JP2002017363A - 微生物を利用した物質の製造法 - Google Patents

微生物を利用した物質の製造法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 エネルギー効率が向上した微生物を創製し、
それを用いた目的物質の生産法を提供する。 【解決手段】 微生物を培地中に培養し、該培地中に目
的物質を生成蓄積させ、該目的物質を採取する、微生物
を利用した目的物質の製造法において、前記微生物は、
呼吸鎖経路として、エネルギー効率の良い呼吸鎖経路
と、エネルギー効率の悪い呼吸鎖経路を保持する微生物
の親株から創製され、以下の性質の一方又は両方を有す
る変異株又は遺伝子組換え株を用いる。 （Ａ）エネルギー効率の良い呼吸鎖経路が増強されてい
る、（Ｂ）エネルギー効率の悪い呼吸鎖経路が欠損して
いる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物を利用した
物質の製造法に関する。本発明において、微生物とはエ
シェリヒア属細菌あるいはコリネ型細菌を代表とするも
のであり、従来より物質生産に供されてきたものであ
る。また、生産される物質とは、Ｌ−アミノ酸、核酸、
抗生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質など、従
来より微生物により生産されてきたものである。本発明
は、微生物を利用した物質の製造法において、最終目的
産物である物質の生産性を改善するための手段を開示す
るものである。
【０００２】
【従来の技術】多くの生物は、呼吸によって生命活動に
必要なエネルギーを獲得している。微生物の呼吸では、
一般に種や生育環境に応じて多様な酵素複合体が働いて
おり、エネルギー獲得効率も様々である。炭水化物、タ
ンパク質、脂肪酸は、解糖系やβ酸化によりアセチルCo
Aとなり、クエン酸回路に入って分解される。その時、N
ADHの形で蓄えられたエネルギーは、NADH脱水素酵素（N
DH）とそれに続く酸化還元酵素からなる電子伝達系によ
り菌体内からのプロトン排出に利用され、それにより細
胞膜内外でプロトン濃度勾配が形成される。そして、こ
のプロトン濃度勾配は、ATP合成の駆動力として利用さ
れる。この時、電子伝達の経路には、NDHと酸化還元酵
素の組み合わせにより、プロトン排出能が高い経路と低
い経路が存在し、プロトン排出能が高い経路はエネルギ
ー効率が良く、プロトン排出能が低い経路はエネルギー
効率が低いと考えられる。このように、１種類の微生物
が、同時に複数の呼吸鎖電子伝達経路を並列に持ち、そ
の経路にエネルギー効率が高い経路と低い経路が存在す
る。
【０００３】エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
の好気条件での呼吸鎖には２種類のNDHと２種類の末端
酸化酵素が存在している。すなわち、NDHについてはエ
ネルギー効率の良いNDH-1（nuoオペロンにコードされ
る）とエネルギー効率の悪いNDH-II（ndhにコードされ
る）が知られている。また、末端酸化酵素については、
エネルギー効率が良く、SoxM型（Castresana, J. and S
araste, M. Trends in Biochem. Sci. 20, 443-448 (19
95)）に分類されるシトクロムbo型酸化酵素（cyoABCDオ
ペロンにコードされる）と、エネルギー効率が悪いシト
クロムbd型酸化酵素（cydABにコードされる）が知られ
ている。これらの呼吸鎖酵素は、生育環境にレスポンス
し、発現量を変化させていることが知られているが（Mi
nagawa et al., The Journal of Biological Chemistr
y, 265:11198-11203 (1990)、Tseng etal., Journal of
Bacteriology, 178:1094-1098 (1996)、Green et al.,
Molecular Microbiology, 12:433-444 (1994)、Bongae
rts et al., Molecular Microbiology, 16:521-534 (19
95)）、それらの発現様式の生理的意義については未だ
不明な点が多い。
【０００４】また、コリネバクテリウム・グルタミカム
（Corynebacterium glutamicum）においては、シトクロ
ムbc1複合体が存在し、少なくとも２種類の末端酸化酵
素、SoxM型酸化酵素とシトクロムbd型酸化酵素の存在が
確認されている（平成１１年度 代謝工学に関する第２
回目のシンポジウム講演要旨集）。このことより、キノ
ンプールから酸素分子への電子伝達経路は、シトクロム
bc1複合体を経由しSoxM型酸化酵素を介する経路と、シ
トクロムbd型酸化酵素だけを介する経路の２種類の経路
が存在することがわかる。前者は１電子が伝達される際
のプロトン輸送比が高くエネルギー効率が高い電子伝達
経路であり、後者は１電子が伝達される際のプロトン輸
送比が低くエネルギー効率が低い経路であると考えられ
る。
【０００５】エシェリヒア・コリの末端酸化酵素につい
ては、シトクロムbo型酸化酵素のみを持つ変異株、シト
クロムbd型酸化酵素だけを持つ変異株、及び、両者を持
つ野生株の好気培養における生育収量を比較すると、生
育収量はシトクロムbd型酸化酵素だけを持つ変異株が最
も低く、末端酸化酵素の種類とそのエネルギー獲得効率
