BRPI0016995B1 - bactéria escherichia coli geneticamente modificada, e, método para produzir l-lisina - Google Patents
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Abstract
"bactéria escherichia, e, método para produzir l-lisina". uma bactéria escherichia (1) que abriga a diidrodipicoiinato sintase da qual a inibição de retroalimentação pela l-lisina é dessensibilizada e a aspartocinase da qual a inibição de retroalimentação pela l-lisina é dessensibilizada, (2) em que a atividade intracelular da diidrodipicolinato reductase é intensificada e (3) em que um gene da diaminopimelato desidrogenase é introduzido ou as atividades intracelulares da tetraidrodipicolinato succinilase e da succinil diaminopimelato desacilase são intensificadas em que a atividade intracelular da aspartato semialdeído desidrogenase ou da fosfoenolpiruvato carboxilase é intensificada, é cultivada em um meio adequado para produzir e acumular l-lisina na cultura e a l-lisina é coletada da cultura.
Description
"BACTÉRIA ESCHERICHIA COLI GENETICAMENTE MODIFICADA, E, MÉTODO PARA PRODUZIR L-LISINA".
CAMPO TÉCNICO A presente invenção diz respeito a indústrias microbianas. Mais especifícamente, a presente invenção diz respeito a um método para produzir L-lisina pela fermentação e um microorganismo usado para o método de produção.
FUNDAMENTOS DA TÉCNICA
Na produção de L-lisina pela fermentação, cepas isoladas de mutantes naturais ou artificiais desta têm sido convencionalmente usadas de modo a melhorar a produtividade. Muitas cepas mutantes artificiais que produzem L-lisina são conhecidas e muitas delas são cepas resistentes à S-2-aminoetilcisteína (AEC) e pertencem ao gênero Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus ou Escherichia. Além disso, várias técnicas foram divulgadas para aumentar a produção de aminoácido, por exemplo, o uso de um transformante obtido usando-se DNA recombínante.
Como para as bactérias Escherichia, por exemplo, métodos para produzir L-lisina usando-se uma cepa em que a atividade da diidrodipicolinato sintase (DDPS) é intensificada foram divulgados no Pedido de Patente Japonesa Aberto ao Público (Kokai) N° 56-18596, Patente US N° 4.346.170 e Applied Microbiology e Biotechnology, 15, pp. 227 a 331 (1982). Além disso, um método para produzir L-lisina usando uma bactéria Escherichia em que a DDPS derivada de uma bactéria Corynebacterium é introduzida foi divulgada na Publicação de Patente Coreana N° 92-8382. Além disso, um método para produzir L-lisina usando uma cepa que é transformada com um plasmídeo contendo o DNA que codifica a diidrodipicolinato sintase derivada de uma bactéria Escherichia tendo uma mutação para dessensibilizar a inibição de retroalimentação pela L-lisina, o DNA que codifica a aspartocinase da qual a inibição de retroalimentação pela L-lisina é dessensibilizada, o DNA que codifica a diidrodipicolinato reductase e o DNA que codifica a diaminopimelato desidrogenase derivado de uma bactéria corineforme é divulgado no Pedido Internacional N2 WO 95/16042.
Como para as bactérias Brevibacterium, o Pedido Internacional N2 WO 95/11985 divulga que a produtividade da L-lisina pode ser melhorada pela intensificação da atividade da nicotinamida adenina dinucleotídeo transidrogenase intracelular. Além disso, um método para produzir L-lisina usando uma cepa em que a atividade da fosfoenolpiruvato carboxilase é unicamente intensificada e um método para produzir L-lisina usando uma cepa em que a atividade da aspartato semialdeído desidrogenase é unicamente intensificada são divulgados no Pedido de Patente Japonesa Aberto ao Público N2 60-87788 e a Publicação de Patente Japonesa (Kokoku) N2 6-102028, respectivamente.
Na produção industrial de aminoácidos pela fermentação, a produção é realizada em uma grande escala. Portanto, mesmo melhora no rendimento de alguns porcentos pode fornecer valor industrial significante e assim a melhora do rendimento é desejada independente do grau da melhora. DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO
Um objetivo da presente invenção é fornecer um método melhorado para produzir L-lisina pela fermentação comparado com os métodos convencionais.
Os presentes inventores estudaram assiduamente de modo a alcançar o objetivo anteriormente mencionado. Como um resultado eles descobriram que, se a atividade da aspartato semialdeído desidrogenase ou da fosfoenolpiruvato carboxilase fosse intensificada em uma bactéria Escherichia tendo uma propriedade especificada e se a atividade ou atividades de uma enzima ou enzimas específicas fossem intensificadas além das enzimas anteriormente mencionadas em tal bactéria Escherichia, a produtividade da bactéria quanto a L-lisina poderia ser melhorada e eles realizaram a presente invenção com base nestas verificações.
Isto é, a presente invenção fornece: em um primeiro aspecto, uma bactéria Escherichia em que (1) as atividades intracelulares de diidrodipicolinato sintase (SEQID NO: 8), aspartocinase (SEQID NO: 10) e diidrodipicolinato reductase (SEQ ID NO: 12) são intensificadas e (2) a atividade intracelular de diaminopimelato desidrogenase (SEQ ID NO: 14) ou as atividades intracelulares de tetraidrodipicolinato succinilase (SEQ ID NO: 16) e succinil diaminopimelato desacilase (SEQ ID NO: 18) é/são intensificada(s) em que a atividade intracelular da aspartato semialdeído desidrogenase (SEQ ID NO: 28) ou fosfoenolpiruvato carboxilase (SEQ ID NO: 26) é intensificada; em um segundo aspecto, uma bactéria Escherichia em que (1) as atividades intracelulares de diidrodipicolinato sintase (SEQ ID NO: 8), aspartocinase (SEQ ID NO: 10) e diidrodipicolinato reductase (SEQ ID NO: 12) são intensificadas e (2) a atividade intracelular de diaminopimelato desidrogenase (SEQ ID NO: 14) ou as atividades intracelulares de tetraidrodipicolinato succinilase (SEQ ID NO: 16) e succinil diaminopimelato desacilase (SEQ ID NO: 18) é/são intensificada(s) em que a atividade intracelular de fosfoenolpiruvato carboxilase (SEQ ID NO: 26) e a atividade intracelular de nicotinamida adenina dinucleotídeo transidrogenase (SEQ ID Nos: 20 e 22) ou aspartato semialdeído desidrogenase (SEQ ID NO: 28) são intensificadas; e em um terceiro aspecto, uma bactéria Escherichia em que (1) as atividades intracelulares de diidrodipicolinato sintase (SEQ ID NO: 8), aspartocinase (SEQ ID NO: 10) e diidrodipicolinato reductase (SEQ ID NO: 12) são intensificadas e (2) a atividade intracelular de diaminopimelato desidrogenase (SEQ ID NO: 14) ou as atividades intracelulares de tetraidrodipicolinato succinilase (SEQ ID NO: 16) e succinil diaminopimelato desacilase (SEQ ID NO: 18) é/são intensificada(s) em que as atividades intracelulares de fosfoenolpiruvato carboxilase (SEQ ID NO: 26) e nicotinamida adenina dinucleotídeo transidrogenase (SEQ ID Nos: 20 e 22) e a atividade intracelular da aspartato semialdeído desidrogenase (SEQ ID NO: 28) ou da aspartase (SEQ ID NO: 24) são intensificadas (daqui em diante, as bactérias de acordo com os três aspectos anteriormente mencionados também são coletivamente chamadas de “bactérias da presente invenção”).
Nas bactérias da presente invenção, é preferido que as atividades intracelulares da aspartato semialdeído desidrogenase e aspartase sejam intensificadas.
Além disso, nas bactérias da presente invenção, é preferido que a aspartocinase, diidrodipicolinato reductase, tetraidrodipicolinato succinilase, succinil diaminopimelato desacilase, fosfoenolpiruvato carboxilase e a aspartato semialdeído desidrogenase sejam cada uma derivadas de uma bactéria Escherichia, a nicotinamida adenina dinucleotídeo transidrogenase e a aspartase, se presentes, são cada uma derivadas de uma bactéria Escherichia, diidrodipicolinato sintase é derivada de uma bactéria Escherichia ou uma bactéria Brevibacterium e a diaminopimelato desidrogenase seja derivada de uma bactéria Brevibacterium.
Nas bactérias da presente invenção, é preferido que a atividade intracelular de enzima da qual a atividade intracelular é intensificada, seja intensificada por um dos seguintes itens ou qualquer combinação destes. (1) Introdução de um plasmídeo tendo um gene da enzima. (2) Aumento do número de cópia de um gene da enzima no cromossoma. (3) Modificação de uma seqüência promotora de um gene da enzima no cromossoma.
Além disso, nas bactérias da presente invenção, é preferido que as atividades intracelulares de diidrodipicolinato sintase e aspartocinase sejam intensificadas pelo acolhimento da diidrodipicolinato sintase da qual a inibição de retroalimentação pela L-lisina é dessensibilizada e a aspartocinase da qual a inibição de retroalimentação pela L-lisina é dessensibilizada e a atividade intracelular da diaminopimelato desidrogenase é intensificada pela introdução de um gene da diaminopimelato desidrogenase. A presente invenção também fornece um método para produzir L-lisina, que compreende cultivar qualquer uma das bactérias da presente invenção em um meio adequado para produzir e acumular L-lisina na cultura e coletar a L-lisina da cultura (daqui em diante também chamado de “método de produção da presente invenção).
