JPS63102692A - Ｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は微生物のホスホフルクトキナーゼ（以下ＰＦＫ
と略す）の合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片と
ベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡをコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物に保有
させ、該微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−グルタ
ミン酸を生成蓄積させ、該培養物からＬ−グルタミン酸
を採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法
に関する。したがって、本発明はバイオインダストリー
の産業分野に関し、とくに食品工業において有用なＬ−
グルタミン酸の製造分野に関する。

従来の技術 ］リネバクテリウム属やブレビバクテリウム属などに属
する微生物を用いる発酵法によるＬ−グルタミン酸の製
造法については、該属菌様の野生株を用いる方法の他、
野生株から誘導されたオレイン酸などに対する栄養要求
性変異株（特公昭５０−１９６３２、特開昭５７−１０
２１９３）、リゾチーム感受性変異株（特開昭５４−１
２２７９４）、温度感受性変異株（特公昭５８−３２５
９５）　、フロロピルビン酸感受性変異株（特公昭５７
−２１３１３）　、あるいは種々の物質に耐性を有する
変異株（特開昭５０−８９５９０．特開昭５６−１６４
７９２、特開昭６Ｏ−６６９９０）などを用いる方法が
知られている。

一方、組換えＤＮＡ技法により育種された菌株を用いる
Ｌ−グルタミン酸の製造法も知られている。例えば、ホ
スホエノールピルビン酸カルボキ／ラーゼをコードする
遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを保有する菌株を用いてＬ
−グルタミン酸を発酵生産する方法（特開昭５８−１２
６７８９）などが知られている。

発明が解決しようとする問題点 食品添加物などとして有用なＬ−グルタミン酸は大量の
需要があり、その製造法の改良は常に望まれている。

問題点を解決するための手段 解糖系に係わる諸酵素のうち、フルクトース−６−リン
酸からフルクトース−１，６−二リン酸への合成を触媒
する酵素であるＰＦＫは、種々の細胞内因子により活性
の調節をうけるアロステリック酵素であり、解糖系全体
の律速酵素であると考えられている。

本発明者はこのＰＦＫの増幅による効果を検討したとこ
ろ、微生物のＰＦＫの合成に関与する遺伝子（以下ＰＦ
Ｋ遺伝子と称すこともある）を含む組換え体ＤＮＡをＬ
−グルタミン酸生産菌に導入すれば、より高収率でＬ−
グルタミン酸を製造できることを見出し本発明を完成す
るに至った。

ＰＦＫの合成に関与する遺伝子を含む組換え体ＤＮＡが
Ｌ−グルタミン酸の生産性に寄与することは、本発明者
により初めて見出されたものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明によれば、微生物のＰＦＫの合成に関与する遺伝
情報を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体Ｄ
ＮＡを保有するコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属する微生物を培地に培養し、培養物中に
Ｌ−グルタミン酸を生成蓄積させ、該培養物からＬ−グ
ルタミン酸を採取することにより、より高収率でＬ−グ
ルタミン酸を製造することができる。

宿主微生物として用いるコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物としては、いわゆる
コリネ型グルタミン酸生産菌として知られる微生物は全
て用いることができるが、好適には下記の菌株が用いら
れる。

コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ３１８３３ コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ１
３８７０ コリネバクテリウム・ハーキユリス 、ＡＴＣＣ１３８６８ コリネバクテリウム・リリウムＡＴＣＣ１５９９０ブレ
ビバクテリウム・ディバリカラム ＡＴＣＣ１４０２０ ブレビバクテリウム・フラブムＡＴ［：Ｃ１４０６７ブ
レビバクテリウム・イマリオフィラムＡＴＣＣ１４０６
８ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム＾ＴＣＣ１
３８６９ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０ 上記したようなコリネ型グルタミン酸生産菌の野生株の
ほか、オレイン酸などに対する要求性やリゾチーム感受
性、温度感受性、フロロピルビン酸感受性、さらには種
々の物質に対する耐性などが付与された菌株も用いるこ
とができる。

本発明におけるＰＦＫの合成に関与する遺伝子の供給源
となる微生物としては、ＰＦＫ活性を有する微生物なら
ばいかなる微生物でも使用できる。

なかでも原核生物である細菌、たとえばエシェリヒア萬
、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属または
バチルス属に属する菌株が好ましい。

