙げられる。
【００３７】
＜３＞Ｌ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘導体の製造方法
Ｌ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘導体のような化合物は、変異型ｃａｒＢ遺伝子が導入され、同化合物を生産する能力を有する細菌を培地で培養し、同化合物を培地中に生成、蓄積させ、それらを培地から回収することにより、効率よく生産することができる。上記ピリミジン誘導体としては、オロト酸、ウリジン、ＵＭＰ、シチジン及びＣＭＰが挙げられる。
【００３８】
本発明の方法において、エシェリヒア属細菌の培養、液体培地からの化合物の回収と精製は、細菌を用いた発酵によるＬ−アルギニン生産のための通常の方法と同様にして行うことができる。培養に使用される培地は、炭素源及び窒素、無機質ならびに、必要に応じて、細菌の成長に必要な適量の栄養分を含む限り、合成培地または天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、使用する細菌の資化能によって、グルコース及びスクロースのような種々の炭水化物、及び種々の有機酸が挙げられる。エタノール及びグリセロールのようなアルコールも使用することができる。窒素源としては、アンモニア、種々のアンモニウム塩、アミンのよう他の窒素化合物、ペプトンのような天然の窒素源、ダイズ水解物及び醗酵性微生物の消化物が使用される。無機質としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムが使用される。
【００３９】
培養は、好ましくは振盪、通気及び撹拌培養のような好気的な状態下で行われる。培養は、通常２０℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３８℃の間で行われる。培養は、通常５〜９、好ましくは６．５〜７．２の間のｐＨで行われる。培養液のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基、及び緩衝液で調整することができる。通常、１日〜３日の培養で、培養液中に化合物が蓄積する。
【００４０】
化合物の単離は、培養の後に遠心分離や濾過により細胞のような固形物を培養液から取り除き、続いてイオン交換、濃縮及び結晶分画法により化合物を回収及び精製することで、行うことができる。
【００４１】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００４２】
【実施例１】
エシェリヒア・コリの野生型ｃａｒＡＢ遺伝子を持つプラスミドpBScarAB-13を、あらかじめBamHI及びPstIで消化したpBluescript II SK(+)ベクター（Fermentas, Lithuania）に、エシェリヒア・コリ染色体からのAvaIII-BglIIＤＮＡ断片（４９１１ｂｐ）をクローニングすることにより構築した。
【００４３】
プラスミドpET22-b(+)（Novagen, USA）は、T7プロモーターをlacプロモーターで置換するように改変した。lacプロモーターは、pUC18プラスミドをテンプレートとして、オリゴヌクレオチド
5'-accagatctgcggcagtgagcgcaacgc-3'（配列番号２１）、及び
5'-gtttctagatcctgtgtgaaattgttatccgc-3'（配列番号２２）
をプライマーとして用いて、ＰＣＲ増幅により取得した。得られたlacプロモーターを含む断片（0.14kb）は、制限酵素BglII及びXbaIで消化し、同じ酵素で処理したpET21-b(+)ベクター中にクローニングした。得られたプラスミドpET-Placは、プラスミドpBScarAB-13からプロモーターを持たないｃａｒＡＢ遺伝子をクローニングするのに用いた。
【００４４】
ｃａｒＡ遺伝子の５’末端（1.18kb）は、pBScarAB-13をテンプレートとして、オリゴヌクレオチド
5'-cctctagaaataaagtgagtgaatattc-3'（配列番号２３）、及び
5'-cttagcggttttacggtactgc-3'（配列番号２４）
