JPH03505284A - メチロトロフィック・バチルスによるアミノ酸の製造 - Google Patents
メチロトロフィック・バチルスによるアミノ酸の製造Info
- Publication number
- JPH03505284A JPH03505284A JP2506452A JP50645290A JPH03505284A JP H03505284 A JPH03505284 A JP H03505284A JP 2506452 A JP2506452 A JP 2506452A JP 50645290 A JP50645290 A JP 50645290A JP H03505284 A JPH03505284 A JP H03505284A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- strain
- amino acid
- methanol
- amino acids
- autotrophic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/20—Aspartic acid; Asparagine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
メチロトロフィック・バチルスによるアミノ酸の製造置型
この発明は、合衆国エネルギー省により裁定された契約番号DE−ACO2−8
2ER12029のもと政府の援助により為された。政府はこの発明においであ
る種の権利を有する。
発明の背景
この発明は、メチロトロフィック・バチルスの栄養要求突然変異体を用いたアミ
ノ酸の製造に関するものである。
二酸化炭素よりも還元されたー炭素化合物を資化する微生物(栄養要求変異種)
は多様かつ偏在している。アンソニー、「ザ・バイオケミストリー・オブ・メチ
ロトローフス」、3頁(アカデミツク・プレス、ロンドン、1982)、ハンソ
ン、Adv、 Appl、 Microbioll、26:3(1980)。
メタンを資化することが報告されているメチロトローフイック菌は全てダラム陰
性であり、殆ど全てエネルギー供給源としての一炭素化合物に関する偏性必要条
件を有する(アンソニー、前出、ライラテンバーブ等、「ジャーナル・オブ・ジ
ェネラル・マイクロバイオロジー」、61:219−226(1970))。メ
タンではなくメタノールおよびメチルアミン類で育つ細菌は、幾つかの条件的お
よび偏性メチロトローフを含む(アンソニー、前出、ハンソン前出)。メタンを
資化し得ない偏性メチロトローフは全てダラム陰性好気性細菌である(アンソニ
ー、前出、ライラテンバーブ、前出)。メタノール、メチルアミンまたはこれら
の両方を資化する分離された条件的メチロトローフのうち、ダラム陽性はごく僅
かしか存在せず、それらはバチルス、コリネバクテリウム、アルトロバクターま
たはノカルディア属に配分されていた(アキバ等、J 、 F erment、
Technol、、48:323−328(1970)、クレメント等、Ab
stracts of the Fifth International S
ymposiura Microbiol、 Growth on C、Co+
*pounds、 69頁(フリー・ユニバージティー・プレス、アムステルダ
ム、1986)、ハーゼン等、「アーカイブス・オブ・マイクロバイオロジーJ
、135:205−210(1983)S工材等、J、 Ferment、 T
echnol、、56:243−252(1978)。
微生物発酵による単細胞蛋白質および選択されたアミノ酸の製造は、例えばスタ
ーリングによるアメリカ合衆国特許第4652527号により知られている。工
業的規模で製造されたーアミノ酸はリジンである。登板等、「トレンズ・イン・
バイオテクノロジー」、1ニア0−74(1983)、登板およびタキナミ、「
プログレス・イン172頁(アイダ等、1986)参照。バチルスの種類は、ア
ミノ酸を製造するための発酵プロセスにおいて使用された。登板等、前出、登板
およびタキナミ、前出。しかしながら、現在まで、50℃を越える温度でメタノ
ールにより急速に成長し得る分離されたバチルス種を用いたアミノ酸の製造は行
なわれていない。
高温での好熱性メタノール資化発酵プロセスの工業的利点については既に記載さ
れている、スネデカーおよびクーニー、「アプライド・マイクロバイオロジー」
、27:112−1.117(1974)。
例えば、高温の使用により冷却コストは顕著に低減化され得る。内性胞子形成種
を含むメタノール資化好熱性混合培養物は、スネデカーおよびクーニーにより選
択された。しかしながら、スネデカーおよびクーニーは、メタノールで成長し得
る純粋培養物を分離し得なかった。混合または不純培養物から適当な突然変異体
を分離することは、非常に困難または不可能である。
従って、窒素供与体、ビタミンBI2並びに炭素およびエネルギー供給源として
のメタノールを有する培地中50℃で持続的成長を呈するバチルス属の1型メチ
ロトロフイツク細菌を用いたアミノ酸の製造方法が要望されている。
発明の要旨
我々は、炭素およびエネルギー供給源としてのメタノール、ビタミンB12およ
びビオチンを含む栄養培地中50℃で持続的成長を呈するバチルス属のI型メチ
ロトロフィック細菌の生物学的に純粋な株を発見した。上記細菌は、約り0℃〜
約60℃の温度で成長し、+
可溶性NAD 依存性アルコール脱水素酵素を含む。
さらに我々は、上述の生物学的に純粋な株のアミノ酸栄養要求変異種が、かなり
の量のアミノ酸を製造するのに有用であることを発見した。好ましい態様におい
て、バチルス属の生物学的に純粋な株I型メチロトロフィック細菌のアミノ酸栄
養要求変異種は、炭素およびエネルギー供給源、好ましくはメタノール、窒素供
与体、ビタミンB12およびビオチンを有する水性栄養培地中50℃で培養され
た場合に少なくとも1種のアミノ酸を製造する。
さらに好ましい態様において、この発明の細菌は、動物飼料および動物飼料補充
物質または動物飼料用の栄養補助物質として有用な多数のアミノ酸を同時に製造
することができる。続いて、この発明により製造されるアミノ酸(複数も可)は
、培養培地から分離され得る。好ましくは、アミノ酸含有培養培地は、乾燥され
、貴重な動物飼料または動物飼料補助物質として直接使用され得る。
この発明の好ましい栄養要求変異種細菌は、生物学的に純粋な株MGA3の突然
変異体およびその形態変異体である。最も好ましくは、この発明のアミノ酸栄養
要求変異種はまた、アミノ酸類縁体に対して抵抗を示す。
二の発明の細菌を培養してアミノ酸を製造するのに好ましい栄養培地は、有効量
の燐酸供給源、硫酸供給源、カルシウム供給源および微量元素と一緒に、炭素お
よびエネルギー供給源、好ましくはメタノール、窒素供給源、ビタミンB12お
よびビオチンを含む。この発明の栄養要求変異種細菌によるアミノ酸製造は、要
求されたアミノ酸と一緒に有効量のメタノールおよび微量元素を培養培地に自動
的に送り込むことにより増強される。最も好ましくは、有効量のメタノール、微
量元素および要求されたアミノ酸を含む連続培養方法を用いることにより細胞が
高い細胞密度に成長すると、アミノ酸製造は最大化される。好ましい半連続的(
フェト−パッチ、fed −batch)または連続的培養方法では、アミノ酸
の製造は一定の細胞密度で非成長的関連性を示す。
我々は、こめ発明の方法を用いると、1型メチロトロフィック・バチルスの生物
学的純粋株の栄養要求変異種細菌が、かなりの量のリジンを排出することを観察
した。好ましい態様において、我々は、L−リジン1リツトル当たり約3−10
グラムを排出するアミノ酸栄養要求変異種を観察した。リジン製造に使用される
さらに好ましい栄養要求突然変異体は、5−2−アミノニチルーシスティン並び
にトレオニンおよびメチオニンの類縁体による成長阻害に抵抗を示すホモセリン
栄養要求変異種である。最も好ましい栄養要求変異種は、5−2−アミノエチル
−システィンによる阻害に対して抵抗を示し、またトリプトファン、チロシンお
よびフェニルアラニン類縁体に抵抗を示すフェニルアラニンおよびチロシンを要
求する突然変異体であるホモセリン栄養要求変異種である。
この発明はまた、炭素およびエネルギー供給源、好ましくはメタノール、ビタミ
ンB1□およびビオチンを含む水性栄養培地中50℃で持続的成長を呈するバチ
ルス属のI型メチロトロフィック細菌の生物学的純粋株を分離し、高いアミノ酸
生産性を呈する突然変異体の製造に有効な突然変異誘発量により上記分離菌を処
理する段階を含む、バチルス属の!型メチロトロフィック細菌の生物学的純粋株
のアミノ酸製造突然変異体を得る方法に関するもの!ある。アミノ酸生産突然変
異体は、1種またはそれ以上の所望のアミノ酸または生合成中間体を含む培地に
おける成長能力に基づいて選択される。
好ましい態様では、この発明の分離されたI型メチロトロフィック・バチルスを
、化学的突然変異原、例えばエチルメタンスルホネートもしくはN−メチル−N
−ニトロ−N′−ニトロソグアニン、またはアミノ酸類縁体、例えば5−2−ア
ミノエチル−し−システィン、またはこれらの両方で処理することにより、細菌
によるアミノ酸生産性を向上させる。
下記の詳細な記載および後記請求の範囲から、この発明の他の特徴および利点は
明白となるはずである。
′図面の記載
第1図は、53℃でMV培地において成長させたMGA3株の位相差顕微鏡写真
である。棒線は10μ腹を示す。
第2図は、45℃でMV培地において成長させたGr株の位相差顕微鏡写真であ
