KR101110580B1

KR101110580B1 - 표적 물질의 제조 방법

Info

Publication number: KR101110580B1
Application number: KR1020040040950A
Authority: KR
Inventors: 야마모토요코; 이토히사오
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 2003-06-05
Filing date: 2004-06-04
Publication date: 2012-02-15
Also published as: EP1484410A1; BRPI0401918A; CN1572868A; US7335496B2; CN100564516C; JP5287904B2; KR20040105568A; EP1484410B1; JP2011103899A; ATE531803T1; BRPI0401918B1; US20050170474A1

Abstract

표적 물질은, 표적 물질의 부산물 또는 표적 물질의 생합성계의 기질을 세균 세포내로 섭취하기 위한 계가 개질되어진 세균으로서, 당해 표적 물질을 생산할 수 있는 능력을 지닌 세균을 배지에서 배양하여 배지중에 표적 물질을 축적시키고, 당해 배지로 부터 표적 물질을 채취함으로써 제조된다.

L-페닐알라닌, L-트립토판, Mtr, TnaB, 섭취계

Description

표적 물질의 제조 방법{Method for producing target substance}

본 발명은 세균을 이용하여 표적 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세히, 본 발명은 세균을 이용하여 L-아미노산, 핵산, 항생물질, 비타민, 성장 인자 또는 생리학적 활성 물질과 같은 표적 물질의 제조를 개선한 방법에 관한 것이다.

미생물을 이용한 발효에 의해 표적 물질, 예를 들어 L-아미노산을 제조하는 방법으로는 아래의 방법이 있다: 야생형 미생물(야생형 균주)을 이용하는 방법, 야생형 균주로 부터 유래된 영양요구성(auxotrophic) 균주를 이용하는 방법, 각종 약물 내성 돌연변이체와 같이 야생형 균주로 부터 유래된 대사-조절된 돌연변이체를 이용하는 방법, 영양요구성 균주 및 대사-조절된 돌연변이체 둘 모두의 특징을 갖는 균주를 이용하는 방법 등.

최근에, 재조합 DNA 기법이 발효에 의한 표적 물질의 제조에 이용되었다. 예를 들면, L-아미노산을 생산하는 미생물의 능력은 L-아미노산 생합성 효소를 암호화하는 유전자를 증강시키거나 (미국 특허 제5,168,056호 및 제5,776,736호), 또 는 L-아미노산 생합성계내로의 탄소원의 유입을 증가시킴 (미국 특허 제5,906,925호)으로써 향상될 수 있다.

미생물내에서 표적 물질의 제조를 개선하는 방법은 물질의 섭취계 또는 배출계를 개질시키는 방법을 포함한다. 섭취계를 개질시키는 방법의 예로는, 표적 물질을 세포내로 섭취하는 계를 제거하거나 저하시킴으로써 표적 물질-생산능을 향상시키는 방법이 있다. 구체적으로, gluABCD 오페론 또는 이의 일부를 결실시켜 L-글루탐산 섭취계를 제거하거나 저하시키는 방법 (EP 1 038 970 A1), 퓨린 뉴클레시드가 세포내로 섭취되는 것을 약화시켜 퓨린 뉴클레오시드 생산능을 증가시키는 방법 등이 공지되어 있다.

미생물의 배출계를 개질시키는 방법은, 표적 물질의 배출계를 증가시키는 방법 및 표적 물질의 생합성계의 중간체 또는 기질에 대한 배출계를 제거하거나 약화시키는 방법을 포함한다. 표적 물질의 배출계를 증가시키는 방법으로서, 예를 들면 L-리신 배출 유전자(lysE)의 발현이 증가된 코리네박테리움 (Corynebacterium) 세균 균주를 이용하여 L-리신을 제조하는 방법 (WO97/23597)이 공지되었다. 후자의 방법으로서, 표적 물질로서 L-글루탐산을 제조하는 방법이 공지되었는데, 이 방법에서는 표적 물질의 중간체인 α-케토글루타르산이 α-케토글루타레이트 퍼미아제(permease) 유전자를 돌연변이시키거나 파괴함으로써 감소된다.

또한, 세포막을 통한 물질의 투과에 관련된 ATP 결합 카세트 슈퍼패밀리 (ABC 수송체)를 암호화하는 유전자가, 세포막을 통한 아미노산 수송이 개질된 미생물을 육종하는데 사용된다 (WO00/37647).

또한, 세포내로 수크로스를 섭취하는데 관련된 단백질인 수크로스 PTS 효소 II를 암호화하는 유전자를 코리네형 세균에 사용하여 아미노산, 핵산 등의 생산성이 향상된 균주를 육종할 수 있다는 것이 제시되었다 (EP 1 197 555 A). 또한, 수크로스 PTS 유전자 그룹 또는 수크로스 비-PTS 유전자 그룹을 이용하여 에스체리키아(Escheruchia) 속에 속하는 세균의 L-아미노산 생산성을 향상시키는 기법 이 또한 공지되었다(미국 특허원 제2001/0049126호).

부산물의 생합성계를 결실시커거나 약화시켜 표적 물질의 부산물의 생성을 감소시키는 기법이 공지되었다[참조: "Amino Acid Fermentation "Gakkai Shuppan Center, p.4, 1986]. 그러나, 이러한 방법에서는, 미생물을 배양할 때, 전술한 부산물을 성장에 필요한 양 만큼 배지에 첨가할 필요가 있다.

Mtr [참조: Heatwole, V.M. et al., J. Bacteriol., American Society for Micobiology, 173, pp.108-115, January 1991] 및 TnaB [참조: Sarsero, J.P. et al., Bacterial., American Society for Microbiology, 173(10), pp.3231-3234, May 1991]은 L-트립토판-특이적 섭취계로서 공지되었고, AroP [참조: Mee-Len, C et al., J. Bacteriol., American Society for Microbiology, 167(2), pp.749-753, August 1986]는 방향족 아미노산에 있어 공통적인 섭취계로서 공지되었다. 그러나, 표적 물질의 부산물에 대한 섭취계를 강화시켜 표적 물질의 생산성을 향상시키는 것은 예전에 기술되지 않았다.

본 발명의 목적은, 부산물의 생성을 감소시키고 바람직하게는 표적 물질의 생성을 향상시키는, 세균을 이용한 L-아미노산, 핵산, 항생물질, 비타민, 성장 인자 또는 생리학적 활성 물질과 같은 표적 물질의 제조 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, 표적 물질의 부산물 또는 표적 물질의 생합성계의 기질을 세포내로 섭취하기 위한 계가 강화되도록 개질된 세균으로서, 표적 물질을 생산할 수 있는 능력을 지닌 세균을 배지에서 배양하고, 당해 배지로 부터 표적 물질을 채취함을 포함하여, 표적 물질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, 상기 부산물이 표적 물질의 생합성 경로중의 중간체, 표적 물질의 생합성 경로중의 기질, 및 상기 경로로 부터 분기된 또 다른 생합성 경로의 생성물로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 상기 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, 세균이 에스체리키아 속에 속하는 상기 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, 상기 표적 물질이 L-페닐알라닌이고 상기 부산물이 L-트립토판인 상기 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, 부산물을 섭취하기 위한 상기 계가 Mtr 및 TnaB로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 상기 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, 상기 계의 활성이 mtr 유전자 또는 tnaB 유전자의 복사체 수를 증가시키는 방법 및 mtr 유전자 또는 tnaB 유전자의 발현 조절 서열을 변형시키는 방법으로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 방법에 의해 증가되는 상기 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, 상기 mtr 유전자가 서열번호 2에 제시된 단백질 서열을 암호화하는 DNA 서열, 서열번호 1에 제시된 DNA 서열, 및 서열번호 2에 제시된 단백질 서열을 암호화하지만 하나 또는 수 개의 아미노산 잔기가 하나 또는 수 개의 부위에서 치환, 결실, 삽입 또는 부가되도록 변형되고 서열번호 2에 제시된 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 DNA 서열로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 DNA 서열을 포함하면서, 상기 mtr 유전자가 Mtr 단백질의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는, 상기 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, tnaB 유전자가 서열번호 4에 제시된 단백질 서열을 암호화하는 DNA 서열, 서열번호 3에 제시된 DNA 서열, 및 서열번호 4에 제시된 단백질 서열을 암호화하지만 하나 또는 수 개의 아미노산 잔기가 하나 또는 수 개의 부위에서 치환, 결실, 삽입 또는 부가되도록 변형되고 서열번호 4에 제시된 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 DNA 서열로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 DNA 서열을 포함하면서, 상기 tnaB 유전자가 TnaB 단백질의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는, 상기 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, 표적 물질을 생산할 수 있는 능력을 가지면서, 표적 물질의 부산물을 세포내로 섭취하기 위한 계의 강화 및 표적 물질의 생합성 경로의 기질을 세포내로 섭취하기 위한 계의 강화로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 변형을 지니는 에스체리키아 속에 속하는 세균을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, 상기 표적 물질이 L-페닐알라닌이고 상기 부산물이 트립토판이고, 세포내로 섭취하기 위한 상기 계가 Mtr 및 TnaB로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는, 상기 세균을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, Mtr 또는 TnaB의 활성이 mtr 유전자 또는 tnaB 유전자의 복사체 수를 증가시키는 방법 및 mtr 유전자 또는 tnaB 유전자의 발현 조절 서열을 변형시키는 방법으로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 방법에 의해 증가되는 상기 세균을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, 상기 mtr 유전자가 서열번호 2에 제시된 단백질 서열을 암호화하는 DNA 서열, 서열번호 1에 제시된 DNA 서열, 및 서열번호 2에 제시된 단백질 서열을 암호화하지만 하나 또는 수 개의 아미노산 잔기가 하나 또는 수개의 부위에서 치환, 결실, 삽입 또는 부가되도록 변형되고 서열번호 2에 제시된 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 DNA 서열로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 DNA 서열을 포함하면서, 상기 mtr 유전자가 Mtr 단백질의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는, 상기 세균 또는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, tnaB 유전자가 서열번호 4에 제시된 단백질 서열을 암호화하는 DNA 서열, 서열번호 3에 제시된 DNA 서열, 및 서열번호 4에 제시된 단백질 서열을 암호화하지만 하나 또는 수 개의 아미노산 잔기가 하나 또는 수 개의 부위에서 치환, 결실, 삽입 또는 부가되도록 변형되고 서열번호 4에 제시된 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 DNA 서열로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 DNA 서열을 포함하면서, 상기 tnaB 유전자가 TnaB 단백질의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는, 상기 방법 또는 세균을 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, L-아미노산과 같은 표적 물질을 세균을 사용하여 제조하는 경우, 부산물의 생성이 감소될 수 있다. 본 발명의 바람직한 태양에 따르면, 표적 물질의 제조가 개선될 수 있다.

