JP2009153382A - メタノール資化性細菌を用いたカルボン酸の製造法 - Google Patents
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Abstract
【課題】安価で大量に入手可能なメタノールを用いて効率良くカルボン酸を製造する。
【解決手段】カルボン酸生産能を有するメタノール資化性細菌をメタノール及びカウンタイオンを含む液体培地で培養し、同培地中にカルボン酸を生成、蓄積させる発酵法によるカルボン酸の製造法で、メタノール及びカウンタイオンを含む物質を流加培養により培地中に流加させ、発酵培地内の総イオン強度を一定以下に制御する方法。
【選択図】なし。
【解決手段】カルボン酸生産能を有するメタノール資化性細菌をメタノール及びカウンタイオンを含む液体培地で培養し、同培地中にカルボン酸を生成、蓄積させる発酵法によるカルボン酸の製造法で、メタノール及びカウンタイオンを含む物質を流加培養により培地中に流加させ、発酵培地内の総イオン強度を一定以下に制御する方法。
【選択図】なし。
Description
本発明は微生物工業に関連したものであり、詳しくは、発酵法によるカルボン酸の製造法、および同製造法に用いる微生物に関するものである。
L−リジン、L−グルタミン酸、L−スレオニン、L−ロイシン、L−イロソイシン、L−バリン及びL−フェニルアラニン等のL−アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、バチルス属、エシェリヒア属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、ペニシリウム属、キャンディダ属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。これらの微生物は、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。また、組換えDNA技術によりL−アミノ酸の生合成酵素を増強することによって、L−アミノ酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。
また、従来、安価に大量に入手可能な発酵原料であるメタノールから発酵法によりカルボン酸を製造する方法としては、アクロモバクター属およびシュードモナス属(特許文献 1)、プロタミノバクター属(特許文献2)、プロタミノバクター属及びメタノモナス属(特許文献3)、ミクロサイクラス属(特許文献4)、メチロバチルス属(特許文献5)、バチルス属(特許文献6)などに属する微生物を用いる方法が知られている。
これまで、人工変異による育種および組換えDNA技術を使ってジヒドロジピコリン酸合成酵素およびアスパルトキナーゼを増強することで、メチロフィラス属細菌を用いたL−アミノ酸製造法の開発を行ってきた(特許文献7)。さらに、メタノール資化性細菌を用いたメタノールからの発酵法によるアミノ酸製造に、アミノ酸の排出過程が、大きな障壁であることを示し、これを解決する手段として、コリネバクテリウム属細菌より単離した、L-リジンの排出に関与する蛋白質LysE蛋白質から、メタノール資化性細菌でL-リジン排出活性を発揮するような改変体を取得した。我々は上記の人工変異による育種、組換えDNA技術およびこの改変したL-リジン排出担体を使うことで、L-リジンを効率よく生産させることができることを明らかにし、メチロフィラス属細菌を用いたL−アミノ酸製造法の開発を行ってきた(特許文献7または8)。
これまで、人工変異による育種および組換えDNA技術を使ってジヒドロジピコリン酸合成酵素およびアスパルトキナーゼを増強することで、メチロフィラス属細菌を用いたL−アミノ酸製造法の開発を行ってきた(特許文献7)。さらに、メタノール資化性細菌を用いたメタノールからの発酵法によるアミノ酸製造に、アミノ酸の排出過程が、大きな障壁であることを示し、これを解決する手段として、コリネバクテリウム属細菌より単離した、L-リジンの排出に関与する蛋白質LysE蛋白質から、メタノール資化性細菌でL-リジン排出活性を発揮するような改変体を取得した。我々は上記の人工変異による育種、組換えDNA技術およびこの改変したL-リジン排出担体を使うことで、L-リジンを効率よく生産させることができることを明らかにし、メチロフィラス属細菌を用いたL−アミノ酸製造法の開発を行ってきた(特許文献7または8)。
上記のような微生物育種の改良により、メタノール資化性細菌を用いた物質生産性はかなり高まっているが、さらに安価かつ効率的なメタノールを使用したカルボン酸の製造法の開発が求められている。
特開昭45-25273号公報
特公昭49-125590号公報
特開昭50-25790号公報
特開昭52-18886号公報
特開平4-91793号公報
特開平3-505284号公報
国際公開00/61723号パンフレット
特許公開2004−166594号公報
本発明は、安価で大量に入手可能なメタノールを用いて、効率良く、カルボン酸、特にL-アミノ酸を製造する方法を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、メタノール資化性細菌をメタノールを炭素源として発酵生産を行う際に、イオン強度が高いとメタノール資化性細菌の増殖が阻害されることを見出し、培養中のイオン強度上昇速度が一定以下になるように制御しながら流加させることにより、菌体生育を阻害することなく、高発酵生産性が維持できることに成功した。
すなわち本発明は以下の通りである。
(1)カルボン酸生産能を有するメタノール資化性細菌をメタノール及びカウンタイオンを含む液体培地で培養し、同培地中にカルボン酸を生成、蓄積させる発酵法によるカルボン酸の製造法で、メタノール及びカウンタイオンを含む物質を流加培養により培地中に流加させ、発酵培地内のカウンタイオンのイオン強度を一定以下に制御する方法。
(2) 培地中の総カウンタイオンのイオン強度の上昇速度が0.02mol/m3/hr以下になるようにイオン強度制御する(1)の方法。
(3)前記イオン強度をメタノール資化性細菌の増殖期に制御する方法である(1)は2に記載の方法。
(4)前記カウンタイオンを含む物質が硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、グルタミン酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム、フマル酸アンモニウム、アスパラギン酸アンモニウム、尿素からなる群より選択される1種又は2種以上の物質である(1)〜(3)に記載の方法。
(5)前記カルボン酸がL-アミノ酸である(1)〜(4)に記載の方法。
(6)前記L-アミノ酸が、L-リジンである(1)〜(5)に記載の方法。
(7)前記メタノール資化性細菌が、アクロモバクター属、シュードモナス属、プロタミノバクター属、メタノモナス属、ミクロサイクラス属、メチロバチルス属、バチルス属、メチロフィラス属細菌からなる群より選択される微生物である(1)〜(6)に記載の方法。
(8)前記メタノール資化性細菌が、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群より選択される1種または2種以上の酵素活性が増強するように改変された細菌である(1)〜(7)に記載の方法。
(9)前記メタノール資化性細菌が、さらにL-リジンによるフィードバック阻害を受けないように改変されたジヒドロジピコリン酸合成酵素及び/又はアスパルトキナーゼをコードするDNAを保持する細菌である(1)〜(8)項に記載の方法。
(10)前記メタノール資化性細菌が、さらにメタノール資化性細菌に導入したときにL-リジンの細胞外への排出を促進する変異型lysEタンパク質をコードするDNAを保持する細菌である(1)〜(9)に記載の方法。
(11)カルボン酸生産能を有するメタノール資化性細菌をメタノール及びカウンタイオンを含む液体培地で培養し、同培地中にカルボン酸を生成、蓄積させる発酵法によるカルボン酸の製造法で、一価イオンをカウンタイオンとして利用する方法。
(12)前記カウンタイオンが、塩化アンモニウム、グルタミン酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム、フマル酸アンモニウム、アスパラギン酸アンモニウムからなる群より選択される1種又は2種以上の物質である(11)に記載の方法。
(13) 前記カルボン酸がL-アミノ酸である(11)または(12)に記載の方法。
(14)前記L-アミノ酸が、L-リジンである(11)〜(13)に記載の方法。
(15)前記メタノール資化性細菌が、アクロモバクター属、シュードモナス属、プロタミノバクター属、メタノモナス属、ミクロサイクラス属、メチロバチルス属、バチルス属、メチロフィラス属細菌からなる群より選択される微生物である(11) 〜(14)に記載の方法。
(16)前記メタノール資化性細菌が、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群より選択される1種または2種以上の酵素活性が増強するように改変された細菌である(11)〜(15)に記載の方法。
(17)前記メタノール資化性細菌が、さらにL-リジンによるフィードバック阻害を受けないように改変されたジヒドロジピコリン酸合成酵素及び/又はアスパルトキナーゼをコードするDNAを保持する細菌である(11)〜(16)に記載の方法。
<1> 本発明の製造法
(1)カルボン酸生産能を有するメタノール資化性細菌をメタノール及びカウンタイオンを含む液体培地で培養し、同培地中にカルボン酸を生成、蓄積させる発酵法によるカルボン酸の製造法で、メタノール及びカウンタイオンを含む物質を流加培養により培地中に流加させ、発酵培地内のカウンタイオンのイオン強度を一定以下に制御する方法。
(2) 培地中の総カウンタイオンのイオン強度の上昇速度が0.02mol/m3/hr以下になるようにイオン強度制御する(1)の方法。
(3)前記イオン強度をメタノール資化性細菌の増殖期に制御する方法である(1)は2に記載の方法。
(4)前記カウンタイオンを含む物質が硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、グルタミン酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム、フマル酸アンモニウム、アスパラギン酸アンモニウム、尿素からなる群より選択される1種又は2種以上の物質である(1)〜(3)に記載の方法。
(5)前記カルボン酸がL-アミノ酸である(1)〜(4)に記載の方法。
(6)前記L-アミノ酸が、L-リジンである(1)〜(5)に記載の方法。
(7)前記メタノール資化性細菌が、アクロモバクター属、シュードモナス属、プロタミノバクター属、メタノモナス属、ミクロサイクラス属、メチロバチルス属、バチルス属、メチロフィラス属細菌からなる群より選択される微生物である(1)〜(6)に記載の方法。
(8)前記メタノール資化性細菌が、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群より選択される1種または2種以上の酵素活性が増強するように改変された細菌である(1)〜(7)に記載の方法。
(9)前記メタノール資化性細菌が、さらにL-リジンによるフィードバック阻害を受けないように改変されたジヒドロジピコリン酸合成酵素及び/又はアスパルトキナーゼをコードするDNAを保持する細菌である(1)〜(8)項に記載の方法。
(10)前記メタノール資化性細菌が、さらにメタノール資化性細菌に導入したときにL-リジンの細胞外への排出を促進する変異型lysEタンパク質をコードするDNAを保持する細菌である(1)〜(9)に記載の方法。
(11)カルボン酸生産能を有するメタノール資化性細菌をメタノール及びカウンタイオンを含む液体培地で培養し、同培地中にカルボン酸を生成、蓄積させる発酵法によるカルボン酸の製造法で、一価イオンをカウンタイオンとして利用する方法。
(12)前記カウンタイオンが、塩化アンモニウム、グルタミン酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム、フマル酸アンモニウム、アスパラギン酸アンモニウムからなる群より選択される1種又は2種以上の物質である(11)に記載の方法。
(13) 前記カルボン酸がL-アミノ酸である(11)または(12)に記載の方法。
(14)前記L-アミノ酸が、L-リジンである(11)〜(13)に記載の方法。
(15)前記メタノール資化性細菌が、アクロモバクター属、シュードモナス属、プロタミノバクター属、メタノモナス属、ミクロサイクラス属、メチロバチルス属、バチルス属、メチロフィラス属細菌からなる群より選択される微生物である(11) 〜(14)に記載の方法。
(16)前記メタノール資化性細菌が、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群より選択される1種または2種以上の酵素活性が増強するように改変された細菌である(11)〜(15)に記載の方法。
(17)前記メタノール資化性細菌が、さらにL-リジンによるフィードバック阻害を受けないように改変されたジヒドロジピコリン酸合成酵素及び/又はアスパルトキナーゼをコードするDNAを保持する細菌である(11)〜(16)に記載の方法。
<1> 本発明の製造法
本発明の方法は、カルボン酸生産能を有するメタノール資化性細菌をメタノール及びカウンタイオンを含む液体培地で培養し、同培地中にカルボン酸を生成、蓄積させる発酵法によるカルボン酸の製造方法で、メタノール及びカウンタイオンを流加培養により培地中に流加させ、培地中の総イオン強度を制御する方法である。ここで総イオン強度とは、培地中に含まれる全てのイオンの強度を意味する。培地中に含まれる全てのイオンとは、カルボン酸やカルボン酸のカウンタイオン、その他有機酸等を含む培地中のカチオン、アニオンを意味する。
ここで本発明において、「カルボン酸」とは、炭素骨格として、カルボキシル基(-CO2H)を有する物質で、例えば有機酸・脂肪酸・アミノ酸・ヒドロキシ酸・ケト酸等が含まれる。カルボン酸としては、特にL-アミノ酸が好ましく、L-アミノ酸の種類は特に制限されないが、L-リジン、L-オルニチン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L−シトルリン等の塩基性アミノ酸、L-イソロイシン、L-アラニン、L-バリン、L-ロイシン、L-グリシン等の脂肪族アミノ酸、L-スレオニン、L-セリン等のヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、L-プロリン等の環式アミノ酸、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン等の芳香族アミノ酸、L-システイン、L-シスチン、L-メチオニン等の含硫アミノ酸、L-グルタミン酸、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-アスパラギン等の酸性アミノ酸が挙げられる。中でも塩基性L-アミノ酸、L-リジン、L-アルギニン、L-オルニチン、L-ヒスチジンが望ましい。
本発明で用いられる培地は、炭素源としてメタノールを含んでおり、カルボン酸のカウンタイオンを含むように調整された培地である。ここで、カウンタイオンの供給源である物質は、窒素源となるアンモニウムイオン、カルボン酸のカウンタイオンとなる硫酸イオン、塩化物イオン、炭酸イオン、有機酸、アミノ酸等を含む物質であることが好ましい。
またカウンタイオンの供給源となる物質は、培地中の総イオン強度を低く保てる物質が好ましく、1価または2価のアニオンを含む物質であることが好ましい。例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、グルタミン酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム、フマル酸アンモニウム、アスパラギン酸アンモニウム、尿素等が好ましい。
本発明では、メタノール及びカウンタイオンを含む物質は、流加培地により流加させることにより培地に供給することが好ましい。ただし、メタノール及びカウンタイオンを含む物質は初発培地に含まれていてもよい。ここで、本発明において、「初発培地」とは、流加させる前の回分培養(batch)培養に用いる培地あるいは、流加を添加する発酵培地のことを意味し、「流加培地」とは、流加培養を行う際に発酵槽に供給する培地のことを意味する。また、本発明において「発酵培地」とは、発酵槽中の培地を意味し、この発酵培地からカルボン酸が回収される。また、本発明において、「発酵槽」とは、カルボン酸発酵を行う器を意味し、発酵タンクを用いてもジャーファーメンターを用いてもよい。また、その容量は、カルボン酸を生成・回収できる容量であればいずれでもよい。
本発明では発酵培地内のカウンタイオンのイオン強度を制御しながら培養することが好ましく、望ましくは培地中の総カウンタイオンのイオン強度の上昇速度が一定以下になるように制御しながら培養を行うことが好ましい。イオン強度の上昇速度は、0.02mol/m2/hr以下、好ましくは、0.015mol/m2/hr以下、好ましくは、0.01mol/m2/hr以下になるように制御しながら、カウンタイオンを含む物質を流加させながら制御することが好ましい。
尚、イオン強度は、培養の全行程において一定以下に制限されていることが好ましいが、制限される工程は一部分でもよい。例えば、本発明の方法が、カルボン酸生産能を持つ微生物を増殖させる段階(増殖期)と、カルボン酸を産生させる段階(生産期)を含む場合、増殖期においてイオン強度を一定濃度以下に制限することが好ましい。また、培養の全期間でイオン強度が前記の範囲である必要はなく、ある一定時間含有量が前記範囲以上になるようにカウンタイオンを存在させ、培養時間に応じて減少してもよい。また不足したカウンタイオンを含む物質を間欠的に追添してもよい。本発明における「増殖期」とは、培養開始から10時間、好ましくは18時間、特に好ましくは、24時間以内の、炭素源が主に菌体生育に使用されている時期、すなわち微生物が対数的に増殖している時期を意味し、本発明における「生産期」とは、培養開始から24時間以降の主にカルボン酸生産に用いられている時期を意味する。
尚、流加培地にはカルボン酸のカウンタイオンとして必要な量を含んでいればよく、一時的に不足している状態になってもよい。一時的とは、例えば発酵全体の時間のうち約20%、40%、最大で約60%の時間でカウンタイオンが不足している状態でもよい。カウンタイオンが不足した状態とは、一時的に0になってもよいが、イオン強度上昇速度が0.001mol/m2/h 以上であることが好ましい。
発酵培地中のイオン強度上昇速度は、硫酸イオン、塩酸イオン、炭酸イオンや、カルボン酸の量を測定することにより計算することができる。例えば硫酸イオン塩酸イオンは、イオンクロマトグラフィーで、炭酸イオンは炭酸ガス測定器で測定することができる。
本発明に用いられる培地に含まれる炭素源としては、メタノール以外にグルコ−ス、グリセロ−ル、フラクト−ス、スクロ−ス、マルト−ス、マンノ−ス、ガラクト−ス、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類を同時に含んでいてもよいその他、酢酸、クエン酸等の有機酸、もメタノールと併用して用いることができる。また、炭素源となる原料としては、ケインモラセス、ビ−トモラセス、ハイテストモラセス、シトラスモラセスを用いてもよいし、セルロ−ス、デンプン、コ−ン、シリアル、タピオカ等の天然原料の加水分解物を用いてもよい。また培養液中に溶存した二酸化炭素も炭素源として使用出来る。これらの炭素源が初発培地にも流加培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、メタノールと混合してもよいし、流加培地の炭素源をメタノールとし、初発は他の炭素源で培養してもよい。
ここでメタノールは発酵培地中に2%以下、好ましくは0.5%以下、さらに好ましくは0.2%以下含まれるように流加させることが好ましい。
本発明の培地中に含まれる窒素源としては、カウンタイオンを供給する物質、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、グルタミン酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができ、pH調整に用いられるアンモニアガス、アンモニア水も窒素源として利用できる。また、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コ−ンスティ−プリカ−、大豆加水分解物等も利用出来る。これらの窒素源は、初発培地にも流加培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、これらの窒素源を混合してもよいし、流加培地の窒素源を初発培地と変更してもよい。
また本発明の培地には、炭素源、窒素源、硫黄の他にリン酸源を含んでいることが好ましい。リン酸源としては、リン酸2水素カリウム、リン酸水素2カリウム、ピロリン酸などのリン酸ポリマ−等が利用出来る。
また本発明の培地には、炭素源、窒素源、硫黄の他に、増殖促進因子を含んでいてもよい。増殖促進因子とは、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用できる。
微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよい。
微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよい。
また本発明の培地には、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。特に本発明に用いることができるL-リジン生産菌は、L-メチオニンやL-スレオニン要求性が付加されていることがL−スレオニン分解能が弱化されているものが多いので、L−メチオニン、L-スレオニンを添加することが望ましい。(米国特許出願公開2004-0214296)
培養は、発酵温度20〜45℃、特に好ましくは33〜42℃で通気培養を行うことが好ましい。ここで酸素濃度は、5−50%に、望ましくは10%程度に調節して行う。また、pHを5〜9に制御し、通気培養を行う。培養中にpHが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス、アンモニア水等のアルカリで中和する。このような条件下で、好ましくは10時間〜120時間程度培養することにより、培養液中に著量のカルボン酸が蓄積される。蓄積されるカルボン酸の濃度は野生株より高く、培地中から採取・回収できる濃度であればいずれでもよいが、10g/L以上、望ましくは30g/L以上、さらに望ましくは50g/L以上である。
培養終了後の培養液からカルボン酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から遠心分離等によって菌体を除去した後に、濃縮晶析することによって採取される。またL-リジンの場合には通常イオン交換樹脂法、沈殿法、その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
本発明の培養法は、回分培養(batch culture)、流加培養(Fed−batch culture)、連続培養法(continuous culture)のいずれも用いることができる。また、本発明においては、カルボン酸蓄積を一定以上に保つために、種培養と本培養と分けて行ってもよく、種培養をフラスコ等のしんとう培養、あるいは回分培養で行い、本培養を流加培養、連続培養で行ってもよく、種培養、本培養ともに回分培養で行ってもよい。
本発明において、流加培養あるいは、連続培養を行う際には、一時的にメタノールや栄養源の供給が停止するように間欠的にフィードしてもよい。また、流加を行う時間の最大で30%以下、望ましくは20%以下、特に望ましくは10%以下で供給を停止することが好ましい。流加培養液を間欠的に流加させる場合には、流加培地を一定時間添加し、2回目以降の添加はある添加期に先行する添加停止期において発酵培地中の炭素源が枯渇するときのpH上昇または溶存酸素濃度の上昇がコンピュ−タ−で検出されるときに開始するように制御を行い、培養槽内の基質濃度を常に自動的に低レベルに維持してもよい。(米国特許5,912,113号明細書)
また、本発明は、カルボン酸生産能を有するメタノール資化性細菌をメタノール及びカウンタイオンを含む液体培地で培養し、同培地中にカルボン酸を生成、蓄積させる発酵法によるカルボン酸の製造法で、一価イオンをカウンタイオンとして利用する方法である。ここで一価イオンとは、塩化アンモニウム、グルタミン酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム、フマル酸アンモニウム、アスパラギン酸アンモニウムを用いることができる。
<2> 本発明に用いることができるメタノール資化性細菌
<2> 本発明に用いることができるメタノール資化性細菌
本発明の「メタノール資化性細菌」とは、メタノールを主たる炭素源として生育するこ
とができる細菌である。具体的には、メチロフィラス・メチロトロファス(Methylophilu
s methylotrophus)等のメチロフィラス属細菌及び、メチロバチラス・グリコゲネス(Me
thylobacillus glycogenes)、メチロバチラス・フラジェラタス(Methylobacillus flag
ellatus)等のメチロバチラス属細菌、アクロモバクター属およびシュードモナス属(特
開昭45-25273号公報)、プロタミノバクター属(特公昭49-125590号公報)、プロタミノ
バクター属及びメタノモナス属(特開昭50-25790号公報)、ミクロサイクラス属(特開昭
52-18886号公報)などに属する細菌が挙げられる。また、メチロバクテリウム属細菌であ
ってもよい。
とができる細菌である。具体的には、メチロフィラス・メチロトロファス(Methylophilu
