JP2003204788A - 発酵法による目的物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｌ−アミノ酸、抗生物質、ビタミン、成長因
子、生理活性物質などの目的物質を微生物を利用して製
造する方法において、従来の方法と異なる原理によって
目的物質の生産性を改善する方法を提供する。 【解決手段】 微生物を培地中に培養し、該培地中に目
的物質を生成蓄積させ、該目的物質を採取する、微生物
を利用した目的物質の製造法において、前記微生物とし
て、定常期に特異的に機能するσ因子が変異又は欠損し
た変異株又は組換え株を用いることにより、目的物質の
生産性を改善する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物を利用した
目的物質の製造法に関し、詳しくは、Ｌ−アミノ酸、抗
生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質などの目的
物質を微生物を利用して製造する方法において、目的物
質の生産性を改善するための手段を開示するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】微生物を利用した物質の製造法の代表的
なものとして発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法が知ら
れている。Ｌ−アミノ酸は、調味料や、食品として用い
られるだけでなく、医療を目的とする様々な栄養混合物
のコンポーネントとして利用される。さらに、動物用飼
料添加物として、製薬業および化学工業における試薬と
して、微生物によるＬ−リジンやＬ−ホモセリンなどの
Ｌ−アミノ酸産生のための成長因子として利用される。
発酵法によってＬ−アミノ酸を製造できる微生物として
は、コリネ型細菌、エシェリヒア属細菌、バチルス属細
菌、セラチア属細菌等が知られている。

【０００３】発酵法によってＬ−アミノ酸を製造するに
は、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から
誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の
薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用い
る方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持
った株を用いる方法等がある。

【０００４】さらに近年はＬ−アミノ酸の発酵生産に、
組換えＤＮＡ技術を用いることが行われてきた。この技
術ではＬ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子を
増強することにより宿主微生物のＬ−アミノ酸生合成系
を強化することを、その原理としている。これらの事情
については例えば「アミノ酸発酵 学会出版センター１
９８６年」に解説されている。

【０００５】また、Ｌ−アミノ酸以外にも微生物を用い
た発酵法で生産されている物質は多い。例えば抗生物質
や、ビタミン等もその例である。これらの物質の発酵生
産においても、組換えＤＮＡ技術の利用は、目的物質又
はその前駆体の生合成系酵素をコードする遺伝子の増強
が主なものである。

【０００６】上記のような微生物の育種技術により、目
的物質の生産性は著しく改善されてきている。一方、微
生物の培養においてその生育は、増殖期を経た後、定常
期に至る。定常期においては増殖と死滅が平衡となるた
め、目的物質の生産効率は増殖期に比べて通常低下す
る。そこで、生産効率を向上させるために、培地や培養
方法等の培養条件に関する検討が種々行われている。ま
た、定常期に特異的に機能するσ（シグマ）因子を欠損
したエシェリヒア・コリが知られている（Mulvey, M.R.
et al., Gene, 73, 337-345 (19 )）が、σ因子と目
的物質の生産性との関係については、検討がなされてい
ない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｌ−アミノ
酸、抗生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質など
の目的物質を微生物を利用して製造する方法において、
従来の方法と異なる原理によって目的物質の生産性を改
善する方法を提供することを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を行った結果、定常期に特異的
に機能するσ因子を欠損した変異株又は組換え株を用い
ると、目的物質の生産性が向上することを見出し、本発
明を完成するに至った。

【０００９】すなわち本発明は、 （１）微生物を培地中に培養し、該培地中に目的物質を
生成蓄積させ、該目的物質を採取する、微生物を利用し
た目的物質の製造法において、前記微生物は、定常期に
特異的に機能するσ因子が弱化又は欠損した変異株又は
組換え株であることを特徴とする方法； （２）前記微生物は、ｋａｔＦ遺伝子が変異又は破壊さ
れたことにより定常期に特異的に機能するσ因子を欠損
したことを特徴とする（１）の方法； （３）前記目的物質がＬ−アミノ酸である（１）の方
法； （４）前記微生物がエシェリヒア属細菌又はコリネ型細
菌である（１）の方法；

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明により製造される目的物質は、微生物によって生
産され得る物質であれば特に制限されず、例えばＬ−ス
レオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ロイシ
ン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−フェニルアラ
ニン等の種々のＬ−アミノ酸が挙げられる。その他に
も、グアニル酸、イノシン酸等の核酸類、ビタミン類、
抗生物質、成長因子、生理活性物質など、微生物により
生合成される物質が挙げられる。また、現在微生物を利
用して生産されていない物質であっても、微生物によっ
て生産され得るものであれば本願発明が利用できること
はいうまでもない。

