WO2001053459A1

WO2001053459A1 - Procede de production de l-lysine

Info

Publication number: WO2001053459A1
Application number: PCT/JP2000/000298
Authority: WO
Inventors: Kazuo Nakanishi; Yoshimi Kikuchi; Junichiro Kojima; Tomoko Suzuki; Yasushi Nishimura; Hiroyuki Kojima
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.
Priority date: 2000-01-21
Filing date: 2000-01-21
Publication date: 2001-07-26
Also published as: EP1253195B1; ES2313878T3; ATE411378T1; US8062869B2; EP1253195A4; SK10542002A3; CN1423691A; US20100173368A1; KR20020065932A; KR100704517B1; DK1253195T3; MXPA02007154A; BR0016995A; SK287800B6; EP1253195A1; HUP0204295A2; US7723081B1; DE60040559D1; BRPI0016995B1; CN100577794C

Description

明細書

L一リジンの製造法技術分野

本発明は微生物工業に関連したものであり、詳しくは、発酵法による Lーリジンの製造法、及びこの製造法に用いる微生物に関するものである。背景技術

従来、発酵法により L一リジンを製造する場合、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。 Lーリジンを生産する人工変異株は数多く知られており、その多くは S— 2—アミノエチルシスティン（A E C ) 耐性変異株であり、ブレビバクテリウム属、コリネパクテリゥム属、バチルス属、またはェシエリヒア属に属している。また、組換え D N Aを使用した形質転換体を用いる等、アミノ酸の生産を増加させる種々の技術が開示されている。

例えば、ェシエリヒア属細菌については、特開昭 56-18596号公報、米国特許第 4, 346， 170号および Applied Microbiology and Biotechnology, 15， p227-231( 19 82)においてジヒドロジピコリン酸合成酵素の活性を増強した株を用いた Lーリジンの製造法が示されている。また、コリネパクテリゥム属細菌由来の D D P S を導入したェシエリヒア属細菌を用いた L—リジンの製造法が、大韓民国特許公告 92-8382号に示されている。さらに、 L—リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するェシエリヒア属細菌由来のジヒドロジビコリン酸合成酵素をコ一ドする D N A、 L—リジンによるフィードバック阻害が解除されたァスノルトキナ一ゼをコ一ドする D N A、ジヒドロジピコリン酸レダク夕一セをコ一ドする D N A、及び、コリネ型細菌由来のジアミノビメリン酸デヒドロゲナ一ゼをコードする D N Aを含むプラスミドにより形質転換した株を用いた L一リジンの製造法が国際公開第 W0 95/16042号に示されている。

ブレビパクテリゥム属細菌については、細胞内のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド卜ランスヒドロゲナーゼの活性の増強により Lーリジン生産性が改善されることが国際公開第 WO 95/11985号に示されている。また、ホスホェノールビルビン酸カルボキシラーゼ単独の活性を増強した株を用いた L—リジンの製造法及びァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナ一ゼ単独の活性を増強した株を用いた Lーリジンの製造法がそれそれ特閧昭 60-87788及び特公平 6-102028に示されている。

発酵法による工業的なアミノ酸の製造においては、大量生産が行われるため、たとえ数％の収率の向上であっても、工業的価値は大きく、従って、収率の向上が、その程度の大小にかかわらず望まれている。発明の開示

本発明は、従来よりもさらに改良された発酵法による L -リジンの製造法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、特定の性質を持つェシエリヒア属細菌において、ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナ一ゼ又はホスホエノールビルビン酸カルボキシラーゼの活性を増強したとき、及び、この酵素に加えて特定の酵素又は酵素群の活性を増強したときに、その細菌による Lーリジンの生産が改善されることを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成した。

すなわち、本発明は、

第 1の態様として、（1 )ジヒドロジビコリン酸合成酵素、ァスパルトキナ一ゼ及びジヒドロジピコリン酸レダクタ一ゼの細胞内の活性が増強されており、かつ ( 2 )ジアミノビメリン酸デヒドロゲナ一ゼの細胞内の活性、又は、テトラヒドロジビコリン酸スクシ二ラ一ゼ及びスクシ二ルジァミノビメリン酸デアシラーゼの細胞内の活性が増強されているェシヱリヒア属細菌であって、ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラーゼの細胞内の活性が増強されていることを特徴とする細菌、

第 2の態様として、（1 )ジヒドロジビコリン酸合成酵素、ァスパルトキナ一ゼ及びジヒドロジビコリン酸レダク夕一ゼの細胞内の活性が増強されており、（2 ) ジアミノビメリン酸デヒドロゲナーゼの細胞内の活性、又は、テトラヒドロジビコリン酸スクシ二ラ一ゼ及びスクシ二ルジァミノピメリン酸デアシラーゼの細胞内の活性が増強されているェシエリヒア属細菌であって、ホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラーゼの細胞内の活性及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドトランスヒドロゲナ一ゼ又はァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの細胞内の活性が増強されていることを特徴とする細菌、及び、

第 3の態様として、（1 )ジヒドロジピコリン酸合成酵素、ァスバルトキナーゼ及びジヒドロジピコリン酸レダクターゼの細胞内の活性が増強されており、（2 ) ジアミノビメリン酸デヒドロゲナ一ゼの細胞内の活性、又は、テトラヒドロジビコリン酸スクシ二ラ一ゼ及びスクシ二ルジァミノビメリン酸デアシラーゼの細胞内の活性が増強されているェシエリヒア属細菌であって、ホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラーゼ及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼの細胞内の活性、並びに、ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナ一ゼ又はァスパルターゼの細胞内の活性が増強されていることを特徴とする細菌を提供する（以下、上記の三つの態様の細菌をまとめて「本発明細菌」ともいラ） o

本発明細菌においては、ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナ一ゼ及びァスパルターゼの細胞内の活性が増強されていることが好ましい。

本発明細菌においては、また、ァスパルトキナーゼ、ジヒドロジピコリン酸レダク夕一ゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシ二ラーゼ、スクシ二ルジァミノピメリン酸デアシラーゼ、ホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラ一ゼ及びァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナ一ゼがェシエリヒア属細菌由来であり、二コチンアミドアデニンジヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ及びァスパルタ一ゼが、存在する場合にはェシエリヒア属細菌由来であり、ジヒドロジビコリン酸合成酵素がェシエリヒア属細菌又はブレビバクテリゥム属細菌由来であり、ジァミノピメリン酸デヒドロゲナーゼがブレビバクテリゥム属細菌由来であることが好ましい。

本発明細菌においては、細胞内の活性が増強される酵素の細胞内の活性が、下記のいずれか又はそれらの組み合わせにより増強されていることが好ましい。

( 1 ) 酵素の遺伝子を有するプラスミドを導入すること。 ( 2 ) 染色体上での酵素の遺伝子のコピー数を増大させること。

( 3 ) 染色体上の酵素の遺伝子のプロモーター配列を改変すること。

さらに、本発明細菌においては、ジヒドロピコリン酸合成酵素及びァスバルトキナーゼの細胞内の活性が、 Lーリジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジビコリン酸合成酵素、及び、 L—リジンによるフィードバック阻害が解除されたァスパル卜キナーゼを保持することにより増強され、ジァミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの細胞内の活性が、ジァミノピメリン酸デヒドロゲナ一ゼ遺伝子の導入により増強されていることが好ましい。

本発明は、また、本発明細菌を好適な培地で培養し、該培養物中に L一リジンを生産蓄積せしめ、該培養物から L一リジンを採取することを特徴とする L—リジンの製造法（以下、「本発明製造法」ともいう）を提供する。図面の簡単な説明