具体的に好適な例としてはエシェリヒア・コリ（大腸菌
）があげられる。ＰＦＫ遺伝子は、上記したような菌株
の染色体ＤＮＡより得ることができる。

該ＤＮＡを組み込むためのベクターとしては、コリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種中で自律
複製できるものであれば特に限定されないが、例えばｐ
ｃＧｌ　（特開昭５７−１３４５００）、ｐＣＧ２　（
特開昭５８−３５１９７）　、ｐＣＧ４．　ｐｃＧｌｌ
　　（いずれも特開昭５７−１８３７９９）、ｐＣＥ５
４．　ｐｃＢｌｏｌ　　（いずれも特開昭５８−１０５
９９９）、ｐｃＥ５１　　（特開昭６Ｏ−３４１９７）
、ｐＣε５２．　ｐＣＥ５３　（いずれもモレキユラー
・アンド・ジェネラル・ジェーネティクス（Ｍｏ１．Ｇ
ｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、）１９６、１７５（１９８４））
　、およびそれらから誘導されたプラスミドを使用する
ことができる。

ＰＦＫをコードする遺伝子を含む供与体ＤＮＡとベクタ
ーＤＮＡとの組換え体ＤＮＡは、試験管内で両ＤＮＡを
制限酵素で切断した後、ＤＮＡＩＪガーゼで処理するか
、またはその切断末端をターミナルトランスフェラーゼ
やＤＮＡポリメラーゼなどで処理した後、Ｄ　Ｎ　Ａ　
Ｕガーゼを作用させて結合する常法〔メソッヅ・イン・
エンチモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ）　６８．　　（１９７９））により種々の組
換え体混成物とともに生成させることができる。この混
成物を用いて、ＰＦＫをコードする遺伝子の欠失したコ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の変異
株を形質転換し、欠損形質が相補された形質転換株を選
択し、この形質転換株の有するプラスミドを単離するこ
とによって、ＰＦＫをコードする遺伝子を含む組換え体
ＤＮＡを取得できる。コリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属微生物の形質転換法としては、プロト
プラストを用いる方法（特開昭５７−１８６４９２およ
び特開昭５７−１８６４８９）により実施することがで
きる。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌株
で直接組換え体ＤＮＡを選択する代わりに、例えば大腸
菌のように既に遺伝子組換え技術が確立している宿主−
ベクター系を用いることもできる。すなわち、供与体Ｄ
ＮＡとベクターＤＮＡの試験管内結合反応物を用い、マ
ンニトール非資化性株として取得される大腸菌のＰＦＫ
欠損変異株を形質転換し、マンニトール資化性の回復し
た形質転換株を選択する。この形質転換株からクローン
化したＤＮＡとコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属微生物のベクターＤＮＡとを取り出し、これ
を試験管内で制限酵素で切断した後、ＤＮＡＩＪガーゼ
で再結合反応させる。この反応物を用いてＰＦＫをコー
ドする遺伝子の欠損したコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属の変異株を形質転換し、欠損形質が
相補された形質転換株を選択する。この手段によっても
同様に目的の組換え体ＤＮＡを取得できる。

また、大腸菌とコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属菌種において複製可俺なシャトルベクターを
用いれば、ＰＦＫが欠損した大腸菌の変異株を用いて、
上記のようにしてＰＦＫ遺伝子をクローン化することで
直接、目的の組換え体ＤＮＡを取得できる。

本発明で用いるＰＦＫをコードする遺伝子の具体的に好
適な例としては、大腸菌Ｋ１２株のＰＦＫ遺伝子（ｐｆ
ｋＡ）があげられる。該遺伝子は、大腸菌に１２株のシ
ーンバンク〔セル（Ｃｅｌｌ）、　　９　、　ｇｌ（１
９７６）　：］中のプラスミドｐＬｃ１６−４に含まれ
ていることが知られている〔ジーン（Ｇｅｎｅ）　、　
　１　、３４７（１９７７）　］が、さらに最近の詳細
な解析の結果、プラスミド匹Ｃ１６−４中の８．５キロ
ベース（以下ｋｂと略す）のＰｓｔｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片
上に大腸菌のベクタープラスミドＣｏ１１Ｅ１の複製開
始点とともに存在していることが示されている〔ジャー
ナル・オブ・バタテリオロジ４　（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、　）、　１５ム９８（１９８２＞　：ｌ。

従ってこの８．５ｋｂのＰｓｔｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片をコ
リネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属菌種の
ベクター、例えばｐｃＧｌｌ　と結合させることにより
、大腸菌に１２株のＰＦＫ遺伝子を有し、大腸菌とコリ
ネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属菌種中で
複製可能な組換え体ＤＮＡを作製することができる（第
１図参照）。

ＰＦＫ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを保有する形質転換
株によるＬ−グルタミン酸の生産は、従来知られている
ように培地中のビオチン含量を低く抑えて培養するか、
ビオチン含量の高い培地の場合にはペニンリンのような
抗生物質（特公昭３７−１６９５）や界面活性剤（特公
昭４０−８７９８　、特公昭４Ｏ−１４５５９）などを
加えて培養することにより行なわれる。またオレイン酸
要求性やグリセロール要求性などの栄昼要求性が付与さ
れた変異株を宿主とした形質転換株では、これら要求物
質の量を制限して培養することで（特公昭５３−６２３
３　、特公昭５３−２８５１９）　、温度感受性変異株
を宿主とした形質転換株では培養中途に培養温度を高め
ることで（特公昭５８−３２５９５）　　Ｌ−グルタミ
ン酸の生産が行なわれる。

培地中の炭素源としてはグルコース、グリセロール、フ
ラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース
、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの種々の炭水化物、
ポリアルコール、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸
などの各種有機酸が使用できる。さらに菌の資化性によ
って、炭化水素、アルコール類なども用いつる。とくに
廃糖蜜は好適に用いられる。

窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ムなどの各種無機および有機アンモニウム塩頌あるいは
尿素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、ＮＺ−
アミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リ
カー、カゼイン加水分解物、フィッンユミールあるいは
その消化物、脱脂大豆粕あるいはその消化物、蛸加水分
解物などの窒素含有有機物など種々のものが使用可能で
ある。

さらに無機物としては、リン酸第−水素カリウム、リン
酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄
、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどが使用できる
。微生物の生育に必要なビタミン、アミノ酸源などは、
前記したような他の培地成分に従って培地に供給されれ
ば特に加えなくてもよい。

培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である
。培養中の培地のｐＨは中性付近に維持することが望ま
しい。培養期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−グルタ
ミン酸が蓄積する。

培養終了後、菌体を除去して晶析、活性炭処理、イオン
交換樹脂処理などの公知の方法で培養液からＬ−グルタ
ミン酸を回収する。

本発胡の有用性は、ＰＦＫ遺伝子とコリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属菌種のベクターＤＮＡと
を形質発現できる形で組み換えた組換え体ＤＮＡをコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種に導
入すれば、該菌種のＬ−グルタミン酸の生産能を強化で
きる点にある。

本明細書では大腸菌のＰＦＫ遺伝子を用いる例を示した
が、代わりに他の微生物のＰＦＫ遺伝子を用いても目的
が達成される。それゆえ、ＰＦＫ遺伝子は本明細書で例
示した大腸菌のＰＦＫ遺伝子に限定されるものではない
。またベクタープラスミドは、組換え体として連結され
たＰＦＫ遺伝子を安定に遺伝させるために、その自律複
製能を提供しているにすぎない、従って、本明細書に例
示したｐｃＧｌｌ　に限らず、コリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属菌種中で自律複製できるプラ
スミドはすべて本願発明方法で使用される。

グルタミン酸高生産能を有するいわゆるコリ木型グルタ
ミン酸生産菌は、主な菌学的性質を同じくしているにも
かかわらず、産業上の重要性から、各研究者により、種
々の菌名が付されており、属名までも、コリネバクテリ
ウム属あるいはブレビバクテリウム属など種々である。

しか“しながら、これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構
成やＤＮＡの塩基組成が画一的であることから、同一の
菌種であることが指摘されていた。さらに、最近、これ
らの菌種間には、７０〜８０％以上のＩ）ＮＡの相同性
があることが明らかにされ、非常に近縁なｉ数生物であ
ることが明白である（Ｋｏｍａｔｓｕ、　Ｙ、ニレポー
ト・オブ・ザ・ファーメンテイティブ・リサーチ・イン
スティチュート（Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅＦｅｒｍ
ｅｎｔａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕ
ｔｅ）、　Ｎｏ、　５５．１（１９８０）および５ｕｚ
ｕｋｉ、に、、　Ｋａｎｅｋｏ、τ、ａｎｄにｏｍａｇ
ａｔａ。