또한, 세균을 배양할 때, 성장에 요구되는 어떠한 물질도 배지에 첨가될 필요가 없다. 또한, 배지내의 부산물의 양이 감소될 수 있기 때문에, 당해 배지로 부터 표적 물질을 정제하는 것이 용이해진다.

본 발명의 발명자들은 전술한 목적을 달성하기 위하여 꾸준히 연구하였다. 연구 결과로서, 표적 물질의 부산물을 세포내로 섭취하기 위한 계가 강화되도록 세포가 개질되면, 그 부산물의 생성이 감소된다는 것을 발견하였으며, 이로써 본 발명이 완성되었다.

본 발명의 세균은 표적 물질을 생성하며, 표적 물질의 부산물 또는 표적 물질의 생합성계의 기질을 세포내로 섭취하기 위한 계가 강화되도록 개질된다. 본 발명의 세균은, 이것이 표적 물질을 생성하고, 표적 물질의 부산물 또는 표적 물질의 생합성계의 기질을 세포내로 섭취하기 위한 계를 생성하는 한, 특별히 제한되지 않는다. 게다가, 상기 요건들이 만족되는 한, 본 발명은 또한 예전에 당업계에서 사용된 적이 없는 세균에 적용될 수 있다. 본 발명의 세균은 표적 물질을 생성할 수 있는 고유 능력을 가질 수 있거나, 또는 당해 능력이 돌연변이 방법, 재조합 DNA 기법 등을 사용한 육종법에 의해 부여될 수 있다.

당해 세균의 구체적 예로는 에스체리키아 속에 속하는 세균 (예: 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli), 코리네형 세균 (예: 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 바실루스 속에 속하는 세균 (예: 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 세라티아 속에 속하는 세균 (예: 세라티아 마세스센스(Serratia marcescens) 등이 있다. 그러나, 본 발명의 세균이 이들 예로 한정되는 것은 아니다.

"표적 물질을 생산하는" 이란 표현은, 본 발명의 세균이 배지에서 배양되는 경우, 세균이 당해 세균 세포 또는 당해 배지로 부터 표적 물질이 채취될 수 있을 정도의 양으로 당해 표적 물질을 생산할 수 있는 능력을 나타내는 것을 의미한다. 바람직하게는, 이는 세균이 당해 세균의 야생형 또는 개질되지 않은 균주에 의해 생산되는 것 보다 많은 양으로 표적 물질을 생산하는 능력을 나타내는 것을 의미한다.

본 발명에 의해 생산된 표적 물질은, 세균에 의해 생산될 수 있는 물질인 한, 특별히 제한되지 않는다. 이의 예로는 각종 아미노산, 예를 들면 L-페닐알라닌, L-트레오닌, L-리신, L-글루탐산, L-루이신, L-이소루이신 및 L-발린이 있다. 또한, 표적 물질은, 생합성의 중간체 또는 기질을 위한 배출계가 존재하는 한, 핵산 (예: 구아닐산 및 이노신산), 비타민, 항생물질, 성장 인자, 생리학적 활성 물질 등을 포함한, 세균에 의해 생합성될 수 있는 모든 물질 일 수 있다. 또한, 본 발명은, 표적 물질의 부산물을 위한 또는 표적 물질의 생합성계의 기질을 세포내로 섭취하기 위한 계가 존재하는 한, 세균을 사용하여 현재 생산할 수 없는 물질을 생 산하는 데 사용될 수 있다.

L-페닐알라닌-생산 세균의 예로는 에스체리키아 콜라이 AJ12741 (FERM P-13000, 일본 특허 제3225597호 참조) 및 AJ12604 (FERM BP-3579, 유럽 특허원 공개 제488,424호 참조), 브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ12637 (FERM BP-4160, 프랑스 특허원 공개 제2,686,898호) 등이 있다. 또한, 표적 물질로서 L-트레오닌을 생산하는 세균의 예로는 에스체리키아 콜라이 VKPM B-3996 (RIA 1867, 미국 특허 제5,175,107호 참조), 코리레박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) AJ12318 (FERM BP-1172, 미국 특허 제5,188,949호 참조) 등이 있다. L-리신-생산 세균의 예로는 에스체리키아 콜라이 AJ11442 (NRRL B-12185, FERM BP-1543, 미국 특허 제4,436,170호 참조), 브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ3990 (ATCC 31269, 미국 특허 제4,066,501호 참조) 등이 있다. L-글루탐산-생산 세균의 예로는 에스체리키아 콜라이 AJ12624 (FERM BP-3853, 프랑스 특허원 공개 제2,680,178호 참조), 에스체리키아 콜라이 AJ13199 (FERM P-15573, 일본 특허 공개 제7-203980호 참조), 브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ12475 (FERM BP-2922, 미국 특허 제5,272,067호 참조) 등이 있다. L-루이신-생산 세균의 예로는 에스체리키아 콜라이 AJ11478 (FERM P-5274, 일본 특허 공개(공고) 제62-34397호 참조), 브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ3718 (FERM P-2516, 미국 특허 제3,970,519호 참조) 등이 있다. L-이소루이신-생산 세균의 예로는 에스체리키아 콜라이 KX141 (VKPM B-4781, 유럽 특허원 공개 제519,113호 참조), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) AJ12149 (FERM BP-759, 미국 특허 제4,656,135호 참조) 등이 있다. L-발린-생산 세균의 예로는 에스체리키아 콜라이 VL1970 (VKPM B-4411, 유럽 특허원 공개 제519,113호 참조), 브레비박테리움 락토페르멘툼 AJ12341 (FERM BP-1763, 미국 특허 제5,188,948호 참조) 등이 있다.

본 발명에서, 표적 물질의 "부산물"은 표적 물질의 생산 중에 부산물로서 생성된 표적 물질 이외의 물질을 의미한다. 또한, 본 발명에서, 본 발명을 위한 섭취계가 강화되도록 세균이 개질되지 않는다면, "부산물" 및 "표적 물질의 생합성계의 기질"이 분비되고, 이 결과로서 세균이 배양될 때 배지내에 축적되고, 당해 부산물 또는 기질을 당해 세균 또는 기타 세균내로 섭취하기 위한 계가 존재한다.

"표적 물질" 및 "부산물" 이란 용어는 상대적 개념이므로, 물질이 표적 물질인지 부산물인지의 여부는 생산하고자 하는 대상에 따라 결정된다. 예를 들면, L-페닐알라닌을 생산하고자 하는 경우, L-페닐알라닌이 표적 물질이고, L-페닐알라닌의 생산 중에 생성된 L-트립토판이 부산물이다. L-트립토판을 생산하고자 하는 경우, L-트립토판이 표적 물질이고 L-트립토판의 생산중에 생성된 L-페닐알라닌은 부산물이다.

본 발명의 부산물의 구체적 예로는 표적 물질의 생합성 경로중의 중간체, 당해 경로로 부터 분기된 또 다른 생합성계의 생성물 등이 있다. 중간체 또는 기질은 당해 표적 물질의 고유한 생합성계중의 중간체 또는 기질, 예를 들면 전구체로 제한되지 않으며, 또 다른 물질의 생합성계 또는 대사계 중의 중간체 또는 기질, 예를 들면 표적 물질이 L-아미노산인 경우 해당계의 중간체 또는 기질일 수 있다. 이후, 전술한 "부산물" 또는 "기질"은 부산물로서 총칭될 수 있으며, 부산물에 관 한 기술은 기질에 유사하게 적용될 수 있다.

본 발명에서, "세포내 섭취를 위한 계 (세포 섭취계)는, 세포 외부로 분비된 전술한 부산물을 세포내로 섭취하는 데 관련된 단백질을 의미한다. 당해 섭취계는 단일 단백질 또는 2 이상의 단백질로 이루어질 수 있다. 또한, 단일 종의 부산물에 대하여 2종 이상의 섭취계가 존재할 수 있다.

"섭취계가 강화되도록 개질된" 이란 표현은, 전술한 부산물의 섭취 양 또는 섭취 속도가 개질되지 않은 균주, 예를 들면 야생형 세균의 것과 비교하여 증가되도록 개질되는 것을 의미한다. 예를 들면, 섭취계를 구성하는 단백질의 활성이 당해 단백질의 양 또는 비활성을 증가시킴으로써 야생형 또는 개질되지 않은 균주에 비해 증가되는 경우, 전술한 섭취계가 강화된다. 섭취계를 구성하는 단백질의 활성이, 예를 들어 단백질이 Mtr, TnaB, TyrP, PheP 또는 AroP인 경우에, 문헌[Sarsero, J.P. et al., J. Bacteriol., 177(2), 297-306, 1995]에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다. 에스체리카아 콜라이로 부터 유래된 NupC 및 NupG의 활성은 문헌[J. Bacteriol., 183(16), 4900-4, Aug. 2001]에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰으로 부터 유래된 GluABCD의 활성은 문헌[J. Bacteriol., 177(5), 1152-8, Mar. 1995]에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰으로 부터 유래된 BrnQ의 활성은 문헌[Arch. Micorbiol., 169(4), 303-12 Apr. 1998]에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다. 에스체리키아 콜라이로 부터 유래된 LivFGHJKM 및 LivK의 활성은 문헌[J. Biol. Chem., 15, 265(20), 11436-43, Jul. 1990; J. Bacteriol., 116, 1258-66, 1973; and J. Bacteriol., 174(1), 108-15, Jan. 1992]에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다. 에스체리키아 콜라이로 부터 유래된 LysP의 활성은 문헌[J. Bacteriol., 174(10), 3242-9, May 1992]에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다. 에스체리키아 콜라이로 부터 유래된 ArtPIQMJ의 활성은 문헌[Mol. Micorbiol., 17(4), 675-86, Aug. 1995]에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다.

에스체리키아 콜라이 세균에 관하여, 예를 들면 비교될 야생형 세균의 예로는 에스체리키아 콜라이 MG1655 균주가 있다.

이들의 생합성계 및 섭취계 중에서 표적 물질, 부산물 또는 기질의 조합의 예가 표 1에 기재되어 있다.

