WO2007088970A1 - メタノール資化性細菌を用いたｌ－リジンの製造法 - Google Patents

メタノール資化性細菌を用いたｌ－リジンの製造法 Download PDF

Info

Publication number
WO2007088970A1
WO2007088970A1 PCT/JP2007/051796 JP2007051796W WO2007088970A1 WO 2007088970 A1 WO2007088970 A1 WO 2007088970A1 JP 2007051796 W JP2007051796 W JP 2007051796W WO 2007088970 A1 WO2007088970 A1 WO 2007088970A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lysine
gene
strain
dna
plasmid
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/051796
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshiya Gunji
Hisashi Yasueda
Reiko Hirai
Seiko Hirano
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co., Inc. filed Critical Ajinomoto Co., Inc.
Priority to EP07713790.9A priority Critical patent/EP1990406B1/en
Publication of WO2007088970A1 publication Critical patent/WO2007088970A1/ja
Priority to US12/184,598 priority patent/US8017363B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the present invention relates to the microbial industry, and in particular, relates to a method for producing L-lysine by a fermentation method and a microorganism used for the production method.
  • L-amino acids such as L-lysine, L-glutamic acid, L-threonine, L-leucine, L-ilosoycin, L-noline, and L-ferulanin are genus Brevibacterium, Corynebaterium, Bacillus And industrially produced by fermentation using microorganisms belonging to the genus Escherichia, Streptomyces, Syudomonas, Arthrobacter, Serratia, Penicillium, Candida and the like. In order to improve the productivity of these microorganisms, natural strains isolated from natural forces or artificial mutants of the strains are used. Various techniques for increasing L-amino acid-producing ability by enhancing L-amino acid biosynthetic enzymes by recombinant DNA techniques have been disclosed.
  • Patent Document 1 discloses a method for producing L-lysine using a strain transformed with a plasmid containing DNA encoding dihydrodipicolinate reductase and DNA encoding diaminopimelate dehydrogenase derived from coryneform bacteria. It is disclosed.
  • Patent Document 5 shows that L-lysine productivity is improved by enhancing the activity of intracellular nicotinamide dinucleotide transhydrogenase.
  • phosphoenolpyruvate carboxylase alone is shown.
  • Patent Documents 6 and 7 show a method for producing L-lysine using a strain with enhanced activity and a method for producing L-lysine using a strain with enhanced activity of aspartate semialdehyde dehydrogenase alone, respectively.
  • Non-Patent Document 2 or Patent Document 9 a protein LysE having a function of specifically discharging L-lysine to the outside of microbial cells and the gene lysE encoding it have been found, and by enhancing it, L-lysine Has been disclosed (Non-Patent Document 2 or Patent Document 9).
  • the present inventors have so far developed a method for producing L-amino acids using Methylophilus bacteria by enhancing dihydrodipicolinate synthase and aspartokinase using artificial mutation breeding and recombinant DNA technology.
  • Patent Document 18 Furthermore, we have shown that the amino acid excretion process is a major obstacle to the production of amino acids by methanol-based fermentation using methanol-assimilating bacteria. From the LysE protein, a protein involved in L-lysine excretion isolated from a genus bacterium, a variant that exhibits L-lysine excretion activity in methanol-assimilating bacteria was obtained.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 56-18596
  • Patent Document 2 U.S. Pat.No. 4,346,170
  • Patent Document 3 International Publication No. 95/16042 (US Pat. No. 6040160)
  • Patent Document 4 International Publication No. 01/53459 (European Patent Application Publication No. 1253195)
  • Patent Document 5 International Publication No. 95/11985 Pamphlet (U.S. Pat. No. 5,830,716)
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 60-87788
  • Patent Document 7 Japanese Patent Publication No. 6-102028
  • Patent Document 8 International Publication No. 9640934 Pamphlet (European Patent No. 841395 Specification)
  • Patent Document 9 International Publication No. 97/23597 Pamphlet (U.S. Patent No. 6858406 Specification)
  • Patent Document 10 Japanese Patent Laid-Open No. 2000-189180 (European Publication) Patent Application Publication No. 1016710)
  • Patent Document 11 European Patent 885962 Specification
  • Patent Document 12 Japanese Patent Laid-Open No. 45-25273
  • Patent Document 13 Japanese Patent Publication No.49-125590
  • Patent Document 14 JP-A-50-25790
  • Patent Document 15 Japanese Patent Laid-Open No. 52-18886
  • Patent Document 16 Japanese Patent Laid-Open No. 4-91793
  • Patent Document 17 Japanese Patent Laid-Open No. 3-505284
  • Patent Document 18 International Publication No. 00Z61723 Pamphlet (European Patent Application Publication No. 1188822 Specification)
  • Patent Document 19 Patent Publication 2004-166594 (US Patent Application Publication No. 2005-003495)
  • Non-Patent Document 1 Applied and Environmental Microbiology 57 (6), 1746-1752 (1991)
  • Non-Patent Document 2 Molecular Microbiology 22: 815-826 (1996)
  • An object of the present invention is to provide a method for producing L-lysine with high efficiency using methanol which is inexpensive and available in large quantities.
  • the present inventors in Methylophilus bacteria, in addition to DNA encoding mutant lysE protein and DNA encoding dihydrodipicolinate synthase released from feedback inhibition by L-lysine, diaminopimelate
  • L-lysine-producing ability of Methylophilus bacteria can be further increased by enhancing the expression of dihydrodipicolinate reductase gene and aspartate semialdehyde dehydrogenase gene in addition to these genes. It was found that it becomes particularly remarkable by enhancing the gene.
  • the present invention is as follows.
  • DNA encoding dihydrodipicolinate synthase that has been desensitized to feedback inhibition by L-lysine, and mutant LysE that promotes the export of L-lysine to the extracellular environment when introduced into methanol-utilizing bacteria A methanol-assimilating bacterium that retains DNA encoding a protein and has been modified to enhance the intracellular activity of diaminobimelate dehydrogenase, diaminopimelate decarboxylase, dihydrodipicolinate reductase and aspartate semialdehyde dehydrogenase.
  • DNA encoding each enzyme or mutant LysE protein is chromosomal DNA
  • DNA encoding dihydrodipicolinate synthase, DNA encoding dihydrodipicolinate reductase, DNA encoding aspartate semialdehyde dehydrogenase, and DNA encoding wasvaltokinase are derived from bacteria belonging to the genus Escherichia. Yes, derived from a DNA-powered Methylophilus bacterium that encodes diaminopimelate decarboxylase, and
  • the methanol-assimilating bacterium according to any one of (1) to (6) is cultured in a medium, L-lysine is produced and accumulated in the medium or the microbial cells, and L-lysine is collected from the medium or the microbial cells. And a method for producing L-lysine.
  • Fig. 1 shows the construction of ⁇ 12 plasmid.
  • FIG. 2 is a diagram showing the construction of pMIV5 plasmid.
  • FIG. 3 shows the construction of pMIV-FRTKmFRT plasmid.
  • FIG. 4 is a diagram showing the construction of pAET7 plasmid.
  • FIG. 5 shows the construction of pFLP31 plasmid.
  • the methanol-assimilating bacterium of the present invention has released feedback inhibition by L-lysine. It retains DNA encoding dihydrodipicolinate synthase and DNA encoding mutant LysE that promotes the export of L-lysine to the extracellular environment when introduced into methanol-utilizing bacteria.
  • the methanol-assimilating bacterium is a bacterium that can grow using methanol as a main carbon source, and includes a Methylophilus bacterium.
  • Methylophilus bacteria such as Methylophilus methylotrophus.
  • Methylophilus methylotrophus include AS1 strain (NCIMB10515).
  • the Methylophilus' Methylotrophus AS1 strain (NCIMB10515) is a national collection of industrial and marine bacteria (National Collections of Industrial and Marine Bacteria, 1 king ⁇ TN 1MB Lts., Torry Research Station 135 Abbey Rodd, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom).
  • the type of DNA that encodes dihydrodipicolinate synthase desensitized to feedback inhibition by L-lysine (hereinafter also referred to as dapA * gene) is not particularly limited.
  • dihydrodipicolinate synthase derived from bacteria belonging to the genus Escherichia Preferred is a DNA encoding that has a mutation that eliminates feedback inhibition by L-lysine.
  • Examples of DNA encoding wild-type dihydrodipicolinate synthase derived from bacteria belonging to the genus Escherichia include DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41.
  • Examples of mutations that eliminate feedback inhibition by L-lysine include a mutation that replaces the histidine residue at position 118 with a tyrosine residue in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 41 (HI 18Y mutation). I can get lost. Accordingly, examples of the dapA * gene include DNA encoding an amino acid sequence in which the histidine residue at position 118 is substituted with a tyrosine residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41.
  • the dapA * gene has a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95%, particularly preferably 98% or more with respect to the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 41. Also, it may be DNA encoding a protein having the H118Y mutation and having dihydrodipicolinate synthase activity! /.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 41 has a sequence containing one or several amino acid substitutions, deletions, insertions or additions as long as it has an H118Y mutation and dihydrodipicolinate synthase activity is not impaired. It may be DNA encoding a protein.
  • “several” differs depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, but specifically 2 to 20, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5 Means individual.
  • the above amino acid substitutions are preferably conservative substitutions: substitution from ala to ser or thr, substitution from arg force to gln, his or lys, asn force from glu, gln, lys, his or Is replaced with asp, asp with asn, glu or gin, cys force with ser or ala, gin force with asn, glu, lys, his, asp or arg, gm force with gly, substitution to asn, gln, lys or asp, gly force to substitution to pro, his force etc.
  • amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions as described above occur naturally, such as based on individual differences or species differences of microorganisms that hold the dihydrodipicolinate synthase gene. Included after being caused by a mutation or variant.
  • the dapA * gene has a H118Y mutation, and as long as it encodes a protein having dihydrodipicolinate synthase activity, a string that is complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 40 or a probe that can be prepared from the sequence. It may be DNA that is to be iridized below.
  • the “stringent condition” refers to a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. Although it is difficult to numerically express this condition, for example, it is 60 ° C, 1 X SSC, 0.1%, which is the usual washing condition for Southern Hybridization. SDS, preferably 0.1 X SSC, 0.1% SDS
  • the conditions include washing at a salt concentration and temperature corresponding to 68 ° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more preferably 2 to 3 times.
  • the dapA * gene can be obtained by site-directed mutagenesis, or can be obtained from plasmid RSFD80 as described below.
  • the DNA encoding dihydrodipicolinate synthase desensitized to feedback inhibition by L-lysine used in the present invention may not necessarily be a DNA encoding a mutant dihydrodipicolinate synthase.
  • LysE24 gene (US2003-0124687 publication), lysE56 gene (US2004-0146974 publication), which encodes the variant LysE that promotes the extracellular release of L-lysine when introduced into methanol-utilizing bacteria. ), LysE24m5 (WO2006 / 059715) can be used.
  • “Promoting the export of L-lysine out of the cell” means that this DNA is introduced into a methanol-assimilating bacterium, and when the resulting methanol-assimilating bacterium is cultured, this DNA is not retained. This means that the amount of L-lysine excreted in the medium is increased compared to that of bacterial bacteria. The promotion of L-lysine excretion out of the cell results in the culture of methanol-utilizing bacteria that retain this DNA compared to methanol-utilizing bacteria that do not retain this DNA. Observed by increasing the concentration of L-lysine.
  • the type of DNA gene encoding the variant LysE that promotes the export of L-lysine out of the cell when introduced into a methanol-utilizing bacterium is not particularly limited.
  • it encodes the LysE protein from Brevibaterium spp. LysE24 gene (US2003-0124687), lysE56 gene (US2004), which has a mutation that promotes the export of L-lysine out of the cell when introduced into methanol-utilizing bacteria.
  • -01 46974 lysE24m5
  • WO2006 / 059715 can be used.
  • the lysE24 gene has a loop region and six hydrophobic helices, and encodes a variant of a protein (wild-type lysE protein: SEQ ID NO: 55) that is involved in the extracellular export of L-lysine DNA encoding a mutant lysE protein that does not have the loop region of wild-type protein, and when introduced into a methanol-utilizing bacterium, L-lysine or L-arginine or both of these L-amino acids It is DNA that promotes extracellular discharge.
  • Examples of the LysE24 gene include the LysE24 gene described in Japanese Patent Publication No. 2004-166594 (US Patent Application Publication No. 2005-003495).
  • DNA encoding the protein of SEQ ID NO: 51 can be mentioned.
  • it is 80% or more, preferably 90% or more based on the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 51. More preferably, it may be a protein having a homology of 95%, particularly preferably 98% or more.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 has a sequence containing one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, or additional calories, as long as the activity of promoting L lysine export to the outside of the cell is not impaired. It may be DNA encoding a protein.
  • the lysE24 gene encodes a protein having an activity that promotes the export of L-lysine to the outside of the cell
  • the lysE24 gene is complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 50 or a probe that can be prepared from the nucleotide sequence. It may be DNA that is noisy under mild conditions.
  • the lysE24 gene can be obtained from the plasmid pRSlysE24 described in Patent Publication No. 2004-166594 (US Patent Application Publication No. 2005-003495).
  • the E.coli JM109 strain transformed with pRSlysE 24 was named AJ13830, and this strain was deposited with the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on June 4, 2001, under the accession number FERM P-18369. It was transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on May 13, 2002, and deposited under the accession number of FERM BP-8040.
  • the lysE56 gene includes at least 56 amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 55. And a gene encoding a protein in which the glycine residue at the position is substituted with another amino acid residue (US2004-0146974). Further, as long as it promotes the export of L-lysine out of cells when introduced into methanol-assimilating bacteria, SEQ ID NO: 55 and 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more In particular, it may be a gene encoding a protein in which the glycine residue at position 56 is substituted with another amino acid residue in an amino acid sequence having 98% or more homology.
  • This gene has a base sequence modified so that a stop codon is present in all three types of reading frames in the lysE24 gene, and when introduced into a methanol-assimilating bacterium, the L lysine produced by the bacterium Alternatively, it is DNA that promotes the export of arginine or both of these L-amino acids to the outside of the cell.
  • DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 56 can be used (WO2006 / 059715) ).
  • Diaminopimelate dehydrogenase activity can be enhanced using a gene encoding diaminopimelate dehydrogenase (hereinafter also referred to as ddh gene).
  • ddh gene a gene encoding diaminopimelate dehydrogenase
  • the type of the ddh gene is not particularly limited, and examples thereof include DNA encoding diaminopimelate dehydrogenase (SEQ ID NO: 53) derived from coryneform bacteria.
  • the ddh gene has a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95%, particularly preferably 98% or more with respect to the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 53, and diaminopimelate dehydrogenase
  • the ddh gene may be a substitution, deletion or insertion of one or several amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53 as long as the diaminopimelate dehydrogenase activity is not impaired.
  • it may be a DNA encoding a protein having a sequence including an addition or the like.
  • the ddh gene is a protein having diaminopimelate dehydrogenase activity. As long as it is encoded, it may be a DNA that hybridizes under stringent conditions with a complementary strand of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 52 or a probe that can be prepared from the nucleotide sequence.
  • the ddh gene of coryneform bacterium was created based on the known ddh sequence of Corynebacterium glut amicum (Ishino, S. et al., Nucleic acid res., 15, 3917 (1987)) Chromosome of Brevibaterium ratatofarmentum or Corynebataterum dartamicam by PCR using the two oligonucleotide primers (for example, SEQ ID NOS: 11 and 12 described in WO / 9516 042) It can be obtained by amplifying the DNA as a cage.
  • Diaminopimelate decarboxylase activity can be enhanced using a diaminopimelate decarboxylase gene (hereinafter also referred to as lysA gene).
  • lysA gene a diaminopimelate decarboxylase gene
  • the type of lysA gene is not particularly limited, and examples thereof include DNA encoding diaminopimelate decarboxylase (SEQ ID NO: 49) derived from a bacterium belonging to the genus Methylophilus.
  • the lysA gene has a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95%, particularly preferably 98% or more with respect to the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, and diaminopimerin A DNA encoding a protein having acid decarboxylase activity.
  • the lysA gene is a protein having a sequence containing one or several amino acid substitutions, deletions, insertions or additions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, unless diaminopimelate decarboxylase activity is impaired. It may be DNA that encodes. Furthermore, as long as the lysA gene encodes a protein having diaminopimelate decarboxylase activity, the lysA gene may also be a DNA that hybridizes under stringent conditions with a complementary strand of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 48 or a probe that can be prepared for the nucleotide sequence. Good.
  • Methylophilus ⁇ The lysA gene of Methylotophus fascia is based on two types of genes created based on known sequences. Methylophilus' methylotrophus chromosomal DNA can be obtained as a saddle type by PCR using a rigonucleotide primer.
  • Dihydrodipicolinate reductase activity can be enhanced using a gene encoding dihydrodipicolinate reductase (hereinafter also referred to as dapB gene).
  • dapB gene a gene encoding dihydrodipicolinate reductase (hereinafter also referred to as dapB gene).
  • the type of dapB gene is not particularly limited, and examples thereof include DNA encoding dihydrodipicolinate reductase (SEQ ID NO: 43) derived from bacteria belonging to the genus Escherichia.
  • the dapB gene has a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95%, particularly preferably 98% or more with respect to the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 43, and dihydrodipicoline It may be DNA encoding a protein having acid reductase activity.
  • the dapB gene encodes a protein having a sequence containing one or several amino acid substitutions, deletions, insertions or additions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43, unless dihydrodipicolinate reductase activity is impaired.
  • the dapB gene encodes a protein having dihydrodipicolinate reductase activity
  • it may be a complementary strand of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 42 or a DNA that hybridizes under stringent conditions with a probe that can be prepared from the nucleotide sequence.
  • the dihydrodipicolinate reductase gene (dapB) can be amplified into E. coli chromosomal DNA as a cocoon by PCR using two oligonucleotide primers prepared based on a known nucleotide sequence.
  • the activity of aspartate semialdehyde dehydrogenase can be enhanced by using a gene encoding aspartate semialdehyde dehydrogenase (hereinafter also referred to as asd gene).
  • the type of asd gene is not particularly limited, and examples thereof include DNA encoding aspartate semialdehyde dehydrogenase (SEQ ID NO: 45) derived from Escherichia bacteria.
  • the asd gene has a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95%, particularly preferably 98% or more with respect to the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 45, and aspartic acid It may be DNA encoding a protein having semialdehyde dehydrogenase activity.
  • the asd gene encodes a protein having a sequence containing one or several amino acid substitutions, deletions, insertions or additions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 unless the aspartate semialdehyde dehydrogenase activity is impaired. Yes, it can be DNA.
  • the asd gene is allowed to hybridize under stringent conditions with a complementary strand of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 44 or a probe that can be prepared from the nucleotide sequence as long as it encodes a protein having aspartate semialdehyde dehydrogenase activity. It can be DNA.
  • the aspartate semialdehyde dehydrogenase gene (asd) can be amplified in E. coli chromosomal DNA as a saddle by PCR using two types of oligonucleotide primers prepared based on a known base sequence.
  • the methanol-assimilating bacterium of the present invention may further retain a DNA encoding aspartokinase which is desensitized to feedback inhibition by L-lysine.
  • DNA that encodes aspartokinase that has been desensitized to feedback inhibition by L-lysine.
  • the lysC * gene encodes aspartokinase derived from bacteria belonging to the genus Escherichia.
  • DNA having a mutation that eliminates feedback inhibition by L-lysine is preferred.
  • Examples of the DNA encoding wild-type aspartokinase derived from bacteria belonging to the genus Escherichia include DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47.
  • Examples of mutations that eliminate feedback inhibition by L-lysine include mutations that replace the threonine residue at position 352 with an isoleucine residue in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47 (T352I mutation).
  • the Therefore, examples of the lysC * gene include DNA encoding an amino acid sequence in which the threonine residue strength S-isoleucine residue at position 352 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47 is substituted.
  • the lysC * gene has a homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95%, particularly preferably 98% or more with respect to the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, and a T3 521 mutation And a DNA encoding a protein having aspartokinase activity.
  • the lysC * gene has a T352I mutation, and includes one or several amino acid substitutions, deletions, insertions or additions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47 as long as the aspartokinase activity is not impaired. It may be DNA encoding a protein having a sequence. Furthermore, the lysC * gene is stringent with a complementary strand of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 46 or a probe that can be prepared from the nucleotide sequence, as long as it has a T352I mutation and encodes a protein having asnorkinase activity. It may be DNA that hybridizes under conditions.
  • the lysC * gene can be obtained by site-directed mutagenesis, or can be obtained from plasmid RSFD80 as described below.
  • the DNA encoding aspartokinase desensitized to feedback inhibition by L-lysine used in the present invention may not necessarily be a DNA encoding mutant aspartokinase. That is, if the wild type protein is not subject to feedback inhibition by L-lysine, the wild type may be used.
  • intracellular activity of each enzyme is enhanced means a wild strain (for example, M. methylotrophus AS1 strain) or a parent strain (all intracellular enzymes of the enzyme specified in the present invention). It means that the enzyme activity in the cell is increased compared to a strain in which the activity of the wild-type or parent strain is higher than that of the strain in which the activity of the wild-type strain is not enhanced.
  • the ddhA gene which encodes the dapA * gene, lysE gene, and diaminodipicolinate dehydrogenase, does not have Methylophilus bacteria, but can detect intracellular enzyme activity, or the dapA * gene, mutation Type lysE gene, ddh gene increased by 1 copy or more If it is wide, it is included in the increase in intracellular enzyme activity.
  • the means for enhancing the intracellular activity is not limited to the following means and powers including combinations thereof.
  • the introduction means of the dapA * gene, mutant lysE gene, and ddh gene include, but are not limited to, the following means.
  • Confirmation that the enzyme activity has been enhanced can be confirmed by comparing the amount of m-RNA of a gene encoding each enzyme with a wild type or an unmodified strain.
  • Examples of methods for confirming the expression level include Northern hybridization and RT-PCR (Molecular cloning (old spring Harbor Laboratory Press, old spring Harbor (USA), 2001)).
