KR20060101545A - 발효에 의한 ｌ-아미노산의 생산방법 - Google Patents

Abstract

L-트레오닌 또는 L-이소류신은, L-트레오닌 또는 L-이소류신을 생산하는 능력을 갖고, 발현이 이의 고유 프로모터에 의해 지시되고 감쇠가 해제되도록 적어도 리더 서열과 감쇠인자가 제거되어진 트레오닌 오페론을 갖는 에스케리키아 속에 속하는 세균을 배지에서 배양하고, 상기 배지로부터 L-트레오닌 또는 L-이소류신을 수거하여 생산된다.

L-트레오닌, L-이소류신, 트레오닌 오페론, 에스케리키아 속에 속하는 세균, 감쇠인자, 감쇠 관여 영역, 리더 서열, 감쇠의 해제

Description

발효에 의한 Ｌ-아미노산의 생산방법{Method for producing L-amino acid by fermentation}

본 발명은 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 세균을 사용하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 L-트레오닌 또는 L-이소류신의 생산방법에 관한 것이다. L-트레오닌 및 L-이소류신은 둘다 필수 아미노산이며, L-트레오닌은 각종 의료용 영양 제형의 성분 또는 동물 사료로서 사용된다. L-이소류신은 영양 제제와 같은 약물로서 유용할 뿐만 아니라, 사료 첨가제로서도 유용하다.

L-트레오닌 및 L-이소류신과 같은 L-아미노산은 L-아미노산을 생산하는 능력을 가진 코리네형 세균 및 에스케리키아 속에 속하는 세균과 같은 아미노산 생산 세균을 사용하여 발효시킴으로써 산업적으로 생산된다. 이러한 L-아미노산의 생산성을 개선시키기 위해, 천연으로부터 분리된 균주 또는 이의 인공 돌연변이주, L-아미노산 생합성 효소 활성을 증가시킨 재조합 균주 등을 포함하는 L-아미노산 생산 세균이 사용되고 있다.

에스케리키아 세균의 돌연변이주를 사용한 L-트레오닌의 생산 방법은 보고되었으며, 6-디메틸아미노푸린-내성 균주[참조: 일본 공개특허공보 제5-304969호]를 사용한 방법 및 보렐리딘-내성 균주를 사용한 방법[참조: 국제특허공보 제WO98/04715호]를 포함한다. 에스케리키아 세균의 재조합 균주를 사용한 L-트레오닌의 생산 방법은 보고되었으며, 트레오닌 오페론이 플라스미드로 증폭된 균주를 사용한 방법[참조: 일본 공개특허공보 제05-227977] 및 포스포에놀피루베이트 카복실라제 유전자 또는 아스파르타제 유전자가 플라스미드로 증폭된 균주를 사용한 방법[참조: 미국 특허원 제2002/0110876호]을 포함한다.

에스케리키아 세균의 돌연변이주를 사용한 L-이소류신의 생산 방법은 보고되었으며, 6-디메틸아미노푸린-내성 균주를 사용한 방법[참조: 일본 공개특허공보 제5-304969], L-이소류신 하이드록사메이트-내성 균주를 사용한 방법[참조: 일본 공개특허공보 제5-130882호] 및 티아이소류신-내성 균주를 사용한 방법[참조: 일본 공개특허공보 제5-130882호]을 포함한다. 재조합 에스케리키아 세균을 사용한 L-이소류신의 생산 방법은 보고되었으며, 트레오닌 데아미나제 유전자 또는 트레오닌 아세토하이드록시산신타제 유전자가 플라스미드로 증폭된 균주를 사용한 방법을 포함한다[참조: 일본 공개특허공보 제2-458호, 유럽 특허 제0593729호].

L-트레오닌 또는 L-이소류신의 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자를 발현을 증폭시키는, 에스케리키아 속에 속하는 세균을 사용하는 L-트레오닌 또는 L-이소류신의 생산 방법이 보고되었다.

에스케리키아 콜라이에서 L-트레오닌의 생합성에 관여하는 효소를 암호화하 는 유전자는 보고되었으며, 아스파르토키나제 III 유전자(lysC), 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제 유전자(asd), 아스파르토키나제 I-호모세린 데하이드로게나제 유전자(thrA), 호모세린 키나제 유전자(thrB), 트레오닌 신타제 유전자(thrC) 등을 포함한다.

에스케리키아 콜라이의 트레오닌-생합성 경로의 일부분인 thrABC 서열은 트레오닌 오페론이라 불리는 오페론을 형성한다.

트레오닌 오페론의 발현은 "감쇠"라 불리는, L-트레오닌과 L-이소류신의 세포내 농도에 의한 전사 감소에 의해 조절된다. 또한, 특히 에스케리키아 콜라이에서 트레오닌 오페론의 발현은 트레오닌 프로모터와 트레오닌 오페론의 구조 유전자인 thrA 사이에 위치하는 조절 서열을 통해서 조절된다[참조: Lynn S.P. et al., "Journal of Molecular Biology (J. Mol. Biol)" Academic Press, vol. 183 (1985) pp.529-541]. 게다가, 이러한 조절 서열이 수십개의 뉴클레오타이드를 포함하는 리더 서열, 및 프로모터 영역과 개시 코돈 사이에 위치하는 감쇠인자(attenuator)를 함유한다는 것이 또한 보고되었다.

많은 트레오닌 및 이소류신 코돈이 리더 서열에 포함되어 있으며, 트레오닌 또는 이소류신이 배지 중에 존재하는 경우, 이러한 리더 서열의 해독은 원활하게 진행된다. 이로 인해서 감쇠인자는 3차원 구조를 형성하여 전사를 감소시키고 따라서 트레오닌 생합성 경로의 유전자의 발현을 감소시킨다. 트레오닌 및 이소류신이 배지중에 존재하지 않는 경우, 리더 서열상에서의 리보솜의 이동은 둔화되고, 트레오닌 생합성 경로 유전자의 발현은 mRNA의 3차원 구조의 변화로 인해서 증가된 다.

고 농도의 이소류신 및 트레오닌의 존재하에 L-트레오닌의 효율적 생산은 감쇠를 해제시켜 트레오닌 오페론이 고 발현되도록 함으로써 시도된 바 있다.

트레오닌 오페론은 감쇠에 의해 다소 조절되며, 이의 발현은 감쇠인자가 결여된 트레오닌 오페론이 당해 오페론이 고 발현되도록 하는 강력한 이종 프로모터와 연결되는 경우 증가된다는 것이 보고되었다. 또한, 이러한 트레오닌 오페론을 함유하는 세균은 L-트레오닌 생산능이 증가된 것으로 보고되었다[참조:일본 공개특허공보 제05-227977]. 게다가, 보렐리딘-내성을 세균에게 부여하면, 트레오니닐-tRNA 신타제 활성이 변화되고 이로써 트레오닌 오페론이 감쇠에 의해 다소 조절된다는 것이 기술되었다. 따라서, L-트레오닌 생산능이 개선될 수 있다[참조: 국제 특허 공보 제WO98/04715호].

그러나, 단지 감쇠인자만을 제거하는 경우, L-이소류신 또는 L-트레오닌을 배지에 부가함으로써 전사의 감소가 일어나고, 감쇠가 해제되었음에도 불구하고 트레오닌 오페론의 발현은 여전히 불충분하다. 따라서, 배지 중의 L-트레오닌 및 L-이소류신의 농도가 증가된 L-트레오닌 및 L-이소류신의 발효시에, 트레오닌 오페론의 발현을 더욱 증가시키는 것이 바람직하다. 환언하면, 이종 프로모터를 사용하여 트레오닌 오페론의 발현을 지시하는 경우, 발현은 프로모터와 전사 개시 부위 사이의 거리, SD 서열과 개시 코돈 사이의 거리 및 개시 코돈의 서열과 같은 인자들에 의해 현저하게 영향을 받는다. 따라서, 최대의 안정한 발현을 수득하기가 곤란하다. 따라서, 안정한 L-이소류신- 또는 L-트레오닌-생산능을 갖는 균주의 제조 가 오랫동안 요망되어 왔다[참조: Dalboge H. et al., "DNA", New York Ny Mary Ann Liebert, July and August, 1988, Vol. 7, No. 6, pp.399-405].

발명의 개요

본 발명의 목적은 에스케리키아 세균의 트레오닌 생합성 경로를 증강시켜 L-아미노산, 특히 L-트레오닌 및 L-이소류신을 생산하는 에스케리키아 속에 속하는 세균의 능력을 개선시키는 것이다.

본 발명의 발명자들은 상기한 목적을 달성하기 위해 예의 연구하였으며, 그 결과 배지 중의 이소류신 및 트레오닌에 의해 매개되는 감쇠에 의해 조절되지 않는 트레오닌 오페론을 작제하는데 성공하였다. 본 발명의 발명자들은 또한 이러한 트레오닌 오페론을 갖는 균주는 발효에 의한 L-트레오닌 또는 L-이소류신의 생산에 있어 보다 우수한 특성을 나타낸다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 상기 오페론의 발현이 고유 프로모터에 의해 지시되고 감쇠에 의한 조절이 해제되도록 적어도 리더 서열 및 감쇠인자가 상기 오페론으로부터 제거되어진, L-트레오닌 또는 L-이소류신을 생산하는 능력을 갖는 에스케리키아 속에 속하는 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 상기 트레오닌 오페론이 플라스미드상에 존재하는 상기한 바와 같은 에스케리키아 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 트레오닌 오페론이 염색체상에 존재하는 상기한 바와같은 에스케리키아 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 L-이소류신을 생산하는 능력을 지니고 L-이소류신 생합성 효소의 활성이 증강된 상기한 바와같은 에스케리키아 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 감쇠 관여 영역, 고유 프로모터 및 구조 유전자 thrABC를 포함하고 적어도 리더 서열 및 감쇠인자가 상기 감쇠 관여 영역으로부터 제거되어진 트레오닌 오페론을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 적어도 뉴클레오타이드 번호 188 내지 310에 상응하는 서열이 제거되어진 서열번호 1에 제시한 서열을 포함하는 상기한 바와 같은 트레오닌 오페론을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 적어도 뉴클레오타이드 번호 168 내지 310에 상응하는 서열이 제거되어진 서열번호 1에 제시한 서열을 포함하는 상기한 바와 같은 트레오닌 오페론을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 적어도 뉴클레오타이드 번호 148 내지 310에 상응하는 서열이 제거되어진 서열번호 1에 제시한 서열을 포함하는 상기한 바와 같은 트레오닌 오페론을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 상기한 바와 같은 세균을 배지에서 배양하고, 상기 배지로부터 축적된 L-트레오닌 또는 L-이소류신을 수거함을 포함하는, L-트레오닌 또는 L-이소류신의 생산방법을 제공하는 것이다.

도 1은 감쇠인자가 결여된 트레오닌 오페론의 증폭을 위한 플라스미드의 작제를 도시한 것이다.

도 2는 감쇠 관여 영역이 결여된 트레오닌 오페론의 증폭을 위한 플라스미드의 작제를 도시한 것이다.

도 3은 감쇠 관여 영역이 결여된 트레오닌 오페론을 염색체내로 도입하기 위한 온도 감수성 플라스미드의 작제를 도시한 것이다.

하기에서 본 발명을 상세히 설명할 것이다.

<1> 본 발명의 에스케리키아 세균

본 발명의 세균은 에스케리키아 속에 속하고 L-트레오닌 또는 L-이소류신을 생산하는 능력을 가지며 발현이 이러한 트레오닌 오페론의 고유 프로모터에 의해 조절되도록 변형된 트레오닌 오페론을 갖는 세균이다. 이러한 트레오닌 오페론에는 감쇠에 의한 조절이 해제되도록 이로부터 적어도 리더 서열과 감쇠인자가 제거되었다. 하기에서 이러한 트레오닌 오페론은 "본 발명의 트레오닌 오페론"으로 지칭된다. 본 발명의 세균은 L-트레오닌-생산능 및 L-이소류신-생산능을 둘다 가질 수 있다.

본 발명의 세균은 본 발명의 트레오닌 오페론을 L-트레오닌 또는 L-이소류신 생산능을 갖는 에스케리키아 속에 속하는 세균에 도입하거나, L-트레오닌 또는 L-이소류신 생산능을 본 발명의 트레오닌 오페론을 갖는 세균에게 부여함으로써 수득할 수 있다. 또한, 본 발명의 세균은 본 발명의 트레오닌 오페론을 갖도록 변형되었기 때문에 L-트레오닌 또는 L-이소류신-생산능을 갖는 세균일 수도 있다.

본 발명의 세균을 수득하기 위해 사용된 에스케리키아 속에 속하는 세균의 모 균주가 특별히 한정되지 않지만, 니드하르트(Neidhardt) 등에 의해 기술된 균주[참조: Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1029, 표 1]를 사용할 수 있다. 이러한 균주에는 예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)가 포함된다. 에스케리키아 콜라이의 구체적 예에는 원형 야생형 균주인 K12로부터 유래된 에스케리키아 콜라이 W3110 균주(ATCC 27325) 및 에스케리키아 콜라이 MG1655(ATCC 47076)가 포함된다.

이들 균주는 예를 들면, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(주소: 미국 매릴랜드주 20852 록빌 파크런 드라이브 12301)으로부터 입수할 수 있다. 각각의 균주는 고유한 등록 번호가 부여되었으며, 이는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션의 카탈로그에 열거되어 있다. 이러한 등록번호를 이용하여 균주를 요청할 수 있다.