【００１１】本発明に用いる微生物は特に制限されず、
従来発酵法による有用物質の生産に用いられている微生
物であれば使用することができる。また、従来、産業上
利用されていない微生物であっても、目的物質を生産す
る能力を有する限り、本発明を適用することができる。
本発明の微生物は、本来目的物質を生産する能力を有す
るものであってもよいし、変異法や組換えＤＮＡ技術な
どを利用した育種により目的物質を生産する能力を付与
されたものであってもよい。

【００１２】具体的には、エシェリヒア・コリ等のエシ
ェリヒア属細菌、ブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタム等のコリネ型細菌、バチルス・サブチリス等のバ
チルス属細菌、セラチア・マルセッセンス等のセラチア
属細菌等が挙げられるが、これらに制限されない。

【００１３】より具体的には以下の菌株が挙げられる。
例えば目的物質がＬ−スレオニンの場合はエシェリヒア
・コリVKPM B-3996(RIA 1867)(米国特許第5,175,107号
参照）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム A
J12318（FERM BP-1172)(米国特許第5,188,949号参照）
等であり、Ｌ−リジンの場合はエシェリヒア・コリ AJ1
1442（NRRL B-12185, FERM BP-1543)(米国特許第4,346,
170号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タム AJ3990（ATCC31269)(米国特許第4,066,501号参
照）等であり、Ｌ−グルタミン酸の場合はエシェリヒア
・コリ AJ12624 (FERM BP-3853)(フランス特許出願公開
第2,680,178号参照）、エシェリヒア・コリAJ13199（FE
RM P-15573)(特開平7-203980号参照)、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムAJ12475（FERM BP-2922)
(米国特許第5,272,067号参照）等であり、Ｌ−ロイシン
の場合はエシェリヒア・コリ AJ11478（FERM P-5274)
(特公昭 62-34397号参照）、ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム AJ3718（FERM P-2516)(米国特許第3,
970,519号参照）等であり、Ｌ−イソロイシンの場合は
エシェリヒア・コリKX141（VKPM B-4781）(欧州特許出
願公開第519,113号参照）、ブレビバクテリウム・フラ
バム AJ12149（FERM BP-759)(米国特許第4,656,135号参
照）等であり、Ｌ−バリンの場合はエシェリヒア・コリ
VL1970（VKPM B-4411)）(欧州特許出願公開第519,113
号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
AJ12341（FERM BP-1763)(米国特許第5,188,948号参
照）等であり、Ｌ−フェニルアラニンの場合は、エシェ
リヒア・コリ AJ12604（FERM BP-3579)(欧州特許出願公
開第 488,424号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタムAJ12637（FERM BP-4160)(フランス特許出
願公開第 2,686,898号参照）等である。

【００１４】本発明に用いる微生物は、目的物質の産生
能を有し、かつ、定常期に特異的に機能するσ因子を欠
損した変異株又は組換えである。σ因子は、ＲＮＡポリ
メラーゼを構成するサブユニットの一つであり、ＲＮＡ
ポリメラーゼのコア酵素に結合してホロ酵素が形成され
ると、ホロ酵素は遺伝子のプロモーターを認識すること
ができる。「定常期に特異的に機能するσ因子を欠損し
た」とは、細胞内で同σ因子が産生されない場合、及
び、産生されてもプロモーターを認識する活性を有しな
い場合を含む。エシェリヒア・コリでは、定常期に特異
的に機能するσ因子（以下、「RpoS」ともいう。）は、
katF遺伝子（rpoS遺伝子とも呼ばれている）によりコー
ドされており、その塩基配列は明らかにされている（Mu
lvey, M.R. et al., Nucleic Acids Res., 17 (23), 99
79-9991 (1989)、GenBank/EMBL/DDBJ Accession AF0828
44）。エシェリヒア・コリ K-12株のkatF遺伝子の塩基
配列及びコードするアミノ酸配列を、配列表の配列番号
３及び４に示す。RpoSを欠損した株は、活性を有するRp
oSを発現しないように、katF遺伝子を破壊し、又は同遺
伝子に変異を起こさせることによって、取得することが
できる。