に依存する（平成７年度日本生物工学会講演要旨集演題
番号３５７）。
【０００６】また、エネルギー効率の良いNDH-Iやシト
クロムbo型酸化酵素を欠損した株は、エネルギー効率が
悪化することが報告されている（Calhoun et al., Jour
nalof Bacteriology, 175:3020-3925 (1993)）。しか
し、NDH-IやSoxM型酸化酵素などの効率の良い呼吸鎖遺
伝子の増幅によるエネルギー効率の変化に関しては未だ
知見はなく、物質生産に結びつけた試みは知られていな
い。また、NDH-IIやシトクロムbd型酸化酵素など効率の
悪い呼吸鎖酵素の欠損化を物質生産に結びつける試みも
報告されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】Ｌ−アミノ酸、核酸を
始めとする生体内での物質の生合成には、エネルギーが
必要である。そのとき利用されるエネルギーの多くは、
NADHやNADPHなどの還元力や、ATPとして蓄えられたエネ
ルギーである。そこで、本願発明者らは微生物を利用し
た目的物質の製造法において、目的物質生産時に利用さ
れるエネルギーの供給を増加させれば、目的物質の生産
性が向上すると考えた。この様な考えに基づき、本発明
は、エネルギー効率が向上した微生物を創製し、それを
用いた目的物質の生産法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、エネルギー
供給が増加した微生物を造成する方法としては、エネル
ギー獲得効率の高い呼吸鎖経路の増強あるいは、エネル
ギー獲得効率の低い呼吸鎖経路の欠損化を行なうことで
達成されると考えた。具体的には、エシェリヒア・コリ
において、エネルギー効率の良い呼吸鎖酵素としてシト
クロムbo型酸化酵素をコードする遺伝子の増幅、または
エネルギー効率の悪い呼吸鎖酵素としてNDH-IIをコード
する遺伝子の欠損化により、エネルギー効率が向上した
と考えられる株を造成した。そして、それらを用いてＬ
−アミノ酸生産を行い、エネルギー効率が向上した株で
はＬ−アミノ酸生産性が向上することを知見し、本発明
を完成するに至った。
【０００９】すなわち本発明は、以下のとおりである （１）微生物を培地中に培養し、該培地中に目的物質を
生成蓄積させ、該目的物質を採取する、微生物を利用し
た目的物質の製造法において、前記微生物は、呼吸鎖経
路として、エネルギー効率の良い呼吸鎖経路と、エネル
ギー効率の悪い呼吸鎖経路を保持する微生物の親株から
創製され、以下の性質の一方又は両方を有する変異株又
は遺伝子組換え株であることを特徴とする、微生物を利
用した目的物質の製造法： （Ａ）エネルギー効率の良い呼吸鎖経路増強されてい
る、（Ｂ）エネルギー効率の悪い呼吸鎖経路が欠損して
いる。 （２）エネルギー効率の良い呼吸鎖経路に関与する呼吸
鎖酵素をコードする遺伝子のコピー数の上昇、又は同遺
伝子の発現調節配列の改変により前記呼吸鎖経路が増強
された、（１）の目的物質の製造法。 （３）エネルギー効率の悪い呼吸鎖経路に関与する呼吸
鎖酵素をコードする遺伝子が破壊されたことにより呼吸
鎖経路が欠損した（１）又は（２）の目的物質の製造
法。 （４）エネルギー効率の良い呼吸鎖酵素がＳｏｘＭ型酸
化酵素酸化酵素、ｂｃ１複合体もしくはＮＤＨ−１又は
それらの２種又は３種である（１）〜（３）のいずれか
の目的物質の製造法。 （５）エネルギー効率の悪い呼吸鎖酵素がシトクロムｂ
ｄ型酸化酵素もしくはＮＤＨ−ＩＩ又はそれらの両方で
ある（１）〜（４）のいずれかの目的物質の製造法。 （６）前記微生物は、ＳｏｘＭ型酸化酵素の活性が増強
され、かつ、ＮＤＨ−ＩＩを欠損した、（１）〜（５）
のいずれかの目的物質の製造法。 （７）ＳｏｘＭ型酸化酵素がシトクロムｂｏ型酸化酵素
である（１）〜（６）のいずれかの目的物質の製造法。 （８）前記微生物がエシェリヒア属細菌又はコリネ型細
菌である（１）〜（７）のいずれかの目的物質の製造
法。 （９）目的物質がＬ−アミノ酸又は核酸である（１）〜
（８）のいずれかの目的物質の製造法。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の製造法により製造される物質は、微生物により
製造され得る物質であれば特に制限されず、例えばＬ−
スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ロイ
シン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−フェニルア
ラニン等の種々のＬ−アミノ酸；グアニル酸、イノシン
酸等の核酸類；ビタミン類；抗生物質；成長因子；生理
活性物質などが挙げられる。
【００１１】本発明に用いる微生物は、上記のような目
的物質の生産能を有し、かつ、呼吸鎖経路として、エネ
ルギー効率の良い呼吸鎖経路と、エネルギー効率の悪い
呼吸鎖経路を保持する微生物の親株から創製され、、以
下の性質の一方又は両方を有する変異株又は遺伝子組換
え株である。 （Ａ）エネルギー効率の良い呼吸鎖経路増強されてい
る、（Ｂ）エネルギー効率の悪い呼吸鎖経路が欠損して
いる。
【００１２】エシェリヒア・コリやコリネ型細菌等の微
生物は、一般的に、同時に複数の呼吸鎖電子伝達経路を
並列に持ち、１電子当たりのプロトン輸送比が高い経路
と低い経路に分けられる。例えば、エシェリヒア・コリ
では、電子供与体がNADHである場合、NADHからキノンプ