<1>-1. L-트레오닌 또는 L-이소류신-생산능의 부여

하기에서 에스케리키아 속에 속하는 세균에 L-트레오닌 또는 L-이소류신 생산능을 부여하는 방법을 기술할 것이다. 본 발명에서, "L-트레오닌-생산능(L-트레오닌을 생산하는 능력)"이란 용어는 본 발명의 세균을 배지에서 배양하는 경우 배지중에서 L-트레오닌을 생산하고 축적하는 본 발명의 세균의 능력을 의미한다. 본 발명에서, "L-이소류신-생산능(L-이소류신을 생산하는 능력)"이란 용어는 본 발명의 세균을 배지에서 배양하는 경우 배지중에 L-이소류신을 생산하고 축적하는 본 발명의 세균의 능력을 의미한다.

L-트레오닌 또는 L-이소류신-생산능을 부여하기 위해, L-트레오닌 또는 L-이소류신을 생산하는, 에스케리키아 속에 속하는 세균 또는 코리네형 세균을 생육하는데 통상적으로 사용되는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, L-트레오닌 또는 L-이소류신을 생산하는 능력을 갖는, 영양요구성 돌연변이주, 유사체-내성 균주 또는 대사 조절 돌연변이주를 수득하는 방법 및 L-트레오닌 생합성 효소 또는 L-이소류신 생합성 효소의 활성이 증강된 재조합 균주를 제조하는 방법을 사용할 수 있다. 이들 방법을 사용하여 L-트레오닌- 또는 L-이소류신-생산 세균을 생육하는 경우, 단독의 또는 다수의 영양요구성, 유사체 내성 및 대사 조절 돌연변이 특성을 부여할 수 있다.

재조합 균주를 제조시, 단일 또는 다수의 L-트레오닌 또는 이소류신-생합성 효소의 활성을 증강시킬 수 있다. 추가로, 영양요구성, 유사체 내성 및 대사 조절 돌연변이 특성을 부여하는 방법은 L-트레오닌 또는 L-이소류신-생합성 효소의 활성을 증강시키는 방법과 병용될 수 있다.

L-트레오닌 또는 L-이소류신 생합성 효소의 활성을 증강시켜 L-트레오닌 또는 L-이소류신 생산능을 에스케리키아 속에 속하는 세균에게 부여하는 방법은 하기에 예시할 것이다. 효소 활성의 증강은 예를 들어, 당해 효소를 암호화하는 유전자에 돌연변이를 도입하여 당해 효소의 세포내 활성을 증가시키거나, 유전자 재조합 기법을 사용하여 달성할 수 있다.

L-트레오닌 생합성 효소를 암호화하는 유전자로는 아스파르토키나제 III 유전자(lysC), 아스파르테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자(asd) 등이 포함된다. 각각의 효소를 암호화하는 유전자의 명칭은 효소 명칭 다음에 괄호안에 나타낸다. 이들 유전자 중 2가지 종류 이상을 에스케리키아 속에 속하는 세균에 도입시킬 수 있다. L-트레오닌 생합성 효소를 암호화하는 이들 유전자는 트레오닌 분해 경로가 억제된 에스케리키아 속에 속하는 세균에 도입시킬 수 있다. 트레오닌 분해 경로가 억제된 세균의 예로는 트레오닌 데하이드로게나제 활성이 결핍된 균주 TDH6가 포함된다[참조: 일본 공개특허공보 제2001-346578호].

L-이소류신-생합성 효소를 암호화하는 유전자의 예로는 트레오닌 데아미나제 유전자(ilvA), 케톨산 리덕토이소머라제 유전자(ilvC), 아세토락테이트 신타제 유전자(ilvI), 디하이드록시산 탈수효소 유전자(dad) 및 아미노트랜스퍼라제 유전자(ilvE)가 포함된다. 각각의 효소를 암호화하는 유전자의 명칭은 효소 명칭 다음에 괄호안에 나타낸다. 이들 유전자 중 2가지 종류 이상을 에스케리키아 속에 속하는 세균에 도입시킬 수 있다. 상기한 ilvA 및 ilvE 유전자는 ilvGMEDA 오페론내에 함유되어 있어[참조: 일본 공개특허공보 제2002-051787호], 이들 유전자를 ilvGMEDA 오페론의 형태로 도입시킬 수 있다.

게다가, L-트레오닌은 L-이소류신에 대한 전구체이다. 따라서, L-이소류신 생산능을 증가시키기 위해서, L-트레오닌의 공급을 증가시키는 것이 바람직하다. 따라서, L-이소류신-생산능은 L-트레오닌 생합성 경로 및 L-이소류신 생합성 경로 둘다를 증강시키는 것 뿐만 아니라, L-이소류신으로의 생합성 경로를 단독으로 증강시킴으로써 증가시킬 수 있다. 이러한 방식으로 L-트레오닌-생산능이 부여된 세균의 예는 일본 공개특허공보 제2002-51787호 및 제9-121872호에 기술되어 있다.

예를 들어, 에스케리키아 속에 속하는 세균 내에서 자율적으로 복제가능한 플라스미드를 사용하여 상기한 유전자를 증폭시켜, 상기한 유전자에 의해 암호화되는 어떠한 효소의 활성이라도 증강시킬 수 있다. 또한, 생합성 효소를 암호화하는 유전자를 염색체 내로 도입시킬 수도 있다. 또한, 활성은 당해 유전자에 의해 암호화되는 효소의 세포내 활성을 증강시키는 돌연변이를 함유하는 유전자를 세균내로 도입시킴으로써 증강시킬 수도 있다. 이러한 돌연변이의 예에는 당해 유전자의 전사량을 증가시키는 프로모터 서열의 돌연변이 및 당해 유전자에 의해 암호화되는 효소의 특이적 활성을 증가시키는 암호화 영역 돌연변이가 포함된다.

유전자 발현은 또한 염색체 DNA 또는 플라스미드 상의 프로모터와 같은 발현 조절 서열을 보다 강력한 발현 조절 서열로 대체시킴으로써 증강시킬 수 있다[참조: 국제특허공보 제WO 00/18935호]. 이러한 프로모터의 예로는 lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터 및 람다 파지 유래의 P_R 프로모터 등이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 프로모터의 변형 방법은 유전자의 카피수를 증가시키는 방법과 병용될 수 있다.

본 발명에 사용될 수 있는, L-트레오닌 또는 L-이소류신-생산능이 부여된 에스케리키아 속에 속하는 세균의 구체적 예는 하기에 예시될 것이다. 그러나, 당해 세균은 이들 예에만 제한되는 것이 아니며, L-트레오닌 또는 L-이소류신-생산능을 갖는 어떠한 세균도 포함한다.

L-트레오닌-생산능이 부여된 세균의 예로는 6-디메틸아미노 푸린-내성 균주[참조: 일본 공개특허공보 제5-304969호], 트레오닌-생합성 효소의 과생산을 유발하는 트레오닌-생합성 효소의 돌연변이된 유전자를 플라스미드로 증폭시킨 균주[참조: 일본 특허공보 제1-29559호 및 일본 공개특허공보 제5-2227977호] 및 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 유전자 및 니코틴아미드 뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제를 암호화하는 유전자가 증폭된 균주[참조: 일본 공개특허공보 제2002-51787호]가 포함된다.

또한, 에스케리키아 콜라이 VKPM B-3996(미국 특허 제5,175,107호)도 사용될 수 있다. 에스케리키아 콜라이 VKPM B-3996 균주는 러시안 내셔날 콜렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)(VKPM GNII 제네티카 주소: 러시아 113545 모스크바 1 도로즈흐니 프로에즈드 1)에 1987년 4월 7일자로 기탁되었으며 수탁번호 제VKPM B-3996호를 부여받았다. VKPM B-3996 균주는 스트렙토마이신-내성 마커 유전자를 갖는 플라스미드 pAYC32[참조: Chistoserdov, A. Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 1986, 16, 161-167]내로 트레오닌 오페론의 유전자(thrABC)를 도입함으로써 수득된 플라스미드 pVIC40[참조; 국제 특허공보 제WO 90/04636호]을 내포하고 있다. pVIC40에서, thrA에 의해 암호화되는 아스파르토키나제 I-호모세린 데하이드로게나제 I의 L-트레오닌-매개 피드백 억제는 해제되어 있다.

L-이소류신-생산능이 부여된 에스케리키아 속에 속하는 세균의 예로는 6-디메틸아미노푸린-내성 균주[참조: 일본 공개특허공보 제5-304969호], L-이소류신 하이드록사메이트-내성 균주[참조: 일본 공개특허공보 제5-130882호], 티아이소류신-내성 균주[참조: 일본 공개특허공보 제5-130882호], DL-에티오닌-내성 균주[참조: 일본 공개특허공보 제5-130882호], 아르기닌 하이드록사메이트-내성 균주[참조: 일본 공개특허공보 제5-130882호], 및 L-이소류신-생합성 효소인 트레오닌 데아미나제 또는 아세토하이드록시산 신타제를 암호화하는 유전자를 플라스미드로 증폭시킨 균주[참조: 일본 공개특허공보 제2-458호, 제2-42988호, 제8-47397호]가 포함된다.

<1>-2. 본 발명의 트레오닌 오페론

트레오닌 오페론의 전사는 고 농도의 이소류신 또는 트레오닌의 존재하에 "감쇠"라 불리는 전사적 조절에 의해 감소되는 것으로 공지되어 있다[참조: J. Mol. Biol. (1985) 183, 529-541]. 이러한 감쇠의 해제는 이들 아미노산의 생산 증가를 위해 중요하다.

트레오닌 오페론은 구조 유전자 thrABC, 당해 구조 유전자의 상부에 있는 고유 프로모터, 및 당해 구조 유전자 thrABC의 발현을 조절하는 리더 서열과 "감쇠인자"라 불리는 특정 서열을 포함하는 감쇠 관여 영역을 함유한다.

리더 서열의 예로는 서열번호 6에 제시한 서열이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 상기 서열은 서열번호 2에 제시한 21개의 아미노산 잔기로 이루어진 리더 펩타이드를 암호화하고, 8개의 트레오닌 코돈 및 4개의 이소류신 코돈을 암호화하는 영역 및 종결 코돈을 함유한 영역으로 이루어져 있다.

감쇠인자의 예로는 서열번호 7에 제시한 서열을 갖는 영역이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 상기 서열은 서로 상보적이여서 DNA 분자내에서 하이브리드화할 수 있는 2개의 서열을 함유한다[참조: J. Mol. Biol. (1985) 183, 529-541]. 당해 감쇠인자는 전사를 종결하는 종결인자의 구조와 유사한 구조를 갖는다. 감쇠인자내 상보적 서열들은 서로 하이브리드화하여 "스템 루프(stem loop)"라 불리는 3차원 구조를 형성하며, 전사는 이 영역에서 종결된다.

고 농도의 트레오닌 및 이소류신의 존재하에 감쇠에 의한 전사의 감소는 다음 기작에 따라 일어난다. 이소류신 및 트레오닌의 농도가 높은 경우, 배양 배지 중의 트레오니닐-tRNA 및 이소류실-tRNA의 농도가 증가한다. 따라서, tRNA-아미노산 복합체가 많은 트레오닌 및 이소류신 코돈을 암호화하는 리더 서열의 전사에 충분한 양으로 세포에 존재하게 된다. 따라서, 상기 리더 서열은 원활하게 전사되고 해독되고, 해독은 이 리더 서열 자체의 종결 코돈에서 종결된다. 이어서, 감쇠인자내 상보적 서열들이 서로 하이브리드화하여 스템 루프 구조를 형성하고, 스템 루프 구조는 전사를 종결하는 작용을 한다. 따라서, 전사가 트레오닌 오페론의 구조 유전자까지 진행하기 어렵게 되어 트레오닌 생합성 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 감소된다.

환언하면, 트레오닌 및 이소류신의 세포내 농도가 낮은 경우, 배지 중의 트레오니닐-tRNA 및 이소류실-tRNA의 세포내 농도가 감소한다. 따라서, tRNA-아미노산 복합체는 리더 서열의 전사에 충분한 양으로 세포에 존재하지 않게 되고, 따라서 리보솜은 리더 서열내 트레오닌 코돈 또는 이소류신 코돈에서 중지한다. 그 결과, 리더 서열이 원활하게 해독되지 않고, 리더 펩타이드의 암호화 영역내 종결 코돈의 바로 상부에 있는 영역 및 감쇠인자 바로 상부에 있는 영역이 쌍을 이루어 당해 감쇠인자내 상보적 서열들의 하이브리드화를 억제한다. 따라서, 종결인자가 형성될 수 없고, 전사는 종결되지 않는다. 따라서, 전사는 당해 오페론의 thrABC 구조 유전자까지 진행됨으로써 트레오닌 오페론의 구조 유전자가 최대로 전사되고 트레오닌 생합성 효소가 최대로 생산된다.

L-트레오닌 및 L-이소류신의 생산이 증가되면, L-트레오닌 및 L-이소류신의 세포내 농도는 높아지고, 감쇠에 의한 조절은 트레오닌 오페론의 구조 유전자의 발현을 감소시키는 작용을 한다. 그 결과, 트레오닌 생합성 효소의 활성은 감소되고 따라서 L-트레오닌 또는 L-이소류신을 생산하는 능력은 최대로 발휘되지 못할 수 있다.