s methylotrophus)等のメチロフィラス属細菌及び、メチロバチラス・グリコゲネス(Me
thylobacillus glycogenes)、メチロバチラス・フラジェラタス(Methylobacillus flag
ellatus)等のメチロバチラス属細菌、アクロモバクター属およびシュードモナス属(特
開昭45-25273号公報)、プロタミノバクター属(特公昭49-125590号公報)、プロタミノ
バクター属及びメタノモナス属(特開昭50-25790号公報)、ミクロサイクラス属(特開昭
52-18886号公報)などに属する細菌が挙げられる。また、メチロバクテリウム属細菌であ
ってもよい。
メチロフィラス・メチロトロファスとしては、AS1株(NCIMB10515)、W3A1(NCIMB 113
48株)などが挙げられる。メチロフィラス・メチロトロファスAS1株(NCIMB10515)、W3A
1(NCIMB 11348株)は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストゥリアル・アンド
・マリン・バクテリア(National Collections of Industrial and Marine Bacteria、住
所 NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United
Kingdom)から入手可能である。
48株)などが挙げられる。メチロフィラス・メチロトロファスAS1株(NCIMB10515)、W3A
1(NCIMB 11348株)は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストゥリアル・アンド
・マリン・バクテリア(National Collections of Industrial and Marine Bacteria、住
所 NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United
Kingdom)から入手可能である。
また、メチロバチラス・グリコゲネスとしては、T-11株(NCIMB 11375)、ATCC 21276
株、 ATCC 21371株、ATR80株(Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994)、42巻, p67-72に記載)、A513株(Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994)、42巻, p67-72に記載)等が挙げられる。メチロバチラス・グリコゲネスNCIMB 11375株は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストゥリアル・アンド・マリン・バクテリア(National Collections of
Industrial and Marine Bacteria、住所 NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abb
ey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom)から入手可能である。
株、 ATCC 21371株、ATR80株(Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994)、42巻, p67-72に記載)、A513株(Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994)、42巻, p67-72に記載)等が挙げられる。メチロバチラス・グリコゲネスNCIMB 11375株は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストゥリアル・アンド・マリン・バクテリア(National Collections of
Industrial and Marine Bacteria、住所 NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abb
ey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom)から入手可能である。
メチロバチラス・フラジェラタスとしては、ATTC 51484株、KT株(N.I. Govorukhinaら
. Microbiology (Russia) 56 (1987), pp. 849-854.に記載)、VKM B-1610株等が挙げら
れる。メチロバチラス・フラジェラタスVKM B-1610株は、ALL-RUSSIAN COLLECTION OF MI
CROORGANISMS(Russia, 142290, Moscow Region, Pushchino, pr. Nauki, 5, IBPM)から
入手可能である。
メチロバチラス・グリコゲネスATCC 21276株、 ATCC 21371株、メチロバチラス・フラ
ジェラタスATTC 51484株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)よ
り分譲を受けることができる (住所 ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20
108, 1,United States of America )。
. Microbiology (Russia) 56 (1987), pp. 849-854.に記載)、VKM B-1610株等が挙げら
れる。メチロバチラス・フラジェラタスVKM B-1610株は、ALL-RUSSIAN COLLECTION OF MI
CROORGANISMS(Russia, 142290, Moscow Region, Pushchino, pr. Nauki, 5, IBPM)から
入手可能である。
メチロバチラス・グリコゲネスATCC 21276株、 ATCC 21371株、メチロバチラス・フラ
ジェラタスATTC 51484株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)よ
り分譲を受けることができる (住所 ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20
108, 1,United States of America )。
本発明において、「カルボン酸生産能」とは、培地中で培養したときに、培地中にすなわち細胞外に遊離のカルボン酸を生成し、蓄積する能力をいい、特に野生株(親株)より多くのカルボン酸を蓄積できる能力をいう。野生株とは、メチロフィラス属細菌であれば、AS1株(NCIMB10515)、メチロバチラス属細菌としては、T-11株(NCIMB 11375)が挙げられる。
カルボン酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、カルボン酸の生合成系酵素の発現が増強された遺伝子組換え株の創製等、従来、エシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる(アミノ酸発酵、(株)学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第77〜100頁参照)。ここで、カルボン酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、2種又は3種以上であってもよい。また、発現が増強されるカルボン酸生合成系酵素も、単独であっても、2種又は3種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
カルボン酸生産能を有する栄養要求性変異株、カルボン酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちX線や紫外線の照射、またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)、エチルメタンスルフォネート(EMS)等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつカルボン酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
遺伝子組換えとしては、目的カルボン酸の生合成に関する酵素をコードする遺伝子の発現を増強する方法や、目的カルボン酸の分解に関する酵素をコードする遺伝子の活性を低下させる方法などが挙げられる。
以下カルボン酸生産能を有する微生物の具体例、特にL-アミノ酸生産能を有する微生物の具体例を挙げるが、本発明において使用することができる微生物は以下のものには限定されない。
遺伝子組換えとしては、目的カルボン酸の生合成に関する酵素をコードする遺伝子の発現を増強する方法や、目的カルボン酸の分解に関する酵素をコードする遺伝子の活性を低下させる方法などが挙げられる。
以下カルボン酸生産能を有する微生物の具体例、特にL-アミノ酸生産能を有する微生物の具体例を挙げるが、本発明において使用することができる微生物は以下のものには限定されない。
<2−1> L-リジン生産能の付与
L−リジン生産能を有するメタノール資化性細菌、例えばメチロフィラス・メチロトロファス菌株は、L−リジン生産能を有しないか、又はL−リジン生産能が低い株に、変異処理を施し、S−(2−アミノエチル)−L−システイン(以下、「AEC」と記す)等のリジンアナログに対する耐性を付与することにより取得することができる。変異処理の方法としては、菌株に、紫外線、X線、γ線などの物理的な刺激や、NTGなどの化学変異誘発剤による処理を施す方法がある。このようにして得られるL−生産能を有するメチロフィラス属細菌の具体例としては、メチロフィラス・メチロトロファス AJ13608が挙げられる。
L−リジン生産能を有するメタノール資化性細菌、例えばメチロフィラス・メチロトロファス菌株は、L−リジン生産能を有しないか、又はL−リジン生産能が低い株に、変異処理を施し、S−(2−アミノエチル)−L−システイン(以下、「AEC」と記す)等のリジンアナログに対する耐性を付与することにより取得することができる。変異処理の方法としては、菌株に、紫外線、X線、γ線などの物理的な刺激や、NTGなどの化学変異誘発剤による処理を施す方法がある。このようにして得られるL−生産能を有するメチロフィラス属細菌の具体例としては、メチロフィラス・メチロトロファス AJ13608が挙げられる。
本菌株は、メチロフィラス・メチロトロファスAS1株にAEC耐性を付与するこ
とによって育種されたものである。尚、メチロフィラス・メチロトロファス AJ13608は、
1999年6月10日付で工業技術院生命工学工業技術研究所(現 独立行政法人 産業技術総合
研究所 特許生物寄託センター(〒305-8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中
央第6))に受託番号FERM P-17416として寄託され、2000年3月31日付にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7112が付与されている。
とによって育種されたものである。尚、メチロフィラス・メチロトロファス AJ13608は、
1999年6月10日付で工業技術院生命工学工業技術研究所(現 独立行政法人 産業技術総合
研究所 特許生物寄託センター(〒305-8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中
央第6))に受託番号FERM P-17416として寄託され、2000年3月31日付にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7112が付与されている。
また、L−リジン生産能を有するメタノール資化性細菌は、L−リジンの生合成に関与
する遺伝情報を担うDNAを遺伝子組換え技術により導入、増強することによっても育種
することができる。導入される遺伝子は、例えば、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ等L−リジンの生合成経路上の酵素をコードする遺伝子である。
また。ジヒドロジピコリン酸合成酵素、アスパルトキナーゼのようにL−リジンによ
るフィードバック阻害を受ける酵素遺伝子の場合には、かかる阻害が解除された酵素をコ
ードする変異型遺伝子を用いることが望ましい。
する遺伝情報を担うDNAを遺伝子組換え技術により導入、増強することによっても育種
することができる。導入される遺伝子は、例えば、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ等L−リジンの生合成経路上の酵素をコードする遺伝子である。
また。ジヒドロジピコリン酸合成酵素、アスパルトキナーゼのようにL−リジンによ
るフィードバック阻害を受ける酵素遺伝子の場合には、かかる阻害が解除された酵素をコ
ードする変異型遺伝子を用いることが望ましい。
また、L−アミノ酸の菌体外への排出に関与するタンパク質の活性を強化することによ
っても、L−アミノ酸生産能を向上させることができる。例えば、L−リジンの細胞外へ
の排出に関与するタンパク質としては、lysE遺伝子によってコードされるLysEタンパク質
が知られている(Vrljic, M., Sahm, H. and Eggeling, L. (1996) Mol. Microbiol. 22,
815-826、国際公開第97/23597号パンフレット)。尚、本発明者らは、ブレビバクテリウ
ム属細菌に由来する野生型lysE遺伝子は、メチロフィラス属細菌やメチロバチラス属細菌
中では全く機能しないが、メチロトローフで機能するような改変が可能であることを確認
している。このようなlysEタンパク質の改変体としては、後記実施例に示すlysE24が挙げられる。lysE24遺伝子とL-リジンによりフィードバック阻害を受けないように改変したジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子を有するメタノール資化性細菌AJ110196は、2005年10月12日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づく国際寄託として、FERMBP-10434の受託番号のもとで寄託されている。
っても、L−アミノ酸生産能を向上させることができる。例えば、L−リジンの細胞外へ
の排出に関与するタンパク質としては、lysE遺伝子によってコードされるLysEタンパク質
が知られている(Vrljic, M., Sahm, H. and Eggeling, L. (1996) Mol. Microbiol. 22,
815-826、国際公開第97/23597号パンフレット)。尚、本発明者らは、ブレビバクテリウ
ム属細菌に由来する野生型lysE遺伝子は、メチロフィラス属細菌やメチロバチラス属細菌
中では全く機能しないが、メチロトローフで機能するような改変が可能であることを確認
している。このようなlysEタンパク質の改変体としては、後記実施例に示すlysE24が挙げられる。lysE24遺伝子とL-リジンによりフィードバック阻害を受けないように改変したジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子を有するメタノール資化性細菌AJ110196は、2005年10月12日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づく国際寄託として、FERMBP-10434の受託番号のもとで寄託されている。
以下本発明の微生物に使用することが出来る遺伝子を具体的に説明する。
<dapA*遺伝子>
L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするDNA(以下、dapA*遺伝子とも呼ぶ)の種類は特に制限されないが、例えば、エシェリヒア属細菌由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするDNAであって、L-リジンによるフィードバック阻害が解除されるような変異を有するものが好ましい。
エシェリヒア属細菌由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするDNAとしては、配列番号41のアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。L-リジンによるフィードバック阻害が解除されるような変異としては、配列番号41に示すアミノ酸配列において118位のヒスチジン残基をチロシン残基に置換する変異(H118Y変異)が挙げられる。したがって、dapA*遺伝子としては、配列番号41のアミノ酸配列において118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換されたアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。
また、dapA*遺伝子は、配列番号41のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%、特に好ましくは98%以上の相同性を有し、かつ、H118Y変異を有し、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
さらに、H118Y変異を有し、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性が損なわれない限りにおいて、配列番号41のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には2〜20個、好ましくは2〜10個、より好ましくは2〜5個を意味する。上記アミノ酸置換は保存的置換が好ましく、保存的置換としては、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutant又はvariant)によって生じるものも含まれる。
さらに、dapA*遺伝子は、H118Y変異を有し、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号40の塩基配列又は該配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAでもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC,0.1%SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1%SDSさらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度、温度で、1回より好ましくは2〜3回洗浄する条件が挙げられる。
dapA*遺伝子は部位特異的変異導入法によって得ることもできるし、後述のように、プラスミドRSFD80から得ることもできる。
なお、コリネ型細菌の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素はL-リジンによるフィードバック阻害を受けないことが知られており、本発明に用いるL-リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするDNAは必ずしも変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするDNAでなくとも構わない。
L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするDNA(以下、dapA*遺伝子とも呼ぶ)の種類は特に制限されないが、例えば、エシェリヒア属細菌由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするDNAであって、L-リジンによるフィードバック阻害が解除されるような変異を有するものが好ましい。
エシェリヒア属細菌由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするDNAとしては、配列番号41のアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。L-リジンによるフィードバック阻害が解除されるような変異としては、配列番号41に示すアミノ酸配列において118位のヒスチジン残基をチロシン残基に置換する変異(H118Y変異)が挙げられる。したがって、dapA*遺伝子としては、配列番号41のアミノ酸配列において118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換されたアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。
また、dapA*遺伝子は、配列番号41のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%、特に好ましくは98%以上の相同性を有し、かつ、H118Y変異を有し、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
さらに、H118Y変異を有し、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性が損なわれない限りにおいて、配列番号41のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には2〜20個、好ましくは2〜10個、より好ましくは2〜5個を意味する。上記アミノ酸置換は保存的置換が好ましく、保存的置換としては、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutant又はvariant)によって生じるものも含まれる。
さらに、dapA*遺伝子は、H118Y変異を有し、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号40の塩基配列又は該配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAでもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC,0.1%SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1%SDSさらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度、温度で、1回より好ましくは2〜3回洗浄する条件が挙げられる。
dapA*遺伝子は部位特異的変異導入法によって得ることもできるし、後述のように、プラスミドRSFD80から得ることもできる。
なお、コリネ型細菌の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素はL-リジンによるフィードバック阻害を受けないことが知られており、本発明に用いるL-リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするDNAは必ずしも変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするDNAでなくとも構わない。
<LysE24遺伝子>
メタノール資化性細菌に導入したときにL−リジンの細胞外への排出を促進する変異型LysEをコードするDNAを以下、LysE24遺伝子とも呼ぶ。
「L−リジンの細胞外への排出を促進する」とは、このDNAをメタノール資化性細菌に導入し、得られたメタノール資化性細菌を培養したときに、このDNAを保持しないメタノール資化性細菌に比べて、培地中に排出されるL−リジンの量が増大することをいう。L−リジンの細胞外への排出の促進は、その結果として、このDNAを保持しないメタノール資化性細菌に比べて、このDNAを保持するメタノール資化性細菌を培養したときに培地中に蓄積するL−リジン濃度が高くなることによって観察される。
LysE24遺伝子の種類は特に制限されないが、例えば、ブレビバクテリウム属細菌由来のLysEタンパク質をコードするDNAであって、メタノール資化性細菌に導入したときにL−リジンの細胞外への排出を促進する変異を有するものが好ましい。
このようなLysE24遺伝子としては、例えば、配列番号51のタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。また、メタノール資化性細菌に導入したときにL−リジンの細胞外への排出を促進するものである限り、配列番号51のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%、特に好ましくは98%以上の相同性を有するタンパク質であってもよい。
また、L−リジンの細胞外への排出を促進する活性が損なわれない限り、配列番号51のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、DNAであってもよい。
さらに、lysE24遺伝子は、L−リジンの細胞外への排出を促進する活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号50の塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAでもよい。
「数個」及び「ストリンジェントな条件」の定義ならびに好ましいアミノ酸置換の種類は上述したとおりである。
例えば、lysE24遺伝子は特許公開2004−166594号公報に記載のプラスミドpRSlysE24から得ることができる。pRSlysE24で形質転換されたE.coli JM109株はAJ13830と命名され、同株は2001年6月4日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号FERM P-18369として寄託され、平成14年5月13日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-8040の受託番号のもとで寄託されている。