【００１５】本発明に用いる変異株は、微生物の野生株
又は目的物質の生産に好ましい変異を有する変異株を変
異処理し、活性を有するRpoSを産生しない変異株を選択
することによって得られる。RpoSを産生しない変異株で
あっても、目的物質の生合成系が完全でないものは、本
発明に用いる微生物として好ましくない。変異処理とし
ては、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニ
トロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異
処理に用いられている変異剤によって微生物を処理する
方法が挙げられる。

【００１６】また、本発明に用いる組換え株は、相同組
換えによる遺伝子破壊によって創製することができる。
定常期に特異的に機能するσ因子をコードする遺伝子
（katF）の５’末端部及び／又は３’末端部を欠失し、
正常に機能しないように改変したkatF遺伝子を含むＤＮ
Ａで微生物を形質転換し、改変したkatF遺伝子と染色体
上のkatF遺伝子との間で組換えを起こさせることによ
り、染色体上のkatF遺伝子を破壊することができる。こ
のような相同組換えによる遺伝子破壊は既に確立してお
り、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製制御領域
を含むプラスミドを用いる方法などによっても遺伝子破
壊を行うことができる。以下に温度感受性複製制御領域
を含むプラスミドを用いる方法を説明する。

【００１７】katF遺伝子の内部を欠失し、正常に機能し
ないように改変した遺伝子（欠失型遺伝子）を含むＤＮ
Ａで微生物を形質転換し、欠失型遺伝子と染色体上の排
出系遺伝子との間で組換えを起こさせることにより、染
色体上のkatF遺伝子を破壊することができる。欠失型遺
伝子を、宿主染色体上のkatF遺伝子と置換するには以下
のようにすればよい。すなわち、温度感受性複製制御領
域と欠失型遺伝子とクロラムフェニコール等の薬剤に耐
性を示すマーカー遺伝子とを挿入して組換えＤＮＡを調
製し、この組換えＤＮＡで微生物を形質転換し、温度感
受性複製制御領域が機能しない温度で形質転換株を培養
し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養することによ
り、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転
換株が得られる。

【００１８】こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込ま
れた株は、染色体上にもともと存在するkatF遺伝子配列
との組換えを起こし、染色体上のkatF遺伝子と欠失型遺
伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベ
クター部分、温度感受性複製制御領域及び薬剤耐性マー
カー）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。したが
って、この状態では正常なkatF遺伝子が優性であるの
で、形質転換株は活性を有するRpoSを産生する。

【００１９】次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型遺伝子のみ
を残すために、２個のkatF遺伝子の組換えにより１コピ
ーのkatF遺伝子を、ベクター部分（温度感受性複製制御
領域及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体ＤＮ
Ａから脱落させる。その際、正常なkatF遺伝子が染色体
ＤＮＡ上に残され、欠失型遺伝子が切り出される場合
と、反対に欠失型遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、正
常なkatF遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場
合も、温度感受性複製制御領域が機能する温度で培養す
れば、切り出されたＤＮＡはプラスミド状で細胞内に保
持される。次に、温度感受性複製制御領域が機能しない
温度で培養すると、欠失型遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残
された場合は、正常なkatF遺伝子を含むプラスミドが細
胞から脱落するためRpoSは活性を有しないが、正常なka
tF遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残された場合はRpoSが機能
する。したがって、非許容温度で薬剤感受性の菌株の染
色体の遺伝子構造をＰＣＲで調べることにより、目的と
する遺伝子破壊株を選択することができる。

【００２０】尚、上記のようにしてkatF遺伝子を破壊し
た後は、遺伝子破壊株にｒｅｃＡ^-を導入しておくと、
低温で培養中にプラスミド上のkarF遺伝子が染色体へ再
び組み込まれるのを防ぐことができる点で好ましい。

【００２１】エシェリヒア・コリのkatF遺伝子は、例え
ば、エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配
列表の配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとするポリメラーゼ・チェイ
ン・ターミネーション法（ＰＣＲ：polymerase chain r
eaction； White,T.J. et al., Trends Genet., 5,185
(1989)参照）によって取得することができる。