Ｋ、；　インターナンヨナル・ジャーナル・オブ・シス
テマティソク・バクテリオロジイ（Ｉｎｔ、　Ｊ、　５
ｙｓｔ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、　３１．１３１　（１９８１
）参照〕。

本明細書では、コリネバクテリウム・グルタミクム八Ｔ
ＣＣ３１８３３、コリネバクテリウム・ハーキュリスＡ
ＴＣＣ１３８６８およびブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタムＡＴＣＣ１３８６９にＰＦＫ遺伝子を含む
組換え体ＤＮＡを導入し、その遺伝子の形質発現に基づ
くＬ−グルタミン酸生産性の向上について例示したが、
上記の事実を踏まえればコリネ型グルタミン酸生産菌全
般での効果が容易に類推される。その効果の有無は組換
え体ＤＮＡがコリネ型グルタミン酸生産菌全般で自律的
に複製し、ＰＦＫ遺伝子が形質発現できるか否かに係わ
り、コリネ型グルタミン酸生産菌間のＤＮＡ相同性など
における若干の相違は何ら関係ないっ しかるに、これらの菌種がプラスミドの複製と遺伝子発
現に係わる機能を等しく保持していることは、特開昭５
７−１８３７９９　に開示されたコリ不ノｈクテリウム
・グルタミクム２２５−２５０株から分離され、スベク
チノマイシンおよび／またはストレブトマインン耐性遺
伝子を有するプラスミドｐＣＧ４がコリ茅バクテリウム
属およびブレビバクテリウム属菌種などのコリネ型グル
タミン酸生産菌内で同じく複製でき、またその耐性遺伝
子が発現される（特開昭５７−１８６４９２）ことから
明らかである。従って、本発明のＰＦＫ遺伝子を含む組
換え体ＤＮＡを導入することによるＬ−グルタミン酸生
産閑の作製法を適用し得る菌種は、コリネバクテリウム
・グルタミクム八ＴＣＣ３１Ｂ：３３、コリネバクテリ
ウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６８およびブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタム＾ＴＣＣ１３８６９
に限らずコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウ
ム属を含むコリネ型グルタミン酸生産菌全てが含まれる
。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例 （１）　　ｐＬｃ１６−４とｐｃＧｌｌの試験管内組換
えｐＬｃ１６−４は大腸菌に１２株のシーンバンク〔セ
ル（Ｃｅｌｌ）、　　９．９Ｈ１９７６）〕から得られ
、その中の８．５ｋｂのＰｓｔｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片上に
大腸菌のベクタープラスミドＣｏｌ［ｉｌの複製開始点
とともに大腸菌に１２株のＰＦＫ遺伝子（ｐｆｋＡ）が
含まれている〔ジャーナル・オブ・バタテリオロジイ（
Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）。

１５２、９８（１９８２））ことが知られているプラス
ミドである。ｐＣＧＩＩは特開昭５７−１８３７９９に
開示されたコリネバクテリウム属およびブレビバクテリ
ウム属のベクタープラスミドで、ストレプトマイシンお
よびスペクチノマイシン耐性遺伝子を有する。

ｐＬｃ１６−４は、それを保有する大腸菌に１２株亜株
の培養菌体からアンらの方法〔ジャーナル・オブ・バタ
テリオロジイ（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、　１４
０．４００（１９７９）　’ｌに従い単離した。ｐｃＧ
ｌｌは、それを保有するコリネバクテリウム・グルタミ
クムＬＡ１０３／ｐｃＧ１１（ＡＴＣＣ３９０２２）の
培養菌体から濃縮単離した。

