JP5407124B2 - Ｌ−グルタミン酸生産細菌及びｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents
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Description
本発明は、Ｌ−グルタミン酸生産細菌及びＬ−グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として広く用いられている。
Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（例えば、非特許文献１参照）。その他の菌株を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物（例えば、特許文献１参照）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物（例えば、特許文献２参照）、バチルス属、シュードモナス属、セラチア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）等の微生物（例えば、特許文献３参照）、エシェリヒア・コリの変異株（例えば、特許文献４参照）等を用いる方法が知られている。また、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントテア属、エンテロバクター属に属する微生物を用いたＬ−グルタミン酸の製造法も開示されている（例えば、特許文献５〜７参照）。また、これまでにrpoS遺伝子欠損により、エシェリヒア属細菌やコリネ型細菌のL−グルタミン酸生産能が向上することが知られている（特許文献８）。
rpoS遺伝子によりコードされるRpoSタンパク質（シグマSファクター）は、定常期特異的シグマ因子として以外にも、様々なストレスに応答して種々の遺伝子発現を制御するシグマ因子として知られる。シグマSファクターは特に耐酸性能の獲得に中心的な役割を担っており、rpoS遺伝子の欠損株では酸性条件における生存率が劇的に低下することが報告されている（Mol Microbiol. 1995 Jul;17(1):155-67.）。一方、微生物の耐酸性については、酸性条件での生存率に着目した研究が主流であり、酸性条件での生育に関する報告はほとんどなく、rpoS欠損株の酸性条件における生育に関しても、これまで調べられていなかった。
米国特許第３，２２０，９２９号明細書
米国特許第３，５６３，８５７号明細書
特公昭３２−９３９３号公報
特開平５−２４４９７０号公報
特開２０００−１０６８６９号公報
特開２０００−１８９１６９号公報
特開２０００−１８９１７５号公報
国際公開ＷＯ０１／０５９３９号パンフレット
明石邦彦ら著 アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年
本発明は、Ｌ−グルタミン酸を効率よく生産することのできる細菌を提供すること、及び該細菌を用いてＬ−グルタミン酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、RNAポリメラーゼのシグマSファクターをコードするrpoS遺伝子を不活化することにより、Ｌ−グルタミン酸
の発酵収率が向上すること、及び、Ｌ−グルタミン酸生産菌の酸性条件での生育が改善することを見出し、本発明を完成するに至った。
の発酵収率が向上すること、及び、Ｌ−グルタミン酸生産菌の酸性条件での生育が改善することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−グルタミン酸生産能を有する、パントエア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、又はエルビニア属に属する細菌であって、遺伝子組換えによりｒｐｏＳ遺伝子を不活化するように改変された細菌。
（２）ｒｐｏＳ遺伝子の発現量を低下させること、またはｒｐｏＳ遺伝子を破壊することにより、ｒｐｏＳ遺伝子が不活化した前記細菌。
（３）ｒｐｏＳ遺伝子が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質をコードする遺伝子である前記細菌：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＲＮＡポリメラーゼのシグマＳファクターの機能を有するタンパク質。
（４）前記ｒｐｏＳ遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、前記細菌：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＲＮＡポリメラーゼのシグマＳファクターの機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（５）前記の細菌を培地中で培養し、該培地中にＬ−グルタミン酸を生成、蓄積せしめ、Ｌ−グルタミン酸を該培地から採取することを特徴とする、Ｌ−グルタミン酸の製造法。（６）前記培養がｐＨ３〜５で行われることを特徴とする、前記方法。
（７）培養中に、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成、蓄積させることを特徴とする前記方法。
（８）遺伝子組換えにより微生物のｒｐｏＳ遺伝子を不活化することにより、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物の酸性条件下での生育を向上させる方法。
（９）前記微生物が、パントエア属、エンテロバクター属、セラチア属、クレブシエラ属、及びエルビニア属からなる群より選択されることを特徴とする前記方法。
（１）Ｌ−グルタミン酸生産能を有する、パントエア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、又はエルビニア属に属する細菌であって、遺伝子組換えによりｒｐｏＳ遺伝子を不活化するように改変された細菌。
（２）ｒｐｏＳ遺伝子の発現量を低下させること、またはｒｐｏＳ遺伝子を破壊することにより、ｒｐｏＳ遺伝子が不活化した前記細菌。
（３）ｒｐｏＳ遺伝子が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質をコードする遺伝子である前記細菌：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＲＮＡポリメラーゼのシグマＳファクターの機能を有するタンパク質。
（４）前記ｒｐｏＳ遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、前記細菌：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に相補的な配列、又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＲＮＡポリメラーゼのシグマＳファクターの機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（５）前記の細菌を培地中で培養し、該培地中にＬ−グルタミン酸を生成、蓄積せしめ、Ｌ−グルタミン酸を該培地から採取することを特徴とする、Ｌ−グルタミン酸の製造法。（６）前記培養がｐＨ３〜５で行われることを特徴とする、前記方法。
（７）培養中に、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成、蓄積させることを特徴とする前記方法。
（８）遺伝子組換えにより微生物のｒｐｏＳ遺伝子を不活化することにより、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物の酸性条件下での生育を向上させる方法。
（９）前記微生物が、パントエア属、エンテロバクター属、セラチア属、クレブシエラ属、及びエルビニア属からなる群より選択されることを特徴とする前記方法。