メタノール資化性細菌に導入したときにL−リジンの細胞外への排出を促進する変異型LysEをコードするDNAを以下、LysE24遺伝子とも呼ぶ。
「L−リジンの細胞外への排出を促進する」とは、このDNAをメタノール資化性細菌に導入し、得られたメタノール資化性細菌を培養したときに、このDNAを保持しないメタノール資化性細菌に比べて、培地中に排出されるL−リジンの量が増大することをいう。L−リジンの細胞外への排出の促進は、その結果として、このDNAを保持しないメタノール資化性細菌に比べて、このDNAを保持するメタノール資化性細菌を培養したときに培地中に蓄積するL−リジン濃度が高くなることによって観察される。
LysE24遺伝子の種類は特に制限されないが、例えば、ブレビバクテリウム属細菌由来のLysEタンパク質をコードするDNAであって、メタノール資化性細菌に導入したときにL−リジンの細胞外への排出を促進する変異を有するものが好ましい。
このようなLysE24遺伝子としては、例えば、配列番号51のタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。また、メタノール資化性細菌に導入したときにL−リジンの細胞外への排出を促進するものである限り、配列番号51のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%、特に好ましくは98%以上の相同性を有するタンパク質であってもよい。
また、L−リジンの細胞外への排出を促進する活性が損なわれない限り、配列番号51のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、DNAであってもよい。
さらに、lysE24遺伝子は、L−リジンの細胞外への排出を促進する活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号50の塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAでもよい。
「数個」及び「ストリンジェントな条件」の定義ならびに好ましいアミノ酸置換の種類は上述したとおりである。
例えば、lysE24遺伝子は特許公開2004−166594号公報に記載のプラスミドpRSlysE24から得ることができる。pRSlysE24で形質転換されたE.coli JM109株はAJ13830と命名され、同株は2001年6月4日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号FERM P-18369として寄託され、平成14年5月13日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-8040の受託番号のもとで寄託されている。
<ddh遺伝子>
ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性の増強はジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(以下、ddh遺伝子とも呼ぶ)を用いて行うことができる。
ddh遺伝子の種類は特に制限されないが、例えば、ブレビバクテリウム属細菌由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(配列番号53)をコードするDNAが挙げられる。
ddh遺伝子は、配列番号53のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%、特に好ましくは98%以上の相同性を有し、かつ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
また、ddh遺伝子は、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性が損なわれない限り、配列番号53のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
さらに、ddh遺伝子は、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号52の塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAでもよい。
「数個」及び「ストリンジェントな条件」の定義ならびに好ましいアミノ酸置換の種類は上述したとおりである。
ブレビバクテリウム ラクトファーメンタムのddh遺伝子はコリネバクテリウム・グルタミカム (Corynebacterium glutamicum) のddhの既知の塩基配列(Ishino, S. et al., Nucleic acid res., 15, 3917 (1987)) をもとに作成した2種のオリゴヌクレオチドプライマー(例えば国際公開第WO/9516042号記載の配列番号11および12) を用いたPCR法により、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタムの染色体DNAを鋳型として増幅することによって得られる。
ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性の増強はジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(以下、ddh遺伝子とも呼ぶ)を用いて行うことができる。
ddh遺伝子の種類は特に制限されないが、例えば、ブレビバクテリウム属細菌由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(配列番号53)をコードするDNAが挙げられる。
ddh遺伝子は、配列番号53のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%、特に好ましくは98%以上の相同性を有し、かつ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
また、ddh遺伝子は、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性が損なわれない限り、配列番号53のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
さらに、ddh遺伝子は、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号52の塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAでもよい。
「数個」及び「ストリンジェントな条件」の定義ならびに好ましいアミノ酸置換の種類は上述したとおりである。
ブレビバクテリウム ラクトファーメンタムのddh遺伝子はコリネバクテリウム・グルタミカム (Corynebacterium glutamicum) のddhの既知の塩基配列(Ishino, S. et al., Nucleic acid res., 15, 3917 (1987)) をもとに作成した2種のオリゴヌクレオチドプライマー(例えば国際公開第WO/9516042号記載の配列番号11および12) を用いたPCR法により、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタムの染色体DNAを鋳型として増幅することによって得られる。
<lysA遺伝子>
ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性の増強はジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(以下、lysA遺伝子とも呼ぶ)を用いて行うことができる。lysA遺伝子の種類は特に制限されないが、例えば、メチロフィラス属細菌由来のジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(配列番号49)をコードするDNAが挙げられる。
lysA遺伝子は、配列番号49のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%、特に好ましくは98%以上の相同性を有し、かつ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
また、lysA遺伝子は、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性が損なわれない限り、配列番号49のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、DNAであってもよい。
さらに、lysA遺伝子は、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号48の塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAでもよい。
「数個」及び「ストリンジェントな条件」の定義ならびに好ましいアミノ酸置換の種類は上述したとおりである。
メチロフィラス・メチロトロファスのlysA遺伝子は既知の配列をもとに作成した2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法により、メチロフィラス・メチロトロファスの染色体DNAを鋳型としてそれぞれ得ることができる。
ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性の増強はジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(以下、lysA遺伝子とも呼ぶ)を用いて行うことができる。lysA遺伝子の種類は特に制限されないが、例えば、メチロフィラス属細菌由来のジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(配列番号49)をコードするDNAが挙げられる。
lysA遺伝子は、配列番号49のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%、特に好ましくは98%以上の相同性を有し、かつ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
また、lysA遺伝子は、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性が損なわれない限り、配列番号49のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、DNAであってもよい。
さらに、lysA遺伝子は、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号48の塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAでもよい。
「数個」及び「ストリンジェントな条件」の定義ならびに好ましいアミノ酸置換の種類は上述したとおりである。
メチロフィラス・メチロトロファスのlysA遺伝子は既知の配列をもとに作成した2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法により、メチロフィラス・メチロトロファスの染色体DNAを鋳型としてそれぞれ得ることができる。
<dapB遺伝子>
ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性の増強は、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子(以下、dapB遺伝子とも呼ぶ)を用いて行うことができる。dapB遺伝子の種類は特に制限されないが、例えば、エシェリヒア属細菌由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(配列番号43)をコードするDNAが挙げられる。
dapB遺伝子は、配列番号43のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%、特に好ましくは98%以上の相同性を有し、かつ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
また、dapB遺伝子は、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性が損なわれない限り、配列番号43のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、DNAであってもよい。
さらに、dapB遺伝子はジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号42の塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAでもよい。
「数個」及び「ストリンジェントな条件」の定義ならびに好ましいアミノ酸置換の種類は上述したとおりである。
ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)は既知の塩基配列をもとに作成した2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法により、E.coli染色体DNAを鋳型として増幅することができる。
ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性の増強は、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子(以下、dapB遺伝子とも呼ぶ)を用いて行うことができる。dapB遺伝子の種類は特に制限されないが、例えば、エシェリヒア属細菌由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(配列番号43)をコードするDNAが挙げられる。
dapB遺伝子は、配列番号43のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%、特に好ましくは98%以上の相同性を有し、かつ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
また、dapB遺伝子は、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性が損なわれない限り、配列番号43のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、DNAであってもよい。
さらに、dapB遺伝子はジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号42の塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAでもよい。
「数個」及び「ストリンジェントな条件」の定義ならびに好ましいアミノ酸置換の種類は上述したとおりである。
ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)は既知の塩基配列をもとに作成した2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法により、E.coli染色体DNAを鋳型として増幅することができる。
<asd遺伝子>
アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性増強は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(以下、asd遺伝子とも呼ぶ)を用いて行うことができる。asd遺伝子の種類は特に制限されないが、例えば、エシェリヒア属細菌由来のアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(配列番号45)をコードするDNAが挙げられる。
asd遺伝子は、配列番号45のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%、特に好ましくは98%以上の相同性を有し、かつ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
また、asd遺伝子は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が損なわれない限り、配列番号45のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、DNAであってもよい。
さらに、asd遺伝子は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号44の塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAでもよい。
「数個」及び「ストリンジェントな条件」の定義ならびに好ましいアミノ酸置換の種類は上述したとおりである。
アスアパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(asd)は既知の塩基配列をもとに作成した2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法により、E.coli染色体DNAを鋳型として増幅することができる。
アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性増強は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(以下、asd遺伝子とも呼ぶ)を用いて行うことができる。asd遺伝子の種類は特に制限されないが、例えば、エシェリヒア属細菌由来のアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(配列番号45)をコードするDNAが挙げられる。
asd遺伝子は、配列番号45のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%、特に好ましくは98%以上の相同性を有し、かつ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
また、asd遺伝子は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が損なわれない限り、配列番号45のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、DNAであってもよい。
さらに、asd遺伝子は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号44の塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAでもよい。
「数個」及び「ストリンジェントな条件」の定義ならびに好ましいアミノ酸置換の種類は上述したとおりである。
アスアパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(asd)は既知の塩基配列をもとに作成した2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法により、E.coli染色体DNAを鋳型として増幅することができる。
<lysC*遺伝子>
本発明のメタノール資化性細菌は、L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードするDNAをさらに保持するものであってもよい。
L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードするDNA(以下、lysC*遺伝子とも呼ぶ)の種類は特に制限されないが、例えば、エシェリヒア属細菌由来のアスパルトキナーゼをコードするDNAであって、L-リジンによるフィードバック阻害が解除されるような変異を有するものが好ましい。
エシェリヒア属細菌由来の野生型アスパルトキナーゼをコードするDNAとしては、配列番号47のアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。L-リジンによるフィードバック阻害が解除されるような変異としては、配列番号47に示すアミノ酸配列において352位のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換する変異(T352I変異)が挙げられる。したがって、lysC*遺伝子としては、配列番号47のアミノ酸配列において352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換されたアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。
lysC*遺伝子は、配列番号47のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%、特に好ましくは98%以上の相同性を有し、かつ、T352I変異を有し、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
また、lysC*遺伝子は、T352I変異を有し、アスパルトキナーゼ活性が損なわれない限り、配列番号47のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
さらに、lysC*遺伝子は、T352I変異を有し、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号46の塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAでもよい。
「数個」及び「ストリンジェントな条件」の定義ならびに好ましいアミノ酸置換の種類は上述したとおりである。
lysC*遺伝子は部位特異的変異導入法によって得ることもできるし、後述のように、プラスミドRSFD80から得ることもできる。
なお、本発明に用いるL-リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードするDNAは必ずしも変異型アスパルトキナーゼをコードするDNAでなくとも構わない。すなわち、野生型タンパク質がL-リジンによるフィードバック阻害を受けないのであれば、野生型を用いてもよい。
本発明のメタノール資化性細菌は、L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードするDNAをさらに保持するものであってもよい。
L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードするDNA(以下、lysC*遺伝子とも呼ぶ)の種類は特に制限されないが、例えば、エシェリヒア属細菌由来のアスパルトキナーゼをコードするDNAであって、L-リジンによるフィードバック阻害が解除されるような変異を有するものが好ましい。
エシェリヒア属細菌由来の野生型アスパルトキナーゼをコードするDNAとしては、配列番号47のアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。L-リジンによるフィードバック阻害が解除されるような変異としては、配列番号47に示すアミノ酸配列において352位のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換する変異(T352I変異)が挙げられる。したがって、lysC*遺伝子としては、配列番号47のアミノ酸配列において352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換されたアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。
lysC*遺伝子は、配列番号47のアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%、特に好ましくは98%以上の相同性を有し、かつ、T352I変異を有し、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
また、lysC*遺伝子は、T352I変異を有し、アスパルトキナーゼ活性が損なわれない限り、配列番号47のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
さらに、lysC*遺伝子は、T352I変異を有し、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号46の塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAでもよい。
「数個」及び「ストリンジェントな条件」の定義ならびに好ましいアミノ酸置換の種類は上述したとおりである。
lysC*遺伝子は部位特異的変異導入法によって得ることもできるし、後述のように、プラスミドRSFD80から得ることもできる。
なお、本発明に用いるL-リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードするDNAは必ずしも変異型アスパルトキナーゼをコードするDNAでなくとも構わない。すなわち、野生型タンパク質がL-リジンによるフィードバック阻害を受けないのであれば、野生型を用いてもよい。
本明細書において、「各酵素の細胞内の活性が増強される」とは、野生株(例えば、M.methylotrophus AS1株)または親株(本発明において特定された組み合わせの酵素のすべての細胞内の活性が増強されていない株)に比べて、細胞内の酵素活性が上昇していることを意味し、野生株または親株が有していない酵素活性を有することも包含する。なお、上記の各々の酵素の活性の測定法は公知であり、細胞内の活性の増強は、当業者であれば容易に確認できる。
