JPH07121227B2

JPH07121227B2 - Ｌ−グルタミン酸の製造法

Info

Publication number: JPH07121227B2
Application number: JP24689586A
Authority: JP
Inventors: 瞭一勝亦; 治彦横井; 邦器木野
Original assignee: 協和醗酵工業株式会社
Priority date: 1986-10-17
Filing date: 1986-10-17
Publication date: 1995-12-25
Anticipated expiration: 2010-12-25
Also published as: JPS63102692A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は微生物のホスホフルクトキナーゼ（以下PFKと
略す）の合成に関与する遺伝情報を担うDNA断片とベク
ターDNAとの組換え体DNAをコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物に保有させ、該微
生物を培地に培養し、培養物中にＬ−グルタミン酸を生
成蓄積させ、該培養物からＬ−グルタミン酸を採取する
ことを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法に関する。
したがって、本発明はバイオインダストリーの産業分野
に関し、とくに食品工業において有用なＬ−グルタミン
酸の製造分野に関する。

従来の技術コリネバクテリウム属やブレビバクテリウム属などに属
する微生物を用いる発酵法によるＬ−グルタミン酸の製
造法については、該属菌種の野生株を用いる方法の他、
野生株から誘導されたオレイン酸などに対する栄養要求
性変異株（特公昭50−19632、特開昭57−102193）、リ
ゾチーム感受性変異株（特開昭54−122794）、温度感受
性変異株（特公昭58−32595）、フロロピルピン酸感受
性変異株（特公昭57−21313）、あるいは種々の物質に
耐性を有する変異株（特開昭50−89590、特開昭56−164
792、特開昭60−66990）などを用いる方法が知られてい
る。

一方、組換えDNA技法により育種された菌株を用いるＬ
−グルタミン酸の製造法も知られている。例えば、ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺
伝子を含む組換え体DNAを保有する菌株を用いてＬ−グ
ルタミン酸を発酵生産する方法（特開昭58−126789）な
どが知られている。

発明が解決しようとする問題点食品添加物などとして有用なＬ−グルタミン酸は大量の
需要があり、その製造法の改良は常に望まれている。

問題点を解決するための手段解糖系に係わる諸酵素のうち、フルクトース−６−リン
酸からフルクトース−1,6二リン酸への合成を触媒する
酵素であるPFKは、種々の細胞内因子により活性の調節
をうけるアロステリック酵素であり、解糖系全体の律速
酵素であると考えられている。

本発明者はこのPFKの増幅による効果を検討したとこ
ろ、微生物のPFKの合成に関与する遺伝子（以下PFK遺伝
子と称すこともある）を含む組換え体DNAをＬ−グルタ
ミン酸生産菌に導入すれば、より高収率でＬ−グルタミ
ン酸を製造できることを見出し本発明を完成するに至っ
た。

PFKの合成に関与する遺伝子を含む組換え体DNAがＬ−グ
ルタミン酸の生産性に寄与することは、本発明者により
初めて見出されたものである。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明によれば、微生物のPFKの合成に関与する遺伝情
報を担うDNA断片とベクターDNAとの組換え体DNAを保有
するコルネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
に属する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−グルタ
ミン酸を生成蓄積させ、該培養物からＬ−グルタミン酸
を採取することにより、より高収率でＬ−グルタミン酸
を製造することができる。

宿主微生物として用いるコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物としては、いわゆる
コリネ型グルタミン酸生産菌として知られる微生物は全
て用いることができるが、好適には下記の細菌が用いら
れる。

コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 31833 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC 1387
0 コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC 13868 コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990 ブレビバクテリウム・ディバリカツム ATCC 14020 ブレビバクテリウム・フラブム ATCC 14067 ブレビバクテリウム・イマリオフィラム ATCC 14068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC 1386
9 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC 19240 上記したようなコリネ型グルタミン酸生産菌の野生株の
ほか、オレイン酸などに対する要求性やリゾチーム感受
性、温度感受性、フロロピルビン酸感受性、さらには種
々の物質に対する耐性などが付与された菌株も用いるこ
とができる。