る。
第3図は、53℃で8M培地において成長させ、37℃に変えた場合のMGA3
株の位相差顕微鏡写真である。棒線は10μmを示第4図はMGA3株の成長を
示す。0.5g/l酵母抽出物(−ロー)、メタノール5.0g/l(−△−)
またはメタノール5g/lおよび0.5g/l酵母抽出物(−・−)を含むMV
培地にMGA3株を接種した。培養物を53℃で振り混ぜながらインキュベーシ
ョンした。
第5図は、この発明の栄養要求変異種細菌によるリジンおよびアスパラギン酸の
同時製造を示す。
第6図は、半連続またはフェト−パッチ条件下における高細胞密度へのMGA3
成長を示す。
発明の詳細な記載
この発明の好ましい態様のメチロトロフィック細菌は、下記第1表に示した特徴
を有するバチルス属の一員である。
第1表、■型メチロトロフィック・バチルスの特徴。
細胞形状 かん状ダラム反応
十内生胞子 卵形胞子嚢
膨れた状態胞子局在性
端付近80℃で10分後の生存 十53℃での胞子形成
−37℃での胞子形成 子連動性
+/−成長に最適なpH7
成長に最適な温度 45−55℃ビタミン必要条件
B17、ビオチン炭素およびエネルギー供給源:
アセテート 曹グルタメート
α−ケトグルタレート
炭水化物からの気体
栄養寒天培地における成長
窒素供給源:
二トレート還元
ニトレート呼吸
ヘキスロース燐酸シンターゼ
加水分解:
ゼラチン
澱粉
NaC1耐容性
W DNA塩基割合(モル%G+C) 44−
脚注:w=弱い陽性1.=測定されず。
W この明細書に記載された方法で分離されたバチルス株MGA3
は、第1表(第1図)に示す特徴を呈した。バチルス株MGA3は、ア十
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、ATC−C5
3907の番号が割り当てられている。さらに、上記細菌は、−最初の発酵槽強
化で見られる多形細胞を連想させた、MGA3株培−獲物のスミアにおいて時折
見られる非常に大型かつ多態性の細胞で十 ある異常型形態を特徴と
する。MGA3のプレートから得られたコー ロニーは、この形態変
異型の純粋培養物を生産した(第2図)。それ十 はGr株と命名さ
れた。この株は、試験されたMGA3株の培養的および生理学的特徴の大部分を
共有していた。Gr株は50℃でメ+ タノールまたはマンニトールに
おいて成長し、好中性であり、成長+ するためにはビタミンBI2お
よびビオチンを必要とし、試験された1% 全ての他の特徴においてMG
A3と似ていた(第1図)。またGr株の粗抽出物は、ヘキスロース−燐酸シン
ターゼ活性を含んでいた。
複製を許容しない53℃から37℃に培養条件を切り換えると、Gr株は相の明
るい胞子を形成した。高温で成長させたGr株の培養物は加熱不活化後生存して
いなかったが、37℃でさらに18時間インキュベーションした培養物から得ら
れた細胞は80℃で10分間生存していた。Grの全体的外観は、ロジャーズ等
により分離されたバチルス・スブチリスおよびバチルス・リケニホルミスのかん
状突然変異体と類似していた(「ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイ
オロジー」、61:155−171(1970))。
この発明の細菌の主たる特徴は、それが、単一の炭素およびエネルギー供給源と
してのメタノールを必要なビタミン類としてビオチンおよびビタミンBI2と共
に含む水性栄養培地中少な(とも50℃の温度で成長することである。この明細
書に記載されている「水性栄養培地」は、この発明の細菌の成長に必要な無機物
およびそれらの塩類を含む水基剤の組成物を指す。好ましい栄養培地は、有効量
の燐酸供給源、窒素供給源、硫酸供給源、カルシウムおよび微量元素を含む。こ
の明細書に記載されている「微量元素」は、痕跡濃度、すなわち1パーセントの
微小フラクション(1000ppmまたはそれ未満)であって成長に不可欠な元
素を指す。第1表で示した通り、この発明の細菌は、グルコースまたはマンニト
ールを含む、メタノール以外の成長に要する若干の炭素およびエネルギー供給源
を資化し得る。しかしながら、好ましい炭素およびエネルギー供給源はメタノー
ルである。
この発明における満足すべき培地は、例えば実施例1に記載された培地などの最
少塩類培地である。好ましい実施態様、例えば実施例1において、この発明の細
菌を成長させるための最少塩類培地は、硫酸アンモニウムを約20〜約500m
M、燐酸カリウムを約10〜125mM、塩化カルシウムを約0.1.−1.5
mMおよびマグネシウムの塩類および微量金属:鉄、銅、マンガン、亜鉛、モリ
ブデン、ホウ酸塩およびコバルトを実施例4に記載された濃度で含む。
成長に必要とされるメタノールおよびビタミンBI2の量は変化し得る。培地中
のメタノールの量は、約0.05重量/容量%〜約5重量/容量%の範囲であり
得、約0,2重量/容量%〜約0.5重量/容量%の量が好ましい。培地は少な
くとも0.05重量/容量%の濃度でメタノールを含むべきである。水性培地中
のビタミンBI2の量は、約0.5 μg/l 〜1mg/lの範囲で変化し得
、約1μg/l〜0.1mg/lの量が好ましい。細菌の最適成長は、約6.0
−8.0のpH範囲内および45−55℃で行なわれる。pHが5.5の場合成
長は行なわれない。成長には約20μg/l〜20mg/lの量のビオチンを必
要とされる。メタノール、ビタミンBI2およびビオチンを含む最少塩類培地で
成長させた場合、この発明の細菌は、約50℃〜60℃の温度で約0.2/時〜
約1.5/時の速度で成長し得る。
さらに、この発明のI型メチロトロフィック細菌は、NAD+依存性メタノール
脱水素酵素を生産する。この脱水素酵素は、この発明の微生物から分離された場
合65℃で最適活性を有し、メタノ−+
ル検知電極における封入、安い電子供与体からのNADH+Hの製造および還元
剤を必要とする他の酵素結合反応の推進に有用であると考えられている。
この発明の細菌は、アミ゛ノ酸を製造し得る栄養要求変異種および形態学的突然
変異体、例えばGr株の形成能力を特徴とする。また、上記細菌は、37℃ない
し約50℃を越えない温度で内生胞子を生じるが、これは株の保存に重要なこと
である。この明細書で記載されている「栄養要求変異種」は、最少栄養培地に存
在する炭素供給源に加えて特異的な成長因子を必要とする微生物を指す。この発
明に関して述べると、栄養要求変異種は、ここに記載されているI型メチロトロ
フィック細菌の突然変異形態を指すもので、1種またはそれ以上のアミノ酸を成
長に必要とし、1種またはそれ以上のアミノ酸を過剰生産および排出する。この
明細書に記載されている「突然変異」は、一般に自然発生的または放射および様
々な化学物質を含む既知突然変異誘発源により誘導され得る生物体の表現型にお
ける突然の遺伝性変化を意味する。この発明の栄養要求変異種は、放射、例えば
紫外線光およびX線および化学的突然変異誘発源を含む様々な突然変異誘発源を
用いて製造され得る。化学的突然変異誘発物質の例は、エチルメタンスルホネー
ト(EMS)、N−メチル−N−二トローN°−ニトロソグアニン(NTG)お
よび亜硝酸である。
また、この発明は、様々なアミノ酸を過剰生産および排出する本明細書記載のI
型メチロトロフィック細菌のアミノ酸類縁体耐性株の製造に関するものである。
この明細書に記載されている「アミノ酸類縁体」は、アミノ酸と構造が類似して
いるが、天然アミノ酸の場合と同じ方法で生合成酵素および遺伝制御要素とは反
応しない化合物を指す。上述の構造が類似した類縁体およびそれらの関連アミノ
酸の例としては、5−メチル−DL−トリプトファン(MT)、p−フルオロフ
ェニルアラニン、5−フルオロ−DL−)リプトファン(F T)、5−2−ア
ミノエチル−L−システィン(ABC)およびエチオニンがあり、各々トリプト
ファン、チロシン、トリプトファン、リジンおよびメチオニンに対応する。
実施例で記載されている通り、この発明の1型メチロトロフィック細菌のアミノ
酸生産突然変異体は、ここに記載されている分離された■型メチロトロフィック
細菌を、1種またはそれ以上のアミノ酸を過剰生産する突然変異体の製造に有効
な量の突然変異誘発物質で処理することにより製造される。使用される突然変異
誘発物質の型および量は変化し得るが、EMSおよびNTGを各々約10および
50μg/mlの量で使用するのが好ましい。突然変異誘発処理後、処理された
細菌の分離株を、少なくともビタミンBI2およびビオチンおよび1種またはそ
れ以上のアミノ酸を含む培地における成長について試験する。アミノ酸排出突然
変異体の選択に適当な一培地は、実施例1記載の型の最少ビタミン培地などであ
る。栄養要求変異種分離株は、1種またはそれ以上の特異的アミノ酸を含む最少
ビタミン培地のみでの成長能力により同定される。この発明の多くのアミノ酸栄
養要求変異種は実施例2で同定される。
また、この明細書に記載されている■型メチロトロフィック細菌は、別法として
、または追加的に特定アミノ酸を過剰生産する突然変異体を選択するためのアミ
ノ酸類縁体で処理され得る。好ましい一実施態様では、まずアミノ酸生産突然変
異体を化学的突然変異誘発物質EMS(10μg/ml)またはNTG(50μ
g/ml)で処理することにより、アミノ酸栄養要求変異種を生成させる。次い
で、選択されたアミノ酸栄養要求変異種を、増量のアミノ酸類縁体AECで処理
することにより、アミノ酸リジンを過剰生産する突然変異体を選択する。この発
明を用いることにより、既知アミノ酸の全部でなければ大部分を生産し得る本明