図 1は、 dapA*24を有する、 RSF1010由来のプラスミド RSF24Pの製造工程を示す図である。

図 2は、 dapA*24及び lysC*80を有するプラスミド RSFD80の製造工程を示す図で

¾ -3 o

図 3は、 dapA*24、 lysC*80及び dapBを有するプラスミド pCABlの製造工程を示す図である。

図 4は、 dapA*24、 lysC*80、 dapB及び ddhを有するプラスミド pCABD2の製造ェ程を示す図である。

図 5は、 dapA*24、 lysC*80、 dapB、 dapD及び dapEを有するプラスミド pCABDEl の製造工程を示す図である。

図 6は、 ppcを有するプラスミド pppcの構造を示す図である。

図 7は、 asdを有するプラスミド pasdの構造を示す図である。

図 8は、 pntAB (pntA及び pntB) を有するプラスミド pMW: : THYの製造工程を示す図である。

図 9は、 aspAを有するプラスミド pMW118 : :aspAの製造工程を示す図である。図 1 0は、 ppc及び asdを有するプラスミド ppcdの製造工程を示す図である。図 1 1は、 ppc及び pntABを有するプラスミド pPTSの製造工程を示す図である。図 1 2は、 ppc及び aspAを有するプラスミド pAPWの製造工程を示す図である。図 1 3は、 ppc、 pntAB及び asdを有するプラスミド pPTdの製造工程を示す図であ ^ 0

図 1 4は、 ppc、 pntAB及び aspAを有するプラスミド pAPTの製造工程を示す図で

¾ o

図 1 5は、 ppc、 pntAB及び aspAを有するプラスミド pAPTKの製造工程を示す図である。

図 1 6は、 asdを有するプラスミド pSdの製造工程を示す図である。

図 1 7は、 ppc、 pntAB、 aspA及び asdを有するプラスミド pKDの製造工程を示す図である。

図 1 8は、 tet^{p p} °を有するプラスミド pUTESの製造工程を示す図である。

図 1 9は、 tet^p r 及びその下流にブレビパクテリゥム ·ラクトフアーメンタム由来の dapAを有するプラスミド PUEBL3の製造工程を示す図である。

図 2 0は、ブレビパクテリゥム ·ラクトフアーメンタム由来の dapA(Brev. dapA)、 lysC、 dapB及び ddhを有するプラスミド pCABD( B )の製造工程を示す図である。発明を実施するための最良の形態

< 1 >本発明細菌

本発明細菌は、（1 )ジヒドロジピコリン酸合成酵素、ァスパルトキナ一ゼ及びジヒドロジビコリン酸レダクターゼの細胞内の活性が増強されており、かつ（2 ) ジアミノビメリン酸デヒドロゲナ一ゼの細胞内の活性、又は、テトラヒドロジピコリン酸スクシ二ラ一ゼ及びスクシ二ルジァミノビメリン酸デアシラーゼの細胞内の活性が増強されているェシヱリヒア属細菌であって、さらに、以下の酵素の細胞内の活性が増強されている細菌である。

( 1 ) ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナ一ゼもしくはホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラ一ゼ、

( 2 ) ホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラ一ゼ、及び、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドトランスヒドロゲナ一ゼ（以下、「トランスヒドロゲナ一ゼ」ともいう）もしくはァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナ一ゼ、又は、 ( 3 ) ホスホエノールビルビン酸カルボキシラーゼ及びトランスヒドロゲナ一ゼ、並びに、ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼもしくはァスパルタ一ゼ。

本発明細菌は、好ましくは、ホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラ一ゼ、卜ランスヒドロゲナ一ゼ、ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びァスパルタ一ゼの細胞内の活性がさらに増強されているェシエリヒァ属細菌である。本発明細菌は、ェシエリヒア 'コリ（E. col i )であることが好ましい。

本明細書において、「細胞内の活性が増強される」とは、野生株（例えば、 E. coli W3110株）又は親株（本発明において特定された組み合わせの酵素の全ての細胞内の活性が増強されていない株）に比べて、細胞内の酵素活性が上昇していることを意味し、野生株又は親株が有していない酵素活性を有することも包含する。なお、上記の各々の酵素の活性の測定法は公知であり、細胞内の活性の増強は、当業者であれば容易に確認できる。

細胞内の活性を増強する手段としては、下記の手段及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

先ず、酵素の発現量を上昇させる手段が挙げられる。

酵素の発現量を増す手段としては、具体的には、以下の手段が挙げられる。

( 1 ) 酵素の遺伝子を有するプラスミドの導入

プラスミドとしては、ェシヱリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターを用いることができる。導入の方法は公知のものでよい。すなわち、このべクタ一に該遺伝子を挿入し、このベクターでェシヱリヒア属細菌を形質転換すればよい。このベクターはマルチコピー型のプラスミドであることが好ましい。

各遺伝子は、同一のプラスミドに保持されていてもよいし、別々のプラスミドに保持されていてもよい。また、遺伝子の一部が同一のプラスミドに保持されていてもよい。複数のプラスミドを用いた場合には、これらのプラスミドが共に安定して細胞内に保持されるような安定分配機構を有するプラスミドを用いることが好ましい。尚、各遺伝子の導入の順序は問わない。

( 2 ) 染色体上での酵素の遺伝子のコピー数の増大 Muファージ等を用いて染色体 DN A上の DN Aを増幅することによりコビー数を増加させることができる。

染色体 DNA上の DNAは、ェシエリヒア属細菌が本来的に有するものであつてもよいし、トランスダクシヨン、トランスポゾン（Berg, D, E. and Berg, C. M.， Bio/Technol., 1， 17(1983))、 Muファージ（特開平 2— 109985 ) または相同性組換え (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbo r Lab. (1972)) を用いた方法で宿主微生物の染色体に組み込んだものであってもよい。

(3) 酵素の遺伝子のプロモーター配列の改変

プロモーター配列を改変し、遺伝子の転写量を増加させ、これにより発現量を上昇させることができる。たとえばプロモーターに変異を導入することによってプロモーター強化をおこない下流にある遺伝子の転写量を増加させることができる。プロモーターに変異を導入する以外にも、 lac,trp，tac，trc，PLその他のェシェリヒア属細菌において機能するプロモー夕一を新たに導入してもよい。あるいは、ェンハンサ一を新たに導入することによって遺伝子の転写量を増加させることができる。プロモー夕一配列は、染色体上の酵素の遺伝子のもの及びプラスミド上の酵素の遺伝子のもののいずれでもよいが、染色体上の酵素の遺伝子のものであることが好ましい。染色体 DN Aへのプロモータ一等の遺伝子の導入については、例えば特開平 1— 2 15280号公報に記載されている。

上記の酵素の遺伝子の由来は特に限定されず、ェシヱリヒア属細菌において、遺伝子が発現可能であり、そして遺伝子産物が機能可能である限り、種々の由来のものを用いることができる。

以下に、 E. coliの L一リジン生合成系遺伝子及びトランスヒドロゲナ一ゼ遺伝子、並びにブレビパクテリゥムラクトフアーメンタムのジヒドロジピコリン酸合成酵素及びジァミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の取得法を例示する。ホスホエノールビルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc) は、この遺伝子を有するプラスミド pS2 (Sabe, H. et al.， Gene, 31， 279 (讓））、あるいは pT 2から得ることができる。 pS2を Aatllと Aflllで切断することにより、 ppcを有する DNA断片が得られる。また、 pT2を Smalと Sealで切断することによつても ppc を有する DNA断片を得ることができる。 pT2を保持する E. coli F15株（AJ1287 3) は、 1993年 7月 15日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号 305-8566 日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3号）に FERM P- 13752の受託番号のもとで寄託され、 1994年 7月 11日にブダべスト条約に基づく国際寄託に移管され、 FERM BP-4732の受託番号が付与されている。

ァスバルトキナーゼ遺伝子（lysC) は、既知の lysCの塩基配列（Cassan, M. , Parsot, C, Cohen, G. Nリ and Patte, J. Cリ J. Biol. Chem. , 261， 1052(19 86)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、国際公開第 W0 95/16042号記載の配列番号 5及び 6) を用いた PCR法により、 E. coli 染色体 DNAを鍀型として増幅することによって得られる。

ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナ一ゼ遺伝子（asd) は、この遺伝子を有するプラスミド pAD20 (Haziza, C. et al.， EMBO, 1, 379 (1982)) から得られる。 pAD20を Aselと Clalで切断すると、 asdを有する D N A断片が得られる。ジヒドロジビコリン酸合成酵素遺伝子（dapA)は、既知の dapAの塩基配列（Rich aud， F. et al.， J. Bacteriol., 297(1986)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチドプライマ一（例えば、国際公開第 W0 95/16042号記載の配列番号 1及び 2) を用いた PCR法により、 E. coli染色体 DNAを錶型として増幅することによって得られる。