本発明の微生物を用いることにより、Ｌ−グルタミン酸を効率よく発酵生産することができる。また、rpoS遺伝子を不活化することにより、Ｌ−グルタミン酸生産菌の酸性条件下での生育を向上させることができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明のＬ−グルタミン酸生産細菌
本発明の細菌は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有し、かつ遺伝子組換えによりrpoS遺伝子を不活化するように改変された腸内細菌科に属する細菌である。
＜１＞本発明のＬ−グルタミン酸生産細菌
本発明の細菌は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有し、かつ遺伝子組換えによりrpoS遺伝子を不活化するように改変された腸内細菌科に属する細菌である。
「Ｌ−グルタミン酸生産能」とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、Ｌ−グルタミン酸を細胞又は培地から回収できる程度に、細胞又は培地中に生成、蓄積する能力をいう。Ｌ−グルタミン酸生産能を有する細菌としては、本来的にＬ−グルタミン酸生産能を有するものであってもよいが、以下に示すような細菌を、変異法や組換えDNA技術を利用してＬ−グルタミン酸生産能を有するように改変したものであってもよい。
本発明の腸内細菌科に属する細菌とは、パントエア属、エルビニア属、エンテロバクター属、又はクレブシエラ属に属し、好ましくは低ｐＨ、特にｐＨ３〜５での生育が良好な細菌である。
特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ−プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J Gen Appl Microbiol 1997 Dec;43(6) 355-361、International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997,p1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)等に再分類されているものがある(International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989;39(3).p.337-345, )。また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993;43(1), p.162-173 参照）。
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。
エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。
エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。
パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13601株（FERM BP-7207）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開0952221号明細書にはエンテロバクター・アグロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13601株（FERM BP-7207）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開0952221号明細書にはエンテロバクター・アグロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
エルビニア・アミロボーラ ATCC15580株
エルビニア・カロトボーラ ATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開955368号明細書)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開955368号明細書)
エルビニア・カロトボーラ ATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開955368号明細書)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開955368号明細書)
本発明の微生物は、酸性条件下で培養したときに液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を越える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力（以下、酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能ということがある）を有する微生物であってもよい。このような微生物は、ｒｐｏＳ遺伝子の不活化により、飽和濃度を超える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を獲得した微生物でもよいし、本来的に酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能を有するものであってもよい。また、欧州公開公報1078989号記載の方法により、低ｐＨ環境下でＬ
−グルタミン酸に対する耐性が向上した菌株を取得することにより、飽和濃度を超える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を付与することができる。
−グルタミン酸に対する耐性が向上した菌株を取得することにより、飽和濃度を超える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を付与することができる。
本来的に酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能を有する微生物として具体的には、パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）、及びAJ13601株（FERM BP-7207）（以上、欧州特許出願公開0952221号明細書参照）などが挙げられる。パントエア・アナナティスAJ13356は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号FERM P-16645として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6615が付与されている。AJ13601は、１９９９年８月１８日に経済産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に受託番号FERMP17156として寄託され、２０００年７月６日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。
上述したような細菌にＬ−グルタミン酸生産能を付与する、又は細菌のＬ−グルタミン酸生産能を増強するための改変の方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。
Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」ともいう）、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ（以下、「ＣＳ」ともいう）、メチルクエン酸シンターゼ（以下「ＰＲＰＣ」ともいう）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」ともいう）、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセルムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼなどが挙げられる。これらの酵素の中では、ＣＳ又はＰＲＰＣ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１種以上が好ましく、３種全てがより好ましい。