細書記載のバチルス属の1型メチロトロフィック細菌のアミノ酸栄養要求変異種
および/またはアミノ酸類縁体耐性突然変異体を製造し得ることが想像される。
この発明のI型メチロトロフィック・バチルスの栄養要求変異種および/または
アミノ酸耐性突然変異体からアミノ酸を製造するため、例えば実施例4で示され
た量の燐酸供給源、硫酸供給源、窒素供給源、カルンウムおよび微量元素と一緒
にビオチン、ビタミンB1□およびメタノールを有する水性栄養培地中で生物体
を培養する。
先に記載した通り、満足すべき培地は、最少塩類培地、例えば実施例1記載の培
地などである。アミノ酸の製造に必要とされるメタノールおよびビタミンBI2
の量は変化し得る。メタノールは、約0゜05重量/容量%〜5重量/容量%の
範囲であり得、約0.3重量/容量%〜約0.8重量/容量%の量のメタノール
が好ましい。ビタミンB12は約0.5.czg/l 〜1mg/lの範囲であ
り得、約1μg/l〜約0.1mg/lの量が好ましい。最低で、少なくとも約
0.05重量/容量%のメタノール、0.5μg/lのビタミンB12および約
20μg/l〜約20mg/lのビオチンがアミノ酸の突然変異的製造には必要
とされる。
好ましい実施態様では、水酸化アンモニウムによるpH制御手段に結合した培地
にホスフェート、マグネシウムおよびカルシウムを供給する。多くの窒素供給源
、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが使用さ
れ得る。好ましい窒素供給源は、少なくとも20ミリモルの量で必要とされる塩
化アンモニウムまたは(NH4)2SO4である。
所望ならば、培養において製造されたアミノ酸は、抽出方法、例えばイオン交換
クロマトグラフィーを用いて分離され得る。好ましい方法では、I型メチロトロ
フィック・バチルス、培養培地成分および生産されたアミノ酸を含む発酵ブロス
を直接乾燥することにより、細胞、培地成分および動物飼料または動物飼料補助
物質として有用な1種またはそれ以上の過剰生産された必須アミノ酸を含む物質
を製造する。発酵ブロスは、例えばG、 L、 ソロモンズ、「マテリアルズ
・アンド・メソッズ・イン・ファーメンテ−ジョン」(アカデミツク・プレス、
ニューヨーク、二ニーヨーク、1964)で報告された方法により乾燥され得る
。
この発明のI型メチロトロフィック細菌の栄養要求変異種および/またはアミノ
酸耐性突然変異体を用いることにより、アミノ酸がかなりの量で製造され得ると
考えられる。すなわち、少なくとも5グラム/1〜約150グラム/1、好まし
くは約50グラム/1〜約150グラムおよびさらに好ましくは約100〜15
0g/lの量のアミノ酸が製造され得る。この発明は20種のアミノ酸の多(を
製造するのに有用であると考えられるが、特にリジン、フェニルアラニンおよび
トリプトファンの単独または同時製造に有用である。一実施態様において、同じ
くアミノ酸感受性である栄養要求変異種は、約3〜約5g/lの割合でリジンを
製造し得る。好ましい実施態様では、同じくアミノ酸感受性である栄養要求変異
種は、8グラム/l以下の割合でリジンを製造し得る。少なくとも4、Og/l
のL−リジンおよび少な(とも1.5g/lのL−アスパラギン酸の同時製造も
また達成され得る。好ましい一実施態様では、4.5g/lのL−リジンおよび
2.0g/lのL−アスパラギン酸の同時製造が達成される。
実施例1で記載したタイプの最少塩類培地で培養した場合、この発明の■型メチ
ロトロフィック株は、乾燥重量にして50グラム/1以下の細胞密度で成長し得
る。好ましくは、45℃ないし55℃の温度でビタミンBI2、ビオチンおよび
メタノールを含む最少塩類培地における細胞成長は、少なくとも150g/l(
乾燥重量)およびメタノール1グラム当たり細胞0.6グラム以下であり得る。
メタノール1グラ°ム当たり細胞約0.53グラムの細胞収率を有する30−5
0g/l(乾燥重量)の細胞密度が観察された。
この発明の栄養要求変異種はバッチ培養で成長させた場合にアミノ酸を製造し得
る。しかしながら、必要とされるアミノ酸と共にメタノールおよび微量元素をフ
ェト−バッチまたは半連続的に供給すると、アミノ酸製造が促進される。さらに
、この発明の栄養要求変異種によるアミノ酸製造は、必要とされるアミノ酸と共
に微量元素を自動的に供給する連続培養方法を用いることにより促進され得る。
さらに、バッチ供給または連続培養へのホスフェート、マグネシウムおよびカル
シウム供給は、pH制御と結びつけられ得る。栄養要求変異種によるアミノ酸の
製造は、純粋酸素を連続的に加えると同時にメタノールおよび微量元素を培養培
地へ連続的に加えることにより、この発明の細菌を最高細胞密度に成長させた場
合に最大化される。
実施例I
M G A 3株の分離及び特性表示
A、方法と操作
成育及び胞子形成培地:最少塩培地(MS)は、1リツトルの蒸留水中に、K
tHP O−、3,8g:NaHtP O4・Hto、2.8g:(N H4)
zSO,,3,sg;Mg5o、・7Hz0,0.5g;Fe50.−71h0
.2mg:Cu5O,−5Hz0.40μg;HsBOs;30μg;Mn5O
,・4Ht0.200 μg; Z nS O4・7 Hto、200 μg;
Na*MoO++ 40 μg;cac1t・2Ht0,5.3μg;CoC1
t・6Hz0.408g、を含有した。本培地のpHをオートクレーブ処理する
前に7.0に調整した。リン酸塩は、MS培地を連続培養に用いる場合、50%
に減少した。
最少ビタミン培養(MV)は、MS培地にチアミン・HC(1,D−パントテン
酸カルシウム、リボフラビン及びニコチン酸アミドを各50μ9・g−1、ビオ
チンと葉酸を各20μ9・Q−’としてBllを1μ?・12−1加えたもので
あった。
酵母水培地(MY)は、酵母エキス0.59・ff−’を加えたMS培地。
であった。
全ての培地(MV及びMY)は、特にことわらない限り、04%(v/v)メタ
ノールを含んだ。普培地(NB)は10001112に蒸留水中にビーフェキス
39とペプトン59を含有した。Jビタミン培地(J V)は、リットル当りペ
プトン(59)と酵母エキス(159)、及びMV培地と同一濃度のビタミンを
含んだ。胚子形成培地(SM)は、3部のNBと4部のMV培地から構成された
。全固体培地は、二倍の強さの培地成分と同量の3%バクト(bacto)寒天
をオートクレーブ処理後、混合することにより調製した。
栄養強化:淡水沼地土壌を蒸留水に懸濁し、90°Cで20分間加熱した。この
懸濁液の一部を、53℃でのバッチ培養で扱う発酵槽用の接種材料として用いた
。生育が容器内で明白と′なったとき、培地ポンプを稼動して流速を徐々に増加
して栄養強化用の連続性培養を行なった。
連続培養:2つの1eオムニ(Omni)−培養発酵槽(バーチス社、ガージナ
ー、二ニーヨーク)を連続培養に用いた。メータリング(meter i ng
)ポンプ(アイスマチック・ミニ、シカゴ、イリノイ)で容器に未滅菌のMS培
地を供給し、流量を1時間当り0.1と0.5容量の間に調整した。セパレート
メータリングポンプでメタノールを流出物中、約29・、2−1の残留濃度を保
つ速度で供給した。メタノールの濃度はガスクロマトグラフィで測定した。pH
を10%v/v水酸化アンモニウムの添加によりpH6,8に自動的に調節した
(コントローラー・モデル5656−00.コール・バーマー・インスツルーメ
ント・フンバニイ、シカゴ・イリノイ)。温度は53℃と56℃の間に保った。
空気を2v/v/mで散布し、三枚平羽根タービンインペラを60ORPMで操
作した。
分離及び純培養:発酵槽からの試料を周期的にMY及びMV寒天上に画線して5
3°Cでインキュベートした。これらのプレートから得た分離コロニーを同一条
件で生育した。コロニーを、23!12のMV培地を18mm試験管に接種し、
そして試験管を旋回水浴振盪機中53℃でインキュベートすることにより、メタ
ノールでの生育について試験した。このメタノール最少ブロス中の生育を伴う試
験管を次の精製用にMV寒天上に接種した。
形態学的特性 ダラム染色(strain)、胞子染色(strain)及びポ
リ−β−ヒドロキシブチラード染色(straining)をトーチ、マニュア
ル・オブ・プレート・フォア・ジェネラル・バクテリオロジイ 21−33頁(
アメリカン・ソサエティ・フォア・マイクロバイオロジイ、1981)に記載さ
れるように行った。ダラム染色は、上記ガーガーセンにより記載されたように実
施したKOH試験で証明した。
細胞径はMY寒天上50’Cで18時間生育した細胞で測定した。
特性試験:APIウサギCH及びウサキEストリップ系(シャーウッド・メディ
カル、プレインヴコー、二ニーヨーク)を用いて49物質の標準発酵検査と9の
追加生物学的測定をそれぞれ行なった。2セツトのストリップ5接種するのに用
いた培養株は、JV寒天培地上と5M寒天培地上で55℃で18時間生育させた
。試験ストリップは系で与えられた指示に従って接種し読み取った。硝酸塩還元
、NaCQ’fr’l性、チロシン分解及びリゾチーム耐性をゴートン等、ザ・
ジーナス・バチルス・ハンドブック、No、427(ワシントン、ディーシー、
デパートメント・オブ・アゲ、1973)によって記載されたように行なったか
、以下の通り変更した。硝酸塩から亜硝酸塩への還元、NaCQ耐性及びリゾチ
ーム耐性はJV培地中、チロシン(59・Q−1)及び0.5%メタノールで試
験した。窒素源として硝酸塩の適性を試験するため、硝酸カリウム(59・ρ−