EXPLICACÀQ RESUMIDA DOS DESENHOS A Figura 1 mostra um processo de produção do plasmídeo RSF24P derivado de RSF1010, que contém dapA*24. A Figura 2 mostra um processo de produção do plasmídeo RSFD80 contendo dapA*24 e lysC*80. A Figura 3 mostra um processo de produção do plasmídeo pCABl contendo dapA*24, lysC*80 e dapB. A Figura 4 mostra um processo de produção do plasmídeo pCABD2 contendo dapA*24, lysC*80, dapB e ddh. A Figura 5 mostra um processo de produção do plasmídeo pCABDEl contendo dapA*24, lysC*80, dapB, dapD e dapE. A Figura 6 mostra a estrutura do plasmídeo pppc contendo ppc. A Figura 7 mostra a estrutura do plasmídeo pasd contendo asd. A Figura 8 mostra um processo de produção do plasmídeo pMW::THY contendo pntAB (pntA e pntB). A Figura 9 mostra um processo de produção do plasmídeo pMW 118: :aspA contendo aspA. A Figura 10 mostra um processo de produção do plasmídeo ppcd contendo ppc e asd. A Figura 11 mostra um processo de produção do plasmídeo pPTS contendo ppc e pntAB. A Figura 12 mostra um processo de produção do plasmídeo pAPW contendo ppc e aspA. A Figura 13 mostra um processo de produção do plasmídeo pPTd contendo ppc, pntAB e asd. A Figura 14 mostra um processo de produção do plasmídeo pAPT contendo ppc, pntAB e aspA. A Figura 15 mostra um processo de produção do plasmídeo pAPTK contendo ppc, pntAB e aspA. A Figura 16 mostra um processo de produção do plasmídeo pSd contendo asd. A Figura 17 mostra um processo de produção do plasmídeo pKD contendo ppc, pntAB, aspA e asd. A Figura 18 mostra um processo de produção do plasmídeo pUTES contendo tetpro. A Figura 19 mostra um processo de produção do plasmídeo pUEBL3, contendo tetpro e dapA derivado de Brevibacterium lactofermentum à jusante de tetpro. A Figura 20 mostra um processo de produção do plasmídeo pCABD(B) contendo dapA derivado de Brevibacterium lactofermentum (Brev. dapA), lysC, dapB e ddh. MELHOR MODO DE REALIZAR A INVENÇÃO <1> Bactérias da presente invenção As bactérias da presente invenção são bactérias Escherichia em que (1) as atividades intracelulares de diidrodipicolinato sintase (SEQID NO: 8), aspartocinase (SEQ ID NO: 10) e diidrodipicolinato reductase (SEQ ID NO: 12) são intensificadas e (2) a atividade intracelular de diaminopimelato desidrogenase (SEQ ID NO: 14) ou as atividades intracelulares de tetraidrodipicolinato succinilase (SEQ ID NO: 16) e succinil diaminopimelato desacilase (SEQ ID NO: 18) é/são intensificada(s) e as atividades intracelulares das seguintes enzimas são mais intensificadas: (1) aspartato semialdeído desidrogenase (SEQ ID NO: 28) ou fosfoenolpiruvato carboxilase (SEQ ID NO: 26), (2) fosfoenolpiruvato carboxilase (SEQ ID NO: 26) e nicotinamida adenina dinucleotídeo transidrogenase (SEQ ID Nos: 20 e 22) (daqui em diante também chamada de “transidrogenase”) ou aspartato semialdeído desidrogenase (SEQ ID NO: 28) ou (3) fosfoenolpiruvato carboxilase (SEQ ID NO: 26) e transidrogenase (SEQ ID Nos: 20 e 22) e aspartato semialdeído desidrogenase (SEQ ID NO: 28) ou aspartase (SEQ ID NO: 24).
As bactérias da presente invenção são preferivelmente bactérias Escherichia em que as atividades intracelulares de fosfoenolpiruvato carboxilase, transidrogenase, aspartato semialdeído desidrogenase e aspartase são mais intensificadas.
As bactérias da presente invenção preferivelmente pertencem a Escherichia coli (E. coli).
Neste relatório descritivo, a expressão “a atividade intracelular é intensificada” significa que a atividade enzimática intracelular é aumentada comparada com uma cepa selvagem (por exemplo E. coli cepa W3110) ou uma cepa precursora (cepa em que as atividades intracelulares de todas as enzimas incluídas nas combinações especificadas na presente invenção não são intensificadas) e também significa que uma bactéria tem uma atividade enzimática que não é possuída por uma cepa selvagem ou uma cepa precursora. Os métodos de medição para as atividades das enzimas anteriormente mencionadas são conhecidos e a intensificação das atividades intracelulares pode ser facilmente confirmado por aqueles habilitados na técnica.
Meios de intensificar as atividades intracelulares incluem os seguintes meios e suas combinações, mas não são limitado a estes.
Primeiro de tudo, meios de aumentar a quantidade de expressão das enzimas podem ser mencionados.
Especificamente, como meios de aumentar a quantidade de expressão de enzimas, os seguintes meios podem ser mencionados. (1) Introdução de plasmídeo contendo gene de enzima Como o plasmídeo, um vetor autonomamente replicável em uma célula da bactéria Escherichia pode ser usado. Este pode ser introduzido de uma maneira conhecida. Isto é, um gene de interesse pode ser inserido no vetor e uma bactéria Escherichia pode ser transformada com este vetor. Este vetor é preferivelmente um plasmídeo do tipo de cópia múltipla.
Os genes podem ser transportados pelo mesmo plasmídeo ou por plasmídeos diferentes. Alguns dos genes podem ser transportados pelo mesmo plasmídeo. Quando dois ou mais tipos de plasmídeos são usados, é preferível usar plasmídeos que tenham sistemas de divisão estável que permitam a coexistência estável destes plasmídeos em uma célula. A ordem de introdução dos genes não é particularmente limitada. (2) Aumento do número de cópia de gene de enzima no cromossoma O número de cópia pode ser aumentado pela amplificação do DNA no DNA cromossômico usando o fago Mu ou semelhante. O DNA no DNA cromossômico pode ser um originalmente possuído pelas bactérias Escherichia ou um incorporado no cromossoma de um microorganismo hospedeiro por um método usando transdução, transposon (Berg, D. E. e Berg C. M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)), fago Mu (Pedido de Patente Japonesa Aberto ao Público N2 2-109985) ou recombinação homóloga (Experiments in Molecular Genetics and Cold Spring Harbor Lab. (1972)). (3) Modificação de seqüência promotora de gene de enzima Uma seqüência promotora pode ser modificada para aumentar a quantidade de transcrição de um gene e desse modo aumentar a quantidade de expressão. Por exemplo, um promotor pode ser realçado pela introdução de uma mutação no promotor para aumentar a quantidade de transcrição de um gene localizado à jusante do promotor. Diferente de introduzir uma mutação no promotor, um promotor que pode funcionar em bactérias Escherichia tal como lac, trp, tac, trc e PL podem ser introduzidos de maneira nova. Altemativamente, a quantidade de transcrição de gene pode ser aumentada pela introdução de maneira nova de um intensificador. Embora a seqüência promotora possa ser uma para um gene da enzima no cromossoma ou uma para um gene da enzima em um plasmídeo, é preferivelmente uma para o gene da enzima no cromossoma. A introdução de genes tais como promotores no DNA cromossômico está descrita no Pedido de Patente Japonesa Aberto ao Público N2 1-215280, por exemplo.
As origens dos genes para as enzimas anteriormente mencionadas não são particularmente limitadas e aquelas obtidas de várias origens podem ser usadas contanto que os genes possam ser expressados e os produtos genéticos podem funcionar em bactérias Escherichia.
Mais adiante, os métodos para a obtenção de genes do sistema de biossíntese da L-lisina e gene da transidrogenase de E. coli e genes da diidrodipicolinato sintase e da diaminopimelato desidrogenase de Brevibacterium lactofermentum serão exemplificados.
Um gene da fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) pode ser obtido a partir do plasmídeo pS2 (Sabe, H. et al., Gene, 31, 279 (1984)) ou pT2, que contêm este gene. Um fragmento de DNA que contém ppc pode ser obtido digerindo-se pS2 com Aatll e AflII. Além disso, um fragmento de DNA que contém ppc também pode ser obtido digerindo-se pT2 com Smal e Seal. Uma E. coli da cepa F15 que abriga pT2 (AJ12873) foi depositada no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science e Technology, Ministry of International Trade and Industry (postal code 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) em 15 de julho de 1993 e recebeu um número de acesso de FERM P-13752. Depois, foi transferida para um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapest em 11 de julho de 1994 e recebeu um número de acesso de FERM BP-4732.
Um gene da aspartocinase (lysC) pode ser obtido pela amplificação por PCR usando DNA cromossômico de E. coli como um padrão e dois tipos de iniciadores de oligonucleotídeo preparados com base na seqüência de nucleotídeo conhecida de lysC (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N. e Patte, J. C., J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986) (por exemplo, aqueles mencionados no Pedido Internacional N2 WO 95/16042, SEQ ID NOS: 5 e 6).
Um gene da aspartato semialdeído desidrogenase (asd) pode ser obtido a partir do plasmídeo pAD20 (Haziza, C. et al. EMBO, 1, 379 (1982)), que contém este gene. Se o pAD20 é digerido com Asei e Ciai, um fragmento de DNA contendo asd será obtido.
Um gene da diidrodipicolinato sintase (dapA) pode ser obtido pela amplificação por PCR usando DNA cromossômico de E. coli como um padrão e dois tipos de iniciadores de oligonucleotídeo (por exemplo, aqueles das SEQ ID NOS: 1 e 2 mencionadas no Pedido Internacional Na WO 95/16042) preparados com base na seqüência de nucleotídeo conhecida de dapA (Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297 (1986)).
