JPS6024192A - フエニ−ルアラニンの製造法 - Google Patents
フエニ−ルアラニンの製造法Info
- Publication number
- JPS6024192A JPS6024192A JP58094392A JP9439283A JPS6024192A JP S6024192 A JPS6024192 A JP S6024192A JP 58094392 A JP58094392 A JP 58094392A JP 9439283 A JP9439283 A JP 9439283A JP S6024192 A JPS6024192 A JP S6024192A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- phenylalanine
- dna
- genus
- corynebacterium
- brevibacterium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/10—Citrulline; Arginine; Ornithine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/84—Brevibacterium
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/843—Corynebacterium
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は遺伝子の新規形質発現方法によりフェニールア
ラニンを製造する方法に関与する。さらに詳細には本発
明はフェニールアラニン生成に関与する遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用いコ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属す
る微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換して得られる
形質転換株を培地に培養し、培養物中にフェニールアラ
ニンを生成蓄積せしめ、該培養物からフェニールアラニ
ンを採取することを特徴とするフェニールアラニンの製
造法に関する。
ラニンを製造する方法に関与する。さらに詳細には本発
明はフェニールアラニン生成に関与する遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用いコ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属す
る微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換して得られる
形質転換株を培地に培養し、培養物中にフェニールアラ
ニンを生成蓄積せしめ、該培養物からフェニールアラニ
ンを採取することを特徴とするフェニールアラニンの製
造法に関する。
発酵法によるし一フェニールアラニンの直接的製造法と
しては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属
などの細菌のフェニールアラニンアナログ耐性株などの
突然変異株を用いる方法が知られている。
しては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属
などの細菌のフェニールアラニンアナログ耐性株などの
突然変異株を用いる方法が知られている。
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物を宿主として用い、これに該宿主に対して外
来性であるところの目的遺伝子またはベクターを含む組
換え体ＤＮＡを導入して該目的遺伝子の形質を発現させ
た例は今まで全く知られていない。コリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属に属する微生物を宿主と
する組換えＤＮＡ技法においても、これら微生物中で自
律複製し、選択可能な表現型を有し、多くの遺伝子のク
ローニングに用いうるベクター系の造成と、効率のよい
形質転換系の確立が必要である。さらに発現に際して現
れる種々の障壁の解消方法の確立が必要である。
する微生物を宿主として用い、これに該宿主に対して外
来性であるところの目的遺伝子またはベクターを含む組
換え体ＤＮＡを導入して該目的遺伝子の形質を発現させ
た例は今まで全く知られていない。コリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属に属する微生物を宿主と
する組換えＤＮＡ技法においても、これら微生物中で自
律複製し、選択可能な表現型を有し、多くの遺伝子のク
ローニングに用いうるベクター系の造成と、効率のよい
形質転換系の確立が必要である。さらに発現に際して現
れる種々の障壁の解消方法の確立が必要である。
本発明者らは先にコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物中で自律複製し、選択可能
な表現型と適当なりローニング部位を有するプラスミド
ベクターを造成する一方効率の高い形質転換系を開発し
特許出願を行った（特開昭５７−１８３７９９．同５７
−１８’６４９同５７−１８６４８９）。また本発明者
らは該プラスミドベクターに既に知られているインビト
ロにおける組換えＤＮＡ技法（Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ
４，２３７，２２４）を用い、グルタミン酸、リジンな
どのアミノ酸の生合成に関与する外来性遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を連結し、開発した形質転換系を用いてコリネ
バクテリウム・グルタミクムし一２２株またはその誘導
株を形質転換したところ、該外来性遺伝子が該宿主中で
形質を発現され、該アミノ酸の生産の増大に利用するこ
とができることを見出し特許出願を行った（特願昭５６
−２１１’９０８）。