1)をMV培地中、硫酸アンモニウムと置き換えた。
加水分解活性:0,5%(v/v)メタノールを含むMV寒天プレートは、可溶
性澱粉(39・F’)、果実ペクチン(サート・ブランド、10g・g−1及び
ゼラチン(シグマ・タイプI、4g・Q−I)をブレトを混釈する前にMV培地
に加えることにより調製し、加水分解活性を調べた。カゼイン含有プレートは、
IQの半分の強さのMV培地に159の脱脂乾燥ミルク(カーネイション・カン
バニイ)を加えて調製した。これらプレートでの加水分解は、ラス牛ン及びレッ
ケヴアリアー、CRCハンドブック・オブ・マイクロバイオロジイ、734−7
35頁(CRCブレス、1971)に記載されたように検定したジピコリン酸抽
出及び決定ニ
ジピコリン酸(D P A)は、細胞懸濁液の511Q試料を20分間オートク
レーブ処理することにより抽出した。次いで試料を冷却し、1膚ρのIN酢酸で
酸性とし、1時間放置し、次いで12,0OOx9で10分間遠心分離した。上
清フラクション中の大量のDPAを、センセン等、サイエンス、127:26−
27(1958)により記載された比色分析により決定した。胞子ノウ及び胞細
計数は、ベトロフーハウザー血球計算板を使用して視覚的に測定した。
熱及びクロロホルム耐性:培養菌の一部を80’Cに加熱し、次いで80’Cで
10分間保った。生存数及び熱安定数を、MY寒天上に加熱及び未加熱培養株の
適当希釈物をプレートすることにより測定した。胞子懸濁液はMY中、50°C
18時間及び37°C1B時間生育° した培養菌から調製した。培養菌を12
.0009で遠心分離し、蒸留水中での遠心分離と蒸留水中への再懸濁によって
洗浄した。胞子懸濁液を65°Cで10分間滅菌した。次いでこの懸濁液の一部
を80℃で10分加熱した。胞子計数はMX7寒天上に希釈物をプレートし、プ
レートを50°Cで48時間インキ二ヘートすることにより測定した。
クロロホルム5μQを1jI12の培養菌を含む試験管(13mmX 100m
m)に加えた。懸濁液をヴオルテノクス(vortex)混合機で混合後、試験
管を、上記のように希釈及びプレートする前に37℃で10分間インキニベート
した。
生育試験二種々の物質に対する生育反応を、アル;−ル0.5%(V/v)、シ
ョ糖、有機酸及びメチル置換アミン各0.3%(v/v)並びにホルムアルデヒ
ド0.03%(W/V)を含むMV培地中で測定した。生育に関するpHの影響
は、HCQ又はNa(12を添加してpHを調整したMV培地中で測定した。生
育速度は、約20ORPMで稼動させた旋回振盪機(二ニー・プランスウイノク
・モデルG−7)上の三重バッフルフラスコ内の培養菌の生育によって決定した
。生育は、スペクトル光度計又はクレット・ユニット(#66フイルター)を用
いて650nmでの濁り測定によって測定した。1吸光度単位は0、42g・1
2−1の乾燥細胞重量に対応した。
抗生物質感受性:0.2tn(l容量の半指数期培養菌を0,5%(v/v)メ
タノールを含むMV寒天プレート上に塗布した。プレートを55°Cで1時間イ
ンキニベートして表面を乾燥させた。次いで抗生物質含有ディスク(ディフコ・
ラボラトリイズ、デトロイト、ミシガン)を表面上に無菌的に置き、プレートを
48時間55℃にもどした。感受性を試験するために用いた抗生物質ディスクは
、ゲンタマイシン10IC9、スルファジアジン300 zcg、テトラサイク
リン30wcg、アンピシリン101C9、リフアンピン5 ycg、クロロマ
イセチン30txcg、エリスロマイシン5 mcg及びペニシリンGIO単位
を含有したメタノール酸化:バチルス株MGA3の培養菌を、メタノール(49
・12−1)又はマンニトール(39・e−1)を含む液体MV培地中、50℃
で半指数期まで生育した。細胞を4℃で12,0OOXfで8分間遠心分離する
ことにより集め、水冷0.05Mリン酸緩衝液pH7中で遠心分離することによ
り洗浄し、水冷0.05MIJン酸緩衝液に懸濁した。メタノール酸化は、ロウ
ツ酸素電極(ロウツ・ブロス1.ボッティジャム、イングランド)を用いて測定
した。酸素消費はo、05Mリン酸緩衝液中に細胞(3,7−7,3x9・3j
f2−’)の懸濁液を置くことにより電極で測定した。内因性酸素消費の速度が
確立したのち、メタノール1.09・Q−’を電極に加えてメタノール依存性酸
素消費の速度を測定した。
粗製抽出物及び酵素アッセイ:細胞を半指数期で集め、50mM!Jン酸緩衝液
、pHに再び懸濁し、15.000psiに操作したフレンチ加圧室(Fren
ch pressure cell)を通して2つに分裂させた。
細胞残がいを12.000gで遠心分離して除き、上清区分を粗製抽出物として
用いた。ヘキスロースリン酸合成酵素を、コックス及びザットマン:バイオケミ
カル・ジャーナル、141.605−608(1974)による方法により分析
しくこれを引用して明細書記載の一部とする)、ヒドロキシピルビン酸エステル
還元酵素をラージ及びファイル、バイオケミカル・ジャーナル、87:387(
1963)による方法により分析したくこれを引用して明細書記載の一部とする
)。蛋白濃度をクラーク及びスウィツアー、エクスベリメンタル・バイオケミス
トリイ(第2版、フリーマン・プレス、1977)の方法(これを引用して明細
書記載の一部とする)により、ビニ−レット試薬で測定した。ウシ血清アルブミ
ンを標準として用いた。
DNA塩基組成:
DNA塩基組成は、標準としてエセリシア・コリD N Aを含む0.12Mリ
ン酸ナトリウムpHe、s中、温度の機能(function)として吸光度の
濃色シフトを測定することにより決定した。マンテル及びマーマー、メソーズ・
エンザイモル、12.195−206(1968)。
B、結果
栄養強化及び分離: 53−56℃でのメタノール利用混合培養の増殖は迅速で
豊富であった。連続培養が確立したとき、希釈速度は洗浄することなく (wi
thout washout) 1時間当り0.45まで上げることができた
。スミアは胞子形成細菌を含む圧倒的なグラム陽性形及びいくつかの非常に大き
な多形態性細胞を含む種々の形態学的型を明らかにした。しかしながら、メタノ
ール最少培地にもどしたとき生育しなかった細菌のみは、すくに栄養強化容器か
ら分離できた。上に記載された分離操作を用いて多くの分離物をスクリーニング
したのち、MV培地中53℃で迅速に生育するものが見い出され、又、株名称M
GA3が得られた。
細胞及びコロニイ形態学:MGA3株の細胞は、丸い末端の杆状形(0,8−1
,OX2.5−4.5μ貫)であった(第1図)。若い培養菌はダラム陽性に染
色し、全ての培養菌はKOH陰性であった。■−型ペアの細胞が培養菌中にしば
しば存在した。空胞は全く見られず、ポリ−β−ヒドロキシブチラードはスダン
ブラックB染色では検出できなかった。MV寒天上に生じたコロニーは、無色、
半透明、円形、凸状で金縁を有していた。画線培養では種々の大きさのコロニー
が生成し、全てのコロニーは、アミノ酸、グルコース、酵母エキス又は少量の普
通ブロスを加えたMV寒天上で、添加しなかったMV寒天上でよりも大きく生育
した。色素は生成しなかった。
内生胞子:胞子は卵形で0.8−1.OXl、IXl、2μaであり、それるの
位置は大端部で、胞子ノウはふくれていた(第3図)c M〜7寒天上53°C
て生育した大部分の培養菌は、屈折性内生胞子を含まず、室温で保存すると速や
かに生存度を失うことが認められた。これらの培養菌は、新鮮培地に接種した場
合、生育しなかった。しかしながら、内生胞子を含む培養菌は、80°Cて10
分間加熱後でさえ、新鮮培地で生育した。M G A 3株は50−5.5°C
でよ(生育したが、はとんどの細胞は内生胞子を生成することなく溶解した。内
生胞子は、50−55°Cで18時間インキュベートし、そしてさらに37°C
で18時間インキュベートした培養菌中に形成することが認められた。培養菌を
これらの条件下で生育した場合、54%の細胞が屈折性内生胞子を含有し、クロ
ロホルム耐性コロニー形成単位は、生存細胞数(2,7X10−’細胞・Rff
一つの10%に等しかった。又、メタノール添加培地(MY、SM)は最少培地
(MV)よりも多くの内生胞子を生成することも認められた。普通寒天又は硫酸
マグ不ンウム(519・Q−1)添加普通寒天は良好な胞子形成培地としては機
能しなかった。
熱耐性(トレランス):MGA3の指数期培養菌は50℃で生育し、1xQ当り
含有する3、 I X I O@:)C’エニー成単位(CF U)は80°C
1o分の加熱により完全に無くtっだ。53℃で18時間生育して37℃で18
時間さらにインキュベートした培養菌からの殺菌した胞子懸濁液は、メタノール
塩培地(M V )上に置いたとき7.37X10’CFUを含有した。同じ懸
濁液は、800Cて10分加熱後、3.5x10’CFUを含有した。
ジピコリン酸ニジピコリン酸は増殖性細菌には存在しないが内生胞子中に大量に
存在する化合物である。MV培地に37°Cで生育したメチロフィルス・メチロ
トロフスの培養菌とMVで50℃で次いで37℃に変えて生育したMGA3株の
培養菌を、それぞれ70哩(湿a重りの細胞プレートの源とした。各細胞プレー
トを抽出してジピコリン酸を分析した。メチロフィルス・メチロトロフスの細胞
は検出可能なジピコリン酸を含有しなかったが、MGA3の細胞は0.189+
yのジピコリン酸を含有した。
生育:MGA3株は、J培地、バチルスの特殊の培養基を必要とする(fast
idious)種を生育するのに用いた天然培地「グレガーセン、ニール、ジェ