  • the activity or expression level may be any as long as it is higher than that of the wild strain or non-modified strain.
  • the activity or expression level is 1.5 times or more, 2 times or more, 3 It is desirable that it rises to more than double, more preferably 5 times or more, and even more preferably 10 times or more.
  • dihydrodipicolinate synthase preferably has an increase in enzyme activity of 10 times or more, more preferably 15 times or more, and even more preferably 20 times or more.
  • Confirmation that the copy number has been amplified can be carried out by sazanno or hybridization using a probe complementary to the target gene.
  • the number of copies is preferably 3 or more, more preferably 5 or more, and even more preferably 10 or more.
  • the dapB gene, lysA gene, ddh gene, and asd gene are introduced in 2 copies or more, more preferably 3 copies or more.
  • the lysC * gene is introduced in 3 copies or more, more preferably 4 copies or more.
  • the dapA gene and the mutant lysE gene are introduced at least 10 copies, preferably at least 12 copies, more preferably at least 15 copies! /.
  • the methanol-assimilating bacterium of the present invention can be produced by the above-described modification (enhanced expression of each gene of mutant lysE, dapA *, lysA, ddh, dapB, asd, (lysC *)).
  • “L-lysine producing ability” means that when the methanol-assimilating bacterium of the present invention is cultured in a medium, a recoverable amount of L-lysine can be accumulated in the medium.
  • the methanol-assimilating bacterium of the present invention may be a bacterium that has been modified as described above in a mutant strain having a mutation such as an auxotrophic mutation, an analog resistance mutation, and a metabolic regulation mutation.
  • auxotrophic mutation after making the above-mentioned modification (gene amplification), auxotrophic mutation, analog resistance Introduce mutations such as sex mutations and metabolic control mutations.
  • these DNA fragments are ligated with a vector that functions in a bacterium belonging to the genus Methylophilus, preferably a multicopy-type vector, to produce a thread-reversed DNA. May be introduced into a Methylophilus bacterium host for transformation.
  • a vector that functions in a bacterium belonging to the genus Methylophilus preferably a multicopy-type vector
  • the intracellular activities of the enzymes encoded by the target genes of dihydrodipicolinate synthase and wasvaltokinase are enhanced.
  • dihydrodipicolinate synthase may be abbreviated as DDPS, aspartokinase as AK, and aspartokinase III as ⁇ .
  • the donor microorganism for the gene encoding DDPS and the gene encoding AK may be any microorganism as long as it retains DNA capable of expressing DDPS activity and AK activity in microorganisms belonging to the genus Methylophilus. But you can use it.
  • the microorganism may be a wild strain or a mutant derived therefrom. Specific examples include E. coli (Escherichia coli) K-12 strain and Methylophilus' methylotrophus AS1 strain (NCIMB10515).
  • E. coli Erscherichia coli K-12 strain
  • Methylophilus' methylotrophus AS1 strain NCIMB10515
  • DDPS and AK used in the present invention are not subject to feedback inhibition by L-lysine.
  • Wild-type DDPS from E. coli is known to be feedback-inhibited by L-lysine, and wild-type moth from E. coli is known to be inhibited by L-lysine and feedback-inhibited. Yes. Therefore, for introduction into Methylophilus bacteria It is preferable to introduce a mutation that eliminates feedback inhibition by L-lysine.
  • DDPS derived from Corynebacterium bacteria is not originally subject to feedback inhibition by L-lysine, so that the DDPS gene and AK gene used in the present invention are not necessarily mutants.
  • lysC * encoding AK are two types of oligos, which are made from a plasmid containing this and based on a known nucleotide sequence. It can be obtained by PCR using nucleotide primers.
  • RSFD80 A wide host range plasmid RSFD80 is known as a plasmid containing dapA * and lysC *! (WO95 / 16042).
  • the E. coli JM109 strain transformed with this plasmid was named AJ12396, and this strain was established on 28 October 1993 at the Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry (now National Institute of Advanced Industrial Science and Technology).
  • Deposited under the deposit number FERM P-13936 transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on November 1, 1994, and deposited under the deposit number FERM BP-4859.
  • RSFD80 can be obtained from AJ12396 strain by a known method.
  • the dapA * contained in RSFD80 has a sequence in which the C of base number 597 is changed to T in the base sequence of the wild-type dapA gene shown in SEQ ID NO: 40, and thus the encoded mutant type.
  • DDPS has a sequence in which the histidine residue at position 118 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 41 is substituted with a tyrosine residue.
  • lysC * contained in RSFD80 has a sequence in which C of base number 1638 is T-changed in the base sequence of wild-type lysC shown in SEQ ID NO: 46, so that the encoded mutant ⁇ is It has a sequence in which the threonine residue at position 352 is replaced with an isoleucine residue in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 47
  • plasmids used for gene cloning include pBR322, pTWV228, pMWll9, and pUC19, as long as they can replicate in microorganisms such as Escherichia bacteria.
  • the vector that functions in a Methylophilus bacterium is, for example, a plasmid that can autonomously replicate in a Methylophilus bacterium.
  • the broad host range vector RSF1010 and Derivatives such as pAYC32 (Chistorerdov, AY, Tsygankov, YD Plasmid, 1986
  • pBBRl and its derivatives such as pBHRl (Antoine, R. and Locht, C, Molecular Microbiology, 6, 1785-99. (1992)), which are broad host range vectors different from RSF1010, etc. Can be given.
  • the enhancement of DDPS activity and AK activity can also be achieved by making multiple copies of dapA * and lysC * on the chromosomal DNA of Methylophilus bacteria.
  • To introduce multiple copies of dapA * and lysC * onto the chromosomal DNA of Methylophilus bacteria homologous recombination is carried out using a sequence present on the chromosomal DNA as a target. Repetitive DNA and inverted repeats at the ends of transposable elements can be used as sequences that exist in multiple copies on chromosomal DNA.
  • dapA * and Z or lysC * can be mounted on a transposon and transferred to introduce multiple copies onto chromosomal DNA. Either method increases the number of copies of dapA * and lysC * in the transformed strain, resulting in increased DDPS activity and AK activity. Width.
  • min ⁇ Mu derived from Mu phage is preferably used as the transposon.
  • Amplification of DDPS activity and AK activity can be achieved by replacing expression control sequences such as promoters of dapA * and lysC * with strong ones in addition to the gene amplification described above (Japanese Patent Application Laid-Open (JP-A)). 1-215280).
  • expression control sequences such as promoters of dapA * and lysC *
  • strong ones in addition to the gene amplification described above
  • lac promoter, trp promoter, tr c promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter, amyE promoter, spac promoter, etc. are known as strong promoters.
  • Substitution with these promoters enhances the expression of dapA * and lysC *, thereby amplifying DDPS activity and AK activity.
  • Enhancing expression regulatory sequences can be combined with increasing the copy number of dapA * and lysC *! /.
  • the microorganism of the present invention when introduced into the DNA obtained by the above method and encoding dihydrodipicolinate synthase released from feedback inhibition by L-lysine, and a methanol-assimilating bacterium. Retains the DNA encoding the mutant LysE protein that promotes the export of L-lysine out of the cell, and contains intracellular diaminopimelate dehydrogenase, diaminopimelate decarboxylase, dihydrodipicolinate reductase, and aspartate semialdehyde dehydrogenase.
  • methanol-assimilating bacterium modified to enhance the activity may be used, but as a typical example, Methylophilus' methylotrophs AJ 110196 strain (FERM BP-10434) or AJ 110196-derived microorganism (derived) Stock).
  • the “derived strain” is a strain that has been bred with AJ110196 as the parent strain, and also DNA that encodes dihydrodipicolinate synthase that has been desensitized to feedback inhibition by L-lysine, and methanol assimilation.
  • the methanol-assimilating bacterium of the present invention may enhance other enzymes involved in L-lysine biosynthesis in addition to the enhanced expression of the above six or seven types of genes.
  • an enzyme Phosphoenol pyruvate carboxylase (JP-A-60-87788), aspartate aminotransferase (JP-B-6-102028), diaminopimelate epimerase gene and other enzymes of the diaminopimelate pathway (JP 2003-135066), or homo Examples thereof include enzymes of aminoadipic acid pathway such as aconitic acid hydratase gene.
  • Entner-Doudoroff pathway enzymes such as 6-phosphodalconate dehydratase activity or 2-keto-3-deoxy-1-phosphodarconate aldolase.
  • the methanol-assimilating bacterium of the present invention further decreases or lacks the activity of an enzyme that catalyzes a reaction that produces a compound other than L-lysine by branching the biosynthetic pathway of L-lysine.
  • an enzyme that catalyzes a reaction that produces a compound other than L-lysine by branching the biosynthetic pathway of L-lysine.
  • Enzymes that catalyze reactions that branch to produce compounds other than L-lysine include homoserine dehydrogenase and (see WO 95/23864) L-lysine decarboxylase (Japanese Patent Laid-Open No. 2004-254544) ). Modifications to reduce enzyme activity can be performed by techniques such as gene disruption using homologous recombination.
  • the methanol-assimilating bacterium of the present invention may be further modified to require L-methionine for growth.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2004-248669 In order to modify L-methionine so as to require L-methionine, the methanol-assimilating bacterium of the present invention is naturally mutated, so that it does not contain L-methionine by mutation treatment. However, it may be modified so that it cannot grow in the medium, and it can also be obtained by disrupting the metA gene (JP-A-2004-248669) or the metF gene (SEQ ID NO: 58).
  • L-lysine is produced by cultivating the Methylophilus bacterium having L-lysine-producing ability obtained as described above in a medium, producing and accumulating L-lysine in the culture, and collecting the culture strength L-lysine. can do.
  • the microorganism used in the present invention can be cultured by a method usually used for culturing a methanol-assimilating microorganism.
  • the medium used in the present invention is a medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic ion, and other organic trace components as necessary, any difference between a natural medium and a synthetic medium can be used.
  • methanol is used as the main carbon source
  • L-lysine can be produced at low cost.
  • methanol is used as the main carbon source, 0.001 to 30% is added to the medium.
  • As the nitrogen source ammonium sulfate or the like is added to the medium. In addition to these, a small amount of trace components such as potassium phosphate, sodium phosphate, magnesium sulfate, ferrous sulfate and manganese sulfate is usually added.
  • Cultivation is carried out under aerobic conditions such as shaking culture or aeration-agitation culture while maintaining the pH at 5 to 9 and the temperature at 20 to 45 ° C, and is usually completed in 24 to 120 hours.
  • Collection of L-lysine with culture strength can be usually carried out by a combination of an ion exchange resin method, a precipitation method, and other known methods.
  • Wako Pure Chemicals or those manufactured by Nacalai Testa Co., Ltd. were used as reagents.
  • the composition of the medium used in each example is as shown below.
  • the pH of each medium was adjusted with NaOH or HC1.
  • lysE24 gene DNA encoding mutant LysE protein
  • mutant dapA gene DNA encoding dihydrodipicolinate synthase released from feedback inhibition by L-lysine
  • PMIV5 is first digested with the known vector pMW119 (available for purchase from Toyobo Co., Ltd.) with restriction enzyme PvuII, and separated by agarose gel electrophoresis. To construct a pMWl plasmid. Next, mini-Mu-phage was transferred to the pM Wl plasmid in E. coli cells. Specifically, by introducing PMD4041 which is a known plasmid (Journal of Bacteriology 158, 488-495 (1984) into Escherichia coli K12 strain, pMD4041 is selected by selecting kanamycin resistant and ampicillin sensitive strains.
  • PMD4041 which is a known plasmid (Journal of Bacteriology 158, 488-495 (1984) into Escherichia coli K12 strain
  • pMD4041 is selected by selecting kanamycin resistant and ampicillin sensitive strains.
  • mini-Mu 4041 a factor that suppresses Mu translocation of mini-Mu4041, has a temperature-sensitive mutation.
  • the c-repressor of mini-Mu on the chromosome becomes inactive, and as a result, the transfer of mini-Mu4041 is greatly activated, resulting in efficient transfer of mini-Mu on the chromosome PMWl was transformed at 30 ° C into a strain in which mini-Mu4041 was lysogenized on this chromosome.
  • Plasmid number of cells lml at 30 ° C the strain carrying the treatment for 1 hour was also cultured in LB medium until the 2Xl0 8 for the at 42 ° C.
  • a plasmid DNA was prepared from the cell strength and transformed into an Esche richia coli strain. Transformation of kanamycin resistance and ampicillin resistance • Plasmids were prepared from each of the 50 strains, and the structure was examined by restriction enzyme treatment. As a result, one target plasmid was obtained. This plasmid was named pMul l.
  • This pMul l plasmid had mini-Mu4041 transferred to the par region on the pMWl plasmid! /. More specifically, PMW119 has a force composed of fragments of the known plasmids pBR322 and pSClOl, inserted at position 259 when this boundary position is zero. This plasmid was digested with the restriction enzyme Hindll I, separated by agarose gel electrophoresis, and a fragment of about 6.9 kbp was recovered and ligated with DNA Ligation Kit (Takara Bio) to construct pM12 plasmid (Fig. 1).
  • This pMl2 plasmid was digested with HindIII-AvaIII (EcoT22I), and this was used as a vector, to which was inserted a PCR-amplified terminator region of the E. coli thr operon.
  • EcoT22I HindIII-AvaIII
  • coli chromosomal DNA was used for PCR amplification, and primers were p-ter-thrL-f (SEQ ID NO: 1: 5-aaaaaagct taacacagaaaaaagcc-3) and p-ter-thrL-r (self-sequence number) 2: 5-aaactgcagtggtcgaaaaaaaaa gccc-3) was used, and PCR was performed under the conditions of denaturation 94 ° C-20 seconds, annealing 55 ° C-30 seconds, extension reaction 7 2 ° C-60 seconds in 25 cycles.
  • the resulting plasmid is digested with the restriction enzymes EcoR and Hindill, and this is used as a vector.
  • the PCR amplified multicloning site region and the PCR amplified pacteriophage fd-derived low-factor-independent transcription termination factor fragment. was inserted.
  • the pUC57 plasmid (available from Fermentus AB, LITHUANIA) is used for PCR amplification of the multicloning site region, and the primers are pUC57-MCS-f (SEQ ID NO: 3: 5-aaagaattcgagctcggtacctc-3) and Using pUC57-MC3 ⁇ 4-r (line number 4: 5-aaaaag cttgcatgcaggcctct-3), PCR conditions were denaturation 94 ° C-20 seconds, annealing 55 ° C-30 seconds, extension reaction 72 ° C-30 seconds. The cycle was performed in 25 cycles. This amplified fragment was designed in advance as a primer and digested with EcoRI-BamHI.
  • Pacteriophage fd ⁇ nom DNA was used for PCR amplification of the rho factor-independent transcription termination factor fragment derived from butteriophage fd, and the primer was ter- fd-f (SEQ ID NO: 5: 5- aaaggatccgcatgccgtt ga- ⁇ ) and ter— fd— r ( ⁇ Self-Series number b: 5— aaagaattccgatacaattaaaggctccttttggagccttttttttttt ggagattttcaacgtgaaaaaattattattattcgcaattccaagctaat-3) and PCR conditions were denatured94.
  • This amplified fragment was digested with EcoR and Hindlll designed in advance as primers. These three fragments were ligated with DNA Ligation kit (Takara Bio) to construct pMIV5 plasmid (Fig. 2). Furthermore, this plasmid was digested with EcoRV, and a kanamycin resistance gene fragment excised with Hindi from the commercially available plasmid pUC4K was inserted therein to construct pMIV5-Km plasmid.
  • the target gene was inserted into the plasmid pMIV5-Km for gene integration using mini-Mu constructed as described above, and the target DNA fragment was transferred onto the chromosome using this.
  • PMIV5-Km plasmid was digested with Smal and treated with dephosphorylation.
  • the lysE24 + dapA * fragment has a known plasmid pRSlysEdapA (see JP-A-2003-61687) containing the same gene as a cocoon-shaped pRS-ls (SEQ ID NO: 8: 5-cacagagacatattgcccgttg-3) ⁇ C row 3 ⁇ 4 ⁇ No.
  • Pfima ' ⁇ was obtained by PCR amplification.
  • PCR conditions were denaturation 94 ° C-20 seconds, annealing 55 ° C-30 seconds, extension reaction 72 ° C-120 seconds in 25 cycles.
  • the PCR amplified fragment was ligated with both TaKaRa BKL kit (Takarabio) to construct pMIV-Km-lysE24dapA plasmid.
  • a known plasmid pUC1918 (Gene, (1993) 134, 89-91) was digested with the restriction enzyme EcoRI and blunt-ended. Using this as a vector, blunt-ended DNA fragment encoding mute ranposose obtained by digesting known plasmid pMu4041 (Journal of Bacteriology, (1984), 158, 488-495) with Seal-Eco47III Concatenated with things. This plasmid was named pUC-MH7.
  • This pUC-MH7 plasmid was digested with BamHI, and the excised DNA transposase-encoding DNA fragment was inserted into the BamHI site of a known plasmid pAYC32 (Journal of General Microbiology 137, 169-178 (1991)), and pAET7 A plasmid was obtained.
  • pAET7 was introduced into the M. methylotrophus AS strain by the electro-poration method and applied to a SEII plate containing 50 mg / 1 streptomycin.
  • the pMIV-Km-lysE24dapA plasmid was introduced into the resulting transformant by the electroporation method to form a cohesion on a SEII plate containing 20 mg / 1 kanamycin and 50 mg / L streptomycin. Acquired stock.
  • the kanamycin resistance gene has been inserted inside the mini-Mu cassette, and the pMIV-KmlysE24dapA plasmid cannot be replicated in M. methylotrophus.
  • VAE # 8 ⁇ Acquisition of lysE24 and mutant dapA gene with higher high-copy integration
  • VAE # 1 is considered to be a strain with 1 or 2 copies of the mini-Mu cassette inserted on the chromosome. It was. Therefore, in order to further improve L-lysine productivity, the min-to-mu cassette was amplified on the chromosome.
  • the pAET7 plasmid carrying the Mu transposase contains a gene encoding a MuC protein that suppresses Mu transposase activity. This MuC protein has a temperature-sensitive property, so it is cultivated at 42 ° C.
  • the activity of Mu transposase can be promoted, and as a result, amplification of the min-to-Mu cassette on the chromosome can be performed.
  • VAE # 1 strain was suspended in SEII liquid medium to an appropriate concentration, and this was incubated at 42 ° C for 1 hour, and then the appropriately diluted bacterial solution was mixed with 50 mg / L streptomycin and It was applied to a SEII plate containing 20 mg / L kanamycin to form a single colony.
  • Randomly 200 single colonies Spread on a SEII plate containing 50 mg / L streptomycin and 20 mg / L kanamycin, and incubate at 37 ° C for 1 mm, and then scrape 50 mg / L of cells on the surface of the medium at about 0.3 square centimeters.
  • the cells were inoculated into S (production medium (5 ml) containing L streptomycin and 20 mg / L kanamycin, and cultured with shaking at 37 ° C for 34 hours.
  • VAE # 8 (# 403)> Next, L-methionine requirement was given to VAE # 8. Giving amino acid-requiring requirements to amino acid-producing bacteria is an effective means for controlling the amount of bacterial cells produced during culture.
  • VAE # 8 strain is treated with NTG by a known method (WO 00/61723), and this is appropriately diluted to the density of bacteria that form a single mouth, and contains 0.5 g / L of L-methionine Applied to SEII agar medium. This was replicated (replicated) on SEII agar medium not containing L-methionine, and a strain that could not grow on this plate, that is, an L-methionine-requiring strain was obtained. This strain was named # 403.
  • This artificially disrupted metF strain showed the same properties as # 403, an L-methionine-requiring strain obtained by the above-mentioned NTG mutation treatment.
  • Destructive DNA fragments used for gene disruption are shown in known literature (Ho, SN, Hunt, HD, Horton, RM, Pullen, JK and Pease, LR, Gene, 77, 51-9. (1989)). It was prepared using the overlap-PCR method.
  • this # 403 strain and VAE # 8 strain as a control were cultured in SEII production medium containing 0.075 g / L L-methione and 2.5 g / L sodium pyruvate, Lys accumulation was improved.
  • Table 2 shows the relative value of Lys accumulation for # 403 strains when VAE # 8 strain is 100.
  • PCR primers are pGm-5-cgccagccaggacagaaatgc-3: SEQ ID NO: 10) and pGmr- (5-gtccagcggtttttcttgggct) -3: Using SEQ ID NO: 11), PCR was performed under the conditions of denaturation 94 ° C-20 seconds, annealing 55 ° C-30 seconds, extension reaction 72 ° C-60 seconds in 25 cycles.
  • This plasmid was named pMIV-FRTGmFRT.
  • a mini-Mu cassette was constructed to amplify the gene of interest on the chromosome of M. methylotrophus by inserting the gene of interest into the region between this plasmid and attL and attR (Fig.
  • the pMIV-FRTGmFRT plasmid was digested with the restriction enzyme Smal, and this was dephosphorylated.
  • the lysE24 + dapA * fragment was obtained by PCR amplification using a known plasmid pR SlysEdapA (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-61687) containing the same gene as a cage and pRS-Is and dapA-r as primers.
  • PCR conditions were denaturation 94 ° C-20 seconds, annealing 55 ° C-30 seconds, and extension reaction 72 ° C-120 seconds in 25 cycles.
  • the PCR amplified fragment was phosphorylated with TaKa Ra BKL kit (Takara Bio) and ligated with a vector to construct a pMIV-FRT GmFRT-EA plasmid.
  • the pKD4 and pCP20 plasmids are registered as CGSCstrain # 7632 and # 7629 at the E. coli Genetic Stock Center, respectively, and are available.
  • pAET7 was introduced into # 403 strain by the Elect Mouth Position Method, and a 50 mg / l strain was introduced. It was applied to a SEII plate containing putomycin.
  • the pMET-FRTGmFRT-EA plasmid is introduced into the obtained pAET7 transformant by the electroporation method to form colonies on SEII plates containing 20 mg / l gentamicin and 50 mg / L streptomycin. Acquired shares. Since the gentamicin resistance gene is inserted inside the mini-Mu cassette, and the pMIV-FRTGmFRT-EA plasmid cannot replicate in M.
  • this gentamicin resistant strain is This is a strain with a mini-Mu cassette inserted. Therefore, 200 strains were randomly selected from these strains, spread on a SEII plate containing 50 mg / L streptomycin and 20 mg / L gentamicin, cultured at 37 ° C for 1 mm, and then cultured on the medium surface. 0.3 square centimeters of cells were inoculated to SEII production medium (5 ml) containing 50 mg / L streptomycin and 20 mg / L gentamicin, and cultured with shaking at 37 ° C for 48 hours.
  • the base sequence is determined using a sequencing primer (attR-rl 5-catctgtttcatttgaagcgcgaaagcta-3: distribution U number 12) that is designed outwardly at the inside of attR present at the right end of min ⁇ Mu cassette.
  • a sequencing primer attR-rl 5-catctgtttcatttgaagcgcgaaagcta-3: distribution U number 12
  • Example 9 [0069] ⁇ Removal of drug metabolite marker from # 403-l l-Gm (pFLP31), acquisition of # 403-11 stock> Construction of PAYCTER3>
  • SEQ ID NO: 15 (5'- ctatgatcat ttgcctggcg gcagtagcgc-3 ') and U 6 on the sequence U number (0—cttagatctcaaaaagagtttgtagaaacgc—3) were synthesized in accordance with conventional methods (Saito and Miura's method). [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)]) A region encoding the rrnB terminator sequence was amplified from the chromosomal DNA of Escherichia coli K-12 strain prepared by PCR.
  • the restriction enzyme Bglll recognition sequence is designed as a primer
  • the restriction enzyme Bell recognition sequence is designed as a primer of SEQ ID NO: 14.
  • Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) is used for the PCR reaction. Following the protocol recommended by the manufacturer, this PCR fragment was digested with restriction enzymes Bglll and Bell, and then this PCR fragment was ligated with the previous polylinker to produce a DNA fragment of about 400 bp. Is DNA Ligation Kit Ver.2. 1 (manufactured by Takara Bio Inc.), and the reaction conditions followed the protocol recommended by the manufacturer, and then the restriction enzyme of pAYC32 (J. Gen.
  • the gentamicin resistance gene of the # 403-1 lGm strain constructed in Example 7 is designed in such a way that it is sandwiched between two FRT sequences, this can be achieved by using FLP recombinase. It is also possible to remove chromosomal forces from drug resistance genes.
  • the PAPCTER3 constructed by the above method was digested with BamHI-Smal, and FLP recombinase was obtained from a known plasmid pCP 20 (PROCEEDINGS OFTHE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNIT ED STATES OF AMERICA, (2000) 97, 6640-6645).
  • the pCP20 plasmid is registered as CGSC strain # 7629 at the E. coli Genetic Stock Center and is available.
  • pAET7 was removed by a method well known to those skilled in the art, and a strain sensitive to streptomycin was obtained.
  • the pFLP31 plasmid was introduced into this strain by the electoporation method and applied to a SEII agar medium containing 50 mg / L streptomycin and 0.5 g / L L-methionine.