세균	표적 물질	부산물	섭취계 유전자
이. 콜라이	L-페닐알라닌, L-트립토판 등	L-트립토판	mtr, tnaB
이. 콜라이	L-페닐알라닌, L-트립토판 등	L-티로신	tyrP
이. 콜라이	L-티로신, L-트립토판 등	L-페닐알라닌	pheP
이. 콜라이	방향족 아미노산 이외의 물질	방향족 아미노산	aroP, pheP, tyrP
이. 콜라이	분지쇄 아미노산 이외의 물질	분지쇄 아미노산	brnQ, livFGHJKM
이. 콜라이	L-리신 이외의 물질	L-리신	lysP
이. 콜라이	L-트레오닌 및 L-세린 이외의 물질	L-트레오닌, L-세린	tdcC, sdaC
이. 콜라이	L-아르기닌 이외의 물질	L-아르기닌	artIJMPQ
이. 콜라이	L-루이신 이외의 물질, 예를 들면 L-이소루이신, L-발린 등	L-루이신	livK
이. 콜라이	우라실 이외의 물질	우라실	uraA
이. 콜라이	뉴클레오시드 이외의 물질	뉴클레오시드	urpC, nupG
코리네형 세균	L-글루탐산 이외의 물질, 예를 들면 L-글루타민 등	L-글루탐산	gluABCD
코리네형 세균	L-리신 이외의 물질	L-리신	lysI

본 발명의 표적 물질의 특히 바람직한 예는 L-페닐알라닌이다. 또한, 이의 부산물의 예는 L-트립토판이다.

L-페닐알라닌을 생산하는 에스체리키아 속에 속하는 세균의 바람직한 예는 에스체리키아 콜라이 AJ12741 균주이다. 이 균주는 플라스미드 pMGAL1을 tyrR 및 tyrA 유전자가 결여된 에스체리키아 콜라이 K-12 W3110 균주 속에 도입하는 방법으로 작제되었다[참조: W3110(tyrR, tyrA)/pMGAL1, 일본 특허 제3225597호]. 당해 플라스미드 pMGAL1은, 피드백(feedback) 억제가 해제된 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로네이트-7-포스페이트 신타제 (DS), 피드백 억제가 해제된 코리스메이트 무타제(chorismate mutase)/프레페네이트 데하이드라타제(prephenate dehydratase) (CM-PD), 및 쉬리키메이트(shikimate) 키나제를 암호화하는 유전자들을 함유한다. 이 균주는 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 (최근에는, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센타: 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 1고 소재)에 1992년 6월 11일자로 기탁되었고, FERM P-13000의 수탁번호를 부여받았다. 그 후, 이는 부다페스트 조약하의 국제기탁으로 1994년 9월 14일자로 이관되어, FERM BP-4796의 수탁번호를 부여받았다.

또한, 전술한 에스체리키아 콜라이 AJ12604 균주는 또한 L-페닐알라닌-생산 세균의 바람직한 예이다. 이 균주는, 피드백 억제가 해제된 DS를 암호화하는 유전자를 함유하는 플라스미드 pBR-aroG4, 및 피드백 억제가 해제된 CM-PD를 암호화화는 유전자를 함유하는 플라스미드 pACMAB를, tyrA 유전자가 결여된 에스체리키아 콜라이 K-12 W3110 균주 속에 도입함으로써 작제되었다. 이 균주는 통상산업성 공업기술원 미생물공업기술연구소 (최근에는, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센타: 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 1고 소재)에 1991년 1월 28일자로 기탁되었고, FERM P-11975의 수탁번호를 부여받았다. 그 후, 이는 부 다페스트 조약하의 국제기탁으로 1991년 9월 26일자로 이관되어, FERM BP-3579의 수탁번호를 부여받았다.

L-트립토판 섭취계의 예로는 Mtr 및 TnaB가 있다. 에스체리키아 콜라이의 Mtr을 암호화하는 유전자(mtr) 및 TnaB를 암호화하는 유전자(tnaB)는 이미 보고되었다[참조 문헌: Heatwole, V.M., J. Bacteriol., 173, 108-115; Sarsero, J.P., J. Bacteriol., 173(10), 3231-3234, 1991]. 이들 유전자들은, 예를 들면 에스체리키아 콜라이의 염색체 DNA를 주형으로서 사용하여 PCR (폴리머라제 연쇄 반응)에 의해 수득될 수 있다[참조 문헌: White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185, 1989]. mtr을 증폭시키기 위한 프라이머의 예로는 서열번호 5 및 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드가 있다. tnaB를 증폭시키기 위한 프라이머의 예로는 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드가 있다. 전술한 염색체 DNA의 공급원의 예로는 에스체리키아 콜라이의 야생형 균주, 예를 들면 W3110 균주 (ATCC39936)이 있다. tnaB의 경우에, IS (삽입 서열)가 W3110 균주 tnaB속에 삽입되고, 이 유전자에 의해 암호화된 TnaB가 활성을 갖지 않기 때문에 [참조 문헌: Kamath, A.V. et al., J. Bacteriol., 176(5), 1546-1547, 1994], 기능성 TnaB를 함유하는 다른 세균 균주가 사용된다. tnaB를 수득하기 위한 공급원의 예로는 에스체리키아 콜라이 MG1655 균주(ATCC700926), JM109 균주 등이 있다. W3110 균주 및 MG1655 균주는 기탁기관 (American Type Culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209, U.S.A.)]으로 부터 수득할 수 있다. JM109 균주는 판매원[Takara Shuzo Co., Ltd., etc.]로 부터 시판된 다.

mtr의 뉴클레오티드 서열 및 이 유전자에 의해 암호화된 Mtr의 아미노산 서열은 서열번호 1 및 2에 제시되어 있다. tnaB의 뉴클레오티드 서열 및 이 유전자에 의해 암호화된 TnaB의 아미노산 서열은 서열번호 3 및 4에 제시되어 있다.

본 발명에서 사용된 mtr 또는 tnaB는 각각 Mtr 또는 TnaB를 암호화할 수 있으며, 암호화된 단백질, Mtr 또는 TnaB의 활성이 감소되지 않는 한 하나 또는 수 개의 부위에 하나 또는 수 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 "수 개" 아미노산 잔기의 수는 단백질의 3차원 구조에서의 아미노산 잔기의 위치 및 아미노산 잔기의 유형에 따라 달라진다. 그러나, 이는 구체적으로 2 내지 30, 바람직하게는 2 내지 20, 보다 바람직하게는 2 내지 10 이다.

전술한 Mtr 또는 TnaB와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 mtr 또는 tnaB의 뉴클레오티드 서열을 변형시킴으로써 수득될 수 있다. 예를 들면, 부위-지시된 돌연변이유발을 사용하여, 아미노산 잔기(들)의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위가 특정 부위에서 일어나도록 할 수 있다. 또한, 상기한 바와 같이 변형된 DNA는 통상적으로 공지된 돌연변이유발 처리법에 의해 수득될 수 있다. 돌연변이유발 처리법의 예로는 돌연변이 처리 전의 DNA를 시험관내에서 하이드록실아민 등으로 처리하는 방법, 및 돌연변이 처리 전의 DNA를 함유하는 미생물, 예를 들어 에스체리키아 속에 속하는 세균을 자외선 조사 또는 통상적 돌연변이 처리에서 사용되는 돌연변이유발제, 예를 들면 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG), EMS 등으로 처리하는 방법이 있다.

Mtr 또는 TnaB와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는, 전술한 모든 돌연변이를 포함하는 DNA를 적당한 세포에서 발현시키고, 발현 생성물의 활성을 조사함으로써 수득될 수 있다. 또한, 예를 들면, 서열번호 1의 뉴클레오티드 번호 181 내지 1425의 뉴클레오티드 서열(mtr의 암호 영역) 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 번호 91 내지 1338의 뉴클레오티드 서열(tnaB의 암호 영역) 또는 이들 서열의 일부를 갖는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화될 수 있고 Mtr 또는 TnaB와 동일한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA가, 돌연변이를 갖는 Mtr 또는 TnaB를 암호화하는 DNA, 또는 이러한 DNA를 함유하는 세포로 부터 수득될 수 있다. 본원에서 언급된 "엄격한 조건"은 소위 특이적 하이브리드만이 형성되고 비-특이적 하이브리드는 형성되지 않는 조건으로서 정의된다. 이러한 조건을 특정 수치를 사용하여 명확히 표현하는 것은 곤란하다. 그러나, 엄격한 조건은, 예를 들어 높은 상동성을 갖는 DNA, 예를 들면 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA는 서로 하이브리드화되지만, 상기한 것 보다 낮은 상동성을 갖는 DNA는 서로 하이브리드화되지 않는 조건을 포함한다. 달리, 엄격한 조건은, DNA가 서던(Southern) 하이브리드화를 위한 전형적인 세척 조건에 상당하는 염 농도, 즉 60℃에서, 1 x SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1 x SSC, 0.1% SDS에서 서로 하이브리드화되는 조건으로 예시된다.

서열번호 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열의 일부 서열이 또한 프로브로서 사용될 수 있다. 이러한 프로브는, 서열번호 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열을 기초 로 하여 제조된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하고, 서열번호 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편을 주형으로서 사용하는 PCR에 의해 제조될 수 있다. 약 300bp의 길이를 갖는 DNA 단편이 프로브로서 사용되는 경우, 하이브리드화를 위한 세척 조건은 50℃에서, 2 x SSC, 0.1% SDS일 수 있다.

Mtr과 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA의 구체적 예로는, 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 가지며 Mtr과 필적할 만한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA가 있다. 또한, TnaB와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA의 구체적인 예로는, 서열번호 4의 아미노산 서열에 대해 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖으며 TnaB에 필적할 정도의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA가 있다.

다른 세균의 mtr 또는 tnaB의 동족체가 전술한 에스체리키아 콜라이의 mtr 또는 tnaB에 대해 사용된 것과 동일한 방법으로 수득될 수 있다. 또한, mtr 또는 tnaB 이외의 섭취계를 암호화하는 유전자를 익히 공지되고 통상적인 유전자 수득 방법을 사용하여 세균의 염색체 DNA로 부터 PCR에 의해 수득할 수 있다.

염색체 DNA는 DNA 공여체인 세균으로 부터, 예를 들면 사이토(Satio) 및 미우라(Miura)의 방법[참조 문헌: Saito H. and Miura K., Biochem. Biophys. Acta, 72, 619, 1963; Seibutsu Kogaku Jikkensho (Text for Bioengineering Experiments), Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, 97-98, Baifukan, 1992] 등에 의해 제조할 수 있다.

수득된 유전자를 에스체리키아 콜라이 및/또는 목적 세균의 세포내에서 자율적으로 복제가능한 벡터 DNA와 연결(ligation)시켜 재조합 DNA를 제조하여 에스체리키아 콜라이 속에 도입하는 경우, 후속 작업이 용이해진다. 에스체리키아 콜라이 내에서 자율적으로 복제가능한 벡터의 예로는 pSTV29, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219 등이 있다.

수득된 유전자를 목적 세균내에서 작용하는 벡터에 연결시켜 재조합 DNA를 제조하기 위하여, 당해 벡터를 제한 효소로 절단하여, 절단된 말단이 전술한 유전자의 말단과 합치하도록 한 후, 당해 벡터와 전술한 유전자를 T4 DNA 리가제와 같은 리가제를 사용하여 연결시킬 수 있다.

표적 물질의 부산물의 섭취계는, 섭취계의 일부인 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 증강시킴으로써 강화될 수 있다. 당해 유전자의 발현 양은 유전자의 복사체 수를 증가시킴으로써 증가된다. 예를 들면, 전술한 유전자 단편을 세균내에서 작용하는 벡터, 바람직하게는 다중-복사형 벡터에 연결시켜, 재조합 DNA를 제조한 다음, 이를 사용하여 표적 물질을 생산하는 숙주를 형질전환시킬 수 있다. 또한, 전술한 재조합 DNA를 야생형 세균 속에 도입하여, 형질전환 균주를 수득하면, 이때 표적 물질-생산능이 당해 형질전환체 균주에 부여될 수 있다.

지금까지 보고된 모든 공지된 형질전환 방법은 재조합 DNA를 세균 속으로 도입하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, DNA의 세포 투과성을 증가시키기 위하여 수용 세균 세포를 염화칼슘으로 처리하는 방법이 공지되었고 에스체리키아 콜라이 K- 12에 대해 보고되었으며[참조 문헌: Manel, M. and Higa, A, J. Mol. Biol., 53, 159, 1970], 성장기에 있는 세포로 부터 수용적격 세포(competent cell)를 수득한 다음, DNA를 이들 속에 도입하는 방법이 또한 공지되었고 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에 대해 보고되었다[참조 문헌: Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E. Gene, 1, 153, 1977]. 또한, DNA-수용 세포를, 재조합 DNA를 쉽게 섭취할 수 있는 원형질체 또는 스페로플라스트(spheroplast)로 만든 다음, 재조합 DNA를 바실루스 서브틸리스, 방선균 및 효모에 대해 공지된 DNA-수용 세포 속에 도입하는 방법이 또한 공지되었다[참조 문헌: Chang, S. and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111, 1979; Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398, 1978; Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1929, 1978]. 미생물의 형질전환은 또한 전기 펄스(pulse)법에 의해 수행될 수 있다[참조: 일본 특허공개 제2-207791호).

유전자의 복사체 수는, 유전자의 다중 복사체가 세균의 염색체 DNA 상에 존재할 수 있도록 함으로써 증가될 수 있다. 유전자의 다중 복사체를 염색체 DNA 속에 도입하기 위하여, 염색체 DNA 상에 다중 복사체 수로서 존재하는 표적으로서의 서열을 사용하여 상동 재조합을 수행할 수 있다. 염색체 DNA 상에 다중 복사체 수로 존재하는 서열로서, 전위 요소(transposble element)의 말단에 존재하는 반복 DNA 또는 역위된 반복체가 사용될 수 있다. 달리, 일본 특허 공개 제2-109985호에 기재된 바와 같이, 목적하는 유전자의 다중 복사체가, 이들을 트랜스포손(transposon) 속에 도입하고 이를 전달하는 방법으로 염색체 DNA 속에 도입될 수 있다.

전술한 유전자 증폭 외에, 섭취계가 또한 염색체 DNA 또는 플라스미드 상의 섭취계 암호화 유전자의 프로모터와 같은 발현 조절 서열을 보다 강한 것으로 대체함으로써 강화될 수 있다. 예를 들면, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터 등이 강한 프로모터로서 공지되었다. 또한, 국제 특허 공보 WO 00/18935에 기재된 바와 같이, 프로모터를 수 개의 뉴클레오티드의 치환을 유전자의 프로모터 영역 속에 도입하는 방법으로 보다 강한 프로모터로 변형시킬 수 있다. 전술한 바와 같은 프로모터의 치환 또는 변형은 섭취계를 암호화하는 유전자의 발현을 증강시키므로, 섭취계가 강화된다. 발현 조절 서열의 변형은 유전자의 복사체 수의 증가와 조합될 수 있다.

발현 조절 서열의 치환은, 예를 들면 온도-감응성 플라스미드를 사용하여 유전자 치환에서와 동일한 방법으로 수행할 수 있다. 에스체리키아 콜라이의 온도-감응성 복제 기점을 갖는 벡터의 예로는, 플라스미드 pMAN997 [국제 특허 공보 WO 99/03988 참조] 등이 있다. 또한, 발현 조절 서열의 치환은, λ 파아지의 레드 리캄비나제(Red recombinase)를 사용하는 방법[참조 문헌: Datsenko, K.A., PNAS, 97(12), 6640-6645, 2000]에 의해 수행될 수 있다.

또한, 실시예 부문에 제시된 바와 같이, 발현 조절 서열의 치환은 또한, 아래와 같이 λ 파아지의 레드 리캄비나제(Red recombinase)를 이용하는 시스템과 P1 형질도입을 조합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 먼저, PCR에 의해 수득된 발현 조절 서열을, 공여체로서 사용된 이. 콜라이 W3110 균주로 부터 유래된 균주 속으 로 레드 리캄비나제(Red recombinase)를 이용한 방법에 의해 도입한다. 이어서, 발현 조절 서열을 공여 균주로 부터 수용 균주속으로 P1 형질도입에 의해 형질도입시킨다. 당해 공여 균주는, 이것이 W3110 균주의 유도체이고 치환된 발현 조절 서열을 가지는 한, 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 세균에서는, 표적 물질을 세포내로 섭취하기 위한 계가 제거되거나 저하될 수 있다. 또한, 표적 물질의 배출계가 강화될 수 있다.

당해 표적 물질은, 상기한 바와 같이 수득된 본 발명의 세균을 배지에서 배양하여, 당해 배지내에 표적 물질을 축적시키고, 당해 배지로 부터 표적 물질을 채취함으로써 효율적으로 제조될 수 있다.

본 발명의 표적 물질은, 본 발명의 세균이 사용되는 점을 제외하고는, 통상적으로 제조되었던 바와 동일한 방법으로 제조될 수 있다. 배양 조건은 세균에 따라 적절히 선택될 수 있다.

예를 들면, 배지는 탄소원, 질소원, 무기이온 및 기타 필요한 유기 성분을 함유하는 전형적인 배지일 수 있다. 글루코스, 락토스, 갈락토스, 프럭토스, 아라비노스, 말토스, 크실로스, 트리할로스, 리보스 및 전분의 가수분해물과 같은 당류, 글리세롤, 만니톨 및 소르비톨과 같은 알코올, 및 글루콘산, 푸마르산, 시트르산 및 석신산과 같은 유기산이 탄소원으로서 사용될 수 있다. 황산암모늄, 염화암모늄 및 인산암모늄과 같은 무기 암모늄 염, 대두 가수분해물과 같은 유기 질소, 암모니아 가스, 암모니아 수 등이 질소원으로서 사용될 수 있다. 유기 미량 영양소로서, 필수 물질, 예를 들면 비타민(예: 비타민 B1), 핵산(예: 아데닌 및 핵산), 효모 추출물 등을 적당한 양으로 첨가하는 것이 바람직할 것이다. 이들 물질외에, 소량의 인산칼슘, 황산마그네슘, 철이온, 망간이온 등이 필요에 따라 첨가된다. 본 발명의 세균에 tyrA 유전자가 결여된 경우, 성장에 필요한 L-티로신을 배지에 첨가한다.

에스체리키아 콜라이의 경우에, 예를 들면 배양을 호기적 조건하에 약 16 내지 72 시간 동안 수행하는 것이 바람직하다. 배양하는 동안에, 배양 온도를 30 내지 45℃로 조절하고, pH를 5 내지 8로 조절한다. 무기 또는 유기, 산성 또는 알카리성 물질 뿐만 아니라 암모니아 가스 등을 사용하여 pH를 조정할 수 있다.

배지로 부터의 표적 물질의 채취는 익히 공지된 방법을 조합하여 수행할 수 있다. 이러한 방법은 표적 물질에 따라 통상적으로 이온 교환 수지법, 침전법 등을 이용한다.

실시예

본 발명은 아래의 비-제한적 실시예를 참조하여 보다 구체적으로 설명될 것이다.

실시예 1

<1> mtr 유전자-보유 플라스미드 및 tnaB 유전자-보유 플라스미드의 작제

(1) mtr 유전자-보유 플라스미드의 작제

에스체리키아 콜라이 W3110 균주의 염색체 DNA를 주형으로서 사용하고 서열번호 5 및 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하여 PCR를 수행하였다. PCR을 LATaq(Takara Shuzo)를 사용하여 94℃ 2분 (1 사이 클) 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 및 72℃ 1분 30초의 30 사이클로 수행하였다. mtr의 프로모터 및 ORF를 포함하는 약 1.5kb의 증폭된 단편이 수득되었다.

상기-증폭된 단편을 MicroSpins^TM S400HR 칼럼 (Amarsham Pharmacia Biotech Inc.)을 사용하여 정제한 다음, SacI 및 KpnI으로 분해하고, SacI 및 KpnI으로 유사하게 분해된 pSTV28 및 pSTV29 (Takara Shuzo)에 연결시켰다. 에스체리키아 콜라이 JM109 수용적격 세포 (Takara Shuzo)를 상기 반응 혼합물로 형질전환시켰다. 당해 형질전환체를 클로르암페니콜, IPTG 및 X-Gal을 함유하는 LB 플레이트 상에서 배양하였다. 백색 콜로니를 선별하였다. mtr-보유 플라스미드 pSTV28mtr 및 pSTV29mtr를 선별된 형질전환체로 부터 수득하였다.

pSTV28mtr에서는, mtr 유전자가 lac 프로모터와 동일한 방향으로 삽입되었다. 한편, pSTV29mtr에서는, mtr 유전자가 lac 프로모터와는 반대 방향으로 삽입되었다.

(2) tnaB 유전자-보유 플라스미드의 작제

에스체리키아 콜라이 MG1655 균주의 염색체 DNA를 주형으로서 사용하고 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하여 PCR를 수행하였다. PCR을 LATaq(Takara Shuzo)를 사용하여 94℃ 2분 (1 사이클) 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 및 72℃ 1분 30초의 30 사이클로 수행하였다. ORF 및 tnaB를 포함하는 약 1.5kb의 증폭된 단편이 수득되었다. tnaB는 tnaA와 함께 오페론을 형성하고, tnaB의 직 상류에는 프로모터가 존재하지 않았다.

상기-증폭된 단편을 MicroSpins^TM S400HR 칼럼 (Amarsham Pharmacia Biotech Inc.)을 사용하여 정제한 다음, SalI 및 PstI으로 분해하고, SalI 및 PstI으로 유사하게 분해된 pSTV28 및 pSTV29 (Takara Shuzo)에 연결시켰다. 에스체리키아 콜라이 JM109 수용적격 세포 (Takara Shuzo)를 상기 반응 혼합물로 형질전환시켰다. 당해 형질전환체를 클로르암페니콜, IPTG 및 X-Gal을 함유하는 LB 플레이트 상에서 배양하고, 백색 클로니를 선별하였다. tnaB-보유 플라스미드 pSTV28tnaB 및 pSTV29tnaB를 선별된 형질전환체로 부터 수득하였다.

pSTV28tnaB에서는, tnaB 유전자가 lac 프로모터와 동일한 방향으로 삽입되었다. 한편, pSTV29tnaB에서는, tnaB 유전자가 lac 프로모터와는 반대 방향으로 삽입되었다.