細胞内の活性を増強する手段としては、下記の手段及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。
(1)各タンパク質をコードするDNAを含むプラスミドを用いた形質転換
(2)各タンパク質をコードするDNAの染色体上への組込み
(3)各タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター配列の改変
細胞内の活性を増強する手段としては、下記の手段及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。
(1)各タンパク質をコードするDNAを含むプラスミドを用いた形質転換
(2)各タンパク質をコードするDNAの染色体上への組込み
(3)各タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター配列の改変
本発明に用いることが出来るメタノール資化性細菌は、上記のような改変(lysE24、dapA*、lysA、ddh、dapB、asd、(lysC*)の各遺伝子の発現増強)により、L-リジン生産能を有している。ここで、「L-リジン生産能」とは、本発明のメタノール資化性細菌を培地で培養したときに、回収可能な量のL-リジンを培地中に蓄積できることを意味する。
本発明のメタノール資化性細菌は、栄養要求性変異、アナログ耐性変異、及び代謝制御変異などの変異を有する変異株において上記のような改変がなされた細菌であってもよい。例えば、L−ホモセリン、又はL−スレオニン及びL−メチオニンを要求する変異株(特公昭48-28078号、特公昭56-6499号)、イノシトールまたは酢酸を要求する変異株(特開昭55-9784号、特開昭56-8692号)、又はオキサリジン、リジンハイドロキサメート、S−(2−アミノエチル)−システイン、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム、DL−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、又はN−ラウロイルロイシンに耐性を有する変異株などにおいて上記のような改変がなされた細菌であってもよい。
なお、上記のような改変(遺伝子増幅)を行った後に、栄養要求性変異、アナログ耐性変異、及び代謝制御変異などの変異を導入してもよい。
なお、上記のような改変(遺伝子増幅)を行った後に、栄養要求性変異、アナログ耐性変異、及び代謝制御変異などの変異を導入してもよい。
次に、L-リジンによるフィードバック阻害を受けないジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子(dapA*遺伝子)およびアスパルトキナーゼ遺伝子(lysC*遺伝子)の発現を増強する方法を、以下に例示する。
dapA*遺伝子およびlysC*遺伝子の発現を増強するには、これらのDNA断片を、メチロフィラス属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換えDNAを作製し、これをメチロフィラス属細菌の宿主に導入して形質転換すればよい。これらの遺伝子のコピー数が上昇する結果、ジヒドロジピコリン酸合成酵素及びアスパルトキナーゼの細胞内活性が増強される。以下、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をDDPS、アスパルトキナーゼをAK、アスパルトキナーゼIIIをAKIIIと略すことがある。
dapA*遺伝子およびlysC*遺伝子の発現を増強するには、これらのDNA断片を、メチロフィラス属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換えDNAを作製し、これをメチロフィラス属細菌の宿主に導入して形質転換すればよい。これらの遺伝子のコピー数が上昇する結果、ジヒドロジピコリン酸合成酵素及びアスパルトキナーゼの細胞内活性が増強される。以下、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をDDPS、アスパルトキナーゼをAK、アスパルトキナーゼIIIをAKIIIと略すことがある。
DDPSをコードする遺伝子及びAKをコードする遺伝子の供与微生物としては、メチロフィラス属に属する微生物中でDDPS活性及びAK活性を発現することができるDNAを保持する微生物であれば、いかなる微生物でも使用できる。微生物は、野生株及びそれから誘導した変異株のいずれでもよい。具体的にはE. coli(エシェリヒア・コリ(Escherichia coli))K-12株及びメチロフィラス・メチロトロファスAS1株(NCIMB10515)等が挙げられる。エシェリヒア属細菌由来のDDPSをコードする遺伝子(Richaud, F. et al. J. Bacteriol., 297(1986))及びAKIIIをコードする遺伝子(Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. and Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052(1986))は、いずれも塩基配列が明らかにされているので、これらの遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、E. coli K-12等の微生物の染色体DNAを鋳型とするPCR法により、これらの遺伝子を取得することが可能である。以下、E. coli由来のdapA及びlysCを例として説明するが、本発明に用いる遺伝子は、これらに限定されるものではない。
本発明に用いるDDPS及びAKは、L−リジンによるフィードバック阻害を受けないものである。E. coli由来の野生型DDPSはL−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、E. coli由来の野生型AKIIIはL−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、メチロフィラス属細菌に導入するためには、それぞれL−リジンによるフィードバック阻害が解除されるような変異を導入することが好ましい。
ただし、例えば、コリネバクテリウム属細菌由来のDDPSはもともとL−リジンによるフィードバック阻害を受けないため、本発明において用いるDDPS遺伝子及びAK遺伝子は必ずしも変異型である必要はない。
ただし、例えば、コリネバクテリウム属細菌由来のDDPSはもともとL−リジンによるフィードバック阻害を受けないため、本発明において用いるDDPS遺伝子及びAK遺伝子は必ずしも変異型である必要はない。
L-リジンによるフィードバック阻害が解除されたDDPSをコードするdapA*及びAKをコードするlysC*はこれを含むプラスミドを鋳型とし、既知の塩基配列をもとに作成した2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法により得ることができる。
dapA*及びlysC*を含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80が知られている(WO95/16042号)。同プラスミドで形質転換されたE. coli JM109株は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所(現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター)に受託番号FERM P-13936として寄託され、1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号のもとで寄託されている。RSFD80は、AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。
dapA*及びlysC*を含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80が知られている(WO95/16042号)。同プラスミドで形質転換されたE. coli JM109株は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所(現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター)に受託番号FERM P-13936として寄託され、1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号のもとで寄託されている。RSFD80は、AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。
RSFD80に含まれているdapA*は、配列番号40に示す野生型dapA遺伝子の塩基配列において塩基番号597のCがTに変化した配列を有し、それによって、コードされる変異型DDPSは、配列番号41に示すアミノ酸配列において118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有する。また、RSFD80に含まれているlysC*は、配列番号46に示す野生型lysCの塩基配列において塩基番号1638のCがT変化した配列を有し、それによって、コードされる変異型AKIIIは、配列番号47に示すアミノ酸配列において352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換された配列を有する。
遺伝子のクローニングに使用されるプラスミドとしては、エシェリア属細菌等の微生物において複製可能なものであればよく、具体的には、pBR322、pTWV228、pMW119、pUC19等が挙げられる。
また、メチロフィラス属細菌で機能するベクターとは、例えばメチロフィラス属細菌で自律複製出来るプラスミドである。具体的には、広宿主域ベクターであるRSF1010及びその誘導体、例えばpAYC32(Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 1986, 16, 161-167)、あるいはpMFY42(gene, 44, 53(1990))、pRP301、pTB70(Nature, 287, 396, (1980))等が挙げられる。また、RSF1010とは不和合性が異なる広宿主域ベクターであるpBBR1およびその誘導体たとえばpBHR1(Antoine, R. and Locht, C., Molecular Microbiology, 6, 1785-99. (1992).)等があげられる。
dapA*、lysC*およびその他のタンパク質をコードするDNAをメチロフィラス属細菌で機能するベクターを連結して組み換えDNAを調製するには、これらの遺伝子を含むDNA断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、T4 DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。これらの遺伝子は、それぞれ別個のベクターに搭載してもよく、同一のベクターに搭載してもよい。
DNAの切断、連結、その他、染色体DNAの調製、PCR、プラスミドDNAの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
DNAの切断、連結、その他、染色体DNAの調製、PCR、プラスミドDNAの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
上記のように調製した組換えDNAをメチロフィラス属細菌に導入するには、十分な形質転換効率が得られる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、エレクトロポレーション法(Canadian Journal of Microbiology, 43. 197(1997))が挙げられる。
また、DDPS活性及びAK活性の増強は、dapA*及びlysC*をメチロフィラス属細菌の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。メチロフィラス属細菌の染色体DNA上にdapA*及びlysC*を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペッティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、dapA*及び/又はlysC*をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のdapA*及lysC*のコピー数が上昇する結果、DDPS活性及びAK活性が増幅される。
DDPS活性及びAK活性の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、dapA*及lysC*のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される(特開平1-215280号公報参照)。たとえば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、ラムダファージのPRプロモーター、PLプロモーター、tetプロモーター、amyEプロモーター、spacプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、dapA*及びlysC*の発現が強化されることによってDDPS活性及びAK活性が増幅される。発現調節配列の増強は、dapA*及lysC*のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
以上、DDPS及びAKの細胞内活性を増加させるためのdapA*遺伝子及びlysC*遺伝子の発現増強について説明したが、lysE24遺伝子、dapB遺伝子、lysA遺伝子、ddh遺伝子及びasd遺伝子も同様にして発現増強することができる。
本発明のメタノール資化性細菌は、上記6又は7種類の遺伝子の発現増強に加えて、他のL−リジン生合成に関与する酵素を増強してもよい。そのような酵素としては、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(特開昭60-87788号)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(特公平6-102028号)、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝子等のジアミノピメリン酸経路の酵素(特開2003-135066)、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子等のアミノアジピン酸経路の酵素等が挙げられる。
また、本発明のメタノール資化性細菌は、さらに、L−リジンの生合成経路から分岐してL−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。L−リジンの生合成経路から分岐してL−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼがある(WO 95/23864参照)。酵素活性を低下するための改変は相同組換えを利用した遺伝子破壊などの手法によって行うことができる。
以下、本発明に用いることができるL-リジン以外のアミノ酸生産菌について例示する。アミノ酸酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された遺伝子組換え株の創製等、従来、エシェリヒア属細菌、コリネ型細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる(アミノ酸発酵、(株)学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第77〜100頁参照)。
また、L-アミノ酸の生合成系遺伝子の強化、L-アミノ酸を分解する遺伝子の弱化によってもL-アミノ酸生産菌を構築することが可能である。
<2−2L−グルタミン酸生産能の付与>
また、L-アミノ酸の生合成系遺伝子の強化、L-アミノ酸を分解する遺伝子の弱化によってもL-アミノ酸生産菌を構築することが可能である。
<2−2L−グルタミン酸生産能の付与>
メチロフィラス属細菌へのL−グルタミン酸生産能は、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(特開昭61−268185号)、グルタミンシンセターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(特開昭62−166890号、特開昭63−214189号)、アコニット酸ヒドラターゼ(特開昭62−294086号)、クエン酸シンターゼ(特開昭62−201585号、特開昭63−119688号)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(特開昭60−87788号、特開昭62−55089号)、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ(特開昭63−102692号)、グルコースリン酸イソメラーゼ、グルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ(WO99/07853)等の酵素をコードするDNAを導入することによって、付与することができる。
さらに、本発明の微生物は、L−グルタミン酸の生合成経路から分岐してL−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。L−グルタミン酸の生合成経路から分岐してL−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、αケトグルタール酸デヒドロゲナーゼ(αKGDH)、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、1−ピロリンデヒドロゲナーゼ等がある。
<2−3 L−スレオニン生産能の付与>
<2−3 L−スレオニン生産能の付与>
L−スレオニン生産能は、例えば、アスパルトキナーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ及びスレオニンシンターゼの活性を増強することにより、付与又は増強することができる。これらの酵素の活性は、例えば、スレオニンオペロンを含有した組換えプラスミド(特開昭55−131397号公報、特開昭59−31691号公報、特開昭56−15696号公報、および特表平3−501682号公報参照)でメチロフィラス属細菌を形質転換することにより、増強することができる。
また、L−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有するスレオニンオペロン(特公平1−29559号公報)、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(特開昭60−012995号)、又はホモセリンキナーゼ及びホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(特開昭61−195695号)を増幅又は導入することによっても、生産性を付与又は増強することができる。
さらに、アスパラギン酸によるフィードバック阻害を解除する変異を有する変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするDNAを導入することによって、L−スレオニン生産能を向上させることができる。
<2−4 L−バリン生産能の付与>
さらに、アスパラギン酸によるフィードバック阻害を解除する変異を有する変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするDNAを導入することによって、L−スレオニン生産能を向上させることができる。
<2−4 L−バリン生産能の付与>
L−バリンの生産能の付与は、例えば、制御機構が実質的に解除されたL−バリン生合成系遺伝子をメチロフィラス属細菌に導入することによって行うことができる。また、メチロフィラス属に属する微生物が保持するL−バリン生合成系遺伝子の制御機構が実質的に解除されるような変異を導入してもよい。
L−バリン生合成系遺伝子としては、例えばE. coliのilvGMEDAオペロンが挙げられる。尚、ilvA遺伝子がコードするスレオニンデアミナーゼは、L−イソロイシン生合成系の律速段階であるL−スレオニンから2−ケト酪酸への脱アミノ化反応を触媒する。したがって、L−バリン合成系の反応を効率よく進行させるためには、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないオペロンを用いることが好ましい。このようなスレオニンデアミナーゼ活性を発現しないilvGMEDAオペロンとしては、スレオニンデアミナーゼ活性を失うような変異がilvAに導入された、又はilvAが破壊されたilvGMEDAオペロン、あるいはilvAが欠失したilvGMEDオペロンが挙げられる。
また、ilvGMEDAオペロンは、L−バリン及び/又はL−イソロイシン及び/又はL−ロイシンによるオペロンの発現調節(アテニュエーション)を受けるので、生成するL−バリンによる発現抑制を解除するために、アテニュエーションに必要な領域が除去又は変異されていることが好ましい。
上記のような、スレオニンデアミナーゼ活性を発現せず、アテニュエーションが解除されたilvGMEDAオペロンは、野生型ilvGMEDAオペロンを変異処理し、または遺伝子組換え技術を用いて改変することにより得られる(以上、WO96/06926参照)。
<2−5 L−ロイシン生産能の付与>
上記のような、スレオニンデアミナーゼ活性を発現せず、アテニュエーションが解除されたilvGMEDAオペロンは、野生型ilvGMEDAオペロンを変異処理し、または遺伝子組換え技術を用いて改変することにより得られる(以上、WO96/06926参照)。
<2−5 L−ロイシン生産能の付与>
L−ロイシンの生産能の付与または増強は、例えば、上記L−バリン生産に必要な性質に加えて、制御機構が実質的に解除されたL−ロイシン生合成系遺伝子をメチロフィラス属に属する微生物に導入することによって行われる。また、メチロフィラス属に属する微生物が保持するL−ロイシン生合成系遺伝子の制御機構が実質的に解除されるような変異を導入してもよい。このような遺伝子として、例えば、L−ロイシンによる阻害が実質的に解除されたleuA遺伝子が挙げられる。
<2−6 L−イソロイシン生産能の付与>
<2−6 L−イソロイシン生産能の付与>
L−イソロイシンは、例えば、E. coli由来のL−スレオニンによる阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼI−ホモセリンデヒドロゲナーゼIをコードするthrA遺伝子を含むthrABCオペロンと、L−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするilvA遺伝子を含みかつアテニュエーションに必要な領域が除去されたilvGMEDAオペロンとを導入することにより、L−イソロイシン生産性を付与することができる(特開平8−47397参照)。
<2−7 その他のアミノ酸生産能の付与>
<2−7 その他のアミノ酸生産能の付与>
L−トリプトファン、L−フェニルアラニン、L−チロシン、L−スレオニン及びL−イソロイシンは、メチロフィラス属細菌のホスホエノールピルビン酸の生産能を上昇させることによって、生合成が強化され得る(WO97/08333)。
L−フェニルアラニン及びL−チロシンは、脱感作型コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼ(CM−PDT)遺伝子(特開平5−236947号、特開昭62−130693号公報参照)、脱感作型3−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−7−リン酸シンターゼ(DS)遺伝子(特開平5−236947号、特開昭61−124375号公報参照)を増幅又は導入することによって、生産性が向上する。
L−フェニルアラニン及びL−チロシンは、脱感作型コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼ(CM−PDT)遺伝子(特開平5−236947号、特開昭62−130693号公報参照)、脱感作型3−デオキシ−D−アラビノヘプツロン酸−7−リン酸シンターゼ(DS)遺伝子(特開平5−236947号、特開昭61−124375号公報参照)を増幅又は導入することによって、生産性が向上する。
また、L−トリプトファンは、脱感作型アントラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロン(特開昭57−71397号、特開昭62−244382号、米国特許第4,371,614)を増幅又は導入することによって、生産性が向上する。
なお、本明細書において、酵素の「活性が増強されている」とは、通常には、野生株よりも細胞内のその酵素活性が高いことを意味し、遺伝子組換え技術等による改変によりその酵素活性が増強された菌株を得た場合には、改変前の菌株よりも細胞内のその酵素活性が高いことを意味する。また、酵素の「活性が低下している」とは、通常には、野生株よりも細胞内のその酵素活性が低いことを意味し、遺伝子組換え技術等による改変によりその酵素活性が低下した菌株を得た場合には、改変前の菌株よりも細胞内のその酵素活性が低いことを意味する。
[実施例]
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されない。