をプライマーとして用いて、ＰＣＲ増幅により取得した。得られた断片はXbaI及びDraIIIで消化し、ｃａｒＡ遺伝子の５’−末端配列を含むXbaI-DraIII断片（0.61kb）をアガロース電気泳動により精製した。この断片、pBScarAB-13プラスミドより得たDraIII-SacI断片（ｃａｒＡ遺伝子及びｃａｒＢ遺伝子の３’−末端配列を含んでいる）及びpET-Plac/XbaI-SacIベクターの混合物を連結し、エシェリヒア・コリＴＧ１細胞を形質転換した。得られた組換えプラスミドpEL-carAB-wtは、lacプロモーターの制御下で、野生型ｃａｒＡＢオペロンの配列を持っている。
【００４５】
ＰＣＲ増幅に用いたTaKaRa La DNA Polymeraseは、宝酒造(株)（日本）より入手し、推奨される条件で使用した。
【００４６】
＜１＞ランダム化断片による突然変異誘発
プラスミドpBScarAB-13をテンプレートとして用い、センスプライマーＰ１：5'-ggtcgtgcgctgNN(T/C)N(T/C)CNN(T/C)NNN(G/A)NNggcgataaagaacgcgtggtg-3'（配列番号２５）（４８塩基）をｃａｒＢ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいてデザインし、標準Ｍ１３ダイレクトシークエンスプライマーを、アンチセンスプライマーとして用いた。プライマーＰ１の固定された５’末端１２ヌクレオチド、及び固定された３’末端２１ヌクレオチドは、ｃａｒＢ遺伝子のＧｌｕ９５１コドンの下流、及びＬｅｕ９４７コドンの上流の配列にそれぞれ相同性を有する。
【００４７】
0.75kbp ＤＮＡ断片（ｃａｒＢ遺伝子の３’末端）が、ランダム化された１５ヌクレオチドとＰ１プライマーを用いて、１段目のＰＣＲで増幅された。
１段目のＰＣＲは以下のようにして行った。100ngのpBScarAB-13を、10pmol濃度の２つのプライマーそれぞれを含むＰＣＲ溶液に、テンプレートとして加えた。2400 DNAサーマルサイクラー（Perkin-Elmer Co., Foster City, Calif.）を用いて15PCRサイクル（94℃で15秒、52℃で20秒、72℃で１分）を行った。
【００４８】
二回目の増幅として、次の15サイクル（94℃で１分、35℃で１分、72℃で２分）を行った。その際、増幅断片の（−）鎖が遺伝子全長を得るためにそれを伸長させるための「プライマー」として機能させた。
【００４９】
三段目の増幅として、反応混合液の10μl分を、100pmolのセンスプライマー：Ｍ１３ダイレクトシークエンスプライマー、及びアンチセンスとしてプライマーＰ２：5'-ccacttcctcgatgacgcgg-3'（配列番号２６）を含む新鮮な90μlの反応混合液に添加し、さらに15サイクル（94℃で0.5分、55℃で20秒、72℃で２分）を行った。
【００５０】
ｃａｒＢ遺伝子の３’末端断片の様々な変異体のプールをコードする1.32kbのDNA断片を、アガロースゲル電気泳動で精製し、次いでAflII及びSacIで消化した後、あらかじめ同じ制限酵素で消化したpEL-carAB-wtベクターに連結し、pEL-carAB-NNを得た。
【００５１】
後の実験で、約150ngの連結されたＤＮＡを、エシェリヒア・コリＴＧ１（supE hsdΔ5 thiΔ(lac-proAB)F'[traD36 proAB+ lacq lacZΔM15]）（J. Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989）受容細胞の形質転換に用い、約2000の組換えクローンが得られた。組換えプラスミド（pEL-carAB-NN）のプールを精製し、活性ＣａｒＡＢ酵素を持つ組換えプラスミドpEL-carAB-NNを選択するために用いたエシェリヒア・コリVKPM B-6969（car:Tn10）を形質転換した。
【００５２】
＜２＞部位特異的突然変異誘発
単一変異Ser948Pheを導入するために、プラスミドpBScarAB-13をテンプレートとして、ｃａｒＢ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計したセンスプライマー5'-cgtgcgctgcttttcgtgcgcgaaggcgataaag-3'（３４塩基）（配列番号２７）、及び、アンチセンスプライマーとして標準Ｍ１３ダイレクトシークエンスプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅及び断片のクローニングは、上記のようにして行った。
【００５３】