Um gene da diidrodipicolinato reductase (dapB) pode ser obtido pela amplificação por PCR usando DNA cromossômico de E. coli como um padrão e dois tipos de iniciadores de oligonucleotídeo (por exemplo, aqueles das SEQ ID NOS: 9 e 10 mencionados no Pedido Internacional N2 WO 95/16042) preparados com base na seqüência de nucleotídeo conhecida de dapB (Bouvier, J. et al., J. Biol. Chem., 259,14829 (1984)).
Um gene da tetraidrodipicolinato succinilase (dapD) pode ser obtido pela amplificação por PCR usando DNA cromossômico de E. coli como um padrão e dois tipos de iniciadores de oligonucleotídeo (por exemplo, aqueles das SEQ ID NOS: 15 e 16 mencionados no Pedido Internacional N2 WO 95/16042) preparados com base na seqüência de nucleotídeo conhecida de dapD (Richaud, C. et al., J. Biol. Chem., 259, 14824(1984)).
Um gene da succinil diaminopimelato desacilase (dapE) pode ser obtido pela amplificação por PCR usando DNA cromossômico de E. coli como um padrão e dois tipos de iniciadores de oligonucleotídeo (por exemplo, aqueles das SEQ ID NOS: 17 e 18 mencionados no Pedido Internacional N° WO 95/16042) preparados com base na seqüência de nucleotídeo conhecida de dapE (Bouvier, J. et al., J. Bacteriol, 174, 5265 (1992)).
Um gene da aspartase (aspA) pode ser obtido pela amplificação por PCR usando DNA cromossômico de E. coli como um padrão e dois tipos de iniciadores de oligonucleotídeo (por exemplo, aqueles das SEQ ID NOS: 5 e 6 mencionados na Listagem de Seqüência do presente relatório descritivo) preparados com base na seqüência de nucleotídeo conhecida de daspA (Woods, S. A. et al, Biochem. J., 237 (2), 547 a 557 (1986)).
Um gene da transidrogenase (pntAB) pode ser preparado com base na seqüência de nucleotídeo conhecida do gene da transidrogenase (D. M. Clarke et al, Eur. J. Biochem., 158, 647 a 653 (1986)). Na E. coli, a transidrogenase é composta de duas subunidades, que são codificadas por pntA e pntB, respectivamente (D. M. Clarke et al., acima). Portanto, ambos genes são preparados (ver, por exemplo, o Pedido Internacional N2 WO 95/11985).
Também pode ser obtido a partir de um plasmídeo contendo pntAB. Como o plasmídeo contendo pntAB, o plasmídeo pMW::THY mencionado no Pedido Internacional N2 WO 95/11985 pode ser mencionado. Este plasmídeo é um plasmídeo recombinante obtido pela ligação de um fragmento de 3,0 kb de DNA de E. coli da cepa K-12 MC 1061, que contém pntA e pntB e um fragmento BamHI e HindIII do vetor plasmídico pMWl 18. Uma Escherichia coli da cepa JM109 que abriga pMW::THY foi designada como cepa AJ12929 e depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industiy (postal code 305-0046, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) em 4 de outubro de 1993 e recebeu um número de acesso de FERM P-13890. Depois, foi transferida para um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapest em 11 de setembro de 1994 e recebeu um número de acesso de FERM BP-4798.
Um gene da dii drodipicolinato sintase (dapA) de Brevibacterium lactofermentum pode ser obtido pela amplificação por PCR usando o DNA cromossômico de Brevibacterium lactofermentum como um padrão e dois tipos de iniciadores de oligonucleotídeo (por exemplo, aqueles das SEQID NOS: 3 e 4 mencionados na Listagem de Seqüência do presente relatório descritivo) preparados com base na seqüência de nucleotídeo conhecida de dapA (Bonassie, S. et al., N.A.R., 18 (21), 6421 (1990)).
Um gene da diaminopimelato desidrogenase (ddh) de Brevibacterium lactofermentum pode ser obtido pela amplificação por PCR usando o DNA cromossômico de Brevibacterium lactofermentum como um padrão e dois tipos de iniciadores de oligonucleotídeo (por exemplo, aqueles das SEQ ID NOS: 11 e 12 mencionados no Pedido Internacional Ns WO 95/16042) preparados com base na seqüência de nucleotídeo conhecida de ddh de Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15,3917(1987)).
Como os meios de intensificar as atividades intracelulares, também podem ser mencionados meios de aumentar as atividades específicas das enzimas. Estes meios podem ser combinados com os meios de aumentar as quantidades de expressão das enzimas.
Como meios de aumentar as atividades específicas das enzimas, podem ser mencionados a introdução de uma enzima tendo uma mutação para aumentar a atividade específica, a inclusão de uma enzima da qual a inibição de retroalimentação é dessensibilizada, quando a enzima recebe a inibição de retroalimentação e assim por diante.
Os exemplos da enzima da qual a inibição de retroalimentação é dessensibilizada incluem a diidrodipicolinato sintase (DDPS) da qual a inibição de retroalimentação pela L-lisina é dessensibilizada e a aspartocinase (AK) da qual a inibição de retroalimentação pela L-lisina é dessensibilizada A expressão que “a inibição de retroalimentação pela L-lisina é dessensibilizada” significa que a dessensibilização substancial da inibição é suficiente e não é requerido que a inibição deva ser completamente dessensibilizada. Além disso, uma enzima derivada de um organismo outro que não as bactérias Escherichia também está incluída na enzima da qual a inibição de retroalimentação pela L-lisina é dessensibilizada, independente de se é uma enzima do tipo selvagem ou do tipo mutante do organismo, se o grau da inibição de retroalimentação pela L-lisina é mais baixa do que aquela de uma enzima do tipo selvagem derivada de uma bactéria Escherichia. Portanto, uma enzima que é originalmente livre da inibição de retroalimentação pela L-lisina tal como a DDPS derivada de bactérias Brevibacterium também é incluída. O grau da inibição de retroalimentação pela L-lisina pode ser avaliado por métodos conhecidos tais como os métodos descritos no Pedido Internacional Ne WO 95/16042 exemplos 1 e 2.
Como a DDPS da qual a inibição de retroalimentação pela L-lisina é dessensibilizada (DDPS dessensibilizada) e a AK da qual a inibição de retroalimentação pela L-lisina é dessensibilizada (AK dessensibilizada), aquelas divulgadas no Pedido Internacional Ns WO 95/16042 e no Pedido de Patente Japonesa Aberto ao Público N° 10-113183 podem ser mencionadas.
Isto é os exemplos da DDPS dessensibilizada incluem aquelas tendo uma mutação que dessensibiliza a inibição de retroalimentação pela L-lisina encontrada na DDPS do tipo selvagem. Como a DDPS do tipo selvagem, aquelas derivadas de bactérias Escherichia especialmente DDPS derivada de E. coli, podem ser mencionadas. Os exemplos da mutação que dessensibiliza a inibição de retroalimentação pela L-lisina de DDPS incluem: (1) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de alanina na posição 81 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de valina), (2) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de histidina na posição 118 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de tirosina) e (3) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de alanina na posição 81 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de valina) e substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de histidina na posição 118 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de tirosina) na seqüência de aminoácido da DDPS apresentada como a SEQ ID NO: 4 no Pedido Internacional Ns WO 95/16042 em que a posição é contada a partir do término N da DDPS. É bem conhecido que diferenças na seqüência de aminoácido que não afetem a atividade podem ocorrer entre as espécies ou cepas e um resíduo de aminoácido que corresponda aos resíduos de aminoácido específicos anteriormente mencionados pode ser facilmente reconhecido por aqueles habilitados na técnica.
Outros exemplos da DDPS dessensibilizada incluem DDPS derivada de bactérias corineformes, por exemplo, Brevibacterium lactofermentum (Cremer J. et al., J. Gen. Microbiol., 134, 3221 a 3229 (1988)).
De modo a fazer com que uma DDPS dessensibilizada seja abrigada pelas bactérias Escherichia, por exemplo, o DNA que codifica a DDPS dessensibilizada pode ser introduzido.
Os exemplos do DNA que codifica a DDPS dessensibilizada incluem aqueles que correspondem ao DNA que codifica uma DDPS do tipo selvagem tendo uma mutação para dessensibilizar a inibição de retroalimentação pela L-lisina da DDPS codificada. A seguir, um método para se obter o DNA que codifica a DDPS dessensibilizada (gene da DDPS dessensibilizada) será explicado exemplificando-se a DDPS derivada de bactérias Escherichia. Com relação à DDPS de outros organismos, o DNA pode ser similarmente obtido. Além disso, se uma DDPS do tipo selvagem derivada de um outro organismo é uma DDPS dessensibilizada, o DNA que a codifica pode ser usado como tal. O DNA que codifica a DDPS do tipo selvagem não é particularmente limitado contanto que codifique a DDPS derivada de uma bactéria Escherichia. Especificamente, o DNA que codifica a seqüência de aminoácido apresentada no Pedido Internacional N° WO 95/16042, SEQ ID NO: 4, pode ser mencionado. Mais especificamente, pode ser mencionada a seqüência representada pelos números de nucleotídeo de 272 a 1147 dentro da seqüência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 3 do mesmo. Nestas seqüências, uma tendo uma mutação de seqüência de nucleotídeo que cause a substituição dos resíduos de aminoácido anteriormente mencionados é o DNA que codifica uma DDPS dessensibilizada. Além disso, o tipo do códon que corresponde ao resíduo de aminoácido substituído não é particularmente limitado, contanto que codifique o resíduo de aminoácido. Além disso, também é esperado que exista leve diferença na seqüência de aminoácido da DDPS contida entre as espécies e cepas bacterianas. Entretanto, aquelas que tenham tal diferença que cause a substituição, supressão ou inserção de resíduos de aminoácido nas posições que não afetam a atividade da enzima caem dentro do escopo do gene da DDPS dessensibilizada.