試薬は、特記しない限り和光純薬、又はナカライテスク社製のものを用いた。各実施例で用いる培地の組成は以下に示すとおりである。いずれの培地もpHはNaOHまたはHClで調整した。
[実施例]
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されない。
試薬は、特記しない限り和光純薬、又はナカライテスク社製のものを用いた。各実施例で用いる培地の組成は以下に示すとおりである。いずれの培地もpHはNaOHまたはHClで調整した。
(LB培地)
トリプトン・ペプトン(ディフコ社製) 10g/L
酵母エキス(ディフコ社製) 5g/L
NaCl 10g/L
pH7.0
[120℃、20分間蒸気滅菌を行った。]
トリプトン・ペプトン(ディフコ社製) 10g/L
酵母エキス(ディフコ社製) 5g/L
NaCl 10g/L
pH7.0
[120℃、20分間蒸気滅菌を行った。]
(LB寒天培地)
LB培地
バクトアガー 15g/L
[120℃、20分間蒸気滅菌を行った。]
LB培地
バクトアガー 15g/L
[120℃、20分間蒸気滅菌を行った。]
(SEII培地)
K2HPO4 1.9g/L
NaH2PO4 1.56g/L
MgSO4・7H2O 0.2g/L
(NH4)2SO4 5g/L
CuSO4・5H2O 5μg/L
MnSO4・5H2O 25μg/L
ZnSO4・7H2O 23μg/L
CaCl2・2H2O 72mg/L
FeCl3・6H2O 9.7mg/L
メタノール 0.5%(vol/vol)
pH7.0
[メタノール以外は121℃、15分間蒸気滅菌を行った。良くさめてからメタノールを添加した。]
K2HPO4 1.9g/L
NaH2PO4 1.56g/L
MgSO4・7H2O 0.2g/L
(NH4)2SO4 5g/L
CuSO4・5H2O 5μg/L
MnSO4・5H2O 25μg/L
ZnSO4・7H2O 23μg/L
CaCl2・2H2O 72mg/L
FeCl3・6H2O 9.7mg/L
メタノール 0.5%(vol/vol)
pH7.0
[メタノール以外は121℃、15分間蒸気滅菌を行った。良くさめてからメタノールを添加した。]
(SEII生産培地)
K2HPO4 1.9g/L
NaH2PO4 1.56g/L
MgSO4・7H2O 0.2g/L
(NH4) 2SO4 5g/L
CuSO4・5H2O 5μg/L
MnSO4・5H2O 25μg/L
ZnSO4・7H2O 23μg/L
CaCl2・2H2O 72mg/L
FeCl3・6H2O 9.7mg/L
ピルビン酸・Na 2.5 g/L
CaCO3(関東化学製) 30g/L
メタノール 2%(vol/vol)
pH7.0
[メタノール以外は121℃、15分間蒸気滅菌を行った。良くさめてからメタノールを添加した。]
K2HPO4 1.9g/L
NaH2PO4 1.56g/L
MgSO4・7H2O 0.2g/L
(NH4) 2SO4 5g/L
CuSO4・5H2O 5μg/L
MnSO4・5H2O 25μg/L
ZnSO4・7H2O 23μg/L
CaCl2・2H2O 72mg/L
FeCl3・6H2O 9.7mg/L
ピルビン酸・Na 2.5 g/L
CaCO3(関東化学製) 30g/L
メタノール 2%(vol/vol)
pH7.0
[メタノール以外は121℃、15分間蒸気滅菌を行った。良くさめてからメタノールを添加した。]
(SEII寒天培地)
K2HPO4 1.9g/L
NaH2PO4 1.56g/L
MgSO4・7H2O 0.2g/L
(NH4) 2SO4 5g/L
CuSO4・5H2O 5μg/L
MnSO4・5H2O 25μg/L
ZnSO4・7H2O 23μg/L
CaCl2・2H2O 72mg/L
FeCl3・6H2O 9.7mg/L
ピルビン酸・Na 1.0 g/L
メタノール 1%(vol/vol)
pH7.0
バクトアガー(ディフコ社製) 15g/L
[メタノール以外は121℃、15分間蒸気滅菌を行った。良くさめてからメタノールおよび必要に応じて20g/Lに調製したL-メチオニン溶液をフィルター滅菌して添加した。]
[参考例1]
<mini-Muシステムの構築、pMIV-Km、pMIV-Km-EA、pAET7>
染色体上でlysE24および変異型dapA遺伝子のコピー数を増幅するために、エシェリヒア・コリにて見出されたバクテリオファージであるMu-phageの機能を利用した遺伝子組み込み系を利用した。
K2HPO4 1.9g/L
NaH2PO4 1.56g/L
MgSO4・7H2O 0.2g/L
(NH4) 2SO4 5g/L
CuSO4・5H2O 5μg/L
MnSO4・5H2O 25μg/L
ZnSO4・7H2O 23μg/L
CaCl2・2H2O 72mg/L
FeCl3・6H2O 9.7mg/L
ピルビン酸・Na 1.0 g/L
メタノール 1%(vol/vol)
pH7.0
バクトアガー(ディフコ社製) 15g/L
[メタノール以外は121℃、15分間蒸気滅菌を行った。良くさめてからメタノールおよび必要に応じて20g/Lに調製したL-メチオニン溶液をフィルター滅菌して添加した。]
[参考例1]
<mini-Muシステムの構築、pMIV-Km、pMIV-Km-EA、pAET7>
染色体上でlysE24および変異型dapA遺伝子のコピー数を増幅するために、エシェリヒア・コリにて見出されたバクテリオファージであるMu-phageの機能を利用した遺伝子組み込み系を利用した。
<pMIV5の構築>(図1、2)
Mu-phageがエシェリヒア・コリの染色体上に組み込まれるためにはattL, attRという認識配列に挟み込まれた薬剤耐性遺伝子および転移に必要な転移酵素(ミュートランスポゼース=Mu転移酵素)が必要である。両者は必ずしも同一ベクターに搭載されている必要はないので、まず、認識配列attL, attRおよびカナマイシン耐性遺伝子を搭載したpMIV5プラスミドを構築し、これとは別にMu転移酵素を搭載するpAET7プラスミドを構築した。両プラスミドを同一菌内で保持させることで両者が機能し、その保持している菌株の染色体DNAにattL,attRにはさまれた領域が転移する。
pMIV5はまず、公知のベクターpMW119(東洋紡から購入可能)を制限酵素PvuIIにて消化後、アガロースゲル電気泳動にて分離し、約3.9kbpの断片を回収しこれをDNA Ligation Kit(タカラバイオ)にて連結し、pMW1プラスミドを構築した。次に、このpMW1プラスミドにE.coliの細胞内でmini-Mu-phageを転移させた。具体的にはEscherichia coliのK12株に公知のプラスミド(Journal of Bacteriology 158, 488-495(1984))であるpMD4041を導入したのち、カナマイシン耐性でかつアンピシリン感受性の株を選択することで、pMD4041プラスミドが脱落し、かわりにmini-Mu 4041が染色体上に転移した株を選択した。このmini-Mu4041のMu転移を抑制する因子であるcリプレッサーが温度感受性変異を持つため、この株を42℃にて培養すると染色体上のmini-Muのcリプレッサーが不活性化され、そのためmini-Mu4041の転移が大きく活性化され、結果として染色体上にmini-Muの転移が効率的に起こるため致死となる。この染色体上にmini-Mu4041が溶原化された株にpMW1を30℃にて形質転換した。このpMW1プラスミド保持する株を30℃にて1mlの細胞数が2x108になるまでLB培地で培養したものを42℃にて1時間処理した。この処理によってpMW1プラスミド上にmini-Mu4041が転移したプラスミドを取得する目的で、この菌体からプラスミドDNAを調製して、Escherichia coli株に形質転換した。カナマイシン耐性でかつアンピシリン耐性となる形質転換株50株よりそれぞれプラスミドを調製して、制限酵素処理により構造を調べたところ目的のプラスミドをひとつ得た。このプラスミドをpMu11と命名した。このpMu11プラスミドはpMW1プラスミド上のpar領域上にmini-Mu4041が転移していた。さらに具体的にはpMW119は公知のプラスミドpBR322とpSC101の断片からなるが、この境界位置をゼロ位置としたときの259の位置に挿入されていた。このプラスミドを制限酵素HindIIIにて消化し、アガロースゲル電気泳動にて分離し、約6.9kbpの断片を回収しこれをDNA Ligation Kit(タカラバイオ)にて連結し、pM12プラスミドを構築した(図1)。このpM12プラスミドをHindIII-AvaIII(EcoT22I)にて消化し、これをベクターとし、これにPCR増幅したE.coliのthrオペロンのターミネーター領域を連結、挿入した。PCR増幅の鋳型にはE.coliの染色体DNAを用い、プライマーはp-ter-thrL-f(配列番号1:5- aaaaagcttaacacagaaaaaagcc-3)およびp-ter-thrL-r(配列番号2:5- aaactgcagtggtcgaaaaaaaaagccc-3)を用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-60秒のサイクルを25サイクルで行った。得られたプラスミドを制限酵素EcoRI-HindIIIにて消化し、これをベクターとし、PCR増幅したマルチクローニングサイト領域およびPCR増幅したバクテリオファージfd由来のロー因子非依存的転写終結因子断片を挿入した。マルチクローニングサイト領域のPCR増幅の鋳型にはpUC57プラスミド(Fermentus AB社、LITHUANIAより購入可能)を用い、プライマーはpUC57-MCS-f(配列番号3:5- aaagaattcgagctcggtacctc-3)およびpUC57-MCS-r(配列番号4:5- aaaaagcttgcatgcaggcctct-3)を用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-30秒のサイクルを25サイクルで行った。この増幅断片をあらかじめプライマーにデザインしておいたEcoRI-BamHIにて消化した。バクテリオファージfd由来のロー因子非依存的転写終結因子断片のPCR増幅の鋳型にはバクテリオファージfdのケ゛ノムDNAを用い、プライマーはter-fd-f(配列番号5:5- aaaggatccgcatgccgttga-3)およびter-fd-r(配列番号6:5-aaagaattccgatacaattaaaggctccttttggagccttttttttggagattttcaacgtgaaaaaattattattcgcaattccaagctaat-3)を用い、PCR条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-30秒のサイクルを25サイクルで行った。この増幅断片をあらかじめプライマーにデザインしておいたEcoRI-HindIIIにて消化した。この3断片をDNA Ligation kit(タカラバイオ)にて連結し、pMIV5プラスミドを構築した(図2)。さらにこのプラスミドをEcoRVにて消化し、ここに市販のプラスミドであるpUC4KよりHincIIにて切り出したカナマイシン耐性遺伝子断片を挿入してpMIV5-Kmプラスミドを構築した。
Mu-phageがエシェリヒア・コリの染色体上に組み込まれるためにはattL, attRという認識配列に挟み込まれた薬剤耐性遺伝子および転移に必要な転移酵素(ミュートランスポゼース=Mu転移酵素)が必要である。両者は必ずしも同一ベクターに搭載されている必要はないので、まず、認識配列attL, attRおよびカナマイシン耐性遺伝子を搭載したpMIV5プラスミドを構築し、これとは別にMu転移酵素を搭載するpAET7プラスミドを構築した。両プラスミドを同一菌内で保持させることで両者が機能し、その保持している菌株の染色体DNAにattL,attRにはさまれた領域が転移する。
pMIV5はまず、公知のベクターpMW119(東洋紡から購入可能)を制限酵素PvuIIにて消化後、アガロースゲル電気泳動にて分離し、約3.9kbpの断片を回収しこれをDNA Ligation Kit(タカラバイオ)にて連結し、pMW1プラスミドを構築した。次に、このpMW1プラスミドにE.coliの細胞内でmini-Mu-phageを転移させた。具体的にはEscherichia coliのK12株に公知のプラスミド(Journal of Bacteriology 158, 488-495(1984))であるpMD4041を導入したのち、カナマイシン耐性でかつアンピシリン感受性の株を選択することで、pMD4041プラスミドが脱落し、かわりにmini-Mu 4041が染色体上に転移した株を選択した。このmini-Mu4041のMu転移を抑制する因子であるcリプレッサーが温度感受性変異を持つため、この株を42℃にて培養すると染色体上のmini-Muのcリプレッサーが不活性化され、そのためmini-Mu4041の転移が大きく活性化され、結果として染色体上にmini-Muの転移が効率的に起こるため致死となる。この染色体上にmini-Mu4041が溶原化された株にpMW1を30℃にて形質転換した。このpMW1プラスミド保持する株を30℃にて1mlの細胞数が2x108になるまでLB培地で培養したものを42℃にて1時間処理した。この処理によってpMW1プラスミド上にmini-Mu4041が転移したプラスミドを取得する目的で、この菌体からプラスミドDNAを調製して、Escherichia coli株に形質転換した。カナマイシン耐性でかつアンピシリン耐性となる形質転換株50株よりそれぞれプラスミドを調製して、制限酵素処理により構造を調べたところ目的のプラスミドをひとつ得た。このプラスミドをpMu11と命名した。このpMu11プラスミドはpMW1プラスミド上のpar領域上にmini-Mu4041が転移していた。さらに具体的にはpMW119は公知のプラスミドpBR322とpSC101の断片からなるが、この境界位置をゼロ位置としたときの259の位置に挿入されていた。このプラスミドを制限酵素HindIIIにて消化し、アガロースゲル電気泳動にて分離し、約6.9kbpの断片を回収しこれをDNA Ligation Kit(タカラバイオ)にて連結し、pM12プラスミドを構築した(図1)。このpM12プラスミドをHindIII-AvaIII(EcoT22I)にて消化し、これをベクターとし、これにPCR増幅したE.coliのthrオペロンのターミネーター領域を連結、挿入した。PCR増幅の鋳型にはE.coliの染色体DNAを用い、プライマーはp-ter-thrL-f(配列番号1:5- aaaaagcttaacacagaaaaaagcc-3)およびp-ter-thrL-r(配列番号2:5- aaactgcagtggtcgaaaaaaaaagccc-3)を用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-60秒のサイクルを25サイクルで行った。得られたプラスミドを制限酵素EcoRI-HindIIIにて消化し、これをベクターとし、PCR増幅したマルチクローニングサイト領域およびPCR増幅したバクテリオファージfd由来のロー因子非依存的転写終結因子断片を挿入した。マルチクローニングサイト領域のPCR増幅の鋳型にはpUC57プラスミド(Fermentus AB社、LITHUANIAより購入可能)を用い、プライマーはpUC57-MCS-f(配列番号3:5- aaagaattcgagctcggtacctc-3)およびpUC57-MCS-r(配列番号4:5- aaaaagcttgcatgcaggcctct-3)を用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-30秒のサイクルを25サイクルで行った。この増幅断片をあらかじめプライマーにデザインしておいたEcoRI-BamHIにて消化した。バクテリオファージfd由来のロー因子非依存的転写終結因子断片のPCR増幅の鋳型にはバクテリオファージfdのケ゛ノムDNAを用い、プライマーはter-fd-f(配列番号5:5- aaaggatccgcatgccgttga-3)およびter-fd-r(配列番号6:5-aaagaattccgatacaattaaaggctccttttggagccttttttttggagattttcaacgtgaaaaaattattattcgcaattccaagctaat-3)を用い、PCR条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-30秒のサイクルを25サイクルで行った。この増幅断片をあらかじめプライマーにデザインしておいたEcoRI-HindIIIにて消化した。この3断片をDNA Ligation kit(タカラバイオ)にて連結し、pMIV5プラスミドを構築した(図2)。さらにこのプラスミドをEcoRVにて消化し、ここに市販のプラスミドであるpUC4KよりHincIIにて切り出したカナマイシン耐性遺伝子断片を挿入してpMIV5-Kmプラスミドを構築した。
<pMIV-Km-lysE24dapA>
上記のように構築したmini-Muを利用した遺伝子組み込み用プラスミドpMIV5-Kmに目的の遺伝子を挿入し、これを用いて染色体上に目的のDNA断片を転移させた。具体的にはpMIV5-KmプラスミドをSmaIにて消化し、これを脱リン酸化処理した。一方、lysE24+dapA*断片は同遺伝子を含む公知プラスミドpRSlysEdapA(特開2003-61687号広報参照)を鋳型とし、pRS-1s(配列番号8:5- cacagagacatattgcccgttg-3)およびdapA-r(配列番号7:5- cattctagatccctaaactttacagcaaaccggcat-3)をプライマーとしたPCR増幅によって得た。PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-120秒のサイクルを25サイクルで行った。PCR増幅断片をTaKaRa BKL kit(タカラバイオ)両者を連結してpMIV-Km-lysE24dapAプラスミドを構築した。
上記のように構築したmini-Muを利用した遺伝子組み込み用プラスミドpMIV5-Kmに目的の遺伝子を挿入し、これを用いて染色体上に目的のDNA断片を転移させた。具体的にはpMIV5-KmプラスミドをSmaIにて消化し、これを脱リン酸化処理した。一方、lysE24+dapA*断片は同遺伝子を含む公知プラスミドpRSlysEdapA(特開2003-61687号広報参照)を鋳型とし、pRS-1s(配列番号8:5- cacagagacatattgcccgttg-3)およびdapA-r(配列番号7:5- cattctagatccctaaactttacagcaaaccggcat-3)をプライマーとしたPCR増幅によって得た。PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-120秒のサイクルを25サイクルで行った。PCR増幅断片をTaKaRa BKL kit(タカラバイオ)両者を連結してpMIV-Km-lysE24dapAプラスミドを構築した。
<pAET7の構築>(図4)
既知のプラスミドpUC1918(Gene,(1993) 134, 89-91)を制限酵素EcoRIにて消化し、平滑末端処理を行った。これをベクターとし、既知のプラスミドpMu4041(Journal of Bacteriology, (1984), 158, 488-495)をScaI-Eco47IIIにて消化することで得たミュートランスポゼースをコードするDNA断片を平滑末端処理したものと連結した。このプラスミドをpUC-MH7と命名した。このpUC-MH7プラスミドをBamHIにて消化し、切り出したミュートランスポゼースをコードするDNA断片を既知のプラスミドpAYC32(Journal of General Microbiology 137, 169-178 (1991))のBamHIサイトに挿入し、pAET7プラスミドを得た。
[参考例2]
既知のプラスミドpUC1918(Gene,(1993) 134, 89-91)を制限酵素EcoRIにて消化し、平滑末端処理を行った。これをベクターとし、既知のプラスミドpMu4041(Journal of Bacteriology, (1984), 158, 488-495)をScaI-Eco47IIIにて消化することで得たミュートランスポゼースをコードするDNA断片を平滑末端処理したものと連結した。このプラスミドをpUC-MH7と命名した。このpUC-MH7プラスミドをBamHIにて消化し、切り出したミュートランスポゼースをコードするDNA断片を既知のプラスミドpAYC32(Journal of General Microbiology 137, 169-178 (1991))のBamHIサイトに挿入し、pAET7プラスミドを得た。
[参考例2]
<lysE24および変異型dapA遺伝子のメチロフィラス・メチロトロファス株の染色体上への組み込み、VAE#1取得>
まず、M.methylotrophusAS株にpAET7をエレクトロポレーション法によって導入、50mg/lのストレプトマイシンを含むSEIIプレートに塗布した。次に、得られた形質転換株に、pMIV-Km-lysE24dapAプラスミドをエレクトロポレーション法によって導入して20mg/lのカナマイシンおよび50mg/Lのストレプトマイシンを含むSEIIプレートにてコロニーを形成する株を取得した。mini-Muカセットの内部にはカナマイシン耐性遺伝子が挿入されており、また、pMIV-Km-lysE24dapAプラスミドはM.methylotrophus中で複製することができないので、このカナマイシン耐性となった株は、染色体上にmini-Muカセットが挿入された株である。そこで、これらの株より無作為に200株を選択し、50mg/Lのストレプトマイシンおよび20mg/Lのカナマイシンを含むSEIIプレートに塗り広げ、37℃にて1晩培養したのち、培地表面約0.3平方センチメートルの菌体をかきとって50mg/Lのストレプトマイシンおよび20mg/Lのカナマイシンを含むSEII生産培地(5ml)に植菌し、37℃にて34時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により除去し、培養上清に含まれるL−リジン濃度をバイオテックアナライザーAS-210(サクラ精機製)を用いて定量し、L-リジンを最も多く含む株を選択した。この株をVAE#1と命名した。
[参考例3]
まず、M.methylotrophusAS株にpAET7をエレクトロポレーション法によって導入、50mg/lのストレプトマイシンを含むSEIIプレートに塗布した。次に、得られた形質転換株に、pMIV-Km-lysE24dapAプラスミドをエレクトロポレーション法によって導入して20mg/lのカナマイシンおよび50mg/Lのストレプトマイシンを含むSEIIプレートにてコロニーを形成する株を取得した。mini-Muカセットの内部にはカナマイシン耐性遺伝子が挿入されており、また、pMIV-Km-lysE24dapAプラスミドはM.methylotrophus中で複製することができないので、このカナマイシン耐性となった株は、染色体上にmini-Muカセットが挿入された株である。そこで、これらの株より無作為に200株を選択し、50mg/Lのストレプトマイシンおよび20mg/Lのカナマイシンを含むSEIIプレートに塗り広げ、37℃にて1晩培養したのち、培地表面約0.3平方センチメートルの菌体をかきとって50mg/Lのストレプトマイシンおよび20mg/Lのカナマイシンを含むSEII生産培地(5ml)に植菌し、37℃にて34時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により除去し、培養上清に含まれるL−リジン濃度をバイオテックアナライザーAS-210(サクラ精機製)を用いて定量し、L-リジンを最も多く含む株を選択した。この株をVAE#1と命名した。
[参考例3]
<更なる高コピー組み込み株の取得(VAE#8)>
VAE#1株は1コピーまたは2コピーのmini-Muカセットが染色体上に挿入された株であると思われた。そこで、さらにL-リジンの生産性を向上させるためmini-Muカセットの染色体上での増幅を行った。Muトランスポゼースを搭載するpAET7プラスミド上にはMuトランスポゼースの活性を抑制するMuCタンパク質をコードする遺伝子が搭載されているが、このMuCたんぱく質は温度感受性の性質を持っているため、42℃にて培養することでMuトランスポゼースの活性を促進することができ、その結果、染色体上でのmini-Muカセットの増幅を行うことができる。具体的にはVAE#1株をSEII液体培地に適当な濃度になるように懸濁し、これを42℃にて1時間保温した後、適当に希釈した菌液を50mg/Lのストレプトマイシンおよび20mg/Lのカナマイシンを含むSEIIプレートに塗布し、シングルコロニーを形成させた。このシングルコロニーを無作為に200個を選択し、50mg/Lのストレプトマイシンおよび20mg/Lのカナマイシンを含むSEIIプレートに塗り広げ、37℃にて1晩培養したのち、培地表面約0.3平方センチメートルの菌体をかきとって50mg/Lのストレプトマイシンおよび20mg/Lのカナマイシンを含むSEII生産培地(5ml)に植菌し、37℃にて34時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により除去し、培養上清に含まれるL−リジン濃度をバイオテックアナライザーAS-210(サクラ精機製)で定量し、L-リジンを最も多く含む株を選択した。この株をVAE#2と命名した。この操作を8回繰り返すことでVAE#8株を得た。VAE#8株のLys蓄積の相対値をVAE#1を100としたときの値で表1に示した。