【００２２】温度感受性プラスミドとしては、エシェリ
ヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌で機能するものとし
ては、ｐＨＳＧ４１５及びｐＨＳＧ４２２（Hashimoto-
Gotoh, T. et al, Gene, 16, 227-235 (1981)）が、ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型
細菌で機能するものとしては、ｐＨＳ４、ｐＨＳ２２、
ｐＨＳ２３が挙げられる。また、ｐＨＳ４から切り出し
たコリネ型細菌由来の複製制御領域を含むＤＮＡ断片
を、エシェリヒア・コリ用のベクターであるｐＨＳＧ３
９８に接続して得られたプラスミドｐＨＳＣ４も、同様
に温度感受性プラスミドとして本発明に使用することが
できる。ｐＨＳＣ４は、コリネ型細菌、及びエシェリヒ
ア・コリ中で自律増殖して、宿主にクロラムフェニコー
ル耐性を付与する。ｐＨＳＣ４を保持するエシェリヒア
・コリＡＪ１２５７１は、１９９０年１０月１１日に通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１１７６３として寄託され、１９９１年
８月２６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管さ
れ、ＦＥＲＭ ＢＰ−３５２４の受託番号で寄託されて
いる。

【００２３】これらのうち、エシェリヒア・コリ用の温
度感受性ププラスミドは、エシェリヒア・コリ細胞中に
おいて、約２５〜３７℃では自律増殖できるが、約４２
℃以上では自律増殖できない。また、コリネ型細菌用温
度感受性プラスミドは、コリネ型細菌細胞中において、
約１０〜３２℃では自律増殖できるが、約３４℃以上で
は自律増殖できない。温度感受性複製制御領域を有する
ＤＮＡ断片は、例えば、上記ｐＨＳＧ４１５をBalIで切
り出すことによって、又はｐＨＳＣ４をＢａｍＨＩとＫ
ｐｎＩで切り出すことによって得られる。

【００２４】尚、上記の各々のプラスミドの構築及びそ
の温度感受性複製制御領域を含む領域の塩基配列は、特
公平７−１０８２２８号公報に記載されている。染色体
ＤＮＡの調製、遺伝子断片とプラスミドとの連結、ＰＣ
Ｒ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、
形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチド
の設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方
法を採用することができる。これらの方法は、Sambroo
k, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecula
r Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Co
ldSpring Harbor Laboratory Press (1989)等に記載さ
れている。

【００２５】上記のようにして得られるkatF遺伝子が破
壊された微生物は、RpoSを欠損しているので、katFが正
常に機能する株に比べて増殖期が長くなり、その結果、
目的物質の生産生が向上する。

【００２６】本発明の微生物は、本発明の効果が損なわ
れない限り、RpoSを欠損していることに加えて、目的物
質の生合成系酵素が増強されているなど、他の性質が付
与されていてもよい。また、本発明の微生物は、目的物
質の生合成経路から分岐して目的物質以外の化合物を生
成する反応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損し
ていてもよい。さらに、本発明の微生物は、目的物質の
生産にとって好ましい他の性質が付与されていてもよ
い。

【００２７】上記のようにして目的物質の生産能が向上
した微生物を培地中に培養し、該培地中に目的物質を生
成蓄積せしめ、該培養物から目的物質を採取することに
より、目的物質を製造することができる。培養に用いる
培地や培養条件は、用いる宿主に応じて適宜選択すれば
よい。

【００２８】上記のようにして製造される目的物質は、
必要に応じて、菌体抽出液又は培地からイオン交換クロ
マトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着ク
ロマトグラフィー、溶媒沈殿等、通常の目的物質の精製
法を用いて精製することができる。

【００２９】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００３０】＜１＞エシェリヒア・コリＬ−グルタミン
酸生産菌のkatF遺伝子破壊株の創製 E. coli AJ13199株の全ゲノムＤＮＡを、斎藤、三浦の
方法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619(1963)）により調
製した。エシェリヒア・コリAJ13199株（特開平7-20398
0号参照）は、ＤＬ−アスパラギン酸βヒドロキサメー
ト耐性株であり、工業技術院生命工学工業技術研究所
（郵便番号305-8566日本国茨城県つくば市東一丁目１番
３号）に受託番号FERM P-15573として寄託されている。
一方、公知のkatF遺伝子の塩基配列に基づいて、配列番
号１及び２に示す配列を有する２種のプライマーを作製
した。これらを用いてＰＣＲ反応を行い、katF遺伝子の
増幅を行った。得られたＤＮＡを、ベクターpHSG399
（宝酒造(株)製）のEcoRI部位に挿入し、プラスミドp39
9RPOSを得た。