ールへのプロトン伝達を触媒するNADH脱水素酵素とし
て、NDHIとNDHIIがある。これらのうち、NDHIはエネル
ギー効率が良く、NDHIIはエネルギー効率が悪い。すな
わち、電子一個当たり排出できるプロトンの分子数（プ
ロトン輸送比(proton translocation value)）は、NDHI
では２であると考えられているが、NDHIIでは０であ
る。本発明においては、上記のような１電子当たりのプ
ロトン輸送比が高い経路、すなわちエネルギー効率の良
い呼吸鎖経路の増強を行い、エネルギー効率の悪い呼吸
鎖経路の欠損を行う。エネルギー効率の良い呼吸鎖経路
の増強は、該呼吸鎖経路に関与する呼吸鎖酵素の活性を
増強することにより行うことができる。また、エネルギ
ー効率の悪い呼吸鎖経路の欠損は、該呼吸鎖経路に関与
する呼吸鎖酵素の活性を低下又は消失させることにより
行うことができる。
【００１３】本発明における呼吸鎖経路に関与する呼吸
鎖酵素とは、呼吸鎖を構成する酵素であれば特に制限さ
れないが、具体的には電子供与体からユビキノン、ジメ
チルメナキノン、メナキノン等のキノンプールへの電子
伝達を触媒する脱水粗酵素、及び、キノンプールから電
子受容体への電子伝達を触媒する酸化酵素が挙げられ
る。
【００１４】一方、キノンプールからの電子伝達により
水分子を生成する反応を触媒する酸化酵素にはSoxM型
（bo型）とbd型があるが、プロトン輸送比はbo型では２
であるのに対し、bd型は１であり、bo型の方がエネルギ
ー効率は高い。
【００１５】本発明においてエネルギー効率が「良い」
又は「悪い」とは、絶対的なものではなく、上記のよう
に相対的な概念である。次に、エネルギー効率の良い呼
吸鎖酵素の活性を増強する手段、及び、エネルギー効率
の悪い呼吸鎖酵素の活性を低下又は消失させる手段を説
明する。
【００１６】エネルギー効率の良い呼吸鎖酵素の活性の
増強は、例えば、同酵素をコードする遺伝子を断片を、
微生物細胞内で機能するベクター、好ましくはマルチコ
ピー型ベクターと連結して組換えＤＮＡを作製し、これ
を微生物に導入して形質転換すればよい。形質転換株の
細胞内の前記酵素遺伝子のコピー数が上昇する結果、酵
素活性が増幅される。以下に、エネルギー効率の良い呼
吸鎖酵素の遺伝子としてシトクロムbo型酸化酵素をコー
ドするcyoオペロン（cyoABCDE）を例として説明する。
【００１７】エシェリヒア・コリのcyoオペロンの配列
はすでに報告されており（Chepuri et al., The Journa
l of Biological Chemistry, 265:11185-11192 (199
0)）、その配列をもとに同オペロンをクローニングする
ことができる。cyoオペロンは、エシェリヒア属細菌の
遺伝子を用いることも、コリネ型細菌などの他の生物由
来の遺伝子を用いることも可能である。
【００１８】遺伝子のクローニング及び微生物への導入
に使用されるベクターとしては、例えばエシェリヒア・
コリ細胞内で自律複製可能なプラスミド、具体的にはpU
C19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHS
G398、RSF1010、pSTV29等が挙げられる。また、コリネ
型細菌への遺伝子の導入には、コリネ型細菌及びエシェ
リヒア・コリにおいて自律複製可能なシャトルベクター
を用いることが好ましい。例えば、コリネ型細菌で自律
複製可能なプラスミドとしては、以下のものが挙げられ
る。
【００１９】 ｐＡＭ ３３０ 特開昭５８−６７６９９号公報参照 ｐＨＭ １５１９ 特開昭５８−７７８９５号公報参照 ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−１９２９００号公報参照 ｐＡＪ ６１１ 同 上 ｐＡＪ １８４４ 同 上 ｐＣＧ １ 特開昭５７−１３４５００号公報参照 ｐＣＧ ２ 特開昭５８−３５１９７号公報参照 ｐＣＧ ４ 特開昭５７−１８３７９９号公報参照 ｐＣＧ １１ 同 上 ｐＨＫ４ 特開平５−７４９１号公報参照
【００２０】cyoオペロンを含むＤＮＡ断片とベクター
を連結して組換えＤＮＡを調製するには、ｇｌｔＢＤ遺
伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断す
る。連結は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用い
て行うのが普通である。
【００２１】上記のように調製した組換えＤＮＡを微生
物に導入するには、これまでに報告されている形質転換
法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ
Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を
塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法
（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (197
0)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されて
いるような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調
製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.