イ、アプル、マイクロハイロル バイオチクノル、5:123−123(197
8)、これを引用して明細書記載の一部とする]によく生育し、普通ブロス又は
普通寒天にほとんど生育しなかった。微生物はメタノールまたはマンニトールを
含むMU培地中で急速に発育する。この培地中に存在するビタミンのうち、ビタ
ミンBitだけが発育を刺激し、ビタミンB1.とビオチンの両方が発育に必須
である。培地が炭素およびエネルギー源としてグルコースを含むときは、MGA
3株の発育は遅い。マルトース、リボース、アセタート、グルコナートおよびア
ルファーケトグルタラードはほとんど利用されず、ガラクトースによる発育はわ
ずかであるか、またははっきりしない。ラクトース、スクロース、キシロース、
ホーラード、スクシナート、グリセロール、エタノール、n−プロパツール、n
−ブタノール、ホルムアルテヒド、メチルアミン、ジエチルアミン、またはトリ
メチルアミンは利用されない。
MはAPi高速高速Cステストわれた49種の基質(リホース、D −クルコー
ス、マンニトール、マルトース、D−タガトース、D−アラビトール、および5
−ケト−グルコナート)のうち7種だけから生産される。気体はつぎに記載の基
質からは発生しない:グリセロール、エリスリトール、D−アラビノース、L−
アラビノース、D−キシロース、L−キシロース、アドニトール、ベーターメチ
ル−キシロシド、ガラクトース、D−フルクトース、D−マンノース、L−ソル
ボース、ラムノース、ズルシトール、イノシトール、ソルビトール、アルファー
メチル−D−マンノシド、アルファーメチル−D−グルコナート、N−アセチル
−グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオ
ース、ラクトース、メリビオース、サッカロース、トレハロース、インスリン、
メレントース、D−ラフィノース、デンプン、グリコーゲン、キシリトール、β
−ゲンチオビオース、D−ツラノース、D−リキソース、D−フコース、L−フ
コース、D−アラビトール、グルコナート、または2−ケト−グルコナート。
MGA3株は1%NaC]を含むJvブロスては発育するが、5%NaClを含
むブロスで発育しない。
メタノール上での発育:MV培地中での8種のビタミン成分のうち、ビタミンB
l、とビオチンだけがメタノール上ytcAj株の発育に必要である。もしビタ
ミンB IfがMV培地がら除がれた場合は、MGA3株の発育はおこらない。
硝酸塩も窒素源として利用されない。
メタノール中でMGA3株の発育はpH7,0−7,5において最適である。p
H5,5では発育しない。最適発育温度そ50”Cがら53°Cの間であること
が判明した。微生物はMY培地中30℃と61℃にて発育した。25℃および6
5℃では発育しなかった。
第1表 MV培地中バチルス(Bacillus) MG A 3株の発育速度
に対する温度の影響
50 0.5153 0.4
3MGA3株の世代時間は50℃にてMV培地中1.4時間である。メタノール
上での発育は酵母抽出液のような複合栄養混合物をわずか添加することにより刺
激される。世代時間はこれらの培地中ではおよそ1時間減少する。
生化学的特徴
MGA3のメタノール増殖培養物から調製した粗細胞抽出物はヒドロキシビルハ
ートレダクターゼ活性を欠いているが多量のへキスo−x−e−、tスフアート
シンターゼ活性を有している。ヘキスロース−6−ホスフアートシンターゼの特
異的活性は使用した蛋白のmg・9当たりホルムアルデヒド6.27−3.72
μmである。
MGA3株はカタラーゼまたはチロシン分解酵素を産生じない。デンプン、ゼラ
チンおよびペクチンは加水分解しないが、発育はカゼイン含有平板上で阻害され
る。API高速高速ステストトクロームオキシダーゼ、ウレアーゼおよびアセト
インの存在を示している。
β−ガラクトシダーセ、リジン デカルボキシターセ、オルニチンデカルボキシ
ダーゼ、シトラード利用性、フェニルアラニン脱アミノ化、インドールに対する
高速Eテストは陰性であった。硝酸塩は亜硝酸塩に還元されなかった。
炭素およびエネルギー源としてメタノールまたはマンニトールによる発育細胞懸
濁液によるメタノール酸化を50°Cおよび37℃で測定した。炭素およびエネ
ルギー源としてメタノールにより発育した細胞は37℃にて、5.8X10−’
ミリモルmin−I−mg−1の速度でメタノール酸化する。炭素およびエネル
ギー源としてマンニトールにより発育した細胞は50℃にて、6.5X10−5
ミリモルmin−mg”の速度でメタノールを酸化する。
抗生物質感受性:MGA3株はすべての被験抗生物質に対して感受性を示した。
DNA塩基組成:MGA3株から分離されたDNAはG+Cで塩基含有44モル
パーセントを示す。
A、栄養要求変異株の生産
アミノ酸栄養要求およびリジン産生株を2種の環境分離物、バチルスMGA3お
よびN0A2から誘導した。バチルスMGA3は上記実施例1と同様にして、連
続培養物から分離した。N0A2は、同様の方法ではあるが、MV培地、メタノ
ール2 (V/V)を含む37℃のパンチ培養を採用し、殺菌した湿地黒泥土(
bog muck)に接種した。N0A2は実施例1に記載と同様のMGA30
種関連特性を示した。通常、アミノ酸栄養要求およびアナログ耐性変異株の両方
を誘発する標準突然変異誘発はエチルメタンスルホナー) (EMS)またはN
−メチル−N−二トローN′−二トロソグアニン(NTG)による処理をした。
突然変異処理細胞はカザミノ酸(CAA 012%)を添加したMV培地中で遅
い対数期(OD2.5)まで増殖した。培地(2,5m1)は同量の新鮮培地と
一緒にし、下記の量の化学的突然変異誘発物質を添加した:m1当たり
分 ℃NTG 50μg 10−15
’ 50EMS 10−20μ] 20−25 3
7ついて希釈し、カザミノ酸(0,2−0,4%)、被験アミノ酸(60mg/
])のいずわがまたは両方を含む培地中て成長(outgrowth)させる。
6時間増殖後、この培地を3部の炭素無含有培地で希釈し、37℃にて18時間
インキュベートする。胞子を遠心分離し、二度洗浄し、胞子セ濁液を4°Cにて
保存する。胞子懸濁液の適当な希釈液をアミノ酸含有寒天上で平板培養し、50
°Cにて36時間インキュベートする。コロニーはアミノ酸含有培地、最小培地
にレプリカ培養し、−夜50°Cにてインキュベートする。1個またはそれ以上
の発育用アミノ酸を要求すると見られるコロニーを個々のアミノ酸およびアミノ
酸の混合物の成長につき検討し、特異的アミノ酸要求を決定する。リジン、トリ
プトファン、フェニルアラニンおよび他のアミノ酸の産生に重要な突然変異株を
産生ずる突然変異誘発処理は下記の表に概括する。
栄養要求株の生産:
尖体 見付 透茜週 虻 新変異株Gr 07/22/
88 NTG 50 10 7/30−130−15(hse−)
12108/87 EMs 10 15 512(hse−)ATCC
No、53908::55 07/22/88 NTG 50 10
10/12−]1(leu−)10/12−24(tyr−)
10/12−24(try−)
11101/88 N T G 50 10 11/25−1(tyr
−phe−)12/9−1(tyr−phe−)
11/26−1(tyr−phe−)
NOA2 08/11/88 NTG 50 10 g/14−4(
hse−)8/16−5(hse−)
9/3l−4(phe−)
9/3l−4(+)he−)
1.1101/88 N T G 50 10 11/1O−12(p
he−tyr−)*:NTG μg/ml ; EMS μl/mlB、栄養
要求の立証
各栄養要求単離物のアミノ酸要求はMVブロス培地に添加したアミノ酸に対する
その発育応答により立証した。
実施例3−アナログ耐性
リシンアナログ 5−2−アミノエチル−1−ンステイン(AEC)をMGA3
およびN0A2の栄養要求および不栄養要求株のうちからリジン過剰生産変異株
の効果的な選択に使用した。AEC2g/]の量に抵抗性を示す変異株は、AE
Cおよびメチオニン、スレオニン、およびイソロイシン(250−500mg/
l)を含むMV培地に突然変異誘発株を平板培養する段階的方法(5段階で2g
/]のAEC抵抗性になるように;およそ0.25g/Iの発育数)で生産した
。各段階において、培地は50°Cにて3日間インキュベートした。得られた耐
性単離物を所定の耐性濃度に達するか、さらに突然変異誘発を要求するまでの高
濃度のAECを含有する培地上で処理する。AECの耐性増大とリジン産生増加
は高い相関関係を有する。、原始栄養株M G A 3 # 55を上記の方
法で選択したが、抵抗性はAEC2g/lであり、リシン0.12g/lを産生
じた。リジン生産量はリジン経路に無関係の栄養要求マーカーの導入により改善
され、例えば、1.1/25−1 (t ry−phe→および12/9−1
(t y r−a ] aつは各々リジンを0. 6および0.8g/l生
産した。8/ 14−4 (h s e−)のようなホモセリン無含有突然変異
株は、高AEC耐性でなくても、はぼ同量のリジンを生産した。しかし、AEC
のより高濃度(600−1500mg/])に対して抵抗性を有する変異株を選
択することにより、生産量をおよそ2倍にすることができる。
実施例4−リジン過剰生産
リジンはバイオケミカル・ジャーナル第67巻筒416−423頁(1957年
)に記載の操作−引用してこの明細書の記載とする−により培養土清液に、酸性
ニンヒドリン測定方法を用いて測定した。ニンヒドリン試薬は氷酢酸64m1.