이러한 감쇠에 의한 조절이 해제될 수 있는 경우, 트레오닌 오페론은 높은 수준으로 발현될 수 있을 것이다. 또한, L-트레오닌 또는 L-이소류신을 생산하는 능력을 보다 개선시키기 위해 감쇠의 해제는 상기한 바와 같은 L-트레오닌 또는 L-이소류신-생산능의 증강과 병용될 수 있다.

본 발명의 트레오닌 오페론은 "감쇠 관여 영역, 당해 트레오닌 오페론에 고유한 프로모터 및 구조 유전자 thrABC를 포함하고 적어도 리더 서열 및 감쇠인자가 상기 감쇠 관여 영역으로부터 제거되어진 트레오닌 오페론"이다.

본 발명에서 사용되는 "감쇠"란 용어는 트레오닌 및 이소류신의 세포내 농도의 증가로 인한 트레오닌 오페론 구조 유전자의 전사 감소를 의미한다. "감쇠인자"란, 분자내에서 상보적 서열들 간에 스템 루프 구조를 형성하여 구조 유전자의 전사를 종결시킬 수 있는 서열을 갖는 영역을 의미한다. 에스케리키아 속에 속하는 세균으로부터 유래된 이러한 서열의 예로는 서열번호 7의 서열이 포함된다. "리더 서열"은 많은 수의 이소류신 코돈과 트레오닌 코돈을 함유하는 서열을 지칭하고, 에스케리키아 속에 속하는 세균으로부터 유래된 이러한 서열의 예로는 서열번호 2에 제시한 4개의 이소류신 잔기와 8개의 트레오닌 잔기를 함유한 리더 서열을 암호화하는 서열번호 6에 제시한 서열이 포함된다[참조: J. Mol. Biol. (1985) 183, 529-541]. "고유 프로모터"는 트레오닌 오페론 자체의 프로모터를 지칭하며, 에스케리키아 속에 속하는 세균으로부터 유래된 이러한 프로모터의 예로는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 번호 71 내지 99의 서열 및/또는 뉴클레오타이드 번호 104 내지 132의 서열을 갖는 프로모터가 포함된다. 또한, "thrABC 구조 유전자"란 구는 아스파르토키나제 I-호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 구조 유전자(thrA), 호모세린 키나제를 암호화하는 구조 유전자(thrB) 및 트레오닌 신타제를 암호화하는 구조 유전자(thrC)를 함유하는 다시스트론(polycistron)을 의미한다. 에스케리키아 속에 속하는 세균으로부터 유래된 thrABC 구조 유전자의 예로는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 번호 337 내지 5020의 서열이 포함된다. "thrABC 구조 유전자"는 이러한 유전자가 아스파르토키나제 I-호모세린 데하이드로게나제, 호모세린 키나제 및 트레오닌 신타제의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 상기한 바와 같은 pVIC40에 함유된 thrABC 유전자와 같이, 당해 thrABC 구조 유전자는 L-트레오닌-매개 피드백 억제가 제거되도록 변형시킬 수 있다.

본 발명에서, "감쇠 관여 영역"이란 구는 프로모터와 thrA 개시 코돈 사이에 위치하고 적어도 리더 서열과 감쇠인자를 함유하는 영역을 의미한다. 이는 또한 "감쇠 영역"으로서도 지칭되며, 에스케리키아 속에 속하는 세균으로부터 유래된 이러한 영역의 예로는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 번호 148 내지 310을 갖는 영역이 포함된다[참조: J. Mol. Biol. (1985) 183, 529-541].

본 발명에서, "감쇠에 의한 조절이 해제된다"란 구는 트레오닌 오페론으로부터 적어도 리더 서열과 감쇠인자가 제거됨으로 인해서 감쇠인자가 불안정해져서 스템 루프 구조가 형성되고, 따라서 고 농도의 이소류신 또는 트레오닌의 존재하에서의 트레오닌 오페론의 구조 유전자의 발현이 야생형 균주 또는 비-돌연변이 균주와 비교해 증가됨을 의미한다.

게다가, "감쇠 관여 영역으로부터 적어도 리더 서열과 감쇠인자가 제거되어진 트레오닌 오페론"이란 구는 트레오닌 오페론이 적어도 리더 서열과 감쇠인자가 결여된 서열을 갖는 것을 의미한다. 감쇠가 해제되는 한, 당해 서열은 리더 서열의 상부에 있는 서열 및/또는 리더 서열과 감쇠인자 사이의 서열이 또한 결여된 서열일 수 있다. 예를 들어, 리더 서열, 감쇠인자, 리더 서열과 감쇠인자 사이의 서열 및 리더 서열의 5' 부위(상부)에 있는 서열이 제거될 수 있다. 리더 서열과 감쇠인자 사이의 서열의 예로는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 번호 256 내지 272의 서열 등이 포함된다. 리더 서열의 5' 부위에 있는 서열의 예로는 서열번호 1의 168번 내지 189번 뉴클레오타이드의 서열, 서열번호 1의 148번 내지 189번 뉴클레오타이드의 서열 등이 포함된다. 감쇠가 해제되는 한, 이들 서열의 5' 부위에 있는 서열이 추가 제거될 수 있다.

본 발명의 "트레오닌 오페론"으로서는 에스케리키아 속에 속하는 세균으로부터 유래된 트레오닌 오페론을 변형시켜 수득된 트레오닌 오페론이 바람직하다. 본 발명의 트레오닌 오페론의 예로는 적어도 서열번호 6 및 서열번호 7의 서열이 결실되어진 서열번호 1의 서열을 갖는 트레오닌 오페론 및 이의 상동체가 포함된다. 구체적으로는, 적어도 뉴클레오타이드 번호 188 내지 310의 서열이 결실되어진 서열번호 1의 서열이 바람직하고; 적어도 뉴클레오타이드 번호 168 내지 310의 서열이 결실되어진 서열번호 1의 서열이 보다 바람직하고; 적어도 뉴클레오타이드 번호 148 내지 310의 서열이 결실되어진 서열번호 1의 서열이 특히 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 트레오닌 오페론의 상동체는, 당해 트레오닌 오페론이 감쇠에 의해 조절되지 않고 효소적으로 활성인 thrA, B 및 C 단백질을 발현하는 한, 적어도 서열번호 6 및 서열번호 7의 서열이 결실되어진 서열번호 1의 하나 또는 수개의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 서열을 갖는 트레오닌 오페론일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "수개"는 2개 내지 50개, 바람직하게는 2개 내지 10개, 보다 바람직하게는 2개 내지 5개를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 트레오닌 오페론의 상동체는, 당해 트레오닌 오페론이 감쇠에 의해 조절되지 않고 효소적으로 활성인 ThrA, B 및 C 단백질을 발현하는 한, 적어도 서열번호 6 및 서열번호 7의 서열이 결실되어진 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건하에 하이브리드화할 수 있는 트레오닌 오페론일 수도 있다. 엄격한 조건의 예로는 예를 들어, 하이브리드화 후에 60℃에서 1x SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1x SSC 및 0.1% SDS의 염 농도에서 1회, 바람직하게는 2회 또는 3회의 세척을 포함한다.

또한, 상기한 서열은 결실된 영역에서는 리더서열 또는 감쇠인자로서 작용할 수 없는 서열을 함유할 수 있다. 리더서열 또는 감쇠인자로서 작용할 수 없는 서열의 예로는 트레오닌 코돈 또는 이소류신 코돈의 모두 또는 일부분이 다른 아미노산의 코돈 또는 종결 코돈으로 대체된 리더 서열, 스템 루프 구조를 형성하지 못하도록 변형된 감쇠인자 등이 포함된다.

본 발명에서, "트레오닌 오페론의 구조 유전자의 발현이 증가된다"란 구는 구조 유전자의 mRNA의 전사가 감쇠 해제로 인해서 증가되고 이로써 해독된 thrABC 단백질의 양이 증가됨을 의미한다. 본 발명에서, "트레오닌 오페론에 의해 암호화되는 트레오닌 생합성 효소의 특이적 활성이 증가된다"란 구는 트레오닌 오페론의 구조 유전자의 발현이 증가됨으로 인해서 당해 구조 유전자, 즉 thrABC 유전자에 의해 암호화되는 아스파르토키나제 I-호모세린 데하이드로게나제(thrA), 호모세린 키나제(thrB) 및 트레오닌 신타제(thrC)의 특이적 활성이 야생형 균주 또는 모 균주와 비교하여 증가됨을 의미한다. 비교용 균주로서 사용되는 에스케리키아 콜라이의 야생형 균주의 예로는 스케리키아 콜라이 W3110(ATCC 27325), MG1655 (ATCC 47076)가 포함된다.

상기한 바와 같은 본 발명의 트레오닌 오페론을 함유하는 에스케리키아 속에 속하는 세균은 부위-지시된 돌연변이유발법 등에 의해 "적어도 리더 서열과 감쇠인자가 제거된 감쇠 관여 영역"을 함유하는 DNA를 제조하고, 수득된 DNA를 본원에서 기술하는 방법에 따라서 염색체상 트레오닌 오페론의 감쇠 관여 영역에 도입시킴으로써 수득할 수 있다. 또한, 이러한 세균은 에스케리키아 속에 속하는 세균내에서 본 발명의 트레오닌 오페론을 지닌 벡터 DNA를 증폭시켜 수득할 수도 있다. 본 목적에 유용한 벡터 DNA로는 본원에서 기술한 바와 같은 에스케리키아 속에 속하는 세균에서 자율 복제할 수 있는 플라스미드가 포함된다. 결실을 위한 돌연변이의 도입은 예를 들어, 시판되는 유전자 돌연변이유발 키트, 제한 효소, PCR 등을 조합하여 사용함으로써 달성할 수 있다.

트레오닌 오페론의 감쇠 관여 영역은 또한, L-트레오닌 또는 L-이소류신을 생산하는 능력을 갖는 에스케리키아 속에 속하는 세균을 자외선 자외선 조사, X-선 조사, 방사선 노출 또는 N-메틸-N'-니트로소구아니딘(NTG) 또는 EMS(에틸 메탄설포네이트)와 같은 돌연변이유발제 처리와 같은 돌연변이유발 처리에 적용하고, 감쇠가 해제된 세균을 선별함으로써 변형시킬 수 있다.

본 발명의 세균에서 감쇠가 해제됨으로 인한 트레오닌 오페론 구조 유전자의 발현 증가는 고 농도의 L-트레오닌 또는 L-이소류신의 존재하에 배양된 세균내에서 thrABC 유전자에 의해 암호화되는 트레오닌 생합성 효소 하나 이상의 효소 활성을 측정하여 확인할 수 있다. 이러한 과정에서, L-트레오닌 및 L-이소류신-고갈된 배지에서 배양된 본 발명의 세균의 효소 활성을 측정하여 비교하는 것이 바람직한데, 그 이유는 이러한 환경에서는 감쇠가 일어나지 않기 때문이다.

호모세린 데하이드로게나제의 효소 활성은 문헌[참조: Truffa-Bachi P., Le Bras G., Cohen G.N., Biochem. Biophys. Acta., 128:450 (1966)]에 기술된 방법을 사용하여 측정할 수 있고, 호모세린 키나제 및 트레오닌 신타제의 효소 활성은 문헌[참조: Parsot C., EMBO J. 1986 Nov., 5(11):3013-9]에 기술된 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 또한. 세포 단백질은 예를 들어, 표준으로서 소 혈청 알부민을 사용하여 단백질 분석법(Bio-Rad)으로 정량할 수 있다.

본 발명의 세균을 호모세린 데하이드로게나제(이하, HD라 지칭함) 활성 측면에서 평가하는 경우, 예를 들어, 고 농도의 트레오닌 또는 이소류신의 존재하에 25 nmol/분/세포 단백질 mg 이상의 HD 활성을 나타내는 세균, 고 농도의 트레오닌 또는 이소류신의 존재하에 야생형 세균보다 2배 내지 3배 높은 HD 활성을 나타내는 세균, 또는 고 농도의 트레오닌 또는 이소류신의 존재하에서 배양하는 경우, 트레오닌 또는 이소류신의 부재하에 배양한 동일한 세균의 HD 활성의 1/3 이상의 HD 활성을 나타내는 세균이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 세균은 이러한 세균들로 제한되지 않는다. 당해 세균을 고 농도의 트레오닌 또는 이소류신의 존재하에 배양하는 경우, L-이소류신 또는 L-트레오닌을 바람직하게는 50mg/L 이상의 농도로 첨가한다.

본 발명의 트레오닌 오페론을 에스케리키아 속에 속하는 세균으로 도입시키기 위해 사용되는 DNA 벡터로서, 바람직하게는 플라스미드 DNA가 사용되며, 에스케리키아 콜라이용 플라스미드의 예로는 pSTV29 (Takara Bio), RSF1010[참조: Gene, vol. 75 (2), pp.271-288, 1989], pUC19, pBR322, pMW119가 포함된다. 또한, 파아지 DNA 벡터도 사용될 수 있다. 본 발명의 트레오닌 오페론을 보유하는 플라스미드의 예로는 피드백 억제-내성 유형의 트레오닌 오페론을 보유하고 L-트레오닌-생산 미생물 VKPM B-3996에 내포되어 있는 플라스미드 pVIC40[참조: 일본 국제 특허공보 제3-501682호]으로부터 감쇠 관여 영역을 제거하여 수득한 플라스미드가 포함된다.