以下に、目的遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を例示する。
１つ目の方法は、目的遺伝子のコピー数を高める方法である。例えば、目的遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得られたプラスミドを用いて宿主細菌を形質転換することにより、該遺伝子のコピー数を高めることができる。例えば、目的遺伝子としてＣＳをコードする遺伝子（ｇｌｔＡ遺伝子）あるいはＰＲＰＣをコードする遺伝子（prpC遺伝子）、ＰＥＰＣをコードする遺伝子（ｐｐｃ遺伝子）、およびＧＤＨをコードする遺伝子（ｇｄｈＡ遺伝子）を用いる場合、これらの遺伝子はエシェリヒア属細菌、及びコリネバクテリウム属細菌において、既に塩基配列が明らかにされていることから（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２巻、５２４３〜５２４９頁、１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９〜９１６頁、１９８４年；Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３〜１９９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１４０巻、１８１７〜１８２８頁、１９９４年；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２１８巻、３３０〜３３９頁、１９８９年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３１７〜３２６頁、１９９２年）、それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、腸内細菌科に属する細菌から染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが可能である。
形質転換に用いるプラスミドとしては、腸内細菌群に属する細菌の中で自律複製可能な
プラスミド、例えばpUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29（pHSG、pSTVはタカラバイオ社より入手可）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMWはニッポンジーン社より入手可）等が挙げられる。なお、プラスミドの代わりにファージＤＮＡをベクターとして用いてもよい。上記ＣＳ又はＰＲＰＣ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨの活性を同時に増強するためのプラスミドとして、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子及びｇｄｈＡ遺伝子が組み込まれたRSFCPG（欧州特許出願公開第0952221号明細書参照）、及びRSFCPGのｇｌｔＡ遺伝子をｐｒｐＣ遺伝子に置き換えたRSFPPG（実施例参照）が挙げられる。
プラスミド、例えばpUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29（pHSG、pSTVはタカラバイオ社より入手可）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMWはニッポンジーン社より入手可）等が挙げられる。なお、プラスミドの代わりにファージＤＮＡをベクターとして用いてもよい。上記ＣＳ又はＰＲＰＣ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨの活性を同時に増強するためのプラスミドとして、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子及びｇｄｈＡ遺伝子が組み込まれたRSFCPG（欧州特許出願公開第0952221号明細書参照）、及びRSFCPGのｇｌｔＡ遺伝子をｐｒｐＣ遺伝子に置き換えたRSFPPG（実施例参照）が挙げられる。
形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）などが挙げられる。
あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75
1929 (1978)）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、微生物の形質転換を行うこともできる。
あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75
1929 (1978)）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、微生物の形質転換を行うこともできる。
遺伝子のコピー数を高めることは、目的遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー導入することによっても達成できる。微生物の染色体DNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して、相同組換え法（Experimentsin Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)）により行うことができる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。さらに、Muファージを用いる方法（特開平2-109985号）で宿主染色体に目的遺伝子を組み込むこともできる。
２つ目の方法は、染色体DNA上またはプラスミド上において、目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列をより強力なものに置換することによって目的遺伝子の発現を増強させる方法である。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、PRプロモーター、lacUVプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開WO00/18935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。本発明の腸内細菌科に属する細菌に使用できる出来る、温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えばWO 99/03988号国際公開パンフレットに記載のプラスミドpMAN997等が挙げられる。また後述のキナルジン酸を用いた方法によって、遺伝子置換株の選択を容易に行うことができる。
なお、発現調節配列の改変は、上述したような遺伝子のコピー数を高める方法と組み合わせてもよい。
以上のような方法によりクエン酸シンターゼ遺伝子、メチルクエン酸シンターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強するように改変された微生物としては、特開2001-33376
9号公報、特開2000-106869号公報、特開2000-189169号公報、特開2006-129840、国際公開2006/051660号パンフレット等に記載された微生物が例示できる。
9号公報、特開2000-106869号公報、特開2000-189169号公報、特開2006-129840、国際公開2006/051660号パンフレット等に記載された微生物が例示できる。
また、Ｌ−グルタミン酸生産能は、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性を増強させることによっても付与することが出来る。６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性を上昇させた微生物としては、特開2003-274988に開示された微生物を挙げることが出来る。