0.6M燐酸16m1およびニンヒドリン(シグマ#N 4876 ) 1
gを混合して調製した。培養試料をエビンドルフ遠心分離機の高速度回転で2
分間遠心分離した。培養土清液(,05m1)をニンヒドリン試薬(553m1
)と5mlのね1:ふた式パイレンクス管中にて混合した。リジンの標準溶液を
同様に処理した。管を100°Cの水浴中で1時間加熱し、氷酢酸(1,4m1
)を冷却した管に添加した。吸光度を440nmにて、回帰分析によりリジン濃
度をコンピューター化するベックマンDU−70分光光度計で読み取った。測定
結果は日ごとに高い直線性および再現性を示した。別法として、アミノ酸を〇−
フタルアルデヒド(OPA)によるプレーカラム誘導体を用いるHPLCおよび
0PA−アミノ酸誘導体の蛍光度測定により測定した。培養土清液はメタノール
で50−500倍に希釈し、ついで、高速にて2−5分間遠心分離し、沈澱した
蛋白を除去した。試料(25μL)を0−フタルアルデヒド(ピアス#2601
5)(50μML)と混合し、5H粒径C−18逆相カラム(アルチク#280
66)上に注入した。OPAアミノ酸分離は流速1mL/分および50mM燐酸
カリウム(pH6,8)中非直線勾配置0−50%アセトニトリルを用いて行っ
た。
[振とうフラスコスクリーニング法]
存在し得るリジンプロデューサーをスクリーニングするため、MGA3またはN
0A2変異体を10g/リットルに、HPo、、32g/リットル(NH,)、
So、、10g/リットルCa Co、、0゜2g/リットルM g C(h・
6H,0,20g/リットルメタノール、後記濃度の微量金属、ビタミン類(ビ
オチン50μg/リットルおよびB+tlOμg/リットル)および成長に必要
なアミノ酸類200mg/リットルを含む培地で成長させた。株を、バッフルを
備え、メタノール蒸発防止用のミルクフィルターディスクと2ミルのテフロン膜
で覆った250mI2の振とうフラスコ中、上記培地25m12中で培養した。
培養は1−4%の接種物で開始し、空気振とう器中、回転速度300rpm、5
0℃で成長させた。メタノール濃度は12時間毎に試料をとり出し、細胞を遠心
して分離し、上清をガスクロマトグラフに注入して測定した。濃度が200mM
未満になるとメタノールをフラスコに加えた。実験は通常24−48時間行なっ
た。リジンの生成はニンヒドリンまたはHPLCて測定した。数種の変異体をス
クリーニングした結果を第2表に示す。これらの結果は、メタノールを供給しな
がら5す・ノトルの撹拌タンク反応器で行なったリジン生産とよい相関性を示し
た。
第2表
株 振とうフラスコ 反応器
リジン(g/ff) リジン(g/12)NOA28/14−4
0.96 2.2NOA2 R20,600,5O
NO^28/16−5 No、 l 2.6 ND’N0A28/
16−5NO,32,84,5Gr 7/30−15 Its、 l 4.
1 4.0Gr 7/30−15 No、 2 7.0 7
. OMGA:(11/25−I Q、 58 NDMGA31
2/9−1 0.11 0.8NOA2 g/16−5
7.8 8.0:撹拌反応器中でのリジン産生;
硫酸またはりん酸制限最低塩培地を用いてこの発明の適当な変異株を通気撹拌反
応器中で培養してリジンを過剰産生させた。硫酸制限を使用する場合、塩化アン
モニウムが硫酸アンモニウムを置換し、微量金属はすべて塩化物として用いた。
成長に必要な硫酸塩は硫酸カリウムとして供給した。リジンプロデューサーの成
長に必要なアミノ酸は、純アミノ酸またはアミノ酸加水分解物を供給することに
より目的とする細胞密度に達するに必要な濃度で供給した。細胞は、下記濃度範
囲の栄養物を用いて0.5−1最大値の成長率で培養することができる。硫酸ア
ンモニウム20−500 mM、 W酸塩0.1−500mM、メタ/−ル20
−800mM、りん酸塩10−125mM、マグネシウム0.5−20 mM、
7ンガン2−100μM、鉄10−800μM、カルシウム0.1−1.5m
M、塩素イオ70−80mM、亜鉛1−20ttλ11コバルト0.1−20a
M1銅01−20μM1モリブテン酸0.22−40Jt、はう酸0.4−8μ
M、ビタミ7B+20.3gg −c−’ −1rr+g −4−1およびビオ
チン20μg−ρ−’ 20 m g −12−’a a応益のpHは、水酸
化アンモニウムを添加して71に維持した。溶解酸素濃度は、撹拌速度もしくは
通気速度の調節、または純酸素の添加により10%レベルに維持した。発泡は、
ノリコンベース消泡剤(SAG−471)の自動添加により制御した。メタノー
ル濃度は、ガスクロマトグラフィーで監視し、反応器にメタノールを周期的に加
えて50−600mMに維持した。リジン産生はおおむね非成長随伴的であり、
スレオニンがリジン産生阻害を示した。産生リジン量は、りん酸または硫酸制限
を用いたときにほぼ同一であった。Gr7/3O−15No、1生物を反応型中
硫酸制限で培養すると、40時間培養で合計4.0g−ρ−゛″細胞乾燥重量が
リジン7.0g−Q−’を産生じた。
実施例5[1種より多いアミノ酸の同時過剰産生]実施例4記載の培地を用いて
適当な変異体をりん酸または硫酸制限条件で培養することにより、2種のアミノ
酸の同時過剰産生をもたらすことができる。実施例4記載の反応器法を用いて、
変異体N0A2・8/16 pNo、3がリジンとアスパラキン酸両者を同時
産生した。培養40時間後、反応器中に3.5g−12−’乾燥細胞重量、4.
5g−Q−’す/ンおよび2g−Q−’アスパラギン酸が含まれていた。
実施例6[高細胞密度に至る成長の達成法コMGA3の高細胞密度に至る成長は
、下記培地栄養供給システムを用いて達成した。培地には、3.09g’I2−
’に、HPO,,0,9g−12−’NaH,PO,,2g−(−’ (NH4
)2SO4,20mg−Q−’ビオチン、0.2 g −(1−’Mg CQt
・6Hz0. 1 mg −(1−’ ヒ9 ミンBI!、3.98mg−f
2”FeCf2t・4Ht0,7.36mg −Q−’CaC(lx・2Hv○
、9.9mg−(1−’MnCQx・4H!○、136μg/リットル1ncQ
t、54.4 u g/リットルc u CQt ・2H20,804μg−(
−ICOCρt’2Hto、96.8μg’(!−’Na2M。
O4・2H20,59,6μg−Q−’HsBo3.32g−12弓メタノール
および250mg−(1−’酵母抽出物が含有されていた。栄養素の濃度は、実
施例4に記載したのと同様に変化し得る。細胞培養は、作業容量11す7トルて
14リットル発酵器中50°Cで行なった。
撹拌速度は900−1500rpmとした。pHは、8N水酸化アンモニウムの
添加により7.1に維持した。水酸化アンモニウムは窒素源の役もした。りん酸
、マグネシウムおよびカルシウムレベルは、10・1:0,1りん酸:マグネシ
ウム:カルシウム液(IMKH,PO2、OIMMgCI2t・6Ht○、0.