即ち該菌株を４００ｍ１のＮＢ培地（粉末ブイヨン２０
ｇ、酵母エキス５ｇを水１１に含みｐＨ７，２に調整し
た培地）で６６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）〈以下、
特記しない限り吸光度は６６０１ｍで測定）が約０．８
になるまで生育させた。培養液から菌体を集菌し、ＴＥ
Ｓ緩衝液〔トリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン
（以下トリスと略す）０．０３Ｍ、エチレンジアミン四
酢酸二ナトリウム（以下ＥＤＴＡと略す）　０．００５
　Ｍ、　　ＮａＣｊ！０．０５Ｍ、　ｐＨ８，０：１で
洗浄後、リゾチーム溶液（２５％ショ糖、０．ＩＭ　　
ＮａＣｆ、０．０５　Ｍ　）リス、０．８ｍｇ／ｍｌリ
ゾチ”　；ｐ）１３．Ｑ　）　１０　ｍｆｌに懸濁し、
３７℃で４時間反応させた。反応液に５　Ｍ　ＮａＣｆ
　２．４　ｍｆｌ、０．５Ｍ　　ＥＤＴ＾（ｐＨ８，０
＞　０．６　ｍｌ、および４％ラウリル硫酸ナトリウム
と０．７　Ｍ　ＮａＣｆからなる溶液４．４ｍｌを順次
添加し、緩やかに混和してから氷水中に１５時間装いた
。溶解物全量を遠心管に移し、４℃で６０分間、６９．
４００　Ｘ　ｇの遠心分離にかけ上澄液を回収した。こ
れに重量百分率１０％相当のポリエチレングリコール（
Ｐ　Ｅ　Ｇ　）　６．０００　　（半井化学薬品社製）
を加え、−静かに混和して溶解後、氷水中に誼いた。１
０時間後、１．５００ｘｇで１０分間遠心分離してペレ
ットを回収した。ＴＢＳ緩衝緩衝液５壱ｌえてペレット
を静かに再溶解してから１．５！ｎｇ／ｍｌエチジウム
ブロマイド２．Ｑｍｌを添加し、これに塩化セシウムを
加えて静かに溶解し、密度を１．５８０に合わせた。こ
の溶液を１８℃で１０５．０００ｘｇ、４８時間超遠心
分離にかけた。この密度勾配遠心により共有結合で閉じ
られた環状のＤＮＡは、紫外線照射することによって遠
心チューブ中下方の密度の高いバンドとして見出された
。このバンドを注射器で遠心チューブの側面から抜きと
ることによってプラスミドｐｃＧ１１が分離された。

ついで分離液を等容量のイソプロピルアルコール液〔容
量百分率９０％イソプロピルアルコール、１０％ＴＥＳ
緩衡液（この混液中に飽和溶解量の塩化セシウムを含む
）〕で５回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し
、しかる後にＴＢＳ緩衝液に対して透析した。こうして
ｐｃＧ１１プラスミドＤＮＡを得た。

ｐＬｃ１６−４プラスミドＤＮＡＩμｇを含む制限酵素
Ｐｓｔｌ用反応緩衝液Ｃ２０ｍＭ）リス、ｌＱｍＭＭｇ
Ｃｊｈ　、５０ｍＭ　（ＮＨ，）、ＳＯ，，０，０１％
ウシ血清アルブミン、ｐＨ７，５）５０μｆに５ＨＬ位
のＰｓｔｌ（宝酒造社製、５単位／μｍ）を添加し、３
７℃で２時間消化反応させた。ｐｃＧ１１プラスミドＤ
ＮＡ１μｇについても同様にしてＰｓｔｌによる消化反
応を行った。両消化物を６５℃で４０分間加温した後混
合し、Ｔ４リガーゼ緩衝液（６６０＋ｒ＋Ｍ）リス、６
６ｍＭ　ＭｇＣｌ！２．１０　ＱｍＭジチオスレイトー
ル、ｐＨ７，６）　１１μＬ　１００ｍＭ　　ＡＴＰ　
１．ｕｉ’。

Ｔ４リガーゼ（宝酒造社製：３５０単位／ｄ）１００単
位を加え、１２℃で２４時間反応させた。

得られたりガーゼ反応混合物を形質転換に供した。

（２）　ｐＥｐｆｋ−１の取得 形質転換は異種微生物より調製されたＤＮＡ断片の結合
操作を頻度よく行うことができるように、宿主特異的制
限欠損変異（ｈｓｄ　Ｒ）を有する大腸菌に１２株亜株
ｗＡ８０２（メチオニン要求性；　ＦＥＲＭ　ＢＰ−７
１８）を用いて行った。ＷＡ８０２株のコンピテント・
セルはダジェルトらの方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、　　
６゜２３（１９７９）］で調製した。