<2> mtr 및 tnaB-강화된 균주의 작제 및 L-페닐알라닌의 생산

(1) 전술한 플라스미드 pSTV28mtr, pSTV29mtr, pSTV28tnaB 및 pSTV29tnaB를 에스체리키아 콜라이의 L-페닐알라닌-생산 세균인, AJ12741 균주 (일본 특허 제3225597호 참조; 본원에서 이후 "R/GAL 균주"로서 언급됨) 속에 통상의 방법으로 도입하여, R/GAL/pSTV28mtr, R/GAL/pSTV29mtr, R/GAL/pSTV28tnaB 및 R/GAL/pSTV29tnaB를 수득하였다. 이어서, 이들 형질전환체 및 R/GAL 균주의 L-페닐알라닌-생산능을 평가하였다.

아래의 조성을 갖는 배지 20ml를 사카구치(Sakaguchi) 플라스크 (500ml) 속에 도입하고, 각 세균 균주를 접종시켜, 글루코스가 전부 소비될 때까지 37℃에서 배양하였다. 배양 후 배지내에 축적된 L-페닐알라닌(L-Phe) 및 L-트립토판(L-Trp)의 양을 측정하였다. 결과는 표 2에 제시되어있다.

배지 조성 (pH 7.0):

글루코스 40g/L

황산마그네슘 7수산화물 1g/L

황산암모늄 16g/L

인산이수소칼슘 1g/L

효모 추출물 2g/L

황산제1철 7수산화물 10mg/L

황산망간 4 또는 5 수산화물 8mg/L

L-티로신 125mg/L

앰피실린 50mg/L

클로르암페니콜 50mg/L

(R/GAL 균주에는 첨가되지 않음)

탄산칼슘 30g/L

세균 균주	L-Phe (g/L)	L-Trp (mg/L)
R/GAL	6.8	60
R/GAL/pSTV28mtr	6.6	<1.5
R/GAL/pSTV29mtr	6.7	<1.5
R/GAL/pSTV28tnaB	6.6	<1.5
R/GAL/pSTV29tnaB	6.7	<1.5

표 2에 제시된 바와 같이, R/GAL 균주는 부산물로서 L-트립토판을 생산하였다. 그러나, mtr-강화된 균주 및 tnaB-강화된 균주는 부산물로서 L-트립토판을 생산하지 않았으며, R/GAL 균주를 사용하여 수득된 것과 필적한 양으로 L-페닐알라닌을 축적시킬 수 있었다.

실시예 2

<1> mtr 유전자 프로모터-강화된 균주 및 tnaB 유전자 프로모터-강화된 균주의 작제

λ 파아지의 레드 리캄비나제(Red recombinase)를 이용하는 시스템 (Datsenko, K.A. PNAS, 97(12), 6640-6645, 2000)과 P1 형질도입을 조합한 방법을 사용하여, λ 파아지의 P_L 프로모터를 에스체리키아 콜라이의 염색체상의 mtr 유전자 및 tnaB 유전자의 암호 영역속에 삽입하여, mtr 유전자 프로모터-강화된 균주 및 tnaB 유전자 프로모터-강화된 균주를 작제하였다.

먼저, (1) λ 파아지-유래된 attR 서열, (2) Tn9-유래된 cat 유전자, (3) T7 파아지-유래된 Pa2 프로모터 서열, (4) pBR322-유래된 tet 유전자 서열 (부분 서열), 및 (5) λ 파아지-유래된 attL 서열을 각각 PCR에 의해 증폭시켰다. λ DNA 를 주형으로서 사용하고 (1)f (서열번호 9) 및 (1)r (서열번호 10)을 프라이머로서 사용하여 단편(1)을 증폭시켰다. Tn9을 갖는 이.콜라이 (예: GM2159 및 GM2150)의 염색체 DNA를 주형으로서 사용하고 (2)f (서열번호 11) 및 (2)r (서열번호 12)를 프라이머로서 사용하여 단편(2)를 증폭시켰다. T7 파아지 DNA를 주형으로서 사용하고 (3)f (서열번호 13) 및 (3)r (서열번호 14)을 프라이머로서 사용하여 단편(3)을 증폭시켰다. pBR322를 주형으로서 사용하고 (4)f (서열번호 15) 및 (4)r (서열번호 16)을 프라이머로서 사용하여 단편(4)을 증폭시켰다. λ DNA를 주형으로서 사용하고 (5)f (서열번호 17) 및 (5)r (서열번호 18)을 프라이머로서 사용하여 단편(5)을 증폭시켰다. 전술한 GM2159 및 GM2150은 공급원[E. coli Genetic Stock Center (Yale University, Dept. Biology, Osborn Memorial Labs., P.O. Box 6666, New Haven, CT, U.S.A. 06511-7444)]으로 부터 구입할 수 있다.

또한, (6) thr 오페론 터미네이터 서열 (58bp)을, 합성 DNA (6)f (서열번호 19) 및 (6)r (서열번호 20)을 어닐링시켜 수득하였다.

수득된 각 단편을 표 3에 제시된 바와 같이 사용하여 교차(crossover) PCR을 수행하여 DNA 단편 (본원에서 이후 "단편 A"로서 지칭함)을 수득하고, 이에 단편 (1), (6), (2), (3), (4) 및 (5)을 연결시켰다.

주형	프라이머	수득된 단편
(1) 및 (6)	(1)f 및 (6)r2	(1)+(6)
(2) 및 (3)	(2)f 및 (3)r	(2)+(3)
(4) 및 (5)	(4)f 및 (5)r	(4)+(5)
(1)+(6) 및 (2)+(3)	(1)f 및 (3)r	(1)+(6)+(2)+(3)
(1)+(6)+(2)+(3) 및 (4)+(5)	(1)f 및 (5)r	(1)+(6)+(2)+(3)+(4)+(5)

이후, P_L 프로모터 서열 (lacZ 상류에 존재하는 SD 서열이 부가됨)을, λ DNA을 주형으로서 사용하고 프라이머 P1 (서열번호 21) 및 P2mtr (36bp의 mtr ORF 서열을 포함, 서열번호 22) 또는 P2tnaB (36bp의 tnaB ORF 서열을 포함, 서열번호 23)을 프라이머로서 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다. 이러한 증폭된 단편 및 단편 A를 주형으로서 사용하고 mtr 유전자 또는 tnaB 유전자의 ORF의 상류 영역의 서열(36bp)을 포함하는 프라이머 (1)fmtr (서열번호 24) 또는 (1)ftnab (서열번호 25) 및 프라이머 P2mtr 또는 P2tnab를 프라이머로서 사용하여, 교차 PCR을 수행하였다. 각각의 증폭된 단편은 양 말단에 mtr 유전자 또는 tnaB 유전자의 상류 영역의 서열 및 OFR의 내부 서열을 포함하였다. 이들 DNA 단편들의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 26 및 27에 제시되어 있다. 이들 DNA 단편들의 구조는 표 4에 제시되어 있다.

서열번호 26 또는 27내의 위치	구성물
1 내지 36	mtr 유전자 또는 tnaB 유전자의 상류 서열
37 내지 202	λ 파아지의 attR
203 내지 260	이.콜라이 K12의 thr 오페론 터미네이터
261 내지 1043	Tn9의 cat 유전자
1043 내지 1175	T7 파아지의 초기 유전자 프로모터 (Pa2)
1176 내지 1521	pBR322로 부터 유래된 tet 유전자 서열
1522 내지 1666	λ 파아지의 attL
1671 내지 1933	λ 파아지의 P_L 프로모터
1934 내지 3178 또는 3181	mtr 유전자 또는 tnaB 유전자

상기 DNA 단편의 각각을 통상의 방법으로, 헬퍼 플라스미드 pKD46가 미리 도입되어진 이.콜라이 K-12 W3110의 유도체인 TD-18 균주 속에 도입하였다. pKD46은 레드 리캄비나제를 발현한다는 것이 공지되었다[참조 문헌: PNAS, 97(12), 6640- 6645, 2000]. 유전자 치환이 일어난 후, 플라스미드 pKD46을 당해 형질전환체로 부터 제거하였다.

형질전환된 균주가 클로르암페니콜 내성을 나타내기 때문에, 목적하는 유전자 mtr 유전자 또는 tnaB 유전자 프로모터-강화된 균주는 이러한 마커를 사용하여 효율적으로 선별될 수 있다.

이때, 전술한 mtr 유전자 또는 tnaB 유전자-강화된 균주를 P1 파아지로 감염시켰다. 각각의 P1 파아지-감염된 균주를 P1 형질도입을 위한 공여체로서 사용하면서, 클로로암페니콜 내성을 지표로서 사용하여 P1 형질도입에 의해 L-페닐알라닌-생산 세균인 AJ12741(R/GAL 균주)의 mtr 유전자 또는 tnaB 유전자 ORF의 상류 영역을 P_L 프로모터로 대체하였다. 목적하는 유전자 치환이 일어났음은 PCR에 의해 확인되었다.

전술한 방법에 의해 증폭된 각각의 DNA 단편을 L-페닐알라닌-생산 세균인 AJ12741 균주 (R/GAL 균주) 속에 도입함으로써, mtr 유전자 또는 tnaB 유전자 ORF의 상류 영역이 P_L 프로모터로 대체된 세균 균주가 숙주로서 수득될 수 있다.

<2> mtr 유전자 프로모터-강화된 균주 및 tnaB 유전자 프로모터-강화된 균주에 의한 L-페닐알라닌의 생산

mtr 유전자 ORF의 상류 영역이 P_L 프로모터로 대체된 R/GAL 균주 (RM11) 및 tnaB 유전자 ORF의 상류 영역이 P_L 프로모터로 대체된 R/GAL 균주 (Rtp32)를 상기한 바와 같이 수득하였다. 이들 세균 균주를 실시예 1에서와 동일한 방법으로 배양하여 L-페닐알라닌을 생산하였고, 배지 중의 L-페닐알라닌 및 L-트립토판의 양을 측정하였다. 결과는 표 5에 제시되어 있다.

세균 균주	L-Phe (g/L)	L-Trp (mg/L)
R/GAL	6.8	60
RM11	6.9	<1.5
Rtp22	7.1	<1.5

표 5에 제시된 바와 같이, R/GAL 균주는 L-트립토판을 부산물로서 생산하였다. 그러나, mtr 프로모터-강화된 균주 RM11 및 tnaB 프로모터-강화된 균주 Rtp32는 부산물로서 L-트립토판을 생산하지 않았으며, R/GAL 균주를 사용하여 수득된 것과 필적한 양으로 L-페닐알라닌을 축적하였다.