OI MCa C(!! ・2H20)の自動供給により維持した。りん酸/
マグネシウム/カルシウムミックスの供給は、pH調節器にポンプをつないで、
pH調節のため水酸化アンモニウムを添加するとき常にりん酸/マグネシウム/
カルシウムミックスか供給されるようにして行なった。水酸化アンモニウム(8
N)対りん酸・マグネシウム・カルシウム供給物(IMりん酸、0.1Mマグネ
ンウム、0.01カルシウム)の比率は1・2になるように調節した。これは窒
素、りん酸、マグネシウム、カルシウムのバランスを適当に維持した。通気速度
は005−2vvとした。溶解酸素濃度は電位プローブで監視し、溶解酸素レベ
ルを純酸素強化通気により30%に維持した。使用した純酸素llは溶解酸素プ
ローブに結合したマスフローコントローラーニヨり監視制御した。発泡は、シリ
コンベース消泡剤(SAG−471)の自動添加により液面コントローラーを用
いて制御した。廃ガス(2M化炭素、酸素、窒素、アルゴン、メタノール、アン
モニア、水)は、マススペクトルで監視した。メタノールレベルは、ツアオ、オ
ースチン、「オンラインメタノールセンサーを用いるメタノール濃度制御」、ア
メリカン・ケミカル・ソサイアティ・ナショナル・ミーティング、トロント、オ
ンタリオ、カナダ(]、998866月記載のシリコンチュービングプローブを
ガスクロマトグラフのフレームイオン検出器に連結してなるオンラインメタノー
ルセンサーで連続的に監視した。カスクロマトグラフからの信号を比率制御器を
用いてメタ/−ル供給ポンプ(ワタソン・マーロー)の自動操作に用いた。培養
物へのメタノール供給量はロードセルを用いて監視した。メタノールには下記濃
度の所要微量金属を含ませた。1.09g ”2−’Fe50.−7HtO,0
,39g ”Q−’MnCQt−4HtO122mg−5−’Zn5O,−7H
,O519mg−12−’CoCL・6H,0119mg−ff−’Na、Mo
0a・2H,0,19mg −(1−’CuS06・5 H、O,この培地と上
記供給ストラテジーにより、生物は50 g−、Q−’細胞乾燥重量(第6図)
まで成長し得た。
FIG、 1
FIG、 2
FIG、 3
時間(時間)
FIG、 4
国際調査報告
l−11、ass、+n*w*p(7,’US 901019082国際調査報
告
us 9001901i+
SA 36278
Claims (50)
- 1.有効量の窒素源、ビタミンB12,ピオチン及び炭素源と少なくとも一つの アミノ酸又はアミノ酸混合物を生成するためのエネルギー源としてメタノールを 含む水性普通培地中、50℃で持続した成育を示す、バチルス(Bacillu s)属のタイプIC1資化性細菌の生物学的に純粋な株のアミノ酸自家栄養株を 培養することを含む、アミノ酸の製造法。
- 2.該細菌、アミノ酸及び培地成分を含む水性培養液をさらに乾燥してアミノ酸 含有生成物を得る、請求項1の方法。
- 3.該乾燥生成物を動物飼料又は動物飼料添加物用に用いる、請求項2の方法。
- 4.該培養物から該アミノ酸をさらに分離することを含む、請求項1の方法。
- 5.該自家栄養株が生物学的に純粋なMGA3株及びその形態学的変異菌の変異 株である、請求項1の方法。
- 6.該水性普通培地が有効量のリン酸源、硫酸源及び微量成分を含む、請求項1 の方法。
- 7.該水性普通培地が有効量のリン酸源、硫酸源、カルシウム源及び微量成分を 含む、請求項1の方法。
- 8.該自家栄養株が少なくとも3g/lのアミノ酸を生成する、請求項1の方法 。
- 9.該自家栄養株が約5から約150g/lのアミノ酸を生成する、請求項1の 方法。
- 10.該アミノ酸自家栄養株がさらにアミノ酸類似体耐性である、請求項1の方 法。
- 11.該自家栄養株が相当量のリジン、トリプトファン又はフェニルアラニン或 いはこれらの混合物を分泌する、請求項1の方法。
- 12.該生物学的に純粋な株が8g/lまでのL−リジンを分泌する、請求項1 の方法。
- 13.該生物学的に純粋な株バチルスの乾燥重量50グラム細胞までの生育を示 す、請求項1の方法。
- 14.該株が約20−50g/lの細胞密度まで生育する、請求項9の方法。
- 15.該培地が少なくとも50mMメタノールを含む、請求項1の方法。
- 16.該窒素源が硫酸アンモニウムである、請求項1の方法。
- 17.該自家栄養株が同時にリジンとアスパラギン酸を生成する、請求項1の方 法。
- 18.該自家栄養株が約4.5g/lまでのL−リジンと約27g/lまでのL −アスパラギン酸を生成する、請求項17の方法。
- 19.メタノールと微量成分を、バッチ培養で生育している自家栄養株に要求さ れるアミノ酸と共に自動的に供給する、請求項7の方法。
- 20.該微量成分を該メタノールと連続的に供給する、請求項7の方方法。
- 21.マグネシウム及びカルシウムリン酸塩の該培地への添加がpH調整と結び 付く、請求項7の方法。
- 22.メタノール、微量成分及びアミノ酸を半連続工程中、成育している自家栄 養株に連続的に供給する、請求項7の方法。
- 23.メタノール、微量成分及びアミノ酸を連続工程中、成育している自家栄養 株に連続的に供給する、請求項7の方法。
- 24.水酸化アンモニウム及び微量物質の連続的供給の結果、50グラム/リッ トルの乾燥細胞量となる、請求項1の方法。
- 25.株が炭素源及びエネルギー源としてのメタノール、ビタミンB12及びビ オチンを含む普通培地中50℃で持続した生育を示す、バチルス属のタイプIC 1資化性細菌の生物学的に純粋な株。
- 26.該株が、変異誘発でアミノ酸自家栄養株を容易に生成するMGA3及びそ の形態学的変異歯並びにアミノ酸類似体耐性変異株である、請求項25の生物学 的に純粋な株。
- 27.該株が、窒素源を含む培地で生育したとき、相当量の少なくとも一つのア ミノ酸を分泌する、請求項26の生物学的に純粋な株。
- 28.該窒素源が水酸化アンモニウムである、請求項27の生物学的に純粋な株 。
- 29.該培地が少なくとも0.1g/lのビタミンB12を含む、請求項25の 生物学的に純粋な株。
- 30.該細菌が該培地中、約50グラム乾燥重重/lまでの細胞密度に生育する 、請求項25の生物学的に純粋な株。
- 31.該株が60℃で成育を示す、請求項25の生物学的に純粋な株。
- 32.該株が、約45℃から約55℃の温度で、約0.2hr−1から約1.5 hr−1の速度のメタノールで生育可能である、請求項25の生物学的に純粋な 株。
- 33.該株がS−アミノエチル−L−システインによる生育阻害に対し耐性でリ ジンを分泌する、請求項25の生物学的に純粋な株。
- 34.該株がさらに可能性NAD+依存性メタノールデヒドロゲナーゼを生成す る、請求項25の生物学的に純粋な株。
- 35.該株がホモセリン自家栄養株である、請求項25の生物学的に純粋な株。
- 36.該株がトリプトファンアミノ酸類似体耐性の、ホモセリン、チロシン、フ ェニルアラニン自家栄養株である、請求項25の生物学的に純粋な株。
- 37.バチルス属のタイプIC1資化性細菌の突然変異原付与自家栄養株を、窒 素源、ビタミンB12、ビオチン及び炭素源とエネルギー源としてのメタノール 並びに必要なアミノ酸を含有する水性普通培地中、50℃で培養しリジンを生成 することを含む、リジンの製造法。
- 38.該自家栄養株がS−2−アミノエチルシステイン耐性のホモセリン自家栄 養株である、請求項37の方法。
- 39.該培養細胞が少なくとも約3g/lのL−リジンを生成する、請求項37 の方法。
- 40.(a)炭素源とエネルギー源としてのメタノール、ビタミンB12及びビ オチンを含む水性普通培地中、50℃で持続した生育を示す、バチルス属のタイ プIC1資化性細菌の生物学的に純粋な株を分離すること、及び (b)該分離細菌をかなりの量の、アミノ酸生成変異株を生成するのに有効な変 異誘発剤で処理すること を含む、バチルス属のタイプIC1資化性細菌の生物学的に純粋な株のアミノ酸 生成変異株の分離方法。
- 41.さらに、ビタミンB12及び少なくとも一つの必要なアミノ酸を含む培地 での成育によりアミノ酸生成変異株を選別することを含む、請求項40の方法。
- 42.該細菌が化学的変異誘発に付される、請求項40の方法。
- 43.該変異株が該細菌のアミノ酸自家栄養株である、請求項40の方法。
- 44.該変異誘発剤がメタンスルホン酸エチル又はN−メチル−N−ニトロ−N −ニトロソグアニンである、請求項40の方法。
- 45.段階(b)の該自家栄養株をアミノ酸類似体で攻撃してアミノ酸生成を増 加させる次の段階を含む、請求項40の方法。
- 46.該アミノ酸類似体がS−2−アミノエチル−L−システインである、請求 項40の方法。
- 47.生成された該アミノ酸がりジンである、請求項40の方法。
- 48.該変異株がアミノ酸類似体耐性である、請求項40の方法。
- 49.該細菌により生成された該アミノ酸がりジンである、請求項39の方法。
- 50.(a)炭素源とエネルギー源としてのメタノール、ビタミンB12及びビ オチンを含む水性普通培地中、50℃で持続した生育を示す、バチルス属のタイ プIC1資化性細菌の生物学的に純粋な株を分離すること、及び (b)該分離細菌をかなりの量の、該細菌のアミノ酸自家栄養株を生成するのに 有効な変異誘発剤で処理すること、(c)少なくとも一つの必要なアミノ酸を含 んでいる最少ビタミン培地での成育に関し、該処理された細菌の分離物を試験す ることを含む、バチルス属のタイプIC1資化性細菌の生物学的に純粋な株のア ミノ酸生成変異株の分離方法。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US33569189A | 1989-04-10 | 1989-04-10 | |
US335,691 | 1989-04-10 | ||
US35143689A | 1989-05-12 | 1989-05-12 | |
US351,436 | 1989-05-12 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03505284A true JPH03505284A (ja) | 1991-11-21 |
Family
ID=26989842
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2506452A Pending JPH03505284A (ja) | 1989-04-10 | 1990-04-09 | メチロトロフィック・バチルスによるアミノ酸の製造 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0422187B1 (ja) |
JP (1) | JPH03505284A (ja) |
AT (1) | ATE128187T1 (ja) |
AU (1) | AU631640B2 (ja) |
BR (1) | BR9006409A (ja) |
CA (1) | CA2030529C (ja) |
DE (1) | DE69022522T2 (ja) |
ES (1) | ES2080825T3 (ja) |
WO (1) | WO1990012105A2 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007088970A1 (ja) | 2006-02-02 | 2007-08-09 | Ajinomoto Co., Inc. | メタノール資化性細菌を用いたl-リジンの製造法 |
WO2007114465A1 (ja) | 2006-03-30 | 2007-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | メタノール資化性細菌を用いたカルボン酸の製造法 |
JP2015504686A (ja) * | 2012-01-25 | 2015-02-16 | シンヴェント エイエス | バシラス由来の新規のメタノールデヒドロゲナーゼ酵素 |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR0130196B1 (ko) * | 1990-02-15 | 1998-04-03 | 도바 다다스 | 염기성 아미노산과 산성 아미노산의 동시 발효법 |