ジヒドロジビコリン酸レダクターゼ遺伝子（dapB) は、既知の dapBの塩基配列 (Bouvier, J. et al.， J. Biol. Chem. , 259, 14829 (1984)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチドプライマ一（例えば、国際公開第 W0 95/16042号記載の配列番号 9及び 10) を用いた P CR法により、 E. coli染色体 DNAを錶型として増幅することによって得られる。

テトラヒドロジビコリン酸スクシ二ラーゼ遺伝子（dapD)は、既知の dapDの塩基配列 (Richaud, C. et al.， J. Biol. Chem., 259, 14824 (1984)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、国際公開第 W0 95/16042 号記載の配列番号 15及び 16) を用いた PCR法により、 E. coli染色体 DN Aを錶型として増幅することによって得られる。

スクシ二ルジァミノビメリン酸デアシラーゼ遺伝子（dapE)は、既知の dapEの塩基配列 (Bouvier, J. et al. , J. Bacteriol., 174, 5265 (1992)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチドプライマ一（例えば、国際公開第 W0 95/16042 号記載の配列番号 17及び 18) を用いた P CR法により、 E. coli染色体 DNAを錶型として増幅することによって得られる。

ァスパルタ一ゼ遺伝子（aspA)は、既知の aspAの塩基配列 (Woods, S. A. et al., Biochem. J., 237(2), 547-557(1986)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレ才チドブライマー（例えば、本明細書配列表の配列番号 5及び 6) を用いた PC R法により、 E. coli DNAを銪型として増幅することによって得られる。

トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（pntAB) は、既知のトランスヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列 (D. . Clarke et al., Eur. J. Biochem., 158,647-653(198 6))に基づいて調製することができる。 E. coliでは、トランスヒドロゲナーゼは 2つのサブユニットからなり、各々 pntA、 pntBによってコードされている（前掲、 D. M. Clarke et al.)ので、その双方を調製する（例えば、国際公開第 W0 95/11 985号参照）。

また、 pntABを含むプラスミドから得ることができる。 pntABを含むプラスミドとしては、国際公開第 W0 95/11985号に記載のプラスミド pMW : ： THYが挙げられる。同プラスミドは、 E. coli K-12 MC1061株の pntA及び pntBを含む 3. O kの DNA断片と、プラスミドベクタ一 pMW118の BamHI及び Hindlll断片を連結することにより得られた組換えプラスミドである。 pMW : ： THYを保持するェシエリヒア 'コリ JM109株は、 A J 12929株と命名され、 1993年 10月 4日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号 305-0046 日本国茨城県つレくば巿東一丁目 1番 3号）に、受託番号 FERM P- 13890として寄託され、 1994年 9 月 14日にブダぺスト条約に基づく国際寄託へ移管され、 FERM BP- 4798の受託番号が付与されている。

ブレビパクテリゥムラクトファ一メンタムのジヒドロジビコリン酸合成酵素遺伝子 (dapA) は、既知の dapAの塩基配列 (Bonassie, S. et al., N. A. R., 1 8(21)， 6421(1990)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチドプライマ一 (例えば、本明細書配列表の配列番号 3及び 4) を用いた PCR法により、ブレビバクテリウムラクトフアーメンタム染色体 DN Aを铸型として増幅することによって得られる。

ブレビパクテリゥムラクトファ一メンタムのジアミノビメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ddh) は、コリネパクテリゥムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum) の ddhの既知の塩基配列（Ishino, S. et al.， Nucleic Acids Res. , 15, 3917 ( 1987)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、国際公開第 W0 95/16042号記載の配列番号 11及び 12) を用いた P C R法により、ブレビパクテリゥムラクトフアーメンタムの染色体 D N Aを錶型として増幅することによって得られる。

また、細胞内の活性を増強する手段として、酵素の比活性を上昇させる手段が挙げられる。この手段は、酵素の発現量を上昇させる手段と組み合わせてもよい。酵素の比活性を上昇させる手段としては、比活性が上昇する変異を導入した酵素を保持させること、酵素がフィードバック阻害を受ける場合、フィードバック阻害を解除した酵素を保持させることなどが挙げられる。

フィードバック阻害が解除された酵素としては、 L一リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジビコリン酸合成酵素（ D D P S ) 及び L—リジンフィードバック阻害が解除されたァスパルトキナ一ゼ（A K ) が挙げられる。

「L一リジンによるフィードバック阻害が解除された」とは、実質的に阻害が解除されていればよいことを意味し、完全に解除されている必要はない。また、ェシエリヒア属細菌の他の生物由来の酵素も、それがその生物の野生型のものであるか変異型のものであるかに拘わらず、 L—リジンによるフィードバック阻害の程度がェシエリヒア属細菌由来の野生型酵素よりも低ければ、 L—リジンによるフィードバック阻害が解除された酵素に包含される。従って、ブレビパクテリゥム属細菌由来の D D P Sのように、本来的に L一リジンによるフィードバック阻害を受けない酵素も包含される。

L一リジンによるフィードバック阻害の程度は、国際公開第 W0 95/16042号の実施例 1及び 2に記載の方法など公知の方法によって評価することができる。

L一リジンによるフィードバック阻害が解除された D D P S (非感受性 D D P S ) 及び L一リジンによるフィードバック阻害が解除された A K (非感受性 A K ) としては、国際公開第 W0 95/16042号及び特閧平 10-113183に記載されたものが挙げられる。

すなわち、非感受性 DD P Sの例としては、野生型 DD P Sの L—リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するものが挙げられる。野生型 DD PSとしては、ェシエリヒア属細菌由来のもの、特に E. coli由来の DDPSが挙げられる。 DDPSの L一リジンによるフィードバック阻害を解除する変異の例としては、国際公開第 W095/16042号記載の配列番号 4に示される DDPSのアミノ酸配列中、 - DDP Sの N—末端から

① 81番目のァラニン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはパリン残基）に置換させる変異、

② 118番目のヒスチジン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはチロシン残基）に置換させる変異、

③ 81番目のァラニン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはノリン残基）に置換させかつ 118番目のヒスチジン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはチロシン残基）に置換させる変異、が挙げられる。種や株の間で、活性に影響を与えない相違がアミノ酸配列にあり得ることはよく知られており、上記特定のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基は当業者であれば容易に認識できる。

非感受性 D DP Sの他の例としては、コリネ型細菌（例えばブレビバクテリウムラクトフアーメンタム）由来の DD P S(Cremer J. et al. J. Gen. Microb iol., 134, 3221-3229 (1988))が挙げられる。

非感受性 D D P Sを保持させる方法としては、非感受性 D D P Sをコードする DN Aをェシエリヒア属細菌に導入することが挙げられる。

非感受性 DDP Sをコードする DN Aの例としては、野生型 DDP Sをコードする DN Aにおいて、コードされる DDP Sの L—リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するものが挙げられる。

以下、ェシエリヒア属細菌由来の DDP Sを例にとって非感受性 DDP Sをコードする DNA (非感受性 DDPS遺伝子）の取得方法について説明するが、他の生物由来の DDP Sについても同様である。また、他の生物由来の野生型 DD P Sが非感受性 DDP Sであれば、それをコードする DN Aをそのまま用いることができる。

野生型 DDP Sをコ一ドする DN Aとしては、ェシエリヒア属細菌由来の DD PSをコードするものであれば特に制限されないが、具体的には国際公開第 W0 9 5/16042号記載の配列番号 4に示されるァミノ酸配列をコードする D N Aが挙げられ、さらに具体的には同配列番号 3に示される塩基配列のうち、塩基番号 27 2〜1 147で表される配列が挙げられる。これらの配列において、上記アミノ酸残基の置換を起こすような塩基配列の変異を有するものが、非感受性 DDP S をコードする DNAである。尚、置換されたアミノ酸残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わない。また、菌種ゃ菌株の違いにより保持する DD P Sのアミノ酸配列がわずかに相異することが予想されるが、このような酵素の活性に関与しない位置でのアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入を有するものも非感受性 DD P S遺伝子に含まれる。