A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あ
るいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母につ
いて知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換
えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェ
ロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に
導入する方法（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. G
enet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopw
ood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,
J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1
929 (1978)）も応用できる。コリネ型細菌の形質転換
は、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参
照）が有用である。
【００２２】シトクロムbo型酸化酵素活性の増幅は、cy
oオペロンを宿主の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させ
ることによっても達成できる。エシェリヒア属細菌やコ
リネ型細菌等の微生物の染色体ＤＮＡ上にcyoオペロン
を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー
存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。
染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペ
ッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーテ
ィッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−
１０９９８５号公報に開示されているように、cyoオペ
ロンをトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色
体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いず
れの方法によっても形質転換株内のcyoオペロンのコピ
ー数が上昇する結果、シトクロムbo型酸化酵素活性が増
幅される。
【００２３】シトクロムbo型酸化酵素活性の増幅は、上
記の遺伝子増幅による以外に、cyoオペロンのプロモー
ター等の発現調節配列を強力なものに置換することによ
っても達成される（特開平１−２１５２８０号公報参
照）。たとえば、lacプロモーター、trpプロモーター、t
rcプロモーター、tacプロモーター、ラムダファージの
ＰRプロモーター、PLプロモーター、tetプロモーター、
amyEプロモーター等が強力なプロモーターとして知られ
ている。これらのプロモーターへの置換により、cyoオ
ペロンの発現が強化されることによってシトクロムbo型
酸化酵素活性が増強される。発現調節配列の増強は、cy
oオペロンのコピー数を高めることと組み合わせてもよ
い。
【００２４】エネルギー効率の良い呼吸鎖酵素の活性の
増強は、微生物を突然変異処理し、同酵素の細胞内の活
性が上昇するように同酵素の遺伝子に変異を導入するこ
とによっても達成される。そのような変異には、酵素の
比活性が高くなるようなコード領域の変異、及び、遺伝
子の発現量が増加するような発現調節配列の変異等があ
る。突然変異処理としては、紫外線照射、またはN−メ
チル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もし
くは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤に
よって処理する方法が挙げられる。
【００２５】エネルギー効率の悪い呼吸鎖酵素の活性を
低下又は消失させるには、例えば、同酵素の細胞内の活
性が低下又は消失するように、同酵素の遺伝子に変異を
導入するか、あるいは、同遺伝子が正常に機能しないよ
うに微生物の染色体上の遺伝子を破壊する。以下に、エ
ネルギー効率の悪い呼吸鎖酵素の遺伝子としてNDH-IIを
コードするndhを例として、ndh遺伝子を破壊する方法を
説明する。
【００２６】エシェリヒア・コリのndhの配列はすでに
報告されており（Young et al., European Journal of
Biochemistry, 116:165-170 (1981)）、その配列をもと
に同遺伝子をクローニングすることができる。ndh遺伝
子は、エシェリヒア属細菌の遺伝子を用いることも、コ
リネ型細菌などの他の生物由来の遺伝子を用いることも
可能である。
【００２７】染色体上のndh遺伝子の破壊は、ndh遺伝子
の内部を欠失し、正常に機能するndhを産生しないよう
に改変したndh遺伝子（欠失型ndh遺伝子）を含むＤＮＡ
で微生物を形質転換し、欠失型ndh遺伝子と染色体上のn
dh遺伝子との間で組換えを起こさせることにより、行う
ことができる。このような相同組換えによる遺伝子破壊
は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感
受性複製制御領域を含むプラスミドを用いる方法などが
あるが、温度感受性複製制御領域を含むプラスミドを用
いる方法が好ましい。
【００２８】欠失型ndh遺伝子を、宿主染色体上のndh遺
伝子と置換するには以下のようにすればよい。すなわ
ち、温度感受性複製制御領域と欠失型ndh遺伝子と薬剤
耐性マーカー遺伝子とを挿入して組換えＤＮＡを調製
し、この組換えＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、温
度感受性複製制御領域が機能しない温度で形質転換株を
培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養することに
より、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質
転換株が得られる。
【００２９】こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込ま
れた株は、染色体上にもともと存在するndh遺伝子配列
との組換えを起こし、染色体ndh遺伝子と欠失型ndh遺伝
子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベク
ター部分、温度感受性複製制御領域及び薬剤耐性マーカ
ー）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。したがっ
て、この状態では正常なndh遺伝子が優性であるので、
形質転換株はndhを発現する。
【００３０】次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型ndh遺伝子
のみを残すために、２個のndh遺伝子の組換えにより１
コピーのndh遺伝子を、ベクター部分（温度感受性複製
制御領域及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体
ＤＮＡから脱落させる。その際、正常なndh遺伝子が染
色体ＤＮＡ上に残され、欠失型ndh遺伝子が切り出され
る場合と、反対に欠失型ndh遺伝子が染色体ＤＮＡ上に
残され、正常なndh遺伝子が切り出される場合がある。