本発明におけるPFKの合成に関与する遺伝子の供給源と
なる微生物としては、PFK活性を有する微生物ならばい
かなる微生物でも使用できる。なかでも原核生物である
細菌、たとえばエシェリヒア属、コリネバクテリウム
属、ブレヒバクテリウム属またはバチルス属に属する菌
株が好ましい。具体的に好適な例としてはエシェルヒア
・コリ（大腸菌）があげられる。PFK遺伝子は、上記し
たような菌株の染色体DANより得ることができる。

該DNAを組み込むためのベクターとしては、コリネバク
テリウム属またはブレビバクテリウム属菌種中で自律複
製できるものであれば特に限定されないが、例えばpCG1
（特開昭57−134500）、pCG2（特開昭58−35197）、pCG
4,PCG11（いずれも特開昭57−183799）、pCE54,pCB101
（いずれも特開昭58−105999）、pCE51（特開昭60−341
97）、pCE52,pCE53〔いずれもモレキュラー・アンド・
ジェネラル・ジェネティクス（Mol・Gen.Genet.）196,1
75（1984）〕、およびそれらから誘導されたプラスミド
を使用することができる。

PFKをコードする遺伝子を含む供与体DNAとベクターDNA
との組換え体DNAは、試験管内で両DNAを制限酵素で切断
した後、DNAリガーゼで処理するか、またはその切断末
端をターミナルトランスフェラーゼーやDNAポリメラー
ゼなどで処理した後、DNAリガーゼを作用させて結合す
る常法〔メソッゾ・イン・エンチモロジィ（Methods in
Enzymology）68，（1979）〕により種々の組換え体混
成物とともに生成させることができる。この混成物を用
いて、PFKをコードする遺伝子の欠失したコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属の変異株を形質転
換し、欠損形質が相補された形質転換株を選択し、この
形質転換株の有するプラスミドを単離することによっ
て、PFKをコードする遺伝子を含む組換え体DNAを取得で
きる。コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属微生物の形質転換法としては、プロトプラストを用い
る方法（特開昭57−186492および特開昭57−186489）に
より実施することができる。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌株
で直接組換え体DNAを選択する代わりに、例えば大腸菌
のように既に遺伝子組換え技術が確立している宿主−ベ
クター系を用いることもできる。すなわち、供与体DNA
とベクターDNAの試験管内結合反応物を用い、マンニト
ール非資化性株として取得される大腸菌のPFK欠損変異
株を形質転換し、マンニトール資化性の回復した形質転
換株を選択する。この形質転換株からクローン化したDN
Aとコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
微生物のべクターDNAとを取り出し、これを試験管内で
制限酵素で切断した後、DNAリガーゼで再結合反応させ
る。この反応物を用いてPFKをコードする遺伝子の欠損
したコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
の変異株を形質転換し、欠損形質が相補された形質転換
株を選択する。この手段によっても同様に目的の組換え
体DNAを取得できる。

また、大腸菌とコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属菌種において複製可能なシャトルベクターを
用いれば、PFKが欠損した大腸菌の変異株を用いて、上
記のようにしてPFK遺伝子をクローン化することで直
接、目的の組換え体DNAを取得できる。

本発明で用いるPFKをコードする遺伝子の具体的に好適
な例としては、大腸菌K12株のPFK遺伝子（pfkA）があげ
られる。該遺伝子は、大腸菌K12株のジーンバンク〔セ
ル（Cell），９,91（1976）〕中のプラスミドpLC16−４
に含まれていることが知られている〔ジーン（Gene），
１,347（1977）〕が、さらに最近の詳細な解析の結果、
プラスミドpLC16−４中の8.5キロベース（以下kbと略
す）のPstIDNA断片上に大腸菌のベクタープラスミドCol
E1の複製開始点とともに存在していることが示されてる
〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジィ（J.Bacterio
l.），152,98（1982）〕。従ってこの8.5kbのPstIDNA断
片をコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属
菌種のベクター、例えばpCG11と結合させることによ
り、大腸菌K12株のPFK遺伝子を有し、大腸菌とコリネバ
クテリウム属およびブレビバクテリウム属菌種中で複製
可能な組換え体DNAを作製することができる（第１図参
照）。