VAE#1株は1コピーまたは2コピーのmini-Muカセットが染色体上に挿入された株であると思われた。そこで、さらにL-リジンの生産性を向上させるためmini-Muカセットの染色体上での増幅を行った。Muトランスポゼースを搭載するpAET7プラスミド上にはMuトランスポゼースの活性を抑制するMuCタンパク質をコードする遺伝子が搭載されているが、このMuCたんぱく質は温度感受性の性質を持っているため、42℃にて培養することでMuトランスポゼースの活性を促進することができ、その結果、染色体上でのmini-Muカセットの増幅を行うことができる。具体的にはVAE#1株をSEII液体培地に適当な濃度になるように懸濁し、これを42℃にて1時間保温した後、適当に希釈した菌液を50mg/Lのストレプトマイシンおよび20mg/Lのカナマイシンを含むSEIIプレートに塗布し、シングルコロニーを形成させた。このシングルコロニーを無作為に200個を選択し、50mg/Lのストレプトマイシンおよび20mg/Lのカナマイシンを含むSEIIプレートに塗り広げ、37℃にて1晩培養したのち、培地表面約0.3平方センチメートルの菌体をかきとって50mg/Lのストレプトマイシンおよび20mg/Lのカナマイシンを含むSEII生産培地(5ml)に植菌し、37℃にて34時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により除去し、培養上清に含まれるL−リジン濃度をバイオテックアナライザーAS-210(サクラ精機製)で定量し、L-リジンを最も多く含む株を選択した。この株をVAE#2と命名した。この操作を8回繰り返すことでVAE#8株を得た。VAE#8株のLys蓄積の相対値をVAE#1を100としたときの値で表1に示した。
<VAE#8転移位置の決定>
次に、VAE#8株の染色体上でmini-Muカセットが転移している位置を決定した。VAE#8株の染色体DNAを調製し、これを制限酵素SalIにて完全分解した。これをpHSG398ベクターに連結し、12.5mg/Lのクロラムフェニコール及び25mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地にて選択し、得られたコロニーよりプラスミドDNAを調製した。このプラスミドにはmini-Muカセット上のカナマイシン耐性遺伝子及びその転移した位置の周辺の染色体DNAがクローニングされている。これを、mini-Muカセットの右端に存在するattR内部に外向きにデザインしたシークエンシングプライマー(attR-r1 5- catctgtttcatttgaagcgcgaaagcta-3:配列番号9)を用いて塩基配列を決定することで、染色体上に転移したmini-Muカセットの転移位置を決定することができる。この方法で決定した転移位置の情報に基づいてVAE#8と全く同一の株を構築することも可能である。
[参考例5]
次に、VAE#8株の染色体上でmini-Muカセットが転移している位置を決定した。VAE#8株の染色体DNAを調製し、これを制限酵素SalIにて完全分解した。これをpHSG398ベクターに連結し、12.5mg/Lのクロラムフェニコール及び25mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地にて選択し、得られたコロニーよりプラスミドDNAを調製した。このプラスミドにはmini-Muカセット上のカナマイシン耐性遺伝子及びその転移した位置の周辺の染色体DNAがクローニングされている。これを、mini-Muカセットの右端に存在するattR内部に外向きにデザインしたシークエンシングプライマー(attR-r1 5- catctgtttcatttgaagcgcgaaagcta-3:配列番号9)を用いて塩基配列を決定することで、染色体上に転移したmini-Muカセットの転移位置を決定することができる。この方法で決定した転移位置の情報に基づいてVAE#8と全く同一の株を構築することも可能である。
[参考例5]
<VAE#8へのMet要求性の付与(#403)>
次に、VAE#8株へのL-メチオニン要求性の付与を行った。アミノ酸生産菌へのアミノ酸要求性の付与は培養を行う際の菌体生成量を制御するのに有効な手段である。既知の方法(WO 00/61723)にてVAE#8株をNTG変異処理し、これをシングルコロニーを形成する菌密度まで適当に希釈して、0.5g/LのL-メチオニンを含むSEII寒天培地に塗布した。これをL-メチオニンを含まないSEII寒天培地にレプリカ(複製)し、このプレートで生育することができない株、すなわちL-メチオニン要求株を取得した。この株を#403と命名した。この#403株のL-メチオニン生合成に関与すると思われる複数の遺伝子を他の微生物との相同性に基づく当業者によく知られた方法でクローニングし、塩基配列を決定した結果、5,10メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素をコードするmetF遺伝子の一部が欠失していることがわかった。具体的にはmetF遺伝子の開始コドンから92bp下流側から344bp下流側までが欠失していた。我々が見出した既知の方法(、直鎖DNAを用いた相同組み換え法)にてVAE#8のmetF遺伝子を破壊したところL-メチオニン要求性を付与することが可能であった。詳細は実施例19にて後述する。この人為的にmetFを破壊した株は上述のNTG変異処理によって取得したL-メチオニン要求株である#403と同じ性質を示した。遺伝子破壊に用いる破壊用DNA断片は既知の文献(Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K. and Pease, L. R., Gene, 77, 51-9. (1989).)に示されているOver-lap-PCR法を用いて調製した。この#403株および対照としてVAE#8株を0.075g/LのL-メチオニンおよび2.5g/Lのピルビン酸ナトリウムを含むSEII生産培地にて培養したところLys蓄積が向上した。#403株のLys蓄積の相対値をVAE#8株を100としたときの値で結果を表2に示す。
次に、VAE#8株へのL-メチオニン要求性の付与を行った。アミノ酸生産菌へのアミノ酸要求性の付与は培養を行う際の菌体生成量を制御するのに有効な手段である。既知の方法(WO 00/61723)にてVAE#8株をNTG変異処理し、これをシングルコロニーを形成する菌密度まで適当に希釈して、0.5g/LのL-メチオニンを含むSEII寒天培地に塗布した。これをL-メチオニンを含まないSEII寒天培地にレプリカ(複製)し、このプレートで生育することができない株、すなわちL-メチオニン要求株を取得した。この株を#403と命名した。この#403株のL-メチオニン生合成に関与すると思われる複数の遺伝子を他の微生物との相同性に基づく当業者によく知られた方法でクローニングし、塩基配列を決定した結果、5,10メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素をコードするmetF遺伝子の一部が欠失していることがわかった。具体的にはmetF遺伝子の開始コドンから92bp下流側から344bp下流側までが欠失していた。我々が見出した既知の方法(、直鎖DNAを用いた相同組み換え法)にてVAE#8のmetF遺伝子を破壊したところL-メチオニン要求性を付与することが可能であった。詳細は実施例19にて後述する。この人為的にmetFを破壊した株は上述のNTG変異処理によって取得したL-メチオニン要求株である#403と同じ性質を示した。遺伝子破壊に用いる破壊用DNA断片は既知の文献(Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K. and Pease, L. R., Gene, 77, 51-9. (1989).)に示されているOver-lap-PCR法を用いて調製した。この#403株および対照としてVAE#8株を0.075g/LのL-メチオニンおよび2.5g/Lのピルビン酸ナトリウムを含むSEII生産培地にて培養したところLys蓄積が向上した。#403株のLys蓄積の相対値をVAE#8株を100としたときの値で結果を表2に示す。
<pMIV-FRTGmFRT、pMIV-FRTGmFRT-EAプラスミドの構築>(図3)
#403株にさらにmini-Muカセットを組み込むためにカナマイシンとは異なる薬剤耐性遺伝子をもつ挿入カセットを構築した。具体的にはpMIV5プラスミドをEcoRVにて消化し、これをベクターとした。次に、既知のプラスミドpKD4(PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, (2000) 97, 6640-6645) をHindIII-NdeIにて消化し平滑化した、カナマイシン耐性遺伝子領域を持つ断片を挿入した。このプラスミドをpMIV-FRTKmFRTと命名した。このプラスミドを制限酵素BglIIにて消化して平滑末端化し、ここにPCR増幅したゲンタマイシン耐性遺伝子断片を挿入した。PCRの鋳型には既知のプラスミドpML122を用い(Gene, 89, 37-46. (1990))、PCRプライマーはpGm-f(5- cgccagccaggacagaaatgc-3:配列番号10)およびpGm-r(5- gtccagcggtttttcttgggct-3:配列番号11)を用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-60秒のサイクルを25サイクルで行った。このプラスミドをpMIV-FRTGmFRTと命名した。このプラスミドのattLおよびattRに挟まれた領域に目的の遺伝子を挿入することで、目的の遺伝子をM.methylotrophusの染色体上で遺伝子増幅するためのmini-Muカセットを構築した(図3)。具体的にはpMIV-FRTGmFRTプラスミドを制限酵素SmaIにて消化し、これを脱リン酸化処理した。一方、lysE24+dapA*断片は同遺伝子を含む公知プラスミドpRSlysEdapA(特開2003-61687号広報参照)を鋳型とし、pRS-1sおよびdapA-rをプライマーとしたPCR増幅によって得た。PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-120秒のサイクルを25サイクルで行った。PCR増幅断片をTaKaRa BKL kit(タカラバイオ)にてリン酸化した後にこれをベクターと連結してpMIV-FRTGmFRT-EAプラスミドを構築した。なお、pKD4およびpCP20プラスミドはE.coli Genetic Stock CenterにてそれぞれCGSC strain #7632、#7629として登録されており入手可能である。
[参考例7]
#403株にさらにmini-Muカセットを組み込むためにカナマイシンとは異なる薬剤耐性遺伝子をもつ挿入カセットを構築した。具体的にはpMIV5プラスミドをEcoRVにて消化し、これをベクターとした。次に、既知のプラスミドpKD4(PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, (2000) 97, 6640-6645) をHindIII-NdeIにて消化し平滑化した、カナマイシン耐性遺伝子領域を持つ断片を挿入した。このプラスミドをpMIV-FRTKmFRTと命名した。このプラスミドを制限酵素BglIIにて消化して平滑末端化し、ここにPCR増幅したゲンタマイシン耐性遺伝子断片を挿入した。PCRの鋳型には既知のプラスミドpML122を用い(Gene, 89, 37-46. (1990))、PCRプライマーはpGm-f(5- cgccagccaggacagaaatgc-3:配列番号10)およびpGm-r(5- gtccagcggtttttcttgggct-3:配列番号11)を用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-60秒のサイクルを25サイクルで行った。このプラスミドをpMIV-FRTGmFRTと命名した。このプラスミドのattLおよびattRに挟まれた領域に目的の遺伝子を挿入することで、目的の遺伝子をM.methylotrophusの染色体上で遺伝子増幅するためのmini-Muカセットを構築した(図3)。具体的にはpMIV-FRTGmFRTプラスミドを制限酵素SmaIにて消化し、これを脱リン酸化処理した。一方、lysE24+dapA*断片は同遺伝子を含む公知プラスミドpRSlysEdapA(特開2003-61687号広報参照)を鋳型とし、pRS-1sおよびdapA-rをプライマーとしたPCR増幅によって得た。PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-120秒のサイクルを25サイクルで行った。PCR増幅断片をTaKaRa BKL kit(タカラバイオ)にてリン酸化した後にこれをベクターと連結してpMIV-FRTGmFRT-EAプラスミドを構築した。なお、pKD4およびpCP20プラスミドはE.coli Genetic Stock CenterにてそれぞれCGSC strain #7632、#7629として登録されており入手可能である。
[参考例7]
<pMIV-Gm-EAを用いた更なる高コピー組み込み株の取得(#403-11-Gm)>
まず、#403株にpAET7をエレクトロポレーション法によって導入し、50mg/lのストレプトマイシンを含むSEIIプレートに塗布した。次に、得られたpAET7形質転換株に、pMIV-FRTGmFRT-EAプラスミドをエレクトロポレーション法によって導入して20mg/lのゲンタマイシンおよび50mg/Lのストレプトマイシンを含むSEIIプレートにてコロニーを形成する株を取得した。mini-Muカセットの内部にはゲンタマイシン耐性遺伝子が挿入されており、また、pMIV-FRTGmFRT-EAプラスミドはM.methylotrophus中で複製することができないので、このゲンタマイシン耐性となった株は、染色体上にmini-Muカセットが挿入された株である。そこで、これらの株より無作為に200株を選択し、50mg/Lのストレプトマイシンおよび20mg/Lのゲンタマイシンを含むSEIIプレートに塗り広げ、37℃にて1晩培養したのち、培地表面約0.3平方センチメートルの菌体をかきとって50mg/Lのストレプトマイシンおよび20mg/Lのゲンタマイシンを含むSEII生産培地(5ml)に植菌し、37℃にて48時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により除去し、培養上清に含まれるL−リジン濃度をバイオテックアナライザーAS-210(サクラ精機製)で定量し、L-リジンを最も多く含む株を選択した。この株を#403−11Gmと命名した。
[参考例8]
まず、#403株にpAET7をエレクトロポレーション法によって導入し、50mg/lのストレプトマイシンを含むSEIIプレートに塗布した。次に、得られたpAET7形質転換株に、pMIV-FRTGmFRT-EAプラスミドをエレクトロポレーション法によって導入して20mg/lのゲンタマイシンおよび50mg/Lのストレプトマイシンを含むSEIIプレートにてコロニーを形成する株を取得した。mini-Muカセットの内部にはゲンタマイシン耐性遺伝子が挿入されており、また、pMIV-FRTGmFRT-EAプラスミドはM.methylotrophus中で複製することができないので、このゲンタマイシン耐性となった株は、染色体上にmini-Muカセットが挿入された株である。そこで、これらの株より無作為に200株を選択し、50mg/Lのストレプトマイシンおよび20mg/Lのゲンタマイシンを含むSEIIプレートに塗り広げ、37℃にて1晩培養したのち、培地表面約0.3平方センチメートルの菌体をかきとって50mg/Lのストレプトマイシンおよび20mg/Lのゲンタマイシンを含むSEII生産培地(5ml)に植菌し、37℃にて48時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により除去し、培養上清に含まれるL−リジン濃度をバイオテックアナライザーAS-210(サクラ精機製)で定量し、L-リジンを最も多く含む株を選択した。この株を#403−11Gmと命名した。
[参考例8]
<#403-11-Gmの転移位置の決定>
次に、#403−11Gm株の染色体上でmini-Muカセットが転移している位置を決定した。#403−11株の染色体DNAを調製し、これを制限酵素SalIにて完全分解した。これをpHSG398ベクターに連結し、12.5mg/Lのクロラムフェニコール及び25mg/Lのゲンタマイシンを含むLB寒天培地にて選択し、得られたコロニーよりプラスミドDNAを調製した。このプラスミドにはmini-Muカセット上のカナマイシン耐性遺伝子及びその転移した位置の周辺の染色体DNAがクローニングされている。これを、mini-Muカセットの右端に存在するattR内部に外向きにデザインしたシークエンシングプライマー(attR-r1 5- catctgtttcatttgaagcgcgaaagcta-3:配列番号12)を用いて塩基配列を決定することで、染色体上に転移したmini-Muカセットの転移位置を決定した。この方法で決定した転移位置の情報に基づいて#403−11Gmと全く同一の株を構築することも可能である。
[参考例9]
次に、#403−11Gm株の染色体上でmini-Muカセットが転移している位置を決定した。#403−11株の染色体DNAを調製し、これを制限酵素SalIにて完全分解した。これをpHSG398ベクターに連結し、12.5mg/Lのクロラムフェニコール及び25mg/Lのゲンタマイシンを含むLB寒天培地にて選択し、得られたコロニーよりプラスミドDNAを調製した。このプラスミドにはmini-Muカセット上のカナマイシン耐性遺伝子及びその転移した位置の周辺の染色体DNAがクローニングされている。これを、mini-Muカセットの右端に存在するattR内部に外向きにデザインしたシークエンシングプライマー(attR-r1 5- catctgtttcatttgaagcgcgaaagcta-3:配列番号12)を用いて塩基配列を決定することで、染色体上に転移したmini-Muカセットの転移位置を決定した。この方法で決定した転移位置の情報に基づいて#403−11Gmと全く同一の株を構築することも可能である。
[参考例9]
<#403-11-Gmからの薬剤耐性マーカー除去(pFLP31)、#403-11取得>
<pAYCTER3の構築>
pUC19のマルチクローニングサイトの配列を含有するようにデザインした配列番号13(5'-aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aagctta-3')と配列番号14(5'-gatctaagct tgcatgcctg caggtcgact ctagaggatc cccgggtacc gagctcg-3')に記載の合成DNAを、当業者に良く知られた方法でアニーリングさせてポリリンカーを作成した。このポリリンカーは制限酵素EcoRIとBglIIで切断後と同じ末端形状となる様にデザインしてある。更に、配列番号15(5'- ctatgatcat ttgcctggcg gcagtagcgc-3')と配列番号16(5'-cttagatctcaaaaagagtttgtagaaacgc-3')に記載のプライマーを合成し、常法に従って(斉藤、三浦の方法[Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)])調製したEscherichia coli K-12株の染色体DNAからrrnBのターミネーター配列をコードする領域をPCR法にて増幅した。配列番号13のプライマーには制限酵素BglIIの認識配列を、配列番号14のプライマーには制限酵素BclIの認識配列をそれぞれデザインしてある。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase(宝バイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。このPCR断片を制限酵素BglIIとBclIで消化させた後、このPCR断片と先程のポリリンカーとをライゲーションさせて約400bpのDNA断片を作成した。ライゲーション反応にはDNA Ligation Kit Ver.2.1(宝バイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。次に、公知のプラスミドであるpAYC32(J. Gen. Microbiol., 137, 169-178 (1991))の制限酵素EcoRIとBamHIで切り出される約9.2kbpの断片を回収し、先程のDNA断片を挿入する事により、M.methylotrophus NCIMB10515中で機能する発現用プラスミドpAYCTER3を構築した。なお、このpAYCTER3は、pAYC32中にコードされているstrA遺伝子の5’側上流配列を欠損し、代わりにpUC19のマルチクローニングサイトとrrnBターミネーターを持つ構造になっている。
<pAYCTER3の構築>
pUC19のマルチクローニングサイトの配列を含有するようにデザインした配列番号13(5'-aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aagctta-3')と配列番号14(5'-gatctaagct tgcatgcctg caggtcgact ctagaggatc cccgggtacc gagctcg-3')に記載の合成DNAを、当業者に良く知られた方法でアニーリングさせてポリリンカーを作成した。このポリリンカーは制限酵素EcoRIとBglIIで切断後と同じ末端形状となる様にデザインしてある。更に、配列番号15(5'- ctatgatcat ttgcctggcg gcagtagcgc-3')と配列番号16(5'-cttagatctcaaaaagagtttgtagaaacgc-3')に記載のプライマーを合成し、常法に従って(斉藤、三浦の方法[Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)])調製したEscherichia coli K-12株の染色体DNAからrrnBのターミネーター配列をコードする領域をPCR法にて増幅した。配列番号13のプライマーには制限酵素BglIIの認識配列を、配列番号14のプライマーには制限酵素BclIの認識配列をそれぞれデザインしてある。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase(宝バイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。このPCR断片を制限酵素BglIIとBclIで消化させた後、このPCR断片と先程のポリリンカーとをライゲーションさせて約400bpのDNA断片を作成した。ライゲーション反応にはDNA Ligation Kit Ver.2.1(宝バイオ社製)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。次に、公知のプラスミドであるpAYC32(J. Gen. Microbiol., 137, 169-178 (1991))の制限酵素EcoRIとBamHIで切り出される約9.2kbpの断片を回収し、先程のDNA断片を挿入する事により、M.methylotrophus NCIMB10515中で機能する発現用プラスミドpAYCTER3を構築した。なお、このpAYCTER3は、pAYC32中にコードされているstrA遺伝子の5’側上流配列を欠損し、代わりにpUC19のマルチクローニングサイトとrrnBターミネーターを持つ構造になっている。
<pFLP31の構築>
実施例7にて構築した#403−11Gm株のゲンタマイシン耐性遺伝子はあらかじめ2個のFRT配列に挟まれる形でデザインしてあるため、ここにFLPリコンビナーゼを作用させることでこの薬剤耐性遺伝子を染色体上から除去することが可能である。上記の方法で構築したpAYCTER3をBamHI-SmaIにて消化し、ここに公知のプラスミドpCP20(PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, (2000) 97, 6640-6645)よりFLPリコンビナーゼが含まれるSmaI-BamHIにて切り出した3.3kbpの断片を挿入した。得られたプラスミドをpFLP31と命名した。なお、pCP20プラスミドはE.coli Genetic Stock CenterにてCGSC strain #7629として登録されており入手可能である。
実施例7にて構築した#403−11Gm株のゲンタマイシン耐性遺伝子はあらかじめ2個のFRT配列に挟まれる形でデザインしてあるため、ここにFLPリコンビナーゼを作用させることでこの薬剤耐性遺伝子を染色体上から除去することが可能である。上記の方法で構築したpAYCTER3をBamHI-SmaIにて消化し、ここに公知のプラスミドpCP20(PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, (2000) 97, 6640-6645)よりFLPリコンビナーゼが含まれるSmaI-BamHIにて切り出した3.3kbpの断片を挿入した。得られたプラスミドをpFLP31と命名した。なお、pCP20プラスミドはE.coli Genetic Stock CenterにてCGSC strain #7629として登録されており入手可能である。
<薬剤耐性マーカーの除去>
#403−11Gmより当業者によく知られた方法でpAET7を脱落させストレプトマイシン感受性の株を取得した。この株に上記pFLP31プラスミドをエレクトロポレーション法により導入し、50mg/Lのストレプトマイシン及び0.5g/LのL-メチオニンを含むSEII寒天培地に塗布した。得られた株を適度な濃度になるように50mg/Lのストレプトマイシン及び0.5g/LのL-メチオニンを含むSEII培地に懸濁し、これを42℃にて1時間処理した後、シングルコロニーを形成するように希釈した後に50mg/Lのストレプトマイシン及び0.5g/LのL-メチオニンを含むSEII寒天培地に塗布した。得られたコロニーからゲンタマイシン感受性を示す株を選択した。さらに、この株よりpAET7を脱落させてストレプトマイシン感受性となった株を#403−11と命名した。この#403−11株および対照として#403株を20mg/Lのカナマイシンを含み、0.075g/LのL-メチオニンおよび2.5g/Lのピルビン酸ナトリウムを含むSEII生産培地にて培養したところLys蓄積が向上した。#403−11株のLys蓄積の相対値を#403株のLys蓄積を100としたときの値で表3に示す。