いずれの場合も、温度感受性複製制御領域が機能する温
度で培養すれば、切り出されたＤＮＡはプラスミド状で
細胞内に保持される。次に、温度感受性複製制御領域が
機能しない温度で培養すると、欠失型ndh遺伝子が染色
体ＤＮＡ上に残された場合は、正常なndh遺伝子を含む
プラスミドが細胞から脱落するため増殖できないが、正
常なndh遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残された場合は増殖
できる。したがって、温度感受性複製制御領域が機能す
る温度で増殖することができ、温度感受性複製制御領域
が機能しない温度で増殖できない株を選択することによ
って、染色体ＤＮＡ上のndh遺伝子が破壊され、正常なn
dh遺伝子をプラスミド上に保持する株を得ることができ
る。
【００３１】上記のようにして得られるndh遺伝子破壊
株は、温度感受性複製制御領域が機能する温度（例えば
低温）で培養すればndh遺伝子を細胞内に保持し、温度
感受性複製制御領域が機能しない温度（例えば高温）で
培養すればndh遺伝子を欠損する。
【００３２】尚、本発明に用いる微生物として、染色体
ＤＮＡ上のndh遺伝子を破壊し、正常なndh遺伝子をプラ
スミド上に保持させた後にrecA-にした株を用いると、
低温で培養中にプラスミド上のndh遺伝子が染色体へ組
み込まれるのを防ぎ、遺伝子の脱落を確実にすることが
できる点で好ましい。
【００３３】エシェリヒア・コリ用の温度感受性複製起
点を有するベクターとしては、例えばWO99/03988号国際
公開パンフレットに記載のプラスミドpMAN997等が、ま
た、コリネ型細菌用の温度感受性複製起点を有するベク
ターとしては、例えば特開平5-7491号公報に記載のプラ
スミドpHSC4等が挙げられるが、これらに限定されず、
他のベクターを用いることもできる。
【００３４】上記のようにして取得される微生物として
具体的には、ＳｏｘＭ型酸化酵素もしくはＮＤＨ−１又
はそれらの両方が増強された微生物、シトクロムｂｄ型
酸化酵素もしくはＮＤＨ−ＩＩ又はそれらの両方の活性
が低下又は消失した微生物、及び、ＳｏｘＭ型酸化酵素
もしくはＮＤＨ−１又はそれらの両方が増強され、か
つ、シトクロムｂｄ型酸化酵素もしくはＮＤＨ−ＩＩ又
はそれらの両方の活性が低下又は消失した微生物が挙げ
られる。より具体的には、例えば、ＳｏｘＭ型酸化酵素
の活性が増強され、かつ、ＮＤＨ−ＩＩを欠損したエシ
ェリヒア・コリが挙げられる。また、ＳｏｘＭ型酸化酵
素としては、シトクロムｂｏ型酸化酵素が挙げられる。
【００３５】本発明を適用する微生物としては、上記性
質を付与し得る微生物であれば特に制限されず、エシェ
リヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グ
ルタミカム）等のコリネ型細菌、バチルス・サブチリス
等のバチルス属細菌、セラチア・マルセッセンス等のセ
ラチア属細菌、サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母
等が挙げられる。
【００３６】具体的には、発酵生産物がＬ−スレオニン
の場合はエシェリヒア・コリVKPM B-3996(RIA 1867)(米
国特許第5,175,107号参照）、コリネバクテリウム・ア
セトアシドフィラム AJ12318（FERM BP-1172)(米国特許
第5,188,949号参照）等であり、Ｌ−リジンの場合はエ
シェリヒア・コリ AJ11442（NRRL B-12185, FERM BP-15
43)(米国特許第4,346,170号参照）、エシェリヒア・コ
リW3110(tyrA)（同株はエシェリヒア・コリW3110(tyrA)
/pHATerm（FERM BP-3653）からプラスミドpHATermを脱
落させることにより得られる。WO 95/16042国際公開パ
ンフレット参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム AJ12435（FERM BP-2294)（米国特許第5,304,4
76号）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム A
J3990（ATCC31269)(米国特許第4,066,501号参照）等で
あり、Ｌ−グルタミン酸の場合はエシェリヒア・コリ A
J12624 (FERM BP-3853)(フランス特許出願公開第2,680,
178号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムAJ12821（FERM BP-4172)（特開平5-26811号、フラ
ンス特許出願公開第2,701,489号）、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムAJ12475（FERM BP-2922)(米
国特許第5,272,067号参照）、ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムAJ13029（FERM BP-5189)(JP 95/015
86号国際公開パンフレット参照）等であり、Ｌ−ロイシ
ンの場合はエシェリヒア・コリ AJ11478（FERM P-5274)
(特公昭 62-34397号参照）、ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム AJ3718（FERM P-2516)(米国特許第3,
970,519号参照）等であり、Ｌ−イソロイシンの場合は
エシェリヒア・コリKX141（VKPM B-4781）(欧州特許出
願公開第519,113号参照）、ブレビバクテリウム・フラ
バム AJ12149（FERM BP-759)(米国特許第4,656,135号参
照）等であり、Ｌ−バリンの場合はエシェリヒア・コリ
VL1970（VKPM B-4411）(欧州特許出願公開第519,113号
参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム A
J12341（FERM BP-1763)(米国特許第5,188,948号参照）
等であり、Ｌ−フェニルアラニンの場合は、エシェリヒ
ア・コリ AJ12604（FERM BP-3579)(特開平5-236947号、
欧州特許出願公開第488,424号参照）、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム AJ12637（FERMBP-4160)(フ
ランス特許出願公開第 2,686,898号参照）等である。
【００３７】本発明に用いる微生物は、目的物質に応じ
て、目的物質の生合成に関与する酵素の活性が増強され
ていてもよい。また、目的物質の産生に不利な酵素の活
性が低下又は消失していてもよい。
【００３８】上記のような微生物を培地中に培養し、該
培地中に目的物質を生成蓄積させ、該目的物質を採取す
ることにより、目的物質を製造することができる。使用
する目的物質生産用の培地は、利用される微生物に応じ
て従来より用いられてきた周知の培地を用いてかまわな
い。つまり、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応
じその他の有機成分を含有する通常の培地である。本発
明を実施するための特別な培地は必要とされない。
【００３９】炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解
物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアル
コール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸
類等を用いることができる。
【００４０】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。