US5196326A (en) * | 1990-02-15 | 1993-03-23 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for concurrent fermentation of basic amino acid and acidic amino acid |
JP3046332B2 (ja) * | 1990-08-02 | 2000-05-29 | 協和醗酵工業株式会社 | 発酵法によるアミノ酸の製造法 |
WO1999020784A1 (en) * | 1997-10-17 | 1999-04-29 | Regents Of The University Of Minnesota | PRODUCTION OF GLUTAMATE USING SALT TOLERANT, METHANOL UTILIZING $i(BACILLUS) |
AU1091999A (en) * | 1997-10-17 | 1999-05-10 | Regents Of The University Of Minnesota | Production of lysine using salt tolerant, methanol utilizing bacillus |
US6083728A (en) * | 1997-10-17 | 2000-07-04 | Regents Of The University Of Minnesota | Production of glutamate using wild type Bacillus methanolicus |
EP1063288A3 (en) * | 1999-06-15 | 2001-01-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-lysine |
US6689601B2 (en) | 2000-09-01 | 2004-02-10 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | High growth methanotropic bacterial strain |
JP2004166592A (ja) | 2002-11-20 | 2004-06-17 | Ajinomoto Co Inc | メチロトローフを用いたl−アミノ酸の製造法 |
JP2004166595A (ja) | 2002-11-20 | 2004-06-17 | Ajinomoto Co Inc | メチロトローフを用いたl−アミノ酸の製造法 |
JP4120364B2 (ja) | 2002-11-20 | 2008-07-16 | 味の素株式会社 | メタノール資化性菌を用いたl−リジンまたはl−アルギニンの製造法 |
DE102004001674B4 (de) | 2003-01-29 | 2019-01-24 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Einsatz von Methanol verwertenden Bakterien |
JP2011067095A (ja) * | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
CN113331211A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-09-03 | 广西壮族自治区亚热带作物研究所(广西亚热带农产品加工研究所) | 一种防治百香果茎基腐病的药剂及其制备方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA923059A (en) * | 1967-08-05 | 1973-03-20 | Kurasawa Shogo | Fermentation process for the production of amino acids |
DE3533198A1 (de) * | 1985-09-18 | 1987-03-19 | Kernforschungsanlage Juelich | Verfahren zur fermentativen herstellung von l-aminosaeuren aus (alpha)-ketocarbonsaeuren |
-
1990
- 1990-04-09 BR BR909006409A patent/BR9006409A/pt not_active Application Discontinuation
- 1990-04-09 DE DE69022522T patent/DE69022522T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-09 CA CA002030529A patent/CA2030529C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-09 ES ES90906690T patent/ES2080825T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-09 AU AU55229/90A patent/AU631640B2/en not_active Ceased
- 1990-04-09 AT AT90906690T patent/ATE128187T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-04-09 WO PCT/US1990/001908 patent/WO1990012105A2/en active IP Right Grant
- 1990-04-09 EP EP90906690A patent/EP0422187B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-09 JP JP2506452A patent/JPH03505284A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007088970A1 (ja) | 2006-02-02 | 2007-08-09 | Ajinomoto Co., Inc. | メタノール資化性細菌を用いたl-リジンの製造法 |
WO2007114465A1 (ja) | 2006-03-30 | 2007-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | メタノール資化性細菌を用いたカルボン酸の製造法 |
JP2015504686A (ja) * | 2012-01-25 | 2015-02-16 | シンヴェント エイエス | バシラス由来の新規のメタノールデヒドロゲナーゼ酵素 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2030529A1 (en) | 1990-10-11 |
ES2080825T3 (es) | 1996-02-16 |
WO1990012105A2 (en) | 1990-10-18 |
DE69022522T2 (de) | 1996-05-15 |
EP0422187A1 (en) | 1991-04-17 |
WO1990012105A3 (en) | 1990-11-15 |
BR9006409A (pt) | 1991-08-06 |
ATE128187T1 (de) | 1995-10-15 |
AU5522990A (en) | 1990-11-05 |
AU631640B2 (en) | 1992-12-03 |
EP0422187B1 (en) | 1995-09-20 |
CA2030529C (en) | 1999-10-19 |
DE69022522D1 (de) | 1995-10-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPH03505284A (ja) | メチロトロフィック・バチルスによるアミノ酸の製造 | |
US8592198B2 (en) | Method for culturing microorganisms on a growth substrate comprising biomass obtained from methanotrophic bacteria | |
JP3690958B2 (ja) | 乳酸菌用合成培地 | |
US6110713A (en) | Production of glutamic acid and lysine using auxotrophic mutants of Bacillus methanolicus | |
Archibold et al. | Regulation of methionyl-transfer ribonucleic acid synthetase formation in Escherichia coli and Salmonella typhimurium | |
Hummel et al. | Leucine dehydrogenase from Bacillus sphaericus. Optimized production conditions and an efficient method for its large-scale purification | |
US5314820A (en) | Process and microorganisms for producing single cell protein | |
JPH0564597A (ja) | 発酵法によるリボフラビンの製造法 | |
US4104124A (en) | Process for the production of single cell protein and amino acids | |
US6261825B1 (en) | Production of amino acids using auxotrophic mutants of methylotrophic bacillus | |
US7078222B2 (en) | Microorganism for producing riboflavin and method for producing riboflavin using the same | |
JP3154348B2 (ja) | スカトール分解能を有する微生物およびスカトールの微生物的分解法 | |
KR880002417B1 (ko) | 구아노신의 제조법 | |
FR2653135A1 (fr) | L-carnitine deshydrogenase stable et procede pour sa production. | |
JP2570313B2 (ja) | 新規微生物 | |
WO1999020785A1 (en) | Production of glutamate using wild type bacillus methanolicus | |
JP2518218B2 (ja) | 微生物菌体の製造方法 | |
JPS6291177A (ja) | セレン含有微生物菌体 | |
Shiio et al. | Genetically altered repression pattern of purine nucleotide synthesizing enzymes and inosine production in 8-azaguanine resistant mutants of Bacillus subtilis | |
JP3129773B2 (ja) | D−リボースの製造法 | |
JP3413294B2 (ja) | 2,5−ジヒドロキシピリジンの製造法および2,5−ジヒドロキシピリジン生産菌 | |
JP2676741B2 (ja) | 新規微生物 | |
Hong et al. | A 3, 5-diaminohexanoate-decomposing Brevibacterium | |
WO1998054297A1 (fr) | Micro-organismes produisant l'acide 5-aminolevulinique et procedes de production de cet acide a l'aide de ces micro-organismes | |
JP2004113002A (ja) | プロトンatpアーゼ活性低下株を用いたグルタミン酸の製造法 |