PFK遺伝子を含む組換え体DNAを保有する形質転換株によ
るＬ−グルタミン酸の生産は、従来知られているように
培地中のビオチン含量を低く抑えて培養するか、ビチオ
ン含量の高い培地の場合にはペニシリンのような抗生物
質（特公昭37−1695）や界面活性剤（特公昭40−8798、
特公昭40−14559）などを加えて培養することにより行
なわれる。またオレチン酸要求性やグリセロール要求性
などの栄養要求性が付与された変異株を宿主とした形質
転換株では、これら要求物質の量を制限して培養するこ
とで（特公昭53−6233、特公昭53−28519）、温度感受
性変異株を宿主とした形質転換株では培養中途に培養温
度を高めることで（特公昭58−32595）Ｌ−グルタミン
酸の生産が行なわれる。

培地中の炭素源としてはグルコース、グリセロール、フ
ラクトース、シュークロース、マルトース、マンノー
ス、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの種々の炭水化
物、ポリアルコール、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、
酢酸などの各種有機酸が使用できる。さらに菌の資化性
によって、炭化水素、アルコール類なども用いうる。と
くに廃糖蜜は好適に用いられる。

窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは
尿素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、NZ−ア
ミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカ
ー・カゼイン加水分解物、フイッシュミールあるいはそ
の消化物、脱脂大豆粕あるいはその消化物、蛹加水分解
物などの窒素含有有機物など種々のものが使用可能であ
る。

さらに無機物としては、リン酸第一水素カリウム、リン
酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどが使用でき
る。微生物の生育に必要なビタミン、アミノ酸源など
は、前記したような他の培地成分に従って培地に供給さ
れれば特に加えなくてもよい。

培養は振盪培養あるいは通気撹拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は一般に20〜40℃が好適である。培
養中の培地のpHは中性付近に維持することが望ましい。
培養期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−グルタミン酸
が蓄積する。

培養終了後、菌体を除去して晶析、活性炭処理、イオン
交換樹脂処理などの公知の方法で培養液からＬ−グルタ
ミン酸を回収する本発明の有用性は、PFK遺伝子とコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属菌種のベクターDNAとを形
質発現できる形で組み換えた組換え体DNAをコリネバク
テリウム属またはブレビバクテリウム属菌種に導入すれ
ば、該菌種のＬ−グルタミン酸の生産性を強化できる点
にある。本明細書では大腸菌のPFK遺伝子を用いる例を
示したが、代わりに他第の微生物のPFK遺伝子を用いて
も目的が達成される。それゆえ、PFK遺伝子は本明細書
で例示した大腸菌のPFK遺伝子に限定されるものではな
い。またベクタープラスミドは、組換えとして連結され
たPFK遺伝子を安定に遺伝させるために、その自律複製
能を提供しているにすぎない、従って、本明細書に例示
したpCG11に限らず、コリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属菌種中で自律複製できるプラスミドは
すべて本願発明方法で使用される。

グルタミン酸高生産能を有するいわゆるコリネ型グルタ
ミン酸生産菌は、主な菌学的性質を同じくしているにも
かかわらず、産業上の重要性から、各研究者により、種
々の菌名が付されており、属名までも、コリネバクテリ
ウム属あるいはブレビバクテリウム属など種々である。
しかしながら、これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構成
やDNAの塩基組成が画一的であることから、同一の菌種
であることが指摘されていた。さらに、最近、これらの
菌種間には、70〜80％以上のDNAの相同性があることが
明らかにされ、非常に近縁な微生物であることが明白で
ある〔Komatsu,Y.:レポート・オブ・ザ・ファーメンテ
イティブ・リサーチ・インスティチュート（Report of
the Fermentative Reseach Institute）,No.55,1（198
0）およびSuzuki,K.,Kaneko,T.and Komagata,K.:インタ
ーナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・
バクテリオロジィ（Int.J.Syst.Bacteriol.），31,131
（1981）参照〕。