【００４１】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ1、
Ｌ−ホモセリン、Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵
母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの
他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウ
ム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００４２】培養は、利用される微生物に応じて従来よ
り用いられてきた周知の条件で行ってかまわない。例え
ば、好気的条件下で１６〜１２０時間培養を実施するの
がよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５
〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の
酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を
使用することができる。
【００４３】培養終了後の培地液からの代謝産物の採取
は、本願発明において特別な方法が必要とされることは
ない。すなわち、本発明は従来より周知となっているイ
オン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を組み合わせるこ
とにより実施できる。
【００４４】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
【００４５】
【実施例１】シトクロムbo型酸化酵素遺伝子のクローニ
ング エシェリヒア・コリのシトクロムbo型酸化酵素をコード
するcyoオペロン（cyoABCDE）の配列はすでに報告され
ており（Chepuri et al., The Journal of Biological
Chemistry, 265:11185-11192 (1990)）、その配列をも
とに同オペロンをクローニングした。
【００４６】具体的には、cyoオペロンを含む小原のフ
ァージライブラリー（Kohara et al., Cell, 50:495-50
8 (1987)）から目的とするcyo オペロン遺伝子の取得を
行った。同オペロンを含む小原のファージクローン147
[2H5]から、Wizard lambda prep（Promega）を用いてフ
ァージDNAを取得した。取得したファージDNA 147[2H5]
をPshBIで処理し、得られた5.5Kbのcyoオペロンを含む
断片を平滑末端化し、pMW119（ニッポンジーン）のSmaI
部位に挿入して、プロモーター領域を含むcyoオペロン
をクローニングした。得られたプラスミドには、cyoオ
ペロンがpMW119上のラクトースオペロンプロモーターと
は逆向きに挿入されている。このプラスミドをpMW(CYO)
B と命名した。
【００４７】pMW(CYO)Bをエシェリヒア・コリW3110株
（国立遺伝学研究所（日本国静岡県三島市）から入手）
に導入し、W3110/pMW(CYO)B を得た。既知の方法（Kita
et al., The Journal of Biological Chemistry, 259:
3368-3374 (1984)）を用いて、W3110とW3110/pMW(CYO)B
株の細胞抽出液中に存在する末端酸化酵素活性とし
て、 ユビキノールオキシダーゼ活性を測定した。結果
を表１に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】表１に示すように、pMW(CYO)B 導入株では
末端酸化酵素活性が増強されていることがわかった。こ
の末端酸化酵素活性の増強は、cyoオペロン増強による
シトクロムbo型酸化酵素活性の増強に由来すると考えら
れる。
【００５０】
【実施例２】NDH-II欠損株の取得 NDH-II欠損株を作製するために、内部が分断されたNDH-
IIの部分配列（破壊型NDH-II遺伝子）を作製した。NDH-
IIの部分配列は、公知のエシェリヒア・コリのNDH-IIを
コードする遺伝子ndhの配列（Young et al., European
Journal of Biochemistry, 116:165-170 (1981)）をも
とにクローニングした。
【００５１】具体的には、以下のようにして破壊型NDH-
II遺伝子を作製した（図１）。まず、NDH-IIの部分配列
を含む約2.4kbのDNA断片を、ndh-1プライマー（配列番
号１）とndh-2（配列番号２）をプライマーに用い、エ
シェリヒア・コリ染色体ＤＮＡよりPCRにより増幅し
た。この断片をpGEM-T vector（Promega）にクローニン
グし、pGEM-ndhを得た。このpGEM-ndhを制限酵素EcoR
I、StuIで処理して得られる0.5kbのDNA断片を回収し、E
coRI、SmaIで処理したpTWV229（宝酒造）に連結し、pTW
V-ndhを得た。
【００５２】次に、pGEM-ndhを制限酵素StuIで処理して
得られる0.9kbのDNA断片を回収し、pTWV-ndhのHincII部
位に挿入した。これにより、ndhの部分配列の内部にpTW
V229のマルチクローニングサイトの一部を含むpTWVΔnd
hを得た。pTWVΔndhは、ndh配列内部のStuI部位にpTWV2
29由来の17bpの配列が挿入された配列を持つ。続いて、
pTWVΔndhをHindIIIとEcoRIで処理し得られる1.5kbの断
片を、温度感受性プラスミドpMAN997（WO99/03988号国
際公開パンフレット参照）のHindIII、 EcoRI部位に挿
入し、pTS-Δndhを得た。このプラスミド pTS-Δndhの
温度感受性の性質を利用した一般的な相同性組換えの手
法（Matuyama et al., Journal of Bacteriology, 162:
1196 (1985)）で、W3110株のゲノム上のndhと相同組換
えを行い、ゲノム上のndhのコーディング領域にpTWV229
由来の17bpの配列が挿入され、正常なNDH-IIタンパクを
発現しないW3110(ndh) 株を取得した。このW3110(ndh)
株に、W3110(tyrA)よりP1トランスダクションにより、
テトラサイクリン耐性を指標として、tyrA欠損を導入
し、W3110(ndh,tyrA) 株を取得した。
【００５３】前記pMAN997は、pMAN031(J. Bacteriol.,
162, 1196 (1985))とpUC19（宝酒造社製）のそれぞれの
VspI-HindIII断片を繋ぎ換えたものである（図２）。ま
た、W3110(tyrA)株は、欧州特許公開92年488424号公報
に詳しい記載があるが、その調製方法について簡単にふ
れると以下の通りである。国立遺伝学研究所（静岡県三
島市）よりE. coli Ｗ３１１０株を入手した。同株をス
トレプトマイシン含有のＬＢプレートにまき、コロニー
を形成する株を選択してストレプトマイシン耐性株を取
得した。選択したストレプトマイシン耐性株と、E. col
i K-12 ME8424株を混合して、完全培地（L-Broth：1％
Bacto trypton, 0.5％ Yeast extract, 0.5％ NaCl）で
３７℃の条件下、１５分間静置培養して接合を誘導し
た。E. coli K-12 ME8424株は、（HfrPO45, thi, relA
1, tyrA::Tn10, ung-1, nadB）の遺伝形質を有し、国立
遺伝学研究所より入手できる。その後、培養物を、スト
レプトマイシン、テトラサイクリンおよびＬ−チロシン
を含有する完全培地（L-Broth：1％ Bacto trypton, 0.
5％ Yeast extract, 0.5％ NaCl, 1.5％ agar）にま
き、コロニーを形成する株を選択した。この株を、E. c
oli W3110(tyrA)株と命名した。
【００５４】欧州特許公開92年488424号公報には、この
菌株にプラスミドを導入して形成される株が多く記載さ
れている。たとえば、プラスミドpHATermを導入して得
られる株は、エシェリヒア・コリW3110(tyrA)/pHATerm
と命名され、1991年11月16日に通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所（郵便番号305 日本国茨城県つ
くば市東一丁目１番３号）に、ブダペスト条約に基づき
国際寄託されており、FERM BP-3653の受託番号が付与さ
れている。この菌株からプラスミドpHATermを常法によ
り脱落させることによってエシェリヒア・コリW3110(ty
rA)株を取得することができる。
【００５５】
【実施例３】Ｌ−リジンの製造 W3110(tyrA) と実施例２で取得された W3110(ndh,tyrA)
株に、実施例１で取得したpMW(CYO)Bを導入し、W3110
(tyrA)/pMW(CYO)B とW3110(ndh,tyrA)/pMW(CYO)Bを得
た。同様に、W3110(tyrA)にpMW119を導入して、W3110(t
yrA)/pMW119株を得た。このW3110(tyrA)/pMW(CYO)B
株、W3110(ndh,tyrA)/pMW(CYO)B 株と、対象としてW311
0(tyrA)/pMW119を用いて、フラスコ培養によりＬ−リジ
ン生産性を評価した。培養は、下記組成の培地を用い、
37℃で24〜48時間振盪することによって行った。結果を
表２に示す。
【００５６】（培地組成） グルコース 40 g/L MgSO4・7H2O 1 g/L KH2PO4 1 g/L FeSO4・7H2O 0.01 g/L MnSO4・5H2O 0.01 g/L Yeast Extract (Difco) 2 g/L L-チロシン 0.1 g/L または 0.05 g/L KOHでpH7.0に調整し、115℃で10分間オートクレーブし
た。ただし、グルコースとMgSO4・7H2Oは別殺菌した。ま
た培養前に、180℃で乾熱滅菌した局方CaCO3 30g/Lと、
抗生物質アンピシリン100μg/Lを加えた。
【００５７】
【表２】
【００５８】Ｌ−リジン生産性エシェリヒア・コリにお
いて、シトクロムbo型酸化酵素活性を増強することによ
り、Ｌ−リジン生産性が向上することが判明した。これ
は、エネルギー効率の良い呼吸鎖経路の増強によりエネ
ルギー獲得効率が向上し、そのエネルギーがＬ−リジン
生産に利用されるためであると考えられる。
【００５９】また、Ｌ−リジン生産性エシェリヒア・コ
リにおいて、NDH-IIを欠損させることによって、Ｌ−リ
ジン生産性が向上することが判明した。これはエネルギ
ー効率が悪い呼吸鎖経路の欠損によりエネルギー獲得効
率が向上し、そのエネルギーがＬ−リジン生産に利用さ
れるためであると考えられる。
【００６０】
【実施例３】Ｌ−スレオニンの製造 Ｌ−スレオニン生産菌エシェリヒア・コリVKPM B-3996
（RIA 1867）（米国特許第5,175,107号参照。以下、「B
-3996株」という）に、上記方法で取得されたpMW(CYO)B
を導入し、B-3996/pMW(CYO)Bを得た。B-3996 株は、ス
トレプトマイシン耐性マーカーを有する広域ベクタープ
ラスミドpAYC32（Chistorerdov, A.Y.,Tsygankov, Y.D.
Plasmid, 1986, 16, 161-167を参照のこと）にスレオニ
ンオペロンを挿入して得られたプラスミドpVIC40（WO90
/04636国際公開パンフレット）を保持している。B-3996
株は、USSR Antibiotics Research Institute (VNIIA)
に、登録番号 RIA1867のもとに寄託されている。
【００６１】対象として、B-3996にpMW119を導入してB-
3996/pMW119を得た。これらB-3996/pMW(CYO)BとB-3996/
pMW119を用いて、フラスコ培養によりＬ−スレオニン生
産性を評価した。培養は、表３記載の組成を有する培地
を用い、培養時間 38 時間、温度37℃、攪拌114〜116rp
mでおこなった。表３中、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分は別
々に調製 して殺菌し、冷却後、Ａ成分１６／２０容
量、Ｂ成分４／２０容量、Ｃ成分３０ｇ／Ｌとなるよう
に混合した。結果を表４に示す。
【００６２】
【表３】 表３ スレオニン生産培地 ──────────────────────────────── Ａ (NH4)2SO4 16g/L KH2PO4 1g/L FeSO4・7H2O 0.01g/L MnSO4・4H2O 0.01g/L Yeast Extract (Difco) 2g/L L-イソロイシン 50mg/L ニコチン酸 10mg/L KOHでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーフ゛ (16/20容) ──────────────────────────────── Ｂ 20% ク゛ルコース 115℃で10分オートクレーフ゛ ( 4/20容) MgSO4・7H2O 1g/L ──────────────────────────────── Ｃ 局方 CaCO3 180℃で２日乾熱 (30g/L) 抗生物質（ストレフ゜トマイシン 100μg/ml，カナマイシン 5μg/ml） ────────────────────────────────
【００６３】
【表４】
【００６４】Ｌ−スレオニン生産性エシェリヒア・コリ
において、シトクロムbo型酸化酵素活性を増強すること
により、Ｌ−スレオニン生産性が改善されることが判明
した。
【００６５】
【実施例４】Ｌ−フェニルアラニンの製造 エシェリヒア・コリW3110(tyrA)/pACMAB, pBR-aroG4株
から、一般的なプラスミドの精製法にしたがってプラス
ミドpACMABを回収した。同プラスミドは、Ｌ−フェニル
アラニン生合成固有系の脱感作型コリスミン酸ムターゼ
−プレフェン酸デヒドラターゼ（CM-PDH）遺伝子を含有
するＤＮＡ断片をプラスミドベクターpACYC184（Apr）