본 발명이 이의 바람직한 태양을 참조하여 상세히 기술되었지만, 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 각종 변화가 이루어질 수 있고 균등물이 사용될 수 있다는 것은 당업자에게는 명백할 것이다. 전술한 각각의 문헌들은 물론 외국 우선권 서류, JP 2003-161181은 본원에 참조로서 전문이 인용된다.

본 발명을 사용하는 경우, 부산물의 생성을 감소시키고 표적 물질의 생성을 향상시킬 수 있으며, 또한, 세균을 배양할 때, 성장에 요구되는 어떠한 물질도 배지에 첨가할 필요가 없으며, 배지내의 부산물의 양이 감소될 수 있기 때문에, 당해 배지로 부터 표적 물질을 정제하는 것이 용이해진다.

<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Method for producing target substance <130> OP-C4047 <150> JP 2003-161181 <151> 2003-06-05 <160> 27 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1550 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (181)..(1425) <400> 1 cgtcgtcgtt tcggtggtga tgcgtaatca tcgctgaaca gcgaacacaa tctgtaaaat 60 aatatataca gccccgattt ttaccatcgg ggcttttttt ctgtcttttg tactcgtgta 120 ctggtacagt gcaatgcata acaacgcagt cgcactattt ttcactggag agaagccctc 180 atg gca aca cta acc acc acc caa acg tca ccg tcg ctg ctt ggc ggc 228 Met Ala Thr Leu Thr Thr Thr Gln Thr Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly 1 5 10 15 gtg gtg att atc ggc ggc acc att att ggc gca ggg atg ttt tct ctg 276 Val Val Ile Ile Gly Gly Thr Ile Ile Gly Ala Gly Met Phe Ser Leu 20 25 30 cca gtg gtc atg tcc ggg gcg tgg ttt ttc tgg tca atg gcg gcg ctg 324 Pro Val Val Met Ser Gly Ala Trp Phe Phe Trp Ser Met Ala Ala Leu 35 40 45 atc ttt acc tgg ttc tgt atg ctg cat tcc ggc ttg atg att ctg gaa 372 Ile Phe Thr Trp Phe Cys Met Leu His Ser Gly Leu Met Ile Leu Glu 50 55 60 gct aac ctg aat tac aga atc ggt tcg agt ttt gac acc atc acc aaa 420 Ala Asn Leu Asn Tyr Arg Ile Gly Ser Ser Phe Asp Thr Ile Thr Lys 65 70 75 80 gat ttg ctg ggc aaa ggc tgg aac gtg gtc aac ggc att tcc att gcc 468 Asp Leu Leu Gly Lys Gly Trp Asn Val Val Asn Gly Ile Ser Ile Ala 85 90 95 ttt gtg ctc tat atc ctg acc tat gcc tat att tct gcc agt ggt tcg 516 Phe Val Leu Tyr Ile Leu Thr Tyr Ala Tyr Ile Ser Ala Ser Gly Ser 100 105 110 att ctg cat cac acc ttc gca gag atg tca cta aac gtc ccg gca cgg 564 Ile Leu His His Thr Phe Ala Glu Met Ser Leu Asn Val Pro Ala Arg 115 120 125 gcg gcg ggt ttt ggt ttt gca ttg ctg gta gcg ttt gtg gtg tgg ttg 612 Ala Ala Gly Phe Gly Phe Ala Leu Leu Val Ala Phe Val Val Trp Leu 130 135 140 agc act aaa gcc gtc agt cgc atg aca gcg att gtg ctg ggg gcg aaa 660 Ser Thr Lys Ala Val Ser Arg Met Thr Ala Ile Val Leu Gly Ala Lys 145 150 155 160 gtc att acc ttc ttc ctc acc ttt ggt agc ctg ctg ggg cat gtg cag 708 Val Ile Thr Phe Phe Leu Thr Phe Gly Ser Leu Leu Gly His Val Gln 165 170 175 cct gcg aca ttg ttc aac gtc gcc gaa agc aat gcg tct tat gca ccg 756 Pro Ala Thr Leu Phe Asn Val Ala Glu Ser Asn Ala Ser Tyr Ala Pro 180 185 190 tat ctg ttg atg acc ctg ccg ttc tgt ctg gca tcg ttt ggt tat cac 804 Tyr Leu Leu Met Thr Leu Pro Phe Cys Leu Ala Ser Phe Gly Tyr His 195 200 205 ggt aac gtg cca agc ctg atg aag tat tac ggc aaa gat ccg aaa acc 852 Gly Asn Val Pro Ser Leu Met Lys Tyr Tyr Gly Lys Asp Pro Lys Thr 210 215 220 atc gtg aaa tgt ctg gtg tac ggt acg ctg atg gcg ctg gcg ctg tat 900 Ile Val Lys Cys Leu Val Tyr Gly Thr Leu Met Ala Leu Ala Leu Tyr 225 230 235 240 acc atc tgg ttg ctg gcg acg atg ggt aac atc ccg cgt ccg gag ttt 948 Thr Ile Trp Leu Leu Ala Thr Met Gly Asn Ile Pro Arg Pro Glu Phe 245 250 255 atc ggt att gca gag aag ggc ggt aat att gat gtg ctg gta cag gcg 996 Ile Gly Ile Ala Glu Lys Gly Gly Asn Ile Asp Val Leu Val Gln Ala 260 265 270 tta agc ggc gta ctg aac agc cgt agt ctg gat ctg ctg ctg gtc gtg 1044 Leu Ser Gly Val Leu Asn Ser Arg Ser Leu Asp Leu Leu Leu Val Val 275 280 285 ttc tca aac ttt gcg gta gcg agt tcg ttc ctc ggc gta acg ctg ggt 1092 Phe Ser Asn Phe Ala Val Ala Ser Ser Phe Leu Gly Val Thr Leu Gly 290 295 300 ttg ttt gac tat ctg gca gat ctg ttt ggt ttc gac gac tcg gct gtg 1140 Leu Phe Asp Tyr Leu Ala Asp Leu Phe Gly Phe Asp Asp Ser Ala Val 305 310 315 320 ggc cgc ttg aaa acg gca ttg ctg acc ttt gcc ccg cca gtt gtg ggg 1188 Gly Arg Leu Lys Thr Ala Leu Leu Thr Phe Ala Pro Pro Val Val Gly 325 330 335 ggg ctg ttg ttc ccg aac gga ttc ctg tac gcc att ggt tat gct ggt 1236 Gly Leu Leu Phe Pro Asn Gly Phe Leu Tyr Ala Ile Gly Tyr Ala Gly 340 345 350 tta gcg gct acc atc tgg gcg gca att gtt ccg gcg ctg tta gcc cgt 1284 Leu Ala Ala Thr Ile Trp Ala Ala Ile Val Pro Ala Leu Leu Ala Arg 355 360 365 gca tcg cgt aaa cgc ttt ggc agc ccg aaa ttc cgc gtc tgg ggt ggc 1332 Ala Ser Arg Lys Arg Phe Gly Ser Pro Lys Phe Arg Val Trp Gly Gly 370 375 380 aag ccg atg att gcg ctg att ctg gtg ttt ggc gtc ggc aac gca ctg 1380 Lys Pro Met Ile Ala Leu Ile Leu Val Phe Gly Val Gly Asn Ala Leu 385 390 395 400 gtg cat att tta tcg agc ttt aat tta ctg ccg gtg tat cag taa 1425 Val His Ile Leu Ser Ser Phe Asn Leu Leu Pro Val Tyr Gln 405 410 tcagcggtgc cttatccgac atttctgctg cctacacaat gcctgatgcg cttcgcttat 1485 caggtctatg taggacagcg ttgccagctc ggataaggct tcccgcgtta agacacacta 1545 tccca 1550 <210> 2 <211> 414 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Ala Thr Leu Thr Thr Thr Gln Thr Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly 1 5 10 15 Val Val Ile Ile Gly Gly Thr Ile Ile Gly Ala Gly Met Phe Ser Leu 20 25 30 Pro Val Val Met Ser Gly Ala Trp Phe Phe Trp Ser Met Ala Ala Leu 35 40 45 Ile Phe Thr Trp Phe Cys Met Leu His Ser Gly Leu Met Ile Leu Glu 50 55 60 Ala Asn Leu Asn Tyr Arg Ile Gly Ser Ser Phe Asp Thr Ile Thr Lys 65 70 75 80 Asp Leu Leu Gly Lys Gly Trp Asn Val Val Asn Gly Ile Ser Ile Ala 85 90 95 Phe Val Leu Tyr Ile Leu Thr Tyr Ala Tyr Ile Ser Ala Ser Gly Ser 100 105 110 Ile Leu His His Thr Phe Ala Glu Met Ser Leu Asn Val Pro Ala Arg 115 120 125 Ala Ala Gly Phe Gly Phe Ala Leu Leu Val Ala Phe Val Val Trp Leu 130 135 140 Ser Thr Lys Ala Val Ser Arg Met Thr Ala Ile Val Leu Gly Ala Lys 145 150 155 160 Val Ile Thr Phe Phe Leu Thr Phe Gly Ser Leu Leu Gly His Val Gln 165 170 175 Pro Ala Thr Leu Phe Asn Val Ala Glu Ser Asn Ala Ser Tyr Ala Pro 180 185 190 Tyr Leu Leu Met Thr Leu Pro Phe Cys Leu Ala Ser Phe Gly Tyr His 195 200 205 Gly Asn Val Pro Ser Leu Met Lys Tyr Tyr Gly Lys Asp Pro Lys Thr 210 215 220 Ile Val Lys Cys Leu Val Tyr Gly Thr Leu Met Ala Leu Ala Leu Tyr 225 230 235 240 Thr Ile Trp Leu Leu Ala Thr Met Gly Asn Ile Pro Arg Pro Glu Phe 245 250 255 Ile Gly Ile Ala Glu Lys Gly Gly Asn Ile Asp Val Leu Val Gln Ala 260 265 270 Leu Ser Gly Val Leu Asn Ser Arg Ser Leu Asp Leu Leu Leu Val Val 275 280 285 Phe Ser Asn Phe Ala Val Ala Ser Ser Phe Leu Gly Val Thr Leu Gly 290 295 300 Leu Phe Asp Tyr Leu Ala Asp Leu Phe Gly Phe Asp Asp Ser Ala Val 305 310 315 320 Gly Arg Leu Lys Thr Ala Leu Leu Thr Phe Ala Pro Pro Val Val Gly 325 330 335 Gly Leu Leu Phe Pro Asn Gly Phe Leu Tyr Ala Ile Gly Tyr Ala Gly 340 345 350 Leu Ala Ala Thr Ile Trp Ala Ala Ile Val Pro Ala Leu Leu Ala Arg 355 360 365 Ala Ser Arg Lys Arg Phe Gly Ser Pro Lys Phe Arg Val Trp Gly Gly 370 375 380 Lys Pro Met Ile Ala Leu Ile Leu Val Phe Gly Val Gly Asn Ala Leu 385 390 395 400 Val His Ile Leu Ser Ser Phe Asn Leu Leu Pro Val Tyr Gln 405 410 <210> 3 <211> 1450 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (91)..(1338) <400> 3 ttaatactac agagtggcta taaggatgtt agccactctc ttaccctaca tcctcaataa 60 caaaaatagc cttcctctaa aggtggcatc atg act gat caa gct gaa aaa aag 114 Met Thr Asp Gln Ala Glu Lys Lys 1 5 cac tct gca ttt tgg ggt gtt atg gtt ata gca ggt aca gta att ggt 162 His Ser Ala Phe Trp Gly Val Met Val Ile Ala Gly Thr Val Ile Gly 10 15 20 gga ggt atg ttt gct tta cct gtt gat ctt gcc ggt gcc tgg ttt ttc 210 Gly Gly Met Phe Ala Leu Pro Val Asp Leu Ala Gly Ala Trp Phe Phe 25 30 35 40 tgg ggt gcc ttt atc ctt atc att gcc tgg ttt tca atg ctt cat tcc 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Ile Ser Ala Asn Gly Ala Ile Ile 100 105 110 Ser Glu Thr Ile Ser Met Asn Leu Gly Tyr His Ala Asn Pro Arg Ile 115 120 125 Val Gly Ile Cys Thr Ala Ile Phe Val Ala Ser Val Leu Trp Leu Ser 130 135 140 Ser Leu Ala Ala Ser Arg Ile Thr Ser Leu Phe Leu Gly Leu Lys Ile 145 150 155 160 Ile Ser Phe Val Ile Val Phe Gly Ser Phe Phe Phe Gln Val Asp Tyr 165 170 175 Ser Ile Leu Arg Asp Ala Thr Ser Ser Thr Ala Gly Thr Ser Tyr Phe 180 185 190 Pro Tyr Ile Phe Met Ala Leu Pro Val Cys Leu Ala Ser Phe Gly Phe 195 200 205 His Gly Asn Ile Pro Ser Leu Ile Ile Cys Tyr Gly Lys Arg Lys Asp 210 215 220 Lys Leu Ile Lys Ser Val Val Phe Gly Ser Leu Leu Ala Leu Val Ile 225 230 235 240 Tyr Leu Phe Trp Leu Tyr Cys Thr Met Gly Asn Ile Pro Arg Glu Ser 245 250 255 Phe Lys Ala Ile Ile Ser Ser Gly Gly Asn Val Asp Ser Leu Val Lys 260 265 270 Ser Phe Leu Gly Thr Lys Gln His Gly Ile Ile Glu Phe Cys Leu Leu 275 280 285 Val Phe Ser Asn Leu Ala Val Ala Ser Ser Phe Phe Gly Val Thr Leu 290 295 300 Gly Leu Phe Asp Tyr Leu Ala Asp Leu Phe Lys Ile Asp Asn Ser His 305 310 315 320 Gly Gly Arg Phe Lys Thr Val Leu Leu Thr Phe Leu Pro Pro Ala Leu 325 330 335 Leu Tyr Leu Ile Phe Pro Asn Gly Phe Ile Tyr Gly Ile Gly Gly Ala 340 345 350 Gly Leu Cys Ala Thr Ile Trp Ala Val Ile Ile Pro Ala Val Leu Ala 355 360 365 Ile Lys Ala Arg Lys Lys Phe Pro Asn Gln Met Phe Thr Val Trp Gly 370 375 380 Gly Asn Leu Ile Pro Ala Ile Val Ile Leu Phe Gly Ile Thr Val Ile 385 390 395 400 Leu Cys Trp Phe Gly Asn Val Phe Asn Val Leu Pro Lys Phe Gly 405 410 415 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 5 gggagctcgt cgtttcggtg gtgatgcgta 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 6 ggggtaccga tagtgtgtct taacgcggga 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 7 gggtcgacgt tagccactct cttaccctac 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 8 ggctgcagcg caaagcatac gtggtgaagg 30 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer (1)f <400> 9 cgctcaagtt agtataaa 18 <210> 10 <211> 54 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer (1)r <400> 10 cctgacagtg cgggcttttt ttttcgacca ctgcagtctg ttacaggtca ctaa 54 <210> 11 <211> 54 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer (2)f <400> 11 cccgcactgt caggtgcggg cttttttctg tgttaagctt cgacgaattt ctgc 54 <210> 12 <211> 54 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer (2)r <400> 12 gcagcgtcaa ccgggcgctc tagctagata tcggatccga gattttcagg agct 54 <210> 13 <211> 54 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer (3)f <400> 13 agctcctgaa aatctcggat ccgatatcta gctagagcgc ccggttgacg ctgc 54 <210> 14 <211> 54 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer (3)r <400> 14 ctacgcgatc atggcgacca cacccgtcct gtggatctcc ggataagtag acag 54 <210> 15 <211> 54 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer (4)f <400> 15 ttcgtgcgac ttatcaggct gtctacttat ccggagatcc acaggacggg tgtg 54 <210> 16 <211> 54 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer (4)r <400> 16 cgaattctca tgtttgacag cttatcatcg ataagcttta atgcggtagt ttat 54 <210> 17 <211> 54 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer (5)f <400> 17 ttagcaattt aactgtgata aactaccgca ttaaagctta tcgatgataa gctg 54 <210> 18 <211> 54 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer (5)r <400> 18 ttttgcaggg gggcattgtt tggtaggtga agatcttgaa gcctgctttt ttat 54 <210> 19 <211> 58 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic DNA (6)f <400> 19 ctgcagtggt cgaaaaaaaa agcccgcact gtcaggtgcg ggcttttttc tgtgttaa 58 <210> 20 <211> 58 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic DNA (6)r <400> 20 ttaacacaga aaaaagcccg cacctgacag tgcgggcttt ttttttcgac cactgcag 58 <210> 21 <211> 54 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer P1 <400> 21 tgccaactta gtataaaaaa gcaggcttca agatcttcac ctaccaaaca atgc 54 <210> 22 <211> 72 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer P2mtr <400> 22 cgacggtgac gtttgggtgg tggttagtgt tgccatagcc tgtttccttc tagacggcca 60 atgcttcgtt tc 72 <210> 23 <211> 72 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer P2tnab <400> 23 aaatgcagag tgcttttttt cagcttgatc agtcatagcc tgtttccttc tagacggcca 60 atgcttcgtt tc 72 <210> 24 <211> 54 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer (1)fmtr <400> 24 gcgaacacaa tctgtaaaat aatatataca gccccgcgct caagttagta taaa 54 <210> 25 <211> 54 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer (1)ftnab <400> 25 tcctcaataa caaaaatagc cttcctctaa aggtggcgct caagttagta taaa 54 <210> 26 <211> 3178 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fused gene <400> 26 gcgaacacaa tctgtaaaat aatatataca gccccgcgct caagttagta taaaaaagct 60 gaacgagaaa cgtaaaatga tataaatatc aatatattaa attagatttt gcataaaaaa 120 cagactacat aatactgtaa aacacaacat atgcagtcac tatgaatcaa ctacttagat 180 ggtattagtg acctgtaaca gactgcagtg gtcgaaaaaa aaagcccgca ctgtcaggtg 240 cgggcttttt tctgtgttaa gcttcgacga atttctgcca ttcatccgct tattatcact 300 tattcaggcg tagcaccagg cgtttaaggg caccaataac tgccttaaaa aaattacgcc 360 ccgccctgcc actcatcgca gtactgttgt aattcattaa gcattctgcc gacatggaag 420 ccatcacaga cggcatgatg aacctgaatc gccagcggca tcagcacctt gtcgccttgc 480 gtataatatt tgcccatggt gaaaacgggg gcgaagaagt tgtccatatt ggccacgttt 540 aaatcaaaac tggtgaaact cacccaggga ttggctgaga cgaaaaacat attctcaata 600 aaccctttag ggaaataggc caggttttca ccgtaacacg ccacatcttg cgaatatatg 660 tgtagaaact gccggaaatc gtcgtggtat tcactccaga gcgatgaaaa cgtttcagtt 720 tgctcatgga aaacggtgta acaagggtga acactatccc atatcaccag ctcaccgtct 780 ttcattgcca tacggaattc cggatgagca ttcatcaggc gggcaagaat gtgaataaag 840 gccggataaa acttgtgctt atttttcttt acggtcttta aaaaggccgt aatatccagc 900 tgaacggtct ggttataggt acattgagca actgactgaa atgcctcaaa atgttcttta 960 cgatgccatt gggatatatc aacggtggta tatccagtga tttttttctc cattttagct 1020 tccttagctc ctgaaaatct cggatccgat atctagctag agcgcccggt tgacgctgct 1080 agtgttacct agcgatttgt atcttactgc atgttacttc atgttgtcaa tacctgtttt 1140 tcgtgcgact tatcaggctg tctacttatc cggagatcca caggacgggt gtggtcgcca 1200 tgatcgcgta gtcgatagtg gctccaagta gcgaagcgag caggactggg cggcggccaa 1260 agcggtcgga cagtgctccg agaacgggtg cgcatagaaa ttgcatcaac gcatatagcg 1320 ctagcagcac gccatagtga ctggcgatgc tgtcggaatg gacgatatcc cgcaagaggc 1380 ccggcagtac cggcataacc aagcctatgc ctacagcatc cagggtgacg gtgccgagga 1440 tgacgatgag cgcattgtta gatttcatac acggtgcctg actgcgttag caatttaact 1500 gtgataaact accgcattaa agcttatcga tgataagctg tcaaacatga gaattcgaaa 1560 tcaaataatg attttatttt gactgatagt gacctgttcg ttgcaacaaa ttgataagca 1620 atgctttttt ataatgccaa cttagtataa aaaagcaggc ttcaagatct tcacctacca 1680 aacaatgccc ccctgcaaaa aataaattca tataaaaaac atacagataa ccatctgcgg 1740 tgataaatta tctctggcgg tgttgacata aataccactg gcggtgatac tgagcacatc 1800 agcaggacgc actgaccacc atgaaggtga cgctcttaaa aattaagccc tgaagaaggg 1860 cagcattcaa agcagaaggc tttggggtgt gtgatacgaa acgaagcatt ggccgtctag 1920 aaggaaacag gctatggcaa cactaaccac cacccaaacg tcaccgtcgc tgcttggcgg 1980 cgtggtgatt atcggcggca ccattattgg cgcagggatg ttttctctgc cagtggtcat 2040 gtccggggcg tggtttttct ggtcaatggc ggcgctgatc tttacctggt tctgtatgct 2100 gcattccggc ttgatgattc tggaagctaa cctgaattac agaatcggtt cgagttttga 2160 caccatcacc aaagatttgc tgggcaaagg ctggaacgtg gtcaacggca tttccattgc 2220 ctttgtgctc tatatcctga cctatgccta tatttctgcc agtggttcga ttctgcatca 2280 caccttcgca gagatgtcac taaacgtccc ggcacgggcg gcgggttttg gttttgcatt 2340 gctggtagcg tttgtggtgt ggttgagcac taaagccgtc agtcgcatga cagcgattgt 2400 gctgggggcg aaagtcatta ccttcttcct cacctttggt agcctgctgg ggcatgtgca 2460 gcctgcgaca ttgttcaacg tcgccgaaag caatgcgtct tatgcaccgt atctgttgat 2520 gaccctgccg ttctgtctgg catcgtttgg ttatcacggt aacgtgccaa gcctgatgaa 2580 gtattacggc aaagatccga aaaccatcgt gaaatgtctg gtgtacggta cgctgatggc 2640 gctggcgctg tataccatct ggttgctggc gacgatgggt aacatcccgc gtccggagtt 2700 tatcggtatt gcagagaagg gcggtaatat tgatgtgctg gtacaggcgt taagcggcgt 2760 actgaacagc cgtagtctgg atctgctgct ggtcgtgttc tcaaactttg cggtagcgag 2820 ttcgttcctc ggcgtaacgc tgggtttgtt tgactatctg gcagatctgt ttggtttcga 2880 cgactcggct gtgggccgct tgaaaacggc attgctgacc tttgccccgc cagttgtggg 2940 ggggctgttg ttcccgaacg gattcctgta cgccattggt tatgctggtt tagcggctac 3000 catctgggcg gcaattgttc cggcgctgtt agcccgtgca tcgcgtaaac gctttggcag 3060 cccgaaattc cgcgtctggg gtggcaagcc gatgattgcg ctgattctgg tgtttggcgt 3120 cggcaacgca ctggtgcata ttttatcgag ctttaattta ctgccggtgt atcagtaa 3178 <210> 27 <211> 3181 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fused gene <400> 27 tcctcaataa caaaaatagc cttcctctaa aggtggcgct caagttagta taaaaaagct 60 gaacgagaaa cgtaaaatga tataaatatc aatatattaa attagatttt gcataaaaaa 120 cagactacat aatactgtaa aacacaacat atgcagtcac tatgaatcaa ctacttagat 180 ggtattagtg acctgtaaca gactgcagtg gtcgaaaaaa aaagcccgca ctgtcaggtg 240 cgggcttttt tctgtgttaa gcttcgacga atttctgcca ttcatccgct tattatcact 300 tattcaggcg tagcaccagg cgtttaaggg caccaataac tgccttaaaa aaattacgcc 360 ccgccctgcc actcatcgca gtactgttgt aattcattaa gcattctgcc gacatggaag 420 ccatcacaga cggcatgatg aacctgaatc gccagcggca tcagcacctt gtcgccttgc 480 gtataatatt tgcccatggt gaaaacgggg gcgaagaagt tgtccatatt ggccacgttt 540 aaatcaaaac tggtgaaact cacccaggga ttggctgaga cgaaaaacat attctcaata 600 aaccctttag ggaaataggc caggttttca ccgtaacacg ccacatcttg cgaatatatg 660 tgtagaaact gccggaaatc gtcgtggtat tcactccaga gcgatgaaaa cgtttcagtt 720 tgctcatgga aaacggtgta acaagggtga acactatccc atatcaccag ctcaccgtct 780 ttcattgcca tacggaattc cggatgagca ttcatcaggc gggcaagaat gtgaataaag 840 gccggataaa acttgtgctt atttttcttt acggtcttta aaaaggccgt aatatccagc 900 tgaacggtct ggttataggt acattgagca actgactgaa atgcctcaaa atgttcttta 960 cgatgccatt gggatatatc aacggtggta tatccagtga tttttttctc cattttagct 1020 tccttagctc ctgaaaatct cggatccgat atctagctag agcgcccggt tgacgctgct 1080 agtgttacct agcgatttgt atcttactgc atgttacttc atgttgtcaa tacctgtttt 1140 tcgtgcgact tatcaggctg tctacttatc cggagatcca caggacgggt gtggtcgcca 1200 tgatcgcgta gtcgatagtg gctccaagta gcgaagcgag caggactggg cggcggccaa 1260 agcggtcgga cagtgctccg agaacgggtg cgcatagaaa ttgcatcaac gcatatagcg 1320 ctagcagcac gccatagtga ctggcgatgc tgtcggaatg gacgatatcc cgcaagaggc 1380 ccggcagtac cggcataacc aagcctatgc ctacagcatc cagggtgacg gtgccgagga 1440 tgacgatgag cgcattgtta gatttcatac acggtgcctg actgcgttag caatttaact 1500 gtgataaact accgcattaa agcttatcga tgataagctg tcaaacatga gaattcgaaa 1560 tcaaataatg attttatttt gactgatagt gacctgttcg ttgcaacaaa ttgataagca 1620 atgctttttt ataatgccaa cttagtataa aaaagcaggc ttcaagatct tcacctacca 1680 aacaatgccc ccctgcaaaa aataaattca tataaaaaac atacagataa ccatctgcgg 1740 tgataaatta tctctggcgg tgttgacata aataccactg gcggtgatac tgagcacatc 1800 agcaggacgc actgaccacc atgaaggtga cgctcttaaa aattaagccc tgaagaaggg 1860 cagcattcaa agcagaaggc tttggggtgt gtgatacgaa acgaagcatt ggccgtctag 1920 aaggaaacag gctatgactg atcaagctga aaaaaagcac tctgcatttt ggggtgttat 1980 ggttatagca ggtacagtaa ttggtggagg tatgtttgct ttacctgttg atcttgccgg 2040 tgcctggttt ttctggggtg cctttatcct tatcattgcc tggttttcaa tgcttcattc 2100 cgggttattg ttattagaag caaatttaaa ttatcccgtc ggctccagtt ttaacaccat 2160 caccaaagat ttaatcggta acacctggaa cattatcagc ggtattaccg ttgccttcgt 2220 tctctatatc ctcacttatg cctatatctc tgctaatggt gcgatcatta gtgaaacgat 2280 atcaatgaat ttgggttatc acgctaatcc acgtattgtc gggatctgca cagccatttt 2340 cgttgccagc gtattgtggt taagttcgtt agccgccagt cgtattacct cattgttcct 2400 cgggctgaag attatctcct ttgtgatcgt gtttggttct tttttcttcc aggtcgatta 2460 ctccattctg cgcgacgcca ccagctccac tgcgggaacg tcttacttcc cgtatatctt 2520 tatggctttg ccggtgtgtc tggcgtcatt tggtttccac ggcaatattc ccagcctgat 2580 tatttgctat ggaaaacgca aagataagtt aatcaaaagc gtggtatttg gttcgctgct 2640 ggcgctggtg atttatctct tctggctcta ttgcaccatg gggaatattc cgcgagaaag 2700 ctttaaggcg attatctcct caggcggcaa cgttgattcg ctggtgaaat cgttcctcgg 2760 caccaaacag cacggcatta tcgagttttg cctgctggtg ttctctaact tagctgttgc 2820 cagttcgttc tttggtgtca cgctggggtt gttcgattat ctggcggacc tgtttaagat 2880 tgataactcc cacggcgggc gtttcaaaac cgtgctgtta accttcctgc cacctgcgtt 2940 gttgtatctg atcttcccga acggctttat ttacgggatc ggcggtgccg ggctgtgcgc 3000 caccatctgg gcggtcatta ttcccgcagt gcttgcaatc aaagctcgca agaagtttcc 3060 caatcagatg ttcacggtct ggggcggcaa tcttattccg gcgattgtca ttctctttgg 3120 tataaccgtg attttgtgct ggttcggcaa cgtctttaac gtgttaccta aatttggcta 3180 a 3181