単一変異を持つｃａｒＢ遺伝子の３’末端断片をコードする1.32kbpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、AflII及びSacIで消化し、次いで同じ制限酵素であらかじめ消化したpEL-carAB-wtベクターに連結した。およそ100ngの得られたＤＮＡプラスミドを、エシェリヒア・コリVKPM B-6969の形質転換に用い、単一置換Ser948Pheを有する活性ＣａｒＡＢ酵素をコードするｃａｒＡＢ遺伝子を保持するリコンビナントプラスミドpEL-carAB-6を選択した。
【００５４】
【実施例２】
新規ｃａｒＢ変異体の単離及び触媒特性に対するＣＰＳａｓｅのアミノ酸配列置換の効果
初めに、４０株の組換えB-6969（pEL-carAB-NN）クローンで、ＣａｒＡＢ活性及びそのＵＭＰに対するフィードバック耐性を、ＣａｒＡＢ及びＡｒｇＩ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）酵素により触媒される、オルニチンからのシトルリン生合成の反応において評価した。
反応の概要は以下の通りである。
【００５５】
【化１】
この反応中、カルバモイルリン酸シンセターゼは、遊離のＮＨ4 +を基質として用いる。
【００５７】
４０株のB-6969（pEL-carAB-NN）及びＴＧ１（pUC18-argI）の細胞のタンパク質抽出物を、(NH4)2SO4（75％飽和）を用いた沈殿により、超音波処理を行った粗細胞抽出液から調製した。タンパク質の沈殿物は、以下の組成の緩衝液に溶解された。Tris-HCl(50mM), pH7.5、2-メルカプトエタノール（2mM）。
【００５８】
テスト系は、B-6969(pEL-carAB-NN）株及びＴＧ１（pUC18-argI）のタンパク抽出物、及び、以下の試薬を含む。ATP（8mM）、MgSO4（8mM）、(NH4)2SO4（200mM）、Na2CO3（8mM）及びオルニチン（1mM）、（pH7.5）。
【００５９】
反応混合液中のオルニチン及びシトルリン含有量は、以下の組成の液相を用いてＴＬＣで解析した。イソプロパノール／酢酸エチル／水酸化アンモニウム／Ｈ2Ｏ＝40/20/13/27（v/v）。
【００６０】
活性を有し、かつＵＭＰに対するフィードバック耐性である変異型ＣＰＳａｓｅを発現する９クローン、及び、単一置換Ｓｅｒ９４８Ｐｈｅを有するＣＰＳａｓｅを発現する１クローンを、変異酵素活性の計測に用いた。
【００６１】
前記１０クローンのプラスミドを精製し、ダイデオキシチェーンターミネーション法を用いて、ｃａｒＢ遺伝子のランダム化断片の配列を決定した（表１）。
次いで、これら９クローンのB-6969（pEL-carAB-NN）及び１クローンのB-6969（pEL-carAB-6）のタンパク抽出物を、グルタミン及びアンモニアからのカルバモイルリン酸（ＣＰ）合成反応における変異型ＣＰＳａｓｅの活性及びｆｂｒを評価するために用いた。
【００６２】
粗細胞抽出液は、0.5mlのバッファーＡ（200mM K2HPO4/KH2PO4、pH8.0、1mM EDTA、1mM PMSF、1mM DTT）に懸濁した20mg湿細胞ペレットを超音波処理することで調製し、６５％飽和に達する固形硫酸アンモニウムで処理した。10分間４℃でインキュベートした後、懸濁液を13,000rpmで10分間遠心し、沈殿物を１mlのバッファーＢ（20mM K2HPO4/KH2PO4，pH8.0、50mM KCl、1mM PMSF、1mM DTT）に溶解させた。得られたタンパク質抽出物を、ＣＰＳａｓｅ活性の評価に用いた。反応の概要は、以下のとおりである：
【００６３】
【化２】
I. Gln + CO2 + 2MgATP + H2O → NH2COOPO3 2- + 2MgADP + Glu + Pi
II. NH3 + CO2 + 2MgATP + H2O → NH2COOPO3 2- + 2MgADP + Pi
【００６４】
50μlの各反応混合液は、以下のものを含む。
反応I：20mM tris-HCl、pH8.0、100mM KCl、5mM Na2CO3、10mM ATP、10mM MgCl2、5mMグルタミン、10μlタンパク質抽出物、
反応II：20mM tris-HCl、pH8.0、100mM KCl、5mM Na2CO3、10mM ATP、10mM MgCl2、200mM (NH4)2SO4、10μlタンパク質抽出物。
【００６５】
また、反応Iの系列を、ＣＰＳａｓｅのフィードバック阻害レベルを評価するため、10mM UTP存在下で行った。