  • the obtained strain is suspended in SEII medium containing 50 mg / L streptomycin and 0.5 g / L L-methionine to an appropriate concentration, treated at 42 ° C for 1 hour, After diluting to form colonies, it was applied to SEII agar medium containing 50 mg / L streptomycin and 0.5 g / L L-methionine.
  • a strain exhibiting gentamicin sensitivity was selected from the obtained colonies.
  • Sarako the strain that became peptidic sensitive by removing pAET7 from this strain was named # 403-11.
  • This # 403-11 strain and # 403 strain as a control were cultured in SEII production medium containing 20mg / L kanamycin, 0.075g / L L-methionine and 2.5g / L sodium pyruvate. Lys accumulation has improved. Table 3 shows the relative value of Lys accumulation for # 403—11 strains, where Lys accumulation for # 403 strain is 100.
  • the # 403-11 strain thus obtained has 8 copies of the lysE24dapA cassette transferred on the chromosome.
  • an increase in the activity of dihydrodipicolinate synthase encoded by dapA was confirmed in # 403-11 strain.
  • the activity of dihydrodipicolinate synthase was measured using a known method (Journal of Biological Chemistry, 240, 4710-4716 (1965) with some modifications. Specifically, the reaction solution contained 50 mM imidazole-HCl. (pH 7.4), 2 mM L-aspartate- ⁇ -semialdehyde, 2 mM sodium pyruvate and a cell extraction system were prepared, and the final solution volume was 1 ml.
  • the dapA * and LysE24 genes were obtained from a known plasmid pRSlysEdapA (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-61687) containing the same genes.
  • the E.coli JM109 strain transformed with the pRSlysEdapA plasmid was named AJ13832, and this strain was assigned to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary on June 4, 2001. Deposited as 18371, transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on May 13, 2002, and deposited under the accession number FERM B P-8042.
  • pRSlysEdapA is added to the restriction enzyme EcoRI And digested with Bglll, and the phenol 'Kuroguchi form solution was added and mixed to stop the reaction. After centrifuging the reaction solution, the upper layer was collected, and DNA was collected by ethanol precipitation. Then, the target DNA fragment was separated by 0.8% agarose gel electrophoresis, and the DNA fragment of about 2.0 Kbp was extracted into EASY TRAP ver.2 ( The DNA was recovered using a DNA recovery kit (Takara Shuzo). The obtained DNA fragment was blunt-ended with BKL kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) and phosphorylated.
  • the pBHRI digest prepared as described above, and dapA * and LysE24 gene region fragment were ligated using DN A Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo).
  • Escherichia coli E. coli JM109 competent cells, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • was transformed with this ligation solution applied to an LB agar medium containing 20 mg / L kanamycin, and incubated at 37 ° C. Colonies that appeared on the agar medium were inoculated into an LB liquid medium containing 20 mg / L kanamycin, and cultured with shaking at 37 ° C for 8 hours.
  • Plasmid DNA is extracted from each culture solution using the alkaline-SDS method, the structure is confirmed by digestion with restriction enzymes and determination of the nucleotide sequence, the transcription direction of the chloramphenicol resistance gene, dapA * and lysE24. The gene with the same transcription direction was designated as pBHR-EA.
  • Plasmid pBGEA in which a gentamicin drug resistance marker was introduced into pBHR-EA obtained as described above was constructed.
  • pBHR-EA was digested with the restriction enzyme Ncol, and a phenol / chloroform solution was added and mixed to stop the reaction. After centrifuging the reaction solution, the upper layer was collected and DNA was collected by ethanol precipitation. The collected DNA fragment was blunt-ended with DNA Blunting kit (Takara Shuzo).
  • the gentamicin resistance gene region is a plasmid pGm-f (SEQ ID NO: 17: 5) using a known plasmid pML122 (Monika Labes, Alfred Puhler, and Reinhard Simon, Gene, 89, (1990), 37-46) as a cocoon-type DNA.
  • -CGCCAGCCA GGACAGAAATGC-3) and pGm-r SEQ ID NO: 18: 5-GTCCAGCGGTTTTTCTTG GGCT-3) using PCR (denaturation 94 ° C-10 seconds, annealing 60 ° C-30 seconds, extension reaction 72 ° C-9 0 seconds).
  • Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo) was used for the PCR reaction.
  • the resulting gentamicin-resistant gene fragment was smoothed and phosphorylated at the ends with BKL kit (Takara Shuzo).
  • the pBHR-EA digest prepared as described above and the gentamicin resistance gene region fragment were ligated using DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo).
  • E. coli JM109 competent cells manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • Colonies that appeared on the agar medium were inoculated into an LB liquid medium containing 20 mg / L gentamicin and cultured with shaking at 37 ° C for 8 hours.
  • Plasmid DNA was extracted from each culture solution by the alkali-SDS method, the structure was confirmed by digestion with restriction enzymes and determination of the base sequence, and pBGEA was obtained.
  • This pBGEA was further introduced into the # 403-11 strain, which is a strain in which the genes of lysE24 and dapA * were integrated on the chromosome prepared in Example 9, to reinforce the lysE24 and dapA * genes. This strain was designated as # 403-11 / pBGEA strain.
  • This # 403-11 / pBGEA strain and the control # 403-11 strain contain 20 mg / L kanamycin, 50 mg / L gentamicin (the control strain medium does not contain gentamicin), and 0.075 g / L L- When cultured in SEII production medium containing methionine and 2.5 g / L sodium pyruvate, Lys accumulation was improved.
  • Table 5 shows the relative value of Lys accumulation of # 403—1 ⁇ / pBGEA strain with the value of Lys accumulation of # 403—11 strain as 100. The Lys production of # 403-11 strain was improved by introducing the plasmid.
  • Methylophilus methylotrophus diaminopimelate decarboxylase gene was obtained by PCR using two oligonucleotide primers based on a known sequence (SEQ ID NO: 13 of International Publication WO / 2000061723). Each of the chromosomal DNAs was obtained as a cage.
  • Primer is plysA-f (SEQ ID NO: 19: 5 -AAAC CCGGGGATCCTGAGCGCCAATACCCTCAAACGCCT-3 ') and plysA- r (sequence
  • PCR was performed under 25 cycles of denaturation 94 ° C-20 seconds, annealing 55 ° C-30 seconds, and extension reaction 72 ° C-60 seconds.
  • the amplified M. methylotrophus lysA gene fragment was digested with Sse8387I_XbaI designed in advance using primers, and this was ligated with a known plasmid pRStac (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-61687) digested with Sse8387I-XbaI. .
  • This plasmid was named pRSlysA.
  • Brevibaterum Ratatofamentum diaminopimelate dehydrogenase gene (ddh) was replaced with the known nucleotide sequence of dyne of Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. et al., Nucleic acid res., 15, 3917 (1987)) was obtained by amplifying the chromosomal DNA of Brevibaterium ratatofa armament 2256 strain (ATCC13869 strain) as a saddle by PCR using two kinds of oligonucleotide primers. It was.
  • Primers were pddh-f (SEQ ID NO: 21: 5'-ACCCCTGCAGGGCCACCACAATT TTGGAGGATTACAAGAAC-3 ') and pddh-r (SEQ ID NO: 22: 5'-TCCTCTAGACT CGAGCTAAATTAGACGTCGCGT-3,), and PCR conditions were denatured 94 ° C-20 Second, end ring 55 ° C-30 seconds, extension reaction 72 ° C-60 seconds, 25 cycles.
  • the amplified ddh gene fragment was deleted into Sse8387I_XbaI designed in advance using primers, and this was ligated with a digested known plasmid pRStac (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-61687) with Sse8387I-XbaI. This plasmid was named pRSddh.
  • E.coli chromosomal DNA was amplified in a saddle shape by PCR using two oligonucleotide primers prepared from the E.coli dihydrodipicolinate reductase gene (dapB) based on a known base sequence.
  • Primers were pdapB-f (SEQ ID NO: 23: 5'- GCGCCTGCAGGCG CTGGTTACTCTGAAAACGGTCT-3 ') and pdapB-r (SEQ ID NO: 24: 5'-GCATCT conditions were denaturing 94 ° C-20 seconds, annealing 55 ° C-30 seconds, Extension reaction 72 ° C-60 seconds cycle was performed in 25.
  • the amplified dapB gene fragment was designed using primers.
  • E. coli chromosomal DNA was amplified as a saddle by PCR using two types of oligonucleotide primers prepared based on the known base sequence of the aspartate semialdehyde dehydrogenase gene (asd) of E. coli.
  • the primer was & 3 (1 (SEQ ID NO: 25: 5'-GCCCCT GCAGGCCGGCACATTTATACAGCACACATCTTTG-3,) and pasd-r (SEQ ID NO: 26: 5'—TAATCTAGAAAGATTACGCCAGTTGACGAAGCATC-3,), and the condition of PCR was 94 ° C -20 seconds, annealing 55 ° C-30 seconds, extension reaction 72 ° C-60 seconds, 25 cycles.
  • the amplified ddh gene fragment was designed by using the primers together with Sse8387I -Digested into Xbal and ligated with a known plasmid pRStac (JP 2003-6168 7) digested with Sse8387I-XbaI This plasmid was named pRSasd.
  • the methylophyllus / Methylotophasus asphalt kinase gene ( as k) is a PCR method using two oligonucleotide primers prepared based on a known sequence (SEQ ID NO: 5 of International Publication WO / 2000061723).
  • SEQ ID NO: 5 of International Publication WO / 2000061723 a known sequence
  • Methylophilus' methylotrophus chromosomal DNA was obtained as a saddle type.
  • Primer is & 31 ⁇ -1 > (SEQ ID NO: 27: 5'-AGGGAATTCTAAACCGG ATATGGCGATGGCAGGTGGTACT -3 ') and & 31 ⁇ (SEQ ID NO: 28: 5'- TAACT GCAGGAAGTTTTAATAGTACCAACACAGCGCATG -3,), PCR conditions are denatured 94 ° A cycle of C-20 seconds, annealing 55 ° C-30 seconds, and extension reaction 72 ° C-90 seconds was performed in 25 cycles. The amplified M.
  • methylotrophus ask gene fragment was designed in advance with primers, digested to EcoRI-Pstl, and then blunt-ended, and this was transformed into a known plasmid pRStac (JP 2003-61687) to Sse8387I. After digestion, it was ligated with the blunt end. This plasmid was named pRSask.
  • Strains were prepared by introducing the five types of plasmids prepared as described above into the # 403-11 / pBGE A strain prepared in Example 11, respectively, and 0.075 g / L L-methionine and 2.5 g / L pyrvin were prepared. The ability to grow in SEII production medium containing sodium acid. The top was not seen. Lys productivity declined in strains that introduced ddh.
  • diaminopimelate dehydrogenase This is the ddh-encoded diaminopimelate dehydrogenase, which is an enzyme that reversibly catalyzes the reaction in both the production and degradation directions of diaminopimelate, and strengthening with ddh alone promotes the degradation of diaminopimelate rather than the formation of diaminopimelate. It was thought that it was because of.
  • diaminopimelate decarboxylase following this diaminopimelate dehydrogenase is a decarboxylation reaction and is an irreversible enzyme that proceeds only in the direction of L-lysine production.
  • diaminopimelate dehydrogenase and diaminopimelate decarboxylase simultaneously prevented the decomposition of diaminopimelate by diaminopimelate dehydrogenase, and conversely promoted the synthesis of diaminopimelate.
  • the pRSddh plasmid digested with Sapl, blunt-ended and dephosphorylated was used as a vector, and the lysA gene region DNA fragment containing the tac promoter region amplified by PCR was inserted into this vector.
  • PRSlysA plasmid is used for PCR amplification, and primers are pta c- f (SEQ ID NO: 29: 5'-AAAGATCTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGA C-3,) and plysA-r (SEQ ID NO: 20: 5'- TTTCCCGGGCTTGGCGGCTTCGGTTTT TTTATTAGGGGTTGCC-3 ') PCR was performed under the conditions of denaturation 94 ° C-20 seconds, annealing 55 ° C_30 seconds, extension reaction 72 ° C-60 seconds in 25 cycles. This PCR amplified fragment was digested with Xbal and blunt-ended, and then ligated with the vector.
  • the obtained plasmid had the same transcriptional direction for the ddh and lysA genes, and this plasmid was named pDA.
  • Table 6 shows the relative value of Lys accumulation in # 403–11 / pBGEA / pDA strain when the Lys accumulation in # 403–11 / pBGEA strain is 100.
  • L-lysine productivity was enhanced by combining and enhancing the enzyme genes ddh and lysA that catalyze two consecutive reactions in the biosynthetic pathway.
  • ddh + lysA As a result of investigating combination enhancement by adding various enzyme genes to ddh + lysA, we found that combining dapB and asd with ddh and lysA improves L-lysine accumulation.
  • the pRSdapB plasmid was digested with EcoRI, blunt-ended and dephosphorylated, and used as a vector.
  • the pDA plasmid was digested with Hpal-Sapl, and a 2.5 kbp DNA fragment containing lysA and ddh containing the tac promoter was excised upstream of each gene and ligated with the blunt-ended DNA fragment. It was constructed. This plasmid was inserted upstream of dapB so that the ddh and lysA genes were in the same orientation as dapB.
  • this pBDA plasmid was digested with Sapl, blunt-ended and dephosphorylated, and the asd gene region DNA fragment containing the PCR amplified tac promoter region was inserted into the vector.
  • PRSasd plasmid is used for PCR amplification, primers are ptac-f and pasd-r, PCR conditions are denaturation 94 ° C-20 seconds, annealing 55 ° C-30 seconds, extension Reaction The cycle of 72 ° C-90 seconds was performed in 25 cycles.
  • This PCR-amplified fragment was blunt-end treated and phosphate-treated, and ligated with the above vector.
  • the plasmid thus obtained was named pB DAS.
  • the target gene was first cloned onto the PMW119 vector, We solved this problem by cutting it together.
  • the pMW119 vector was digested with Xbal, and a DNA fragment containing Ptac + dapB excised from pRSdapB with Xbal was ligated thereto.
  • this plasmid was digested with BamHI, blunt-ended and dephosphorylated, and the vector was used.
  • DNA containing Ptac + ddh + Ptac + lysA obtained by excising the pDA plasmid with Hapl-Sapl The fragments were ligated.
  • This plasmid was digested with Smal and dephosphorylated, and a DNA fragment containing Ptac + asd prepared in the same manner as in Example 14 was ligated.
  • the plasmid constructed in this way is called pMWBDAS. Named. On this plasmid, ddh, lysA, and asd are in the same direction and only dapB is in the reverse direction. The order of gene loading is from the direction of the lac promoter on pMWl 19, followed by dapB, ddh, lysA, asd.
  • a strain in which this pCBDAS plasmid was introduced into the # 403–11 / pBGEA strain contains 20mg / L kanamycin, 50mg / L gentamicin and 50mg / L streptomycin (control)
  • the strain medium does not contain streptomycin), 0.075 g / L L-methyoyun and 2.5 g / L sodium pyruvate, and ammonium sulfate so that the final concentration of ammonium sulfate is 6 g / L.
  • Lys accumulation was improved when cultured in SEII production medium supplemented with hum.
  • the relative value of Lys accumulation of # 403-11 / pBGEA / pBDAS strain is shown in Table 8 with the value of Lys accumulation of # 403403 / pBGEA strain as 100.
  • a method for obtaining a strain that does not contain a drug resistance gene marker completely in a cell and incorporates a Lys biosynthesis gene on a chromosome is shown.
  • the pMIV-FRTKmFRT shown in Example 6 was deleted with Smal, and the PCR-amplified lysE + dapA * fragment was inserted here.
  • the lyS E24 + dapA * fragment was obtained by the method shown in Example 6.
  • the resulting plasmid was named pMIV_FRT KmFRT-EA. This is different from pMIV-FRTGmFRT-EA shown in Example 6 in chemical resistance. Sex genes are different.
  • Example 1 the pAET7 plasmid described in Example 1 was introduced into AS 1 (NCIMB 10515), which is a wild strain of M. methylotrophus, and transformants were selected on SEII agar medium containing 50 mg / L of streptomycin.
  • AS 1 NCIMB 10515
  • transformants were selected on SEII agar medium containing 50 mg / L of streptomycin.
  • Introducing pMIV-FRTKmFRT- EA plasmid by the method shown in this strain in Example 2 by elect port Poreshiyon method, on chromosome l ys E24 + dapA * gene including mini- Mu cassette (EA unit) is The transferred strain was selected on SEII agar medium containing 50 mg / L streptomycin and 20 mg / L kanamycin.
  • the transfer position of the mini-Mu force set on the V12 strain chromosome was determined by the same method as that shown in Example 4. Based on this information, it is possible to construct a strain identical to the V12 strain.
  • V12Sa This V12S a Is named AJ110196, and the same stock was deposited on October 12, 2005, at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (1st, 1st, 1st, 1st, 1st, 1st, Tsukuba, Ibaraki, 305-5466, Japan) As an international deposit under the Budapest Treaty, it has been deposited under the deposit number of FERM BP-10434.
  • Example 15 in addition to strengthening lysE24 + dapA *, strengthening various Lys biosynthetic genes has been shown to greatly improve Lys productivity. Plasmid construction for gene integration was performed. First, pMIV-FRTKmFR T was digested with EcoRI, blunt-ended and dephosphorylated, and PCR-amplified lysE24 + d apA * fragment was inserted therein to construct pMIV-FRTKmFRT-EA # 1. This plasmid was extinguished with Smal and treated with dephosphorylation, and a PCR amplified Ptac + dapB fragment was inserted.
  • the pRSdapB plasmid is used for PCR amplification, the primers are ptac-13 ⁇ 4 and pdapB-r, and the PCR conditions are denaturation 94 ° C-20 seconds, annealing 55 ° C-30 seconds, extension reaction 72 ° C- A 90 second cycle was performed in 25 cycles.
  • This PCR-amplified fragment was subjected to blunt end treatment and phosphate treatment, and ligated with the above vector to obtain pMIV-FRTKmFRT-EAB # 1. At this time, the transcription directions of dapA and dapB genes were the same.
  • this plasmid was digested with Hindill, blunted, dephosphorylated, and ligated with the DNA fragment containing lysA and ddh excised by the method described in Example 14, and pMIV- Obtained FRTKmFRT-EABDA # 12. The direction of transcription of ddh gene was opposite to that of dapA and dapB.
  • This plasmid was digested with Sail, blunted and dephosphorylated, and an as d gene region DNA fragment containing the tac promoter region prepared by the method described in Example 14 was inserted therein.
  • plasmid in which asd fragment strength was inserted was obtained, and pMIV-FRTKmFRT-EABDAS # 10 was constructed from this plasmid. Both asd genes were opposite to dapA and dapB.
  • the final arrangement of genes on pMIV-FRTKmFRT-EABDAS # 10 was lysE, dapA, dapB, asd, asd, lysA, ddh.
  • plasmids used for transferring six types of gene cassettes on the chromosome were constructed.
  • Example 18 [0094] ⁇ Construction of lysE24 + dapA * + lysA + ddh + dapB + asd + lysC amplification strain (Vmac3 strain, Vmac3S strain) and evaluation of L-lysine productivity>
  • PAET7 was introduced into V12Sa obtained in Example 16, pMIV-FRTKmFRT-EAB DAS # 10 plasmid was introduced into this, and lys E, dapA was added onto the chromosome of V12S ⁇ strain in the same manner as in Example 16. , dapB, asd, lysA and ddh genes were obtained.
  • the randomly selected 200 strains were cultured in a SEII production medium containing 50 mg / L streptomycin and 20 mg / L kanamycin, and the strain with the highest L-lysine accumulation was selected. I named it Vmacl. By selecting a streptomycin sensitive strain from this Vmacl strain, a strain from which pAET7 was eliminated was obtained.
  • the pFLP31 plasmid shown in Example 9 was introduced into this strain, and the kanamycin resistance gene region was removed from the mini-Mu cassette on the chromosome in the same manner as described in Example 9.
  • the kanamycin sensitive strain obtained by this manipulation was named VmaclS strain.
  • a streptomycin sensitive strain from this VmaclS strain a strain from which the pFLP31 plasmid has been removed was obtained, and the pAET7 plasmid was introduced again into this strain, and the pMIV-FRTK mFRT-EABDAS # 10 plasmid was introduced again into this strain.
  • the strain with the highest accumulation was selected and named V mac2 strain.
  • Vmac2S strain, Vmac3 strain, and Vmac3S strain were obtained. Table 10 shows the relative value of Lys accumulation in the Vmac3 S strain when the Lys accumulation in the V12 strain is 100.
  • Vmac3S PAET7 is introduced into the strain, the pMIV-FRTKmFRT-EA plasmid is introduced into it, and selection is performed on the SEII agar medium containing 50 mg / L streptomycin and 20 mg / L kanamycin. A strain incorporating lysE24 + dapA * was obtained.
  • Randomly extracted 200 strains were cultured in SEII production medium containing 50 mg / L streptomycin and 20 mg / L kanamycin, and the strain with the highest accumulation of L-lysine was selected. Named. The transfer was repeated three times in exactly the same manner as shown in Example 3, and the strain with the highest L-lysine accumulation was named V3E2. The drug resistance marker was removed from this strain by the method described above, and the strain that became kanamycin sensitive was named V3E2S. Next, LAE-methionine requirement was applied to VAE # 8 strain, which was effective in improving L-lysine accumulation.
  • PCR-amplified DNA fragments designed to have regions that overlap each other in PCR are mixed, and PCR is performed in a bowl shape again to reconstitute the target gene.
  • a DNA fragment for gene disruption was prepared in which the kanamycin resistance gene was inserted almost at the center.
  • Fragment 1 N-terminal fragment
  • Fragment 1 is chromosomal DNA of M. methylotrophu sASl strain
  • PCR primers are metF-ihl (SEQ ID NO: 30: 5'-TGG ACTGACGGTGGCTACTC-3 ') and metF-rn (SEQ ID NO: 32).
  • PCR primers are metF-rcl (SEQ ID NO: 33: 5'-TCC CAAATACGGGCTACTG-3 ') and metF-fc (SEQ ID NO: 35: 5'- GAGAATAGGAAC
  • Fragment 3 (Km resistance gene fragment) is a pKD4 plasmid in a saddle shape, and the PCR primer is pKD-Kmf (SEQ ID NO: 36: 5'-GCATTACACGTCTTGAGCGATTGT GTAGGC-3,) and pKD-KmGmr (SEQ ID NO: 37: 5'-CCTCCTTAGTTCCTATTCC GAAGTTCCTATTCTC-3 ') was used.
  • PCR conditions were denaturation 94 ° C-30 seconds, annealing 60 ° C-30 seconds, and extension reaction 72 ° C-30 seconds in 25 cycles. Fragments 1 and 2 were separated on a 1% low melting point agarose gel and Promega Wizard PCR Preps DNA purific Purification with ation sysytem. Measure the concentration of each fragment, mix the fragments 1, 2, and 3 so that the concentration is 2: 2: 1, and use the PCR primer as metF-lh2 (SEQ ID NO: 31: 5'-GA CCACGTCATTTTCCCT -3 ') and metF-rc2 (SEQ ID NO: 34: 5'-TCCGGGCTCAAT TCACTC-3') were used.
  • metF-lh2 SEQ ID NO: 31: 5'-GA CCACGTCATTTTCCCT -3 '
  • metF-rc2 SEQ ID NO: 34: 5'-TCCGGGCTCAAT TCACTC-3'
  • PCR was performed at 25 cycles of denaturation 98 ° C-20 seconds and extension reaction 68 ° C-3 minutes.
  • LA taq polymerase (Takara Bio) was used for this amplification.
  • the DNA fragment amplified in this way has a structure in which a kanamycin resistance gene is inserted in the middle of the gene fragment around the metF gene. About 3 micrograms of this DNA fragment were prepared and introduced into the V3E2S strain by the electopore method.
  • a SEII liquid medium containing 0.4 g / L L-methionine was used, and this was added to SEII containing 20 mg / L kanamycin, 0.4 g / L L-methionine and 2.5 g / L sodium pyruvate.
  • a strain that did not contain L-methionine and was unable to grow when applied to SEII agar medium, that is, a strain exhibiting L-methionine requirement was selected and named V3E3F.
  • lysC that is E.coli-derived asphalt kinase that is not subject to feedback inhibition by L-lysine.
  • the lysC is a known plasmid, RSFD80 (by a PCR method using two oligonucleotide primers prepared based on a known sequence. WO95 / 16042) was obtained as a saddle type.
  • Primer is 1 "(SEQ ID NO: 38: 5'-GAACCTGCAGGCCCTGACA CGAGGTAGATTATGTC -3 ')
  • PCR conditions were denaturation 94 ° C-20 seconds, annealing 55 ° C-30 seconds, and extension reaction 72 ° C-90 seconds in 25 cycles.
  • This was designed as a primer in advance and digested with Sse833871 and Sapl, and ligated with a known plasmid pRStac (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-61687) digested with Sse8387I-SapI.
  • This plasmid was named pRSlysC *.
  • this pRSlys C * was digested with EcoR ⁇ Sapl, the lysC * fragment containing the tac promoter sequence was excised, and this was digested with the restriction enzyme Dral, blunt-ended and dephosphorylated.
  • This plasmid was designated as pBHR-lysC plasmid. This was erased with Ncol, blunt-ended, and dephosphorylated as a vector, and the gentamicin resistance gene fragment prepared by the method described in Example 11 was inserted therein to construct a pBGlysC plasmid. .
  • pBGlysC plasmid was introduced into the V3E2F strain prepared in Example 19, an increase in L-lysine accumulation was observed.
  • L-lysine production was further improved by introducing a known pRSlysEda pA (see JP-A-2003-61687) into the V3E2F / pBGlysC strain.
  • V3E2F / pBGlvsC and V3E2F / pBGlysC / pRSlysEdapA strains were mixed with 50 mg / L genta Containing mycin and 50 mg / L streptomycin (no control strain medium), 0.08 g / L L-methionine and 2.5 g / L sodium pyruvate, final ammonium sulfate Lys accumulation was improved when cultured in SEII production medium supplemented with ammonium sulfate to a concentration of 6 g / L.
  • the relative value of Lys accumulation at this time is shown in Table 13 as the relative value when Lys accumulation of V3E2F is 100.
  • V3E2F / DBG1 V_SC / D_RS 1 vsEdapA 1 3 2 Possibility of industrial use
  • the productivity of L-lysine by methanol-assimilating bacteria can be improved.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡ、および、メタノール資化性細菌に導入したときにＬ－リジンの細胞外への排出を促進する変異型LysEタンパク質をコードするＤＮＡを保持し、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼおよびアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの細胞内活性が増強されるように改変されたメタノール資化性細菌を培地中で培養し、該培地中にL-リジンを生産蓄積させ、該培地からL-リジンを採取する。