#403−11Gmより当業者によく知られた方法でpAET7を脱落させストレプトマイシン感受性の株を取得した。この株に上記pFLP31プラスミドをエレクトロポレーション法により導入し、50mg/Lのストレプトマイシン及び0.5g/LのL-メチオニンを含むSEII寒天培地に塗布した。得られた株を適度な濃度になるように50mg/Lのストレプトマイシン及び0.5g/LのL-メチオニンを含むSEII培地に懸濁し、これを42℃にて1時間処理した後、シングルコロニーを形成するように希釈した後に50mg/Lのストレプトマイシン及び0.5g/LのL-メチオニンを含むSEII寒天培地に塗布した。得られたコロニーからゲンタマイシン感受性を示す株を選択した。さらに、この株よりpAET7を脱落させてストレプトマイシン感受性となった株を#403−11と命名した。この#403−11株および対照として#403株を20mg/Lのカナマイシンを含み、0.075g/LのL-メチオニンおよび2.5g/Lのピルビン酸ナトリウムを含むSEII生産培地にて培養したところLys蓄積が向上した。#403−11株のLys蓄積の相対値を#403株のLys蓄積を100としたときの値で表3に示す。
<DDPS活性上昇の確認>
このようにして得られた#403−11株は染色体上に8コピーのlysE24dapAカセットが転移している。そこで、dapAにコードされるジヒドロジピコリン酸合成酵素の活性上昇を#403−11株にて確認した。ジヒドロジピコリン酸合成酵素の活性測定は既知の方法(Journal of Biological Chemistry, 240, 4710-4716 (1965))を一部変更して行った。具体的には、反応溶液には50mMのimidazole-HCl(pH 7.4)、2mMのL-aspartate-β-semialdehyde, 2mMのsodium pyruvateおよび細胞抽出系を含むように調製し、最終溶液量を1mlとした。結果を表4に示す。
このようにして得られた#403−11株は染色体上に8コピーのlysE24dapAカセットが転移している。そこで、dapAにコードされるジヒドロジピコリン酸合成酵素の活性上昇を#403−11株にて確認した。ジヒドロジピコリン酸合成酵素の活性測定は既知の方法(Journal of Biological Chemistry, 240, 4710-4716 (1965))を一部変更して行った。具体的には、反応溶液には50mMのimidazole-HCl(pH 7.4)、2mMのL-aspartate-β-semialdehyde, 2mMのsodium pyruvateおよび細胞抽出系を含むように調製し、最終溶液量を1mlとした。結果を表4に示す。
[参考例11]
<pBGEAプラスミドの構築、#403-11/pBGEAの構築>
(1)L-リジン生合成系酵素遺伝子(dapA*)およびL-リジン排出活性を持つ遺伝子(lysE24)を搭載するpBGEAプラスミドの構築
メチロフィラス属細菌にdapA*およびLysE24遺伝子を導入するために、公知のプラスミドpBHR1(Antoine, R. and Locht, C., Molecular Microbiology, 6, 1785-99. (1992))を用いて、dapA*およびLysE24発現用プラスミドpBGEAを構築した。まずpBHR1を制限酵素DraIで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて、混合し反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてDNAを回収した。回収したDNA断片をDNA Blunting kit(宝酒造社製)にて末端を平滑化した。
一方、dapA*およびLysE24遺伝子は、同遺伝子を含む公知プラスミドpRSlysEdapA(特開2003-61687号広報参照)より取得した。尚、pRSlysEdapAプラスミドで形質転換されたE.coli JM109株はAJ13832と命名され、同株は2001年6月4日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号FERM P-18371として寄託され、平成14年5月13日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-8042の受託番号のもとで寄託されている。
まず、pRSlysEdapAを制限酵素EcoRIおよびBglIIで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて、混合し反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてDNAを回収した後、0.8%アガロースゲル電気泳動にて目的DNA断片を分離し、約2.0KbpのDNA断片をEASY TRAP ver.2(DNA回収キット、宝酒造社製)を用いて回収した。得られたDNA断片をBKL kit(宝酒造社製)にて末端を平滑化、リン酸化した。
上記のように調整したpBHRI消化物とdapA*およびLysE24遺伝子領域断片を、DNA Ligation Kit Ver.2(宝酒造社製)を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシャリヒア・コリ(E.coli JM109 competent cells、宝酒造社製)を形質転換し、20mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを20mg/Lのカナマイシンを含むLB液体培地に接種し、37℃で8時間振とう培養した。アルカリ―SDS法にて各培養液からプラスミドDNAを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により、構造を確認して、クロラムフェニコール耐性遺伝子の転写方向とdapA*およびlysE24遺伝子の転写方向が同じ向きになっているものをpBHR-EAとした。
上記のようにして得られたpBHR-EAにゲンタマイシン薬剤耐性マーカーを導入したプラスミドpBGEAを構築した。まずpBHR-EAを制限酵素NcoIで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて、混合し反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてDNAを回収した。回収したDNA断片をDNA Blunting kit(宝酒造社製)にて末端を平滑化した。
一方、ゲンタマイシン耐性遺伝子領域は、公知プラスミドpML122(Monika Labes, Alfred Puhler, and Reinhard Simon, Gene, 89,(1990),37-46)を鋳型DNAとして、プライマーpGm-f(配列番号17:5- CGCCAGCCAGGACAGAAATGC-3)およびpGm-r(配列番号18:5- GTCCAGCGGTTTTTCTTGGGCT-3)を用いてPCR(変性94℃-10秒、アニーリング60℃-30秒、伸長反応72℃-90秒)により増幅した。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase(宝酒造社製)を用いた。得られたゲンタマイシン耐性遺伝子断片をBKL kit(宝酒造社製)にて末端を平滑化、リン酸化した。
上記のように調整したpBHR-EA消化物とゲンタマイシン耐性遺伝子領域断片を、DNA Ligation Kit Ver.2(宝酒造社製)を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ(E.coli JM109 competent cells、宝酒造社製)を形質転換し、20mg/Lのゲンタマイシンを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを20mg/Lのゲンタマイシンを含むLB液体培地に接種し、37℃で8時間振とう培養した。アルカリ-SDS法にて各培養液からプラスミドDNAを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により、構造を確認して、pBGEAを得た。実施例9で作成した染色体上にlysE24およびdapA*の遺伝子が組み込まれた株である#403−11株にこのpBGEAをさらに導入してlysE24およびdapA*遺伝子の強化を行った。この株を#403−11/pBGEA株とした。この#403−11/pBGEA株および対照として#403−11株を20mg/Lのカナマイシン、50mg/Lのゲンタマイシンを含み(対照株の培地はゲンタマイシンを含まない)、0.075g/LのL-メチオニンおよび2.5g/Lのピルビン酸ナトリウムを含むSEII生産培地にて培養したところLys蓄積が向上した。#403−11/pBGEA株のLys蓄積の相対値を#403−11株のLys蓄積を100としたときの値で表5に示す。プラスミドの導入により#403−11株のLys生産量は向上した。
(1)L-リジン生合成系酵素遺伝子(dapA*)およびL-リジン排出活性を持つ遺伝子(lysE24)を搭載するpBGEAプラスミドの構築
メチロフィラス属細菌にdapA*およびLysE24遺伝子を導入するために、公知のプラスミドpBHR1(Antoine, R. and Locht, C., Molecular Microbiology, 6, 1785-99. (1992))を用いて、dapA*およびLysE24発現用プラスミドpBGEAを構築した。まずpBHR1を制限酵素DraIで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて、混合し反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてDNAを回収した。回収したDNA断片をDNA Blunting kit(宝酒造社製)にて末端を平滑化した。
一方、dapA*およびLysE24遺伝子は、同遺伝子を含む公知プラスミドpRSlysEdapA(特開2003-61687号広報参照)より取得した。尚、pRSlysEdapAプラスミドで形質転換されたE.coli JM109株はAJ13832と命名され、同株は2001年6月4日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号FERM P-18371として寄託され、平成14年5月13日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-8042の受託番号のもとで寄託されている。
まず、pRSlysEdapAを制限酵素EcoRIおよびBglIIで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて、混合し反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてDNAを回収した後、0.8%アガロースゲル電気泳動にて目的DNA断片を分離し、約2.0KbpのDNA断片をEASY TRAP ver.2(DNA回収キット、宝酒造社製)を用いて回収した。得られたDNA断片をBKL kit(宝酒造社製)にて末端を平滑化、リン酸化した。
上記のように調整したpBHRI消化物とdapA*およびLysE24遺伝子領域断片を、DNA Ligation Kit Ver.2(宝酒造社製)を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシャリヒア・コリ(E.coli JM109 competent cells、宝酒造社製)を形質転換し、20mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを20mg/Lのカナマイシンを含むLB液体培地に接種し、37℃で8時間振とう培養した。アルカリ―SDS法にて各培養液からプラスミドDNAを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により、構造を確認して、クロラムフェニコール耐性遺伝子の転写方向とdapA*およびlysE24遺伝子の転写方向が同じ向きになっているものをpBHR-EAとした。
上記のようにして得られたpBHR-EAにゲンタマイシン薬剤耐性マーカーを導入したプラスミドpBGEAを構築した。まずpBHR-EAを制限酵素NcoIで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて、混合し反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてDNAを回収した。回収したDNA断片をDNA Blunting kit(宝酒造社製)にて末端を平滑化した。
一方、ゲンタマイシン耐性遺伝子領域は、公知プラスミドpML122(Monika Labes, Alfred Puhler, and Reinhard Simon, Gene, 89,(1990),37-46)を鋳型DNAとして、プライマーpGm-f(配列番号17:5- CGCCAGCCAGGACAGAAATGC-3)およびpGm-r(配列番号18:5- GTCCAGCGGTTTTTCTTGGGCT-3)を用いてPCR(変性94℃-10秒、アニーリング60℃-30秒、伸長反応72℃-90秒)により増幅した。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase(宝酒造社製)を用いた。得られたゲンタマイシン耐性遺伝子断片をBKL kit(宝酒造社製)にて末端を平滑化、リン酸化した。
上記のように調整したpBHR-EA消化物とゲンタマイシン耐性遺伝子領域断片を、DNA Ligation Kit Ver.2(宝酒造社製)を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ(E.coli JM109 competent cells、宝酒造社製)を形質転換し、20mg/Lのゲンタマイシンを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを20mg/Lのゲンタマイシンを含むLB液体培地に接種し、37℃で8時間振とう培養した。アルカリ-SDS法にて各培養液からプラスミドDNAを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により、構造を確認して、pBGEAを得た。実施例9で作成した染色体上にlysE24およびdapA*の遺伝子が組み込まれた株である#403−11株にこのpBGEAをさらに導入してlysE24およびdapA*遺伝子の強化を行った。この株を#403−11/pBGEA株とした。この#403−11/pBGEA株および対照として#403−11株を20mg/Lのカナマイシン、50mg/Lのゲンタマイシンを含み(対照株の培地はゲンタマイシンを含まない)、0.075g/LのL-メチオニンおよび2.5g/Lのピルビン酸ナトリウムを含むSEII生産培地にて培養したところLys蓄積が向上した。#403−11/pBGEA株のLys蓄積の相対値を#403−11株のLys蓄積を100としたときの値で表5に示す。プラスミドの導入により#403−11株のLys生産量は向上した。
<pRSlysA、pRSddh、pRSdapB、pRSasd、pRSaskプラスミドの構築および各プラスミドの#403-11/pBGEA株への導入及び評価>
次に、各Lys生合成系遺伝子を搭載した発現用プラスミドの構築および#403-11/pBGEA株への導入及びLys生産性へ与える影響を調べた。
<1>pRSlysAプラスミドの構築
メチロフィラス・メチロトロファスのジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(lysA)は既知の配列(国際公開WO/2000061723の配列番号13)をもとに作成した2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法により、メチロフィラス・メチロトロファスの染色体DNAを鋳型としてそれぞれ得た。プライマーはplysA-f(配列番号19:5'-AAACCCGGGGATCCTGAGCGCCAATACCCTCAAACGCCT-3')およびplysA-r(配列番号20:5'-TTTCCCGGGCTTGGCGGCTTCGGTTTTTTTATTAGGGGTTGCC-3')を用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-60秒のサイクルを25サイクルで行った。増幅されたM.methylotrophusのlysA遺伝子断片をプライマーにあらかじめデザインしておいたSse8387I-XbaIに消化し、これを既知のプラスミドpRStac(特開2003-61687)をSse8387I-XbaIにて消化したものと連結した。このプラスミドをpRSlysAと命名した。
次に、各Lys生合成系遺伝子を搭載した発現用プラスミドの構築および#403-11/pBGEA株への導入及びLys生産性へ与える影響を調べた。
<1>pRSlysAプラスミドの構築
メチロフィラス・メチロトロファスのジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(lysA)は既知の配列(国際公開WO/2000061723の配列番号13)をもとに作成した2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法により、メチロフィラス・メチロトロファスの染色体DNAを鋳型としてそれぞれ得た。プライマーはplysA-f(配列番号19:5'-AAACCCGGGGATCCTGAGCGCCAATACCCTCAAACGCCT-3')およびplysA-r(配列番号20:5'-TTTCCCGGGCTTGGCGGCTTCGGTTTTTTTATTAGGGGTTGCC-3')を用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-60秒のサイクルを25サイクルで行った。増幅されたM.methylotrophusのlysA遺伝子断片をプライマーにあらかじめデザインしておいたSse8387I-XbaIに消化し、これを既知のプラスミドpRStac(特開2003-61687)をSse8387I-XbaIにて消化したものと連結した。このプラスミドをpRSlysAと命名した。
<2>pRSddh
ブレビバクテリウム ラクトファーメンタムのジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh)をコリネバクテリウム・グルタミカム (Corynebacterium glutamicum) のddhの既知の塩基配列(Ishino, S. et al., Nucleic acid res., 15, 3917 (1987)) をもとに作成した2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法により、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム2256株(ATCC13869株)の染色体DNAを鋳型として増幅することによって得た。プライマーはpddh-f(配列番号21:5'-ACCCCTGCAGGGCCACCACAATTTTGGAGGATTACAAGAAC-3')およびpddh-r(配列番号22:5'-TCCTCTAGACTCGAGCTAAATTAGACGTCGCGT-3')を用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-60秒のサイクルを25サイクルで行った。増幅されたddh遺伝子断片をプライマーにあらかじめデザインしておいたSse8387I-XbaIに消化し、これを既知のプラスミドpRStac(特開2003-61687)をSse8387I-XbaIにて消化したものと連結した。このプラスミドをpRSddhと命名した。
ブレビバクテリウム ラクトファーメンタムのジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh)をコリネバクテリウム・グルタミカム (Corynebacterium glutamicum) のddhの既知の塩基配列(Ishino, S. et al., Nucleic acid res., 15, 3917 (1987)) をもとに作成した2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法により、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム2256株(ATCC13869株)の染色体DNAを鋳型として増幅することによって得た。プライマーはpddh-f(配列番号21:5'-ACCCCTGCAGGGCCACCACAATTTTGGAGGATTACAAGAAC-3')およびpddh-r(配列番号22:5'-TCCTCTAGACTCGAGCTAAATTAGACGTCGCGT-3')を用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-60秒のサイクルを25サイクルで行った。増幅されたddh遺伝子断片をプライマーにあらかじめデザインしておいたSse8387I-XbaIに消化し、これを既知のプラスミドpRStac(特開2003-61687)をSse8387I-XbaIにて消化したものと連結した。このプラスミドをpRSddhと命名した。
<3>pRSdapB
E.coliのジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)を既知の塩基配列をもとに作成した2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法により、E.coli染色体DNAを鋳型として増幅した。プライマーはpdapB-f(配列番号23:5'-GCGCCTGCAGGCGCTGGTTACTCTGAAAACGGTCT-3')およびpdapB-r(配列番号24:5'-GCATCTAGAGACAATTTAAAAACATAACACCAAAAATAAAAGGGCC-3')を用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-60秒のサイクルを25サイクルで行った。増幅されたdapB遺伝子断片をプライマーにあらかじめデザインしておいたSse8387I-XbaIに消化し、これを既知のプラスミドpRStac(特開2003-61687)をSse8387I-XbaIにて消化したものと連結した。このプラスミドをpRSdapBと命名した。
E.coliのジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)を既知の塩基配列をもとに作成した2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法により、E.coli染色体DNAを鋳型として増幅した。プライマーはpdapB-f(配列番号23:5'-GCGCCTGCAGGCGCTGGTTACTCTGAAAACGGTCT-3')およびpdapB-r(配列番号24:5'-GCATCTAGAGACAATTTAAAAACATAACACCAAAAATAAAAGGGCC-3')を用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-60秒のサイクルを25サイクルで行った。増幅されたdapB遺伝子断片をプライマーにあらかじめデザインしておいたSse8387I-XbaIに消化し、これを既知のプラスミドpRStac(特開2003-61687)をSse8387I-XbaIにて消化したものと連結した。このプラスミドをpRSdapBと命名した。
<4>pRSasd
E.coliのアスアパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(asd) を既知の塩基配列をもとに作成した2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法により、E.coli染色体DNAを鋳型として増幅した。プライマーはpasd-f(配列番号25:5'- GCCCCTGCAGGCCGGCACATTTATACAGCACACATCTTTG -3')およびpasd-r(配列番号26:5'- TAATCTAGAAAGATTACGCCAGTTGACGAAGCATC -3')を用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-60秒のサイクルを25サイクルで行った。増幅されたddh遺伝子断片をプライマーにあらかじめデザインしておいたSse8387I-XbaIに消化し、これを既知のプラスミドpRStac(特開2003-61687)をSse8387I-XbaIにて消化したものと連結した。このプラスミドをpRSasdと命名した。
E.coliのアスアパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(asd) を既知の塩基配列をもとに作成した2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法により、E.coli染色体DNAを鋳型として増幅した。プライマーはpasd-f(配列番号25:5'- GCCCCTGCAGGCCGGCACATTTATACAGCACACATCTTTG -3')およびpasd-r(配列番号26:5'- TAATCTAGAAAGATTACGCCAGTTGACGAAGCATC -3')を用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-60秒のサイクルを25サイクルで行った。増幅されたddh遺伝子断片をプライマーにあらかじめデザインしておいたSse8387I-XbaIに消化し、これを既知のプラスミドpRStac(特開2003-61687)をSse8387I-XbaIにて消化したものと連結した。このプラスミドをpRSasdと命名した。