【００３１】上記プラスミドp399RPOSを制限酵素AvaII
で完全に切断した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてセル
フライゲーションを行い、katF遺伝子の内部を欠失さ
せ、p399ΔRPOSを得た。次に、p399ΔRPOSの欠失型KatF
遺伝子を、エシェリヒア・コリで自律複製可能なプラス
ミドから取得した自己複製能が温度感受性になった変異
型の複製起点を持つプラスミドpHSG415に導入した。具
体的には、p399RPOSをEcoRIで消化し、得られた欠失型K
atF遺伝子を含む断片を、プラスミドpHSG415（Hashimot
o-Gotoh, T. et al, Gene, 16, 227-235 (1981)）のEco
RI部位に挿入し、p415ΔRPOSを作製した。

【００３２】このプラスミドを用いて、エシェリヒア・
コリのＬ−グルタミン酸生産菌であるエシェリヒア・コ
リAJ13199株を形質転換し、染色体上のkatF遺伝子を欠
失型に置換した。具体的には、プラスミドが導入された
AJ13199／p415ΔRPOSをＬＢ培地（バクトトリプトン10
g、バクトイーストエクストラクト5g、NaCl 5gを１Ｌの
水に含む）で２５℃にて６時間振とう培養した後、２５
μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上に撒
き、４２℃で培養して形成したコロニーをプラスミド組
み込み株として取得した。次に、この株から４２℃でカ
ナマイシンに対して感受性になった株をレプリカ法によ
り取得した。この感受性株から染色体上のkatF遺伝子の
塩基配列を調べ、同遺伝子が欠失型に置換されているこ
とを確認し、これをΔRpoS株と命名した。

【００３３】＜３＞katF破壊株によるＬ−グルタミン酸
の生産 AJ13199株（形質転換株）及びAJ13199/ΔRpoS株を、Ｌ
−グルタミン酸生産培地（組成：グルコース４０．０ｇ
／Ｌ、硫酸マグネシウム（別殺菌）１．０ｇ／Ｌ、硫酸
アンモニウム２０．０ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム
１．０ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄７水和物１０．０ｍｇ／Ｌ、
硫酸マンガン５水和物１０．０ｍｇ／Ｌ、バクトイース
トエキストラクト２．０ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０．
０ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム（乾熱殺菌）５０．０ｇ／
Ｌ、ｐＨ７．０（ＫＣｌで調整））で３７℃、残糖がな
くなるまで培養し、培地中のＬ−グルタミン酸の量を旭
化成（株）製バイオテックアナライザーAS-210により測
定した。また、培養後の培地の620nmにおける吸光度（O
D₆₂₀）を測定した。これらの結果を表１に示す。

【００３４】

【表１】 ───────────────────────────── 菌株 L-ク゛ルタミン酸(g/L) OD₆₂₀ 培養時間（h） ───────────────────────────── AJ13199 19.8 0.76 40 ΔRpoS 20.1 0.90 30 ─────────────────────────────

【００３５】

【発明の効果】本発明により、目的物質を産生する微生
物の増殖期を延長させることができ、その結果、目的物
質の生産性を向上させることができる。

【００３６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.） <120> 発酵法による目的物質の製造法 <130> P-6309 <141> 1999-07-19 <160> 4

【００３７】 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 1 gcgcgaattc atgagtcaga atacgctg 28

【００３８】 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 2 gcgcgaattc ggtaatgcgc tcgttaag 28