Description

明 細 書
メタノール資化性細菌を用いた L一リジンの製造法
技術分野
[0001] 本発明は微生物工業に関連したものであり、詳しくは、発酵法による L リジンの製 造法、および同製造法に用いる微生物に関するものである。
背景技術
[0002] L リジン、 L グルタミン酸、 L—スレオ-ン、 L ロイシン、 L—イロソイシン、 L— ノ リン及び L—フエ-ルァラニン等の L—アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバタ テリゥム属、バチルス属、ェシエリヒア属、ストレプトミセス属、シユードモナス属、ァー スロバクター属、セラチア属、ぺニシリウム属、キャンディダ属等に属する微生物を用 いた発酵法により工業生産されている。これらの微生物は、生産性を向上させるため に、自然界力 分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。また、 組換え DNA技術により L アミノ酸の生合成酵素を増強することによって、 L -ァミノ 酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。
[0003] 例えば、ェシエリヒア属細菌については、ジヒドロジピコリン酸合成酵素の活性を増 強した株を用いた L-リジンの製造法などが開示されている (特許文献 1又は 2)。 また L-リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するェシエリヒア属細 菌由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする DNA、 L-リジンによるフィードバッ ク阻害が解除されたァスバルトキナーゼをコードする DNA,ジヒドロジピコリン酸レダク ターゼをコードする DNA、および、コリネ型細菌由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲナ ーゼをコードする DNAを含むプラスミドにより形質転換した株を用いた L-リジンの製 造法が特許文献 3に開示されている。
さらに、 L-リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するェシエリヒア属 細菌由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする DNA、 L-リジンによるフィード バック阻害が解除されたァスバルトキナーゼをコードする DNA,ジヒドロジピコリン酸レ ダクターゼをコードする DNA、および、コリネ型細菌由来のジアミノピメリン酸デヒドロ ゲナーゼをコードする DNAを有するェシエリヒア属細菌において、ァスパラギン酸セミ アルデヒドデヒドロゲナーゼまたはホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼおよび 、これに加えてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼまたはァス パルターゼを増強したときに、その細菌による L-リジンの生産が改善されることが示さ れている。（特許文献 4)
コリネ型細菌については、細胞内のニコチンアミドジヌクレオチドトランスヒドロゲナ ーゼの活性増強により L-リジン生産性が改善されることが特許文献 5に示されている また、ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ単独の活性を増強した株を用い た L-リジンの製造法およびァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ単独の活 性を増強した株を用いた L-リジンの製造法がそれぞれ特許文献 6および 7に示され ている。
また、フィードバック阻害が解除された変異を有する変異型ァスバルトキナーゼ遺 伝子に加え、ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子を導入することによって L-リジン生 産性が向上するとの報告がある (非特許文献 1)。
さらにコリネ型細菌において、 L-リジン生合成遺伝子を複数個、具体的には変異型 ァスバルトキナーゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジヒドロジピコリン酸合成酵素 、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼおよびジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼを組 み合わせて導入することで、生育を抑制せずに L-リジンの収率を大幅に改善する方 法も示されて!/ヽる (特許文献 8)。
一方、近年 L-リジンを特異的に微生物の菌体の外部に排出する機能を持つタンパ ク質 LysEおよびそれをコードする遺伝子 lysEが見出され、これを増強することによつ て L-リジンの生産能を増加させる技術が開示されている（非特許文献 2又は特許文 献 9)。
また、ェシエリヒア 'コリにお 、てアミノ酸排出タンパク質の発現量を上昇させることに より、いくつかの L アミノ酸の生産性を向上させることができることが知られている（ 特許文献 10)。例えば、ェシエリヒア'コリにおいては、 ORF306遺伝子の発現を増強 することによって、シスチン、システィン等の生産性が向上することが報告されている（ 特許文献 11)。 [0004] 上記のような微生物育種や製造法の改良により、 L アミノ酸の生産性はかなり高 まってはいるが、今後の需要のいっそうの拡大に応えるためには、さらに安価かつ効 率的な L アミノ酸の製造法の開発が求められて!/、る。
[0005] ところで、従来、安価に大量に入手可能な発酵原料であるメタノール力 発酵法に より L アミノ酸を製造する方法としては、ァクロモパクター属およびシユードモナス属 (特許文献 12)、プロタミノバクター属（特許文献 13)、プロタミノバクター属及びメタノ モナス属 (特許文献 14)、ミクロサイクラス属 (特許文献 15)、メチロバチルス属 (特許 文献 16)、バチルス属（特許文献 17)などに属する微生物を用いる方法が知られて いる。
本発明者らはこれまで、人工変異による育種および組換え DNA技術を使ってジヒド ロジピコリン酸合成酵素およびァスバルトキナーゼを増強することで、メチロフイラス属 細菌を用いた L アミノ酸製造法の開発を行ってきた (特許文献 18)。さらに、我々は これまでにメタノール資化性細菌を用いたメタノール力 の発酵法によるアミノ酸製造 に、アミノ酸の排出過程が、大きな障壁であることを示し、これを解決する手段として、 コリネパクテリゥム属細菌より単離した、 L-リジンの排出に関与する蛋白質 LysE蛋白 質から、メタノール資化性細菌で L-リジン排出活性を発揮するような改変体を取得し た。我々は上記の人工変異による育種、組換え DNA技術およびこの改変した L-リジ ン排出担体を使うことで、 L-リジンを効率よく生産させることができることを明らかにし 、メチロフイラス属細菌を用いた L アミノ酸製造法の開発を行ってきた (特許文献 18 または 19)。
[0006] しかし、これまでメタノール資化性細菌を用いたメタノール力 の発酵法による L-ァ ミノ酸製造に、 L-アミノ酸の排出遺伝子と複数個の L-リジン生合成遺伝子を組み合 わせて発現増強することで L-リジン収率の大幅な改善に成功した例は知られていな い。
[0007] コリネ型細菌においては ddh、 lysAをそれぞれ単独で増強することで Lys蓄積量が 向上することが知られて 、る。またこの ddhと lysAを組み合わせて増強することで Lys 生産速度および Lys蓄積量が向上することが示されている。
しかし、メチロフイラス属細菌においては、これらの遺伝子を単独で増強しても L-リ ジン蓄積量が全く増カロしないか、やや低下するにすぎなかった。
特許文献 1：特開昭 56-18596号公報
特許文献 2 :米国特許第 4346170号明細書
特許文献 3：国際公開 95/16042号パンフレット (米国特許第 6040160号明細書） 特許文献 4 :国際公開 01/53459号パンフレット (欧州特許出願公開第 1253195号明細 書）
特許文献 5 :国際公開 95/11985号パンフレット (米国特許第 5830716号明細書） 特許文献 6：特開昭 60-87788号公報
特許文献 7：特公平 6-102028号公報
特許文献 8 :国際公開 9640934号パンフレット (欧州特許第 841395号明細書） 特許文献 9：国際公開 97/23597号パンフレット (米国特許第 6858406号明細書） 特許文献 10：特開 2000-189180号 (欧州特許出願公開第 1016710号明細書） 特許文献 11 :欧州特許 885962号明細書
特許文献 12：特開昭 45-25273号公報
特許文献 13：特公昭 49-125590号公報
特許文献 14 :特開昭 50-25790号公報
特許文献 15：特開昭 52-18886号公報
特許文献 16：特開平 4-91793号公報
特許文献 17：特開平 3-505284号公報
特許文献 18 :国際公開 00Z61723号パンフレット (欧州特許出願公開第 1188822号 明細書）
特許文献 19 :特許公開 2004— 166594号公報 (米国特許出願公開第 2005- 003495 号明細書）
非特許文献 1 : Applied and Environmental Microbiology 57 (6), 1746-1752(1991) 非特許文献 2 : Molecular Microbiology 22:815-826(1996)
発明の開示
本発明は、安価で大量に入手可能なメタノールを用いて、効率良ぐ L リジンを製 造する方法を提供することを課題とする。 [0009] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、 L-リジンの排 出因子をコードする遺伝子と同時に複数の L-リジン生合成遺伝子を組み合わせて増 強することで L-リジン生成収率を大幅に改善することに成功した。すなわち、本発明 者らは、メチロフイラス属細菌において、変異型 lysEタンパク質をコードする DNAおよ び L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコー ドする DNAに加えて、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子とジアミノピメリン 酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を増強することで、これらの単独の発現増強では 全く得られな力つた L-リジン生成収率の向上という効果を見出した。さらに、メチロフィ ラス属細菌の L-リジン生産能は、これらの遺伝子にカ卩えて、ジヒドロジピコリン酸レダ クターゼ遺伝子及びァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を 増強させることでさらに上昇し、ァスバルトキナーゼ遺伝子を増強することで特に顕著 になることを見出した。
また、メタノール資化性細菌にぉ 、てはプラスミドのみ生合成遺伝子発現増強だけ でなぐこれと染色体上への複数コピーの遺伝子の組み込みをおこなうことで、極め て安定的な菌株を構築することができた。これにさらにプラスミドでの遺伝子発現増 強を組み合わせることで、大きく L リジン生成効率が向上したメタノール資化性細菌 を取得するに至った。
以上に基づき、本発明を完成させるに至った。
[0010] すなわち、本発明は以下のとおりである。
(1) L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素を コードする DNA、および、メタノール資化性細菌に導入したときに L—リジンの細胞 外への排出を促進する変異型 LysEタンパク質をコードする DNAを保持し、ジアミノビ メリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリン酸 レダクターゼおよびァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの細胞内活性が増 強されるように改変されたメタノール資化性細菌。
(2) L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたァスバルトキナーゼをコードす る DNAをさらに保持することを特徴とする（1)のメタノール資化性細菌。
(3)前記各酵素もしくは変異型 LysEタンパク質をコードする DNAが染色体 DNA 上に組み込まれたこと、および Zまたは前記各酵素もしくは変異型 LysEタンパク質を コードする DNAを含むプラスミドで形質転換されたことを特徴とする、 (1)または（2)の メタノール資化性細菌。
(4)ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする DNA、ジヒドロジピコリン酸レダクタ ーゼをコードする DNA、ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする D NA、およびァスバルトキナーゼをコードする DNAがェシエリヒア属細菌由来であり、 ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする DNA力メチロフイラス属細菌由来 であり、かつ
ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする DNAおよび変異型 LysEをコードする DNAがブレビバタテリゥム属細菌由来である、 (3)のメタノール資化性細菌。
(5)メチロフイラス属細菌である、 (1)〜 (4)の 、ずれかのメタノール資化性細菌。
(6)メチロフィラス'メチロトロファス AJ110196株（FERM BP-10434)由来の微生物 である、 (1)〜（5)のいずれかのメタノール資化性細菌。
(7) (1)〜（6)のいずれかのメタノール資化性細菌を培地で培養し、該培地又は 菌体内に L リジンを生産蓄積させ、該培地又は菌体内から L リジンを採取するこ とを特徴とする L リジンの製造法。
(8)前記培地カ^タノールを主たる炭素源とすることを特徴とする（7)の L リジン の製造法。
(9)メチロフィラス'メチロトロファス AJ110196株（FERM BP- 10434)。 図面の簡単な説明
[0011] [図 1]ρΜ12プラスミドの構築を示す図。
[図 2]pMIV5プラスミドの構築を示す図。
[図 3]pMIV-FRTKmFRTプラスミドの構築を示す図。
[図 4]pAET7プラスミドの構築を示す図。
[図 5]pFLP31プラスミドの構築を示す図。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 以下、本発明を詳細に説明する。
[0013] 本発明のメタノール資化性細菌は、 L-リジンによるフィードバック阻害が解除された ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする DNA、および、メタノール資化性細菌に導 入したときに L リジンの細胞外への排出を促進する変異型 LysEをコードする DNA を保持し、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ 、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼおよびァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナー ゼの細胞内の活性が増強されるように改変されたメタノール資化性細菌である。
[0014] 本発明にお 、てメタノール資化性細菌とは、メタノールを主たる炭素源として生育 することができる細菌であって、メチロフイラス属細菌などを含む。具体的には、メチロ フィラス'メチロトロファス（Methylophilus methylotrophus)等のメチロフイラス属細菌が 挙げられる。メチロフィラス'メチロトロファスとしては、 AS1株（NCIMB10515)等が挙げ られる。メチロフィラス'メチロトロファス AS1株（NCIMB10515)は、ナショナル'コレクシ ヨン ·ォブ ·インダストウリアル ·アンド'マリン ·バクテリア（National Collections of Indust rial and Marine Bacteria、 1王^ T Nし 1MB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Ro ad, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom)から入手可能である。
[0015] く L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコー ドする DNA>
L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコー ドする DNA (以下、 dapA*遺伝子とも呼ぶ）の種類は特に制限されないが、例えば、 ェシエリヒア属細菌由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする DNAであって、 L-リジンによるフィードバック阻害が解除されるような変異を有するものが好ましい。 ェシエリヒア属細菌由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする DNAと しては、配列番号 41のアミノ酸配列をコードする DNAが挙げられる。 L-リジンによるフ イードバック阻害が解除されるような変異としては、配列番号 41に示すアミノ酸配列 にお 、て 118位のヒスチジン残基をチロシン残基に置換する変異（HI 18Y変異）が挙 げられる。したがって、 dapA*遺伝子としては、配列番号 41のアミノ酸配列において 1 18位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換されたアミノ酸配列をコードする DNAが 挙げられる。
また、 dapA*遺伝子は、配列番号 41のアミノ酸配列全体に対して、 80%以上、好ま しくは 90%以上、より好ましくは 95%、特に好ましくは 98%以上の相同性を有し、か つ、 H118Y変異を有し、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコー ドする DNAであってもよ!/、。
さらに、 H118Y変異を有し、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性が損なわれない限り において、配列番号 41のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、 欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする DNAであってもよ い。
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類に よっても異なるが、具体的には 2〜20個、好ましくは 2〜10個、より好ましくは 2〜5個 を意味する。上記アミノ酸置換は保存的置換が好ましぐ保存的置換としては、 alaか ら ser又は thrへの置換、 arg力ら gln、 his又は lysへの 換、 asn力ら glu、 gln、 lys、 his又 は aspへの置換、 asp ら asn、 glu又は ginへの 換、 cys力ら ser又は alaへの 換、 gin 力ら asn、 glu、 lys、 his、 asp又は argへの 換、 gm力ら gly、 asn、 gln、 lys又は aspへの 換、 gly力ら proへの置換、 his力ら asn、 lysゝ gln、 arg又は tyrへの置換、 ile力ら leu、 met、 val又は pheへの置換、 leu力ら ile、 met、 val又は pheへの]^換、 lys力ら asn、 glu、 gln、 hi s又は argへの置換、 me )ら ile、 leu、 val又は pheへの置換、 pheX^ら trp、 tyr、 met、 ile 又は leuへの置換、 serから thr又は alaへの置換、 thrから ser又は alaへの置換、 trpから phe又は tyrへの置換、 tyrから his、 phe又は trpへの置換、及び、 valから met、 ile又は le uへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、また は逆位等には、ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子を保持する微生物の個体差、種 の違いに基づく場合などの天然に生じる変異 (mutant又は variant)によって生じるも のち含まれる。
さらに、 dapA*遺伝子は、 H118Y変異を有し、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性を 有するタンパク質をコードする限り、配列番号 40の塩基配列の相補鎖又は該配列か ら調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズする DNAでもよ い。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、 非特異的なハイブリッドが形成されな 、条件を 、う。この条件を明確に数値ィ匕するこ とは困難であるが、一例を示せば、通常のサザンノヽイブリダィゼーシヨンの洗いの条 件である 60°C、 1 X SSC, 0. 1%SDS、好ましくは、 0. 1 X SSC、 0. 1%SDSさらに 好ましくは、 68°C、 0. 1 X SSC、 0. 1%SDSに相当する塩濃度、温度で、 1回より好 ましくは 2〜3回洗浄する条件が挙げられる。
dapA*遺伝子は部位特異的変異導入法によって得ることもできるし、後述のように、 プラスミド RSFD80から得ることちできる。
なお、コリネ型細菌の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素は L-リジンによるフィード バック阻害を受けないことが知られている（J Gen Microbiol. 1988 Dec;134(12):3221- 9.)。したがって、本発明に用いる L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒ ドロジピコリン酸合成酵素をコードする DNAは必ずしも変異型ジヒドロジピコリン酸合 成酵素をコードする DNAでなくとも構わな 、。
[0016] <メタノール資化性細菌に導入したときに L リジンの細胞外への排出を促進する変 異型 LysEをコードする DNA>
メタノール資化性細菌に導入したときに L リジンの細胞外への排出を促進する変 異型 LysEをコードする DNAは、例えば、 LysE24遺伝子（US2003-0124687号公報）、 lysE56遺伝子（US2004-0146974号公報）、 lysE24m5 (WO2006/059715号公報）を用 、ることが出来る。
「L リジンの細胞外への排出を促進する」とは、この DNAをメタノール資化性細菌 に導入し、得られたメタノール資化性細菌を培養したときに、この DNAを保持しない メタノール資化性細菌に比べて、培地中に排出される L リジンの量が増大すること をいう。 L—リジンの細胞外への排出の促進は、その結果として、この DNAを保持し な 、メタノール資化性細菌に比べて、この DNAを保持するメタノール資化性細菌を 培養したときに培地中に蓄積する L—リジン濃度が高くなることによって観察される。 メタノール資化性細菌に導入したときに L リジンの細胞外への排出を促進する変 異型 LysEをコードする DNAの遺伝子の種類は特に制限されないが、例えば、ブレビ バタテリゥム属細菌由来の LysEタンパク質をコードする DNAであって、メタノール資 化性細菌に導入したときに L リジンの細胞外への排出を促進する変異を有するも のが好ましぐ LysE24遺伝子（US2003-0124687号公報）、 lysE56遺伝子（US2004-01 46974号公報）、 lysE24m5 (WO2006/059715号公報）を用いることが出来る。
[0017] (l) lysE24遺伝子 lysE24遺伝子は、ループ領域と、 6個の疎水性へリックスとを有し、かつ、 L—リジン の細胞外への排出に関与するタンパク質 (野生型 lysEタンパク質：配列番号 55)の改 変体をコードする DNAであって、野生型タンパク質が持つループ領域を持たな 、変 異型 lysEタンパク質をコードし、かつ、メタノール資化性菌に導入したときに L リジン もしくは L アルギニン又はこれらの両方の L アミノ酸の細胞外への排出を促進す る DNAである。 LysE24遺伝子としては、特許公開 2004— 166594号公報（米国特 許出願公開第 2005-003495号明細書）に記載の LysE24遺伝子が挙げられる。
例えば、配列番号 51のタンパク質をコードする DNAを挙げることができる。また、メ タノール資化性細菌に導入したときに L リジンの細胞外への排出を促進するもので ある限り、配列番号 51のアミノ酸配列全体に対して、 80%以上、好ましくは 90%以 上、より好ましくは 95%、特に好ましくは 98%以上の相同性を有するタンパク質であ つてもよい。
また、 L リジンの細胞外への排出を促進する活性が損なわれない限り、配列番号 51のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付カロ 等を含む配列を有するタンパク質をコードする、 DNAであってもよい。
さらに、 lysE24遺伝子は、 L リジンの細胞外への排出を促進する活性を有するタ ンパク質をコードする限り、配列番号 50の塩基配列の相補鎖又は該塩基配列から調 製され得るプローブとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする DNAでもよい。
「数個」及び「ストリンジェントな条件」の定義ならびに好ましいアミノ酸置換の種類は 上述したとおりである。
例えば、 lysE24遺伝子は特許公開 2004— 166594号公報 (米国特許出願公開第 2005-003495号明細書）に記載のプラスミド pRSlysE24から得ることができる。 pRSlysE 24で形質転換された E.coli JM109株は AJ13830と命名され、同株は 2001年 6月 4日に 、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 FERM P- 18369として寄託され、平成 14年 5月 13日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移 管され、 FERM BP-8040の受託番号のもとで寄託されている。
(2) lysE56遺伝子
lysE56遺伝子としては、配列番号 55に記載のアミノ酸配列において、少なくとも 56 位のグリシン残基が他のアミノ酸残基に置換されたタンパク質をコードする遺伝子が 挙げられる（US2004-0146974号公報)。また、メタノール資化性細菌に導入したとき に L—リジンの細胞外への排出を促進するものである限り、配列番号 55と 80%以上、 好ましくは、 90%以上、より好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上の相同性を有 するアミノ酸配列において、 56位のグリシン残基が他のアミノ酸残基に置換されたタ ンパク質をコードする遺伝子であってもよ 、。
[0019] (3) lysE24m5遺伝子
この遺伝子は、前記 lysE24遺伝子において、 3種類の読み枠全てに終止コドンが存 在するように改変された塩基配列を有し、かつメタノール資化性細菌に導入されたと きに該細菌による L リジンもしくはし アルギニン又はこれらの両方の L アミノ酸の 細胞外への排出を促進する DNAであり、具体的には、配列番号 56に示す塩基配列 を有する DNAを使用することができる（WO2006/059715号公報）。また、 L—リジンの 細胞外への排出を促進する活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号 56 の塩基配列の相補鎖又は該塩基配列力 調製され得るプローブとストリンジェントな 条件下でハイブリダィズする DNAでもよ!/、。
[0020] < ddh遺伝子 >
ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性の増強はジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ をコードする遺伝子（以下、 ddh遺伝子とも呼ぶ）を用いて行うことができる。
ddh遺伝子の種類は特に制限されないが、例えば、コリネ型細菌由来のジアミノピメ リン酸デヒドロゲナーゼ（配列番号 53)をコードする DNAが挙げられる。
ddh遺伝子は、配列番号 53のアミノ酸配列全体に対して、 80%以上、好ましくは 90 %以上、より好ましくは 95%、特に好ましくは 98%以上の相同性を有し、かつ、ジアミ ノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNAであってもよい また、 ddh遺伝子は、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性が損なわれない限り、 配列番号 53のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入 又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする DNAであってもよい。
さらに、 ddh遺伝子は、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を コードする限り、配列番号 52の塩基配列の相補鎖または該塩基配列から調製され得 るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAでもよい。
「数個」及び「ストリンジェントな条件」の定義ならびに好ましいアミノ酸置換の種類は 上述したとおりである。
コリネ型細菌の ddh遺伝子はコリネバタテリゥム 'グルタミカム（Corynebacterium glut amicum)の ddhの既知の塩基配列 (Ishino, S. et al., Nucleic acid res., 15, 3917 (1987 》をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば国際公開第 WO/9516 042号記載の配列番号 11および 12)を用いた PCR法により、ブレビバタテリゥム ラタ トフアーメンタムまたは、コリネバタテリゥム'ダルタミカムの染色体 DNAを铸型として増 幅すること〖こよって得られる。
< lysA遺伝子 >
ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性の増強はジアミノピメリン酸デカルボキシ ラーゼ遺伝子（以下、 lysA遺伝子とも呼ぶ）を用いて行うことができる。 lysA遺伝子の 種類は特に制限されないが、例えば、メチロフイラス属細菌由来のジアミノピメリン酸 デカルボキシラーゼ（配列番号 49)をコードする DNAが挙げられる。
lysA遺伝子は、配列番号 49のアミノ酸配列全体に対して、 80%以上、好ましくは 9 0%以上、より好ましくは 95%、特に好ましくは 98%以上の相同性を有し、かつ、ジァ ミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNAであって ちょい。
また、 lysA遺伝子は、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性が損なわれない限 り、配列番号 49のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿 入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、 DNAであってもよ ヽ。 さらに、 lysA遺伝子は、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク 質をコードする限り、配列番号 48の塩基配列の相補鎖または該塩基配列力 調製さ れ得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAでもよい。
「数個」及び「ストリンジェントな条件」の定義ならびに好ましいアミノ酸置換の種類は 上述したとおりである。
メチロフィラス ·メチロト口ファスの lysA遺伝子は既知の配列をもとに作成した 2種のォ リゴヌクレオチドプライマーを用いた PCR法により、メチロフィラス'メチロトロファスの染 色体 DNAを铸型としてそれぞれ得ることができる。
[0022] < dapB遺伝子 >
ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性の増強は、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼを コードする遺伝子（以下、 dapB遺伝子とも呼ぶ）を用いて行うことができる。 dapB遺伝 子の種類は特に制限されないが、例えば、ェシエリヒア属細菌由来のジヒドロジピコリ ン酸レダクターゼ（配列番号 43)をコードする DNAが挙げられる。