본 발명의 트레오닌 오페론을 세균의 염색체내로 도입시키는 것은 예를 들어, 유전자 재조합 기법을 사용한 상동 재조합[참조: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)]을 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 도입은 염색체상의 야생형 트레오닌 오페론의 감쇠 영역을 포함하는 영역을 감쇠-해제된 유형의 서열을 갖는 단편으로 대체시켜 달성할 수 있다. 본원에서 사용된 "감쇠-해제된 유형의 서열"이란 용어는 적어도 리더 서열과 감쇠인자가 제거되어진 감쇠 관여 영역의 서열을 의미한다.

상동 재조합의 기작은 다음과 같다. 염색체 서열과 상동성을 나타내는 서열을 갖는 플라스미드가 세포로 도입되면, 이는 특정한 빈도로 상동 서열의 부위에서 재조합을 유발하고, 도입된 플라스미드는 전체로서 염색체내로 통합된다. 상기 상동 서열의 부위에서 재조합이 추가로 유발되는 경우, 플라스미드는 상기 염색체로부터 다시 제거된다. 이어서, 재조합이 유발되는 몇몇 부위에서, 도입된 유전자는 염색체내로 통합될 수 있고, 본래 염색체 유전자는 플라스미드와 함께 염색체로부터 절단될 수 있다. 이러한 균주를 선택함으로써 염색체상의 야생형 감쇠 영역이 감쇠-해제된 유형의 서열을 갖는 단편으로 대체된 균주를 수득할 수 있다.

상동 재조합에 근거한 이러한 유전자 재조합 방법은 이미 확립되어 있으며, 선형 DNA, 온도 감수성 플라스미드 등을 사용한 방법이 사용될 수 있다.

에스케리키아 속에 속하는 세균에서 작용할 수 있는 온도 감수성 플라스미드의 예로는 pMAN997[참조: 국제 특허 공보 제WO99/03998호], pMAN031[참조: Yasueda, H. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 211 (1991)], pHSG415, pHSG422[참조: Hashimoto, Gotoh, T. et al, 16, 227-235 (1981)] 등이 포함된다.

표적 유전자의 치환은 염색체상의 유전자를 서던 블롯팅 또는 PCR로 분석하여 확인할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 유전자 제조, 하이브리드화, PCR, 플라스미드 DNA 제조, DNA의 분해 및 연결 및 형질전환 방법은 문헌[참조: Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989)]에 기재되어 있다.

본 발명의 트레오닌 오페론을 도입시키는 경우, 다수의 오페론을 염색체내로 도입시켜 당해 트레오닌 오페론의 카피수를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 트레오닌 오페론을 Mu 파아지[참조: 일본 공개특허공보 제2-109985호], 트랜스포존[참조: Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1-147] 등을 사용하여 염색체내로 도입시킬 수 있다.

<2> L-트레오닌 또는 L-이소류신의 생산방법

L-트레오닌 또는 L-이소류신은, 감쇠 영역을 제거하거나 돌연변이를 상기한 영역에 도입시켜 트레오닌 오페론 구조 유전자의 발현을 증가시킨, 에스케리키아 속에 속하고 L-트레오닌 또는 L-이소류신을 생산하는 능력을 갖는 세균을 배지에서 배양하고, L-트레오닌 또는 L-이소류신을 배지중에 생산 및 축적시키고, 상기 배지로부터 L-트레오닌 또는 L-이소류신을 수거함으로써 생산할 수 있다. L-트레오닌과 L-이소류신을 동시에 생산할 수 있다.

L-트레오닌 또는 L-이소류신은 필요에 따라 탄소원, 질소원, 무기염 및 기타 유기 미량 영양소를 함유하는 통상의 배지와 함께 본 발명의 세균을 통상의 방식으로 사용하여 생산할 수 있다. 합성 배지 및/또는 천연 배지를 사용할 수 있다. 배양될 균주에 의해 사용될 수 있는 한 어떠한 탄소원 및 질소원이라도 당해 배지에서 사용할 수 있다.

탄소원으로서, 글루코스, 글리세롤, 프럭토스, 슈크로스, 말토스, 만노스, 갈락토스, 전분 가수분해물 및 당밀과 같은 당을 사용할 수 있으며, 아세트산 및 시트르산과 같은 유기산 및 에탄올과 같은 알코올을 단독으로 또는 함께 사용할 수도 있다.

질소원으로서, 황산암모늄, 탄산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 및 아세트산암모늄과 같은 암모늄 염, 질산염 등을 사용할 수 있다.

미량의 유기 영양소로서, 아미노산, 비타민, 지방족 산, 핵산, 이들을 함유한 기질, 예를 들어, 카사미노산 및 대두 단백질의 분해 산물 등을 사용할 수 있다. 성장을 위해 아미노산 등을 필요로 하는 영양요구성 돌연변이주를 사용하는 경우, 요구되는 영양소를 보충하는 것이 바람직하다. 특히, 이소류신-영양요구성을 나타내는 트레오닌 생산 세균은 바람직하게는 성장을 위해 요구되는 이소류신을 보충하면서 배양한다.

인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염, 망간염 등을 미량의 유기 영양소로서 이용할 수 있다.

배양은 바람직하게는 25 내지 45℃의 온도 및 pH 5 내지 9에서 호기성 조건하에서 수행한다. pH 값이 배양 도중 증가되는 경우, 탄산칼슘을 첨가할 수 있거나, 배지를 암모니아 가스와 같은 알칼리성 물질로 중화시킬 수 있다. 이러한 조건하에서, 바람직하게는 약 10시간 내지 120시간 동안 배양한 후 배지 중에 현저한 양의 L-트레오닌 또는 L-이소류신이 축적된다.

배양 후에 배지로부터 축적된 L-트레오닌 또는 L-이소류신의 수거는 어떠한 통상의 수거 방법으로도 달성할 수 있다. 예를 들어, 세포를 원심분리한 다음, 농축에 의해 결정화시켜 배지로부터 제거함으로써 아미노산을 수거할 수 있다.

본 발명을 다음의 비제한적 실시예를 참조로 하여 보다 상세히 설명할 것이다.

실시예 1: 감쇠인자가 제거되어진 트레오닌 오페론의 증폭을 위한 플라스미드를 내포한 균주의 작제 및 평가

<1> 감쇠인자 제거를 위한 플라스미드의 제조

에스케리키아 콜라이내에서 자율적으로 복제할 수 있고 당해 트레오닌 오페론 을 보유한 플라스미드 pVIC40[참조: 일본 국제특허공보 제3-501682호]를 제한 효소 HindIII 및 BamHI로 분해시켜, 당해 트레오닌 오페론을 함유한 약 6kb의 단편 을 수득하였다. 이어서, pBR322(구입원: Takara Bio)를 제한 효소 HindIII 및 BamHI로 분해시키고, 상기한 트레오닌 오페론을 함유한 약 6kb의 단편을 분해된 pBR322에 삽입시켜 pBRT3240A을 수득하였다. 이러한 pBRT3240A를 MluI로 처리하고, 서열번호 8에 제시한 올리고뉴클레오타이드 및 이의 상보적 쇄를 하이브리드화하여 수득한, 제한 효소 XbaI 인식 부위를 갖는 어댑터(adapter)를 pBRT3240A의 MluI 부위에 삽입시켜 플라스미드 pBR3240A를 수득하였다.

이어서, 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 thrA 유전자와 트레오닌 프로모터 둘다를 함유하는 단편을 주형으로서 pVIC40을 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 수득된 단편을 pHSG399(구입원: Takara Bio)의 HincII 부위에 삽입시켜, pHSGthrA를 수득하였다.

pBRT3240A를 제한 효소 XbaI 및 SnaBI로 분해시켜 수득한 단편, 및 pHSGthrA를 XbaI과 SnaBI로 분해시켜 수득한 thrA 영역을 암호화하는 단편을 연결시켜 플라스미드 pBRΔT3을 수득하였다. 이어서, pBRΔT3을 PstI 및 BamHI로 처리하여 수득한 thrABC를 함유하는 단편을 pVIC40의 PstI- 및 BamHI-분해된 단편내로 도입시켜 플라스미드 pVICΔT3를 수득하였다. 플라스미드 pVICΔT3은 에스케리키아 콜라이에서 자율적으로 복제할 수 있으며, 감쇠인자만이 제거되어진 감쇠 관여 영역을 포함하는 트레오닌 오페론을 갖고 있다(도 1).

상기한 플라스미드 pVICΔT3, 및 야생형 감쇠인자를 갖는 대조군 플라스미드 pVIC40을 사용하여, C.T. 청(Chung)의 방법[참조: C.T. Chung, S.L. Niemela, R.H. Miller, Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) vol. 86, pp.2172-2175]에 따라 호모세린 데하이드로게나제가 결핍된 이. 콜라이 Gif33 균주[참조: AK-I, Theze J., Saint-Girons I., J. Bacteriol., 118(3):990 (1974)]를 형질전환시켰다. pVICΔT3-증폭된 형질전환체 및 대조군 야생형 트레오닌 오페론-증폭된 형질전환체를 스트렙토마이신-내성으로 선별하였다. pVICΔT3을 도입시켜 수득한 형질전환체는 Gif33/pVICΔT3으로 명명하였고, pVIC40을 도입시켜 수득한 형질전환체는 Gif33/pVIC40으로 명명하였다.

플라스미드를 상기한 바와 같이 선별한 Gif33/pVICΔT 및 Gif33/pVIC40 균주로부터 추출하고, 목적하는 플라스미드가 각 균주에서 각각 증폭되었음을 확인하였다.

<2> 감쇠인자가 제거되어진 트레오닌 오페론의 증폭을 위한 플라스미드를 내포한 균주의 배양 및 호모세린 데하이드로게나제 활성의 측정

감쇠인자를 갖지 않는 트레오닌 오페론을 함유한 플라스미드 pVICΔT3가 증폭된 형질전환체 Gif33/pVICΔT3 및 야생형 감쇠인자를 함유하는 pVIC40가 증폭된 형질전환체 Gif33/pVIC40을 각각 하기하는 바와 같이 배양하고, 호모세린 데하이드로게나제(이하 HD로 지칭함) 활성을 각 균주에서 측정하였다.

20㎍/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 LB 배지에서 예비배양된 Gif33/pVIC40 및 Gif33/pVICΔT3의 세포를 각각 37℃에서 약 115rpm에서 진탕하면서 22시간 내지 27시간 동안 정제수 1L(KOH를 사용하여 pH 7.0로 조정됨)당 글루코스 40g, 황산암모늄 16g, 인산일칼륨 1g, 황산제1철 7수화물 0.01g, 염화망간 4수화물 0.01g, 효모 추출물 2g, 황산마그네슘 7수화물 1g, 이소류신 50mg 또는 250mg 및 탄산칼슘 30g을 함유하는 생산 배지에서 배양하였다.

배양이 완료된 후, 세포를 배지로서 수거하고, HD 활성을 문헌[참조: Truffa-Bachi P., Le Bras G., Cohen G.N., Biochem. Biophys. Acta., 128:450 (1966)]에 따른 방법을 사용하여 측정하였으며, 여기서, 조 효소 용액을 200mM Tris-HCl(pH 9.0), 500mM KCl, 25mM L-호모세린 및 0.8mM NADP를 함유하는 반응 혼합물에 첨가하고, 340nm에서 흡수의 증가를 측정하였다. 대조군으로서는 호모세린 대신에 물을 함유하는 반응 용액을 사용하였다. 조 효소 용액은, 세포를 상기한 배지로부터 원심분리에 의해 분리시키고, 세포를 0.1M KP 완충액(0.01M DTT, pH 7.0)으로 세척하고, 세포를 초음파처리에 의해 분산시킨 다음, 파괴되지 않은 세포를 원심분리하여 제거함으로써 제조하였다. 조 효소 용액 중의 단백질을 표준물로서 소 혈청 알부민을 사용하여 단백질 분석법(Bio-Rad)으로 정량하였다. 결과는 하기 표 1에 제시한다.

균주	첨가된 이소류신(mg/L)	HD 활성 (nmol/분/mg)
Gif33/pVIC40	50 250	11.6 4.3
Gif33/pVICΔT3	50 250	12.0 4.5

결과로서, 균주 Gif33/pVICΔT 및 Gif33/pVIC40 간에 HD 효소 활성의 차이는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 트레오닌 오페론의 발현이 단지 감쇠인자의 제거 결과로서만 증가되지 않았음을 입증한다.