【００３９】 <210> 3 <211> 1475 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (287)..(1372) <400> 3 cgaccgcaga tggccgcgtt gtttatgctg gtaacgcgct gcgcggctac ggtaatctga 60 ttatcatcaa acataatgat gattacctga gtgcctacgc ccataacgac acaatgctgg 120 tccgggaaca acaagaagtt aaggcggggc aaaaaatagc gaccatgggt agcaccggaa 180 ccagttcaac acgcttgcat tttgaaattc gttacaaggg gaaatccgta aacccgctgc 240 gttatttgcc gcagcgataa atcggcggaa ccaggctttt gcttga atg ttc cgt 295 Met Phe Arg 1 caa ggg atc acg ggt agg agc cac ctt atg agt cag aat acg ctg aaa 343 Gln Gly Ile Thr Gly Arg Ser His Leu Met Ser Gln Asn Thr Leu Lys 5 10 15 gtt cat gat tta aat gaa gat gcg gaa ttt gat gag aac gga gtt gag 391 Val His Asp Leu Asn Glu Asp Ala Glu Phe Asp Glu Asn Gly Val Glu 20 25 30 35 gtt ttt gac gaa aag ccg tta gta gaa cag gaa ccc agt gat aac gat 439 Val Phe Asp Glu Lys Pro Leu Val Glu Gln Glu Pro Ser Asp Asn Asp 40 45 50 ttg gcc gaa gag gaa ctg tta tcg cag gga gcc aca cag cgt gtg ttg 487 Leu Ala Glu Glu Glu Leu Leu Ser Gln Gly Ala Thr Gln Arg Val Leu 55 60 65 gac gcg act cag ctt tac ctt ggt gag att ggt tat tca cca ctg tta 535 Asp Ala Thr Gln Leu Tyr Leu Gly Glu Ile Gly Tyr Ser Pro Leu Leu 70 75 80 acg gcc gaa gaa gaa gtt tat ttt gcg cgt cgc gca ctg cgt gga gat 583 Thr Ala Glu Glu Glu Val Tyr Phe Ala Arg Arg Ala Leu Arg Gly Asp 85 90 95 gtc gcc tct cgc cgc cgg atg atc gag agt aac ttg cgt ctg gtg gta 631 Val Ala Ser Arg Arg Arg Met Ile Glu Ser Asn Leu Arg Leu Val Val 100 105 110 115 aaa att gcc cgc cgt tat ggc aat cgt ggt ctg gcg ttg ctg gac ctt 679 Lys Ile Ala Arg Arg Tyr Gly Asn Arg Gly Leu Ala Leu Leu Asp Leu 120 125 130 atc gaa gag ggc aac ctg ggg ctg atc cgc gcg gta gag aag ttt gac 727 Ile Glu Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys Phe Asp 135 140 145 ccg gaa cgt ggt ttc cgc ttc tca aca tac gca acc tgg tgg att cgc 775 Pro Glu Arg Gly Phe Arg Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg 150 155 160 cag acg att gaa cgg gcg att atg aac caa acc cgt act att cgt ttg 823 Gln Thr Ile Glu Arg Ala Ile Met Asn Gln Thr Arg Thr Ile Arg Leu 165 170 175 ccg att cac atc gta aag gag ctg aac gtt tac ctg cga acc gca cgt 871 Pro Ile His Ile Val Lys Glu Leu Asn Val Tyr Leu Arg Thr Ala Arg 180 185 190 195 gag ttg tcc cat aag ctg gac cat gaa cca agt gcg gta gag atc gca 919 Glu Leu Ser His Lys Leu Asp His Glu Pro Ser Ala Val Glu Ile Ala 200 205 210 gag caa ctg gat aag cca gtt gat gac gtc agc cgt atg ctt cgt ctt 967 Glu Gln Leu Asp Lys Pro Val Asp Asp Val Ser Arg Met Leu Arg Leu 215 220 225 aac gag cgc att acc tcg gta gac acc ccg ctg ggt ggt gat tcc gaa 1015 Asn Glu Arg Ile Thr Ser Val Asp Thr Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu 230 235 240 aaa gcg ttg ctg gac atc ctg gcc gat gaa aaa gag aac ggt ccg gaa 1063 Lys Ala Leu Leu Asp Ile Leu Ala Asp Glu Lys Glu Asn Gly Pro Glu 245 250 255 gat acc acg caa gat gac gat atg aag cag agc atc gtc aaa tgg ctg 1111 Asp Thr Thr Gln Asp Asp Asp Met Lys Gln Ser Ile Val Lys Trp Leu 260 265 270 275 ttc gag ctg aac gcc aaa cag cgt gaa gtg ctg gca cgt cga ttc ggt 1159 Phe Glu Leu Asn Ala Lys Gln Arg Glu Val Leu Ala Arg Arg Phe Gly 280 285 290 ttg ctg ggg tac gaa gcg gca aca ctg gaa gat gta ggt cgt gaa att 1207 Leu Leu Gly Tyr Glu Ala Ala Thr Leu Glu Asp Val Gly Arg Glu Ile 295 300 305 ggc ctc acc cgt gaa cgt gtt cgc cag att cag gtt gaa ggc ctg cgc 1255 Gly Leu Thr Arg Glu Arg Val Arg Gln Ile Gln Val Glu Gly Leu Arg 310 315 320 cgt ttg cgc gaa atc ctg caa acg cag ggg ctg aat atc gaa gcg ctg 1303 Arg Leu Arg Glu Ile Leu Gln Thr Gln Gly Leu Asn Ile Glu Ala Leu 325 330 335 tta ccg cga gta agt aag cat ctg tca gaa agg cca gtc tca agc gag 1351 Leu Pro Arg Val Ser Lys His Leu Ser Glu Arg Pro Val Ser Ser Glu 340 345 350 355 gct ggt ttt ttc tgt gca caa taaaaggtcc gaatgcccat cggacctttt 1402 Ala Gly Phe Phe Cys Ala Gln 360 tattaaggtc aaattaccgc ccatacgcac acaggtaatt aagaatccgg taaaaccgag 1462 aatggtcgtt aac 1475