dapB遺伝子は、配列番号 43のアミノ酸配列全体に対して、 80%以上、好ましくは 9 0%以上、より好ましくは 95%、特に好ましくは 98%以上の相同性を有し、かつ、ジヒ ドロジピコリン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする DNAであってもよ い。
また、 dapB遺伝子は、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性が損なわれない限り、 配列番号 43のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入 又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、 DNAであってもよ ヽ。
さらに、 dapB遺伝子はジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質をコ ードする限り、配列番号 42の塩基配列の相補鎖または該塩基配列から調製され得る プローブとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAでもよい。
「数個」及び「ストリンジェントな条件」の定義ならびに好ましいアミノ酸置換の種類は 上述したとおりである。
ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子 (dapB)は既知の塩基配列をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた PCR法により、 E.coli染色体 DNAを铸型と して増幅することができる。
[0023] < asd遺伝子 >
ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性増強は、ァスパラギン酸セミア ルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（以下、 asd遺伝子とも呼ぶ）を用いて行 うことができる。 asd遺伝子の種類は特に制限されないが、例えば、ェシエリヒア属細 菌由来のァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号 45)をコードする DNAが挙げられる。 asd遺伝子は、配列番号 45のアミノ酸配列全体に対して、 80%以上、好ましくは 90 %以上、より好ましくは 95%、特に好ましくは 98%以上の相同性を有し、かつ、ァス パラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA であってもよい。
また、 asd遺伝子は、ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が損なわれ ない限り、配列番号 45のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠 失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、 DNAであってもよ い。
さらに、 asd遺伝子は、ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する タンパク質をコードする限り、配列番号 44の塩基配列の相補鎖または該塩基配列か ら調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズする DNAでもよ い。
「数個」及び「ストリンジェントな条件」の定義ならびに好ましいアミノ酸置換の種類は 上述したとおりである。
アスアパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子 (asd)は既知の塩基配列を もとに作成した 2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用 、た PCR法により、 E.coli染色 体 DNAを铸型として増幅することができる。
<lysC*遺伝子 >
本発明のメタノール資化性細菌は、 L-リジンによるフィードバック阻害が解除された ァスバルトキナーゼをコードする DNAをさらに保持するものであってもよい。
L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたァスバルトキナーゼをコードする DN A (以下、 lysC*遺伝子とも呼ぶ）の種類は特に制限されないが、例えば、ェシエリヒア 属細菌由来のァスバルトキナーゼをコードする DNAであって、 L-リジンによるフィー ドバック阻害が解除されるような変異を有するものが好ましい。
ェシエリヒア属細菌由来の野生型ァスバルトキナーゼをコードする DNAとしては、 配列番号 47のアミノ酸配列をコードする DNAが挙げられる。 L-リジンによるフィードバ ック阻害が解除されるような変異としては、配列番号 47に示すアミノ酸配列において 352位のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換する変異 (T352I変異）が挙げられ る。したがって、 lysC*遺伝子としては、配列番号 47のアミノ酸配列において 352位の スレオニン残基力 Sイソロイシン残基に置換されたアミノ酸配列をコードする DNAが挙 げられる。
lysC*遺伝子は、配列番号 47のアミノ酸配列全体に対して、 80%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%、特に好ましくは 98%以上の相同性を有し、かつ、 T3 521変異を有し、ァスバルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNAであつ てもよい。
また、 lysC*遺伝子は、 T352I変異を有し、ァスパルトキナーゼ活性が損なわれない 限り、配列番号 47のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、 挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする DNAであってもよい。 さらに、 lysC*遺伝子は、 T352I変異を有し、ァスノルトキナーゼ活性を有するタンパ ク質をコードする限り、配列番号 46の塩基配列の相補鎖または該塩基配列から調製 され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAでもよい。
「数個」及び「ストリンジェントな条件」の定義ならびに好ましいアミノ酸置換の種類は 上述したとおりである。
lysC*遺伝子は部位特異的変異導入法によって得ることもできるし、後述のように、 プラスミド RSFD80から得ることちできる。
なお、本発明に用いる L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたァスパルトキ ナーゼをコードする DNAは必ずしも変異型ァスバルトキナーゼをコードする DNAで なくとも構わない。すなわち、野生型タンパク質が L-リジンによるフィードバック阻害を 受けないのであれば、野生型を用いてもよい。
本明細書において、「各酵素の細胞内の活性が増強される」とは、野生株 (例えば、 M.methylotrophus AS1株）または親株（本発明にお 、て特定された酵素のすべての 細胞内の活性が増強されていない株）に比べて、細胞内の酵素活性が上昇している ことを意味し、野生株または親株が有して ヽな ヽ酵素活性を有することも包含する。 具体的には、 dapA*遺伝子、 lysE遺伝子、ジアミノジピコリン酸デヒドロゲナーゼをコ ードする ddh遺伝子は、メチロフイラス属細菌は有さないが、細胞内の酵素活性が検 出できる、あるいは dapA*遺伝子、変異型 lysE遺伝子、 ddh遺伝子が 1コピー以上増 幅されていれば、細胞内の酵素活性が上昇することに包含される。
細胞内の活性を増強する手段としては、下記の手段及びそれらの組み合わせが挙 げられる力 これに限定されない。
(1)各タンパク質をコードする DNAを含むプラスミドを用いた形質転換によるコピー 数の増加
(2)各タンパク質をコードする DNAの染色体上への組込みによるコピー数の増加
(3)各タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター配列の改変による発現量の増 加
[0026] dapA*遺伝子、変異型 lysE遺伝子、 ddh遺伝子の導入手段としては、下記の手段が 挙げられる力 これに限定されない。
(1)各タンパク質をコードする DNAを含むプラスミドを用いた形質転換によるコピー 数の増加
(2)各タンパク質をコードする DNAの染色体上への組込みによるコピー数の増加 また、これらの手段とプロモーター配列の改変を組み合わせてもよ!/、。
[0027] また、酵素活性の増強は、ジヒドロジピコリン酸合成酵素（E4.2.1.52,)は、 yugari.Yら の方法（Biochim.Biophys.Acta 62 612-614 1962)の方法で、ジアミノジピコリン酸デヒ ドロゲナーゼ（EC: 1.4.1.16)は、 Misono,Hらの方法で（J.Biol,Chem.255, 10599-10605 1980)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（EC4.1.1.20)は、 White.P.Jらの方法で ((1965) Biochem,J,96,75- 84)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（EC:1.3.1.26)は、 Ki mura,Hらの方法で（J.Biochem,77, 405-413 1975)、ァスパラギン酸セミアルデヒドレ ダクターゼ（EC 1.2.1.11)は、 Black,Sらの方法で (J.Biol Chem.213 39-50 1955)、ァス バルトキナーゼ（EC:2.7.2.4)は、 Truffa- Bachiらの方法で（The Enzymes(3rd ed.)8,509 -553)で測定することにより確かめることができる。この時の比較対象株として、メチロ フィラス'メチロトロファスとしては、 AS1株（NCIMB10515)を用いることができる。
[0028] また、酵素活性活性が増強されたことの確認は、それぞれの酵素をコードする遺伝 子の m-RNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。 発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダィゼーシヨン、 RT-PCRが挙げられる (Molecular cloning (し old spring Harbor Laboratory Press,し old spring Harbor(USA), 2001) )。活性あるいは発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上 昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて 1. 5倍以上、 2倍 以上、 3倍以上、より好ましくは 5倍以上、さらに好ましくは 10倍以上に上昇しているこ とが望ましい。特にジヒドロジピコリン酸合成酵素は、酵素活性が 10倍以上、より好ま しくは 15倍以上、さらに好ましくは 20倍以上上昇して 、ることが好まし 、。
[0029] コピー数が増幅されたことの確認は、 目的遺伝子と相補的なプローブを用いたサザ ンノ、イブリダィゼーシヨンによって行うことができる。コピー数は、 3コピー以上、より好 ましくは 5コピー以上、さらに好ましくは 10コピー以上増幅されていることが好ましい。 特に dapB遺伝子、 lysA遺伝子、 ddh遺伝子、 asd遺伝子は 2コピー以上、より好ましく は 3コピー以上導入されていることが好ましぐ lysC *遺伝子は 3コピー以上、より好ま しくは 4コピー以上導入されていることが好ましぐ dapA遺伝子、変異型 lysE遺伝子は 、 10コピー以上、好ましくは 12コピー以上、さらに好ましくは 15コピー以上導入されて 、ることが好まし!/、。
[0030] 本発明のメタノール資化性細菌は、上記のような改変（変異型 lysE、 dapA*、 lysA、 d dh、 dapB、 asd, (lysC*)の各遺伝子の発現増強）により、 L-リジン生産能を有している 。ここで、 「L-リジン生産能」とは、本発明のメタノール資化性細菌を培地で培養したと きに、回収可能な量の L-リジンを培地中に蓄積できることを意味する。
[0031] 本発明のメタノール資化性細菌は、栄養要求性変異、アナログ耐性変異、及び代 謝制御変異などの変異を有する変異株において上記のような改変がなされた細菌で あってもよい。
例えば、 L—ホモセリン、又は Lースレオニン及び L—メチォニンを要求する変異株 (特公昭 48-28078号、特公昭 56-6499号）、イノシトールまたは酢酸を要求する変異 株 (特開昭 55-9784号、特開昭 56-8692号）、又はォキサリジン、リジンノ、イド口キサメ ート、 S - (2—アミノエチル）一システィン、 γ—メチルリジン、 (X—クロロカプロラクタ ム、 DL— a アミノー ε一力プロラタタム、 a アミノーラウリルラタタム、ァスパラギ ン酸一アナログ、スルファ剤、キノイド、又は N ラウロイルロイシンに耐性を有する変 異株などにぉ 、て上記のような改変がなされた細菌であってもよ 、。
なお、上記のような改変 (遺伝子増幅)を行った後に、栄養要求性変異、アナログ耐 性変異、及び代謝制御変異などの変異を導入してもよ 、。
[0032] 次に、 L-リジンによるフィードバック阻害を受けないジヒドロジピコリン酸合成酵素遺 伝子 (dapA*遺伝子）およびァスパルトキナーゼ遺伝子 (lysC*遺伝子）の発現を増強 する方法を、以下に例示する。なお、変異型 lysE遺伝子、 dapB遺伝子、 lysA遺伝子、 ddh遺伝子及び asd遺伝子も同様にして発現増強することができる。
dapA*遺伝子および lysC*遺伝子の発現を増強するには、これらの DNA断片を、メ チロフイラス属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結し て糸且み換え DNAを作製し、これをメチロフイラス属細菌の宿主に導入して形質転換 すればよい。これらの遺伝子のコピー数が上昇する結果、ジヒドロジピコリン酸合成酵 素及びァスバルトキナーゼの目的遺伝子がコードする酵素の細胞内活性が増強され る。以下、ジヒドロジピコリン酸合成酵素を DDPS、ァスバルトキナーゼを AK、ァスパル トキナーゼ IIIを ΑΚΠΙと略すことがある。
[0033] DDPSをコードする遺伝子及び AKをコードする遺伝子の供与微生物としては、メチ ロフイラス属に属する微生物中で DDPS活性及び AK活性を発現することができる DNA を保持する微生物であれば、いかなる微生物でも使用できる。微生物は、野生株及 びそれから誘導した変異株のいずれでもよい。具体的には E. coli (ェシエリヒア'コリ (E scherichia coli)) K- 12株及びメチロフィラス'メチロトロファス AS1株（NCIMB10515)等 が挙げられる。ェシエリヒア属細菌由来の DDPSをコードする遺伝子（Richaud, F. et al . J. BacterioL, 297(1986))及び AKIIIをコードする遺伝子（Cassan, M., Parsot, C, C ohen, G.N. and Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052(1986))は、いずれも塩基配列 が明らかにされて 、るので、これらの遺伝子の塩基配列に基づ!/、てプライマーを合 成し、 E. coli K- 12等の微生物の染色体 DNAを铸型とする PCR法により、これらの遺 伝子を取得することが可能である。以下、 E. col油来の dapA及び lysCを例として説明 するが、本発明に用いる遺伝子は、これらに限定されるものではない。
[0034] 本発明に用いる DDPS及び AKは、 L リジンによるフィードバック阻害を受けないも のである。 E. coli由来の野生型 DDPSは L—リジンによるフィードバック阻害を受けるこ とが知られており、 E. coli由来の野生型 ΑΚΠΙは L リジンによる抑制及びフィードバッ ク阻害を受けることが知られている。したがって、メチロフイラス属細菌に導入するため には、それぞれ L—リジンによるフィードバック阻害が解除されるような変異を導入す ることが好ましい。
ただし、例えば、コリネバタテリゥム属細菌由来の DDPSはもともと L—リジンによるフ イードバック阻害を受けな 、ため、本発明にお 、て用いる DDPS遺伝子及び AK遺伝 子は必ずしも変異型である必要はな 、。
[0035] L-リジンによるフィードバック阻害が解除された DDPSをコードする dapA*及び AKを コードする lysC*はこれを含むプラスミドを铸型とし、既知の塩基配列をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた PCR法により得ることができる。
dapA*及び lysC*を含むプラスミドとして、広宿主域プラスミド RSFD80が知られて!/、る (WO95/16042号）。同プラスミドで形質転換された E. coli JM109株は、 AJ12396と命 名され、同株は 1993年 10月 28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所 (現 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）に受託番号 FERM P- 13936として寄託され、 1994年 11月 1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管さ れ、 FERM BP-4859の受託番号のもとで寄託されている。 RSFD80は、 AJ12396株から 、公知の方法によって取得することができる。
[0036] RSFD80に含まれている dapA*は、配列番号 40に示す野生型 dapA遺伝子の塩基 配列において塩基番号 597の Cが Tに変化した配列を有し、それによつて、コードされ る変異型 DDPSは、配列番号 41に示すアミノ酸配列において 118位のヒスチジン残基 がチロシン残基に置換された配列を有する。また、 RSFD80に含まれている lysC*は、 配列番号 46に示す野生型 lysCの塩基配列において塩基番号 1638の Cが T変化した 配列を有し、それによつて、コードされる変異型 ΑΚΙΠは、配列番号 47に示すアミノ酸 配列において 352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換された配列を有する
[0037] 遺伝子のクローユングに使用されるプラスミドとしては、ェシエリア属細菌等の微生 物において複製可能なものであればよぐ具体的には、 pBR322、 pTWV228、 pMWll 9、 pUC19等が挙げられる。
[0038] また、メチロフイラス属細菌で機能するベクターとは、例えばメチロフイラス属細菌で 自律複製出来るプラスミドである。具体的には、広宿主域ベクターである RSF1010及 びその誘導体、例えば pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 1986
, 16, 161— 167)、あるいは pMFY42 (gene, 44, 53(1990))、 pRP301、 pTB70 (Nature, 28
7, 396, (1980))等が挙げられる。また、 RSF1010とは不和合性が異なる広宿主域べク ターである pBBRlおよびその誘導体たとえば pBHRl(Antoine, R. and Locht, C, Mol ecular Microbiology, 6, 1785-99. (1992).)等があげられる。
[0039] dapA*、 lysC*およびその他のタンパク質をコードする DNAをメチロフイラス属細菌で 機能するベクターを連結して組み換え DNAを調製するには、これらの遺伝子を含む
DNA断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、 T4 DNAリ ガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。これらの遺伝子は、それぞれ別個 のベクターに搭載してもよぐ同一のベクターに搭載してもよ 、。
DNAの切断、連結、その他、染色体 DNAの調製、 PCR、プラスミド DNAの調製、 形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によ く知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、 Sambrook, J., F ntsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecularし loning A Laboratory Manual, second E dition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
[0040] 上記のように調製した組換え DNAをメチロフイラス属細菌に導入するには、十分な 形質転換効率が得られる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、エレ タトロポレーシヨン法（Canadian Journal of Microbiology, 43. 197(1997))が挙げられる
[0041] また、 DDPS活性及び AK活性の増強は、 dapA*及び lysC*をメチロフイラス属細菌の 染色体 DNA上に多コピー存在させることによつても達成できる。メチロフイラス属細 菌の染色体 DNA上に dapA*及び lysC*を多コピーで導入するには、染色体 DNA上 に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体 DNA上に 多コピー存在する配列としては、レぺッティブ DNA、転移因子の端部に存在するィ ンバーティッド 'リピートが利用できる。あるいは、特開平 2-109985号公報に開示され て 、るように、 dapA*及び Z又は lysC*をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて 染色体 DNA上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質 転換株内の dapA*及 lysC*のコピー数が上昇する結果、 DDPS活性及び AK活性が増 幅される。なかでもトランスポゾンとしては、 Mu phage由来の min卜 Muを用いることが 好ましい。
[0042] DDPS活性及び AK活性の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、 dapA*及 lysC *のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによつても達成され る（特開平 1-215280号公報参照）。たとえば、 lacプロモーター、 trpプロモーター、 tr cプロモーター、 tacプロモーター、ラムダファージの PRプロモーター、 PLプロモータ 一、 tetプロモーター、 amyEプロモーター、 spacプロモーター等が強力なプロモータ 一として知られている。これらのプロモーターへの置換により、 dapA*及び lysC*の発 現が強化されることによって DDPS活性及び AK活性が増幅される。発現調節配列の 増強は、 dapA*及 lysC*のコピー数を高めることと組み合わせてもよ!/、。
[0043] 本発明の微生物は、上記の方法により取得された、 L-リジンによるフィードバック阻 害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする DNA、および、メタノール 資化性細菌に導入したときに L—リジンの細胞外への排出を促進する変異型 LysEタ ンパク質をコードする DNAを保持し、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメ リン酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼおよびァスパラギン酸セ ミアルデヒドデヒドロゲナーゼの細胞内活性が増強されるように改変されたメタノール 資化性細菌であればいずれでも構わないが、代表例として、メチロフィラス'メチロトロ ファス AJ 110196株（FERM BP-10434)あるいは、 AJ 110196由来の微生物（派生株）を 挙げることができる。ここで「派生株」とは、 AJ110196を親株として育種された株で、さ らに L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコ ードする DNA、および、メタノール資化性細菌に導入したときに L—リジンの細胞外 への排出を促進する変異型 LysEタンパク質をコードする DNAの発現量が増強され たり、さらに、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラー ゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼおよびァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナ ーゼの細胞内活性が増強されていてもよいし、以下に示すように、他の性質が付与さ れていてもよい。
[0044] 本発明のメタノール資化性細菌は、上記 6又は 7種類の遺伝子の発現増強に加え て、他の L—リジン生合成に関与する酵素を増強してもよい。そのような酵素としては 、ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ（特開昭 60-87788号）、ァスパラギン酸 アミノトランスフェラーゼ (特公平 6-102028号）、ジアミノピメリン酸ェピメラーゼ遺伝子 等のジアミノピメリン酸経路の酵素（特開 2003-135066)、あるいはホモアコニット酸ヒド ラターゼ遺伝子等のアミノアジピン酸経路の酵素等が挙げられる。また、 6—ホスホダ ルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは 2 ケト一 3 デォキシ一 6 -ホスホダルコン酸ァ ルドラーゼ等のェントナー ·ドウドロフ経路の酵素を増強してもよ 、。（特開 2004-1665 95号公報）
[0045] また、本発明のメタノール資化性細菌は、さらに、 L リジンの生合成経路力も分岐 して L リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠 損して 、てもよ 、。 L リジンの生合成経路力 分岐して L リジン以外の化合物を生 成する反応を触媒する酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼや (WO 95/23864 参照） L-リジンデカルボキシラーゼ (特開 2004-254544号公報）が挙げられる。酵素活 性を低下するための改変は相同組換えを利用した遺伝子破壊などの手法によって 行うことができる。
また、本発明のメタノール資化性細菌は、さらに、生育に L—メチォニンを要求する ように改変してもよい。（特開 2004-248669号公報） L-メチォニンを要求するように改 変するには、本発明のメタノール資化性細菌を自然突然変異ある 、は変異処理によ り、 L-メチォニンを含まな 、培地では生育できな 、ように改変してもよ 、し、 metA遺伝 子（特開 2004-248669号公報）あるいは metF遺伝子（配列番号 58)を破壊すること〖こ よって取得することもできる。
[0046] < 3 >L リジンの製造
上記にようにして得られる L リジン生産能を有するメチロフイラス属細菌を培地に 培養し、該培養物中に L リジンを生産蓄積させ、該培養物力 L リジンを採取す ることにより、 L リジンを製造することができる。
[0047] 本発明で用いられる微生物は、通常メタノール資化性微生物の培養に用いられる 方法で培養することができる。本発明で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機ィ オン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合 成培地の ヽずれでも用いられる。 [0048] メタノールを主たる炭素源として用いると、 L リジンを安価に製造することができる 。メタノールは、主たる炭素源として用いる場合は、培地中に 0.001〜30%添加する。 窒素源としては硫酸アンモ-ゥムなどを培地に添カ卩して用いる。これらの他に、通常 、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンなど の微量成分が少量添加される。
[0049] 培養は、振とう培養又は通気撹拌培養などの好気条件下、 pH5〜9、温度 20〜45°C に保持して行われ、通常 24〜120時間で終了する。
培養物力 の L—リジンの採取は、通常イオン交換榭脂法、沈殿法、その他の公知 の方法を組み合わせることにより実施できる。
[0050] [実施例]
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
試薬は、特記しない限り和光純薬、又はナカライテスタ社製のものを用いた。各実 施例で用いる培地の組成は以下に示すとおりである。いずれの培地も pHは NaOHま たは HC1で調整した。
[0051] (LB培地)トリプトン 'ペプトン (ディフコ社製） 10g/L酵母エキス (ディフコ社製）
5g/LNaCl 10g/LpH7.0 [120°C、 20分間蒸気滅菌を行った。 ]
[0052] (LB寒天培地) LB培地パクトァガー 15g/L[120°C、 20分間蒸気滅菌を行った。 ]
[0053] (SEII培地） K HPO 1.9g/L
2 4
NaH PO 1.56g/L
2 4
MgSO · 7Η O 0.2g/L
4 2
(NH ) SO 5g/L
4 2 4
CuSO ·5Η O 5 /z g/L
4 2
MnSO -5H O 25 μ g/L
4 2
ZnSO - 7H O 23 μ g/L
4 2
CaCl -2H O 72mg/L
2 2
FeCl -6H O 9.7mg/L
3 2
メタノーノレ 0.5%(vol/vol)pH7.0
[メタノール以外は 121°C、 15分間蒸気滅菌を行った。良くさめてからメタノールを添カロ した。]
[0054] (SEII生産培地）
K HPO 1.9g/L
2 4
NaH PO 1.56g/L
2 4
MgSO - 7H O 0.2g/L
4 2
(NH ) SO 5g/L
Figure imgf000025_0001
MnSO -5H O 25 g/L
Figure imgf000025_0002
CaCl -2H O 72mg/LFeCl -6H O 9.7mg/L
2 2 3 2
ピルビン酸 'Na 2.5 g/L
CaCO (関東ィ匕学製） 30g/L
3
メタノー/レ 2%(vol/vol)pH7.0
[メタノール以外は 121°C、 15分間蒸気滅菌を行った。良くさめて力 メタノールを添カロ した。]
[0055] (SEII寒天培地）
K HPO 1.9g/L
2 4
NaH PO 1.56g/L
2 4
MgSO · 7Η O 0.2g/L
4 2
(NH ) SO 5g/L
Figure imgf000025_0003
MnSO -5H O 25 μ g/L
4 2
ZnSO - 7H O 23 g/L
4 2
CaCl -2H O 72mg/L
2 2
FeCl -6H O 9.7mg/L
3 2
ピ /レビン酸 'Na 1.0 g/L
メタノーノレ 1% (vol/vol) pH7.0バタトァガー (ディフコ社製） 15g/L
[メタノール以外は 121°C、 15分間蒸気滅菌を行った。良くさめてからメタノールおよび 必要に応じて 20g/Lに調製した L-メチォニン溶液をフィルター滅菌して添加した。] 実施例 1
[0056] < min卜 Muシステムの構築、 pMIV- Km、 pMIV- Km- EA、 pAET7 >
染色体上で lysE24遺伝子 (変異型 LysEタンパク質をコードする DNA)および変異 型 dapA遺伝子 (L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合 成酵素をコードする DNA)のコピー数を増幅するために、ェシエリヒア 'コリにて見出 されたバタテリオファージである Mu-phageの機能を利用した遺伝子組み込み系を利 用した。
[0057] < pMIV5の構築 > (図 1、 2)
Mu-phageがェシエリヒア'コリの染色体上に組み込まれるためには attL, attRという 認識配列に挟み込まれた薬剤耐性遺伝子および転移に必要な転移酵素 (ミュートラ ンスポゼース =Mu転移酵素）が必要である。両者は必ずしも同一ベクターに搭載さ れている必要はないので、まず、認識配列 attL, attRおよびカナマイシン耐性遺伝子 を搭載した PMIV5プラスミドを構築し、これとは別に Mu転移酵素を搭載する pAET7プ ラスミドを構築した。両プラスミドを同一菌内で保持させることで両者が機能し、その保 持している菌株の染色体 DNAに attL,attRにはさまれた領域が転移する。