실시예 2: 감쇠인자 및 리더 서열을 포함하는 서열의 상이한 절편이 제거되어진 트레오닌 오페론을 갖는 균주의 작제 및 평가

<1> 감쇠인자 및 리더 서열의 제거를 위한 플라스미드의 작제

상기한 바와 같이, 이소류신 첨가에 의해 유발된 감쇠는 감쇠인자의 제거로서 해제되지 못했다. 따라서, 감쇠인자 뿐만 아니라 리더 서열의 제거를 시도하였다. 먼저, 주형으로서 pVIC40을 사용하여 PCR을 수행하여, 프로모터와 후속적 영역을 갖는 단편을 수득하였다. 프로모터의 상부에 있는 영역에 위치하는 서열에 상보적인 서열번호 9에 제시한 올리고뉴클레오타이드, 및 서열번호 10 내지 14의 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 중 어느 하나를 사용하여 PCR을 수행하였다. 수득된 각각의 DNA 단편을 통상의 방식으로 증폭시키고, HincII로 분해시킨 pHSG398(Takara Bio)에 연결시켰다. 이로써, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오타이드가 증폭된 단편을 함유하는 플라스미드 pHPBthr, 서열번호 9 및 11의 올리고뉴클레오타이드가 증폭된 단편을 함유하는 플라스미드 pHPCthr, 서열번호 9 및 12의 올리고뉴클레오타이드가 증폭된 단편을 함유하는 플라스미드 pHPDthr, 서열번호 9 및 13의 올리고뉴클레오타이드가 증폭된 단편을 함유하는 플라스미드 pHPEthr 및 서열번호 9 및 14의 올리고뉴클레오타이드가 증폭된 단편을 함유하는 플라스미드 pHPFthr가 수득되었다. 이어서, 이들 5개의 플라스미드를 제한 효소 HindIII 및 BamHI로 분해시키고, thrA의 상부 영역을 함유하는 수득된 단편을 HindIII-BamHI-분해된 pBR322(Nippon Gene)내로 도입시켜, 플라스미드 pBRBthr, pBRCthr, pBRDthr, pBREthr 및 pBRFthr를 수득하였다.

이어서, 감쇠인자가 결여된 트레오닌 오페론을 증폭시키기 위한 상기한 플라스미드 pBRΔT3을 XbaI 및 BamHI으로 분해시키고, thrABC를 함유하는 수득된 단편을 XbaI-BamHI-분해된 pBRBthr, pBRCthr, pBRDthr, pBREthr 및 pBRFthr에 도입시켜, 각각 리더 서열과 감쇠인자를 포함하는 서열의 상이한 절편이 제거되어진 트레오닌 오페론을 보유하는 플라스미드 pBAT3, pCAT3, pDAT3, pEAT3 및 pFAT3을 수득하였다. 플라스미드 pBAT3, pCAT3, pDAT3, pEAT3 및 pFAT3을 PstI 및 BamHI로 분해시켜 수득한 단편들을 각각 pVIC40의 PstI-BamHI 부위로 도입시켜, 플라스미드 pBAT3, pCAT3, pDAT3, pEAT3 및 pFAT3를 수득하였다(도 2). 수득된 플라스미드 pBAT3, pCAT3, pDAT3, pEAT3 및 pFAT3은 에스케리키아 콜라이내에서 자율적으로 복제할 수 있으며, 감쇠 영역의 감쇠인자 및 리더 서열은 완전하게 제거된 반면, 리더 서열의 상부에 있는 서열은 상이한 정도로 제거되었다. 즉, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 번호 188 내지 310을 갖는 서열이 pBAT3에서 제거되었으며, 뉴클레오타이드 번호 178 내지 310을 갖는 서열이 pCAT3에서 제거되었으며, 뉴클레오타이드 서열 번호 168 내지 310을 갖는 서열이 pDAT3에서 제거되었으며, 뉴클레오타이드 번호 158 내지 310을 갖는 서열이 pEAT3에서 제거되었으며, 뉴클레오타이드 서열 번호 148 내지 310을 갖는 서열이 pFAT3에서 제거되었다.

<2> 감쇠 영역의 제거를 위한 각 플라스미드가 도입된 균주의 작제 및 평가

수득된 플라스미드의 일부에 대해서, 리더 서열과 감쇠인자의 제거 효율성을 시험하였다. 각각 리더서열과 감쇠인자를 포함하는 상이한 길이의 서열이 결여된 플라스미드 pDAT3 및 pFAT3, 및 대조군 플라스미드 pVIC40을 각각 HD-결핍 Gif33 균주에 도입시키고, 형질전환체를 스트렙토마이신-내성에 대해 선별하였다. 플라스미드 pDAT3 또는 pFAT3이 도입된 균주를 각각 Gif33/pDAT3 또는 Gif33/pFAT3으로 명명하였다.

플라스미드를 Gif33/pDAT3, Gif33/pFAT3 및 대조군 Gif33/pVIC40으로부터 추출하고, 목적하는 플라스미드가 각 균주에서 증폭되었음을 확인하였다. 이들 형질전환체를 실시예 1의 <2>에서 기술한 방법으로 배양하고, HD 활성을 측정하였다. 결과는 하기 표 2에 제시한다.

균주	첨가된 이소류신 (mg/L)	HD 활성 (nmol/분/mg)
Gif33/pVIC40	0 250	20.0 3.4
Gif33/pDAT3	0 250	17.7 63.0
Gif33/pFAT3	0 250	72.3 46.2

HD 활성은 야생형 감쇠 영역을 갖는 증폭된 트레오닌 오페론을 함유하는Gif33/pVIC40 균주에서 이소류신의 존재하에 약 1/6로 감소되었다. 감쇠인자와 리더 서열이 결여된 트레오닌 오페론이 증폭된 Gif33/pDAT3 및 Gif33/pFAT3 균주에서, HD 활성은 이소류신 균주의 존재하에 감소되지 않았다. 실시예 1 및 실시예 2의 결과로부터, 감쇠인자 뿐만 아니라 리더 서열이 결여된 트레오닌 오페론의 증폭을 위한 플라스미드를 내포한 균주 Gif33/pDAT3 및 Gif33/pFAT3은 이소류신 첨가에 의해 유발된 감쇠에 의해 영향을 받지 않았다. Gif33/pDAT3 균주의 HD 활성은 이소류신의 부재하에 17.7nmol/분/mg였으며, 이는 대조군 Gif33/pVIC40 균주의 HD 활성 20.0nmol/분/mg보다 낮았다. 그러나, 이는 배양 동안 플라스미드의 제거(curing) 때문인 것으로 사료된다.

이어서, L-트레오닌-생산 VKPMB-3996로부터 pVIC40을 제거하여 수득한 TDH6 균주[참조: 일본 특허 제3239903호]를 각각 감쇠-해제된 서열을 갖는 트레오닌 오페론을 보유한 플라스미드 pBAT3, pCAT3, pDAT3, pEAT3, pFAT3 또는 대조군 플라스미드 pVIC40으로 형질전환시키고, 형질전환체를 스트렙토마이신-내성에 대해 선별하였다. TDH6 균주를 트랜스포존 Tn5[참조: 일본 공개특허공보 제2001-346578호]을 삽입시켜 트레오닌 데하이드로게나제 활성이 결핍되도록 변형시켰다. 상기 TDH6 균주는 기탁기관[Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganism (VNII 제네티카, 주소: 러시아 113545 모스크바 1 도로즈흐니 프로에즈드 1)]에 1985년 8월 8일자로 기탁되었으며 수탁번호 제VKPM B-3420호를 부여받았다.

플라스미드 pBAT3, pCAT3, pDAT3, pEAT3, pFAT3 또는 pVIC40가 도입된 균주를 각각 TDH6/pBAT3 균주, TDH6/pCAT3 균주, TDH6/pDAT3 균주, TDH6/pEAT3 균주, TDH6/pFAT3 균주 또는 TDH6/pVIC40 균주로 명명하였다.

플라스미드를 상기한 바와 같은 형질전환체로부터 추출하고, 목적하는 플라스미드가 각 균주에서 증폭되었음을 확인하였다. 이들 형질전환체를 실시예 1의 <2>에 기술된 방법으로 배양하고, 이소류신의 존재 또는 부재하에서의 이의 L-트레오닌-생산능을 측정하였다.

배양이 완료된 후, 각 배양액 중의 축적된 L-트레오닌의 양을 적절하게 희석된 배양액에 대해 액체 크로마토그래피하여 분석하였다. 당해 결과는 하기 표 3에 제시한다. 각각의 형질전환체에 대해, 생산된 L-트레오닌의 양은 이소류신의 부재하에 생산된 L-트레오닌의 양(100으로 취함)에 대해 상대값으로 나타낸다.

균주	첨가된 L-이소류신 (mg/L)	상대값으로서의 생산된 L-트레오닌
TDH6/pVIC40	0 250	100 55
TDH6/pBAT3	0 250	100 60
TDH6/pCAT3	0 250	100 39
TDH6/pDAT3	0 250	100 76
TDH6/pEAT3	0 250	100 320
TDH6/pFAT3	0 250	100 79

트레오닌 산출량은 TDH6/pVIC40 균주에서 이소류신의 부재하에 수득된 산출량과 비교하여 L-이소류신의 존재하에 55%로 감소된 반면에, 배지 중의 이소류신의 존재하에 TDH6/pDAT3 균주, TDH6/pEAT3 균주 및 TDH6/pFAT3 균주에서 수득된 산출량은 각각 76%, 320% 및 79%였다. 즉, 이소류신의 존재하에 생산된 L-트레오닌의 양은 다소 감소되었거나 심지어 증가되었다. 따라서, 감쇠 영역의 감쇠인자와 리더 서열이 결여된 서열의 경우, 트레오닌 오페론의 감쇠는 일어나지 않았으며, L-트레오닌의 생산은 고 농도의 L-이소류신의 존재하에 개선되었다. TDH6/pCAT3 균주에 대해 표 3에 제시한 바와 같이, L-이소류신의 존재하에 생산된 L-트레오닌의 양은, 이소류신의 부재하에 생산된 양에 상대적으로 39%였으며, 이는 대조군 균주 TDH6/pVIC40의 값보다 낮은 값이다. 그러나, 이러한 낮은 값은 플라스미드의 제거의 결과인 것으로 사료되며, 상기 균주에서 생산된 L-트레오닌의 양은 감쇠의 제거로 인해서 실질적으로 증가하였다.

실시예 3: 감쇠인자 및 리더 서열이 염색체상 트레오닌 오페론으로부터 제거되어진 균주의 작제 및 당해 균주의 트레오닌 생산의 평가

<1> thrC 유전자-도입된 TDH6 균주의 작제

플라스미드 pDAT3으로부터 유래된 감쇠-해제된 유형의 서열을 염색체로 도입시키고, 이의 효과를 측정하였다. L-트레오닌-생산 균주인 TDH6 균주에는 트레오닌 신타제를 암호화하는 thrC 유전자가 결여되어 있다. 따라서, 야생형 thrC를 갖는 TDH6 균주를 공여 세균으로서 에스케리키아 콜라이 야생형 W3110 균주(ATCC 27325)를 사용하여 P1 형질도입을 사용한 통상의 방법으로 수득하였다.

구체적으로, 상기 균주는 다음과 같이 수득되었다. 에스케리키아 콜라이 W3110 균주의 배양물 및 P1 파아지 희색액을 특정 농도에서 연질 아가 배지에 함께 첨가하고, 이 배지를 LB 플레이트에 도말하였다. 배지가 고형화된 후, 세포를 37℃에서 6시간 내지 7시간 동안 배양하여 파아지가 플라크를 형성하도록 한 다음, 이 파아지를 수거하였다. 수거된 파아지를 수용 TDH6 균주에 첨가하고, 세포를 2.5mM CaCl₂의 존재하에 37℃에서 약 20분 동안 정치시켜 파아지가 흡수되도록 한 다음, 37℃에서 약 30분 동안 10mM Na-시트레이트와 반응시켜 흡수 반응을 종결시켰다.

thrC가 결여된 TDH6 균주는 트레오닌을 함유하지 않은 최소 배지에서 성장하지 못하는 반면, 형질도입에 의해 thrC가 도입된 균주는 상기 최소 배지에서 성장할 수 있다. 이어서, 상기한 반응 용액을 정제수 1L당 글루코스 0.5g, 2mM 황산마그네슘, 인산일칼륨 3g, 염화나트륨 0.5g, 염화암모늄 1g 및 인산이나트륨 6g을 함유하는 최소 배지에 접종시켰다. 24시간 후에 상기 최소 배지에서 성장시킨 콜로니로부터의 균주를 thrC-도입된 균주로서 선별하고 W13으로 명명하였다.

<2> 감쇠-해제된 유형의 서열을 갖는 트레오닌 오페론을 염색체내로 도입시키기 위한 플라스미드의 작제

감쇠 영역의 감쇠인자와 리더 서열이 결여된(서열번호 1의 뉴클레오타이드 번호 168 내지 310을 갖는 영역이 결여된) 플라스미드 pDAT3를 HindIII 및 PvuI로 분해시키고, 프로모터, 절두된 감쇠 영역 및 thrA를 함유하는 수득된 단편을 HindIII-HincII-분해된 플라스미드 pUC18(구입원: Takara Bio)내로 도입시켜 플라스미드 pUC18D를 수득하였다.

이어서, 상동 재조합을 수행하기 위해, 염색체상 트레오닌 오페론에 대해 5' 상부 서열을 도 3에 도시한 바와 같이 PCR로 클로닝하였다. 구체적으로는, GENBANK 등록 번호 AE000510의 서열내 뉴클레오타이드 번호 4454 내지 6127을 갖는 DNA를 클로닝하였다. 5' 프라이머로서, HindIII 및 EcoRI의 도입을 위한 4458번 A 및 4469번 C 둘다를 포함하며 4458번 A가 T로 치환되고 4469번 C가 T로 치환되어 있는 영역에 상응하는 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다. 3' 프라이머로서, GENBANK 등록 번호 AE000510의 서열내 HindIII 부위의 3' 부위(뉴클레오타이드 번호 6122 내지 6127)상의 영역에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다. 이들 프라이머를 사용하여, 트레오닌 오페론 프로모터에 대해 상부에 있는 영역의 단편을 수득하였다. 상기 단편을 HindIII로 분해시키고, pUC18D의 HindIII 부위에 삽입시켜 플라스미드 pUC18DD를 작제하였다.