このような非感受性 DD P S遺伝子を取得する方法の例は以下の通りである。まず、野生型 D D P S遺伝子又は他の変異を有する D D P S遺伝子を含有する D NAをインビ卜ロ変異処理し、変異処理後の DNAと宿主に適合するベクター D N Aとを連結して組換え DN Aを得る。組換え DN Aを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで非感受性 D D P Sを発現するように至ったものを選択すれば、同形質転換体が非感受性 DDPS遺伝子を保持している。また、野生型 D D P S遺伝子又は他の変異を有する D D P S遺伝子を含有する D N Aを、宿主に適合するベクター DN Aと連結して組換え DNAを得て、その後組換え DNAをィンビトロ変異処理し、変異処理後の組換え DN Aを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで非感受性 D DPSを発現するように至ったものを選択しても、同形質転換体は非感受性 D DP S遺伝子を保持している。

野生型 D D P Sを生産する微生物を変異処理し、非感受性 D D P Sを生産する変異株を創成した後、該変異株から非感受性 DDP S遺伝子を取得してもよい。あるいは、野生型遺伝子が連結されている組換え DN Aが導入されている形質転換体を変異処理し、非感受性 DDPSを生産する変異株を創成した後、該変異株から組換え DN Aを回収すれば、同 DN A上に非感受性 D DP S遺伝子が創成される。

DNAをィンビト口変異処理するための薬剤としては、ヒドロキシルァミン等が挙げられる。ヒドロキシルァミンは、シ卜シンを N⁴—ヒドロキシシトシンに変えることによりシトシンからチミンへの変異を起こす化学変異処理剤である。また、微生物自体を変異処理する場合は、紫外線照射または N—メチル—N'—二トロ— N—二トロソグァ二ジン（NTG) もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理を行う。

上記野生型 D DP S遺伝子あるいは他の変異を有する D DP S遺伝子を含有する DNAの供与菌としては、いかなるェシエリヒア厲に属する微生物を用いてもかまわない。具体的にはナイトハルトらの著書 (NeidhardtJ.C. et.al. ,Escheric hia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Wa shington D.C.,1208, table 1) にあげられるものが利用できる。たとえば、 E.c oli J 109株や、 MC1061株などがあげられる。 D D P S遺伝子を含有する DNAの供与菌として野生株を用いた場合、野生型の D DP S遺伝子を含む DNAが取得できる。

非感受性 AKの例としては、野生型 AKの Lーリジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するものが挙げられる。野生型 AKとしては、ェシエリヒア属細菌由来のもの、特に E. coli由来のァスバルトキナーゼ III (AKIII) が挙げられる。 AKIIIの L—リジンによるフィードバック阻害を解除する変異としては、国際公開第 W095/16042号記載の配列番号 8に示される AKIIIのアミノ酸配列中、 AKIIIの N—末端から

(ィ) 323番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはァスパラギン酸残基）に置換させる変異、

(ϋ)323番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはァスパラギン酸残基）に置換させかつ 408番目のグリシン残基に相当するァミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはァスパラギン酸残基）に置換させる変異、

(ハ） 34番目のアルギニン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはシスティン残基）に置換させかつ 323番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはァスパラギン酸残基）に置換させる変異、

(二) 325番目のロイシン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはフヱ二ルァラニン残基）に置換させる変異、

(ホ) 318番目のメチォニン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはイソロイシン残基）に置換させる変異、

(へ) 318番目のメチォニン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはィソロイシン残基）に置換させかつ 349番目のバリン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはメチォニン残基）に置換させる変異、 (ト） 345番目のセリン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはロイシン残基）に置換させる変異、

(チ) 347番目のバリン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはメチォニン残基）に置換させる変異、

(リ) 352番目のスレオニン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはイソロイシン残基）に置換させる変異、

(ヌ） 352番目のスレオニン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはィソロイシン残基）に置換させかつ 369番目のセリン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはフヱニルァラニン残基）に置換させる変異、

(ル） 164番目のグル夕ミン酸残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはリジン残基）に置換させる変異、

(ヲ） 417番目のメチォニン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはィソロイシン残基）に置換させかつ 419番目のシスティン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基（好ましくはチロシン残基）に置換させる変異、が挙げられる。また、 323番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基を別のァミノ酸残基（好ましくはァスパラギン酸残基）に置換させかつ 318番目のメチォ二ン残基に相当するァミノ酸残基を別のァミノ酸残基（好ましくはイソロイシン残基）に置換させる変異（特開平 10- 113183 ) が挙げられる。種や株の間で、活性に影響を与えない相違がアミノ酸配列にあり得ることはよく知られており、上記特定のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基は当業者であれば容易に認識でき o

非感受性 AKの他の例としては、コリネ型細菌由来変異型 AK (特開平 6-6286 6) が挙げられる。

非感受性 AKを保持させる方法としては、非感受性 AKをコードする DNAをェシ: リヒア属細菌に導入することが挙げられる。

非感受性 AKをコードする DNAの例としては、野生型 AKをコ一ドする DN Aにおいて、コードされる AKの Lーリジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するものが挙げられる。

以下、ェシエリヒア属細菌由来の AKIIIを例にとって非感受性 AKをコードする DN Aの取得方法について説明するが、他の生物由来の A Kについても同様である。また、他の生物由来の野生型 AKが非感受性 AKであれば、それをコードする DN Aをそのまま用いることができる。

野生型 ΑΚΙΠをコードする DNAとしては、特に制限されないが、ェシエリヒア属細菌、例えば Ε· coli由来の AKIIIをコードする DNAが挙げられ、具体的には国際公開第 W095/16042号記載の配列番号 8に示されるアミノ酸配列をコードする DNA、さらには同配列番号 7に示される塩基配列のうち、塩基番号 5 84〜 1930で表される配列が挙げられる。尚、 E. coliの AKIIIは、 lysC遺伝子にコ一ドされている。

これらの配列において、上記アミノ酸残基の置換を起こすような塩基配列の変異を有するものが、変異型 AKIIIをコードする DNAである。尚、置換されたアミノ酸残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わない。また、菌種ゃ菌株の違いにより保持する野生型 AKIIIのアミノ酸配列がわずかに相異するものがある。このような酵素の活性に関与しない位置でのアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入を有するものも変異型 AKII I遺伝子に含まれる。例えば、後記実施例 2で得られた野生型 lysC遺伝子の塩基配列（国際公開第 W095/16042号記載の配列番号 7) は、既に発表されている E. coli K-12 JC411株の lysCの配列 (Cassan, M. , Parsot,C, Cohen, G. N. , and Patte, J. C, J. Biol. Chem. , 261， 1052(1986)) と 6ケ所相違しており、そのうち 2ケ所でコ一ドされるアミノ酸残基が異なっている（JC411株の lysCは、国際公開第 W0 95/16042号記載の配列番号 8に示される lysCのアミノ酸配列中、 N—末端から 58番目のグリシン残基がシスティン残基に、 401番目のグリシン残基がァラニン残基に置き換わっている）。この E. coli -12 JC411株の lysC と同一の配列を有する lysCであっても、上記（ィ）〜（ヲ）及び 323番目のグリシン残基に相当するァミノ酸残基を別のァミノ酸残基（好ましくはァスパラギン酸残基）に置換させかつ 318番目のメチォニン残基に相当するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基のいずれかの変異を導入すれば、 Lーリジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有する lysCが得られることが予想される。