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための改変は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることにより行ってもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリン−５−カルボキシレートデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。この中では特に、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましい。
上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、あるいは遺伝子工学的手法によって、上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク質をコードするコード領域であってもよく、プロモーター等の発現制御領域であってもよい。また、遺伝子工学的手法には、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いる方法がある。
細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株と比較することによって確認することができる。例えば、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性は、Reedらの方法（L.J.Reed and B.B.Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61）に従って測定することができる。
２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下した細菌としては、具体的には次のような株が挙げられる。
パントエア・アナナティスAJ13601（FERM BP-7207 欧州特許公開明細書1078989）
パントエア・アナナティスAJ13356（FERM BP-6615 米国特許6.331,419号）
パントエア・アナナティスSC17sucA（FERM BP-8646 国際公開パンフレットWO2005/085419号）
クレブシエラ・プランティコーラ AJ13410（FERM BP-6617 米国特許6,197,559号）
パントエア・アナナティスAJ13356（FERM BP-6615 米国特許6.331,419号）
パントエア・アナナティスSC17sucA（FERM BP-8646 国際公開パンフレットWO2005/085419号）
クレブシエラ・プランティコーラ AJ13410（FERM BP-6617 米国特許6,197,559号）
尚、SC17sucA株は、低ｐＨでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として自然界より単離されたAJ13355株から、粘液質低生産変異株（SC17）を取得し、同株の２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊することによって得られた株である。AJ13601は、このSC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のgltA、ppc、gdhAの各遺伝子、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のgltA遺伝子を導入し、さらに、低pHにおける高濃度Ｌ−グルタミン酸耐性株の選択、及び増殖度及びＬ−グルタミン酸生産能が高い株の選択によって、取得された菌株である。SC17sucA株は、プライベートナ
ンバーAJ417が付与され、平成１６年２月２６日に経済産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、郵便番号３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
ンバーAJ417が付与され、平成１６年２月２６日に経済産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、郵便番号３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
本発明の腸内細菌科に属する細菌は、上記のようなＬ−グルタミン酸生産能を有する、パントエア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、又はエルビニア属に属する細菌であって、かつrpoS遺伝子が遺伝子組換えにより不活性化するように改変された細菌である。
本発明の細菌は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、遺伝子組換えによりrpoS遺伝子を不活性化するように改変することにより得ることができる。なお、本発明の腸内細菌科に属する細菌の育種において、Ｌ−グルタミン酸生産能の付与とrpoS遺伝子を不活性化させる改変は、どちらを先に行ってもよい。
「rpoS遺伝子を不活性化するように改変された」とは、非改変株、例えば親株又は野生株に比べてRpoSタンパク質が正常に機能しないように改変したことを意味する。例えば、遺伝子組換えによりrpoS遺伝子を改変することにより、親株、あるいは野生株に対して細胞あたりのrpoS遺伝子がコードするRpoSタンパク質の分子の数が減少した場合、又はRpoSタンパク質分子が全く生成されなくなった場合、あるいはRpoSタンパク質の分子当たりの活性が低下又は喪失した場合等が含まれる。RpoSタンパク質分子の数は、rpoS遺伝子の発現量を低下させることにより減少させることができる。rpoS遺伝子の発現量の低下には、rpoS mRNAの転写量の低下、及びrpoS mRNAの翻訳量の低下が含まれる。また、RpoSタンパク質分子を全く生成させなくすること、あるいはRpoSタンパク質の分子当たりの活性を低下又は喪失させることは、rpoS遺伝子を破壊することによって達成される。比較対象となる野生株としては、パントエア・アナナティスAJ13355株、クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株等が挙げられる。
rpoS遺伝子の改変は、具体的には、染色体上のrpoS遺伝子コード領域の一部又は全部を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、発現調節配列以外の非翻訳領域の改変によっても、遺伝子の発現量を低下させることができる。さらには、染色体上のrpoS遺伝子の前後の配列を含めて、rpoS遺伝子全体を欠失させてもよい。また、遺伝子組換えにより、染色体上のrpoSのコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入することによっても達成出来る（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95
5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)）。
5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)）。
本発明において、「遺伝子組換えにより改変された」とは、Ｘ線もしくは紫外線を照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤による通常の変異処理による改変ではなく、相同組換えを利用して、染色体上のrpoS遺伝子の発現調節配列、例えばプロモーター領域、又はコード領域、もしくは非コード領域の一部又は全部を欠損させること、又はこれらの領域に他の配列を挿入することによって、細胞内のrpoSの活性を低下させることをいう。本発明においては、rpoS遺伝子の不活化は自然突然変異により元に戻らない程度に、rpoS遺伝子が改変されていることが好ましい。