이어서, 돌연변이를 염색체로 도입하기 위한 온도 감수성 플라스미드를 작제하였다. pBR322(구입원: Nippon Gene)를 HindIII 및 PstI로 분해시키고, 수득된 단편을 pMAN031[참조: Yasueda, H. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 211 (1991)]의 HindIII 부위와 PstI 부위 사이에 도입시켜 온도 감수성 pTS1을 작제하였다. 이어서, 치환된 항생제 내성 유전자를 갖는 플라스미드 pTS2를 작제하였다. 즉, 테트라사이클린 GenBlock(구입원: 애머샴(Amersham))을 pTS1의 암피실린 내성 유전자내 ScaI 부위에 삽입시켜 온도 감수성 pTS2를 작제하였다.

이어서, 감쇠-해제된 유형의 서열을 갖는 트레오닌 오페론을 염색체내로 도입하기 위한 온도 감수성 플라스미드를 다음과 같이 작제하였다. pUC18DD를 EcoRI로 분해시키고, 트레오닌 오페론의 감쇠 영역의 상부 및 하부를 포괄하는 서열을 갖는 수득된 단편을 pTS2의 EcoRI 부위로 도입하여 상동 재조합용 플라스미드 pTS2DD를 작제하였다.

<3> 염색체상에 감쇠-해제된 유형의 서열을 갖는 트레오닌 오페론을 갖는 균주의 작제

온도 감수성 플라스미드 pTS2DD를 W13 균주, 즉 thrC-도입된 TDH6 균주에 도입시켰다. W13 균주를 온도 감수성 플라스미드 pTS2DD로 형질전환시키고, 콜로니를 30℃에서 LB + 테트라사이클린 플레이트에서 선별하였다. 선별된 콜로니를 30℃에서 밤새 배양하고, 배양액을 10³배 희석시키고 LB + 테트라사이클린 플레이트에 접종시켜 42℃에서 콜로니를 선별하였다. 선별된 클론을 LB + 테트라사이클린 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 배양한 다음, 액체 배지로 옮겨서 42℃에서 4시간 내지 5시간 동안 진탕하면서 배양하였다. 배양액을 적합하게 희석시키고 LB 플레이트에 접종시켰다. 수득된 콜로니 중에서 수백개의 콜로니를 선별하여 LB 플레이트 및 LB + 테트라사이클린 플레이트에 접종시키고, 테트라사이클린-민감성 균주를 선별하였다. 콜로니 PCR을 수개의 테트라사이클린-민감성 균주에 대해 수행하여, 감쇠-해제된 유형의 서열을 갖는 트레오닌 오페론이 도입되었는지 여부를 확인하였다. 이러한 방식으로, thrC 및 감쇠-해제된 유형의 트레오닌 오페론을 TDH6 내로 도입시켜 수득한 균주인 W13112 균주를 작제하였다. 상기한 조작에 있어, thrC가 도입되었다는 점을 제외하고는 염색체상에 야생형 감쇠 영역을 갖는 W1325 균주도 수득되었다.

<4> 염색체상에 감쇠-해제된 유형의 서열을 갖는 트레오닌 오페론이 도입된 균주에 의한 L-트레오닌 생산의 평가

염색체상 트레오닌 오페론의 감쇠 영역내에 리더 서열과 감쇠인자가 결여된 W13112 균주, 및 트레오닌 오페론과 야생형 감쇠 영역을 갖는 대조군 W1325 균주를 실시예 1의 <2>에 기술된 방법으로 각각 배양하였다. 생산된 L-트레오닌의 농도를 실시예 2의 <2>에 기술된 방법으로 측정하였다. 각각의 형질전환체에 있어, 이소류신의 존재하에 생산된 L-트레오닌은 이소류신의 부재하에 생산된 L-트레오닌의 양(100으로 취함)에 대해 상대값으로서 나타낸다. 당해 결과는 하기 표 4에 제시한다.

균주	첨가된 이소류신 (mg/L)	생산된 트레오닌
		g/L	상대값
W1325	0 250	2.9 1.0	100 34
W13112	0 250	5.6 5.3	100 96

염색체상 트레오닌 오페론이 감쇠-해제된 유형의 서열을 갖는 W13112 균주에서, 이소류신의 존재하에 축적된 L-트레오닌의 양은 대조군 균주와 비교하여 높았으며, 따라서 감쇠-해제된 유형의 서열을 갖는 염색체상 트레오닌 오페론을 갖는 균주에서는 L-트레오닌 생산량이 배지에 첨가된 이소류신에 의해 거의 영향을 받지 않았음이 입증되었다.

실시예 4: 감쇠-해제된 유형의 서열을 갖는 트레오닌 오페론이 염색체에 도입되어 있고 또한 야생형 트레오닌 오페론을 함유한 플라스미드를 내포하는 균주의 작제

실시예 3에 제시한 바와 같이, 염색체상 트레오닌 오페론이 감쇠-해제된 유형의 서열을 갖는 트레오닌 오페론으로 대체된 균주에서, 축적된 L-트레오닌의 양은 고 농도의 이소류신의 존재하에서도 감소되지 않았다. 이어서, 염색체상 트레오닌 오페론으로부터 감쇠 영역 제거의 효과를 확인하기 위해서 야생형 감쇠 영역을 갖는 트레오닌 오페론을 함유하는 플라스미드 pVIC40을 W13112 균주내로 도입시켰다.

W13112를 pVIC40으로 형질전환시키고, 형질전환체를 스트렙토마이신-내성에 대해 선별하였다. pVIC40-증폭된 균주로서 선별된 형질전환체를 W13112/pVIC40으로 명명하고, 플라스미드를 추출하였다. 목적하는 플라스미드가 상기 균주에서 증폭되었음을 확인하였다.

실시예 1의 <2>에 기술된 방법에 따라서, W13112/pVIC40 균주의 L-트레오닌 생산능을 측정하고 야생형 염색체상 트레오닌 오페론을 함유하는 TDH6/pVIC40 균주의 L-트레오닌-생산능과 비교하였다. 각 형질전환체에 대해, 생산된 L-트레오닌의 양은 이소류신의 부재하에 생산된 L-트레오닌의 양(100으로 취함)에 대한 상대값으로서 나타낸다. 당해 결과는 하기 표 5에 제시한다.

균주	첨가된 이소류신(mg/L)	상대값으로서의 생산된 L-트레오닌
TDH6/pVIC40	0 250	100 60
W13112/pVIC40	0 250	100 77

염색체상 트레오닌 오페론의 야생형 감쇠 영역을 갖는 TDH6/pVIC40 균주에서, 생산된 트레오닌의 양은 이소류신의 첨가시에 현저하게 감소되었다. 환언하면, 염색체상 트레오닌 오페론이 감쇠-해제된 유형인 W13112/pVIC40 균주에서, 이소류신의 존재하에 생산된 트레오닌의 양의 감소는 TDH6/pVIC40 균주와 비교하여 덜 현저하였다.

실시예 5: 염색체상의 감쇠-해제된 유형의 서열을 갖는 트레오닌 오페론이 도입된 균주의 L-이소류신 생산능의 측정

<1> W13112/pVIC40 균주로부터 L-이소류신 생산 균주의 확립 및 이의 평가

L-이소류신은 전구체로서의 L-트레오닌을 통해서 생산되므로, L-이소류신 생산 균주는 L-트레오닌 생산 세균의 L-이소류신-생합성 효소를 증강시켜 수득할 수 있다[참조: 일본 공개특허공보 제09-121872호 및 제2002-051787호]. 따라서, L-이소류신-생합성 효소의 활성을 증강시키기 위해, L-이소류신-생합성 효소의 유전자를 증폭시키기 위한 플라스미드 pMWD5를 각각 실시예 5에서 사용된 TDH6/pVIC40 균주 및 W13112/pVIC40 균주로 도입시켰다. 플라스미드 pMWD5는 이소류신 오페론 자체의 감쇠를 위해 요구되는 영역이 결실되어 있는 이소류신 오페론을 함유한다[참조: 일본 공개특허공보 제09-121872호]. 플라스미드 pMWD5를 실시예 5에서 기술한 형질전환에 의해 각각의 TDH6/pVIC40 및 W13112/pVIC40으로 도입시키고, 형질전환체를 암피실린-내성에 대해 선별하였다. pMWD5를 갖는 TDH6/pVIC40 균주를 TDH6/pVIC40 pMWD5로 명명하고, pMWD5를 갖는 W13112/pVIC40 균주를 W31112/pVIC40 pMWD5로 명명하였다.

<2> 염색체상의 감쇠-해제된 유형의 서열을 갖는 트레오닌 오페론이 도입된 균주의 L-이소류신 생산능의 평가

플라스미드를 TDH6/pVIC40 pMWD5 균주 및 W31112/pVIC40 pMWD5 균주로부터 추출하고, 목적하는 플라스미드가 각 균주에서 증폭되었음을 확인하였다.

20㎍/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 LB 배지에서 예비배양된 TDH6/pVIC40 pMWD5 균주 및 W31112/pVIC40 pMWD5 균주의 세포를 각각 37℃에서 약 115rpm에서 진탕하면서 22시간 내지 27시간 동안 정제수 1L(KOH를 사용하여 pH 7.0로 조정됨)당 글루코스 40g, 황산암모늄 16g, 인산일칼륨 1g, 황산제1철 7수화물 0.01g, 염화망간 4수화물 0.01g, 효모 추출물 2g, 황산마그네슘 7수화물 1g 및 탄산칼슘 30g을 함유하는 L-이소류신 생산 배지에서 배양하였다.

배양이 완료된 후, 각 배양액 중의 축적된 L-트레오닌의 양을 액체 크로마토그래피를 사용하여 적절히 희석된 배양액에 대해 분석하였다.

염색체상에 감쇠-해제된 유형의 서열을 갖는 트레오닌 오페론이 도입된 균주인 W13112/pVIC40 pMWD5 균주로 수득된 L-이소류신의 산출량은 대조군 TDH6/pVIC40 pMWD5 균주에 비해서 개선되었으며, 따라서 트레오닌 오페론으로부터 감쇠 영역의 제거가 L-이소류신의 생산에도 효과적이었음이 입증되었다.

균주	생산된 L-이소류신(g/L)
TDH6/pVIC40 pMWD5	10.1
W31112/pVIC40 pMWD5	11.3

본 발명에 따라서, L-트레오닌 및/또는 L-이소류신의 산출을 발효 동안 에스케리키아 속에 속하는 세균을 사용하여 개선시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 신규한 L-트레오닌 및/또는 L-이소류신 생산 세균의 생육 방법을 제공한다.