本明細書では、コリネバクテリウム・グルタミクムATCC
31833、コリネバクテリウム・ハーキュリスATCC 13868
およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC
13869にPFK遺伝子を含む組換え体DNAを導入し、その遺
伝子の形質発現に基づくＬ−グルタミン酸生産性の向上
について例示したが、上記の事実を踏まえればコリネ型
グルタミン酸生産菌全般での効果が容易に類推される。
その効果の有無は組換え体DNAがコリネ型グルタミン酸
生産菌全般で自律的に複製し、PFK遺伝子が形質発現で
きるか否かに係わり、コリネ型グルタミン酸生産菌間の
DNA相同性などにおける若干の相違は何ら関係ない。

しかるに、これらの菌種がプラスミドの複製と遺伝子発
現に係わる機能を等しく保持していることは、特開昭57
−183799に開示されたコリネバクテリウム・グルタミク
ム225−250株から分離され、スペクチノマイシンおよび
／またはストレプトマイシン耐性遺伝子を有するプラス
ミドpCG4がコリネバクテリウム属およびブレビバクテリ
ウム属菌種などのコリネ型グルタミン酸生産菌内で同じ
く複製でき、またその耐性遺伝子が発現される（特開昭
57−186492）ことから明らかである。従って、本発明の
PFK遺伝子を含む組換え体DNAを導入することによるＬ−
グルタミン酸生産菌の作製法を適用し得る菌種は、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムATCC 31833、コリネバク
テリウム・ハーキュリスATCC13868およびブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムATCC 13869に限らずコリ
ネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属を含むコ
リネ型グルタミン酸生産菌全てが含まれる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例（１） pLC16−４とpCG11の試験管内組換え pLC16−４は大腸菌K12株のジーンバンク〔セル（Cel
l），９,91（1976）〕から得られ、その中の8.5kbのPst
IDNA断片上に大腸菌のベクタープラスミドColE1の複製
開始点とともに大腸菌K12株のPFK遺伝子（pfkA）が含ま
れている〔ジャーナル・オブ・バクテリトロジィ（J.Ba
cterol.），152,98,（1982）〕ことが知られているプラ
スミドである。pCG11は特開昭57−183799に開示された
コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属のベ
クタープラスミドで、ストレプトマイシンおよびスペク
チノマイシン耐性遺伝子を有する。pLC16−４は、それ
を保有する大腸菌K12株亜株の培養菌体からアンらの方
法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジィ（J.Bacterio
l.），140,400（1979）〕に従い単離した。pCG11は、そ
れを保有するコリネバクテリウム・グルタミクムLA103/
pCG11（ATCC 39022）の培養菌体から濃縮単離した。即
ち該菌株を400mlのNB培地（粉末ブイヨン20g、酵母エキ
ス5gを水１に含みpH7.2に調整した培地）で660nmにお
ける吸光度（0D）（以下、特記しない限り吸光度は660n
mで測定）が約0.8になるまで生育させた。培養液から菌
体を集菌し、TES緩衝液〔トリス（ヒドロキシルメチ
ル）アミノメタン（以下トリスと略す）0.03M、エチレ
ンジアミン四酢酸二ナトリウム（以下EDTAと略す）0.00
5 M、MaCl0.05M、pH8.0〕で洗浄後、リゾチーム溶液（2
5％ショ糖、0.1M NaCl、0.05Mトリス、0.8mg/mlリゾチ
ーム;pH8.0）10mlに懸濁し、37℃で４時間反応させた。
反応液に5M NaCl2.4ml、0.5M EDTA（pH8.0）0.6ml、お
よび４％ラウリル硫酸ナトリウムと0.7M MaClからなる
溶液4.4mlを順次添加し、緩やかに混和してから氷水中
に15時間置いた。溶解物全量を遠心管に移し、４℃で60
分間、69,400×ｇの遠心分離にかけ上澄液を回収した。
これに重量百分率10％相当のポリエチレングリコール
（PEG）6,000（半井化学薬品社製）を加え、静かに混和
して溶解後、氷水中に置いた。10時間後、1,500×ｇで1
0分間遠心分離してペレットを回収した。TES緩衝液5ml
を加えてペレットを静かに再溶解してから1.5mg/mlエチ
ジウムブロマイド2.0mlを添加し、これに塩化セシウム
を加えて静かに溶解し、密度を1,580に合わせた。この
溶液を18℃で105,000×ｇ、48時間超遠心分離にかけ
た。この密度勾配遠心により共有結合で閉じられた環状
のDNAは、紫外線照射することによって遠心チューブ中
下方の密度の高いバンドとして見出された。このバンド
を注射器で遠心チューブの側面から抜きとることによっ
てプラスミドpCG11が分離された。ついで分離液を等容
量のイソプロピルアルコール液〔容量百分率90％イソプ
ロピルアルコール、10％TES緩衝液（この混和中に飽和
溶解量の塩化セシウムを含む）〕で５回処理してエチジ
ウムブロマイドを抽出除去し、しかる後にTES緩衝液に
対して透析した。こうしてpCG11プラスミドDNAを得た。