発現調節配列の改変は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上である。また、コード領域を欠失させる場合は、産生するrpoSタンパク質の機能が低下又は欠失するのであれば、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ
末端領域のいずれの領域であってもよく、コード領域全体であってよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実にrpoS遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。
末端領域のいずれの領域であってもよく、コード領域全体であってよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実にrpoS遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。
コード領域に他の配列を挿入する場合も、挿入する位置はrpoS遺伝子のいずれに領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が、確実にrpoS遺伝子を不活化することができる。挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、RpoSタンパク質の機能を低下又は欠損させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子やＬ−グルタミン酸生産に有用な遺伝子を搭載したトランスポゾン等が挙げられる。
染色体上のrpoS遺伝子を上記のように改変するには、例えば、rpoS遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するRpoSタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上のrpoS遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上のrpoS遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。欠失型rpoS遺伝子によってコードされるRpoSタンパク質は、生成したとしても、野生型RpoSタンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号明細書、または特開平05-007491号公報）。
また、キナルジン酸を利用した遺伝子破壊法によってもrpoS遺伝子を不活化でき、２回組み換え株（ダブルクロスオーバー）の取得が可能になる。
キナルジン酸はテトラサイクリンのアナログであり、Tn10にコードされるテトラサイクリン排出タンパク質によって菌体外に排出される。一方キナルジン酸は弱酸性物質であり、弱酸性条件ではその電荷を失いフリー体となるため、容易に細胞膜を透過することができる。弱酸性条件でキナルジン酸が存在するような環境では、テトラサイクリン排出系によってキナルジン酸が排出され、弱酸性の細胞外でフリー体となり再度菌体内に流入し、結果的に細胞内外のプロトン濃度勾配が消失する。つまり、Tn10由来のTet排出遺伝子を保持する菌株は、弱酸性条件においてキナルジン酸に感受性となる（J.Bacteriol. Aug 1980; 143(2), p.926-33）。染色体上への組み込みベクター上にTn10のテトラサイクリン耐性遺伝子を搭載しておけば、シングルクロスオーバーにより染色体上への組み込まれた株はテトラサイクリンで選択でき、ダブルクロスオーバーによりベクター部分が抜け落ちた株は、キナルジン酸含有培地で優性選択できることになり、きわめて操作が容易となる。
従って、遺伝子組換え用のベクターにテトラサイクリン耐性遺伝子を挿入しておけば、マーカー遺伝子を持たない２回組換え株の取得が容易になる。
従って、遺伝子組換え用のベクターにテトラサイクリン耐性遺伝子を挿入しておけば、マーカー遺伝子を持たない２回組換え株の取得が容易になる。
rpoS遺伝子の転写量が低下したことの確認は、rpoSのmRNAの量を野生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。転写量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して低下していれば、いずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて少なくとも75%以下、50％以下、25％以下、又は10％以下に低下していることが望ましく、全く発現していないことが特に好ましい。
rpoS遺伝子がコードするタンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Labo
ratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して、低下していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて、野生株あるいは非改変株と比べて少なくとも75%以下、50％以下、25％以下、又は10％以下以下に減少していることが望ましく、全くタンパク質を産生していない（完全に活性が消失している）ことが特に好ましい。
ratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して、低下していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて、野生株あるいは非改変株と比べて少なくとも75%以下、50％以下、25％以下、又は10％以下以下に減少していることが望ましく、全くタンパク質を産生していない（完全に活性が消失している）ことが特に好ましい。
本発明のrpoS遺伝子がコードするタンパク（RpoSタンパク）とは、RNAポリメラーゼのシグマSファクターである。RNAポリメラーゼは、α、β、β’及びシグマ（σ）の各サブユニットからなる。シグマ因子は、α、β、及びβ’サブユニットからなるコア酵素に結合して、RNAポリメラーゼが転写を行う遺伝子のプロモーターを認識する。本発明において「RpoSタンパク質の機能」とは、上記のような、RNAポリメラーゼが転写を行う遺伝子のプロモーターを認識する機能又は活性をいう。RpoSが正常に機能しないと、RpoSが正常に機能する菌株、例えば野生株において発現する遺伝子の発現が低下又は消失することが予想される。細胞内のRpoS機能の低下は、bolA遺伝子などのrpoSによって転写される遺伝子の発現量をノーザンハイブリダイゼーションやRT-PCR法により検出することにより行うことができる（J Bacteriol. 1991 Jul;173(14):4474-81）。
ここで、腸内細菌科のRpoSタンパク質としては、パントエア・アナナティスrpoS遺伝子（配列番号１）がコードするタンパク質（配列番号２）が挙げられる。また、腸内細菌科の属する種又は菌株によって、rpoSをコードする遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、rpoS遺伝子は配列番号１の塩基配列のバリアントであってもよい。rpoS遺伝子のバリアントは、配列番号１の塩基配列を参考にして、BLAST等によって検索出来る（http://blast.genome.jp/）。また、rpoS遺伝子のバリアントは、rpoS遺伝子ホモログ、例えば腸内細菌科の染色体を鋳型にして、例えば配列番号配列番号7と配列番号１０の合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRで増幅可能な遺伝子を含む。