<110> AJINOMOTO CO., INC. <120> Method for producing L-amino acid by fermentation <130> C312OPC4203 <150> JP 2003-391826 <151> 2003-11-21 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5040 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> promoter <222> (71)..(99) <223> factor Sigma 70; predicted +1 start at 106 <220> <221> promoter <222> (104)..(132) <223> factor Sigma 70; predicted +1 start at 139 <220> <221> promoter <222> (139)..(219) <223> factor Sigma 70; predicted +1 start at 219 <220> <221> CDS <222> (190)..(255) <223> leader peptide <220> <221> attenuator <222> (273)..(307) <223> <220> <221> CDS <222> (337)..(2799) <223> thrA <220> <221> CDS <222> (2801)..(3733) <223> thrB <220> <221> CDS <222> (3734)..(5020) <223> thrC <400> 1 agcttttcat tctgactgca acgggcaata tgtctctgtg tggattaaaa aaagagtgtc 60 tgatagcagc ttctgaactg gttacctgcc gtgagtaaat taaaatttta ttgacttagg 120 tcactaaata ctttaaccaa tataggcata gcgcacagac agataaaaat tacagagtac 180 acaacatcc atg aaa cgc att agc acc acc att acc acc acc atc acc att 231 Met Lys Arg Ile Ser Thr Thr Ile Thr Thr Thr Ile Thr Ile 1 5 10 acc aca ggt aac ggt gcg ggc tga cgcgtacagg aaacacagaa aaaagcccgc 285 Thr Thr Gly Asn Gly Ala Gly 15 20 acctgacagt gcgggctttt tttttcgacc aaaggtaacg aggtaacaac c atg cga 342 Met Arg gtg ttg aag ttc ggc ggt aca tca gtg gca aat gca gaa cgt ttt ctg 390 Val Leu Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Ala Glu Arg Phe Leu 25 30 35 cgt gtt gcc gat att ctg gaa agc aat gcc agg cag ggg cag gtg gcc 438 Arg Val Ala Asp Ile Leu Glu Ser Asn Ala Arg Gln Gly Gln Val Ala 40 45 50 55 acc gtc ctc tct gcc ccc gcc aaa atc acc aac cac ctg gtg gcg atg 486 Thr Val Leu Ser Ala Pro Ala Lys Ile Thr Asn His Leu Val Ala Met 60 65 70 att gaa aaa acc att agc ggc cag gat gct tta ccc aat atc agc gat 534 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Gly Gln Asp Ala Leu Pro Asn Ile Ser Asp 75 80 85 gcc gaa cgt att ttt gcc gaa ctt ttg acg gga ctc gcc gcc gcc cag 582 Ala Glu Arg Ile Phe Ala Glu Leu Leu Thr Gly Leu Ala Ala Ala Gln 90 95 100 ccg ggg ttc ccg ctg gcg caa ttg aaa act ttc gtc gat cag gaa ttt 630 Pro Gly Phe Pro Leu Ala Gln Leu Lys Thr Phe Val Asp Gln Glu Phe 105 110 115 gcc caa ata aaa cat gtc ctg cat ggc att agt ttg ttg ggg cag tgc 678 Ala Gln Ile Lys His Val Leu His Gly Ile Ser Leu Leu Gly Gln Cys 120 125 130 135 ccg gat agc atc aac gct gcg ctg att tgc cgt ggc gag aaa atg tcg 726 Pro Asp Ser Ile Asn Ala Ala Leu Ile Cys Arg Gly Glu Lys Met Ser 140 145 150 atc gcc att atg gcc ggc gta tta gaa gcg cgc ggt cac aac gtt act 774 Ile Ala Ile Met Ala Gly Val Leu Glu Ala Arg Gly His Asn Val Thr 155 160 165 gtt atc gat ccg gtc gaa aaa ctg ctg gca gtg ggg cat tac ctc gaa 822 Val Ile Asp Pro Val Glu Lys Leu Leu Ala Val Gly His Tyr Leu Glu 170 175 180 tct acc gtc gat att gct gag tcc acc cgc cgt att gcg gca agc cgc 870 Ser Thr Val Asp Ile Ala Glu Ser Thr Arg Arg Ile Ala Ala Ser Arg 185 190 195 att ccg gct gat cac atg gtg ctg atg gca ggt ttc acc gcc ggt aat 918 Ile Pro Ala Asp His Met Val Leu Met Ala Gly Phe Thr Ala Gly Asn 200 205 210 215 gaa aaa ggc 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320 325 aag ggc att tcc aat ctg aat aac atg gca atg ttc agc gtt tct ggt 1302 Lys Gly Ile Ser Asn Leu Asn Asn Met Ala Met Phe Ser Val Ser Gly 330 335 340 ccg ggg atg aaa ggg atg gtc ggc atg gcg gcg cgc gtc ttt gca gcg 1350 Pro Gly Met Lys Gly Met Val Gly Met Ala Ala Arg Val Phe Ala Ala 345 350 355 atg tca cgc gcc cgt att tcc gtg gtg ctg att acg caa tca tct tcc 1398 Met Ser Arg Ala Arg Ile Ser Val Val Leu Ile Thr Gln Ser Ser Ser 360 365 370 375 gaa tac agc atc agt ttc tgc gtt cca caa agc gac tgt gtg cga gct 1446 Glu Tyr Ser Ile Ser Phe Cys Val Pro Gln Ser Asp Cys Val Arg Ala 380 385 390 gaa cgg gca atg cag gaa gag ttc tac ctg gaa ctg aaa gaa ggc tta 1494 Glu Arg Ala Met Gln Glu Glu Phe Tyr Leu Glu Leu Lys Glu Gly Leu 395 400 405 ctg gag ccg ctg gca gtg acg gaa cgg ctg gcc att atc tcg gtg gta 1542 Leu Glu Pro Leu Ala Val Thr Glu Arg Leu Ala Ile Ile Ser Val Val 410 415 420 ggt gat ggt atg cgc acc ttg cgt ggg atc tcg gcg aaa ttc ttt gcc 1590 Gly Asp Gly Met Arg Thr Leu Arg Gly Ile Ser Ala Lys Phe Phe Ala 425 430 435 gca ctg gcc cgc gcc aat atc aac att gtc gcc att gct cag gga tct 1638 Ala Leu Ala Arg Ala Asn Ile Asn Ile Val Ala Ile Ala Gln Gly Ser 440 445 450 455 tct gaa cgc tca atc tct gtc gtg gta aat aac gat gat gcg acc act 1686 Ser Glu Arg Ser Ile Ser Val Val Val Asn Asn Asp Asp Ala Thr Thr 460 465 470 ggc gtg cgc gtt act cat cag atg ctg ttc aat acc gat cag gtt atc 1734 Gly Val Arg Val Thr His Gln Met Leu Phe Asn Thr Asp Gln Val Ile 475 480 485 gaa gtg ttt gtg att ggc gtc ggt ggc gtt ggc ggt gcg ctg ctg gag 1782 Glu Val Phe Val Ile Gly Val Gly Gly Val Gly Gly Ala Leu Leu Glu 490 495 500 caa ctg aag cgt cag caa agc tgg ctg aag aat aaa cat atc gac tta 1830 Gln Leu Lys Arg Gln Gln Ser Trp Leu Lys Asn Lys His Ile Asp Leu 505 510 515 cgt gtc tgc ggt gtt gcc aac tcg aag gct ctg ctc acc aat gta cat 1878 Arg Val Cys Gly Val Ala Asn Ser Lys Ala Leu Leu Thr Asn Val His 520 525 530 535 ggc ctt aat ctg gaa aac tgg cag gaa gaa ctg gcg caa gcc aaa gag 1926 Gly Leu Asn Leu Glu Asn 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gat ggc gtc 2598 Glu Gly Lys Val Leu Arg Tyr Val Gly Asn Ile Asp Glu Asp Gly Val 760 765 770 775 tgc cgc gtg aag att gcc gaa gtg gat ggt aat gat ccg ctg ttc aaa 2646 Cys Arg Val Lys Ile Ala Glu Val Asp Gly Asn Asp Pro Leu Phe Lys 780 785 790 gtg aaa aat ggc gaa aac gcc ctg gcc ttc tat agc cac tat tat cag 2694 Val Lys Asn Gly Glu Asn Ala Leu Ala Phe Tyr Ser His Tyr Tyr Gln 795 800 805 ccg ctg ccg ttg gta ctg cgc gga tat ggt gcg ggc aat gac gtt aca 2742 Pro Leu Pro Leu Val Leu Arg Gly Tyr Gly Ala Gly Asn Asp Val Thr 810 815 820 gct gcc ggt gtc ttt gct gat ctg cta cgt acc ctc tca tgg aag tta 2790 Ala Ala Gly Val Phe Ala Asp Leu Leu Arg Thr Leu Ser Trp Lys Leu 825 830 835 gga gtc tga c atg gtt aaa gtt tat gcc ccg gct tcc agt gcc aat atg 2839 Gly Val Met Val Lys Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Ala Asn Met 840 845 850 agc gtc ggg ttt gat gtg ctc ggg gcg gcg gtg aca cct gtt gat ggt 2887 Ser Val Gly Phe Asp Val Leu Gly Ala Ala Val Thr Pro Val Asp Gly 855 860 865 870 gca ttg ctc gga gat gta gtc acg gtt gag gcg gca gag aca ttc agt 2935 Ala Leu Leu Gly Asp Val Val Thr Val Glu Ala Ala Glu Thr Phe Ser 875 880 885 ctc aac aac ctc gga cgc ttt gcc gat aag ctg ccg tca gaa cca cgg 2983 Leu Asn Asn Leu Gly Arg Phe Ala Asp Lys Leu Pro Ser Glu Pro Arg 890 895 900 gaa aat atc gtt tat cag tgc tgg gag cgt ttt tgc cag gaa ctg ggt 3031 Glu Asn Ile Val Tyr Gln Cys Trp Glu Arg Phe Cys Gln Glu Leu Gly 905 910 915 aag caa att cca gtg gcg atg acc ctg gaa aag aat atg ccg atc ggt 3079 Lys Gln Ile Pro Val Ala Met Thr Leu Glu Lys Asn Met Pro Ile Gly 920 925 930 tcg ggc tta ggc tcc agt gcc tgt tcg gtg gtc gcg gcg ctg atg gcg 3127 Ser Gly Leu Gly Ser Ser Ala Cys Ser Val Val Ala Ala Leu Met Ala 935 940 945 950 atg aat gaa cac tgc ggc aag ccg ctt aat gac act cgt ttg ctg gct 3175 Met Asn Glu His Cys Gly Lys Pro Leu Asn Asp Thr Arg Leu Leu Ala 955 960 965 ttg atg ggc gag ctg gaa ggc cgt atc tcc ggc agc att cat tac gac 3223 Leu Met Gly Glu Leu Glu Gly Arg Ile Ser Gly Ser Ile His Tyr Asp 970 975 980 aac gtg gca ccg tgt ttt ctc ggt ggt atg cag ttg atg atc gaa gaa 3271 Asn Val Ala Pro Cys Phe Leu Gly Gly Met Gln Leu Met Ile Glu Glu 985 990 995 aac gac atc atc agc cag caa gtg cca ggg ttt gat gag tgg ctg 3316 Asn Asp Ile Ile Ser Gln Gln Val Pro Gly Phe Asp Glu Trp Leu 1000 1005 1010 tgg gtg ctg gcg tat ccg ggg att aaa gtc tcg acg gca gaa gcc 3361 Trp Val Leu Ala Tyr Pro Gly Ile Lys Val Ser Thr Ala Glu Ala 1015 1020 1025 agg gct att tta ccg gcg cag tat cgc cgc cag gat tgc att gcg 3406 Arg Ala Ile Leu Pro Ala Gln Tyr Arg Arg Gln Asp Cys Ile Ala 1030 1035 1040 cac ggg cga cat ctg gca ggc ttc att cac gcc tgc tat tcc cgt 3451 His Gly Arg His Leu Ala Gly Phe Ile His Ala Cys Tyr Ser Arg 1045 1050 1055 cag cct gag ctt gcc gcg aag ctg atg aaa gat gtt atc gct gaa 3496 Gln Pro Glu Leu Ala Ala Lys Leu Met Lys Asp Val Ile Ala Glu 1060 1065 1070 ccc tac cgt gaa cgg tta ctg cca ggc ttc cgg cag gcg cgg cag 3541 Pro Tyr Arg Glu Arg Leu Leu Pro Gly Phe Arg Gln Ala Arg Gln 1075 1080 1085 gcg gtc gcg gaa atc ggc gcg 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Glu Tyr Gly 1510 1515 1520 ttg ttc ctc ggc acc gcg cat ccg gcg aaa ttt aaa gag agc gtg 4891 Leu Phe Leu Gly Thr Ala His Pro Ala Lys Phe Lys Glu Ser Val 1525 1530 1535 gaa gcg att ctc ggt gaa acg ttg gat ctg cca aaa gag ctg gca 4936 Glu Ala Ile Leu Gly Glu Thr Leu Asp Leu Pro Lys Glu Leu Ala 1540 1545 1550 gaa cgt gct gat tta ccc ttg ctt tca cat aat ctg ccc gcc gat 4981 Glu Arg Ala Asp Leu Pro Leu Leu Ser His Asn Leu Pro Ala Asp 1555 1560 1565 ttt gct gcg ttg cgt aaa ttg atg atg aat cat cag taa aatctattca 5030 Phe Ala Ala Leu Arg Lys Leu Met Met Asn His Gln 1570 1575 ttatctcaat 5040 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Lys Arg Ile Ser Thr Thr Ile Thr Thr Thr Ile Thr Ile Thr Thr 1 5 10 15 Gly Asn Gly Ala Gly 20 <210> 3 <211> 820 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 3 Met Arg Val Leu Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Ala Glu Arg 1 5 10 15 Phe Leu Arg Val Ala Asp Ile Leu Glu Ser Asn Ala Arg Gln Gly Gln 20 25 30 Val Ala Thr Val Leu Ser Ala Pro Ala Lys Ile Thr Asn His Leu Val 35 40 45 Ala Met Ile Glu Lys Thr Ile Ser Gly Gln Asp Ala Leu Pro Asn Ile 50 55 60 Ser Asp Ala Glu Arg Ile Phe Ala Glu Leu Leu Thr Gly Leu Ala Ala 65 70 75 80 Ala Gln Pro Gly Phe Pro Leu Ala Gln Leu Lys Thr Phe Val Asp Gln 85 90 95 Glu Phe Ala Gln Ile Lys His Val Leu His Gly Ile Ser Leu Leu Gly 100 105 110 Gln Cys Pro Asp Ser Ile Asn Ala Ala Leu Ile Cys Arg Gly Glu Lys 115 120 125 Met Ser Ile Ala Ile Met Ala Gly Val Leu Glu Ala Arg Gly His Asn 130 135 140 Val Thr Val Ile Asp Pro Val Glu Lys Leu Leu Ala Val Gly His Tyr 145 150 155 160 Leu Glu Ser Thr Val Asp Ile Ala Glu Ser Thr Arg Arg Ile Ala Ala 165 170 175 Ser Arg Ile Pro Ala Asp His Met Val Leu Met Ala Gly Phe Thr Ala 180 185 190 Gly Asn Glu Lys Gly Glu Leu Val Val Leu Gly Arg Asn Gly Ser Asp 195 200 205 Tyr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Cys Leu Arg Ala Asp Cys Cys Glu 210 215 220 Ile Trp Thr Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Cys Asp Pro Arg Gln Val 225 230 235 240 Pro Asp Ala Arg Leu Leu Lys Ser Met Ser Tyr Gln Glu Ala Met Glu 245 250 255 Leu Ser Tyr Phe Gly Ala Lys Val Leu His Pro Arg Thr Ile Thr Pro 260 265 270 Ile Ala Gln Phe Gln Ile Pro Cys Leu Ile Lys Asn Thr Gly Asn Pro 275 280 285 Gln Ala Pro Gly Thr Leu Ile Gly Ala Ser Arg Asp Glu Asp Glu Leu 290 295 300 Pro Val Lys Gly Ile Ser Asn Leu Asn Asn Met Ala Met Phe Ser Val 305 310 315 320 Ser Gly Pro Gly Met Lys Gly Met Val Gly Met Ala Ala Arg Val Phe 325 330 335 Ala Ala Met Ser Arg Ala Arg Ile Ser Val Val Leu Ile Thr Gln Ser 340 345 350 Ser Ser Glu Tyr Ser Ile Ser Phe Cys Val Pro Gln Ser Asp Cys Val 355 360 365 Arg Ala Glu Arg Ala Met Gln Glu Glu Phe Tyr Leu Glu Leu Lys Glu 370 375 380 Gly Leu Leu Glu Pro Leu Ala Val Thr Glu Arg Leu Ala Ile Ile Ser 385 390 395 400 Val Val Gly Asp Gly Met Arg Thr Leu Arg Gly Ile Ser Ala Lys Phe 405 410 415 Phe Ala Ala Leu Ala Arg Ala Asn Ile Asn Ile Val Ala Ile Ala Gln 420 425 430 Gly Ser Ser Glu Arg Ser Ile Ser Val Val Val Asn Asn Asp Asp Ala 435 440 445 Thr Thr Gly Val Arg Val Thr His Gln Met Leu Phe Asn Thr Asp Gln 450 455 460 Val Ile Glu Val Phe Val Ile Gly Val Gly Gly Val Gly Gly Ala Leu 465 470 475 480 Leu Glu Gln Leu Lys Arg Gln Gln Ser Trp Leu Lys Asn Lys His Ile 485 490 495 Asp Leu Arg Val Cys Gly Val Ala Asn Ser Lys Ala Leu Leu Thr Asn 500 505 510 Val His Gly Leu Asn Leu Glu Asn Trp Gln Glu Glu Leu Ala Gln Ala 515 520 525 Lys Glu Pro Phe Asn Leu Gly Arg Leu Ile Arg Leu Val Lys Glu Tyr 530 535 540 His Leu Leu Asn Pro Val Ile Val Asp Cys Thr Ser Ser Gln Ala Val 545 550 555 560 Ala Asp Gln Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Glu Gly Phe His Val Val Thr 565 570 575 Pro Asn Lys Lys Ala Asn Thr Ser Ser Met Asp Tyr Tyr His Gln Leu 580 585 590 Arg Tyr Ala Ala Glu Lys Ser Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Asp Thr Asn 595 600 605 Val Gly Ala Gly Leu Pro Val Ile Glu Asn Leu Gln Asn Leu Leu Asn 610 615 620 Ala Gly Asp Glu Leu Met Lys Phe Ser Gly Ile Leu Ser Gly Ser Leu 625 630 635 640 Ser Tyr Ile Phe Gly Lys Leu Asp Glu Gly Met Ser Phe Ser Glu Ala 645 650 655 Thr Thr Leu Ala Arg Glu Met Gly Tyr Thr Glu Pro Asp Pro Arg Asp 660 665 670 Asp Leu Ser Gly Met Asp Val Ala Arg Lys Leu Leu Ile Leu Ala Arg 675 680 685 Glu Thr Gly Arg Glu Leu Glu Leu Ala Asp Ile Glu Ile Glu Pro Val 690 695 700 Leu Pro Ala Glu Phe Asn Ala Glu Gly Asp Val Ala Ala Phe Met Ala 705 710 715 720 Asn Leu Ser Gln Leu Asp Asp Leu Phe Ala Ala Arg Val Ala Lys Ala 725 730 735 Arg Asp Glu Gly Lys Val Leu Arg Tyr Val Gly Asn Ile Asp Glu Asp 740 745 750 Gly Val Cys Arg Val Lys Ile Ala Glu Val Asp Gly Asn Asp Pro Leu 755 760 765 Phe Lys Val Lys Asn Gly Glu Asn Ala Leu Ala Phe Tyr Ser His Tyr 770 775 780 Tyr Gln Pro Leu Pro Leu Val Leu Arg Gly Tyr Gly Ala Gly Asn Asp 785 790 795 800 Val Thr Ala Ala Gly Val Phe Ala Asp Leu Leu Arg Thr Leu Ser Trp 805 810 815 Lys Leu Gly Val 820 <210> 4 <211> 310 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Met Val Lys Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Ala Asn Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Phe Asp Val Leu Gly Ala Ala Val Thr Pro Val Asp Gly Ala Leu Leu 20 25 30 Gly Asp Val Val Thr Val Glu Ala Ala Glu Thr Phe Ser Leu Asn Asn 35 40 45 Leu Gly Arg Phe Ala Asp Lys Leu Pro Ser Glu Pro Arg Glu Asn Ile 50 55 60 Val Tyr Gln Cys Trp Glu Arg Phe Cys Gln Glu Leu Gly Lys Gln Ile 65 70 75 80 Pro Val Ala Met Thr Leu Glu Lys Asn Met Pro Ile Gly Ser Gly Leu 85 90 95 Gly Ser Ser Ala Cys Ser Val Val Ala Ala Leu Met Ala Met Asn Glu 100 105 110 His Cys Gly Lys Pro Leu Asn Asp Thr Arg Leu Leu Ala Leu Met Gly 115 120 125 Glu Leu Glu Gly Arg Ile Ser Gly Ser Ile His Tyr Asp Asn Val Ala 130 135 140 Pro Cys Phe Leu Gly Gly Met Gln Leu Met Ile Glu Glu Asn Asp Ile 145 150 155 160 Ile Ser Gln Gln Val Pro Gly Phe Asp Glu Trp Leu Trp Val Leu Ala 165 170 175 Tyr Pro Gly Ile Lys Val Ser Thr Ala Glu Ala Arg Ala Ile Leu Pro 180 185 190 Ala Gln Tyr Arg Arg Gln Asp Cys Ile Ala His Gly Arg His Leu Ala 195 200 205 Gly Phe Ile His Ala Cys Tyr Ser Arg Gln Pro Glu Leu Ala Ala Lys 210 215 220 Leu Met Lys Asp Val Ile Ala Glu Pro Tyr Arg Glu Arg Leu Leu Pro 225 230 235 240 Gly Phe Arg Gln Ala Arg Gln Ala Val Ala Glu Ile Gly Ala Val Ala 245 250 255 Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Pro Thr Leu Phe Ala Leu Cys Asp Lys 260 265 270 Pro Glu Thr Ala Gln Arg Val Ala Asp Trp Leu Gly Lys Asn Tyr Leu 275 280 285 Gln Asn Gln Glu Gly Phe Val His Ile Cys Arg Leu Asp Thr Ala Gly 290 295 300 Ala Arg Val Leu Glu Asn 305 310 <210> 5 <211> 428 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 5 Met Lys Leu Tyr Asn Leu Lys Asp His Asn Glu Gln Val Ser Phe Ala 1 5 10 15 Gln Ala Val Thr Gln Gly Leu Gly Lys Asn Gln Gly Leu Phe Phe Pro 20 25 30 His Asp Leu Pro Glu Phe Ser Leu Thr Glu Ile Asp Glu Met Leu Lys 35 40 45 Leu Asp Phe Val Thr Arg Ser Ala Lys Ile Leu Ser Ala Phe Ile Gly 50 55 60 Asp Glu Ile Pro Gln Glu Ile Leu Glu Glu Arg Val Arg Ala Ala Phe 65 70 75 80 Ala Phe Pro Ala Pro Val Ala Asn Val Glu Ser Asp Val Gly Cys Leu 85 90 95 Glu Leu Phe His Gly Pro Thr Leu Ala Phe Lys Asp Phe Gly Gly Arg 100 105 110 Phe Met Ala Gln Met Leu Thr His Ile Ala Gly Asp Lys Pro Val Thr 115 120 125 Ile Leu Thr Ala Thr Ser Gly Asp Thr Gly Ala Ala Val Ala His Ala 130 135 140 Phe Tyr Gly Leu Pro Asn Val Lys Val Val Ile Leu Tyr Pro Arg Gly 145 150 155 160 Lys Ile Ser Pro Leu Gln Glu Lys Leu Phe Cys Thr Leu Gly Gly Asn 165 170 175 Ile Glu Thr Val Ala Ile Asp Gly Asp Phe Asp Ala Cys Gln Ala Leu 180 185 190 Val Lys Gln Ala Phe Asp Asp Glu Glu Leu Lys Val Ala Leu Gly Leu 195 200 205 Asn Ser Ala Asn Ser Ile Asn Ile Ser Arg Leu Leu Ala Gln Ile Cys 210 215 220 Tyr Tyr Phe Glu Ala Val Ala Gln Leu Pro Gln Glu Thr Arg Asn Gln 225 230 235 240 Leu Val Val Ser Val Pro Ser Gly Asn Phe Gly Asp Leu Thr Ala Gly 245 250 255 Leu Leu Ala Lys Ser Leu Gly Leu Pro Val Lys Arg Phe Ile Ala Ala 260 265 270 Thr Asn Val Asn Asp Thr Val Pro Arg Phe Leu His Asp Gly Gln Trp 275 280 285 Ser Pro Lys Ala Thr Gln Ala Thr Leu Ser Asn Ala Met Asp Val Ser 290 295 300 Gln Pro Asn Asn Trp Pro Arg Val Glu Glu Leu Phe Arg Arg Lys Ile 305 310 315 320 Trp Gln Leu Lys Glu Leu Gly Tyr Ala Ala Val Asp Asp Glu Thr Thr 325 330 335 Gln Gln Thr Met Arg Glu Leu Lys Glu Leu Gly Tyr Thr Ser Glu Pro 340 345 350 His Ala Ala Val Ala Tyr Arg Ala Leu Arg Asp Gln Leu Asn Pro Gly 355 360 365 Glu Tyr Gly Leu Phe Leu Gly Thr Ala His Pro Ala Lys Phe Lys Glu 370 375 380 Ser Val Glu Ala Ile Leu Gly Glu Thr Leu Asp Leu Pro Lys Glu Leu 385 390 395 400 Ala Glu Arg Ala Asp Leu Pro Leu Leu Ser His Asn Leu Pro Ala Asp 405 410 415 Phe Ala Ala Leu Arg Lys Leu Met Met Asn His Gln 420 425 <210> 6 <211> 66 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> <222> (1)..(66) <223> leader sequence <400> 6 atgaaacgca ttagcaccac cattaccacc accatcacca ttaccacagg taacggtgcg 60 ggctga 66 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> <222> (1)..(34) <223> attenuator <400> 7 aaaaaagccc gcacctgaca gtgcgggctt tttt 34 <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : XbaI linker for linkage to thrA and attenuater <400> 8 gactctagag tc 12 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : primer for amplifying Escherichia coli leader sequence in thr operon <400> 9 tggttacctg ccgtgagtaa at 22 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : primer for amplifying Escherichia coli leader sequence in thr operon <400> 10 atgttgtgta ctctgtaatt tttatc 26 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : primer for amplifying Escherichia coli leader sequence in thr operon <400> 11 ctctgtaatt tttatctgtc tgtgc 25 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : primer for amplifying Escherichia coli leader sequence in thr operon <400> 12 tttatctgtc tgtgcgctat gcc 23 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : primer for amplifying Escherichia coli leader sequence in thr operon <400> 13 tgtgcgctat gcctatattg g 21 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : primer for amplifying Escherichia coli leader sequence in thr operon <400> 14 gcctatattg gttaa 15