即ち、Ｌ培地（バタトトリプトン１０ｇ１酵母エキス５
ｇ、グルコース１ｇおよびＮａＣｆ５ｇを水１βに含み
、ｐ）１７．２に調整した培地）５０ｍｌにｐ；Ａ３０
２株を植菌し、ＯＤが０．５になるまで３７℃で培養し
た。培養液を氷水中で１０分間冷却してから遠心した。

冷却した０、　Ｉ　Ｍ　ＣａＣＬ　　２０　ｍｌｌに菌
体を再懸濁し、０℃に２０分間置いた。菌体を再遠心し
、０．　Ｉ　Ｍ　ＣａＣｌ２０．５　ｍ（ｌに懸濁し、
０℃で１８時間置いた。［ａＣ１２処理した菌液１５０
μ！に前記（１）で得られたりガーゼ反応混合物５０μ
ｌを添加混合し、０℃に１０分間置いてから３７℃で５
分間加温した。次いでＬ培地２ＩＩＩＩ！を添加し、３
７℃で２時間振盪培養した。

生理食塩水で２回遠心洗浄後スペクチノマイシン１００
μｇ／　ｍｌｌを含むＬ寒天培地（Ｌ培地１！に寒天１
６ｇを含む培地）に塗布し、３７℃で２日間培養した。

出現した形質転換株のうちの１株から、前記のｐＬｃ１
６−４を単離したのと同様の方法によりプラスミドＤＮ
Ａを単離した。該プラスミドＤＮＡを用いてＰＦＫが欠
損した大腸菌に１２株亜株ＤＦ４５６　　（メチオニン
、アルギニン要求性ふよびマンニトール非資化性（ＰＦ
Ｋ欠損変異）；ジャーナル・オブ・バクテリオロジイ（
Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、１３７．５０２（１９７９）
）を前記と同様に形質転換し、スペクチノマイシン耐性
株を選択した。

それらは全てマンニトール資化性を獲得しており、該プ
ラスミドにＰＦＫ遺伝子が含まれていることが示された
。また該プラスミドＤＮＡを制限酵素消化とアガロース
ゲル電気泳動で解析した結果、第１図に示すように、Ｐ
ＦＫ遺伝子と大腸菌のベクタープラスミド（：ｏｌＥ　
１の複製開始点とを含むｐＬｃ１６−４中の３．５ｋｂ
のＰｓｔｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片〔ジャーナル・オブ・バタ
テリオロジイ（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１５２
゜９８　（１９８２））がｐｃＧｌｌのＰｓｔｌ切断部
位に挿入された構造を有していた。このプラスミドをｐ
Ｅｐｆｋ−１と命名した。

（３）ｐＥｐｆｋ−１による形質転換 コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
、コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６
８およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム＾
ＴＣＣ１３８６９のプロトプラストを形質転換してｐＥ
ｐｆｋ−１を導入した。コリネバクテリウム・グルタミ
クムＡＴＣＣ３１８３３、コリネバクテリウム・ハーキ
ュリスＡＴＣＣ１３８６８、およびブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９をそれぞれ
ＮＢ培地にて３０℃で１６時間振盪培養し、その種培養
０．１ｆｆｌβを１０ｍｊ！の３３Ｍ培地〔グルコース
１０　ｇＳＮＨｎＣｊ’　４ｇ、尿素２ｇ、酵母エキス
Ｉｇ。

にＨ２ＰＯ４１ｇ、　Ｋ２ＨＰＯ４３ｇＳＭｇＣＬ・６
Ｈ，００，４ｇ　。

Ｆｅ５Ｏｓ　・７Ｈ２０１０ｍｇ、　Ｍｎ５Ｏａ　・４
〜６Ｈ２００，２ｍｇ５ＺｎＳＯ４・７Ｌ００．９ｍｇ
、　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，４ｍｇ、Ｎａ２Ｂ、Ｏｔ
　＋　１０Ｈ２０ｏ、ｏ９ｍｇ、　（Ｎｆｌａ）ｓＭＯ
７Ｔｏ＋　’　４）＋２０ｏ、ｏ４ｍｇ、ビオチン３０
μｇ１サイアミン塩酸塩１ｍｇを純水１１に含みｐＨ７
，２に調整した培地〕の入ったＬ字型試験管に接種し、
モノー型培養槽にて３０℃で振盪培養した。ＯＤが０．
１５になった時点で０．５単位／ｍｆ！になるようにペ
ニシリンＧを添加した。さらに培養を続け、ＯＤが約０
．６になったところで細胞を集菌し、ＲＣＧＰ培地〔グ
ルコース５ｇ、カザミノ酸５ｇ、酵母エキス２．５ｇ。