pLC16−４プラスミドDNA1μｇを含む制限酵素PstI用反
応緩衝液〔20mMトリス、10mM MgCl₂、50mM（NH₄）₂S
O₄、0.01％ウシ血清アルブミン、pH7.5〕μに５単位
のPstI（宝酒造社製、５単位／μ）を添加し、37℃で
２時間消化反応させた。pCG11プラスミドDNA1μｇにつ
いても同様にしてPstIによる消化反応を行った。両消化
物を65℃で40分間化温した後混合し、T4リガーゼ緩衝液
（660mMトリス、66mM MgCl₂、100mMジチオスレイトー
ル、pH7.6）11μ、100mM ATP1μ、 T4リガーゼ（宝酒造社製:350単位／μ）100単位を加
え、12℃で24時間反応させた。得られたリガーゼ反応混
合物を形質転換に供した。

（２）pEpfk−１の取得形質転換は異種微生物より調製されたDNA断片の結合操
作を頻度よく行うことができるように、宿主特異的制限
欠損変異（hsd R）を有する大腸菌K12株亜株WA802（メ
チオニン要求性;FERM BP−718）を用いて行った。WA802
株のコンピテント・セルはダジェルトらの方法〔ジーン
（Gene），６,23（1979）〕で調製した。

即ち、Ｌ培地（バクトトリプトン10g、酵母エキス5g、
グルコース1gおよびNaCl5gを水１に含み、pH7.2に調
整した培地）50mlにWA802株を植菌し、ODが0.5になるま
で37℃で培養した。培養液を氷水中で10分間冷却してか
ら遠心した。冷却した0.1M CaCl₂20mlに菌体を再懸濁
し、０℃に20分間置いた。菌体を再遠心し、0.1M CaCl₂
0.5mlに懸濁し、０℃で18時間置いた。CaCl₂処理した菌
液150μに前記（１）で得られたリガーゼ反応混合物5
0μを添加混合し、０℃に10分間置いてから37℃で５
分間加温した。次いでＬ培地2mlを添加し、37℃で２時
間振盪培養した。

生理食塩水で２回遠心洗浄後スペクチマイシン100μg/m
lを含むＬ寒天培地（Ｌ培地１に寒天16gを含む培地）
に塗布し、37℃で２日間培養した。出現した形質転換株
のうちの１株から、前記のpLC16−４を単離したのと同
様の方法によりプラスミドDNAを単離した。該プラスミ
ドDNAを用いてPFKが欠損した大腸菌K12株亜株DF456〔メ
チオニン、アルギニン要求性およびマンニトール非資化
性（PFK欠損変異）；ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジィ（J.Bacteriol.），137,502（1979）〕を前記と同
様に形質転換し、スペクチノマイシン耐性株を選択し
た。それらは全てマンニトール資化性を獲得しており、
該プラスミドにPFK遺伝子が含まれていることが示され
た。また該プラスミドDNAを制限酵素消化とアガロース
ゲル電気泳動で解析した結果、第１図に示すように、PF
K遺伝子と大腸菌のベクタープラスミドColE1の複製開始
点とを含むpLC16−４中の8.5kbのPstIDNA断片〔ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジィ（J.Bacteriol.）152,98
（1982）〕がpCG11のPstI切断部位に挿入された構造を
有していた。このプラスミドをpEpfk−１と命名した。