L—リジンによるフィードバック阻害が解除された変異型 ΑΚΙΠをコードする DNAを取得する方法の例は以下の通りである。まず、野生型 AKIII遺伝子又は他の変異を有する ΑΚΠΙ遺伝子を含有する DNAをインビトロ変異処理し、変異処理後の DN Aと宿主に適合するべクタ一 DN Aとを連結して組換え DN A を得る。組換え DNAを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで変異型 A Killを発現するように至ったものを選択すれば、同形質転換体が変異型遺伝子を保持している。また、野生型 AKIII遺伝子又は他の変異を有する AK III遺伝子を含有する DN Aを、宿主に適合するベクター DN Aと連結して組換え DN Aを得て、その後組換え DNAをインビトロ変異処理し、変異処理後の組換え DN Aを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同形質転換体のうちで変異型 A Killを発現するように至ったものを選択しても、同形質転換体は変異型遺伝子を保持している。

あるいは、野生型酵素を生産する微生物を変異処理し、変異型酵素を生産する変異株を創成した後、該変異株から変異型遺伝子を取得してもよい。 DNAを直接変異処理するための薬剤としては、ヒドロキシルァミン等が挙げられる。ヒドロキシルァミンは、シトシンを N⁴—ヒドロキシシトシンに変えることによりシトシンからチミンへの変異を起こす化学変異処理剤である。また、微生物自体を変異処理する場合は、紫外線照射または N—メチルー N'—二卜ロー N—二トロソグァニジン（NTG) 等の通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理を行う。上記野生型 Α Κ Ι Π遺伝子あるいは他の変異を有する A K I I I遺伝子を含有する DNAの供与菌としては、いかなるェシエリヒア属に属する微生物を用いてもかまわない。具体的にはナイトハルトらの著書（Neidhardt, F. C. et al .， Escheri chia coli and Salmonel la Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C.， 1208, table 1) にあげられるものが利用できる。たとえば、 E. coli 扁 9株や、 MC1061株などがあげられる。

本発明細菌においては、ァスパル卜キナーゼ、ジヒドロジピコリン酸レダク夕ーゼ、テトラヒドロジビコリン酸スクシ二ラ一ゼ、スクシ二ルジアミノビメリン酸デァシラ一ゼ、ホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラ一ゼ及びァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼがェシエリヒア属細菌由来であり、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ及びァスパルタ一ゼが、存在する場合にはェシヱリヒア属細菌由来であり、ジヒドロジビコリン酸合成酵素がェシエリヒア属細菌又はブレビパクテリゥム属細菌由来であり、ジァミノピメリン酸デヒドロゲナ一ゼがブレビバクテリゥム属細菌由来であることが好ましい。

ブレビパクテリゥム属細菌としては、ブレビパクテリゥム ·ラクトフアーメンタムの他に、ブレビパクテリゥム ' フラバム、ブレビバクテリゥム .ディバリカタム、コリネバクテリゥム ·グルタミカム、コリネパクテリゥム . リリウム等が挙げられる。

また、本発明細菌においては、ジヒドロビコリン酸合成酵素及びァスパルトキナーゼの細胞内の活性が、 L一リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジビコリン酸合成酵素、及び、 L—リジンによるフィードバック阻害が解除されたァスノ^レトキナーゼを保持することにより増強され、ジァミノピメリン酸デヒドロゲナ一ゼの細胞内の活性が、ジァミノビメリン酸デヒドロゲナ一ゼ遺伝子の導入により増強されていることが好ましい。このような好ましい本発明細菌は、国際公開第 W0 95/16042号に記載のプラスミド pCABD2又は pCABDElをェシェリヒア属細菌に導入することによって得ることができる。

< 2 >本発明製造法上記のようにして得られる本発明細菌を、好適な培地中で培養し、該培養物中に L一リジンを生産蓄積させ、該培養物から L—リジンを採取することにより、 L一リジンを効率よく製造することができる。

本発明によるェシエリヒア属細菌の培養に使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。

炭素源としては、グルコース、ラクト一ス、ガラクトース、フラクトースもしくはでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールもしくはソルビトールなどのアルコール類、またばフマール酸、クェン酸もしくはコハク酸等の有機酸類を用いることができる。

窒素源としては、硫酸アンモニゥム、塩化アンモニゥムもしくはリン酸アンモニゥム等の無機アンモニゥム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、またはアンモニア水等を用いることができる。

有機微量栄養源としては、ビタミン B !、 L一イソロイシンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。

培養は、好気的条件下で 1 6〜7 2時間実施するのがよく、培養温度は 2 5 °C 〜4 5 °Cに、培養中 p Hは 5〜8に制御する。尚、 p H調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアル力リ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができ発酵液からの L—リジンの採取は通常ィオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。実施例

以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する

実施例 1

< 1 > 種々の性質を有するェシエリヒア属細菌の作製

下記に示すプラスミドを E. coli W3110(tyrA)に導入した。ブラスミド名保持する遺伝子

SF24P dapA*

RSFD80 dapA*, lysC*

pCABl dapA*, lysC*， dapB

PCABD2 dapA*, lysC*, dapB, ddh

pCABD(B ) Brev. dap A, lysC*, dapB, ddh

pCABDEl dapA* , lysC*, dapB, dapD, dapE 遺伝子の略号の意味は以下の通りである。

ppc ：ホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラ —ゼ

lysC ：ァスパルトキナ一ゼ I I I

lysC* ：阻害解除型ァスバルトキナーゼ I I I

asd ：ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナ一ゼ

dapA ：ジヒドロジビコリン酸シン夕ーゼ

dapA* ：阻害解除型ジヒドロジビコリン酸シン夕ーゼ

Brev. dapA：阻害解除型ジヒドロジビコリン酸シンターゼ（ブレビバクテリウムラクトフアーメンタム由来）

dapB ：ジヒドロジピコリン酸レダク夕ーゼ

dapD ：テトラヒドロジビコリン酸スクシ二ラ一ゼ

dapE ：スクシ二ルジァミノビメリン酸デアシラーゼ

ddh ：ジアミノビメリン酸デヒドロゲナ一ゼ（ブレビバクテリゥムラクトファーメンタム由来）プラスミド RSF24P、 RSFD80, pCABl、 pCABD2及び pCABDElは国際公開第 WO 95/16 042号に記載されている。その構築の詳細は国際公開第 W0 95/16042号に記載されており、その概略は以下の通りである。

( 1 ) RSF24P

既知の E. col iの dapAの塩基配列（J. BacterioL , 166， 297 ( 1986 ) )に基づいて、 PCR法により dapAの SD配列及びオープンリーディングフレーム（0RF )を含む断片を増幅した。増幅断片をクローニングベクター pCRlOOOに連結し、 pCRlOOO中の lacZプロモー夕一による転写方向に対して dapAの転写の向きが逆方向となるように連結されたプラスミド pdapA2を得た。 pdapA2をヒドロキシルァミンにより変異処理し、変異処理された pdapA2を E. col i W3110に導入し、形質転換体から AEC耐性のあるものを選択した。さらに、選択された耐性株が有するプラスミドにコードされた D D P Sの Lーリジンによる阻害の度合いを測定し、 L—リジンによる阻害が解除されたものを選択した。配列決定により、 597番目の Cが Tに変化していることが確認された pdapA24を、 pVIC40のテトラサイクリン耐性遺伝子プロモ一夕一の下流に連結し、 RSF24Pを得た（図 1 ) 。

RSF24Pを E. col i JM109株に導入したものは、 AJ12395と命名され、 1993年 10月 28曰に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号 305-8566 日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3号）に FERM P- 13935の受託番号のもとで寄託され、 1994年 11月 1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、 FERM BP-485 8の受託番号が付与されている。

(2 ) RSFD80

既知の E. col iの lysCの塩基配列（J. Biol . Chem. , 261 , 1052 ( 1986 ) )に基づいて、 PCR法により lysCの SD配列及び 0RFを含む断片を増幅した。増幅断片を多コビ一ベクタ一 PUC18に連結し、 pUC18中の lacZプロモ一夕一による転写方向に対して lysCの転写の向きが逆方向となるように連結されたプラスミド pLYSClを得た。 pLYSClをヒドロキシルァミンにより変異処理し、変異処理された pLYSClを E. col i GT3に導入し、形質転換体から AEC及び L—リジンに耐性のあるものを選択した。また、 pLYSClを E. col i MC1061に導入し、菌体をヒドロキシルァミンにより変異処理し、 AEC及び L一リジンに耐性のあるものを選択した。さらに、選択された耐性株が有するブラスミドにコ一ドされた A Kの Lーリジンによる阻害の度合い及び熱安定性を測定し、 L一リジンによる阻害が解除されかつ安定性に優れたものを選択した。配列決定により、 352番目の Cが Tに変化していることが確認された pLYSCl*80を、 PHSG399の lacZプロモー夕一の下流に連結し、 pLLC*80を得た。 p LLC *80と RSF24Pとから図 2に示す様にして RSFD80を作製した。

RSFD80を E. coli JM109株に導入したものは、 AJ12396と命名され、 1993年 10月 28曰に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号 305-8566 日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3号）に FERM P-13936の受託番号のもとで寄託され、 1994年 11月 1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、 FERM BP- 485 9の受託番号が付与されている。

(3) pCABl

既知の dapBの塩基配列 (Bouvier, J. et al.， J. Biol. Chem. , 259, 14829 (1984)) に基づいて P CR法により、 E. coli W3110株染色体 D N Aから dapBを増幅し、得られた増幅 DNA断片を Aselと Dralで切断し、末端を平滑化した後、 PMW119の Smal部位に挿入し、プラスミド pdapBを得た。次いで、図 3に示す様にして dapBを &SFD80に組み込み、 pCAB 1を得た。

(4) pCABD2

コリ不ノヽ *クテリウムグノレ夕ミカム (Corynebacterium glutamicum) の ddhの既知の塩基配列 (Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)) に基づいて P CR法により、ブレビパクテリゥムラクトフアーメンタム ATCC1 3869 の染色体 DNAから ddhを増幅し、得られた増幅 D N A断片を EcoT22Iと Ava Iで切断し、末端を平滑化した後、 PMW119の Smal部位に挿入し、プラスミド pddh を得た。次いで、図 4に示す様にして ddhを pCABlに組み込み、プラスミド pCABD2 を得た。

(5) pCABDEl

既知の dapDの塩基配列 (Richaud, C. et al., J. Biol. Chem., 259, 14824 (1984)) に基づいて P CR法により、 E. coli W3110株染色体 D N Aから dapDを増幅し、得られた増幅 DNA断片を Eco0109Iと Saclで切断し、末端を平滑化した後、 pMW118の Smal部位に挿入し、プラスミド pdapDを得た。また、既知の dapEの塩基配列 (Bouvier, J. et al,, J. Bacteriol., 174, 5265 (1992)) に基づいて PCR法により、 E. coli W3110株染色体 DNAから dapEを増幅し、得られた増幅 DNA断片を Muniと Bglllで切断し、末端を平滑化した後、 _PMW118の Smal部位に挿入し、プラスミド pdapEを得た。 pdapEから dapEを切り出し、 pdapDに揷入して dapE及び dapDを共に有するプラスミド pMWdapDElを作製した。さらに、図 5 に示す様にして、 pMWdapDElから dapE及び dapDを含む断片を切り出し、これを pCA B 1に挿入して pCABDElを得た。

プラスミド pCABD( B )は、以下のように構築した。

まず、下記の配列のプライマーを用いて PBR322より Tet耐性遺伝子のプロモー夕一部位を含む DNA断片を増幅した。

5' -TCAAGAATTCTCATGTTTGA-3' (配列番号 1 )

5' -GTTAGATTTGGTACCCGGTGCCTGACTGCGTTAGC-3' (配列番号 2 )

増幅された DNA断片を Kpnl及び EcoRIで切断し、 pUC18の Kpnl及び EcoRI切断部位に挿入し、 pUTESを得た（図 1 8 ) 。

次に下記の配列のプライマ一を用いてブレビパクテリゥムラクトファ一メンタム Ysr株染色体 DNAを铸型として Brev. dapA遺伝子を増幅した。

5' -GGTTGTGGTACCCCCAAATGAGGGAAGAAG-3' (配列番号 3 )

5' -TGGAACCTCTGTTGCTGCAG-3' (配列番号 4 )

増幅された Brev. dapA遺伝子を Kpnl及び BamHIで切断し、 pUTESの Kpnl及び BamH I切断部位に挿入し、 PUEBL3を得た（図 1 9 ) 。

次に PUEBL3を EcoRI及び Xbalで切断し、両端を平滑末端化し、 Brev. dapAを含む断片を取得した。次に国際公開第 W0 95/16042号記載の pCABD2を Nhel及び Spe l で切断後、両端を平滑末端化し、 lysC、 dapB及び ddhを含む断片を回収後、ここ 'に先に取得した Brev. dapAを含む断片を挿入することにより、 pCABD(B )を取得した（図 2 0 ) 。

E. col i W3110( tyrA)については欧州特許公開第 4 8 8 4 2 4号公報に詳しい記載があるが、その調製方法について簡単にふれると以下の通りである。国立遺伝学研究所（静岡県三島巿）より E. col i W3110株を入手した。同株をストレブ卜マイシン含有の L Bプレートにまき、コロニーを形成する株を選択してス卜レプトマイシン耐性株を取得した。選択したストレプトマイシン耐性株と、 E . col i K-12 ΜΕ8424株を混合して、完全培地（L- Broth： 1 % Bacto trypton, 0. 5 % Y east extract, 0.5% NaCl ) で 3 7 °Cの条件下、 1 5分間静置培養して接合を誘導した。 E . col i K-12 ME8424株は、（HfrP045 , thi , relAl , tyrA: : TnlO, ung- 1, nadB) の遺伝形質を有し、国立遺伝学研究所より入手できる。

その後で培養物を、ストレプトマイシン、テトラサイクリンおよび L—チロシンを含有する完全培地（レ Broth : 1 % パクトトリプトン， 0.5% イーストェキストラクト， 0.5% NaCl, 1.5% 寒天）にまき、コロニーを形成する株を選択した。この株を、 E. coli W3110(tyrA)株と命名した。

また、欧州特許公開第 4 8 8 4 2 4号公報には、 W3110(tyrA)株にプラスミドを導入して形成される株が多く記載されている。例えば、プラスミド pHATermを導入して得られる株は、 E. col i W3110(tyrA)/pHATerm株（E. col i AJ 12662株) と命名され、 1991年 11月 16日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 (郵便番号 305- 8566 曰本国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3号）に国際寄託されており、受託番号 FERM BP- 3653が付与されている。この E. coli W3110(tyrA)/pH ATerm株からプラスミド pHATermを脱落させることによつても W3110(tyrA)株を取得することができる。プラスミドの脱落は常法によって行うことができる。

< 2 > ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（asd)、ホスホエノールビルビン酸遺伝子（ ppc )、又はァスパルタ一ゼ遺伝子（ aspA )の導入および L—リジン生産性の評価

asdを含むプラスミド及び ppcを有するプラスミドとしては、国際公開第 W0 95/ 16042号に記載された pasd及び pppcを用いた。これらのプラスミドの構築については国際公開第 W0 95/16042号に詳細な記載がある。その概略は以下の通りである。

( 1 ) pasd

asdは、この遺伝子を有するプラスミド pAD20 (Haziza, C. et al .， EMB0, 1， 379 ( 1982 )) から得た。 pAD20を Aselと Clalで切断し、末端を平滑化した後、 pMW 118の Smal部位に揷入し、プラスミド pasdを得た（図 8 )。

(2 ) pppc

ppcは、この遺伝子を有するプラスミド pT2から得た。 ρΤ2を Smalと Sealで切断し、末端を平滑化した後、 pMW118の Smal部位に挿入し、プラスミド pppcを得た (図 9 ) 。 pT2を保持する E. col i F15株 (AJ12873) は、 1993年 7月 15日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号 305- 8566 日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3号）に FERM P-13752の受託番号のもとに寄託され、 1994年 7 月 11日にブ夕べスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号 FERM BP-4732が付与されている。

aspAを有するプラスミドは以下のように構築した。

下記の配列のプライマーを用いて E. coliの aspA遺伝子を増幅した。

5' -TGATCAGCGAAACACTTTTA-3' (配列番号 5 )

5' -CAGCAAACTATGATGAGAA-3' (配列番号 6 )

次に、得られた増幅断片を PMW118 (二ッポンジーン社）の Smal切断部位に挿入し pMW118::aspAを取得した（図 9 ) 。

E. coli W3110(tyrA)及び上記 < 1 >で得られた形質転換体の各々に、 p W118 (対照プラスミド）、 pasd、 pppc及び p W118::aspA (比較例プラスミド）をそれそれ導入した。得られた形質転換体は、 E. coli W3110(tyrA)に、 p W118、 pasd、 pppc又は pMW118::aspAを導入したものを除いて、 pMW118、 pasd、 pppc及び pMW118 ：: aspAのいずれかと、 SF24P, RSFD80, pCAB pCABD2、八80(8)及び 80£1のいずれかとの 2種類のプラスミドが共存している。これらの形質転換体について、国際公開第 W0 95/16042号に記載された方法により L—リジン生産性を調べた。具体的には、以下のように行った。

培養は、 500ml坂口フラスコに下記組成の培地を 20 ml入れ、培養温度 37°C、撹拌 114〜116rpmの条件下で 30時間行った。

(培地組成）

グルコース 40 g/1

(NH₄)₂S0₄ 16 g/1

イーストエキストラクト（Difco) 2 g/1

L-チロシン 0.1 /1

KOH で pH7.0 に調整し、 115°Cで 10分ォ一トクレーブ（グルコース、 MgS0₄'7H ₂0は別殺）局方 CaCOa 25g/l (180°Cで 2曰間乾熱滅菌）

抗生物質（導入するプラスミドの種類に応じストレプトマイシン 20 fflg/K ァンピシリン 50 mg/K またはカナマイシン 25 mg/1) 培養液（培養後の培地）中の L一リジンの定量を、旭化成（株）製バイオテツクアナライザ一 AS 2 10を使用して行った。

結果を表 1に示す。表中、 L—リジンの量は培地 dl当たりの mgで示す。表 1

n.d.測定せ表 1から明らかなように、 asd又は ppcを、 E. coli中で、単独又は dapA(flSF24P) もしく ttdapA+lysC(RSFD80)¾しくは dapA+lysC + dapB(pCABl)と共に増強した場合の L—リジンの生産量（蓄積量）は、 asd又は ppcを増強しない場合と比較して変化ないか、あっても微弱であり、特に asdでは減少する場合もある（asdでは -180〜20 mg/dK ppcでは 10〜30 mg/dl) 。これに比し、 dapA+lysC + dapB+ddh ( PCABD2 )又は dapA +lysC+dapB+ dapD + dapE ( pCABDE 1 )と共に増強した場合には、 asd又は ppcを増強しない場合と比し顕著な L—リジンの生産量の上昇が認められた (asdでは 70 ing/dU ppcでは 90 mg/dl) 。しかし、 aspAは、 dapA+lysC+dapB +ddh(pCABD2)と共に増強した場合でも、顕著な L一リジンの生産量の上昇は認められなかった。さらに、ェシエリヒア 'コリ由来の dapAの代わりにブレビパクテリゥム 'ラクトファ一メン夕ム由来の dapAを用いた場合 (pCABD(B))でも、ェシエリヒア 'コリ由来の dapAを用いた場合（pCABD2)と同様な効果が得られたことから、遺伝子の由来は重要でなく、その組み合わせが重要と考えられる。実施例 2

< 1 >ホスホエノールビルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc)と、ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（asd)、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子 (pntAB)又はァスパルタ一ゼ（aspA)とを有するプラスミドの構築

ppc及び asdを有するプラスミド、 ppc及び pntABを有するプラスミド、並びに、 ppc及び aspAを有するプラスミドを下記の様にして構築した。

(1) ppc及び asdを有するプラスミド（ppcd)

国際公開第 WO 95/16042号記載の pasdを Kpnl及び Sphlで切断後、 asdを含む DNA 断片の両端を平滑末端化した。次に国際公開第 W0 95/16042号記載の pppcを Xbal で切断後、両端を平滑末端化し、ここに先の asd断片を挿入することで ppcdを得た（図 10) 。

(2) ppc及び pntABを有するプラスミド（pPTS)

国際公開第 W0 95/11985号記載の ^::1"1^を31^1及び 11(1111で切断し、 pntAB を含む DNA断片を回収した。次に国際公開第 W0 95/16042号記載の pppcを Xbalで切断後、両端を平滑末端化し、更に Hindlllで切断し、ここに先の pntAB断片を挿入することで pPTSを得た（図 1 1) 。

プラスミド pMW:: THYの構築については国際公開第 W0 95/11985号に詳細な記載がある。その概略は以下の通りである。

既知の E. coliの pntA, pntBの塩基配列（D. M. Clarke et al.， Eur. J. Bioch em., 158， 647-653(1986))に基づいて、 PCR法によりプロモー夕一活性のある領域を含めて両遺伝子を含む断片を増幅した。増幅された DNA断片を BamHI及び Hind IIIで消化して得られた DNA断片を、 BamHI及び Hindi IIで切断したプラスミドべク夕一 PMW118 (二ヅポンジーン社）に連結し、 pMW::THYを得た（図 8) 。

pMW118::THYを E. coli JM109株に導入したものは、 AJ12929と命名され、 1993 年 10月 4日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号 305- 8566

V レ ·

曰本国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3号）に FERM P-13890の受託番号のもとで寄レ . . '

託され、 1994年 9月 14日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、 FERM BP -4798の受託番号が付与されている。レ

(3) ppc及び aspAを有するプラスミド（pAPW) 上記実施例 1に記載の PMW118 : :aspAを Sac lで切断後、両端を平滑末端化し、更に Hindl l lで切断することにより aspAを含む DNA断片を得た。次に国際公開第 W0 9 5/16042号記載の pppcを Xbalで切断後、両端を平滑末端化し、更に Hindl l lで切断し、ここに先の aspA断片を挿入することで pAPWを得た（図 1 2 ) 。

< 2 >二つの遺伝子の導入並びに L一リジン生産性の評価

上記実施例く 1 >で得られた、 PCABD2を導入した形質転換体に、 pppc (参照プラスミド）、 ppcd、 pPTS及び pAPW (比較例プラスミド）を導入した。得られた形質転換体は、 pp_pc、 pp_Cd、 pPTS及び pAPWのいずれかと、 pCABD2との 2種類のブラスミドが共存している。これらの形質転換体について、実施例 1く 2〉と同様に L一リジン生産性を調べた。

結果を表 2に示す。表 2

表 2から明らかなように、 asd又は pntABを dapA+ lysC +dapB +ddh+ppcと共に増強した場合（ppcd又は pPTS) には、顕著な L一リジンの生産量の上昇が認められた（asdでは 80 mg/dK pntABでは 70 mg/dl ) 。しかし、 aspAは、 dapA+ lysC + dapB +ddh+ppcと共に増強した場合（pAPW) でも、顕著な L一リジンの生産量の上昇は認められなかった。実施例 3

く 1 >ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc )と、トランスヒドロゲナ一ゼ遺伝子（pntAB )と、ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（asd )又はァスパルターゼ（aspA)遺伝子とを有するプラスミドの構築 ppc、 pntAB及び asd遺伝子を有するプラスミド、並びに、 ppc、 pntAB及び aspA を有するプラスミドを下記の様にして構築した。

( 1 ) ppc、 pntAB及び asdを有するプラスミド（pPTd)

国際公開第 WO 95/16042号記載の pasdを Kpnl及び Sphlで切断後、 asdを含む DNA 断片の両端を平滑末端化した。次に上記実施例 2に記載の pPTSを Hindl l lで切断し、平滑末端化した後、ここに先の asd断片を挿入することで pPTdを得た（図 1 3 ) 。

(2 ) ppc、 pntAB及び aspAを有するプラスミド（pAPT)

国際公開第 W095/11985号記載の p W:： THYを Smal及び Hindi 1 1で切断することにより pntABを含む DNA断片を取得した。次に上記実施例 2に記載の pAPWを Xbalで切断後、両端を平滑末端化し、更に Hindi I Iで切断し、ここに先の pntABを含む断片を挿入することにより pAPTを得た（図 1 4 ) 。

< 2 >三つの遺伝子の導入並びに Lーリジン生産性の評価

上記実施例 < 1 >で得られた、 PCABD2を導入した形質転換体に、 pPTS (参照プラスミド）、 pPTd及び pAPTを導入した。得られた形質転換体は、 pPTS、 pPTd及び pAPTのいずれかと、 pCABD2との 2種類のプラスミドが共存している。これらの形質転換体について、実施例 1 < 2 >と同様に L—リジン生産性を調べた。

結果を表 3に示す。表 3

表 3から明らかなように、 asd又は aspAを dap A + ly sC + dapB + ddh + ppc 4- pntAB と共に増強した場合（pPTd又は pAPT) には、顕著な L一リジンの生産量の上昇が認められた（asdでは 60 mg/dU aspAでは 50 mg/dl ) 。実施例 4

< 1 >ホスホェノールピルビン酸カルボキシラ一ゼ遺伝子（PDC )と、トランスヒドロゲナ一ゼ遺伝子（pntAB )と、ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナ一ゼ遺伝子（asd)と、ァスパルタ一ゼ（aspA)遺伝子とを有するプラスミドの構築 ppc、 pntAB, asd及び aspAを有するプラスミドを下記の様にして構築した。上記実施例 3に記載の pAPTを Hindl l lで切断後、両端を平滑末端化し、更に Sma Iで切断することにより、 ppc、 aspA、及び pntABを含む DNA断片を取得した。次に PMW218 (二ツボンジーン社）を EcoRIで切断後、両端を平滑末端化し、ここに先の ppc、 aspA、及び pntABを含む DNA断片を挿入することにより pAPTKを取得した (図 1 5 ) 。

次に、国際公開第 W0 95/16042号記載の pasdを Kpnlで切断後、両端を平滑末端化し、更に BamHIで切断することにより asdを含む DNA断片を取得した。そして pST V29を Pstlで切断後、両端を平滑末端化し、更に BajnHIで切断した部位に先の asd 断片を挿入することにより pSdを取得した（図 1 6 ) 。

次に、 pSdを Sphlで切断後、両端を平滑末端化し、更に Xbalで切断することにより再度 asdを含む DNA断片を取得した。そして pAPTKを Sac lで切断後、両端を平滑末端化し、更に Xbalで切断した部位に先の asd断片を断片を挿入することにより pKDを取得した（図 1 7 ) 。

< 2 >四つの遺伝子の導入並びに Lーリジン生産性の評価

上記実施例く 1 >で得られた、 pCABD2、 pCABD( B )又は pCABDElを導入した形質転換体に、 pAPT (参照プラスミド 1 ) 、 pAPTK (参照プラスミド 2 ) 及び pKDをそれそれ導入した。得られた形質転換体は、 pAPT、 pAPTK及び pKDのいずれかと、 pC ABD2、 pCABD( B)及び pCABDElのいずれかとの 2種類のプラスミドが共存している。これらの形質転換体について、実施例 1 < 2 >と同様に L一リジン生産性を調べフ

結果を表 4に示す。表 4

表 4から明らかなように、 asdを dap A + lysC + dapB + ddh + ppc + pntAB + aspAと共に増強した場合には、顕著な L—リジンの生産量の上昇が認められた。この結果は、 pCABD2の代わりに、 pCABD( B )又は pCABDElを用いた場合でも同様であった。表 4中、 pAPTKは pAPTの薬剤耐性遺伝子をアンピシリンからカナマイシンに変更したものである（ベクターを pMW118から pMW218に変更したため）。 pKDは、 pAP TKに asdを挿入して作成したため、 pKDのコントロールとしては pAPTより pAPTKの方が適切と考えられるので、 pAPTKのデータも示した。薬剤耐性遺伝子の変更により L一リジンの生産量は影響を受けないことも確認された。産業上の利用可能性

本発明により、 L一リジンの生産性の高いェシエリヒア属細菌が提供され、この細菌を用いることにより L—リジンを高収率で得ることができる。

Claims

請求の範囲

1 . ( 1 )ジヒドロジビコリン酸合成酵素、ァスパルトキナ一ゼ及びジヒドロジビコリン酸レダク夕ーゼの細胞内の活性が増強されており、かつ（2 )ジァミノビメリン酸デヒドロゲナーゼの細胞内の活性、又は、テトラヒドロジビコリン酸スクシ二ラーゼ及びスクシ二ルジァミノビメリン酸デアシラーゼの細胞内の活性が増強されているェシエリヒア属細菌であって、ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナ一ゼ又はホスホェノールピルビン酸カルボキシラ一ゼの細胞内の活性が増強されていることを特徴とする細菌。

2 . ( 1 )ジヒドロジビコリン酸合成酵素、ァスパル卜キナーゼ及びジヒドロジピコリン酸レダク夕ーゼの細胞内の活性が増強されており、（2 )ジァミノビメリン酸デヒドロゲナーゼの細胞内の活性、又は、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ及びスクシ二ルジァミノビメリン酸デアシラーゼの細胞内の活性が増強されているェシエリヒア属細菌であって、ホスホエノールビルビン酸カルボキシラーゼの細胞内の活性及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド卜ランスヒドロゲナーゼ又はァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナ一ゼの細胞内の活性が増強されていることを特徴とする細菌。

3 . ( 1 )ジヒドロジビコリン酸合成酵素、ァスパルトキナ一ゼ及びジヒドロジビコリン酸レダク夕ーゼの細胞内の活性が増強されており、（2 )ジァミノピメリン酸デヒドロゲナ一ゼの細胞内の活性、又は、テトラヒドロジビコリン酸スクシニラ一ゼ及びスクシ二ルジァミノビメリン酸デアシラーゼの細胞内の活性が増強されているェシェリヒア属細菌であって、ホスホエノールビルビン酸カルボキシラーゼ及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドトランスヒドロゲナ一ゼの細胞内の活性、並びに、ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はァスパルターゼの細胞内の活性が増強されていることを特徴とする細菌。

4 . ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びァスパルタ一ゼの細胞内の活性が増強されている請求項 3記載の細菌。

5 . ァスパルトキナ一ゼ、ジヒドロジビコリン酸レダク夕ーゼ、テ卜ラヒドロジピコリン酸スクシ二ラーゼ、スクシ二ルジアミノビメリン酸デアシラーゼ、ホスホエノールビルビン酸カルボキシラ一ゼ及びァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼがェシエリヒア属細菌由来であり、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ及びァスパルタ一ゼが、存在する場合にはェシエリヒァ属細菌由来であり、ジヒドロジピコリン酸合 fig酵素がェシヱリヒァ属細菌又はブレビパクテリゥム属細菌由来であり、ジァミノビメリン酸デヒドロゲナ一ゼがブレビパクテリゥム属細菌由来である請求項 3又は 4記載の細菌。

6 . 細胞内の活性が増強される酵素の細胞内の活性が、前記酵素の遺伝子を有するプラスミドの導入により増強されている請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の細菌。

7 . 細胞内の活性が増強される酵素の細胞内の活性が、染色体上での前記酵素の遺伝子のコビ一数を増大させることにより増強されている請求項 1 ~ 5のいずれか 1項に記載の細菌。

8 . 細胞内の活性が増強される酵素の細胞内の活性が、染色体上の前記酵素の遺伝子のプロモー夕一配列を改変することにより増強されている請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の細菌。

9 . ジヒドロピコリン酸合成酵素及びァスバルトキナーゼの細胞内の活性力 L—リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジビコリン酸合成酵素、及び、 L—リジンによるフィードバック阻害が解除されたァスパルトキナ一ゼを保持することにより増強され、ジァミノピメリン酸デヒドロゲナーゼの細胞内の活性が、ジァミノビメリン酸デヒドロゲナ一ゼ遺伝子の導入により増強されている請求項 1 ~ 8のいずれか 1項に記載の細菌。

1 0 . 請求項 1〜 9のいずれか一項に記載の細菌を好適な培地で培養し、該培養物中に L—リジンを生産蓄積せしめ、該培養物から L—リジンを採取することを特徴とする L一リジンの製造法。