Ｋ２ＨＰＯ４３，５ｇ、　ＫＨ２ＰＯ４１，５ｇ、　　
ＭｇＣｆｚ・６１（２００，４１ｇ、　Ｆｅ５０＜　・
７Ｈ２０１０ｍｇ、　！ＪｎＳＯ＜　・４〜６Ｈ２０２
ｍｇ、　ＺｎＳＯ４−７８２００，９ｍｇ、　（Ｎｌ’
１４）ＪｏＪｉ＜　・４）１．。

Ｏ，０４ｍｇ、ビオチン３０μｇ、サイアミン塩酸塩２
ｍｇ１コハク酸二ナトリウム１３５　ｇ、ポリビニルピ
ロリドン（分子ｆｆ１ｌｏ、０００）　３０　ｇを水１
βに含む培地〕に１ｍｇ／＋ｎｆｌのりゾチームを含む
液（ｐｌ（７，６）２ｍ１に懸濁し、Ｌ型試験管に移し
て３０℃で５時間緩やかに振盪反応してプロトプラスト
化した。このプロトプラスト菌液０．５ｍ　４２を小試
験管にとり、２．５００Ｘｇで５分間遠心分離し、Ｔ　
Ｓ　！Ｊ　Ｃ緩衝液（１０ｍＭ　ＭｇＣｌ１２．３０ｍ
Ｍ　ＣａＣβ２．５０ｍＭ）リス、４００ｍＭショ糖、
ｐ）１７．５）　　１　ｍＢに懸濁して遠心洗浄後、Ｔ
ＳｌＩＣ緩衝液（ｌ１ｍ！！に再懸濁した。この菌液に
２倍濃度のＴＳＭＣ緩衝液とｐＥｐｆｋ−１プラスミド
ＤＮＡ溶液との１対１混合液１００度を加えて混和し、
次いで７３ＭＣ緩衝液中に２０％Ｐ　Ｅ　Ｇ６．０００
を含む液１．０ｍＡ’を添加して混合した。３分後２．
５００　ｘ　ｇで５分間遠心分離にかけて上澄液を除去
し、沈降したプロトプラストを１ｍｌのＲＣＧＰ培地（
ｐＨ７，４）に懸濁してから３０℃で２時間緩やかに振
盪した。ついでこのプロトプラスト懸濁液の０．３ｍｆ
ｌをスペクチノマイシン４００μｇ／ｍｌ！を含むＲＣ
ＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ培地に１．６％寒天を含む培地
、ｐ）１７．４）に塗布し、３０℃でｌＯ日間培養した
。

出現したスペクチノマイシン耐性形質転換株を４００ｍ
ｆの３３Ｍ培地で振盪培養し、ＯＤが０．１５になった
ところで０．５単位／ｌＴｌ１となるようにペニシリン
Ｇを添加し、さらにＯＤが０．６５になるまで培養し、
集菌した菌体から前記（１）のｐｃＧｌｌの単離法と同
様な方法でプラスミドを単離した。これらのプラスミド
を制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析した結
果、各種制限酵素切断様式で特徴付けられるｐＥｐｆｋ
−１と同一の構造を有するものであることがわかった。

このような形質転換株がコリネバクテリウム・グルタミ
クムＡＴＣＣ３１８３３／ｐＥｐｆｋ−１、コリネバク
テリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６８／Ｉｌεｐ
ｆｋ−１およびブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムＡＴＣＣ１３８６９／ｐＥｐｆｋ−１である。この
うち、コリネバクテリウム・グルタミクム＾ＴＣＣ３１
８３３／ｐＥｐｆｋ−１は、コリネバクテリウム・グル
タミクムに６９　（ＦＥＲｌ、Ｉ　ＢＰ−１１６０）　
として昭和６１年８月２９日付で工業技術院微生物工業
技術研究所（微工研）に寄託されている。