のBamHI、HindIII切断部位に挿入して得たプラスミドで
ある（WO97/08333号国際公開パンフレット参照）。W311
0(tyrA)/pACMAB, pBR-aroG4株（AJ12604と命名されてい
る）は、平成３年１月２８日に通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県
つくば市東一丁目１番３号）にFERM P-11975の受託番号
で寄託され、平成３年９月２６日にブダペスト条約に基
づく国際寄託に移管されて、FERM BP-3579の受託番号で
寄託されている。
【００６６】pACMABをSalIで処理し、末端を平滑化し
た。これに、前述の小原ファージDNA147[2H5]をPshBI処
理して得られた5.5kbのcyoオペロンを含有するDNA断片
を平滑末端化したものを挿入した。得られたプラスミド
pACMAB-cyoを、W3110(tyrA)/pBR-aroG4に導入した。得
られた形質転換株を、Ｌ−フェニルアラニン生産用培地
（グルコース20g、リン酸水素２ナトリウム29.4g、リン
酸２水素カリウム6g、塩化ナトリウム1g、塩化アンモニ
ウム2g、クエン酸ナトリウム10g、グルタミン酸ナトリ
ウム0.4g、硫酸マグネシウム７水和物3g、塩化カルシウ
ム0.23g、サイアミン塩酸塩2mg、Ｌ−チロシン１00mgを
水１Ｌに含む。pH7.0）を用いて、37℃で40時間培養し
た。培地中のＬ−フェニルアラニンを高速液体クロマト
グラフィーにより定量した。結果を表５に示す。
【００６７】
【表５】
【００６８】Ｌ−フェニルアラニン生産性エシェリヒア
・コリにおいて、シトクロムbo型酸化酵素活性を増強す
ることにより、Ｌ−フェニルアラニン生産性が向上する
ことが判明した。
【００６９】
【発明の効果】本発明により、微生物を培地中に培養
し、該培地中に目的物質を生成蓄積させ、該目的物質を
採取する、微生物を利用した目的物質の製造法におい
て、従来とは異なる原理によって、その目的物質の生産
性を改善することができる。
【００７０】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.） <120> 微生物を利用した物質の製造法 <130> P-7308 <141> 2000-07-05 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying NDH-II gene (ndh-1) <400> 1 cgatggaagc ttccgcgatt atggg 25 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying NDH-II gene (ndh-2) <400> 2 aagcgcggaa ttcgtccttc aatcatc 27
【図面の簡単な説明】
【図１】 NDH-II遺伝子破壊株作製用プラスミドpTS-Δ
ndhの構築を示す図。
【図２】 pMAN997の構築を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 河原 義雄 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 伊藤 久生 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 倉橋 修 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA71 BA80 CA03 DA06 DA10 EA04 GA11 4B064 AE10 AE25 AE29 AF21 CA02 CA19 CC24 DA03 DA10 4B065 AA22X AA24X AA26X AA26Y AA32X AB01 AC14 BA02 CA17 CA23 CA42 CA44

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 微生物を培地中に培養し、該培地中に目
    的物質を生成蓄積させ、該目的物質を採取する、微生物
    を利用した目的物質の製造法において、前記微生物は、
    呼吸鎖経路として、エネルギー効率の良い呼吸鎖経路
    と、エネルギー効率の悪い呼吸鎖経路を保持する微生物
    の親株から創製され、以下の性質の一方又は両方を有す
    る変異株又は遺伝子組換え株であることを特徴とする、
    微生物を利用した目的物質の製造法： （Ａ）エネルギー効率の良い呼吸鎖経路増強されてい
    る、（Ｂ）エネルギー効率の悪い呼吸鎖経路が欠損して
    いる。
  2. 【請求項２】 エネルギー効率の良い呼吸鎖経路に関与
    する呼吸鎖酵素をコードする遺伝子のコピー数の上昇、
    又は同遺伝子の発現調節配列の改変により前記呼吸鎖経
    路が増強された、請求項１記載の目的物質の製造法。
  3. 【請求項３】 エネルギー効率の悪い呼吸鎖経路に関与
    する呼吸鎖酵素をコードする遺伝子が破壊されたことに
    より呼吸鎖経路が欠損した、請求項１又は２に記載の目
    的物質の製造法。
  4. 【請求項４】 エネルギー効率の良い呼吸鎖酵素がＳｏ
    ｘＭ型酸化酵素、ｂｃ１複合体もしくはＮＤＨ−１又は
    それらの２種又は３種である請求項１〜３のいずれか一
    項に記載の目的物質の製造法。
  5. 【請求項５】 エネルギー効率の悪い呼吸鎖酵素がシト
    クロムｂｄ型酸化酵素もしくはＮＤＨ−ＩＩ又はそれら
    の両方である請求項１〜４のいずれか一項に記載の目的
    物質の製造法。
  6. 【請求項６】 前記微生物は、ＳｏｘＭ型酸化酵素の活
    性が増強され、かつ、ＮＤＨ−ＩＩを欠損した、請求項
    １〜５のいずれか一項に記載の目的物質の製造法。
  7. 【請求項７】 ＳｏｘＭ型酸化酵素がシトクロムｂｏ型
    酸化酵素である請求項１〜６のいずれか一項に記載の目
    的物質の製造法。
  8. 【請求項８】 前記微生物がエシェリヒア属細菌又はコ
    リネ型細菌である請求項１〜７のいずれか一項に記載の
    目的物質の製造法。
  9. 【請求項９】 目的物質がＬ−アミノ酸又は核酸である
    請求項１〜８のいずれか一項に記載の目的物質の製造
    法。
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