PMIV5はまず、公知のベクター pMW119(東洋紡力 購入可能)を制限酵素 PvuIIに て消化後、ァガロースゲル電気泳動にて分離し、約 3.9kbpの断片を回収しこれを DN A Ligation Kit (タカラバイオ)にて連結し、 pMWlプラスミドを構築した。次に、この pM Wlプラスミドに E.coliの細胞内で mini-Mu-phageを転移させた。具体的には Escherich ia coliの K12株に公知のプラスミド (Journal of Bacteriology 158, 488- 495(1984》であ る PMD4041を導入したのち、カナマイシン耐性でかつアンピシリン感受性の株を選択 することで、 pMD4041プラスミドが脱落し、かわりに mini-Mu 4041が染色体上に転移 した株を選択した。この mini-Mu4041の Mu転移を抑制する因子である cリプレッサー が温度感受性変異を持っため、この株を 42°Cにて培養すると染色体上の mini-Muの cリブレッサーが不活性ィ匕され、そのため mini-Mu4041の転移が大きく活性ィ匕され、結 果として染色体上に mini-Muの転移が効率的に起こるため致死となる。この染色体上 に mini-Mu4041が溶原化された株に pMWlを 30°Cにて形質転換した。この pMWlプ ラスミド保持する株を 30°Cにて lmlの細胞数が 2xl08になるまで LB培地で培養したも のを 42°Cにて 1時間処理した。この処理によって pMWlプラスミド上に mini-Mu4041が 転移したプラスミドを取得する目的で、この菌体力ゝらプラスミド DNAを調製して、 Esche richia coli株に形質転換した。カナマイシン耐性でかつアンピシリン耐性となる形質転 •50株よりそれぞれプラスミドを調製して、制限酵素処理により構造を調べたとこ ろ目的のプラスミドをひとつ得た。このプラスミドを pMul lと命名した。この pMul lプラ スミドは pMWlプラスミド上の par領域上に mini-Mu4041が転移して!/、た。さらに具体的 には PMW119は公知のプラスミド pBR322と pSClOlの断片からなる力 この境界位置 をゼロ位置としたときの 259の位置に挿入されて!、た。このプラスミドを制限酵素 Hindll Iにて消化し、ァガロースゲル電気泳動にて分離し、約 6.9kbpの断片を回収しこれを D NA Ligation Kit (タカラバイオ)にて連結し、 pM12プラスミドを構築した (図 1)。この pMl 2プラスミドを HindIII-AvaIII(EcoT22I)にて消化し、これをベクターとし、これに PCR増 幅した E.coliの thrオペロンのターミネータ一領域を連結、挿入した。 PCR増幅の铸型 には E.coliの染色体 DNAを用い、プライマーは p- ter- thrL- f (配列番号 1 : 5- aaaaagct taacacagaaaaaagcc-3)および p- ter- thrL- r (酉己列番号 2： 5- aaactgcagtggtcgaaaaaaaaa gccc- 3)を用い、 PCRの条件は変性 94°C- 20秒、アニーリング 55°C- 30秒、伸長反応 7 2°C- 60秒のサイクルを 25サイクルで行った。得られたプラスミドを制限酵素 EcoRト Hin dillにて消化し、これをベクターとし、 PCR増幅したマルチクローユングサイト領域およ び PCR増幅したパクテリオファージ fd由来のロー因子非依存的転写終結因子断片を 挿入した。マルチクローユングサイト領域の PCR増幅の铸型には pUC57プラスミド (Fer mentus AB社、 LITHUANIAより購入可能)を用い、プライマーは pUC57- MCS- f (配列 番 3： 5- aaagaattcgagctcggtacctc-3)およひ pUC57- MC¾- r (目列 号 4： 5- aaaaag cttgcatgcaggcctct- 3)を用い、 PCRの条件は変性 94°C- 20秒、アニーリング 55°C-30秒 、伸長反応 72°C- 30秒のサイクルを 25サイクルで行った。この増幅断片をあらかじめ プライマーにデザインしてお 、た EcoRI-BamHIにて消化した。バタテリオファージ fd由 来のロー因子非依存的転写終結因子断片の PCR増幅の铸型にはパクテリオファー ジ fdのケ'、ノム DNAを用い、プライマーは ter- fd-f (配列番号 5： 5- aaaggatccgcatgccgtt ga-ύ)および ter— fd— r (酉己列 号 b： 5— aaagaattccgatacaattaaaggctccttttggagcctttttttt ggagattttcaacgtgaaaaaattattattcgcaattccaagctaat-3)を用い、 PCR条件は変性 94。C- 2 0秒、アニーリング 55°C- 30秒、伸長反応 72°C- 30秒のサイクルを 25サイクルで行った 。この増幅断片をあらかじめプライマーにデザインしておいた EcoRト Hindlllにて消化 した。この 3断片を DNA Ligation kit (タカラバイオ)にて連結し、 pMIV5プラスミドを構築 した (図 2)。さらにこのプラスミドを EcoRVにて消化し、ここに市販のプラスミドである pU C4Kより Hindiにて切り出したカナマイシン耐性遺伝子断片を挿入して pMI V5-Kmプ ラスミドを構築した。
[0058] < pMIV-Km-lysE24dapA >
上記のように構築した mini-Muを利用した遺伝子組み込み用プラスミド pMIV5-Km に目的の遺伝子を挿入し、これを用いて染色体上に目的の DNA断片を転移させた。 具体的には PMIV5- Kmプラスミドを Smalにて消化し、これを脱リン酸ィ匕処理した。一方 、 lysE24+dapA*断片は同遺伝子を含む公知プラスミド pRSlysEdapA (特開 2003-61687 号公報参照)を铸型とし、 pRS-ls (配列番号 8： 5- cacagagacatattgcccgttg- 3)および d apA- r (酉 C列 ¾·号 7： 5- cattctagatccctaaactttacagcaaaccggcat- ) プフィマ' ~~とした P CR増幅によって得た。 PCRの条件は変性 94°C- 20秒、アニーリング 55°C- 30秒、伸長 反応 72°C-120秒のサイクルを 25サイクルで行った。 PCR増幅断片を TaKaRa BKL kit( タカラバィォ)両者を連結して pMIV-Km-lysE24dapAプラスミドを構築した。
[0059] < pAET7の構築 >(図 4)
既知のプラスミド pUC1918(Gene,(1993) 134, 89-91)を制限酵素 EcoRIにて消化し、 平滑末端処理を行った。これをベクターとし、既知のプラスミド pMu4041(Journal of Ba cteriology, (1984), 158, 488- 495)を Seal- Eco47IIIにて消化することで得たミュートラン スポゼースをコードする DNA断片を平滑末端処理したものと連結した。このプラスミド を pUC- MH7と命名した。この pUC- MH7プラスミドを BamHIにて消化し、切り出したミュ 一トランスポゼースをコードする DNA断片を既知のプラスミド pAYC32 (Journal of Gen eral Microbiology 137, 169-178 (1991))の BamHIサイトに挿入し、 pAET7プラスミドを 得た。
実施例 2
[0060] く lysE24および変異型 dapA遺伝子のメチロフィラス'メチロトロファス株の染色体上へ の組み込み、 VAE#1取得 >
まず、 M.methylotrophusAS株に pAET7をエレクト口ポレーシヨン法によって導入、 50 mg/1のストレプトマイシンを含む SEIIプレートに塗布した。次に、得られた形質転^ に、 pMIV- Km- lysE24dapAプラスミドをエレクト口ポレーシヨン法によって導入して 20m g/1のカナマイシンおよび 50mg/Lのストレプトマイシンを含む SEIIプレートにてコ口- 一を形成する株を取得した。 mini-Muカセットの内部にはカナマイシン耐性遺伝子が 挿入されており、また、 pMIV- Km- lysE24dapAプラスミドは M.methylotrophus中で複 製することができないので、このカナマイシン耐性となった株は、染色体上に mini-Mu カセットが挿入された株である。そこで、これらの株より無作為に 200株を選択し、 50m g/Lのストレプトマイシンおよび 20mg/Lのカナマイシンを含む SEIIプレートに塗り広げ 、 37°Cにて 1晚培養したのち、培地表面約 0.3平方センチメートルの菌体をかきとって 50mg/Lのストレプトマイシンおよび 20mg/Lのカナマイシンを含む SEII生産培地 (5ml) に植菌し、 37°Cにて 34時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により除去 し、培養上清に含まれる L—リジン濃度をバイオテックアナライザー AS- 210(サクラ精 機製)を用いて定量し、 L-リジンを最も多く含む株を選択した。この株を VAE#1と命名 した。
実施例 3
< lysE24および変異型 dapA遺伝子の更なる高コピー組み込み株の取得 (VAE#8) > VAE# 1株は 1コピーまたは 2コピーの mini-Muカセットが染色体上に挿入された株で あると思われた。そこで、さらに L-リジンの生産性を向上させるため minト Muカセットの 染色体上での増幅を行った。 Muトランスポゼースを搭載する pAET7プラスミド上には Muトランスポゼースの活性を抑制する MuCタンパク質をコードする遺伝子が搭載され ているが、この MuCたんぱく質は温度感受性の性質を持っているため、 42°Cにて培 養することで Muトランスポゼースの活性を促進することができ、その結果、染色体上 での minト Muカセットの増幅を行うことができる。具体的には VAE#1株を SEII液体培地 に適当な濃度になるように懸濁し、これを 42°Cにて 1時間保温した後、適当に希釈し た菌液を 50mg/Lのストレプトマイシンおよび 20mg/Lのカナマイシンを含む SEIIプレー トに塗布し、シングルコロニーを形成させた。このシングルコロニーを無作為に 200個 を選択し、 50mg/Lのストレプトマイシンおよび 20mg/Lのカナマイシンを含む SEIIプレ ートに塗り広げ、 37°Cにて 1晚培養したのち、培地表面約 0.3平方センチメートルの 菌体をかきとって 50mg/Lのストレプトマイシンおよび 20mg/Lのカナマイシンを含む S ΕΠ生産培地 (5ml)に植菌し、 37°Cにて 34時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠 心分離により除去し、培養上清に含まれる L—リジン濃度をバイオテックアナライザー AS-210(サクラ精機製)で定量し、 L-リジンを最も多く含む株を選択した。この株を VA E#2と命名した。この操作を 8回繰り返すことで VAE#8株を得た。 VAE#8株の Lys蓄積 の相対値を VAE#1を 100としたときの値で表 1に示した。
[0062] [表 1] 株名 相対 Lys蓄積量 （％)
VAE#1 100
VAE#8 800 実施例 4
[0063] <VAE#8における転移位置の決定 >
次に、 VAE#8株の染色体上で mini-Muカセットが転移している位置を決定した。 VA E#8株の染色体 DNAを調製し、これを制限酵素 Sailにて完全分解した。これを pHSG3 98ベクターに連結し、 12.5mg/Lのクロラムフエ-コール及び 25mg/Lのカナマイシンを 含む LB寒天培地にて選択し、得られたコロニーよりプラスミド DNAを調製した。このプ ラスミドには mini-Muカセット上のカナマイシン耐性遺伝子及びその転移した位置の 周辺の染色体 DNAがクローユングされている。これを、 mini-Muカセットの右端に存在 する attR内部に外向きにデザインしたシークェンシングプライマー（attR-rl 5- catctg tttcatttgaagcgcgaaagcta-3：配列番号 9)を用いて塩基配列を決定することで、染色体 上に転移した mini-Muカセットの転移位置を決定することができる。この方法で決定し た転移位置の情報に基づ 、て VAE#8と全く同一の株を構築することも可能である。 実施例 5
[0064] < VAE#8への Met要求性の付与 (#403) > 次に、 VAE#8株への L-メチォニン要求性の付与を行った。アミノ酸生産菌へのアミ ノ酸要求性の付与は培養を行う際の菌体生成量を制御するのに有効な手段である。 既知の方法 (WO 00/61723)にて VAE#8株を NTG変異処理し、これをシングルコ口- 一を形成する菌密度まで適当に希釈して、 0.5g/Lの L-メチォニンを含む SEII寒天培 地に塗布した。これを L-メチォニンを含まない SEII寒天培地にレプリカ (複製)し、この プレートで生育することができない株、すなわち L-メチォニン要求株を取得した。この 株を # 403と命名した。この # 403株の L-メチォニン生合成に関与すると思われる複 数の遺伝子を他の微生物との相同性に基づく当業者によく知られた方法でクロー- ングし、塩基配列を決定した結果、 5,10メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素をコードす る metF遺伝子の一部が欠失していることがわ力つた。具体的には metF遺伝子の開始 コドン力も 92bp下流側から 344bp下流側までが欠失していた。我々が見出した既知の 方法（特開 2004-229662、直鎖 DNAを用いた相同組み換え法）にて VAE#8の metF遺 伝子を破壊したところ L-メチォニン要求性を付与することが可能であった。詳細は実 施例 19にて後述する。この人為的に metFを破壊した株は上述の NTG変異処理によ つて取得した L-メチォニン要求株である # 403と同じ性質を示した。遺伝子破壊に 用いる破壊用 DNA断片は既知の文献 (Ho, S. N., Hunt, H. D.， Horton, R. M., Pulle n, J. K. and Pease, L. R.， Gene, 77, 51-9. (1989).)に示されている Over- lap- PCR法 を用いて調製した。この # 403株および対照として VAE#8株を 0.075g/Lの L-メチォ- ンおよび 2.5g/Lのピルビン酸ナトリウムを含む SEII生産培地にて培養したところ Lys蓄 積が向上した。 # 403株の Lys蓄積の相対値を VAE#8株を 100としたときの値で結果 を表 2に示す。
[表 2] 株名 相対 Lys蓄積量 (%)
V A E 8 1 0 0
# 4 0 3 1 5 6 実施例 6 [0066] < pMIV- FRTGmFRT、 pMIV-FRTGmFRT-EAプラスミドの構築 > (図 3)
# 403株にさらに mini-Muカセットを組み込むためにカナマイシンとは異なる薬剤耐 性遺伝子をもつ挿入カセットを構築した。具体的には pMIV5プラスミドを EcoRVにて 消ィ匕し、これをベクターとした。次に、既知のプラスミド pKD4(PROCEEDINGS OF TH E NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERIC
A, (2000) 97, 6640-6645)を Hindlll-Ndelにて消化し平滑化した、カナマイシン而性 遺伝子領域を持つ断片を挿入した。このプラスミドを pMIV- FRTKmFRTと命名した。 このプラスミドを制限酵素 Bglllにて消化して平滑末端ィ匕し、ここに PCR増幅したゲンタ マイシン耐性遺伝子断片を挿入した。 PCRの铸型には既知のプラスミド pML122を用 い（Gene, 89, 37-46. (1990))、 PCRプライマーは pGm- 5- cgccagccaggacagaaatgc- 3 ：配列番号 10)および pGm- r(5- gtccagcggtttttcttgggct- 3：配列番号 11)を用い、 PCR の条件は変性 94°C-20秒、アニーリング 55°C- 30秒、伸長反応 72°C- 60秒のサイクル を 25サイクルで行った。このプラスミドを pMIV-FRTGmFRTと命名した。このプラスミド の attLおよび attRに挟まれた領域に目的の遺伝子を挿入することで、 目的の遺伝子 を M.methylotrophusの染色体上で遺伝子増幅するための mini-Muカセットを構築し た（図 3)。具体的には pMIV-FRTGmFRTプラスミドを制限酵素 Smalにて消化し、これ を脱リン酸ィ匕処理した。一方、 lysE24+dapA*断片は同遺伝子を含む公知プラスミド pR SlysEdapA (特開 2003- 61687号公報参照)を铸型とし、 pRS- Isおよび dapA- rをプライ マーとした PCR増幅によって得た。 PCRの条件は変性 94°C- 20秒、アニーリング 55°C- 30秒、伸長反応 72°C-120秒のサイクルを 25サイクルで行った。 PCR増幅断片を TaKa Ra BKL kit (タカラバイオ)にてリン酸化した後にこれをベクターと連結して pMIV-FRT GmFRT-EAプラスミドを構築した。なお、 pKD4および pCP20プラスミドは E.coli Geneti c Stock Centerにてそれぞれ CGSCstrain #7632、 #7629として登録されており入手可 能である。
実施例 7
[0067] < pMIV-Gm- EAを用いた lysE24および変異型 dapA遺伝子の更なる高コピー組み込 み株の取得 (#403-11-Gm) >
まず、 # 403株に pAET7をエレクト口ポレーシヨン法によって導入し、 50mg/lのストレ プトマイシンを含む SEIIプレートに塗布した。次に、得られた pAET7形質転^ ¾に、 p MIV-FRTGmFRT- EAプラスミドをエレクト口ポレーシヨン法によって導入して 20mg/lの ゲンタマイシンおよび 50mg/Lのストレプトマイシンを含む SEIIプレートにてコロニーを 形成する株を取得した。 mini-Muカセットの内部にはゲンタマイシン耐性遺伝子が挿 入されており、また、 pMIV- FRTGmFRT- EAプラスミドは M.methylotrophus中で複製 することができないので、このゲンタマイシン耐性となった株は、染色体上に mini-Mu カセットが挿入された株である。そこで、これらの株より無作為に 200株を選択し、 50m g/Lのストレプトマイシンおよび 20mg/Lのゲンタマイシンを含む SEIIプレートに塗り広 げ、 37°Cにて 1晚培養したのち、培地表面約 0.3平方センチメートルの菌体を力きとつ て 50mg/Lのストレプトマイシンおよび 20mg/Lのゲンタマイシンを含む SEII生産培地（ 5ml)に植菌し、 37°Cにて 48時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により 除去し、培養上清に含まれる L—リジン濃度をバイオテックアナライザー AS-210(サク ラ精機製)で定量し、 L-リジンを最も多く含む株を選択した。この株を # 403— l lGm と命名した。
実施例 8
< #403-11-Gmにおける転移位置の決定 >
次に、 # 403— l lGm株の染色体上で mi -Muカセットが転移している位置を決定 した。 # 403— 11株の染色体 DNAを調製し、これを制限酵素 Sailにて完全分解した 。これを pHSG398ベクターに連結し、 12.5mg/Lのクロラムフエ-コール及び 25mg/Lの ゲンタマイシンを含む LB寒天培地にて選択し、得られたコロニーよりプラスミド DNAを 調製した。このプラスミドには mini-Muカセット上のカナマイシン耐性遺伝子及びその 転移した位置の周辺の染色体 DNAがクローユングされている。これを、 min卜 Muカセ ットの右端に存在する attR内部に外向きにデザインしたシークェンシングプライマー（ attR-rl 5- catctgtttcatttgaagcgcgaaagcta- 3：配歹 U番号 12)を用いて塩基配列を決定 することで、染色体上に転移した mini-Muカセットの転移位置を決定した。この方法で 決定した転移位置の情報に基づ 、て # 403— 1 lGmと全く同一の株を構築すること も可能である。
実施例 9 [0069] < #403-l l-Gmからの薬剤而性マーカー除去 (pFLP31)、 #403-11株の取得 > く PAYCTER3の構築 >
PUC19のマルチクローユングサイトの配列を含有するようにデザインした配列番号 1 3 (5 -aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aagctta— 3 )と目歹 号 14 (5し gatctaagct tgcatgcctg caggtcgact ctagaggatc cccgggtacc gagctcg-3')〖こ g己 載の合成 DNAを、当業者に良く知られた方法でアニーリングさせてポリリンカ一を作 成した。このポリリンカ一は制限酵素 EcoRIと Bglllで切断後と同じ末端形状となる様に デザインしてある。更に、配列番号 15 (5'- ctatgatcat ttgcctggcg gcagtagcgc-3')と配 タ U番号上 6 (0— cttagatctcaaaaagagtttgtagaaacgc— 3ノに己载のプフイマ ~~を合成し、常 法に従って（斉藤、三浦の方法 [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)])調製した Es cherichia coli K-12株の染色体 DNAから rrnBのターミネータ一配列をコードする領 域を PCR法にて増幅した。配列番号 13のプライマーには制限酵素 Bglllの認識配列 を、配列番号 14のプライマーには制限酵素 Bellの認識配列をそれぞれデザインして ある。 PCR反応には Pyrobest DNA polymerase (宝バイオ社製）を用い、反応条件は 業者の推奨するプロトコルに従った。この PCR断片を制限酵素 Bglllと Bellで消化させ た後、この PCR断片と先程のポリリンカ一とをライゲーシヨンさせて約 400bpの DNA断 片を作成した。ライゲーシヨン反応には DNA Ligation Kit Ver.2.1 (宝バイオ社製）を 用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。次に、公知のプラスミドである pAYC32 (J. Gen. Microbiol, 137, 169-178 (1991))の制限酵素 EcoRIと BamHIで切り 出される約 9.2kbpの断片を回収し、先程の DNA断片を挿入する事により、 M.methyl otrophus NCIMB10515中で機能する発現用プラスミド pAYCTER3を構築した。なお、 この PAYCTER3は、 pAYC32中にコードされている strA遺伝子の 5'側上流配列を欠損 し、代わりに pUC19のマルチクローユングサイトと rrnBターミネータ一を持つ構造にな つている。
[0070] < pFLP31の構築 >
実施例 7にて構築した # 403— 1 lGm株のゲンタマイシン耐性遺伝子はあらカゝじめ 2個の FRT配列に挟まれる形でデザインしてあるため、ここに FLPリコンビナーゼを作 用させることでこの薬剤耐性遺伝子を染色体上力も除去することが可能である。上記 の方法で構築した PAYCTER3を BamHI-Smalにて消化し、ここに公知のプラスミド pCP 20(PROCEEDINGS OFTHE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNIT ED STATES OF AMERICA, (2000) 97, 6640- 6645)より FLPリコンビナーゼが含まれ る Smal-BamHIにて切り出した 3.3kbpの断片を挿入した。得られたプラスミドを pFLP31 と命名した。なお、 pCP20プラスミドは E.coli Genetic Stock Centerにて CGSC strain # 7629として登録されており入手可能である。
[0071] <薬剤耐性マーカーの除去 >
# 403— 1 lGmより当業者によく知られた方法で pAET7を脱落させストレプトマイシ ン感受性の株を取得した。この株に上記 pFLP31プラスミドをエレクト口ポレーシヨン法 により導入し、 50mg/Lのストレプトマイシン及び 0.5g/Lの L-メチォニンを含む SEII寒 天培地に塗布した。得られた株を適度な濃度になるように 50mg/Lのストレブトマイシ ン及び 0.5g/Lの L-メチォニンを含む SEII培地に懸濁し、これを 42°Cにて 1時間処理し た後、シングルコロニーを形成するように希釈した後に 50mg/Lのストレプトマイシン及 び 0.5g/Lの L-メチォニンを含む SEII寒天培地に塗布した。得られたコロニーからゲン タマイシン感受性を示す株を選択した。さら〖こ、この株より pAET7を脱落させてストレ プトマイシン感受性となった株を # 403— 11と命名した。この # 403— 11株および 対照として # 403株を 20mg/Lのカナマイシンを含み、 0.075g/Lの L-メチォニンおよ び 2.5g/Lのピルビン酸ナトリウムを含む SEII生産培地にて培養したところ Lys蓄積が 向上した。 # 403— 11株の Lys蓄積の相対値を # 403株の Lys蓄積を 100としたとき の値で表 3に示す。
[0072] [表 3] 株名 相対 Lys蓄積量 （％)
# 4 0 3 1 0 0
# 4 0 3— 1 1 1 0 8 実施例 10
[0073] < DDPS活性上昇の確認 > このようにして得られた # 403— 11株は染色体上に 8コピーの lysE24dapAカセット が転移している。そこで、 dapAにコードされるジヒドロジピコリン酸合成酵素の活性上 昇を # 403— 11株にて確認した。ジヒドロジピコリン酸合成酵素の活性測定は既知 の方法 (Journal of Biological Chemistry, 240, 4710-4716 (1965》を一部変更して行つ た。具体的には、反応溶液には 50mMの imidazole- HCl(pH 7.4)、 2mMの L- aspartate- β -semialdehyde, 2mMの sodium pyruvateおよび細胞抽出系を含むように調製し、最 終溶液量を lmlとした。結果を表 4に示す。
[0074] [表 4] 菌株名 比活性 （ミリユニット/ミリグラムタンパク質）
A S 1 1 2
# 4 0 3— 1 1 1 2 9 ,
1分間に 1マイクロモルの生成物を生成する酵素の量を 1ュ-ットと定義した。 実施例 11
[0075] < pBGEAプラスミドの構築、 #403-11/pBGEAの構築 >
(1) L-リジン生合成系酵素遺伝子 (dapA*)および L-リジン排出活性を持つ遺伝子 (lys E24)を搭載する pBGEAプラスミドの構築
メチロフイラス属細菌に dapA*および LysE24遺伝子を導入するために、公知のプラ スミド pBHRl (Antoine, R. and Locht, C, Molecular Microbiology, 6, 1785—99. (1992 ))を用いて、 dapA*および LysE24発現用プラスミド pBGEAを構築した。まず pBHRlを 制限酵素 Dralで消化し、フエノール'クロ口ホルム溶液をカ卩えて、混合し反応を停止さ せた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にて DNAを回収した 。回収した DNA断片を DNA Blunting kit (宝酒造社製）にて末端を平滑ィ匕した。
一方、 dapA*および LysE24遺伝子は、同遺伝子を含む公知プラスミド pRSlysEdapA( 特開 2003-61687号公報参照)より取得した。尚、 pRSlysEdapAプラスミドで形質転換さ れた E.coli JM109株は AJ13832と命名され、同株は 2001年 6月 4日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号 FERM P-18371として寄 託され、平成 14年 5月 13日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、 FERM B P- 8042の受託番号のもとで寄託されている。まず、 pRSlysEdapAを制限酵素 EcoRIお よび Bglllで消化し、フエノール'クロ口ホルム溶液をカ卩えて、混合し反応を停止させた 。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にて DNAを回収した後、 0.8%ァガロースゲル電気泳動にて目的 DNA断片を分離し、約 2.0Kbpの DNA断片を EASY TRAP ver.2 (DNA回収キット、宝酒造社製）を用いて回収した。得られた DNA 断片を BKL kit (宝酒造社製）にて末端を平滑化、リン酸ィ匕した。
上記のように調製した pBHRI消化物と dapA*および LysE24遺伝子領域断片を、 DN A Ligation Kit Ver.2 (宝酒造社製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でェシャ リヒア 'コリ (E.coli JM109 competent cells,宝酒造社製)を形質転換し、 20mg/Lのカナ マイシンを含む LB寒天培地に塗布し、 37°Cでー晚保温した。寒天培地上に出現した コロニーを 20mg/Lのカナマイシンを含む LB液体培地に接種し、 37°Cで 8時間振とう 培養した。アルカリ- SDS法にて各培養液カゝらプラスミド DNAを抽出し、制限酵素での 消化および塩基配列の決定により、構造を確認して、クロラムフエ二コール耐性遺伝 子の転写方向と dapA*および lysE24遺伝子の転写方向が同じ向きになっているもの を pBHR-EAとした。
上記のようにして得られた pBHR-EAにゲンタマイシン薬剤耐性マーカーを導入した プラスミド pBGEAを構築した。まず pBHR-EAを制限酵素 Ncolで消化し、フエノール'ク ロロホルム溶液を加えて、混合し反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層 を回収し、エタノール沈殿にて DNAを回収した。回収した DNA断片を DNA Blunting k it (宝酒造社製）にて末端を平滑ィ匕した。一方、ゲンタマイシン耐性遺伝子領域は、 公知プラスミド pML122(Monika Labes, Alfred Puhler, and Reinhard Simon, Gene, 89, (1990),37- 46)を铸型 DNAとして、プラィマーpGm-f(配列番号17 : 5- CGCCAGCCA GGACAGAAATGC-3)および pGm- r (配列番号 18 : 5- GTCCAGCGGTTTTTCTTG GGCT- 3)を用いて PCR (変性 94°C- 10秒、アニーリング 60°C-30秒、伸長反応 72°C-9 0秒）により増幅した。 PCR反応には Pyrobest DNA polymerase (宝酒造社製）を用い た。得られたゲンタマイシン耐性遺伝子断片を BKL kit (宝酒造社製）にて末端を平 滑化、リン酸化した。
上記のように調製した pBHR-EA消化物とゲンタマイシン耐性遺伝子領域断片を、 D NA Ligation Kit Ver.2 (宝酒造社製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でェシ エリヒア'コリ (E.coli JM109 competent cells,宝酒造社製)を形質転換し、 20mg/Lのゲ ンタマイシンを含む LB寒天培地に塗布し、 37°Cでー晚保温した。寒天培地上に出現 したコロニーを 20mg/Lのゲンタマイシンを含む LB液体培地に接種し、 37°Cで 8時間 振とう培養した。アルカリ- SDS法にて各培養液カゝらプラスミド DNAを抽出し、制限酵素 での消化および塩基配列の決定により、構造を確認して、 pBGEAを得た。実施例 9で 作成した染色体上に lysE24および dapA*の遺伝子が組み込まれた株である # 403— 11株にこの pBGEAをさらに導入して lysE24および dapA*遺伝子の強化を行った。こ の株を # 403— 11/pBGEA株とした。この # 403— 11/pBGEA株および対照として # 403— 11株を 20mg/Lのカナマイシン、 50mg/Lのゲンタマイシンを含み (対照株の 培地はゲンタマイシンを含まな 、)、 0.075g/Lの L-メチォニンおよび 2.5g/Lのピルビン 酸ナトリウムを含む SEII生産培地にて培養したところ Lys蓄積が向上した。 # 403— 1 Ι/pBGEA株の Lys蓄積の相対値を # 403— 11株の Lys蓄積を 100としたときの値で 表 5に示す。プラスミドの導入により # 403— 11株の Lys生産量は向上した。
[0076] [表 5] 株名 相対 Lys蓄積量 （％)
# 4 0 3— 1 1 1 0 0
# 4 0 3— 1 1 /pBGEA 1 1 1 実施例 12
[0077] < pRSlysA、 pRSddh、 pRSdapB、 pRSasd、 pRSaskプラスミドの構築および各プラスミド の #403-11/pBGEA株への導入及び L-リジン生産性の評価 >