（４）Ｌ−グルタミン酸生産試験 ｐＥｐｆｋ−１による形質転換株のＬ−グルタミン酸生
産試験を行った。

（ａ）　　種培地は、グルコース４％、ポリペプトン２
％、にＨ２ＰＯ，０，１５％、Ｋ２ＰＯ４ｏ、　０５％
、！、Ｉｇｓ０４　　・７Ｈ２００，０５％、ビオチン
１０μｇ／β、尿素０．３％、ｐＨ７，２の組成で１２
０℃、１０分間殺菌したものを用いる。この種培地にて
（３）で得られた形質転換株をそれぞれ３０℃、２４時
間振盪培養した。

種培養４ｒｎｌをそれぞれ３００ｍＩ！容三角フラスコ
中の生産培地〔グルコース６９６、（ＮＨ４）　２ｓＯ
１０，２％、ＫＨ，ＰＯ，０，１％、Ｋ２ＨＰＯ−０，
０５９６、ＭｇＳＯｎ・７Ｈ２ｏ　Ｏ，０５％、　Ｆｅ
ＳＯ４・７）１２０２ｍｇ　／　ｌ、　Ｃｕ５Ｏｎ・５
ＬＯ１ｍｇ／ｌ、！ＪｎＳＯ，・４Ｌｏ　１０ｍｇ／Ｒ
、サイアミン塩酸塩１■／ｉ！、尿素０．５％、フェノ
ールレッド１０ｍｇ／Ｉ！、（ｐＨ６，５，１２０℃、
２０分殺菌）〕２２０ｍに植菌して３０℃で培養を行っ
た。培養中、培養液をｐ）１６．０〜８．０に保つため
、１２時間目と２０時間目の２回、１０％尿素液を１ｍ
βずつ添加して３０畦間振盪培養した。

培養後、培養ｐ液をペーパークロマトグラフィーにかけ
、ニンヒドリン発色後、比色定量してＬ−グルタミン酸
の生成量を測定した。培養液中に蓄積したＬ−グルタミ
ン酸生成量を第１表に示す。

第１表 菌　　　　株　　　　　　Ｌ−グルタミン酸（ｍｇ／ｍ
ｆりら）発酵培地のグルコースの代わりに廃糖蜜（グル
コース換算）６％を用い、培養開始時にペニンリンＧ　
５単位／ｍ１ｆｆ’＋加する以外は前記（ａ）と同様に
培養を行い、Ｌ−グルタミン酸生成量を測定した。培養
液中に蓄積したＬ−グルタミン酸生成量を第２表に示し
た。

第　　　２　　　表 菌　　　株　　　　　　Ｌ−グルタミン酸（ｍｇ／ｍβ
）八ＴＣＣ３１８３３ ＡＴ口Ｃ１３８６８／ｐＥｐｆｋ−１ 発明の効果 本発明によれば、微生物のＰＦＫの合成に関与する遺伝
子を含む組換え体プラスミドＤＮＡを保有させることに
より、コリ２・バタテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属する微生物のＬ−グルタミン酸生産能を向上さ
せることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＥｐｆｋ−１の制限酵素Ｐｓｔｌによる切断
地図と作製工程を示す。 プラスミドの大きさはキロベース（ｋｂ）で表示されて
いる。 ゛　　ノ′

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物のホスホフルクトキナーゼの合成に関与す
   る遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換
   え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属またはブレ
   ビバクテリウム属に属する微生物を培地に培養し、培養
   物中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、該培養物から
   Ｌ−グルタミン酸を採取することを特徴とするＬ−グル
   タミン酸の製造法。
2. （２）該ＤＮＡ断片がエシェリヒア属、コリネバクテリ
   ウム属、ブレビバクテリウム属またはバチルス属に属す
   る微生物に由来することを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の方法。
3. （３）該ベクターがコリネバクテリウムまたはブレビバ
   クテリウム属細菌中で自律複製できるものから選ばれる
   特許請求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、ブレビ
   バクテリウム属またはバチルス属に属する微生物のホス
   ホフルクトキナーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤ
   ＮＡ断片とベクターＤＮＡが結合した組換え体ＤＮＡ。
5. （５）エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、ブレビ
   バクテリウム属またはバチルス属に属する微生物のホス
   ホフルクトキナーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤ
   ＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有す
   るコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に
   属する微生物。