ここで、腸内細菌科のRpoSタンパク質としては、パントエア・アナナティスrpoS遺伝子（配列番号１）がコードするタンパク質（配列番号２）が挙げられる。また、腸内細菌科の属する種又は菌株によって、rpoSをコードする遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、rpoS遺伝子は配列番号１の塩基配列のバリアントであってもよい。rpoS遺伝子のバリアントは、配列番号１の塩基配列を参考にして、BLAST等によって検索出来る（http://blast.genome.jp/）。また、rpoS遺伝子のバリアントは、rpoS遺伝子ホモログ、例えば腸内細菌科の染色体を鋳型にして、例えば配列番号配列番号7と配列番号１０の合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRで増幅可能な遺伝子を含む。
RpoSタンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列を有するものが挙げられるが、細菌の種や菌株によって使用コドンが異なり、rpoS遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、RpoSタンパク質の機能が変わらない限り、これらのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列をコードしている場合がある。ここで、数個とは、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、RpoSタンパク質産生が正常に行われる保存的変異である。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからAsn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。
rpoS遺伝子のバリアントは、配列番号１の塩基配列を有する遺伝子だけでなく、配列番号１からなる塩基配列に相補的な配列、または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェン
トな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。プローブの長さは、ハイブリダイゼーションの条件により適宜選択されるが、通常には、100bp〜1Kbpである。
トな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。プローブの長さは、ハイブリダイゼーションの条件により適宜選択されるが、通常には、100bp〜1Kbpである。
＜２＞Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物の酸性条件下での生育の向上
上記のように、遺伝子組換えにより微生物のｒｐｏＳ遺伝子を不活化することにより、微生物のＬ−グルタミン酸の生産性を向上させることができる。具体的には、微生物の酸性条件下での生育を向上させることができる。酸性条件としては、好ましくはｐＨ３〜５、より好ましくはｐＨ４〜５が挙げられる。
上記のように、遺伝子組換えにより微生物のｒｐｏＳ遺伝子を不活化することにより、微生物のＬ−グルタミン酸の生産性を向上させることができる。具体的には、微生物の酸性条件下での生育を向上させることができる。酸性条件としては、好ましくはｐＨ３〜５、より好ましくはｐＨ４〜５が挙げられる。
前記微生物としては、パントエア属、エンテロバクター属、セラチア属、クレブシエラ属、又はエルビニア属に属する細菌が挙げられる。
酸性条件下での生育が向上した微生物は、特に、微生物を酸性条件下で培養して、Ｌ−グルタミン酸を析出させながら生成、蓄積させる方法に好適に用いることができる。
酸性条件下での生育が向上した微生物は、特に、微生物を酸性条件下で培養して、Ｌ−グルタミン酸を析出させながら生成、蓄積させる方法に好適に用いることができる。
特に、前記微生物が、酸性条件下でのＬ−グルタミン酸蓄積能を有する微生物である場合は、酸性条件下での生育を向上させることにより、酸性条件下でのＬ−グルタミン酸の生産性を向上させることができる。
＜３＞本発明のＬ−グルタミン酸の製造方法
本発明の細菌を培地中で培養し、該培地中にＬ−グルタミン酸を生成、蓄積せしめ、Ｌ−グルタミン酸を該培地から採取することにより、Ｌ−グルタミン酸を製造することが出来る。
本発明の細菌を培地中で培養し、該培地中にＬ−グルタミン酸を生成、蓄積せしめ、Ｌ−グルタミン酸を該培地から採取することにより、Ｌ−グルタミン酸を製造することが出来る。
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。無機塩類としてはりん酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。
培養は、好ましくは、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを３〜９に制御し、通気培養を行う。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培
養することにより、培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。
養することにより、培養液中に著量のＬ−グルタミン酸が蓄積される。
また、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成、蓄積させるように培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０を挙げることができる。尚、酸性条件下での生育の向上、及び、効率的なＬ−グルタミン酸の析出を両立するためには、ｐＨは好ましくは５．０〜４．０、より好ましくは４．５〜４．０、さらに好ましくは４．３〜４．０であることが望ましい。尚、上記ｐＨでの培養は、培養の全期間であってもよく、一部であってもよい。
培養終了後の培養液からＬ−グルタミン酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。培地中にＬ−グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ−グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸を晶析させた後に、併せて単離してもよい。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
＜１＞rpoS遺伝子破壊株の作製
（１）遺伝子破壊用プラスミドpUT-Tn10の構築
＜１＞rpoS遺伝子破壊株の作製
（１）遺伝子破壊用プラスミドpUT-Tn10の構築
rpoS遺伝子を破壊するために、キナルジン酸及びテトラサイクリン耐性遺伝子を利用した遺伝子破壊に用いるベクターを構築した。まず、組換え用ベクターにTn10のテトラサイクリン耐性遺伝子の挿入を行った。プライマーTn10-750Xho（配列番号３）、Tn10-3020Xho（配列番号４）を用い、エシェリヒア・コリ K-12 ME8424株（Hfr, P045, thi, relA1, tyrA::Tn10, ung-1, nadB 国立遺伝学研究所より分譲）の染色体を鋳型としてPCRによりテトラサイクリン耐性遺伝子を増幅した。またプライマーpUT-3710Xho（配列番号５）、pUT-3020Xho（配列番号６）を用い、pUT399を鋳型としてPCRによりpUT399にXhoIサイトを導入した断片を増幅した。両者をXhoIで処理した後、連結し、目的のプラスミドpUT-Tn10を得た。pUT399は、R6Kの複製起点を有するプラスミドであり、接合伝達に必要なmob領域を含むプラスミドであり、pir遺伝子を持たない菌株では複製出来ないプラスミドである(Biomedal社から入手可能：R. Simon., et al., BIO/TECHNOLOGY NOVEMBER 1983, 784-791
(1983)参照)。
(1983)参照)。
（２）rpoS遺伝子破壊株の作製