次に、各 Lys生合成系遺伝子を搭載した発現用プラスミドの構築および #403-11/p BGEA株への導入及び Lys生産性へ与える影響を調べた。
< 1 >pRSlysAプラスミドの構築
メチロフィラス.メチロトロファスのジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子 (lysA) は既知の配列 (国際公開 WO/2000061723の配列番号 13)をもとに作成した 2種のオリ ゴヌクレオチドプライマーを用いた PCR法により、メチロフィラス'メチロトロファスの染 色体 DNAを铸型としてそれぞれ得た。プライマーは plysA-f (配列番号 19： 5 -AAAC CCGGGGATCCTGAGCGCCAATACCCTCAAACGCCT-3')および plysA- r (配列
')を用い、 PCRの条件は変性 94°C-20秒、アニーリング 55°C-30秒、伸長反応 72°C-6 0秒のサイクルを 25サイクルで行った。増幅された M.methylotrophusの lysA遺伝子断 片をプライマーにあらかじめデザインしておいた Sse8387I_XbaIに消化し、これを既知 のプラスミド pRStac (特開 2003-61687)を Sse8387I-XbaIにて消化したものと連結した。 このプラスミドを pRSlysAと命名した。
[0078] < 2>pRSddh
ブレビバタテリゥム ラタトフアーメンタムのジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 (ddh)をコリネバタテリゥム 'グルタミカム（Corynebacterium glutamicum)の ddhの既知 の塩基配列 (Ishino, S. et al.， Nucleic acid res., 15, 3917 (1987))をもとに作成した 2 種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた PCR法により、ブレビバタテリゥム ラタトフ アーメンタム 2256株 (ATCC13869株）の染色体 DNAを铸型として増幅することによつ て得た。プライマーは pddh- f (配列番号 21 : 5'- ACCCCTGCAGGGCCACCACAATT TTGGAGGATTACAAGAAC-3')および pddh- r (配列番号 22： 5'- TCCTCTAGACT CGAGCTAAATTAGACGTCGCGT- 3，）を用い、 PCRの条件は変性 94°C- 20秒、了二 一リング 55°C-30秒、伸長反応 72°C- 60秒のサイクルを 25サイクルで行った。増幅され た ddh遺伝子断片をプライマーにあらかじめデザインしておいた Sse8387I_XbaIに消 化し、これを既知のプラスミド pRStac (特開 2003-61687)を Sse8387I-XbaIにて消化した ものと連結した。このプラスミドを pRSddhと命名した。
[0079] <3>pRSdapB
E.coliのジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子 (dapB)を既知の塩基配列をもとに 作成した 2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた PCR法により、 E.coli染色体 DNA を铸型として増幅した。プライマーは pdapB-f (配列番号 23： 5'- GCGCCTGCAGGCG CTGGTTACTCTGAAAACGGTCT-3')および pdapB- r (配列番号 24： 5'- GCATCT 条件は変性 94°C- 20秒、アニーリング 55°C- 30秒、伸長反応 72°C- 60秒のサイクルを 2 5サイクルで行った。増幅された dapB遺伝子断片をプライマーにあらカゝじめデザインし ておいた Sse8387卜 Xbalに消化し、これを既知のプラスミド pRStac (特開 2003- 61687)を Sse8387I-XbaIにて消化したものと連結した。このプラスミドを pRSdapBと命名した。
[0080] <4>pRSasd
E.coliのアスアパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子 (asd)を既知の塩基 配列をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた PCR法により、 E.col i染色体 DNAを铸型として増幅した。プラィマーは &3(1ィ(配列番号25 : 5'- GCCCCT GCAGGCCGGCACATTTATACAGCACACATCTTTG -3，）および pasd- r (配列番 号 26 : 5'— TAATCTAGAAAGATTACGCCAGTTGACGAAGCATC—3，）を用い、 PC Rの条件は変性 94°C- 20秒、アニーリング 55°C- 30秒、伸長反応 72°C- 60秒のサイクル を 25サイクルで行った。増幅された ddh遺伝子断片をプライマーにあら力じめデザィ ンしてお 、た Sse8387I- Xbalに消化し、これを既知のプラスミド pRStac (特開 2003- 6168 7)を Sse8387I-XbaIにて消化したものと連結した。このプラスミドを pRSasdと命名した。
[0081] <5>pRSask
メチロフィラス ·メチロト口ファスのァスバルトキナーゼ遺伝子 (ask)は既知の配列 (国 際公開 WO/2000061723の配列番号 5)をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチドブラ イマ一を用いた PCR法により、メチロフィラス'メチロトロファスの染色体 DNAを铸型とし てそれぞれ得た。プラィマーは &31^-1>(配列番号27 : 5'- AGGGAATTCTAAACCGG ATATGGCGATGGCAGGTGGTACT -3')ぉょび &31^ （配列番号28 : 5'- TAACT GCAGGAAGTTTTAATAGTACCAACACAGCGCATG -3，）を用い、 PCRの条件は 変性 94°C-20秒、アニーリング 55°C- 30秒、伸長反応 72°C- 90秒のサイクルを 25サイク ルで行った。増幅された M.methylotrophusの ask遺伝子断片をプライマーにあらかじ めデザインしてお 、た EcoRI-Pstlに消化したのち平滑末端化し、これを既知のプラス ミド pRStac (特開 2003-61687)を Sse8387Iにて消化したのち平滑末端化したものと連結 した。このプラスミドを pRSaskと命名した。
[0082] く 6〉各プラスミドの導入'評価
上記のように作成した 5種類のプラスミドを実施例 11で作成した # 403— 11/pBGE A株にそれぞれ導入した株を作成し、 0.075g/Lの L-メチォニンおよび 2.5g/Lのピルビ ン酸ナトリウムを含む SEII生産培地にて培養した力 いずれの株でも Lys生産性の向 上は見られなかった。 ddhを導入した株では Lys生産性が低下した。
実施例 13
< ddh+lysA組み合わせ強化、 pDAプラスミドの構築および L-リジン生産性の評価 > M.methylotrophusにおける Lys生産向上に効果のある lysE24および dapA*遺伝子 発現を染色体上への遺伝子の組み込み及びプラスミド導入にて十分強化した株であ る # 403— 11株を用いて、 Lys生産の次の律速点を調べるために実施例 12に示し たように各遺伝子を単独で増強して効果を調べたが、効果の見られた遺伝子は見出 されなかった。そこで、我々は遺伝子を 2つずつ搭載した組み合わせ強化用のプラス ミドを種々構築し、これを # 403— 11株に導入して評価したところ、 lysAおよび ddhを 組み合わせて強化すると L-リジン生産性が向上することを見出した。
これは ddhにコードされるジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼはジアミノピメリン酸の生 成方向と分解方向の両方向の反応を可逆的に触媒する酵素であり、 ddh単独での強 化はジアミノピメリン酸の生成ではなく分解を促進したためではないかと考えられた。 一方、このジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼに続くジアミノピメリン酸デカルボキシラ ーゼは脱炭酸反応であり L-リジンの生成方向にしか反応が進行しない不可逆的酵 素である。このジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼおよびジアミノピメリン酸デカルボキ シラーゼを同時に強化することでジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼによるジアミノピメ リン酸の分解を防ぎ、逆にジアミノピメリン酸の合成を促進されたためであると考えら れた。
具体的には pRSddhプラスミドを Saplにて消化し、平滑末端処理して脱リン酸化した ものをベクターとし、これに PCR増幅した tacプロモータ領域を含む lysA遺伝子領域 D NA断片を挿入した。 PCR増幅の铸型には pRSlysAプラスミドを用い、プライマーは pta c- f (配列番号 29： 5'- AAAAGATCTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGA C -3，）および plysA- r (配列番号 20： 5'- TTTCCCGGGCTTGGCGGCTTCGGTTTT TTTATTAGGGGTTGCC- 3')を用い、 PCRの条件は変性 94°C- 20秒、アニーリング 5 5°C_30秒、伸長反応 72°C- 60秒のサイクルを 25サイクルで行った。この PCR増幅断片 を Xbalにて消化後、平滑末端処理したものを上記ベクターと連結した。得られたブラ スミドは ddhと lysA遺伝子の転写の向きが同じであり、このプラスミドを pDAと命名した。 この pDAプラスミドを # 403 - 11/pBGEA株に導入した株 ( # 403 - 11/pBGEA/pD A)および対照として # 403— 11/pBGEA株を 20mg/Lのカナマイシン、 50mg/Lのゲ ンタマイシンおよび、 50mg/Lのストレプトマイシンを含み (対照株の培地はストレプトマ イシンを含まな!/、)、 0.075g/Lの L-メチォニンおよび 2.5g/Lのピルビン酸ナトリウムを 含む SEII生産培地にて培養したところ Lys蓄積が向上した。 # 403— 11/pBGEA/pD A株の Lys蓄積の相対値を # 403— 11/pBGEA株の Lys蓄積を 100としたときの値で 表 6に示す。
[0084] [表 6] 株名 相対 Lys蓄積量 （％)
# 4 0 3— 1 1 /pBGEA 1 0 0
# 4 0 3— 1 1 /pBGEA/pDA 1 2 0 実施例 14
[0085] <更なる L-リジン生合成遺伝子の組み合わせ強化、 pBDAS(lysA+ddh+dapB+asd)の 構築および L-リジン生産性の評価 >
生合成経路上の 2つの連続する反応を触媒する酵素遺伝子である ddhおよび lysA を組み合わせて強化すると L-リジン生産性が向上した。我々は ddh + lysAにさらに種 々の酵素遺伝子を追加して組み合わせ強化を検討した結果、 ddhおよび lysAにさら に dapB、 asdを組み合わせることで L-リジン蓄積が向上することを見出した。
具体的には pRSdapBプラスミドを EcoRIにて消化し、これを平滑末端処理、脱リン酸 化処理したものをベクターとした。これを pDAプラスミドを Hpal-Saplにて消化し、それ ぞれ遺伝子の上流に tacプロモーターを含む lysAおよび ddhを含む 2.5kbpの DNA断 片を切り出し、平滑末端処理したものと連結して pBDAプラスミドを構築した。このブラ スミドは dapBの上流に ddh,lysA遺伝子が dapBと同じ向きになるように挿入されていた 。さらにこの pBDAプラスミドを Saplにて消化し、平滑末端処理、脱リン酸化処理したも のをベクターとし、これに PCR増幅した tacプロモータ領域を含む asd遺伝子領域 DNA 断片を挿入した。 PCR増幅の铸型には pRSasdプラスミドを用い、プライマーは ptac-f および pasd- rを用い、 PCRの条件は変性 94°C- 20秒、アニーリング 55°C- 30秒、伸長 反応 72°C-90秒のサイクルを 25サイクルで行った。この PCR増幅断片を平滑末端処 理、リン酸ィ匕処理したものを上記ベクターと連結した。こうして得られたプラスミドを pB DASと命名した。この pBDASプラスミドを # 403— 11/pBGEA株に導入した株 ( # 40 3- 11/pBGEA/pBDAS)および対照として # 403— 11/pBGEA株を 20mg/Lのカナ マイシン、 50mg/Lのゲンタマイシンおよび、 50mg/Lのストレプトマイシンを含み (対照 株の培地はストレプトマイシンを含まない) 0.075g/Lの L-メチォニンおよび 2.5g/Lのピ ルビン酸ナトリウムを含む SEII生産培地にて培養したところ Lys蓄積が向上した。 # 40 3- 11/pBGEA/pBDAS株の Lys蓄積の相対値を # 403— 11/pBGEA株の Lys蓄積 を 100としたときの値で表 7に示す。
[0086] [表 7] 株名 相対 Lys蓄積量 （。/n)
# 4 0 3— 1 1 /pBGEA 1 0 0
# 4 0 3— 1 1 /pBGEA/pDA 1 2 0
# 4 0 3— 1 1 /oBGEA/pRDAS 1 4—3 実施例 15
[0087] < pCBDAS(lysA+ddh+dapB+asd+lysC)の構築および #403- 11/pBGEA株への該プラ スミドの導入及び L-リジン生産性の評価 >
pBDASプラスミドに次の生合成遺伝子を導入するためには適当な制限酵素サイト が見出せず、次の遺伝子を搭載することが困難であったため、まず PMW119ベクター 上に目的の遺伝子をクローユングし、それをまとめて切り出す形でこの問題を解決し た。まず、 pMW119ベクターを Xbalにて消化し、これに pRSdapBより Xbalにて切り出し た Ptac+dapBを含む DNA断片を連結した。次に、このプラスミドを BamHIにて消化し、 平滑末端処理、脱リン酸ィ匕処理したものをベクターとし、これに pDAプラスミドを Hapl- Saplにて切り出した Ptac+ddh+Ptac+lysAを含む DNA断片を連結した。このプラスミドを Smalにて消化し、脱リン酸ィ匕したものをベクターとし、実施例 14と同様にして調製した Ptac+asdを含む DNA断片を連結した。このようにして構築したプラスミドを pMWBDAS と命名した。このプラスミド上では ddh,lysA,asdが同じ向きで dapBのみが逆向きを向い ている。また遺伝子の搭載順序は pMWl 19上の lacプロモーター方向から、 dapB, ddh , lysA, asdの順である。このプラスミドを Sall-Saclにて消化すると dapB, ddh, lysA, asd をそれぞれ力 ¾acプロモーターを含む形で切り出すことができる。この断片を上記 pRS askプラスミドを Sapl〖こて消化し、平滑末端処理したものと連結することで、 pCBDASを 構築した。この pCBDASプラスミドを # 403— 11/pBGEA株に導入した株（ # 403— 1 1/pBGEA/pCBDAS)を 20mg/Lのカナマイシン、 50mg/Lのゲンタマイシンおよび、 50 mg/Lのストレプトマイシンを含み (対照株の培地はストレプトマイシンを含まな 、)、 0.0 75g/Lの L-メチォユンおよび 2.5g/Lのピルビン酸ナトリウムを含み、硫酸アンモ-ゥム の最終濃度が 6g/Lとなるように硫酸アンモ-ゥムを追加添加した SEII生産培地にて 培養したところ Lys蓄積が向上した。 # 403— 11/pBGEA/pBDAS株の Lys蓄積の相 対値を # 403— 11/pBGEA株の Lys蓄積を 100としたときの値で表 8に示す。
[0088] [表 8] - 相対 Lys蓄積量 （％)
# 4 0 3— 1 1 /pBGEA 1 0 0
# 4 0 3— 1 1 /pBGEA/pDA 1 2 0
# 4 0 3— 1 1 /pBGEA/pBDAS 1 4 3
# 4 0 3— 1 1 /PBGEA/DCBDAS 1 6 0 一
実施例 16
[0089] <薬剤耐性マーカー除去可能型生産菌の再構築 (V12S a )のための転移ユニット構 築および V12S α株（lysE24+dapA*遺伝子増幅株）の構築 >
次に、細胞内に完全に薬剤耐性遺伝子マーカーを含まず、染色体上にて Lys生合 成遺伝子を組み込んだ株を取得するための方法を示す。実施例 6で示した、 pMIV- FRTKmFRTを Smalにて消ィ匕し、ここに PCR増幅した lysE+dapA*断片を挿入した。 lyS E24+dapA*断片は実施例 6に示した方法で取得した。得られたプラスミド pMIV_FRT KmFRT- EAと命名した。これは実施例 6で示した pMIV-FRTGmFRT- EAとは薬剤耐 性遺伝子が異なる。
まず、 M.methylotrophusの野生株である AS 1 (NCIMB 10515)株に実施例 1に記載の pAET7プラスミドを導入し、形質転^ ¾を 50mg/Lのストレプトマイシンを含む SEII寒天 培地で選択した。この株に実施例 2で示した方法にて pMIV-FRTKmFRT- EAプラスミ ドをエレクト口ポレーシヨン法によって導入し、染色体上に lysE24+dapA*遺伝子を含 む mini- Muカセット（EAユニット）が転移した株を 50mg/Lのストレプトマイシンおよび 20 mg/Lのカナマイシンを含む SEII寒天培地にて選択した。これらの株より無作為に 200 株を選択し、 50mg/Lのストレプトマイシンおよび 20mg/Lのカナマイシンを含む SEIIプ レートに塗り広げ、 37°Cにて 1晚培養したのち、培地表面約 0.3平方センチメートルの 菌体をかきとって 50mg/Lのストレプトマイシンおよび 20mg/Lのカナマイシンを含む S ΕΠ生産培地 (5ml)に植菌し、 37°Cにて 34時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠 心分離により除去し、培養上清に含まれる L—リジン濃度をバイオテックアナライザー AS-210(サクラ精機製)を用いて定量し、 L-リジンを最も多く含む株を選択した。この 株を VIと命名した。実施例 3に示したのと全く同じ方法で転移を 12回繰り返して行 ヽ 、 V12株を取得した。 V12株の Lys蓄積の相対値を VI株を 100としたときの相対値で 表 9に示した。
[0090] [表 9] 株名 相対 Lvs蓥精畺 ）
VI 1 0 0
V12 1 0 6 6
[0091] 次に、実施例 4に示した方法と完全に同一の方法で V12株染色体上の mini-Mu力 セットの転移位置を決定した。この情報に基づいて V12株と全く同一の株を構築する ことも可能である。
[0092] 次に、 V12株に実施例 9で示した pFLP31プラスミドを導入し、同じく実施例 9に記載 の方法にて染色体上の mini-Muカセットからカナマイシン耐性遺伝子領域を除去した 。この操作によって得られたカナマイシン感受性株を V12S aと命名した。この V12S a は AJ110196と命名され、同株は 2005年 10月 12日に独立行政法人産業技術総合研 究所特許生物寄託センター（干 305-5466 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)にブダペスト条約に基づく国際寄託として、 FERM BP-10434の受託番号の もとで寄託されている。
実施例 17
< lysE24+dapA*+lysA+ddh+dapB+asd+lysC転移ユニットの構築 >
実施例 15で示したように lysE24+dapA*の強化に加えて各種 Lys生合成系遺伝子を 強化することで Lys生産性が大きく向上することがわ力つているので、次に染色体上 にこれらの遺伝子を組み込むためのプラスミド構築を行った。まず、 pMIV-FRTKmFR Tを EcoRIにて消化し、平滑末端化、脱リン酸化処理し、ここに PCR増幅した lysE24+d apA*断片を挿入し pMIV- FRTKmFRT- EA#1を構築した。このプラスミドを Smalにて消 化し、脱リン酸ィ匕処理したものをベクターとし、 PCR増幅した Ptac+dapB断片を挿入し た。 PCR増幅の铸型には pRSdapBプラスミドを用い、プライマーは ptac- 1¾よび pdapB -rを用い、 PCRの条件は変性 94°C- 20秒、アニーリング 55°C- 30秒、伸長反応 72°C-9 0秒のサイクルを 25サイクルで行った。この PCR増幅断片を平滑末端処理、リン酸ィ匕 処理を行ったものを上記ベクターと連結し、 pMIV-FRTKmFRT- EAB#1を取得した。こ のとき dapAと dapB遺伝子の転写方向が同じ向きであった。次に、このプラスミドを Hin dillにて消化し、平滑断片化、脱リン酸ィ匕し、ここに実施例 14に記載の方法で切り出 した lysAおよび ddhを含む DNA断片を連結し、 pMIV-FRTKmFRT- EABDA#12を取得 した。 ddh遺伝子の転写の向きは dapA,dapBと逆向きであった。このプラスミドを Sailに て消化し、平滑断片化、脱リン酸ィ匕し、ここに実施例 14に記載の方法で調製した tac プロモーター領域を含む asd遺伝子領域 DNA断片を挿入した。このとき、 asd断片を 平滑断片にて挿入しているため、 asd断片力 ¾個挿入されたプラスミドが得られ、これ を pMIV- FRTKmFRT- EABDAS#10を構築した。 asd遺伝子は 2個とも dapA,dapBと逆 向きであった。最終的に得られた pMIV- FRTKmFRT- EABDAS#10上での各遺伝子 の配置は lysE, dapA, dapB, asd, asd, lysA, ddhの順序になった。以上のようにして染 色体上に 6種類の遺伝子カセットを転移させるために用いるプラスミドを構築した。 実施例 18 [0094] < lysE24+dapA*+lysA+ddh+dapB+asd+lysC増幅株（Vmac3株、 Vmac3S株）の構築と L -リジン生産性の評価 >
実施例 16にて取得した V12S aに pAET7を導入し、これに pMIV- FRTKmFRT- EAB DAS#10プラスミドを導入し、実施例 16と同様の方法にて V12S α株の染色体上に lys E, dapA, dapB, asd, lysA, ddh遺伝子を挿入した株を取得した。無作為に抽出した 2 00株を 50mg/Lのストレプトマイシンおよび 20mg/Lのカナマイシンを含む SEII生産培 地にて培養し、 L-リジンの蓄積が最も高カゝつた株を選択し、この株を Vmaclと命名し た。この Vmacl株からストレプトマイシン感受性株を選択することで、 pAET7が脱落し た株を取得した。この株に実施例 9で示した pFLP31プラスミドを導入し、同じく実施例 9に記載の方法にて染色体上の mini-Muカセットからカナマイシン耐性遺伝子領域を 除去した。この操作によって得られたカナマイシン感受性株を VmaclS株と命名した。 この VmaclS株よりストレプトマイシン感受性株を選択することで pFLP31プラスミドが脱 落した株を取得し、ここに再び pAET7プラスミドを導入し、この株に再び pMIV-FRTK mFRT-EABDAS#10プラスミドを導入し、同様にして最も蓄積の高力つた株を選択し V mac2株と命名した。同様にして Vmac2S株、 Vmac3株、 Vmac3S株を取得した。 Vmac3 S株の Lys蓄積の相対値を V12株の Lys蓄積を 100としたときの相対値で表 10に示し た。
[0095] [表 10] 株名 相対 Lys蓄積量 （％)
V12 1 0 0
V12S a 1 0 0
Vmac3S 1 8 8 実施例 19
< metF欠損による L-Met要求性付与、 V3E2F株の構築と L_リジン生産性の評価 >
Vmac3S株に pBGEAプラスミドを導入したところさらに L-リジン蓄積が上昇し、 Vmac3 S株において lysE24+dapA*がさらなる高収率化に効果があることがわかったので、再 び染色体上に lysE24+dapA*の mini-Muカセットを組み込んだ。具体的には Vmac3S 株に pAET7を導入し、これに pMIV-FRTKmFRT-EAプラスミドを導入して、 50mg/Lの ストレプトマイシンおよび 20mg/Lのカナマイシンを含む SEII寒天培地上で選択するこ とで、 Vmac3S株の染色体上に lysE24 + dapA*が組み込まれた株を取得した。無作為 に抽出した 200株を 50mg/Lのストレプトマイシンおよび 20mg/Lのカナマイシンを含 む SEII生産培地にて培養し、 L-リジンの蓄積が最も高力つた株を選択し、この株を V mac3EAと命名した。実施例 3に示したのと全く同じ方法で転移を 3回繰り返して行 ヽ 、もっとも L-リジン蓄積の高力つた株を V3E2株と命名した。この株から既述の方法に て薬剤耐性マーカーを除去し、カナマイシン感受性とした株を V3E2Sと命名した。 次に、 VAE#8株にて L-リジン蓄積の向上に効果のあつた L-メチォニン要求性の付 与を行った。具体的には PCRにてお互いにオーバーラップ (重複)する領域を持つよう にデザインした 3種類の PCR増幅した DNA断片を混合して、これを铸型とした PCRを 再度行うことで目的遺伝子のほぼ中央部分にカナマイシン耐性遺伝子が挿入された ような遺伝子破壊用 DNA断片を調製した。断片 1 (N末端側断片）は M.methylotrophu sASl株の染色体 DNAを铸型とし、 PCRプライマーは metF- ihl (配列番号 30 : 5'- TGG ACTGACGGTGGCTACTC- 3')および metF- rn (配列番号 32： 5'- CCAGCCTACAC 用いた。 PCR条件は変性 94°C-30秒、アニーリング 60°C-30秒、伸長反応 72°C-30秒 のサイクルを 25サイクルで行った。断片 2 (C末端側断片）は同様に M.methylotrophus AS1株の染色体 DNAを铸型とし、 PCRプライマーは metF- rcl (配列番号 33 : 5'- TGC CAAATACGGGCTACTG-3')および metF- fc (配列番号 35： 5'- GAGAATAGGAAC
CR条件は変性 94°C-30秒、アニーリング 60°C-30秒、伸長反応 72°C-30秒のサイクル を 25サイクルで行った。断片 3 (Km耐性遺伝子断片）は pKD4プラスミドを铸型とし、 P CRプライマーは pKD- Kmf (配列番号 36： 5'- GCATTACACGTCTTGAGCGATTGT GTAGGC- 3，）および pKD- KmGmr (配列番号 37： 5'- CCTCCTTAGTTCCTATTCC GAAGTTCCTATTCTC- 3')を用いた。 PCR条件は変性 94°C- 30秒、アニーリング 60 °C-30秒、伸長反応 72°C- 30秒のサイクルを 25サイクルで行った。断片 1および 2を 1% の低融点ァガロースゲルにて分離し、 Promega社製の Wizard PCR Preps DNA purific ation sysytemにて精製した。各断片の濃度を測定し、断片 1, 2, 3の濃度が 2 : 2 : 1と なるように混合したものを铸型とし、 PCRプライマーは metF-lh2 (配列番号 31： 5'-GA CCACGTCATTTTCCCT- 3')および metF- rc2 (配列番号 34： 5'- TCCGGGCTCAAT TCACTC-3')を用いた。 PCR条件は変性 98°C- 20秒、伸長反応 68°C-3分のサイクル を 25サイクルで行った。この増幅には特に LA taqポリメラーゼ (タカラバイオ)を用いた 。このようにして増幅された DNA断片は metF遺伝子周辺の遺伝子断片のほぼ中央に カナマイシン耐性遺伝子が挿入された構造を持って 、る。この DNA断片を約 3マイク ログラム調製し、これを V3E2S株にエレクト口ポレーシヨン法によって導入した。回復培 養には 0.4g/Lの L-メチォニンを含む SEII液体培地を用い、これを 20mg/Lのカナマイ シン、 0.4g/Lの L-メチォニンおよび 2.5g/Lのピルビン酸ナトリウムを含む SEII寒天培 地に塗布した。出現したコロニーを L-メチォニンを含まな 、SEII寒天培地に塗布した とき生育することができない、すなわち L-メチォニン要求性を示す株を選択し、 V3E3 Fと命名した。この株を 0.075g/Lの L-メチォニンおよび 2.5g/Lのピルビン酸ナトリウム を含み、硫酸アンモ-ゥムの最終濃度が 6g/Lとなるように硫酸アンモ-ゥムを追加添 加した SEII生産培地にて培養したところ Lys蓄積が向上した。 V3E2F株の Lys蓄積の 相対値を Vmac3Sの Lys蓄積を 100としたときの値で表 11に示す。 L-リジン蓄積が向 上したのは L-メチォニン要求性付与によって菌体生成量が抑制された結果であると 思われる。表 12には野生株および V3E2F株の dapA活性について示した。
[0097] [表 11] 株名 相対 Lys蓄積量 （％)
Vmac3S 1 0 0
V3E2 1 2 8
V3E2F 1 5 0
[0098] [表 12] 菌株名 比活性 （ミリユニット/ミリグラムタンパク質)
A S 1 1 2
V3E2F 1 8 8
1分間に 1マイクロモルの生成物を生成する酵素の量を 1ュニットと定義した。 実施例 20
く pBG- lysCプラスミドの構築、 V3E2F/pBGlysC株の構築と L-リジン生産性の評価 > これまでの検討で、 M.methylotrophusにお!/、てァスバルトキナーゼ活性を増強する と L-リジンの生産性が向上することがわ力つてきた力 実施例 15で示したようにこれ までは M.methylotrophus由来の野生型の AKの増強を行ってきた。し力し、この ask遺 伝子にコードされるァスバルトキナーゼ活性は L-リジンおよび L-スレオニンによって フィードバック阻害を受けることがわかっている。 L-リジン生産性を向上させるために は L-リジンや L-スレオニンによるフィードバック阻害を受けないほうが望ましい。そこ で、 E.coli由来のァスバルトキナーゼで L-リジンによるフィードバック阻害を受けない 変異型 ΑΚΠΙを用いた。 L-リジンによるフィードバック阻害が解除された変異型 ΑΚΠΙを コードする変異型 lysCは既知の配列をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチドプライ マーを用いた PCR法により、公知のプラスミドである RSFD80 (WO95/16042号）を铸型 として得た。プラィマーは じ-1"(配列番号38 : 5'- GAACCTGCAGGCCCTGACA CGAGGTAGATTATGTC -3')ぉょび じ （配列番号39 : 5'- CTTTCGGCTAGA
PCRの条件は変性 94°C- 20秒、アニーリング 55°C- 30秒、伸長反応 72°C- 90秒のサイ クルを 25サイクルで行った。これをあらかじめプライマーにデザインしてお!/、た Sse838 71および Saplにて消化し、既知のプラスミド pRStac (特開 2003- 61687)を Sse8387I-SapI にて消化したものと連結した。このプラスミドを pRSlysC*と命名した。次に、この pRSlys C*を EcoR卜 Saplにて消化し、 tacプロモーター配列を含む lysC*断片を切り出し、これ を公知のプラスミド pBHRlを制限酵素 Dralで消化し平滑末端化、脱リン酸化処理した ものと連結した。このプラスミドを pBHR-lysCプラスミドと命名した。これを Ncolにて消 化し、平滑末端化、脱リン酸ィ匕したものをベクターとし、ここに実施例 11に記載の方 法で調製したゲンタマイシン耐性遺伝子断片を挿入し、 pBGlysCプラスミドを構築し た。この pBGlysCプラスミドを実施例 19で作成した V3E2F株に導入したところ、 L-リジ ン蓄積の向上が観察された。また、この V3E2F/pBGlysC株にさらに公知の pRSlysEda pA (特開 2003-61687号公報参照)を導入することでさらに L-リジン生産量は向上した 。この V3E2F/pBGlvsC株および V3E2F/pBGlysC/pRSlysEdapA株を 50mg/Lのゲンタ マイシンおよび 50mg/Lのストレプトマイシンを含み (対照株の培地はいずれをも含ま ない)、 0.08g/Lの L-メチォニンおよび 2.5g/Lのピルビン酸ナトリウムを含み、硫酸アン モ-ゥムの最終濃度が 6g/Lとなるように硫酸アンモ-ゥムを追カ卩添カ卩した SEII生産培 地にて培養したところ Lys蓄積が向上した。このときの Lys蓄積の相対値を V3E2Fの Ly s蓄積を 100としたときの相対値で表 13に示す。
[0100] [表 13] 株名 相対 Lys蓄積 （％)
V3E2F 1 0 0
V3E2F/pBGlysC 1 1 5
V3E2F/DBG1 V_SC/D_RS 1 vsEdapA 1 3 2 産業上の利用の可能性
[0101] 本発明により、メタノール資化性細菌による L リジンの生産性を向上させることが できる。