（３） pEpfk−１による形質転換コリネバクテリウム・グルタミクムATCC 31833、コリネ
バクテリウム・ハーキュリスATCC13868およびブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869のプロト
プラストを形質転換してpEpfk−１を導入した。コリネ
バクテリウム・グルタミクムATCC31833、コリネバクテ
リウム・ハーキュリスATCC13868、およびブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムATCC13869をそれぞれNB
培地にて30℃で16時間振盪培養し、その異培養0.1mlを1
0mlのSSM培地〔グルコース10g、NH₄Cl4g、尿素2g、酵母
エキス1g、KH₂PO₄1g、K₂HPO₄3g、MgCl₂・6H₂O0.4g、FeS
O₄・7H₂O10mg、MnSO₄・４〜6H₂O0.2mg、ZnSO₄・7H₂O0.9
mg、CuSO₄・5H₂O0.4mg、Na₂B₄O₇・10H₂O0.09mg、（N
H₄）₆Mo₇O₂₄・4H₂O0.04mg、ビオチン30μｇ、サイアミ
ン塩酸塩1mgを純水１に含みpH7.2に調整した培地〕の
入ったＬ字型試験管に接種し、モノー型培養槽にて30℃
で振盪培養した。ODが0.15になった時点で0.5単位/mlに
なるようにペニシリンＧを添加した。さらに培養を続
け、ODが約0.6になったところで細胞を集菌し、PCGP培
地〔グルコース5g、カザミノ酸5g、酵母エキス2.5g、K₂
HPO₄3.5g、KH₂PO₄1.5g、MgCl₂・6H₂O0.41g、FeSO₄・7H₂
O10mg、MnSO₄・４〜6H₂O2mg、ZnSO₄・7H₂O0.9mg、（N
H₄）₆Mo₇O₂₄・4H₂O0.04mg、ビオチン30μｇ、サイアミ
ン塩酸塩2mg、コハク酸二ナトリウム135g、ポリビニル
ピロリドン（分子量10,000）30gを水１に含む培地〕
に1mg/mlのリゾチームを含む液（pH7.6）2mlに懸濁し、
Ｌ型試験管に移して30℃で５時間緩やかに振盪反応して
プロトプラスト化した。このプロトプラスト菌液0.5ml
を小試験管にとり、2,500×ｇで５分間遠心分離し、TSM
C緩衝液〔10mM MgCl₂、30ml CaCl₂、50mMトリス、400mM
ショ糖、pH7.5〕1mlに懸濁して遠心洗浄後、TSMC緩衝液
0.1mlに再懸濁した。この菌液に２倍濃度のTSMC緩衝液
とpEpfk−１プラスミドDNA溶液との１対１混合液100μ
を加えて混和し、次いでTSMC緩衝液中に20％PEG6,000
を含む液1.0mlを添加して混合した。３分後2.500×ｇで
５分間遠心分離にかけて上澄液を除去し、沈降したプロ
トプラストを1mlのRCGP培地（pH7.4）に懸濁してから30
℃で２時間緩やかに振盪した。ついでこのプロトプラス
ト懸濁液の0.3mlをスペクチノマイシン400μg/mlを含む
RCGP寒天培地（RCGP培地に1.6％寒天を含む培地、pH.7.
4）に塗布し、30℃で10日間培養した。