パントエア・アナナティスSC17sucA株（FERM BP-8646）の染色体を鋳型に、プライマーrpoS-F1（配列番号７）／rpoS-FR（配列番号８）、rpoS-RF（配列番号９）／rpoS-R1（配列番号１０）の組み合わせでPCR反応を行い、rpoS遺伝子の上下流それぞれ約2.1kbの断片を増幅した。次に、これらの増幅断片を鋳型としてプライマーKpnI-rpoS-F2（配列番号１１）／KpnI-rpoS-R2（配列番号１２）の組み合わせで、約4.1kbの断片を増幅し、pGEM-T Easy(Promega社製)にクローニングした。
パントエア・アナナティスSC17sucA株（FERM BP-8646）の染色体を鋳型に、プライマーrpoS-F1（配列番号７）／rpoS-FR（配列番号８）、rpoS-RF（配列番号９）／rpoS-R1（配列番号１０）の組み合わせでPCR反応を行い、rpoS遺伝子の上下流それぞれ約2.1kbの断片を増幅した。次に、これらの増幅断片を鋳型としてプライマーKpnI-rpoS-F2（配列番号１１）／KpnI-rpoS-R2（配列番号１２）の組み合わせで、約4.1kbの断片を増幅し、pGEM-T Easy(Promega社製)にクローニングした。
得られたプラスミドをKpnI処理し、約4.1kbの断片をpUT-Tn10のKpnIサイトに連結して、pUT-Tn10/ΔrpoSを得た。このプラスミドを、λ-pirを有するエシェリヒア・コリS17-
1λpir株（Biomedal社から入手可能：R. Simon, et al., BIO/TECHNOLOGY NOVEMBER 1983, 784-791 (1983)）に導入し、得られた株からSC17sucA株へ接合によりこのプラスミドを導入した。
1λpir株（Biomedal社から入手可能：R. Simon, et al., BIO/TECHNOLOGY NOVEMBER 1983, 784-791 (1983)）に導入し、得られた株からSC17sucA株へ接合によりこのプラスミドを導入した。
クロラムフェニコール25mg/L、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン及びジアミノピメリン酸を各100mg/L、5g/Lのスクロースを含むM9最少培地（グルコース5g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 、塩化アンモニウム1g リン酸２ナトリウム6g
を純水1Lに含む培地）で選択することにより、pUT-Tn10/ΔrpoSがSC17sucA株（FE
RM BP-8646）染色体上のrpoS遺伝子部位に組み込まれた株を取得した。
を純水1Lに含む培地）で選択することにより、pUT-Tn10/ΔrpoSがSC17sucA株（FE
RM BP-8646）染色体上のrpoS遺伝子部位に組み込まれた株を取得した。
この株をＬ培地（バクトトリプトン10g、イーストエキストラクト 5g、NaCl 5 g、寒天15 gを純水1Lに含む培地 pH7.0）に、最少培地成分（グルコース5g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 、塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）と25mg/Lのクロラムフェニコール、12.5mg/Lのテトラサイクリンを加えた培地で純化した後、薬剤を含まない同培地で再度コロニーを形成させた。出現したコロニーを数コロニーピックアップし、同じ組成の液体培地で終夜培養を行い、100倍〜10000倍に滅菌水で希釈して、キナルジン酸プレート（バクトトリプトン5g、イーストエキストラクト5 g、NaCl 40 g、テトラサイクリン0.05 g、NaH2PO4 10gを純水900mLに溶解し、KOHにてpHを5.2に調整後、寒天20gと混和し120℃で20分滅菌したものに、キナルジン酸0.2g、ZnCl2 13.6mg、グルコース5gを100mLの純水に溶解し、フィルター滅菌したものを加えた培地）に塗布した。出現したコロニーに関してrpoS遺伝子の構造をプライマーを用いてPCRにより確認し、目的どおりrpoS遺伝子が破壊されている株をSC17sucArpoS株とした。
次にＬ−グルタミン酸生合成系遺伝子、prpC遺伝子（国際公開2006/051660号パンフレット）、ppc遺伝子、gdh（欧州出願公開0999282号明細書）遺伝子を増幅したプラスミドRSFPPGを構築した。
RSFCPG（欧州出願公開1233068号明細書）のgltA遺伝子のORF以外の部分を増幅するプライマー1（配列番号１３）とプライマー2（配列番号１４）を設計した。このプライマーを用いて、RSFCPGを鋳型にPCRを行い、約14.9kbの断片を取得した。一方、prpCに関してはプライマー3（配列番号１５）とプライマー4（配列番号１６）を用い、E.coli W3110株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、約1.2kbの断片を取得した。両PCR産物をそれぞれBglII、KpnIで処理し、ライゲーション後、E. coli JM109株を形質転換した。出現したコロニーを全て集菌し、混合物としてプラスミドを抽出した。このプラスミド混合物でCS欠損株であるE. coli ME8330株を形質転換し、50mg/Lウラシル、5mg/Lチアミン-HClを含有するM9最少培地（グルコース5 g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 、塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）に塗布した。出現した株よりプラスミドを抽出し、これをRSFPPGとした。SC17sucArpoS株にGlu生産プラスミドRSFPPGを導入し、rpoSを欠損したGlu生産菌SC17sucArpoS/RSFPPGを構築した。
RSFCPG（欧州出願公開1233068号明細書）のgltA遺伝子のORF以外の部分を増幅するプライマー1（配列番号１３）とプライマー2（配列番号１４）を設計した。このプライマーを用いて、RSFCPGを鋳型にPCRを行い、約14.9kbの断片を取得した。一方、prpCに関してはプライマー3（配列番号１５）とプライマー4（配列番号１６）を用い、E.coli W3110株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、約1.2kbの断片を取得した。両PCR産物をそれぞれBglII、KpnIで処理し、ライゲーション後、E. coli JM109株を形質転換した。出現したコロニーを全て集菌し、混合物としてプラスミドを抽出した。このプラスミド混合物でCS欠損株であるE. coli ME8330株を形質転換し、50mg/Lウラシル、5mg/Lチアミン-HClを含有するM9最少培地（グルコース5 g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 、塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む培地）に塗布した。出現した株よりプラスミドを抽出し、これをRSFPPGとした。SC17sucArpoS株にGlu生産プラスミドRSFPPGを導入し、rpoSを欠損したGlu生産菌SC17sucArpoS/RSFPPGを構築した。
＜２＞rpoS遺伝子破壊株の酸性条件における生育
SC17sucArpoS/RSFPPGの各種pH条件における生育を調べた。SC17sucArpoS/RSFPPG株とrpoS野生株であるSC17sucA/RSFPCPG株を、Ｌ培地に最少培地成分を加えた固体培地で終夜培養を行い、滅菌水で２回洗菌した。この菌体を5mLの最少培地（グルコース5g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g、塩化アンモニウム1g、リン酸２ナトリウム6g、リジン塩酸塩100mg、Ｌ−メチオニン100mg、ジアミノピメリン酸100mg、及びＬ−グルタミン酸30gを純水1Lに含み、アンモニアにより種々のpHに調整した培地）にOD660nm=0.05となるように植菌し、ADVANTEC社製自動OD測定装置TN1506を用いて、経時的にOD測定を行った。結果を図１、図２に示す。