10分間37℃でインキュベーションを行った後、等量のＥｔＯＨを加えて反応を停止させ、10分間-20℃に冷やし、室温で１分間13,000rpmで遠心を行った。上清は-20℃に冷却した。
【００６６】
反応混合液中のＣＰ含有量は、キャピラリーゾーン電気泳動で解析した。分離は、Quanta 4000Eキャピラリー電気泳動システム（「Waters」、ＵＳＡ）上で、254nmのＵＶ非直接検出で行った。インジェクションは。静水圧で２５秒間行った。分離は、コートしていない融合シリカキャピラリー（７５ｕ I.D．*60cm、有効長53cm）で行い、-25kVの電位で操作した。温度は20℃に維持した。分離緩衝液は、50mM Tris base、25mM安息香酸（非直接検出の場合）pH8.5、0.25mM TTAB（tetradecyl-trimethyl-ammonium bromide）（電気浸透流の逆流用）からなる。ＣＰ合成の反応における変異型ＣＰＳａｓｅの活性の測定値及びｆｂｒのデータを、表２に示す。
【００６７】
【表２】
このように、変異型ＣＰＳａｓｅは、本質的にＵＭＰに非感受性であるが、単一変異は、酵素活性を顕著に低下させた。これらの結果は、９４７位〜９５１位のアミノ酸残基からなるペプチド断片は、ＵＭＰによるＣＰＳａｓｅのフィードバック阻害に関与し、変異型ＣＰＳａｓｅの触媒効率のレベルにもまた関与していることを示している。野生型ＣａｒＡＢ及び変異型ＣａｒＡＢ−３４をコードする遺伝子を、プラスミドpMW119中にクローニングした。この目的のため、プラスミドpEL-carAB-wt及びpEL-carAB-34を、制限酵素SacI及びＸbaIで消化し（これらのプラスミドが２つのXbaIサイトを持つため、部分処理した）、ｃａｒＡＢ遺伝子をコードする断片を、あらかじめ同じ制限酵素で処理したpMW119ベクター中にクローニングした。その結果、lacプロモーター制御下にあるｃａｒＡＢ遺伝子を持つ、低コピー数のpMW119carAB-wt及びpMW119carAB-34プラスミドが得られた。
【００６９】
【実施例３】
変異型ｃａｒＡＢ遺伝子を持つ株を用いたオロト酸の生産
３１１株は、ａｒｇＡ遺伝子にＴｎ１０が挿入されたエシェリヒア・コリＫ１２（VKPM B-3853）から、６−アザウラシル（1mg/ml）耐性変異株として誘導された。３１１株は、ルシアン・ナショナル・コレクション・フォー・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（ＶＫＰＭ）に、２００１年３月５日より受託番号VKPM B-8085として寄託され、２００２年７月１７日にブダペスト条約の規定にしたがって国際寄託に移管されている。
【００７０】
３１１株を、pMW119carAB-wt及びpMW119carAB-34プラスミドで形質転換し、得られた組換え株オロト酸生産を、異なる濃度のウリジン存在下で調べた。
【００７１】
以下の条件で試験管発酵を行った。1/20希釈の一夜培養液、60g/Lグルコース、25g/L硫酸アンモニウム、2g/L KH2PO4、1g/L MgSO4、0.1mg/Lチアミン、5g/Lイーストエクストラクト（Difco）、25 g/L炭酸カルシウム、以上1Lの水道水中（pH7.2）。グルコース及び炭酸カルシウムは別個に滅菌した。2mlの培地を試験管に入れ、32℃で３日間振盪しながら培養を行った。オロト酸生産のレベルは、HPLCにより評価した（表３）。
【００７２】
【表３】
表３に示すように、変異ｃａｒＡＢ遺伝子を保持する311（pMW119carAB-34）株は、親株311(pMW119)株及び野生型ｃａｒＡＢ遺伝子を保持する311(pMW119carAB-wt)株に比べ、多くのオロト酸を生産した。
【００７４】
【実施例４】
変異ｃａｒＡＢ遺伝子を保持する株を用いたアルギニン及び／又はシトルリンの生産
アルギニン生産株である３３３株及び３７４株は、トランスポゾンTn5がilvA遺伝子に挿入されたエシェリヒア・コリ５７株（VKPM B-7386）の誘導体から、６−アザウラシル（1mg/ml）に耐性な変異株として選択された。３３３株及び３７４株は、ルシアン・ナショナル・コレクション・フォー・インダストリアル・マイクロオーガニズムスロシア（ＶＫＰＭ）に、２００１年３月５日より、それぞれ受託番号VKPM B-8084及びVKPM B-8086として寄託され、各々２００２年７月１７日にブダペスト条約の規定にしたがって国際寄託に移管されている。