出現したスペクチノマイシン耐性形質転換株を400mlのS
SM培地で振盪培養し、ODが0.15になったところで0.5単
位/mlとなるようにペニシリンＧを添加し、さらにODが
0.65になるまで培養し、集菌した菌体から前記（１）の
pCG11の単離法と同様な方法でプラスミドを単離した。
これらのプラスミドを制限酵素消化とアガロースゲル電
気泳動で解析した結果、各種制限酵素切断様式で特徴付
けられるpEpfk−１と同一の構造を有するものであるこ
とがわかった。

このような形質転換株がコリネバクテリウム・グルタミ
クムATCC 31833/pEpfk−１、コリネバクテリウム・ハー
キュリスATCC13868/pEpfk−１およびブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムATCC13869/pEpfk−１であ
る。このうち、コリネバクテリウム・グルタミクムATCC
31833/pEpfk−１は、コリネバクテリウム・グルタミク
ムK69（FERM BP−1160）として昭和61年８月29日付で工
業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に寄託されて
いる。

（４）Ｌ−グルタミン酸生産試験 pEpfk−１による形質転換株のＬ−グルタミン酸生産試
験を行った。

（ａ）種培地は、グルコース４％、ポリペプトン２
％、KH₂PO₄0.15％、K₂HPO₄0.05％、MgSO₄・7H₂O0.05
％、ビオチン10μg/、尿素0.3％、pH7.2の組成で120
℃、10分間殺菌したものを用いる。この種培地にて
（３）で得られた形質転換株をそれぞれ30℃、24時間振
盪培養した。種培養4mlをそれぞれ300ml容三角フラスコ
中の生産培地（〔グルコース６％、（NH₄）₂SO₄0.2％、
KH₂PO₄0.1％、K₂HPO₄0.05％、MgSO₄・7H₂O0.05％、FeSO
₄・7H₂O2mg/、CuSO₄・5H₂O1mg/、MnSO₄・4H₂O10mg/
、サイアミン塩酸塩1mg/、尿素0.5％、フェノール
レッド10mg/、（pH6.5,120℃,20分殺菌）〕20mlに植
菌して30℃で培養を行った。培養中、培養液をpH6.0〜
8.0に保つため、12時間目と20時間目の２回、10％尿素
液を1mlずつ添加して30時間振盪培養した。

培養後、培養液をペーパークロマトグラフィーにか
け、ニンヒドリン発色後、比色定着してＬグルタミン酸
の生産量を測定した。培養液中に蓄積したＬ−グルタミ
ン酸生成量を第１表に示す。

（ｂ）発酵培地のグルコースの代わりに廃糖蜜（グル
コース換算）６％を用い、培養開始時にペニシリンＧ
５単位/mlを添加する以外は前記（ａ）と同様に培養を
行い、Ｌ−グルタミン酸生成量を測定した。培養液中に
蓄積したＬ−グルタミン酸生成量を第２表に示した。

発明の効果本発明によれば、微生物のPFKの合成に関与する遺伝子
を含む組換え体プラスミドDNAを保有させることによ
り、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
に属する微生物のＬ−グルタミン酸生産能を向上させる
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はpEpfk−１の制限酵素PstIによる切断地図と作
製工程を示す。プラスミドの大きさはキロベース（kb）で表示されてい
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:13）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】微生物のホスホフルクトキナーゼの合成に
関与する遺伝情報を担うDNA断片とベクターDNAとの組換
え体DNAを保有するコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属に属する微生物を培地に培養し、培養物
中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、該培養物からＬ
−グルタミン酸を採取することを特徴とするＬ−グルタ
ミン酸の製造方法。
【請求項２】該DNA断片がエシェリヒア属、コリネバク
テリウム属、ブレビバクテリウム属またはバチルス属に
属する微生物に由来することを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の方法。
【請求項３】該ベクターがコリネバクテリウムまたはブ
レビバクテリウム属細菌中で自律複製できるものから選
ばれる特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項４】組換え体DNAを保有する微生物がコリネバ
クテリウム・グルタミクムK69（FERM BP−1160）であ
る特許請求の範囲第１項記載の方法。