SC17sucArpoS/RSFPPGの各種pH条件における生育を調べた。SC17sucArpoS/RSFPPG株とrpoS野生株であるSC17sucA/RSFPCPG株を、Ｌ培地に最少培地成分を加えた固体培地で終夜培養を行い、滅菌水で２回洗菌した。この菌体を5mLの最少培地（グルコース5g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g、塩化アンモニウム1g、リン酸２ナトリウム6g、リジン塩酸塩100mg、Ｌ−メチオニン100mg、ジアミノピメリン酸100mg、及びＬ−グルタミン酸30gを純水1Lに含み、アンモニアにより種々のpHに調整した培地）にOD660nm=0.05となるように植菌し、ADVANTEC社製自動OD測定装置TN1506を用いて、経時的にOD測定を行った。結果を図１、図２に示す。
pH5.1以上の条件では、対照であるSC17sucA/RSFPPG株とSC17sucArpoS/RSFPPG株で差は見られなかったが、pH4.9以下ではrpoS遺伝子破壊株のほうが生育が良好となる傾向が観察された。またその生育改善効果は培地のpHが低下すればするほど大きくなる傾向にあった。従って、rpoS遺伝子の破壊は酸性条件下における生育の改善に効果があることが明ら
かとなった。
かとなった。
＜３＞rpoS遺伝子破壊株の酸性条件におけるグルタミン酸生産
次に、SC17sucArpoS/RSFPPG株の酸性条件下におけるグルタミン酸生産能の評価を行った。
L培地（バクトトリプトン10 g、イーストエキストラクト5g、NaCl 5g、寒天15gを純水1Lに含む培地 pH7.0）に、最少培地成分（グルコース5g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 、塩化アンモニウム1g、リン酸２ナトリウム6gを純水1Lに含む培地）と12.5mg/Lテトラサイクリンを加えた培地でSC17sucA/RSFPPG株とSC17sucArpoS/RSFPPG株を終夜培養した。これらのプレート1枚分の菌体を300mLの下記成分の培地を張り込んだジャーファーメンターに植菌し、通気1/1vvm、34℃、アンモニアガスにてpH4.7に制御して培養を行った。初糖が切れた時点で糖のフィードを開始し、培養を継続した。尚、SC17sucArpoS/RSFPPG株に関してはＬ−グルタミン酸の飽和溶解度に達した時点で、ペクチンを1g/Lとなるよう添加した。
次に、SC17sucArpoS/RSFPPG株の酸性条件下におけるグルタミン酸生産能の評価を行った。
L培地（バクトトリプトン10 g、イーストエキストラクト5g、NaCl 5g、寒天15gを純水1Lに含む培地 pH7.0）に、最少培地成分（グルコース5g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 、塩化アンモニウム1g、リン酸２ナトリウム6gを純水1Lに含む培地）と12.5mg/Lテトラサイクリンを加えた培地でSC17sucA/RSFPPG株とSC17sucArpoS/RSFPPG株を終夜培養した。これらのプレート1枚分の菌体を300mLの下記成分の培地を張り込んだジャーファーメンターに植菌し、通気1/1vvm、34℃、アンモニアガスにてpH4.7に制御して培養を行った。初糖が切れた時点で糖のフィードを開始し、培養を継続した。尚、SC17sucArpoS/RSFPPG株に関してはＬ−グルタミン酸の飽和溶解度に達した時点で、ペクチンを1g/Lとなるよう添加した。
（培地組成：単位は全て終濃度）
A区：スクロース100g/L、MgSO4・7H2O 1.2g/L、GD113（消泡剤）0.2mL/L
B区：(NH4)2SO4 5g/L、KH2PO4 6g/L、イーストエキストラクト(Difco) 6g/L、NaCl 1.5g/L、MnSO4・5H2O 60mg/L、Ｌ−リジン0.8g/L、DL-メチオニン0.6g/L、DL-ジアミノピメリン酸0.6g/L、ベタイン4g/L
C区：FeSO4・7H2O 60mg/L
それぞれ120℃で20分滅菌後混ぜ合わせ、300mLずつ1L容ジャーファーメンターに分注した。
フィード液：スクロース700g/L、GD113 0.2mL/L
120℃ 20分滅菌
A区：スクロース100g/L、MgSO4・7H2O 1.2g/L、GD113（消泡剤）0.2mL/L
B区：(NH4)2SO4 5g/L、KH2PO4 6g/L、イーストエキストラクト(Difco) 6g/L、NaCl 1.5g/L、MnSO4・5H2O 60mg/L、Ｌ−リジン0.8g/L、DL-メチオニン0.6g/L、DL-ジアミノピメリン酸0.6g/L、ベタイン4g/L
C区：FeSO4・7H2O 60mg/L
それぞれ120℃で20分滅菌後混ぜ合わせ、300mLずつ1L容ジャーファーメンターに分注した。
フィード液：スクロース700g/L、GD113 0.2mL/L
120℃ 20分滅菌
上記の各培養におけるＬ−グルタミン酸蓄積量及び生育を測定した結果を図３に各々示す。対照であるSC17sucA/RSFPPG株は、培養途中より生育が停止する傾向が見られた。一方、SC17sucArpoS/RSFPPG株においては生育が停止せず、グルタミン酸蓄積もSC17sucA/RSFPPGをはるかに上回る結果となった。
Claims (6)
- Ｌ−グルタミン酸生産能を有する、パントエア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、又はエルビニア属に属する細菌を培地中で培養し、該培地中にＬ−グルタミン酸を生成、蓄積せしめ、Ｌ−グルタミン酸を該培地から採取することを特徴とする、Ｌ−グルタミン酸の製造法であって、
前記細菌が、遺伝子組換えによりｒｐｏＳ遺伝子を不活化するように改変された細菌であり、
前記培養がｐＨ３〜５で行われ、
前記Ｌ−グルタミン酸生産能が、前記細菌を培地中で培養したときに、Ｌ−グルタミン酸を培地から回収できる程度に、培地中に生成、蓄積する能力である、方法。 - ｒｐｏＳ遺伝子の発現量を非改変株と比較して低下させること、またはｒｐｏＳ遺伝子を破壊することにより、ｒｐｏＳ遺伝子が不活化した請求項１に記載の方法。
- ｒｐｏＳ遺伝子が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質をコードする遺伝子である請求項１または２に記載の方法：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＲＮＡポリメラーゼのシグマＳファクターの機能を有するタンパク質。 - 前記ｒｐｏＳ遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に相補的な配列と、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１×ＳＤＳの条件下でハイブリダイズし、かつ、ＲＮＡポリメラーゼのシグマＳファクターの機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 - 培養中に、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成、蓄積させることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 遺伝子組換えにより微生物のｒｐｏＳ遺伝子を不活化することにより、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物の酸性条件下での生育を向上させる方法であって、
前記微生物が、パントエア属、エンテロバクター属、セラチア属、クレブシエラ属、及びエルビニア属からなる群より選択され、
前記酸性条件がｐＨ３〜５であり、
前記Ｌ−グルタミン酸生産能が、前記微生物を培地中で培養したときに、Ｌ−グルタミン酸を細胞又は培地から回収できる程度に、細胞又は培地中に生成、蓄積する能力である、方法。
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