【００７５】
３３３株及び３７４株を、プラスミドpMWcarAB-wt及びpMWcarAB-34で形質転換し、それらの組換え株のアルギニン及びシトルリンの生産を調べた。試験管発酵は、実施例３と同じ方法で行った。100mg/Lのウリジンを含む合成培地での333(pMWcarAB-wt)株及び333(pMWcarAB-34)株のアルギニン及び／又はシトルリンの生産量を、表４に示す。
【００７６】
【表４】
100mg/Lのウリジンを含む合成培地での374(pMWcarAB-wt)株及び374(pMWcarAB-34)株によるシトルリン生産レベルを、表５に示す。
【００７８】
【表５】
表４に示されるように、変異型ｃａｒＡＢ遺伝子を保持する333(pMWcarAB-34)株は、野生型ｃａｒＡＢ遺伝子を保持する株に比べて、多くのアルギニン及びシトルリンを生産した。また、表５に示されるように、374(pMWcarAB-34)株は、野生型ｃａｒＡＢ遺伝子を保持する株よりも多くのシトルリンを生産した。
【００８０】
【発明の効果】
本発明により、フィードバック阻害が脱感作され、かつ、高い活性を維持する変異型カルバモイルリン酸シンセターゼが提供される。同酵素を保持するエシェリヒア属細菌は、発酵法によるＬ−アルギニン、シトルリン及びピリミジン誘導体の効率的な製造に好適に利用することができる。
【００８１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミドpEL-carAB-wtの構築のスキームを示す。
【図２】 変異型ｃａｒＢ遺伝子のプールの構築のスキームを示す。
Claims (9)
- エシェリヒア・コリ由来のカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットであって、配列番号２０の９４７位〜９５１位に相当するアミノ酸配列が、配列番号１〜９のアミノ酸配列のいずれかと置換され、かつ、ウリジン５'−一リン酸によるフィードバック阻害が脱感作されたカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニット。
- 配列番号２０の９４７位〜９５１位のアミノ酸配列が配列番号１〜９のアミノ酸配列のいずれかと置換され、ウリジン５'−一リン酸によるフィードバック阻害が脱感作された、請求項１に記載のカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニット。
- ９４７位〜９５１位以外の一または複数の位置における、一または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加を有し、かつ、ウリジン５'−一リン酸によるフィードバック阻害が脱感作された、請求項１に記載のカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニット。
- 請求項１〜３のいずれか一項に記載のカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットを含む、カルバモイルリン酸シンセターゼ。
- 請求項１〜３のいずれか一項に記載のウリジン５'−一リン酸によるフィードバック阻害が脱感作されたカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットをコードするＤＮＡ。
- 請求項１〜３のいずれか一項に記載のウリジン５'−一リン酸によるフィードバック阻害が脱感作されたカルバモイルリン酸シンセターゼの大サブユニットと、エシェリヒア・コリのカルバモイルリン酸シンセターゼの小サブユニットをコードするＤＮＡ。
- 請求項５又は６に記載のＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌。
- Ｌ−アルギニン、シトルリン及びオロト酸からなる群より選択される化合物を生産する能力を有する請求項７に記載の細菌。
- 請求項７又は８に記載の細菌を培地で培養し、同培地中にＬ−アルギニン、シトルリン及びオロト酸からなる群より選択される化合物を生成、蓄積させ、該培養液より前記化合物を回収する、Ｌ−アルギニン、シトルリン及びオロト酸からなる群より選択される化合物の製造方法。
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