Claims

(a) L-트립토판을 세포내로 섭취하기 위한, Mtr 및 TnaB로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 계가 강화되도록 개질된 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli)로서, L-페닐알라닌을 생산할 수 있는 능력을 지닌 에스체리키아 콜라이를 배지에서 배양하고,

(b) 당해 배지로 부터 L-페닐알라닌을 채취함을 포함하여, L-페닐알라닌을 생산하는 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 계의 활성이,

(a) mtr 유전자 또는 tnaB 유전자의 복사체 수를 증가시키는 방법, 및

(b) mtr 유전자 또는 tnaB 유전자의 발현 조절 서열을 변형시키는 방법으로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 방법에 의해 증가되는 방법.
제6항에 있어서, mtr 유전자가,

(a) 서열번호 2에 제시된 단백질 서열을 암호화하는 DNA 서열 및

(b) 서열번호 1에 제시된 DNA 서열

로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 DNA 서열을 포함하면서, mtr 유전자가 Mtr 단백질의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 방법.
제6항에 있어서, tnaB 유전자가,

(a) 서열번호 4에 제시된 단백질 서열을 암호화하는 DNA 서열 및

(b) 서열번호 3에 제시된 DNA 서열

로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 DNA 서열을 포함하면서, tnaB 유전자가 TnaB 단백질의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 방법.
L-페닐알라닌을 생산할 수 있는 능력을 가지면서,

L-트립토판을 세포내로 섭취하기 위한, Mtr 및 TnaB로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 계가 강화되도록 개질된 에스체리키아 콜라이.
삭제
제9항에 있어서, Mtr 또는 TnaB의 활성이,

(a) mtr 유전자 또는 tnaB 유전자의 복사체 수를 증가시키는 방법 및

(b) mtr 유전자 또는 tnaB 유전자의 발현 조절 서열을 변형시키는 방법으로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 방법에 의해 증가되는 에스체리키아 콜라이.
제11항에 있어서, mtr 유전자가,

(a) 서열번호 2에 제시된 단백질 서열을 암호화하는 DNA 서열 및

(b) 서열번호 1에 제시된 DNA 서열

로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 DNA 서열을 포함하면서, mtr 유전자가 Mtr 단백질의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 에스체리키아 콜라이.
제11항에 있어서, tnaB 유전자가,

(a) 서열번호 4에 제시된 단백질 서열을 암호화하는 DNA 서열 및

(b) 서열번호 3에 제시된 DNA 서열

로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 DNA 서열을 포함하면서, tnaB 유전자가 TnaB 단백질의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 에스체리키아 콜라이.