Tal gene da DDPS dessensibilizada pode ser obtido, por exemplo, como segue. Primeiro, o DNA contendo um gene da DDPS do tipo selvagem ou um outro gene da DDPS tendo uma mutação é submetido a um tratamento de mutação in vitro e o DNA que passou pelo tratamento de mutação e um DNA vetor compatível com um hospedeiro são ligados para preparar um DNA recombinante. O DNA recombinante é introduzido nos microorganismos hospedeiros para se obter os transformantes e um transformante que venha a expressar uma DDPS dessensibilizada é selecionado dos transformantes. Tal transformante abriga o gene da DDPS dessensibilizada. Altemativamente, o DNA contendo um gene da DDPS do tipo selvagem ou um outro gene da DDPS tendo uma mutação e um DNA vetor compatível com um hospedeiro podem ser ligados para preparar um DNA recombinante. Depois, o DNA recombinante pode ser submetido a um tratamento de mutação in vitro e introduzido nos microorganismos hospedeiros para se obter transformantes e um transformante que venha a expressar uma DDPS dessensibilizada pode ser selecionado dos transformantes. Tal transformante também abriga o gene da DDPS dessensibilizada.
Além disso, um microorganismo que produza uma DDPS do tipo selvagem pode ser submetido a um tratamento de mutação para preparar uma cepa mutante que produza uma DDPS dessensibilizada e depois um gene da DDPS dessensibilizada pode ser obtido a partir da cepa mutante. Altemativamente, se um transformante em que um DNA recombinante ligado com um gene do tipo selvagem é introduzido é submetido a um tratamento de mutação para preparar uma cepa mutante que produza uma DDPS dessensibilizada e depois um DNA recombinante é coletado da cepa mutante, um gene da DDPS dessensibilizada é criado neste DNA.
Os exemplos de agentes para o tratamento de mutação in vitro de DNA incluem hidroxilamina e assim por diante. A hidroxilamina é um agente de tratamento de mutação químico que causa a substituição da citosina por timina pela mudança da citosina para N4-hidroxicitosina. Quando um microorganismo por si só é submetido a um tratamento de mutação, o tratamento é realizado com irradiação de ultravioleta ou um agente mutagenizador habitualmente usado para a mutação artificial tal como a N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) e ácido nitroso.
Como uma bactéria doadora do DNA contendo um gene da DDPS do tipo selvagem ou um outro gene da DDPS contendo uma mutação, qualquer um dos microorganismos que pertençam ao gênero Escherichia pode ser usado. Especificamente, aqueles mencionados na literatura de Neidhardt et al. (Neidhardt, F. C. et al., Escherichia coli e Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Tabela 1) podem ser usados. Por exemplo a cepa JM109 e a cepa MC 1061 da E. coli podem ser mencionadas. Quando uma cepa selvagem é usada como um doador de DNA contendo um gene da DDPS, o DNA contendo um gene da DDPS do tipo selvagem pode ser obtido.
Os exemplos da AK dessensibilizada incluem aqueles tendo uma mutação que dessensibiliza a inibição de retroalimentação pela L-lisina encontrada na AK do tipo selvagem. Como a AK do tipo selvagem, aquelas derivadas de bactérias Escherichia especialmente a aspartocinase III (AKIII) derivada de E. coli, podem ser mencionadas. Os exemplos da mutação que dessensibiliza a inibição de retroalimentação pela L-lisina de AKIII incluem: (a) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de glicina na posição 323 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de ácido aspártico), (b) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de glicina na posição 323 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de ácido aspártico) e substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de glicina na posição 408 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de ácido aspártico), (c) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde resíduo de arginina na posição 34 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de cisteína) e substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de glicina na posição 323 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de ácido aspártico), (d) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 325 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de fenilalanina), (e) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de metionina na posição 318 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de isoleucina), (f) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de metionina na posição 318 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de isoleucina) e substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de valina na posição 349 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de metionina), (g) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de serina na posição 345 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de leucina), (h) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de valina na posição 347 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de metionina), (i) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de treonina na posição 352 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de isoleucina), (j) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de treonina na posição 352 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de isoleucina) e substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de serina na posição 369 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de fenilalanina), (k) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de ácido glutâmico na posição 164 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de lisina) e (1) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de metionina na posição 417 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de isoleucina) e substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de cisteína na posição 419 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de tirosina) na seqüência de aminoácido de AKIII apresentada como a SEQ ID NO: 8 no Pedido Internacional N2 WO 95/16042 em que a posição é contada a partir do término N de AKIII. Além disso, pode ser mencionada uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de glicina na posição 323 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de ácido aspártico) e substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de metionina na posição 318 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de isoleucina) (Pedido de Patente Japonesa Aberto ao Público N2 10-113183). É bem conhecido que a diferença na seqüência de aminoácido que não afete a atividade pode ocorrer entre as espécies ou cepas e um resíduo de aminoácido que corresponde aos resíduos de aminoácidos específicos anteriormente mencionados pode ser facilmente reconhecido por aqueles habilitados na técnica.
Outros exemplos da AK dessensibilizada incluem a AK do tipo mutante derivada de bactérias corineformes (Pedido de Patente Japonesa Aberto ao Público N2 6-62866).
De modo a fazer com que uma AK dessensibilizada seja abrigada pelas bactérias Escherichia, por exemplo, o DNA que codifica a AK dessensibilizada pode ser introduzido nas bactérias Escherichia.
Os exemplos do DNA que codifica uma AK dessensibilizada incluem aqueles que correspondem a um DNA que codifica uma AK do tipo selvagem tendo uma mutação para dessensibilizar a inibição de retroalimentação pela L-lisina para a AK codificada. A seguir, um método para se obter o DNA que codifica uma AK dessensibilizada será explicado exemplificando-se a AKIII derivada de bactérias Escherichia. Também como para a AK de outros organismos, o DNA pode ser similarmente obtido. Além disso, se uma AK do tipo selvagem derivada de um outro organismo é uma AK dessensibilizada, o DNA que a codifica pode ser usado como tal. O DNA que codifica a AKIII do tipo selvagem não é particularmente limitado. Por exemplo, o DNA que codifica a AKIII derivada de uma bactéria Escherichia, especialmente E. coli, pode ser mencionado. Especificamente, o DNA que codifica a seqüência de aminoácido apresentada no Pedido Internacional N2 WO 95/16042, SEQ ID NO: 8 e a seqüência representada pelos números de nucleotídeo de 584 a 1930 dentro da seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 7 no mesmo pode ser mencionado. A AKIII de E. coli é codificada pelo gene lysC.
Entre estas seqüências, uma tendo uma mutação que cause a substituição dos resíduos de aminoácido anteriormente mencionados é o DNA que codifica uma AKIII do tipo mutante. Além disso, o tipo do códon que corresponde ao resíduo de aminoácido substituído não é particularmente limitado, contanto que codifique o resíduo de aminoácido. Além disso, também é esperado que haja uma leve diferença na seqüência de aminoácido da AKIII contida entre as espécies e cepas bacterianas. Entretanto, aquelas tendo tal diferença que cause a substituição, supressão ou inserção de resíduos de aminoácido nas posições que não afetem a atividade da enzima caem dentro do escopo do gene AKIII mutante. Por exemplo, a seqüência de nucleotídeo do gene lysC do tipo selvagem obtido no exemplo 2 mencionado a seguir (Pedido Internacional N2 WO 95/16042, SEQ ID NO: 7) tem diferenças na seqüência em 6 posições com respeito à seqüência de nucleotídeo de lysC da E. coli cepa K-12 JC411 já publicada (Cassan M., Parsot, C., Cohen, G. N. e Patte, J. C., J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)), entre as quais duas das diferenças fornecem resíduos de aminoácido codificados diferentes (lysC da cepa JC411 fornece a substituição do resíduo de glicina na posição 58 com um resíduo de cisteína e a substituição do resíduo de glicina na posição 401 com um resíduo de alanina na seqüência de aminoácido codificada pelo lysC apresentado na SEQ ID NO: 8 do Pedido Internacional N° WO 95/16042 em que a posição é contada a partir do seu término N). É esperado que mesmo que o lysC tenha a mesma seqüência como o lysC da E. coli cepa K-12 JC411 possa fornecer lysC tendo uma mutação que dessensibilize a inibição de retroalimentação pela L-lisina, se for introduzida qualquer uma das mutações mencionadas em (a) até (1) acima ou uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponda ao resíduo de glicina na posição 323 com um outro resíduo de aminoácido (preferivelmente um resíduo de ácido aspártico) e substituir um resíduo de aminoácido que corresponda ao resíduo de metionina na posição 318 com um outro resíduo de aminoácido.
Tal DNA que codifica uma AKIII do tipo mutante da qual a inibição de retroalimentação pela L-lisina é dessensibilizada pode ser obtido, por exemplo, como segue. Primeiro, o DNA contendo um gene da AKIII do tipo selvagem ou um outro gene AKIII tendo uma mutação é submetido a um tratamento de mutação in viíro e o DNA que passa pelo tratamento de mutação e um DNA vetor compatível com um hospedeiro são ligados para preparar um DNA recombinante. O DNA recombinante pode ser introduzido nos microorganismos hospedeiros para se obter transformantes e um transformante que venha a expressar uma AKIII do tipo mutante pode ser selecionado a partir dos transformantes. Tal transformante abriga o gene do tipo mutante. Altemativamente, o DNA contendo um gene da AKIII do tipo selvagem ou um outro gene da AKIII tendo uma mutação e um DNA vetor compatível com um hospedeiro podem ser ligados para preparar um DNA recombinante. Depois, o DNA recombinante pode ser submetido a um tratamento de mutação in vitro e introduzido nos microorganismos hospedeiros para se obter transformantes e um transformante que venha a expressar uma AKIII do tipo mutante pode ser selecionado dos transformantes. Tal transformante também abriga o gene do tipo mutante.
Além disso, um microorganismo que produza uma enzima do tipo selvagem pode ser submetido a um tratamento de mutação para preparar uma cepa mutante que produza uma enzima do tipo mutante e depois um gene do tipo mutante pode ser obtido a partir da cepa mutante. Os exemplos de agentes para submeter diretamente o DNA a um tratamento de mutação incluem hidroxilamina e assim por diante. A hidroxilamina é um agente de tratamento de mutação químico que causa a substituição de citosina com timina pela mudança da citosina para N4-hidroxicitosina. Quando um microorganismo por si só é submetido a um tratamento de mutação, o tratamento é realizado com irradiação de ultravioleta ou um agente mutagenizador habitualmente usado para a mutação artificial tal como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina(NTG).
Como uma bactéria doadora do DNA contendo um gene da AKIII do tipo selvagem ou um outro gene AKIII tendo uma mutação, qualquer uma de microorganismos que pertençam ao gênero Escherichia pode ser usada. Especifícamente, aquelas mencionadas na literatura de Neidhardt et al. (Neidhardt, F. C. et al. Escherichia coli e Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Tabela 1) podem ser usadas. Por exemplo a cepa JM109, a cepa MC 1061 da E. coli e assim por diante podem ser mencionadas.
Nas bactérias da presente invenção, é preferido que a aspartocinase, diidrodipicolinato reductase, tetraidrodipicolinato succinilase, succinil diaminopimelato desacilase, fosfoenolpiruvato carboxilase e a aspartato semialdeído desidrogenase sejam cada uma derivadas de bactérias Escherichia, a nicotinamida adenina dinucleotídeo transidrogenase e a aspartase, se presentes, são cada uma derivadas de bactérias Escherichia, a diidrodipicolinato sintase é derivada de uma bactéria Escherichia ou uma bactéria Brevibacterium e a diaminopimelato desidrogenase é derivada de uma bactéria Brevibacterium.
Os exemplos das bactérias Brevibacterium incluem, além disso Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium divaricatum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium lilium e assim por diante.
Além disso, nas bactérias da presente invenção, é preferido que as atividades intracelulares da diidrodipicolinato sintase e da aspartocinase sejam intensificadas pela inclusão da diidrodipicolinato sintase da qual a inibição de retroalimentação pela L-lisina é dessensibilizada e a aspartocinase da qual a inibição de retroalimentação pela L-lisina é dessensibilizada e a atividade intracelular da diaminopimelato desidrogenase é intensificada pela introdução de um gene da diaminopimelato desidrogenase. Tais bactérias preferidas da presente invenção podem ser obtidas pela introdução do plasmídeo pCABD2 ou pCABDEl mencionados no Pedido Internacional N2 WO 95/16042 em uma bactéria Escherichia. <2> Método de produção da presente invenção A L-lisina pode ser eficientemente produzida cultivando-se as. bactérias da presente invenção obtidas como descrito acima em um meio adequado para produzir e acumular L-lisina na cultura e coletar a L-lisina da cultura. O meio usado para a cultura das bactérias de acordo com a presente invenção podem ser um meio usual contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, íons inorgânicos e outros nutrientes com traços orgânicos como requerido.
Como a fonte de carbono, é possível usar açúcares tais como glicose, lactose, galactose, ffutose e hidrolisado de amido; álcoois tais como glicerol e sorbitol; ou ácidos orgânicos tais como ácido fumárico, ácido cítrico e ácido succínico.
Como a fonte de nitrogênio, é possível usar sais de amônio inorgânicos tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio ou fosfato de amônio; nitrogênio orgânico tal como hidrolisado de soja; gás amônia; ou amônia aquosa.
Como para os nutrientes com traços orgânicos, é preferível adicionar substâncias requeridas tais como vitamina BI e L-isoleucina, extrato de levedura e assim por diante em uma quantidade adequada. Além destes, uma pequena quantidade de fosfato de potássio, sulfato de magnésio, íons ferro, íons manganês e assim por diante são adicionados. A cultura é preferivelmente realizada sob uma condição aeróbica durante 16 a 72 horas. A temperatura da cultura pode ser controlada para estar de 20° C a 45° C e o pH pode ser controlado para ser de 5 a 8 durante a cultura. Substâncias inorgânicas ou orgânicas, ácidas ou alcalinas bem como gás amônia e assim por diante podem ser usadas para o ajuste do pH. A coleta de L-lisina do líquido fermentado é usualmente realizada por uma combinação de um método de resina trocadora de íon, um método de precipitação e outras técnicas conhecidas.
EXEMPLOS A presente invenção será mais especifícamente explicada daqui em diante com referência aos seguintes exemplos. EXEMPLO 1 <1> Preparação de bactérias Escherichia tendo várias propriedades Os plasmídeos apresentados abaixo foram introduzidos na E. coli W3110 (tyrA).
Nome do plasmídeo Gene Contido RSF24P dapA* RSFDBO dapA*, lysC* PCAB1 dapA*, lysC*, dapB pCABD2 dapA*, lysC*, dapB, ddh pCABD(B) Brev. dapA, lysC*, dapB, ddh pCABDEl dapA*, lysC*, dapB, dapD, dapE
As abreviações usadas para os genes têm os seguintes significados.
ppc: Fosfoenolpiruvato carboxilase lysC: Aspartocinase III lysC*: Aspartocinase III dessensibilizada para inibição asd: Aspartato semialdeído desidrogenase dapA: Diidrodipicolinato sintase dapA*: Diidrodipicolinato sintase dessensibilizada para inibição Brev. dapA: Diidrodipicolinato sintase dessensibilizada para inibição (derivada de Brevibacterium lactofermentum) dapB: Diidrodipicolinato reductase dapD: Tetraidrodipicolinato succinilase dapE: Succinil diaminopimelato desacilase ddh: Diaminopimelato desidrogenase (derivada de Brevibacterium lactofermentum) Os plasmídeos RSF24P, RSFD80, pCABl, pCABD2 e pCABDEl estão descritos no Pedido Internacional N2 WO 95/16042. As suas construções também estão descritas no Pedido Internacional Ns WO 95/16042 e resumidas abaixo.
(1) RSF24P
Com base na seqüência de nucleotídeo dapA conhecida de E. coli (J. Bacteriol., 166, 297 (1986)), um fragmento contendo a seqüência SD e a matriz de leitura aberta (ORF) de dapA foram amplificados por PCR. O fragmento amplificado foi ligado a um vetor de clonagem pCRIOOO para se obter um plasmídeo pdapA2 em que dapA foi ligado de modo que a direção de transcrição de dapA fosse reversa à direção de transcrição pelo promotor lacZ em pCRIOOO. O plasmídeo pdapA2 foi submetido a um tratamento de mutagênese usando-se hidroxilamina e o pdapA2 submetido ao tratamento de mutagênese foi introduzido no E. coli W3110. A partir dos transformantes, aqueles que exibem resistência ao AEC foram selecionados. Além disso, o grau da inibição pela L-lisina de DDPS codificada pelos plasmídeos abrigados pelas cepas resistentes selecionadas foi medido e uma cepa que foi dessensibilizada quanto a inibição pela L-lisina foi selecionada. O plasmídeo pdapA24, que foi confirmado ter a mudança do 597° C para T pelo seqüenciamento, foi ligado ao pVIC40 em uma posição à jusante do promotor do gene de resistência à tetraciclina para se obter RSF24P (Figura 1).
Uma E. coli da cepa JM109 em que RSF24P foi introduzido foi designada como AJ12395 e foi depositada no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (postal code 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) em 28 de outubro de 1993 e recebeu um número de acesso de FERM P-13 93 5. Depois, foi transferida para um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapest em 1 de novembro de 1994 e recebeu um número de acesso de FERM BP-4858. (2) RSFD80 Com base na seqüência de nucleotídeo lysC conhecida da E. coli (J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986)), um fragmento contendo a seqüência SD e a ORF de lysC foram amplificados por PCR. O fragmento amplificado foi ligado a um vetor de cópia múltipla pUC18 para se obter um plasmídeo pLYSCl em que lysC foi ligado de modo que a direção de transcrição de lysC fosse reversa à direção de transcrição pelo promotor lacZ no pUC18. O plasmídeo pLYSCl foi submetido a um tratamento de mutagênese usando-se hidroxilamina e o pLYSCl submetido ao tratamento de mutagênese foi introduzido na E. coli GT3. A partir dos transformantes, aqueles que exibem resistência ao AEC e resistência à L-lisina foram selecionados. Além disso, o pLYSCl foi introduzido na E. coli MC 1061, depois as células foram submetidas a um tratamento de mutagênese usando-se hidroxilamina e aquelas que exibem resistência ao AEC e resistência à L-lisina foram selecionadas. Além disso, o grau da inibição pela L-lisina e a estabilidade térmica de AK codificada pelos plasmídeos abrigados pelas cepas resistentes selecionadas foram medidos e uma cepa que foi dessensibilizada quanto a inibição pela L-lisina e que exibiu estabilidade superior foi selecionada. O plasmídeo pLYSCl*80, que foi confirmado ter a mudança do 352° C para T pelo seqüenciamento, foi ligado ao ÍSG399 em uma posição à jusante do promotor lacZ para se obter pLLC*80. A partir de pLLC*80 e RSF24P, RSFD80 foi construído como apresentado na Figura 2.
Uma E. coli da cepa JM109 em que RSFD80 foi introduzido foi designada como AJ12396 e foi depositada no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (postal code 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) em 28 de outubro de 1993 e recebeu um número de acesso de FERM P-13936. Depois, foi transferida para um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapest em 1 de novembro de 1994 e recebeu um número de acesso de FERM BP-4859. (3) pCABl Com base na seqüência de nucleotídeo dapB conhecida (Bouvier, J. et al., J. Biol. Chem., 259,14829 (1984)), a dapB foi amplificada a partir da E. coli da cepa W3110, o DNA cromossômico pela PCR. O fragmento de DNA amplificado obtido foi digerido com Asei e Dral e o fragmento obtido foi terminado cego e inserido no sítio Smal de pMW119 para se obter um plasmídeo pdapB. Subsequentemente, dapB foi introduzido no RSFD80 como apresentado na Figura 3 para se obter pCABl. (4) pCABD2 Com base na seqüência de nucleotídeo ddh conhecida da Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)), ddh foi amplificado a partir do DNA cromossômico da Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 pela PCR. O fragmento de DNA amplificado obtido foi digerido com EcoT22I e Aval e o fragmento obtido foi terminado cego e inserido no sítio Smal de pMWl 19 para se obter um plasmídeo pddh. Subsequentemente, ddh foi introduzido no pCABl como apresentado na Figura 4 para se obter um plasmídeo pCABD2. (5) pCABDEl Com base na seqüência de nucleotídeo dapD conhecida (Richaud, C. et al., J. Biol. Chem., 259, 14824 (1984)), a dapD foi amplificada a partir do DNA cromossômico da E. coli cepa W3110 pela PCR. O fragmento de DNA amplificado obtido foi digerido com EcoO109I e Saci e o fragmento obtido foi terminado cego e inserido no sítio Smal de pMWl 18 para se obter um plasmídeo pdapD. Além disso, com base na seqüência de nucleotídeo dapE conhecida (Bouvier, J. et al., J. Bacteriol., 174, 5265 (1992)), a dapE foi amplificada a partir do DNA cromossômico da E. coli cepa W3110 pela PCR. O fragmento de DNA amplificado obtido foi digerido com Muni e BglII e um fragmento obtido foi terminado cego e inserido no sítio Smal de pMW118 para se obter um plasmídeo pdapE. Além disso, a dapE foi cortada de pdapE e inserida no pdapD para se obter um plasmídeo pMWdapDEl contendo tanto a dapE quanto a dapD. Como apresentado na Figura 5, um fragmento contendo dapE e dapD foi cortado de pMWdapDEl e inserido em pCABl para se obter pCABDEl.
Um plasmídeo pCABD(B) foi construído como segue.
Primeiro, um fragmento de DNA contendo o sítio promotor de do gene de resistência Tet foi amplificado a partir de pBR322 usando-se iniciadores tendo as seguintes seqüências. 5 ’ -TC AAGAATTCTCATGTTTGA-3 ’ (SEQID NO: 1) 5’-GTTAGATTTGGTACCCGGTGCCTGACTGCGTTAGC-3’ (SEQ ID NO: 2) O fragmento amplificado de DNA foi digerido com Kpnl e EcoRI e inserido entre os sítios de divagem Kpnl e EcoRI de pUC18 para se obter pUTES (Figura 18).
Depois, o gene Brev. dapA foi amplificado usando-se os iniciadores tendo as seguintes seqüências e o DNA cromossômico de Brevibacterium lactofermentum cepa Ysr como um padrão. 5 ’-GGTTGTGGTACCCCCAAATGAGGGAAGAAG-3 ’ (SEQ ID NO: 3) 5 ’-TGGAACCTCTGTTGCTGCAG-3 ’ (SEQ ID NO: 4) O gene Brev. dapA amplificado foi digerido com Kpnl e BamHI e inserido entre os sítios de divagem Kpnl e BamHI de pUTES para se obter pUEBL3 (Figura 19).
Depois, pUEBL3 foi digerido com EcoRI e Xbal e terminado cego em ambas as extremidades para se obter um fragmento contendo Brev. dapA. Depois disso, pCABD2 mencionado no Pedido Internacional N° WO 95/16042 foi digerido com Nhel e Spel e terminado cego em ambas as extremidades. Um fragmento contendo lysC, dapB e ddh foi coletado e depois o fragmento anteriormente obtido contendo Brev. dapA foi inserido nele para se obter pCABD(B) (Figura 20) Embora a E. coli W3110 (tyrA) seja detalhada na Publicação de Patente Européia Ns 488424, o método de preparação para esta será resumidamente explicado abaixo. A E. coli da cepa W3110 foi obtida do National Institute of Genetics (Shizuoka-ken, Mishima-shi). Esta cepa foi inoculada em uma placa de LB contendo estreptomicina e uma cepa que formou uma colônia foi selecionada para se obter uma cepa resistente á estreptomicina. A cepa resistente á estreptomicina selecionada e a E. coli cepa K-12 ME8424 foram misturadas e cultivadas em um meio completo (Caldo L: 1 % de Bacto tripton, 0,5 % de extrato de levedura, 0,5 % de NaCl) como cultura estacionária a 37° C durante 15 minutos para induzir a conjugação. A E. coli cepa K-12 ME8424 tem as características genéticas de HffP045, thi, relAl, tyrA::TnlO, ung-1 e nadB e pode ser obtida do National Institute of Genetics.
Depois, a cultura foi inoculada a um meio completo (Caldo L: 1 % de Bacto tripton, 0,5 % de extrato de levedura, 0,5 % de NaCl, 1,5 % de ágar) contendo estreptomicina, tetraciclina e L-tirosina e uma cepa que formou uma colônia foi selecionada. Esta cepa foi designada como E. coli cepa W3110 (tyrA).
Muitas cepas formadas pela introdução de um plasmídeo na cepa W3110 (tyrA) são divulgadas na Publicação de Patente Européia N° 488424. Por exemplo, uma cepa obtida pela introdução de um plasmídeo pHATerm foi designada como E. coli cepa W3110 (tyrA)/pHATerm (E. coli cepa AJ12662) e foi depositada no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (postal code 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) em 16 de novembro de 1991 como um depósito internacional e recebeu um número de acesso de FERM BP-3653. A cepa W3110 (tyrA) também pode ser obtida eliminando-se o plasmídeo pHATerm desta E. coli cepa W3110 (tyrA)/pHATerm. A eliminação do plasmídeo pode ser realizada de uma maneira convencional. <2> Introdução do gene da aspartato semialdeído desidrogenase (asd), do gene da fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) ou o gene da aspartase (aspA) e avaliação da produtividade da L-lisina Como um plasmídeo contendo asd e um plasmídeo contendo ppc, pasd e pppc descritos no Pedido Internacional N2 WO 95/16042 foram usados. As construções destes plasmídeos foram detalhadas no Pedido Internacional N2 WO 95/16042. Os esboços são como segue. (1) pasd O plasmídeo asd foi obtido de um plasmídeo pAD20 (Haziza, C. et al. EMBO, 1,379 (1982)), que continha o gene. O plasmídeo pAD20 foi digerido com Asei e Ciai, terminado cego e inserido no sítio Smal de pMWl 18 para se obter um plasmídeo pasd (Figura 8). (2) pppc O plasmídeo pppc foi obtido de um plasmídeo pT2 que continha o gene. O plasmídeo pT2 foi digerido com Smal e Seal, terminado cego e inserido no sítio Smal de pMWl 18 para se obter um plasmídeo pppc (Figura 9). Uma E. coli da cepa F15 (AJ12873) que abriga pT2 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (postal code 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) em 15 de julho de 1993 e recebeu um número de acesso de FERM P-13752. Depois, foi transferida para um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapest em 11 de julho de 1994 e recebeu um número de acesso de FERM BP-4732.
Um plasmídeo contendo aspA foi construído como segue. O gene AspA da E. coli foi amplificado usando-se iniciadores tendo as seguintes sequências. 5 ’ -TGATCAGCGAAACACTTTTA-3 ’ (SEQID NO: 5) 5’-CAGCAAACTATGATGAGAA-3’ (SEQ ID NO: 6) Depois, o fragmento amplificado obtido foi inserido no sítio de divagem Smal de pMWl 18 (Nippon Gene) para se obter pMWl 18::aspA (Figura 9). Cada um de pMW118 (plasmídeo de controle), pasd, pppc e pMWl 18::aspA (plasmídeo comparativo) foi introduzido em cada uma da E. coli W3110 (tyrA) e os transformantes obtidos como em <1> anteriormente mencionado. Os transformantes obtidos exceto aquele obtido pela introdução de pMW118, pasd, pppc ou pMW118::aspA na E. coli W3110 (tyrA), continham dois tipos de plasmídeo, isto é um de pMW118, pasd, pppc e pMWl 18::aspA e um de RSF24P, RSFD80, pCABl, pCABD2, pCABD(B) e pCABDEl. Estes transformantes foram examinados quanto a produtividade da L-lisina pelo método descrito no Pedido Internacional N- WO 95/16042. O procedimento específico foi como segue.
As células foram cultivadas em 20 ml de um meio tendo a seguinte composição contida em um frasco de Sakaguchi de 500 ml a uma temperatura de 37° C durante 30 horas com agitação a 114-116 rpm. (Composição do meio) Glicose 40 g/litro MgS04.7H20 1 g/litro (NH4)2S04 16 g/litro KH2P04 1 g/litro FeS04. 7H20 0,01 g/litro MnS04. 5H20 0,01 g/litro Extrato de levedura (Difco) 2 g/litro L-Tirosina 0,1 g/litro Ajustado ao pH 7,0 com KOH e autoclavado a 115° C durante 10 minutos (a glicose e o MgS04. 7H20 foram separadamente esterilizados). CaC03 25 g/litro (de acordo com a Pharmacopoea of Japan, esterilizado por aquecimento seco a 180° C durante 2 dias) Antibiótico (20 mg/litro de estreptomicina, 50 mg/litro de ampicilina ou 25 mg/litro de canamicina dependendo do tipo do plasmídeo a ser introduzido) A L-lisina no caldo de cultura (meio depois da cultura) foi quantificada usando-se Biotech Analyzer AS210 produzido pela Asahi Chemical Industry Co., Ltd.
Os resultados estão apresentados na Tabela 1. Na tabela, a quantidade de L-lisina é indicada em termos de mg por dl do meio. n.d.: Não determinado Como claramente observado a partir dos resultados apresentados na Tabela 1, quando asd ou ppc foram realçados cada um sozinho ou junto com dapA (RSF24P), dapA + lysC (RSFD80) ou dapA + lysC + dapB (pCABl) na E. coli, a quantidade de produção de L-lisina (quantidade acumulada) não foi alterada ou apenas levemente alterada e, como para asd, podería ser reduzida comparada com o caso ande asd ou ppc não foi intensificada (-180 a 20 mg/dl como para asd, 10 a 30 mg/dl como para ppc). Ao contrário, se fossem realçados juntos com dapA + lysC + dapB + ddh (pCABD2) ou dapA + lysC + dapB + dapD + dapE (pCABDEl), um aumento acentuado da quantidade de produção L-lisina foi observado comparada com o caso onde asd ou ppc não foram realçados (70 mg/dl como para asd, 90 mg/dl como para ppc). Entretanto, quando aspA foi realçado com dapA + LysC + dapB + ddh (pCABD2), um aumento acentuado da quantidade de produção da L-lisina não foi observado. Além disso mesmo quando o dapA derivado da Brevibacterium lactofermentum foi usado ao invés de dapA derivado de Escherichia coli (pCABD(B)), o mesmo efeito foi obtido como no caso onde dapA derivado de Escherichia coli foi usado (pCABD2). Portanto, a origem dos genes não é considerada importante, mas a sua combinação é importante.
Exemplo 2 <1> Construção de plasmídeos contendo o gene da fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) e o gene da aspartato semialdeído desidrogenase (asd), o gene da transidrogenase (pntAB) ou o gene da aspartase (aspA) Um plasmídeo contendo ppc e asd, um plasmídeo contendo ppc e pntAB e um plasmídeo contendo ppc e aspA foram construídos como segue. (1) Plasmídeo contendo ppc e asd(ppcd) O plasmídeo pasd divulgado no Pedido Internacional N2 WO 95/16042 foi digerido com Kpnl e Sphl e o fragmento de DNA contendo asd foi terminado abruptamente em ambas as extremidades. Depois, pppc divulgado no Pedido Internacional Ns WO 95/16042 foi digerido com Xbal e terminado cego em ambas as extremidades e o fragmento asd anteriormente obtido foi inserido nele para se obter ppcd (Figura 10). (2) Plasmídeo contendo ppc e pntAB (pPTS) O plasmídeo pMW::THY divulgado no Pedido Internacional N2 WO 95/11985 foi digerido com Smal e HindIII e o fragmento de DNA contendo pntAB foi coletado. Depois, o pppc divulgado no Pedido Internacional N2 WO 95/16042 foi digerido com Xbal, terminado cego em ambas as extremidades e ainda digerido com HindIII e o fragmento pntAB anteriormente obtido foi inserido no sítio clivado para se obter pPTS (Figura 11). A construção do plasmídeo pMW::THY está detalhada no Pedido Internacional N2 WO 95/11985. Esta será esboçada abaixo.
Com base nas seqüências de nucleotídeo pntA e pntB conhecidas da E. coli (D. M. Clarke et al. Eur. J. Biochem., 158, 647 a 653 (1986)), um fragmento contendo ambos os genes incluindo as regiões tendo atividade promotora foi amplificado por PCR. O fragmento amplificado de DNA foi digerido com BamHI e HindIII e o fragmento obtido de DNA foi ligado ao vetor plasmídico pMW118 (Nippor Gene) digerido com BamHI e HindIII para se obter pMW::THY (Figura 8). A E. coli cepa JM109 em que pMWl 18::THY foi introduzido foi designada como AJ12929 e foi depositada no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (postal code 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) em 4 de outubro de 1993 e recebeu um número de acesso de FERM P-13890. Depois, foi transferida para um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapest em 14 de setembro de 1994 e recebeu um número de acesso de FERM BP-4798. (3) Plasmídeo contendo ppc e aspA (pAPW) O plasmídeo pMW118::aspA descrito no Exemplo 1 anteriormente mencionado foi digerido com Saci, terminado cego em ambas as extremidades e ainda digerido com HindIII para se obter um fragmento de DNA contendo aspA. Depois, o pppc descrito no Pedido Internacional Ns WO 95/16042 foi digerido com Xbal, terminado cego em ambas as extremidades e ainda digerido com HindIII e o fragmento aspA anteriormente obtido foi inserido no sítio de divagem HindIII para se obter pAPW (Figura 12). <2> Introdução de dois tipos de genes e avaliação da produtividade da L-lisina A um transformante introduzido em pCABD2 que foi obtido no Exemplo 1 anteriormente mencionado, cada um de pppc (plasmídeo de referência), ppcd, pPTS e pAPW (plasmídeo comparativo) foram introduzidos. Os transformantes obtidos continham dois tipos de plasmídeos, isto é um de pppc, ppcd, pPTS e pAPW e pCABD2. Estes transformantes foram examinados quanto a produtividade da L-lisina da mesma maneira como no Exemplo 1 <2>.
Os resultados estão apresentados na Tabela 2.
Como claramente observado a partir dos resultados apresentados na Tabela 2, quando asd ou pntAB foram realçados juntos com dapA + lysC + dapB + ddh + ppc (ppcd ou pPTS), um aumento acentuado da quantidade de produção de L-lisina foi observado (80 mg/dl como para asd, 70 mg/dl como para pntAB). Como para aspA, entretanto mesmo quando aspA foi realçado junto com dapA + lysC + dapB + ddh + ppc (pAPW), um aumento acentuado da quantidade de produção de L-lisina não foi observado. Exemplo 3 <1> Construção de plasmídeos contendo o gene da fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), o gene da transidrogenase (pntAB) e o gene da aspartato semialdeído desidrogenase (asd) ou o gene da aspartase (aspA) Um plasmídeo contendo os genes ppc, pntAB e asd e um plasmídeo contendo ppc, pntAB e aspA foram construídos como segue. (1) Plasmídeo contendo ppc, pntAB e asd (pPTd) O plasmídeo pasd descrito na Publicação Internacional N° WO 95/16042 foi digerido com Kpnl e Sphl e o fragmento de DNA contendo asd foi terminado cego em ambas as extremidades. Depois, pPTS descrito no Exemplo 2 anteriormente mencionado foi digerido com HindIII e terminado cego e o fragmento asd anteriormente obtido foi inserido no sítio de divagem HindIII para se obter pPTd (Figura 13). (2) Plasmídeo contendo ppc, pntAB e aspA (pAPT) O plasmídeo pMW::THY descrito no Pedido Internacional Ns WO 95/11985 foi digerido com Smal e HindIII para se obter um fragmento de DNA contendo pntAB. Depois, pAPW descrito no Exemplo 2 anteriormente mencionado foi digerido com Xbal, terminado cego em·-ambas as extremidades e ainda digerido com HindIII. O fragmento anteriormente obtido contendo pntAB foi inserido no sítio de divagem HindIII para se obter pAPT (Figura 14). <2> Introdução dos três tipos de gene e avaliação da produtividade da L-lisina A um transformante introduzido no pCABD2 que foi obtido no Exemplo 1 anteriormente mencionado, pPTS (plasmídeo de referência), pPTd ou pAPT foram introduzidos. Os transformantes obtido contiveram dois tipos de plasmídeo, isto é um de pPTS, pPTd e pAPT e pCABD2. Estes transformantes foram examinados quanto a produtividade da L-lisina da mesma maneira como no Exemplo 1 <2>.
Os resultados estão apresentados na Tabela 3.
Como claramente observado a partir dos resultados apresentados na Tabela 3, quando asd ou aspA foram realçados juntos còm dapA + lysC + dapB + ddh + ppc + pntAB (pPTd ou pAPT), um aumento acentuado da quantidade de produção de L-lisina foi observado (60 mg/dl como para asd, 50 mg/dl como para aspA).
Exemplo 4 <1> Construção de plasmídeos contendo o gene da fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), o gene da transidrogenase (pntAB), o gene da aspartato semialdeído desidrogenase (asd) e o gene da aspartase (aspA) Um plasmídeo contendo ppc, pntAB, asd e aspA foi construído como segue. O plasmídeo pAPT descrito no Exemplo 3 anteriormente mencionado foi digerido com HindIII, terminado cego em ambas as extremidades e ainda digerido com Smal para se obter um fragmento de DNA contendo ppc, aspA e pntAB. Depois, pMW218 (Nippon Gene) foi digerido com EcoRI e terminado cego em ambas as extremidades e o fragmento de DNA anteriormente obtido contendo ppc, aspA e pntAB foi inserido no sítio de divagem EcoRI terminado cego para se obter pAPTK (Figura 15).
Depois, pasd descrito no Pedido Internacional N2 WO 95/16042 foi digerido com Kpnl, terminado cego em ambas as extremidades e ainda digerido com BamHI para se obter um fragmento de DNA contendo asd. Depois, pSTV29 foi digerido com PstI, terminado cego em ambas as extremidades e inserido com o fragmento asd anteriormente obtido no sítio de divagem BamHI para se obter pSd (Figura 16).
Depois, pSd foi digerido com Sphl, terminado cego em ambas as extremidades e ainda digerido com Xbal para se obter um fragmento de DNA contendo asd mais uma vez. depois, pAPTK foi digerido com Saci e terminado cego em ambas as extremidades e o fragmento asd anteriormente obtido foi inserido no sítio de divagem Xbal para se obter pKD (Figura 17). <2> Introdução de quatro tipos de gene e avaliação da produtividade da L-lisina A um transformante em que pCABD2, pCABD(B) ou pCABDEl foram introduzidos, que foram obtidos no Exemplo 1 anteriormente mencionado, pAPT (Plasmídeo de referência 1), pAPTK (Plasmídeo de referência 2) ou pKD foi introduzido. Os transformantes obtido contiveram dois tipos de plasmídeos, isto é um de pAPT, pAPTK e pKD e um de pCABD2, pCABD(B) e pCABDEl. Estes transformantes foram examinados quanto a produtividade da L-lisina da mesma maneira como no Exemplo 1 <2>.
Os resultados estão apresentados na Tabela 4.
Como claramente observado a partir dos resultados apresentados na Tabela 4, quando asd foi realçado junto com dapA + lysC + dapB + ddh + ppc + pntAB + aspA, um aumento acentuado da quantidade de produção de L-lisina foi observado. Um resultado similar foi obtido quando pCABD(B) ou pCABDEl foram usados ao invés de pCABD2. O plasmídeo pAPTK mencionado na Tabela 4 correspondeu ao pAPT do qual o gene de resistência a medicamento foi mudado daquele para ampicilina para aquele para canamicina (porque o vetor foi mudado de pMW118 para pMW218). Visto que o pKD foi preparado pela inserção de asd no pAPTK, foi considerado que pAPTK foi mais adequado do que pAPT como controle de pKD. Portanto, os dados de pAPTK são também apresentados. Também foi confirmado que a quantidade de produção de L-lisina não foi influenciada mesmo se o gene de resistência a medicamento foi mudado.
Aplicabilidade Industrial A presente invenção fornece bactérias Escherichia com alta produtividade de L-lisina e a L-lisina pode ser obtida com um alto rendimento usando-se estas bactérias.
LISTAGEM DE SEOÜÊNCIA < 110> Ajinomoto Co., Ltd. < 120> Método para produzir L-Lisina <130> B-603MSOP956 <160> 6 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Iniciador para a amplificação de uma porção promotora de tet <400> 1 tcaagaattc tcatgtttga 20 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Iniciador para a amplificação de uma porção promotora de tet <400> 2 gttagatttg gtacccggtg cctgactgcg ttagc 3 5 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador para a amplificação de dapA <400> 3 ggttgtggta cccccaaatg agggaagaag 30 <210 4 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador para a amplificação de dapA <400> 4 tggaacctct gttgctgcag 20 <210 5 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador para a amplificação de aspA <400> 5 tgatcagcga aacactttta 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>
<223> Iniciador para a amplificação de aspA <400 6 cagcaaacta tgatgagaa 19 REIVINDICAÇÕES
Claims (7)
1. Bactéria Escherichia coli geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que (1) as atividades intracelulares da diidrodipicolinato sintase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8), aspartocinase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10), e diidrodipicolinato reductase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12) são intensificadas; (2) a atividade intracelular da diaminopimelato desidrogenase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 14) é intensificada ou as atividades intracelulares da tetraidrodipicolinato succinilase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 16) e da succinil diaminopimelato desacilase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 18) são intensificadas, e (3) a atividade intracelular da aspartato semialdeído desidrogenase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 28) ou fosfoenolpiruvato carboxilase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 26) é intensificada, e em que cada uma das atividades intracelulares é intensificada, pela introdução de um plasmídeo com um gene da enzima, pelo aumento do número de cópias de um gene da enzima em cromossomo, ou pela modificação de uma sequência promotora de um gene da enzima em cromossomo.
2. Bactéria Escherichia coli geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que (1) as atividades intracelulares de diidrodipicolinato sintase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8), aspartocinase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10) e diidrodipicolinato reductase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12) são intensificadas, (2) a atividade intracelular de diaminopimelato desidrogenase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 14) é intensificada ou as atividades intracelulares de tetraidrodipicolinato succinilase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 16) e succinil diaminopimelato desacilase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 18) são intensificadas, e (3) a atividade intracelular de fosfoenolpiruvato carboxilase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 26) é intensificada e a atividade intracelular da nicotinamida adenina dinucleotídeo transidrogenase (tendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NOS: 20 e 22) ou aspartato semialdeído desidrogenase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 28) é intensificada, e em que cada uma das atividades intracelulares é intensificada, pela introdução de um plasmídeo com um gene da enzima, pelo aumento do número de cópias de um gene da enzima em cromossomo, ou pela modificação de uma sequência promotora de um gene da enzima em cromossomo.
3. Bactéria Escherichia coli geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que (1) as atividades intracelulares da diidrodipicolinato sintase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8), aspartocinase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10) e diidrodipicolinato reductase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12) são intensificadas, (2) a atividade intracelular da diaminopimelato desidrogenase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 14) é intensificada, e (3) as atividades intracelulares da fosfoenolpiruvato carboxilase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID No: 26) e nicotinamida adenina dinucleotídeo transidrogenase (tendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID Nos: 20 e 22) são intensificadas e a atividade intracelular da aspartato semialdeído desidrogenase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 28) ou da aspartase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 24) é intensificada, e em que cada uma das atividades intracelulares é intensificada, pela introdução de um plasmídeo com um gene da enzima, pelo aumento do número de cópias de um gene da enzima em cromossomo, ou pela modificação de uma sequência promotora de um gene da enzima em cromossomo.
4. Bactéria de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que as atividades intracelulares da aspartato semialdeído desidrogenase e da aspartase são intensificadas pela introdução de um plasmídeo com um gene da enzima, pelo aumento do número de cópias de um gene da enzima em cromossomo, ou pela modificação de uma sequência promotora de um gene da enzima em cromossomo.
5. Bactéria de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que a aspartocinase, diidrodipicolinato reductase, tetraidrodipicolinato succinilase, succinil diaminopimelato desacilase, fosfoenolpiruvato carboxilase e a aspartato semialdeído desidrogenase são, cada uma, derivadas de uma Escherichia coli, a nicotinamida adenina dinucleotídeo transidrogenase e a aspartase, se presentes, são, cada uma, derivadas de uma Escherichia coli, a diidrodipicolinato sintase é derivada de uma Escherichia coli ou de uma Brevibacterium lactofermentum e a diaminopimelato desidrogenase é derivada de uma Brevibacterium lactofermentum.
6. Bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de que as atividades intracelulares de diidrodipicolinato sintase e aspartocinase são intensificadas abrigando-se a diidrodipicolinato sintase da qual a inibição por retroalimentação pela L-lisina é dessensibilizada e a aspartocinase da qual a inibição por retroalimentação pela L-lisina é dessensibilizada e a atividade intracelular da diaminopimelato desidrogenase é intensificada pela introdução de um gene da diaminopimelato desidrogenase, em que a inibição por retroalimentação de diidrodipicolinato sintase pela L-lisina é dessensibilizada pela substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de alanina na posição 81 com um resíduo de valina, e/ou pela substituição de um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de histidina na posição 118 com um resíduo de tirosina, e em que a inibição por retroalimentação de aspartocinase pela L-lisina é dessensibilizada pela introdução de pelo menos uma das seguintes mutações: (a) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de glicina na posição 323 com um resíduo de ácido aspártico, (b) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de glicina na posição 323 com um resíduo de ácido aspártico, e substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de glicina na posição 408 com um resíduo de ácido aspártico, (c) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde resíduo de arginina na posição 34 com um resíduo de cisteína, e substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de glicina na posição 323 com um resíduo de ácido aspártico, (d) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 325 com um resíduo de fenilalanina, (e) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de metionina na posição 318 com um resíduo de isoleucina, (f) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de metionina na posição 318 com um resíduo de isoleucina, e substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de valina na posição 349 com um resíduo de metionina, (g) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de serina na posição 345 com um resíduo de leucina, (h) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de valina na posição 347 com um resíduo de metionina, (i) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de treonina na posição 352 com um resíduo de isoleucina, (j) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de treonina na posição 352 com um resíduo de isoleucina, e substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de serina na posição 369 com um resíduo de fenilalanina, (k) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de ácido glutâmico na posição 164 com um resíduo de lisina, e (l) mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de metionina na posição 417 com um resíduo de isoleucina, e substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de cisteína na posição 419 com um resíduo de tirosina.
7. Método para produzir L-lisina, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a bactéria como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 em um meio adequado para produzir e acumular L-lisina na cultura e coletar a L-lisina da cultura.
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