<5>pRSask
メチロフィラス・メチロトロファスのアスパルトキナーゼ遺伝子(ask)は既知の配列(国際公開WO/2000061723の配列番号5)をもとに作成した2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法により、メチロフィラス・メチロトロファスの染色体DNAを鋳型としてそれぞれ得た。プライマーはpask-f(配列番号27:5'- AGGGAATTCTAAACCGGATATGGCGATGGCAGGTGGTACT -3')およびpask-r(配列番号28:5'- TAACTGCAGGAAGTTTTAATAGTACCAACACAGCGCATG -3')を用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-90秒のサイクルを25サイクルで行った。増幅されたM.methylotrophusのask遺伝子断片をプライマーにあらかじめデザインしておいたEcoRI-PstIに消化したのち平滑末端化し、これを既知のプラスミドpRStac(特開2003-61687)をSse8387Iにて消化したのち平滑末端化したものと連結した。このプラスミドをpRSaskと命名した。
メチロフィラス・メチロトロファスのアスパルトキナーゼ遺伝子(ask)は既知の配列(国際公開WO/2000061723の配列番号5)をもとに作成した2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR法により、メチロフィラス・メチロトロファスの染色体DNAを鋳型としてそれぞれ得た。プライマーはpask-f(配列番号27:5'- AGGGAATTCTAAACCGGATATGGCGATGGCAGGTGGTACT -3')およびpask-r(配列番号28:5'- TAACTGCAGGAAGTTTTAATAGTACCAACACAGCGCATG -3')を用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-90秒のサイクルを25サイクルで行った。増幅されたM.methylotrophusのask遺伝子断片をプライマーにあらかじめデザインしておいたEcoRI-PstIに消化したのち平滑末端化し、これを既知のプラスミドpRStac(特開2003-61687)をSse8387Iにて消化したのち平滑末端化したものと連結した。このプラスミドをpRSaskと命名した。
<6>各プラスミドの導入・評価
上記のように作成した5種類のプラスミドを実施例11で作成した#403−11/pBGEA株にそれぞれ導入した株を作成し、0.075g/LのL-メチオニンおよび2.5g/Lのピルビン酸ナトリウムを含むSEII生産培地にて培養したが、いずれの株でもLys生産性の向上は見られなかった。ddhを導入した株ではLys生産性が低下した。
[参考例13]
上記のように作成した5種類のプラスミドを実施例11で作成した#403−11/pBGEA株にそれぞれ導入した株を作成し、0.075g/LのL-メチオニンおよび2.5g/Lのピルビン酸ナトリウムを含むSEII生産培地にて培養したが、いずれの株でもLys生産性の向上は見られなかった。ddhを導入した株ではLys生産性が低下した。
[参考例13]
<ddh+lysA組み合わせ強化、pDAプラスミドの構築および評価>
M.methylotrophusにおけるLys生産向上に効果のあるlysE24およびdapA*遺伝子発現を染色体上への遺伝子の組み込み及びプラスミド導入にて十分強化した株である#403−11株を用いて、Lys生産の次の律速点を調べるために実施例12に示したように各遺伝子を単独で増強して効果を調べたが、効果の見られた遺伝子は見出されなかった。そこで、我々は遺伝子を2つずつ搭載した組み合わせ強化用のプラスミドを種々構築し、これを#403−11株に導入して評価したところ、lysAおよびddhを組み合わせて強化するとL-リジン生産性が向上することを見出した。
これはddhにコードされるジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼはジアミノピメリン酸の生成方向と分解方向の両方向の反応を可逆的に触媒する酵素であり、ddh単独での強化はジアミノピメリン酸の生成ではなく分解を促進したためではないかと考えられた。一方、このジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼに続くジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼは脱炭酸反応でありL-リジンの生成方向にしか反応が進行しない不可逆的酵素である。このジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼおよびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼを同時に強化することでジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼによるジアミノピメリン酸の分解を防ぎ、逆にジアミノピメリン酸の合成を促進されたためであると考えられた。
具体的にはpRSddhプラスミドをSapIにて消化し、平滑末端処理して脱リン酸化したものをベクターとし、これにPCR増幅したtacプロモータ領域を含むlysA遺伝子領域DNA断片を挿入した。PCR増幅の鋳型にはpRSlysAプラスミドを用い、プライマーはptac-f(配列番号29:5’- AAAAGATCTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGAC -3’)およびplysA-r(配列番号20:5'-TTTCCCGGGCTTGGCGGCTTCGGTTTTTTTATTAGGGGTTGCC-3')を用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-60秒のサイクルを25サイクルで行った。このPCR増幅断片をXbaIにて消化後、平滑末端処理したものを上記ベクターと連結した。得られたプラスミドはddhとlysA遺伝子の転写の向きが同じであり、このプラスミドをpDAと命名した。このpDAプラスミドを#403−11/pBGEA株に導入した株(#403−11/pBGEA/pDA)および対照として#403−11/pBGEA株を20mg/Lのカナマイシン、50mg/Lのゲンタマイシンおよび、50mg/Lのストレプトマイシンを含み(対照株の培地はストレプトマイシンを含まない)、0.075g/LのL-メチオニンおよび2.5g/Lのピルビン酸ナトリウムを含むSEII生産培地にて培養したところLys蓄積が向上した。#403−11/pBGEA/pDA株のLys蓄積の相対値を#403−11/pBGEA株のLys蓄積を100としたときの値で表6に示す。
M.methylotrophusにおけるLys生産向上に効果のあるlysE24およびdapA*遺伝子発現を染色体上への遺伝子の組み込み及びプラスミド導入にて十分強化した株である#403−11株を用いて、Lys生産の次の律速点を調べるために実施例12に示したように各遺伝子を単独で増強して効果を調べたが、効果の見られた遺伝子は見出されなかった。そこで、我々は遺伝子を2つずつ搭載した組み合わせ強化用のプラスミドを種々構築し、これを#403−11株に導入して評価したところ、lysAおよびddhを組み合わせて強化するとL-リジン生産性が向上することを見出した。
これはddhにコードされるジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼはジアミノピメリン酸の生成方向と分解方向の両方向の反応を可逆的に触媒する酵素であり、ddh単独での強化はジアミノピメリン酸の生成ではなく分解を促進したためではないかと考えられた。一方、このジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼに続くジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼは脱炭酸反応でありL-リジンの生成方向にしか反応が進行しない不可逆的酵素である。このジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼおよびジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼを同時に強化することでジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼによるジアミノピメリン酸の分解を防ぎ、逆にジアミノピメリン酸の合成を促進されたためであると考えられた。
具体的にはpRSddhプラスミドをSapIにて消化し、平滑末端処理して脱リン酸化したものをベクターとし、これにPCR増幅したtacプロモータ領域を含むlysA遺伝子領域DNA断片を挿入した。PCR増幅の鋳型にはpRSlysAプラスミドを用い、プライマーはptac-f(配列番号29:5’- AAAAGATCTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGAC -3’)およびplysA-r(配列番号20:5'-TTTCCCGGGCTTGGCGGCTTCGGTTTTTTTATTAGGGGTTGCC-3')を用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-60秒のサイクルを25サイクルで行った。このPCR増幅断片をXbaIにて消化後、平滑末端処理したものを上記ベクターと連結した。得られたプラスミドはddhとlysA遺伝子の転写の向きが同じであり、このプラスミドをpDAと命名した。このpDAプラスミドを#403−11/pBGEA株に導入した株(#403−11/pBGEA/pDA)および対照として#403−11/pBGEA株を20mg/Lのカナマイシン、50mg/Lのゲンタマイシンおよび、50mg/Lのストレプトマイシンを含み(対照株の培地はストレプトマイシンを含まない)、0.075g/LのL-メチオニンおよび2.5g/Lのピルビン酸ナトリウムを含むSEII生産培地にて培養したところLys蓄積が向上した。#403−11/pBGEA/pDA株のLys蓄積の相対値を#403−11/pBGEA株のLys蓄積を100としたときの値で表6に示す。
[参考例14]
<更なる組み合わせ強化、pBDAS(lysA+ddh+dapB+asd)>
生合成経路上の2つの連続する反応を触媒する酵素遺伝子であるddhおよびlysAを組み合わせて強化するとL-リジン生産性が向上した。我々はddh+lysAにさらに種々の酵素遺伝子を追加して組み合わせ強化を検討した結果、ddhおよびlysAにさらにdapB、asdを組み合わせることでL-リジン蓄積が向上することを見出した。
具体的にはpRSdapBプラスミドをEcoRIにて消化し、これを平滑末端処理、脱リン酸化処理したものをベクターとした。これをpDAプラスミドをHpaI-SapIにて消化し、それぞれ遺伝子の上流にtacプロモーターを含むlysAおよびddhを含む2.5kbpのDNA断片を切り出し、平滑末端処理したものと連結してpBDAプラスミドを構築した。このプラスミドはdapBの上流にddh,lysA遺伝子がdapBと同じ向きになるように挿入されていた。さらにこのpBDAプラスミドをSapIにて消化し、平滑末端処理、脱リン酸化処理したものをベクターとし、これにPCR増幅したtacプロモータ領域を含むasd遺伝子領域DNA断片を挿入した。PCR増幅の鋳型にはpRSasdプラスミドを用い、プライマーはptac-fおよびpasd-rを用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-90秒のサイクルを25サイクルで行った。このPCR増幅断片を平滑末端処理、リン酸化処理したものを上記ベクターと連結した。こうして得られたプラスミドをpBDASと命名した。このpBDASプラスミドを#403−11/pBGEA株に導入した株(#403−11/pBGEA/pBDAS)および対照として#403−11/pBGEA株を20mg/Lのカナマイシン、50mg/Lのゲンタマイシンおよび、50mg/Lのストレプトマイシンを含み(対照株の培地はストレプトマイシンを含まない)0.075g/LのL-メチオニンおよび2.5g/Lのピルビン酸ナトリウムを含むSEII生産培地にて培養したところLys蓄積が向上した。#403−11/pBGEA/pBDAS株のLys蓄積の相対値を#403−11/pBGEA株のLys蓄積を100としたときの値で表7に示す。
生合成経路上の2つの連続する反応を触媒する酵素遺伝子であるddhおよびlysAを組み合わせて強化するとL-リジン生産性が向上した。我々はddh+lysAにさらに種々の酵素遺伝子を追加して組み合わせ強化を検討した結果、ddhおよびlysAにさらにdapB、asdを組み合わせることでL-リジン蓄積が向上することを見出した。
具体的にはpRSdapBプラスミドをEcoRIにて消化し、これを平滑末端処理、脱リン酸化処理したものをベクターとした。これをpDAプラスミドをHpaI-SapIにて消化し、それぞれ遺伝子の上流にtacプロモーターを含むlysAおよびddhを含む2.5kbpのDNA断片を切り出し、平滑末端処理したものと連結してpBDAプラスミドを構築した。このプラスミドはdapBの上流にddh,lysA遺伝子がdapBと同じ向きになるように挿入されていた。さらにこのpBDAプラスミドをSapIにて消化し、平滑末端処理、脱リン酸化処理したものをベクターとし、これにPCR増幅したtacプロモータ領域を含むasd遺伝子領域DNA断片を挿入した。PCR増幅の鋳型にはpRSasdプラスミドを用い、プライマーはptac-fおよびpasd-rを用い、PCRの条件は変性94℃-20秒、アニーリング55℃-30秒、伸長反応72℃-90秒のサイクルを25サイクルで行った。このPCR増幅断片を平滑末端処理、リン酸化処理したものを上記ベクターと連結した。こうして得られたプラスミドをpBDASと命名した。このpBDASプラスミドを#403−11/pBGEA株に導入した株(#403−11/pBGEA/pBDAS)および対照として#403−11/pBGEA株を20mg/Lのカナマイシン、50mg/Lのゲンタマイシンおよび、50mg/Lのストレプトマイシンを含み(対照株の培地はストレプトマイシンを含まない)0.075g/LのL-メチオニンおよび2.5g/Lのピルビン酸ナトリウムを含むSEII生産培地にて培養したところLys蓄積が向上した。#403−11/pBGEA/pBDAS株のLys蓄積の相対値を#403−11/pBGEA株のLys蓄積を100としたときの値で表7に示す。
<イオン強度上昇速度が発酵成績に与える影響>
#403−11/pBGEA/pBDAS株を用いて、イオン強度上昇速度がL-リジン発酵成績に与える影響を確認した。
まず、 #403−11/pBGEA/pBDAS株をSEII寒天培地にて37℃で24時間培養した菌体を1枚のプレートからすべて掻き取り、本懸濁液全量を本培養培地300mlを注入した1L容ジャーファーメンターに植菌し、34℃、pH6.6にて培養を行った。本培養培地組成は以下に示す。
<本培養用培地>
K2HPO4 1.9 g/L
NaH2PO4 1.56 g/L
ピルビン酸・Na 2.5 g/L
MgSO4・7H2O 0.2 g/L
(NH4)2SO4 4.97 g/L
L-メチオニン 0.65 g/L
クエン酸 1 g/L
MgSO4・7H2O 1 g/L
CuSO4・5H2O 25 μg/L
MnSO4・5H2O 125 μg/L
ZnSO4・7H2O 115 μg/L
CaCl2・2H2O 0.36 g/L
FeCl3・6H2O 48.5 mg/L
メタノール 2 %(vol/vol)
ストレプトマイシン硫酸塩 50 mg/L
ゲンタマイシン硫酸塩 50 mg/L
カナマイシン硫酸塩 25 mg/L
[メタノール、抗生物質以外のものは混合後、フィルター滅菌したものを添加した。その後、メタノール、及びフィルター滅菌した抗生物質を添加した。]
#403−11/pBGEA/pBDAS株を用いて、イオン強度上昇速度がL-リジン発酵成績に与える影響を確認した。
まず、 #403−11/pBGEA/pBDAS株をSEII寒天培地にて37℃で24時間培養した菌体を1枚のプレートからすべて掻き取り、本懸濁液全量を本培養培地300mlを注入した1L容ジャーファーメンターに植菌し、34℃、pH6.6にて培養を行った。本培養培地組成は以下に示す。
<本培養用培地>
K2HPO4 1.9 g/L
NaH2PO4 1.56 g/L
ピルビン酸・Na 2.5 g/L
MgSO4・7H2O 0.2 g/L
(NH4)2SO4 4.97 g/L
L-メチオニン 0.65 g/L
クエン酸 1 g/L
MgSO4・7H2O 1 g/L
CuSO4・5H2O 25 μg/L
MnSO4・5H2O 125 μg/L
ZnSO4・7H2O 115 μg/L
CaCl2・2H2O 0.36 g/L
FeCl3・6H2O 48.5 mg/L
メタノール 2 %(vol/vol)
ストレプトマイシン硫酸塩 50 mg/L
ゲンタマイシン硫酸塩 50 mg/L
カナマイシン硫酸塩 25 mg/L
[メタノール、抗生物質以外のものは混合後、フィルター滅菌したものを添加した。その後、メタノール、及びフィルター滅菌した抗生物質を添加した。]
培養中のpHは6.6となるようにアンモニアガスを添加することにより調整を行った。培地中のメタノールが0.2%以下となったときには100%メタノール溶液をフィードすることにより、流加培養を行った。
Lys発酵では、Lys生産のための窒素源、及び目的アミノ酸のカウンターイオン供給のために硫酸アンモニウムを培地中に添加する。培地中に硫酸アンモニウムを添加する際、培地中の総イオン強度上昇速度が0.03mol/m3/hr、0.02mol/m3/hr、0.012mol/m3/hrとなるようにフィードしたときの影響を調べた。
Lys発酵では、Lys生産のための窒素源、及び目的アミノ酸のカウンターイオン供給のために硫酸アンモニウムを培地中に添加する。培地中に硫酸アンモニウムを添加する際、培地中の総イオン強度上昇速度が0.03mol/m3/hr、0.02mol/m3/hr、0.012mol/m3/hrとなるようにフィードしたときの影響を調べた。
結果を表1に示した。生産性はイオン強度上昇速度が0.03mol/m3/hr条件の生産性を100%としたときの相対値で示した。表1に示すとおり、イオン強度上昇速度が低下するにつれて生産性が向上することが確認できた。この結果から、培地中のイオン強度上昇速度は0.02mol/m3/hr、好ましくは0.012mol/m3/hr以下になるようにフィードすることにより、L-リジン生産性が向上することが明らかになった。
さらにイオン強度上昇速度が低下した場合の発酵成績への影響を調べるため、1価のカウンターイオンとなる塩化アンモニウム、及びグルタミン酸を窒素源として使用した。なお、グルタミン酸はアンモニア中和した溶液を用いた。
まず、実施例1と同様に、#403−11/pBGEA/pBDAS株をSEII寒天培地にて37℃で24時間培養した菌体を1枚のプレートからすべて掻き取り、本懸濁液全量を本培養培地300mlを注入した1L容ジャーファーメンターに植菌し、34℃、pH6.6にて培養を行った。培養中のpHは6.6となるようにアンモニアガスを添加することにより調整を行った。培地中のメタノールが0.2%以下となったときには100%メタノール溶液をフィードすることにより、流加培養を行った。
培地中に塩化アンモニウム、グルタミン酸の窒素源を添加する際、それぞれイオン強度上昇速度が0.008mol/m3/hr、0.006mol/m3/hrとなるようにフィードした。
まず、実施例1と同様に、#403−11/pBGEA/pBDAS株をSEII寒天培地にて37℃で24時間培養した菌体を1枚のプレートからすべて掻き取り、本懸濁液全量を本培養培地300mlを注入した1L容ジャーファーメンターに植菌し、34℃、pH6.6にて培養を行った。培養中のpHは6.6となるようにアンモニアガスを添加することにより調整を行った。培地中のメタノールが0.2%以下となったときには100%メタノール溶液をフィードすることにより、流加培養を行った。
培地中に塩化アンモニウム、グルタミン酸の窒素源を添加する際、それぞれイオン強度上昇速度が0.008mol/m3/hr、0.006mol/m3/hrとなるようにフィードした。
結果を表9に示した生産性は硫酸アンモニウム使用条件でイオン強度上昇速度が0.03mol/m3/hr条件の生産性を100%としたときの相対値で示した。実験の結果、イオン強度上昇速度を0.012mol/m3/hr以下にすると、更に生産性が向上することが確認された。
Claims (17)
- カルボン酸生産能を有するメタノール資化性細菌をメタノール及びカウンタイオンを含む液体培地で培養し、同培地中にカルボン酸を生成、蓄積させる発酵法によるカルボン酸の製造法で、メタノール及びカウンタイオンを含む物質を流加培養により培地中に流加させ、発酵培地内の総イオン強度を制御する方法。
- 培地中の総イオン強度の上昇速度が0.02mol/m3/hr以下になるようにイオン強度を制御する請求項1に記載の方法。
- 前記イオン強度メタノール資化性細菌の増殖期に制御する方法である請求項1または2に記載の方法。
- 前記カウンタイオンを含む物質が硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、グルタミン酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム、フマル酸アンモニウム、アスパラギン酸アンモニウム、尿素からなる群より選択される1種又は2種以上の物質である請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記カルボン酸がL-アミノ酸である請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記L-アミノ酸が、L-リジンである請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記メタノール資化性細菌が、アクロモバクター属、シュードモナス属、プロタミノバクター属、メタノモナス属、ミクロサイクラス属、メチロバチルス属、バチルス属、メチロフィラス属細菌からなる群より選択される微生物である請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記メタノール資化性細菌が、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群より選択される1種または2種以上の酵素活性が増強するように改変された細菌である請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記メタノール資化性細菌が、さらにL-リジンによるフィードバック阻害を受けないように改変されたジヒドロジピコリン酸合成酵素及び/又はアスパルトキナーゼをコードするDNAを保持する細菌である請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記メタノール資化性細菌が、さらにメタノール資化性細菌に導入したときにL-リジンの細胞外への排出を促進する変異型lysEタンパク質をコードするDNAを保持する細菌である請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- カルボン酸生産能を有するメタノール資化性細菌をメタノール及びカウンタイオンを含む液体培地で培養し、同培地中にカルボン酸を生成、蓄積させる発酵法によるカルボン酸の製造法で、一価イオンをカウンタイオンとして利用する方法。
- 前記カウンタイオンが、塩化アンモニウム、グルタミン酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム、フマル酸アンモニウム、アスパラギン酸アンモニウムからなる群より選択される1種又は2種以上の物質である請求項11に記載の方法。
- 前記カルボン酸がL-アミノ酸である請求項11または12に記載の方法。
- 前記L-アミノ酸が、L-リジンである請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記メタノール資化性細菌が、アクロモバクター属、シュードモナス属、プロタミノバクター属、メタノモナス属、ミクロサイクラス属、メチロバチルス属、バチルス属、メチロフィラス属細菌からなる群より選択される微生物である請求項11〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記メタノール資化性細菌が、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群より選択される1種または2種以上の酵素活性が増強するように改変された細菌である請求項11〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記メタノール資化性細菌が、さらにL-リジンによるフィードバック阻害を受けないように改変されたジヒドロジピコリン酸合成酵素及び/又はアスパルトキナーゼをコードするDNAを保持する細菌である請求項11〜16のいずれか一項に記載の方法。
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