Claims

請求の範囲
[1] L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコード する DNA、および、メタノール資化性細菌に導入したときに L—リジンの細胞外への 排出を促進する変異型 LysEタンパク質をコードする DNAを保持し、ジアミノピメリン 酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリン酸レダ クターゼおよびァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの細胞内活性が増強さ れるように改変されたメタノール資化性細菌。
[2] L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたァスバルトキナーゼをコードする DNA をさらに保持することを特徴とする請求項 1に記載のメタノール資化性細菌。
[3] 前記各酵素もしくは変異型 LysEタンパク質をコードする DNAが染色体 DNA上に組 み込まれたこと、および Zまたは前記各酵素もしくは変異型 LysEタンパク質をコード する DNAを含むプラスミドで形質転換されたことを特徴とする、請求項 1または 2に記 載のメタノール資化性細菌。
[4] ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする DNA、ジヒドロジピコリン酸レダクタ一ゼをコ ードする DNA、ァスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする DNA、およ びァスバルトキナーゼをコードする DNAがェシエリヒア属細菌由来であり、ジアミノピメ リン酸デカルボキシラーゼをコードする DNA力メチロフイラス属細菌由来であり、かつ ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする DNAおよび変異型 LysEをコードする D NAがブレビパクテリゥム属細菌由来である、請求項 3に記載のメタノール資化性細菌
[5] メチロフイラス属細菌である、請求項 1〜4のいずれか一項に記載のメタノール資化性 細菌。
[6] メチロフィラス'メチロトロファス AJ110196株（FERM BP-10434)由来の微生物である、 請求項 1〜5のいずれか一項に記載のメタノール資化性細菌。
[7] 請求項 1〜6のいずれか一項に記載のメタノール資化性細菌を培地で培養し、該培 地又は菌体内に L—リジンを生産蓄積させ、該培地又は菌体内から L—リジンを採取 することを特徴とする L—リジンの製造法。
[8] 前記培地力 タノールを主たる炭素源とすることを特徴とする請求項 7記載の Lーリジ ンの製造法。
メチロフィラス.メチロト口ファス AJl 10196株（FERM BP- 10434)
PCT/JP2007/051796 2006-02-02 2007-02-02 メタノール資化性細菌を用いたｌ－リジンの製造法 WO2007088970A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07713790.9A EP1990406B1 (en) 2006-02-02 2007-02-02 Method for production of l-lysine using methanol-utilizing bacterium
US12/184,598 US8017363B2 (en) 2006-02-02 2008-08-01 Method for production of L-lysine using methanol-utilizing bacterium

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006025617A JP2009089603A (ja) 2006-02-02 2006-02-02 メタノール資化性細菌を用いたｌ−リジンの製造法
JP2006-025617 2006-02-02

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/184,598 Continuation US8017363B2 (en) 2006-02-02 2008-08-01 Method for production of L-lysine using methanol-utilizing bacterium

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007088970A1 true WO2007088970A1 (ja) 2007-08-09

Family

ID=38327538

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/051796 WO2007088970A1 (ja) 2006-02-02 2007-02-02 メタノール資化性細菌を用いたｌ－リジンの製造法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US8017363B2 (ja)
EP (1) EP1990406B1 (ja)
JP (1) JP2009089603A (ja)
WO (1) WO2007088970A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115044521A (zh) * 2021-03-09 2022-09-13 大象株式会社 L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l-赖氨酸的生产方法
EP3986909A4 (en) * 2019-06-21 2023-08-02 Inscripta, Inc. GENOME-WIDE RATIONAL DESIGNED MUTATIONS LEADING TO INCREASED LYSINE PRODUCTION IN E. COLI

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2004124226A (ru) * 2004-08-10 2006-01-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Использование фосфокетолазы для продукции полезных метаболитов
US7794989B2 (en) * 2004-12-28 2010-09-14 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
CN103773745B (zh) 2012-10-18 2018-03-23 中粮生物化学（安徽）股份有限公司 天冬氨酸激酶iii突变体及其宿主细胞和应用
WO2014185430A1 (ja) 2013-05-13 2014-11-20 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
US10400257B2 (en) 2014-10-09 2019-09-03 Cathay R&D Center Co., Ltd Expression of recombinant tetracycline efflux pumps for the production of lysine or lysine-derived products, and methods and applications thereof

Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS49125590A (ja) 1973-04-10 1974-12-02
JPS5025790A (ja) 1973-07-18 1975-03-18
JPS5218886A (en) 1975-08-01 1977-02-12 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Production of amino acids by fermentation process
JPS5618596A (en) 1979-07-23 1981-02-21 Ajinomoto Co Inc Production of l-lysine through fermentation process
JPS6087788A (ja) 1983-08-29 1985-05-17 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ―アミノ酸の製造法
JPH01215280A (ja) 1988-02-23 1989-08-29 Showa Denko Kk 微生物の改良
JPH02109985A (ja) 1988-02-22 1990-04-23 Eurolysine 細菌染色体上ヘの目的遺伝子の組み込み方法及び該方法によって得られた細菌
JPH03505284A (ja) 1989-04-10 1991-11-21 リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・ミネソタ メチロトロフィック・バチルスによるアミノ酸の製造
JPH0491793A (ja) 1990-08-02 1992-03-25 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるアミノ酸の製造法
JPH06102028B2 (ja) 1985-10-04 1994-12-14 協和醗酵工業株式会社 アミノ酸の製造法
WO1995011985A1 (fr) 1993-10-28 1995-05-04 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production d'une substance
WO1995016042A1 (fr) 1993-12-08 1995-06-15 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production de l-lysine par fermentation
WO1996040934A1 (fr) 1995-06-07 1996-12-19 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production de l-lysine
WO1997023597A2 (de) 1995-12-22 1997-07-03 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur mikrobiellen herstellung von aminosäuren durch gesteigerte aktivität von exportcarriern
EP1016710A2 (en) 1998-12-30 2000-07-05 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids
WO2000061723A1 (fr) 1999-04-09 2000-10-19 Ajinomoto Co., Inc. Bacteries produisant du l-amino acide et procede de production de l-amino acide
WO2001053459A1 (fr) 2000-01-21 2001-07-26 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production de l-lysine
EP1266966A2 (en) 2001-06-12 2002-12-18 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-lysine or L-arginine by using methanol assimilating bacterium
JP2003061687A (ja) * 2001-06-12 2003-03-04 Ajinomoto Co Inc メタノール資化性菌を用いたｌ−リジン又はｌ−アルギニンの製造法
JP2004166592A (ja) * 2002-11-20 2004-06-17 Ajinomoto Co Inc メチロトローフを用いたｌ−アミノ酸の製造法
JP2004166594A (ja) 2002-11-20 2004-06-17 Ajinomoto Co Inc メタノール資化性菌を用いたｌ−リジンまたはｌ−アルギニンの製造法
EP0885962B1 (de) 1997-06-19 2005-04-13 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolindinderivaten

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001046067A (ja) * 1999-08-04 2001-02-20 Ajinomoto Co Inc 好熱性バチルス属細菌由来のｌ−リジン生合成系遺伝子
JP2001120292A (ja) * 1999-08-17 2001-05-08 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
JP2001120269A (ja) * 1999-10-22 2001-05-08 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−リジンの製造法
JP2002017351A (ja) * 2000-07-07 2002-01-22 Ajinomoto Co Inc ホスホヘキシュロイソメラーゼ及びその遺伝子
RU2229514C2 (ru) * 2000-11-13 2004-05-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" 3-дезокси-d-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтаза и фрагмент днк, кодирующий 3-дезокси-d-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтазу из methylophilus methylotrophus
US20050176121A1 (en) * 2001-09-06 2005-08-11 Ryo Takeshita Method for producing alcohol by using microorganism
BR0203531A (pt) * 2001-09-06 2003-09-09 Ajinomoto Kk Método para produzir uma substáncia alvo pelo uso de um microorganismo, e, microorganismo no qual um gene da metanol desidrogenase é introduzido
US6911332B2 (en) * 2002-06-12 2005-06-28 Ajinomoto Co., Inc. Isolated polynucleotides encoding d-arabino-3-hexulose-6-phosphate synthases from Methylophilus methylotrophus
JP2004166595A (ja) * 2002-11-20 2004-06-17 Ajinomoto Co Inc メチロトローフを用いたｌ−アミノ酸の製造法
DE102004001674B4 (de) * 2003-01-29 2019-01-24 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Einsatz von Methanol verwertenden Bakterien
JP2004236637A (ja) * 2003-02-10 2004-08-26 Ajinomoto Co Inc 多糖類生成に関与する遺伝子及びその利用
US20060019356A1 (en) * 2003-02-28 2006-01-26 Yoshihiro Usuda Polynucleotides encoding polypeptides involved in intermediates metabolism of the central metabolic pathway in Methylophilus methylotrophus
US7060475B2 (en) * 2003-02-28 2006-06-13 Ajinomoto Co., Inc. Polynucleotides encoding polypeptides involved in intermediates metabolism of central metabolic pathway in methylophilus methylotrophus
US7026149B2 (en) * 2003-02-28 2006-04-11 Ajinomoto Co., Inc. Polynucleotides encoding polypeptides involved in the stress response to environmental changes in Methylophilus methylotrophus
US7029893B2 (en) 2003-02-28 2006-04-18 Ajinomoto Co., Inc. Polynucleotides encoding polypeptides involved in amino acid biosynthesis in methylophilus methylotrophus
JP2004261150A (ja) * 2003-03-04 2004-09-24 Ajinomoto Co Inc 目的物質の製造法
EP1664318B1 (en) * 2004-01-30 2009-09-23 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid-producing microorganism and method for producing l-amino acid
RU2004124226A (ru) * 2004-08-10 2006-01-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Использование фосфокетолазы для продукции полезных метаболитов
US7205132B2 (en) * 2004-09-10 2007-04-17 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
JP2008043201A (ja) 2004-12-03 2008-02-28 Ajinomoto Co Inc メタノール資化性細菌を用いたｌ−リジン又はｌ−アルギニンの製造法
US7794989B2 (en) * 2004-12-28 2010-09-14 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
JP2009153382A (ja) * 2006-03-30 2009-07-16 Ajinomoto Co Inc メタノール資化性細菌を用いたカルボン酸の製造法

Patent Citations (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS49125590A (ja) 1973-04-10 1974-12-02
JPS5025790A (ja) 1973-07-18 1975-03-18
JPS5218886A (en) 1975-08-01 1977-02-12 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Production of amino acids by fermentation process
JPS5618596A (en) 1979-07-23 1981-02-21 Ajinomoto Co Inc Production of l-lysine through fermentation process
US4346170A (en) 1979-07-23 1982-08-24 Ajinomoto Company, Incorporated Method for producing L-lysine by fermentation
JPS6087788A (ja) 1983-08-29 1985-05-17 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ―アミノ酸の製造法
JPH06102028B2 (ja) 1985-10-04 1994-12-14 協和醗酵工業株式会社 アミノ酸の製造法
JPH02109985A (ja) 1988-02-22 1990-04-23 Eurolysine 細菌染色体上ヘの目的遺伝子の組み込み方法及び該方法によって得られた細菌
JPH01215280A (ja) 1988-02-23 1989-08-29 Showa Denko Kk 微生物の改良
JPH03505284A (ja) 1989-04-10 1991-11-21 リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・ミネソタ メチロトロフィック・バチルスによるアミノ酸の製造
JPH0491793A (ja) 1990-08-02 1992-03-25 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるアミノ酸の製造法
WO1995011985A1 (fr) 1993-10-28 1995-05-04 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production d'une substance
US5830716A (en) 1993-10-28 1998-11-03 Ajinomoto Co., Inc. Increased amounts of substances by modifying a microorganism to increase production of NADPH from NADH
WO1995016042A1 (fr) 1993-12-08 1995-06-15 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production de l-lysine par fermentation
US6040160A (en) 1993-12-08 2000-03-21 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing L-lysine by fermentation
WO1996040934A1 (fr) 1995-06-07 1996-12-19 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production de l-lysine
EP0841395A1 (en) 1995-06-07 1998-05-13 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-lysine
WO1997023597A2 (de) 1995-12-22 1997-07-03 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur mikrobiellen herstellung von aminosäuren durch gesteigerte aktivität von exportcarriern
US6858406B1 (en) 1995-12-22 2005-02-22 Forschungszentrum Jülich GmbH Process for the microbial production of amino acids by boosted activity of export carriers
EP0885962B1 (de) 1997-06-19 2005-04-13 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolindinderivaten
JP2000189180A (ja) 1998-12-30 2000-07-11 Ajinomoto Co Inc Ｌ―アミノ酸の製造法
EP1016710A2 (en) 1998-12-30 2000-07-05 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids
WO2000061723A1 (fr) 1999-04-09 2000-10-19 Ajinomoto Co., Inc. Bacteries produisant du l-amino acide et procede de production de l-amino acide
EP1188822A1 (en) 1999-04-09 2002-03-20 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid-producing bacteria and process for producing l-amino acid
WO2001053459A1 (fr) 2000-01-21 2001-07-26 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production de l-lysine
EP1253195A1 (en) 2000-01-21 2002-10-30 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-lysine
EP1266966A2 (en) 2001-06-12 2002-12-18 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-lysine or L-arginine by using methanol assimilating bacterium
JP2003061687A (ja) * 2001-06-12 2003-03-04 Ajinomoto Co Inc メタノール資化性菌を用いたｌ−リジン又はｌ−アルギニンの製造法
JP2004166594A (ja) 2002-11-20 2004-06-17 Ajinomoto Co Inc メタノール資化性菌を用いたｌ−リジンまたはｌ−アルギニンの製造法
US20050003495A1 (en) 2002-11-20 2005-01-06 Yoshiya Gunji Method for producing L-lysine or L-arginine by using methanol-assimilating bacterium
JP2004166592A (ja) * 2002-11-20 2004-06-17 Ajinomoto Co Inc メチロトローフを用いたｌ−アミノ酸の製造法

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBOIOLOGY, vol. 57, no. 6, 1991, pages 1746 - 1752
BOUVIER J. ET AL.: "Nucleotide sequence and expression of the Escherichia coli dapB gene", J. BIOL. CHEM., vol. 259, no. 23, 1984, pages 14829 - 14834, XP003015550 *
CANADIAN JOURNAL OF MICROBIOLOGY, vol. 43, 1997, pages 197
GUNJI Y. ET AL.: "Enhancement of L-lysine production in methyltroph Methylophilus methylotrophus by introducing a mutant LysE exporter", JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 127, no. 1, 2006, pages 1 - 13, XP003015553 *
HAZIZA C. ET AL.: "Nucleotide sequence of the asd gene of Escherichia coli: absence of a typical attenuation signal", EMBO J., vol. 1, no. 3, 1982, pages 379 - 384, XP003015551 *
ISHINO S. ET AL.: "Nucleotide sequence of the meso-diaminopimelate D-dehydrogenase gene from Corynebacterium glutamicum", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 15, no. 9, 1987, pages 3917, XP003015552 *
MOLECULAR MICROBIOLOGY, vol. 22, 1996, pages 81.5 - 826
SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T.: "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition"", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
See also references of EP1990406A4
TSUJIMOTO N. ET AL.: "L-Lysine biosynthetic pathway of Methylophilus methylotrophus and construction of an L-Lysine producer", JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 124, no. 2, 2006, pages 327 - 337, XP003015554 *
YOSHIYA G. ET AL.: "Characterization of the L-lysine biosynthetic pathway in the obligate methylotroph Methylophilus methylotrophus", BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY, vol. 68, no. 7, 2004, pages 1449 - 1460, XP003015549 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3986909A4 (en) * 2019-06-21 2023-08-02 Inscripta, Inc. GENOME-WIDE RATIONAL DESIGNED MUTATIONS LEADING TO INCREASED LYSINE PRODUCTION IN E. COLI
CN115044521A (zh) * 2021-03-09 2022-09-13 大象株式会社 L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l-赖氨酸的生产方法
CN115044521B (zh) * 2021-03-09 2023-11-03 大象株式会社 L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l-赖氨酸的生产方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1990406B1 (en) 2014-12-31
JP2009089603A (ja) 2009-04-30
US20100190216A1 (en) 2010-07-29
US8017363B2 (en) 2011-09-13
EP1990406A1 (en) 2008-11-12
EP1990406A4 (en) 2010-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7211416B2 (en) Method for producing L-lysine using methanol-utilizing bacterium
JP4075087B2 (ja) Ｌ−リジンの製造法
JP3106501B2 (ja) Ｌ−リジンの製造法
AU2019400521B2 (en) Modified Homoserine Dehydrogenase And Method For Producing Homoserine Or L-Amino Acid Derived From Homoserine Using The Same
MXPA06003377A (es) Metodo para producir l-aminoacido mediante fermentacion.
WO2000061723A1 (fr) Bacteries produisant du l-amino acide et procede de production de l-amino acide
CN106715687B (zh) 丙酮酸脱氢酶突变体、包含突变体的微生物和通过使用微生物生产l-氨基酸的方法
JP2004166595A (ja) メチロトローフを用いたｌ−アミノ酸の製造法
JP2004166592A (ja) メチロトローフを用いたｌ−アミノ酸の製造法
BR112019020697B1 (pt) Homoserina desidrogenase modificada e método para a produção de homoserina ou l- aminoácido derivado de homoserina que utiliza a mesma
WO2007088970A1 (ja) メタノール資化性細菌を用いたｌ－リジンの製造法
JP4592760B2 (ja) 外来のｎａｄｐ依存的グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むエシェリキア種またはコリネバクテリウム種の微生物、およびこれらを用いてｌ−リジンを生産する方法
JP4120364B2 (ja) メタノール資化性菌を用いたｌ−リジンまたはｌ−アルギニンの製造法
KR102078732B1 (ko) 변형된 막 투과성
JP7383046B2 (ja) Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びそれを用いたｌ－アミノ酸の生産方法
WO2012172822A1 (ja) 組換え微生物、当該組換え微生物を用いたアラニンの製造方法
US20130266993A1 (en) Method for Producing Carboxylic Acid Using Methanol-Assimilating Bacterium
WO2022017223A1 (zh) 丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其应用
CN115175993B (zh) 柠檬酸合酶活性减弱的新型修饰多肽及使用其生产l-氨基酸的方法
JP4120269B2 (ja) メタノール資化性菌を用いたｌ−リジン又はｌ−アルギニンの製造法
JP2021524260A (ja) 腸内細菌科を用いたトリペプチドγ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＹの製造方法
RU2797843C9 (ru) Микроорганизм, продуцирующий лизин, и способ продуцирования лизина
RU2797843C1 (ru) Микроорганизм, продуцирующий лизин, и способ продуцирования лизина
WO2022152036A1 (zh) 具有启动子活性的多核苷酸及其在生产目标化合物中的用途
CN116891868A (zh) 一种渗透压耐受性功能基因鉴定方法及功能基因的应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007713790

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP