JP5287904B2

JP5287904B2 - 目的物質の製造法

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Publication number: JP5287904B2
Application number: JP2011042797A
Authority: JP
Inventors: 洋子山本; 久生伊藤
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2003-06-05
Filing date: 2011-02-28
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2024-06-04
Also published as: EP1484410A1; BRPI0401918A; CN1572868A; US7335496B2; CN100564516C; KR20040105568A; EP1484410B1; JP2011103899A; ATE531803T1; BRPI0401918B1; US20050170474A1; KR101110580B1

Description

本発明は、細菌を利用した目的物質の製造法に関し、詳しくは、Ｌ−アミノ酸、核酸、抗生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質などの目的物質を細菌を利用して製造する方法において、最終目的産物である物質の生産性を向上するための手段を提供するものである。

微生物を用いた発酵法によってＬ−アミノ酸等の目的物質を製造するには、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持った株を用いる方法等がある。

近年は、目的物質の発酵生産に、組換えＤＮＡ技術を用いることが行われている。例えば、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現を増強すること（特許文献１、２）、又はＬ−アミノ酸生合成系への炭素源の流入を増強すること（特許文献３）によって、微生物のＬ−アミノ酸生産性を向上させることが行われている。

さらに、目的物質の生産能を向上させる方法として、物質の取り込み系、又は排出系を改変する方法が知られている。例えば、取り込み系に関しては、目的物質の細胞内への取り込み系を欠失又は低下させることにより、目的物質の生産能を高める方法がある。具体的には、gluABCDオペロン又はその一部を欠失させ、Ｌ−グルタミン酸の取り込み系を欠失又は低下させる方法（特許文献４）、及び、プリンヌクレオシドの細胞内へ取り込みを弱化することによってプリンヌクレオシド生産能を強化する方法（特許文献５）等が知られている。

また、排出系に関しては、目的物質の排出系を強化する方法、及び、目的物質の生合成系の中間体又は基質の排出系を欠損又は弱化させる方法が知られている。目的物質の排出系を強化するものとしては、例えば、Ｌ−リジン排出遺伝子（lysE）を強化したコリネバクテリウム属細菌の菌株を用いたＬ−リジンの製造法が開示されている（特許文献６）。後者としては、目的物質がＬ−グルタミン酸の場合に、α−ケトグルタレートパーミアーゼ遺伝子を変異又は破壊することにより、目的物質の中間体であるα−ケトグルタル酸の排出を強化する方法が知られている（特許文献７）。

また、物質の細胞膜の透過に関与するＡＴＰ結合カセット（ATP binding cassette）スーパーファミリー（ＡＢＣトランスポーター）をコードする遺伝子を、アミノ酸の細胞膜輸送が改変された微生物の育種に用いることが示唆されている（特許文献８）。

他方、コリネ型細菌において、スクロースの細胞内への取り込みに関与するタンパク質であるスクロースＰＴＳエンザイムＩＩをコードする遺伝子を、アミノ酸及び核酸等の生産性が向上した菌株の育種等に利用することが示唆されている（特許文献９）。また、スクロースＰＴＳ遺伝子群又はスクロース非ＰＴＳ遺伝子群を用いて、エシェリヒア属細菌のＬ−アミノ酸の生産性を向上させる技術が知られている（特許文献１０）。

ところで、目的物質の副生物の生合成系を欠損又は弱化することによって、副生物を低減させる技術が知られている（例えば、非特許文献１）。しかしながら、この方法では、用いる微生物を培養する際に、生育に必要な量の前記副生物を培地に添加する必要がある。

一方、目的物質の副生物の取り込み系を強化することにより、目的物質の生産性を向上させることは知られていない。尚、Ｌ−トリプトファンの取り込み系としては、Ｌ−トリプトファン特異的な取り込み系としてMtr（非特許文献２）及びTnaB（非特許文献３）が、芳香族アミノ酸に共通な取り込み系としてAroP（非特許文献４）が知られている。

米国特許第5168056号明細書米国特許第5776736号明細書米国特許第5906925号明細書欧州特許出願公開第1038970号明細書欧州特許出願公開第1004663号明細書国際公開第97/23597号パンフレット国際公開第01/005959号パンフレット国際公開第00/37647号パンフレット欧州特許出願公開第1197555号明細書米国特許出願公開第2001/0049126号明細書

「アミノ酸発酵」学会出版センター、１９８６年、p.４ヒートウォール（Heatwole, V.M.）ら、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.）」、アメリカン・ソサエティー・フォー・マイクロバイオロジー（American Society for Microbiology）、１９９１年１月、第１７３巻、ｐ．１０８−１１５サルセロ（Sarsero, J.P.）ら、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.）」、アメリカン・ソサエティー・フォー・マイクロバイオロジー（American Society for Microbiology）、１９９１年５月、第１７３巻、第１０号、ｐ．３２３１−３２３４ミー−リン（Mee-Len, C.）ら、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol.）」、アメリカン・ソサエティー・フォー・マイクロバイオロジー（American Society for Microbiology）、１９８６年８月、第１６７巻、第２号、ｐ．７４９−７５３

本発明は、Ｌ−アミノ酸、抗生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質などの目的物質を細菌を利用して製造する方法において、副生物を低減する方法、好ましくは目的物質の生産性を改善する方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、目的物質の副生物の細胞内への取り込み系が強化されるように改変された細菌は、副生物の生成が低減することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。

（１）目的物質を生産する細菌を培地に培養し、培地中に目的物質を生成、蓄積させ、同培地から目的物質を採取する、目的物質の製造法において、
前記細菌は、前記目的物質の副生物、又は目的物質の生合成系の基質の細胞内への取り込み系が強化されるように改変されたことを特徴とする方法。
（２）前記副生物が、目的物質の生合成経路の中間体、基質、又は同経路から分岐する他の生合成系の産物である、（１）の方法。
（３）前記細菌がエシェリヒア属細菌である（１）又は（２）の方法。
（４）目的物質がＬ−フェニルアラニンであり、副生物がＬ−トリプトファンである（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）前記副生物の取り込み系が、Ｍｔｒ及びＴｎａＢから選ばれる（１）〜（４）のいずれかの方法。
（６）ｍｔｒ遺伝子又はｔｎａＢ遺伝子のコピー数を高めること、又はこれらの遺伝子の発現が増強されるように、これらの遺伝子の発現調節配列が改変されたことにより、Ｍｔｒ又はＴｎａＢの活性が上昇した（５）の方法。
（７）目的物質を生産し、かつ、目的物質の副生物、又は目的物質の生合成系の基質の細胞内への取り込み系が強化されるように改変されたエシェリヒア属細菌。
（８）Ｌ−フェニルアラニンを生産し、かつ、Ｍｔｒ及びＴｎａＢから選ばれるＬ−トリプトファンの取り込み系が強化された（７）のエシェリヒア属細菌。
（９）ｍｔｒ遺伝子又はｔｎａＢ遺伝子のコピー数を高めること、又はこれらの遺伝子の発現が増強されるように、これらの遺伝子の発現調節配列が改変されたことにより、Ｍｔｒ又はＴｎａＢの活性が上昇した（８）のエシェリヒア属細菌。

本発明によれば、Ｌ−アミノ酸等の目的物質を、細菌を用いて製造する際に、副生物を低減させることができる。本発明の好ましい形態によれば、目的物質の生産性を向上させることができる。
また、細菌を培養する際に、生育に必要な要求物質を培地に添加する必要がない。さらに、培地中の副生物の量を低減することができるため、培地からの目的物質の精製が容易になる場合がある。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の細菌は、目的物質を生産し、かつ、目的物質の副生物、又は目的物質の生合成系の基質の細胞内への取り込み系が強化されるように改変された細菌である。本発明の細菌としては、目的物質を生産し、かつ、目的物質の副生物、又は目的物質の生合成系の基質の取り込み系を有するものであれば特に制限されない。また、この条件を満たす限り、従来、産業上利用されていない細菌であっても、本発明を適用することができる。本発明の細菌は、本来目的物質を生産する能力を有するものであってもよいし、変異法や組換えＤＮＡ技術などを利用した育種により目的物質を生産する能力を付与されたものであってもよい。

具体的には、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌、セラチア・マルセッセンス等のセラチア属細菌等が挙げられるが、これらに制限されない。

「目的物質を生産する」とは、本発明に用いる細菌を培地に培養したときに、目的物質を細胞又は培地から回収できる程度に生産する能力を有することをいう。好ましくは、細菌の野生株又は非改変株よりも、多量の目的物質を生産する能力を有することをいう。

本発明により製造される目的物質は、細菌によって生産され得る物質であれば特に制限されず、例えばＬ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン等の種々のＬ−アミノ酸が挙げられる。その他にも、グアニル酸、イノシン酸等の核酸類、ビタミン類、抗生物質、成長因子、生理活性物質など、細菌により生合成される物質のうち、その生合成の中間体又は基質の排
出系が存在するものであれば、いかなるものでもよい。また、現在細菌を利用して生産されていない物質であっても、目的物質の副生物、又は目的物質の生合成系の基質の取り込み系が存在するものであれば本願発明を利用できる。

Ｌ−フェニルアラニン生産菌としては、エシェリヒア・コリAJ12741（FERM P-13000）(特許第3225597号）及びAJ12604（FERM BP-3579)(欧州特許出願公開第488,424号参照)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12637（FERM BP-4160)(フランス特許出願公開第 2,686,898号参照）等が挙げられる。その他、目的物質がＬ−スレオニンの場合はエシェリヒア・コリVKPM B-3996(RIA 1867)(米国特許第5,175,107号参照）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ12318（FERM BP-1172)(米国特許第5,188,949号参照）等が、Ｌ−リジンの場合はエシェリヒア・コリ AJ11442（NRRL B-12185, FERM BP-1543)(米国特許第4,346,170号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ3990（ATCC31269)(米国特許第4,066,501号参照）等が、Ｌ−グルタミン酸の場合はエシェリヒア・コリ AJ12624 (FERM BP-3853)(フランス特許出願公開第2,680,178号参照）、エシェリヒア・コリ AJ13199（FERM P-15573)(特開平7-203980号参照)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12475（FERM BP-2922)(米国特許第5,272,067号参照）等が、Ｌ−ロイシンの場合はエシェリヒア・コリ AJ11478（FERM P-5274)(特公昭 62-34397号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ3718（FERM P-2516)(米国特許第3,970,519号参照）等が、Ｌ−イソロイシンの場合はエシェリヒア・コリKX141（VKPM B-4781）(欧州特許出願公開第519,113号参照）、ブレビバクテリウム・フラバム AJ12149（FERM BP-759)(米国特許第4,656,135号参照）等が、Ｌ−バリンの場合はエシェリヒア・コリ VL1970（VKPM B-4411)）(欧州特許出願公開第519,113号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12341（FERM BP-1763)(米国特許第5,188,948号参照）等が挙げられる。

本発明において、目的物質の「副生物」とは、目的物質の産生に関連して副生する目的物質以外の物質である。また、本発明においては、「副生物」及び「目的物質の生合成系の基質」は、本発明の取り込み系が強化されるよう改変されない場合には細菌を培養したときに培地中に排出され、蓄積するものであり、かつ、その細菌又は他の細菌の細胞内への取り込み系が存在するものである。

尚、目的物質と副生物とは相対的な概念であって、目的物質であるか、副生物であるかは、製造しようとする対象に依存する。例えば、Ｌ−フェニルアラニンを製造しようとする場合にはＬ−フェニルアラニンは目的物質であるが、Ｌ−フェニルアラニンの製造に際して産生するＬ−トリプトファンは副生物である。Ｌ−トリプトファンを製造しようとする場合にはＬ−トリプトファンは目的物質であるが、Ｌ−トリプトファンの製造に際して産生するＬ−フェニルアラニンは副生物である。

副生物として具体的には、目的物質の生合成経路の中間体、又は同経路から分岐する他の生合成系の産物等が挙げられる。中間体又は基質は、前駆体など目的物質の固有の生合成系の中間体又は基質には限られず、例えば目的物質がＬ−アミノ酸である場合の解糖系の中間体や基質のように、他の物質の生合成系又は代謝系の中間体又は基質であってもよい。以下、前記「副生物」又は「基質」を、総称して副生物と記載することがあるが、副生物に関する記載は、基質についても同様にあてはまる。

本発明において、「取り込み系」とは、細胞外に排出された前記副生物の細胞内への取り込みに関与するタンパク質をいう。取り込み系は、単一のタンパク質からなるものであってもよいし、２又はそれ以上のタンパク質からなるものであってもよい。また、単一の副生物に対し、２以上の取り込み系が存在していてもよい。

「取り込み系が強化されるように改変された」とは、前記副生物の細胞内への取り込み
量又は取り込み速度が、非改変株、例えば野生型の細菌のそれよりも高くなるように改変されたことをいう。例えば、取り込み系を構成するタンパク質の量又は比活性が上昇することにより、取り込み系を構成するタンパク質の活性が高くなっていれば、前記取り込み系が強化されている。取り込み系を構成するタンパク質の活性は、例えば、Ｍｔｒ、ＴｎａＢ、ＴｙｒＰ、ＰｈｅＰ及びＡｒｏＰの場合、Sarsero, J.P. et al., J. Bacteriol. (1995) 177(2), 297-306に記載の方法によって、測定することができる。エシェリヒア・コリ由来のＮｕｐＣ及びＮｕｐＧの場合、J. Bacteriol. (2001) Aug;183(16):4900-4に記載の方法によって、測定することができる。コリネバクテリウム・グルタミカム由来のＧｌｕＡＢＣＤの場合、J. Bacteriol. (1995) Mar;177(5):1152-8に記載の方法によって測定することができる。コリネバクテリウム・グルタミカム由来のＢｒｎＱの場合、Arch. Microbiol. (1998) Apr;169(4):303-12に記載の方法によって測定することができる。エシェリヒア・コリ由来のＬｉｖＦＧＨＪＫＭ及び、ＬｉｖＫの場合、J. Biol. Chem. (1990) Jul;15:265(20):11436-43 、J. Bacteriol. (1973) 116 1258-66及びJ. Bacteriol. (1992) Jan;174(1):108-15に記載の方法によって測定することができる。エシェリヒア・コリ由来のＬｙｓＰの場合、J. Bacteriol. (1992) May;174(10):3242-9 に記載の方法によって測定することができる。エシェリヒア・コリ由来のＡｒｔＰＩＱＭＪの場合、Mol. Microbiol. (1995) Aug;17(4):675-86に記載の方法によって測定することができる。

比較対象となる野生型の細菌としては、例えばエシェリヒア・コリでは、エシェリヒア・コリMG1655株等が挙げられる。

目的物質、その副生物又はその生合成系の基質、及びそれらの取り込み系の組合せを、表１に例示する。

本発明において特に好ましい目的物質としては、Ｌ−フェニルアラニンが挙げられる。また、その副生物としてはＬ−トリプトファンが挙げられる。

Ｌ−フェニルアラニンを生産する好適なエシェリヒア属細菌として、エシェリヒア・コリAJ12741株が挙げられる。同株は、tyrR、tyrA遺伝子を欠失したエシェリヒア・コリK-12のW3110株に、フィードバック阻害が解除された３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（ＤＳ）、フィードバック阻害が解除されたコリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼ（ＣＭ−ＰＤ）、およびシキミ酸キナーゼのそれぞれをコードする遺伝子を含むプラスミドpMGAL1を導入した株（W3110(tyrR、tyrA)/pMGAL1）である（特許第3225597号公報）。同株は、平成４年６月１１日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にFERM P-13000の受託番号で寄託され、平成６年９月１４日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、FERM BP-4796として寄託されている。

また、前記エシェリヒア・コリAJ12604株も、好ましいＬ−フェニルアラニン生産菌として例示される。同株は、tyrA遺伝子を欠失したエシェリヒア・コリK-12のW3110株に、フィードバック阻害が解除されたＤＳをコードする遺伝子を含むプラスミドpBR-aroG4、及びフィードバック阻害が解除されたＣＭ−ＰＤをコードする遺伝子を含むpACMABを導入した株である（欧州特許出願公開第488,424号）。同株は、平成３年１月２８日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に、受託番号 FERM P-11975として寄託され、平成３年９月２６日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、FERM BP-3579として寄託されている。

Ｌ−トリプトファンの取り込み系としては、Mtr及びTnaBが挙げられる。エシェリヒア・コリのMtrをコードする遺伝子（mtr）及びTnaBをコードする遺伝子（tnaB）は、すでに明らかにされている（Heatwole, V.M., J. Bacteriol., (1991) 173, 108-115、Sarsero,J.P., J. Bacteriol. (1991) 173(10), 3231-3234）。これらの遺伝子は、例えば、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって取得することができる。mtr増幅用のプライマーとしては配列番号５及び６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが、tnaB増幅用のプライマーとしては配列番号７及び８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが、それぞれ挙げられる。前記染色体ＤＮＡの採取源としては、mtrの取得においてはエシェリヒア・コリの野生株、例えばW3110株（ATCC39936）が挙げられる。一方、W3110株のtnaBにはIS（insertion sequence）が挿入されており、同遺伝子がコードするTnaBは活性を失っているため（Kamath, A.V. et al., J. Bacteriol. (1994) 17(5), 1546-1547）、tnaBの取得においては、活性を有するTnaBを保持する他の菌株を用いる。tnaBの取得源としては、エシェリヒア・コリMG1655株（ATCC700926）及びJM109株等が挙げられる。W3110株及びMG1655株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)、住所 10801 University Boulevard, Manassas, VA20110-2209, United States of America）から入手できる。また、JM109株は、宝酒造（株）等から市販されている。

mtrの塩基配列及び同遺伝子がコードするMtrのアミノ酸配列を、配列番号１及び配列番号２に示す。また、tnaBの塩基配列及び同遺伝子がコードするTnaBのアミノ酸配列を、配列番号３及び配列番号４に示す。

本発明に用いるmtr又はtnaBは、コードされるタンパク質のMtr又はTnaBの活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、
又は付加を含むMtr又はTnaBをコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から３０個、好ましくは、２から２０個、より好ましくは２から１０個である。

上記のようなMtr又はTnaBと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように、mtr又はtnaBの塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、変異処理前のＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び変異処理前のＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくはEMS等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。

上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物の活性を調べることにより、Mtr又はTnaBと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するMtr又はTnaBをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列番号１の塩基番号181〜1425からなる塩基配列（mtrのコード領域）、もしくは配列番号３の塩基番号91〜1338からなる塩基配列（tnaBのコード領域）、又はこれらの配列の一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Mtr又はTnaBと同等の活性を有するタンパク質をコードするDNAが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。

プローブとして、配列番号１又は３の塩基配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、配列番号１又は３の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号１又は３の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。

Mtrと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号２に示すアミノ酸配列と、好ましくは７０%以上、より好ましくは８０%以上、さらに好ましくは９０%以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつMtrと同等の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。また、TnaBと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号４に示すアミノ酸配列と、好ましくは７０%以上、より好ましくは８０%以上、さらに好ましくは９０%以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつTnaBと同等の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。

他の細菌のmtr又はtnaBのホモログも、上記エシェリヒア・コリのmtr又はtnaBと同様にして取得することができる。また、mtr又はtnaB以外の取り込み系をコードする遺伝子も、通常の遺伝子の取得法と同様にして、細菌の染色体ＤＮＡからPCR法等によって取得することができる。

染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saitoand K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。

取得された遺伝子は、エシェリヒア・コリ及び／または目的とする細菌の細胞内において自律複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pSTV29, pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219等が挙げられる。

取得された遺伝子と目的とする細菌で機能するベクターを連結して組換えDNAを調製するには、前記遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断し、T4 DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて前記遺伝子とベクターを連結すればよい。

目的物質の副生物の取り込み系を強化するには、取り込み系を構成するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強することによって達成される。同遺伝子の発現量の増強は、同遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、前記遺伝子断片を、細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを目的物質を生産する宿主に導入して形質転換すればよい。また、野生型の細菌に上記組換えDNAを導入して形質転換株を得、その後当該形質転換株に目的物質生産能を付与してもよい。

組換えDNAを細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、細菌の形質転換を行うことができる。

遺伝子のコピー数を高めることは、同遺伝子を細菌の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。細菌の染色体DNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。

取り込み系の強化は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体DNA上またはプラスミド上の取り込み系をコードする遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開WO00/18935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変により取り込み
系をコードする遺伝子の発現が強化され、取り込み系が強化される。これら発現調節配列の改変は、遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。

発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。エシェリヒア・コリの温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えばWO 99/03988号国際公開パンフレットに記載のプラスミドpMAN997等が挙げられる。また、λファージのレッド・リコンビナーゼ（Red recombinase）を利用した方法（Datsenko, K.A., PNAS (2000) 97(12), 6640-6645）によっても、発現調節配列の置換を行うことができる。

また、後述の実施例で示すように、λファージのレッド・リコンビナーゼ及びＰ１形質導入を組合わせた方法によって、以下のようにして発現調節配列の置換を行うこともできる。まず、PCRによって得られた発現調節配列を、レッド・リコンビナーゼを用いる方法の供与菌として使用されるエシェリヒア・コリW3110由来の菌株に導入する。次に、この供与菌から前記発現調節配列をＰ１形質導入によって受容菌である目的物質生産菌に形質導入する。供与菌は、W3110由来で、発現調節配列が置換された菌株であれば、どのような菌株でも用いることができる。

本発明の細菌は、さらに、目的物質の細胞内への取り込み系を欠失又は低下していてもよい。また、目的物質の排出系が強化されていてもよい。

上記のようにして得られる本発明の細菌を培地で培養し、該培地中に目的物質を生成蓄積せしめ、該培地から目的物質を採取することにより、目的物質を効率よく製造することができる。

本発明による目的物質の製造は、本発明の細菌を用いる以外は、通常の細菌を用いた目的物質の製造と同様にして行うことができる。培養条件は、用いる細菌に応じて、適宜設定すればよい。

例えば、培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地でよい。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボースや澱粉の加水分解物などの糖類、グリセロール、マンニトールやソルビトールなどのアルコール類、グルコン酸、フマール酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養素としては、ビタミンB1等のビタミン類、アデニンやRNA等の核酸類などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。尚、本発明の細菌が、tyrA遺伝子を欠失している場合には、生育に必要なＬ−チロシンを培地に添加する。

培養は、例えばエシェリヒア・コリの場合は、好気的条件下で１６〜７２時間程度実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中pHは５〜８に制御する。なお、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、さらにアンモニアガス等を使用することができる。

培地からの目的物質の採取は、目的物質の種類に応じて、イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組合せることにより実施することができる。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

〔実施例１〕
＜１＞mtr遺伝子搭載プラスミド及びtnaB遺伝子搭載プラスミドの構築
（１）mtr遺伝子搭載プラスミドの構築
エシェリヒア・コリW3110株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号５及び６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いてPCRを行い、mtrのプロモーター及びORFを含む約1.5kbの増幅断片を得た。PCRは、LATaq(宝酒造製)を用い、94℃2分（1サイクル）の後、94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分30秒を30サイクル行った。

上記増幅断片を、MicroSpins^TMS400HRColumns（Amarsham Pharmacia Biotech Inc.製）を用いて精製した後、SacI及びKpnIで消化し、同じくSacI及びKpnIで消化したpSTV28及びpSTV29（宝酒造(株)製）とライゲーション反応を行った。この反応液を用いてエシェリヒア・コリJM109 Competent cells（宝酒造(株)製）を形質転換した。形質転換体を、クロラムフェニコール、IPTG、及びX-Galを含むLBプレート上で培養し、白色コロニーを選択した。得られた形質転換体より、mtr搭載プラスミドpSTV28mtr及びpSTV29mtrを得た。
pSTV28mtrにおいては、mtr遺伝子はlacプロモーターと同方向に挿入されている。一方、pSTV29mtrにおいては、mtr遺伝子はlacプロモーターと逆方向に挿入されている。

（２）tnaB遺伝子搭載プラスミドの構築
エシェリヒア・コリMG1655の染色体DNAを鋳型とし、配列番号７及び８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いてPCRを行い、tnaB ORFを含む約1.5kbの増幅断片を得た。PCRは、LATaq(宝酒造製)を用い、94℃2分（1サイクル）の後、94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分30秒を30サイクル行った。尚、tnaBは、tnaAとともにオペロンを形成しており、tnaBの直ぐ上流にはプロモーターは存在していない。

上記増幅断片を、MicroSpins^TMS400HRColumns（Amarsham Pharmacia Biotech Inc.製）を用いて精製した後、SalI及びPstIで消化し、同じくSalI及びPstIで消化したpSTV28及びpSTV29（宝酒造(株)製）とライゲーション反応を行った。この反応液を用いてエシェリヒア・コリJM109 Competent cells（宝酒造(株)製）を形質転換した。形質転換体を、クロラムフェニコール、IPTG、及びX-Galを含むLBプレート上で培養し、白色コロニーを選択した。得られた形質転換体より、tnaB搭載プラスミドpSTV29tnaB及びpSTV29tnaBを得た。
pSTV28tnaBにおいては、tnaB遺伝子はlacプロモーターと同方向に挿入されている。一方、pSTV29tnaBにおいては、tnaB遺伝子はlacプロモーターと逆方向に挿入されている。

＜２＞mtr及びtnaB強化株の構築及びＬ−フェニルアラニンの生産
（１）上記プラスミドpSTV28mtr、pSTV29mtr、pSTV28tnaB及びpSTV29tnaBを、定法に従ってエシェリヒア・コリのＬ−フェニルアラニン生産菌AJ12741株（特許第3225597号公報、以下、「R/GAL株」と記載することがある。）に導入し、R/GAL/pSTV28mtr、R/GAL/pSTV29mtr、R/GAL/pSTV28tnaB、及びR/GAL/pSTV29tnaBを得た。これらの形質転換体及びR/GAL株のＬ−フェニルアラニン生産能を評価した。

下記組成の培地20mlを坂口フラスコ（500ml容）に張り込み、各菌株を植菌した後、グルコースを全て消費するまで37℃で培養した。培養後の培地中のＬ−フェニルアラニン（L-Phe）及びＬ−トリプトファン（L-Trp）の量を測定した結果を表２に示す。

〔培地組成〕（pH7.0）
グルコース 40g/L
硫酸マグネシウム７水塩 1g/L
硫酸アンモニウム 16g/L
リン酸二水素カリウム 1g/L
酵母エキス 2g/L
硫酸第1鉄7水塩 10mg/L
硫酸マンガン４-５水塩 8mg/L
Ｌ−チロシン 125mg/L
アンピシリン 50mg/L
クロラムフェニコール 50mg/L
（R/GAL株には添加しない）
炭酸カルシウム 30g/L

表２に示すように、R/GAL株はＬ−トリプトファンを副生したが、mtr強化株及びtnaB強化株は、Ｌ−トリプトファンを副生せずに、R/GAL株と同等のＬ−フェニルアラニンを蓄積した。

〔実施例２〕
＜１＞mtr遺伝子及びtnaB遺伝子のプロモーター強化株の構築
λファージのレッド・リコンビナーゼ（Red recombinase）を利用したシステム（Datsenko, K.A., PNAS (2000) 97(12), 6640-6645）とＰ１形質導入を組合わせた方法により、エシェリヒア・コリの染色体上のmtr遺伝子及びtnaB遺伝子のコード領域に、λファージのP_Lプロモーターを挿入することにより、mtr遺伝子及びtnaB遺伝子のプロモーター強化株を構築した。

まず、PCRにより、(1)λファージ由来attR配列、(2)Tn9由来cat遺伝子、(3)T7ファージ由来Pa2プロモーター配列、(4)pBR322由来tet遺伝子配列（一部）、(5)λファージ由来attL配列を、各々増幅した。断片(1)の増幅には鋳型にλDNA、プライマーに(1)f（配列番号９）と(1)r（配列番号１０）を、断片(2)の増幅には鋳型にTn9を有するE. coli（例えばGM2159, GM2150等）染色体DNA 、プライマーに(2)f（配列番号１１）と(2)r（配列番号１２）を、断片(3)の増幅には鋳型にT7ファージDNA、プライマーに(3)f（配列番号１３）と(3)r（配列番号１４）を、断片(4)の増幅には鋳型にpBR322、プライマーに(4)f（配列番号１５）と(4)r（配列番号１６）を、断片(5)の増幅には鋳型にλDNA、プライマーに(5)f（配列番号１７）と(5)r（配列番号１８）を、各々用いた。前記GM2159及びGM2150は、エシェリヒア・コリジェネティックストックセンター（E. coli Genetic Stock Center（米国コネチカット州ニューヘブン(New Haven)06511-7444、エール大学生物学部オズボーン記念研究所（Yale University, Dept. Biology, Osborn Memorial Labs.）、P.O. Box 6666））より分譲を受けることができる。

また、(6)thrオペロンターミネーター配列（58bp）を、合成DNA(6)f（配列番号１９）
と(6)r（配列番号２０）をアニーリングすることにより得た。
得られた各断片を用いて、表３に示すようにしてクロスオーバーPCRを行い、断片(1)、(6)、(2)、(3)、(4)及び(5)が連結したＤＮＡ断片（（以下、「断片Ａ」という）を取得した。

次に、λDNAを鋳型とし、プライマーP1（配列番号２１）、及びP2mtr（mtrORF配列36bpを含む。配列番号２２）またはP2tnab（tnaBORF配列36bpを含む。配列番号２３）を用いて、P_Lプロモーター配列（lacZ上流のSD配列が付加されている）をPCRにより増幅した。この増幅断片と断片Ａを鋳型に、mtr遺伝子またはtnaB遺伝子の各々のORFの上流域の配列（36bp）を含むプライマー(1)fmtr（配列番号２４）または(1)ftnab（配列番号２５）、及びプライマーP2mtrまたはP2tnabを用いて、クロスオーバーPCRを行った。増幅された各断片は、その両端に、mtr遺伝子またはtnaB遺伝子の上流域とORF内部の配列を含む。これらのDNA断片の塩基配列を、それぞれ配列番号２６及び２７に示す。これらのDNA断片の構造を、表４に示す。

上記の各DNA断片を、予めヘルパープラスミドpKD46を導入したエシェリヒア・コリTD-18株（エシェリヒア・コリK-12 W3110株に由来する株）に、定法にしたがって導入した。pKD46は、Red recombinaseを発現する（PNAS (2000) 97(12), 6640-6645）。遺伝子置換を行った後、形質転換株からpKD46を脱落させた。形質転換株は、クロラムフェニコール耐性を示すことから、目的とするmtr遺伝子又はtnaB遺伝子のプロモーター置換株を、効率よく選択することができた。

次に、上記mtr、tnaBのプロモーター置換株にＰ１ファージを感染させた。このＰ１ファージ感染株をＰ１形質導入の供与菌として用い、Ｌ−フェニルアラニン生産菌AJ12741株（R/GAL株）のmtr遺伝子またはtnaB遺伝子のORFの上流域を、Ｐ１形質導入によりP_Lプロモーターに置換した。置換は、クロラムフェニコール耐性を指標とした。mtr、tnaBのプロモーター置換をＬ−フェニルアラニン生産菌AJ12741株（R/GAL株）に導入した。PCRにて目的の置換が生じたことを確認した。

＜２＞mtr遺伝子及びtnaB遺伝子のプロモーター強化株によるＬ−フェニルアラニンの生産
上記方法により、mtr遺伝子ORFの上流域がP_Lプロモーターに置換されたR/GAL株（RM11）、及び、tnaB遺伝子ORFの上流域がP_Lプロモーターに置換されたR/GAL株（Rtp32）を取得した。これらの菌株を、実施例１と同様にしてＬ−フェニルアラニン生産培養を行い、培地中のＬ−フェニルアラニン及びＬ−トリプトファンの量を測定した。結果を表５に示す。

表５に示すように、R/GAL株はＬ−トリプトファンを副生したが、mtrプロモーター強化株RM11とtnaBプロモーター強化株Rtp32は、Ｌ−トリプトファンを副生せずに、R/GAL株と同等のＬ−フェニルアラニンを蓄積した。

Claims

目的物質を生産するエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）を培地に培養し、培地中に目的物質を生成、蓄積させ、同培地から目的物質を採取する、目的物質の製造法であって、
前記エシェリヒア・コリが、前記目的物質の副生物の細胞内への取り込み系をコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現が増強されるように該遺伝子の発現調節配列が改変されたことにより、該取り込み系が強化されるように改変されており、
前記目的物質、前記副生物、及び前記遺伝子の組み合わせが以下の（１）〜（３）のいずれかである、方法。
（１）前記目的物質がＬ−フェニルアラニン又はＬ−トリプトファンであり、前記副生物がＬ−チロシンであり、且つ、前記遺伝子がｔｙｒＰ遺伝子である。
（２）前記目的物質がＬ−トリプトファンであり、前記副生物がＬ−フェニルアラニンであり、且つ、前記遺伝子がｐｈｅＰ遺伝子である。
（３）前記目的物質がＬ−イソロイシン又はＬ−バリンであり、前記副生物がＬ−ロイシンであり、且つ、前記遺伝子がｌｉｖＫ遺伝子である。