【００４０】 <210> 4 <211> 362 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Met Phe Arg Gln Gly Ile Thr Gly Arg Ser His Leu Met Ser Gln Asn 1 5 10 15 Thr Leu Lys Val His Asp Leu Asn Glu Asp Ala Glu Phe Asp Glu Asn 20 25 30 Gly Val Glu Val Phe Asp Glu Lys Pro Leu Val Glu Gln Glu Pro Ser 35 40 45 Asp Asn Asp Leu Ala Glu Glu Glu Leu Leu Ser Gln Gly Ala Thr Gln 50 55 60 Arg Val Leu Asp Ala Thr Gln Leu Tyr Leu Gly Glu Ile Gly Tyr Ser 65 70 75 80 Pro Leu Leu Thr Ala Glu Glu Glu Val Tyr Phe Ala Arg Arg Ala Leu 85 90 95 Arg Gly Asp Val Ala Ser Arg Arg Arg Met Ile Glu Ser Asn Leu Arg 100 105 110 Leu Val Val Lys Ile Ala Arg Arg Tyr Gly Asn Arg Gly Leu Ala Leu 115 120 125 Leu Asp Leu Ile Glu Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu 130 135 140 Lys Phe Asp Pro Glu Arg Gly Phe Arg Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp 145 150 155 160 Trp Ile Arg Gln Thr Ile Glu Arg Ala Ile Met Asn Gln Thr Arg Thr 165 170 175 Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Val Lys Glu Leu Asn Val Tyr Leu Arg 180 185 190 Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu Asp His Glu Pro Ser Ala Val 195 200 205 Glu Ile Ala Glu Gln Leu Asp Lys Pro Val Asp Asp Val Ser Arg Met 210 215 220 Leu Arg Leu Asn Glu Arg Ile Thr Ser Val Asp Thr Pro Leu Gly Gly 225 230 235 240 Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile Leu Ala Asp Glu Lys Glu Asn 245 250 255 Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gln Asp Asp Asp Met Lys Gln Ser Ile Val 260 265 270 Lys Trp Leu Phe Glu Leu Asn Ala Lys Gln Arg Glu Val Leu Ala Arg 275 280 285 Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala Ala Thr Leu Glu Asp Val Gly 290 295 300 Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg Val Arg Gln Ile Gln Val Glu 305 310 315 320 Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu Gln Thr Gln Gly Leu Asn Ile 325 330 335 Glu Ala Leu Leu Pro Arg Val Ser Lys His Leu Ser Glu Arg Pro Val 340 345 350 Ser Ser Glu Ala Gly Phe Phe Cys Ala Gln 355 360

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【書類名】 受託番号変更届

【整理番号】 Ｐ−６３０９ＪＨ

【提出日】 平成１１年８月２３日

【旧寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所

【旧受託番号】 微工研菌寄第ＦＥＲＭ Ｐ−１
５５７３

【新寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所

【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−５８０７

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 倉橋 修 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA05 AA10 BA71 BA74 CA03 DA05 EA04 GA11 GA19 GA25 GA27 4B064 AE03 AE19 CA02 CA19 CC01 CC24 DA01 DA10 DA11

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 微生物を培地中に培養し、該培地中に目
   的物質を生成蓄積させ、該目的物質を採取する、微生物
   を利用した目的物質の製造法において、 前記微生物は、定常期に特異的に機能するσ因子が弱化
   または欠損した変異株又は組換え株であることを特徴と
   する方法。
2. 【請求項２】 前記微生物は、ｋａｔＦ遺伝子が変異又
   は破壊されたことにより定常期に特異的に機能するσ因
   子を欠損したことを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 前記目的物質がＬ−アミノ酸である請求
   項１記載の方法。
4. 【請求項４】 前記微生物がエシェリヒア属細菌又はコ
   リネ型細菌である請求項１記載の方法。