Claims (9)

1. 트레오닌 오페론을 가지며 당해 오페론의 발현이 고유 프로모터에 의해 지시되고, 감쇠가 해제되도록 적어도 리더 서열과 감쇠인자(attenuator)가 당해 오페론으로부터 제거되어진, L-트레오닌 또는 L-이소류신을 생산하는 능력을 갖는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 세균.
2. 제1항에 있어서, 트레오닌 오페론이 플라스미드상에 존재하는 세균.
3. 제1항에 있어서, 트레오닌 오페론이 염색체상에 존재하는 세균.
4. 제1항에 있어서, L-이소류신을 생산하는 능력을 갖고, L-이소류신-생합성 효소의 활성이 증강된 세균.
5. 감쇠 관여 영역, 고유 프로모터 및 thrABC 구조 유전자를 포함하고, 적어도 리더 서열과 감쇠인자 서열이 당해 감쇠 관여 영역으로부터 제거되어진 트레오닌 오페론.
6. 제5항에 있어서, 적어도 뉴클레오타이드 번호 188 내지 310에 상응하는 서열이 결실된 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 트레오닌 오페론.
7. 제5항에 있어서, 적어도 뉴클레오타이드 번호 168 내지 310에 상응하는 서열이 결실된 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 트레오닌 오페론.
8. 제5항에 있어서, 적어도 뉴클레오타이드 번호 148 내지 310에 상응하는 서열이 결실된 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 트레오닌 오페론.
9. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 따른 세균을 배지에서 배양하고, 상기 배지로부터 축적된 L-트레오닌 또는 L-이소류신을 수거함을 포함하는, L-트레오닌 또는 L-이소류신의 생산방법.

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