クテリウム属に属する微生物中で自律複製し、選択可能
な表現型と適当なりローニング部位を有するプラスミド
ベクターを造成する一方効率の高い形質転換系を開発し
特許出願を行った（特開昭５７−１８３７９９．同５７
−１８’６４９同５７−１８６４８９）。また本発明者
らは該プラスミドベクターに既に知られているインビト
ロにおける組換えＤＮＡ技法（Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ
４，２３７，２２４）を用い、グルタミン酸、リジンな
どのアミノ酸の生合成に関与する外来性遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を連結し、開発した形質転換系を用いてコリネ
バクテリウム・グルタミクムし一２２株またはその誘導
株を形質転換したところ、該外来性遺伝子が該宿主中で
形質を発現され、該アミノ酸の生産の増大に利用するこ
とができることを見出し特許出願を行った（特願昭５６
−２１１’９０８）。
さらに研究の結果、フェニールアラニンに関しても同様
の方法によって得られた菌株が著量のフェニールアラニ
ンを培地に蓄積できることを見出し本発明を完成するに
至った。
の方法によって得られた菌株が著量のフェニールアラニ
ンを培地に蓄積できることを見出し本発明を完成するに
至った。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明はフェニールアラニン生成に関与する遺伝子を含
むＤＮ、Ａ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを
用いコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
に属する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換して得
られる形質転換株を培地に培養し、フェニールアラニン
を製造する方法を提供する。
むＤＮ、Ａ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを
用いコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
に属する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換して得
られる形質転換株を培地に培養し、フェニールアラニン
を製造する方法を提供する。
遺伝子を含むＤＮＡ断片があげられる。原核生物に由来
する遺伝子としては細菌とくにエソシェリヒア属、コリ
ネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属
、スタフィロコッカス属マタはセラチア属に属する細菌
の菌株に由来する遺伝子で、フェニールアラニンの生成
ならびにその生成に関与する代謝系に係る遺伝子が好適
にあげられる。
する遺伝子としては細菌とくにエソシェリヒア属、コリ
ネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属
、スタフィロコッカス属マタはセラチア属に属する細菌
の菌株に由来する遺伝子で、フェニールアラニンの生成
ならびにその生成に関与する代謝系に係る遺伝子が好適
にあげられる。
フェニールアラニンの生成ならびにその生成に関与する
代謝系に係る遺伝子としては、コリスミン酸合成酵素お
よびプレフェン酸脱水素酵素の生成に係る遺伝子があげ
られる。さらにそのような遺伝子にフェニールアラニン
、チロシンまたはそれらのアナログに対する耐性、たと
えばパラフルオロフェニールアラニン（ＰＰＰ）耐性を
付与したものも用いることができる。本発明におけるＤ
ＮＡ断片の供給源の例としては、コリネバクテリウム・
グルタミクムに３８ （ＰＰＰ耐性）があげられる。
代謝系に係る遺伝子としては、コリスミン酸合成酵素お
よびプレフェン酸脱水素酵素の生成に係る遺伝子があげ
られる。さらにそのような遺伝子にフェニールアラニン
、チロシンまたはそれらのアナログに対する耐性、たと
えばパラフルオロフェニールアラニン（ＰＰＰ）耐性を
付与したものも用いることができる。本発明におけるＤ
ＮＡ断片の供給源の例としては、コリネバクテリウム・
グルタミクムに３８ （ＰＰＰ耐性）があげられる。
本発明に用いるベクターとしては、宿主菌細胞内で自律
増殖できるものでなくてはならない。具体例としては本
発明者らがコリネバクテリウム属に属する微生物から採
取した、または採取したものから誘導して造成したｐｃ
Ｇｌ （特開昭５７−１３４５００）、ｐＣＧ２ （特
開昭５８−３５１９７ ）ｐＣＧ４ （特開昭５７−１
８３７９９）、ｐＣＥ５３、ｐＣＥ５４．ｐｃＧｌｌ、
ｐｃ８１０１などがあげられる。
増殖できるものでなくてはならない。具体例としては本
発明者らがコリネバクテリウム属に属する微生物から採
取した、または採取したものから誘導して造成したｐｃ
Ｇｌ （特開昭５７−１３４５００）、ｐＣＧ２ （特
開昭５８−３５１９７ ）ｐＣＧ４ （特開昭５７−１
８３７９９）、ｐＣＥ５３、ｐＣＥ５４．ｐｃＧｌｌ、
ｐｃ８１０１などがあげられる。
これらプラスミドを保有する菌株はそれぞれ下記の寄託
番号で工業技術院微生物工業技術研究所ならびに米国ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクシリンに寄託さ
れている。
番号で工業技術院微生物工業技術研究所ならびに米国ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクシリンに寄託さ
れている。
プラスミド ＦＥＲＭ−Ｐ ＡＴＣＣ
ｐｃＧｌ ５８６５ ３１８０８
ｐＣＧ２ ５９５４ ３１８３２
ｐＣＧ４ ５９３９ ３１８３０
ｐＣＥ５４ ３９０１９
ｐｃＧ１１ ３９０２２
ｐｃＢ１０１ ３９０２０
好適にはｐｃＧｌｌが用いられる。
ｐｃＧｌｌは本発明者らが先に発明し特許出願（特開昭
５７−１３４５００）したプラスミドで、コリネバクテ
リウム・グルタミクム２２５−５７（ＡＴＣＣ３１８０
８，ＦＥＲＭ−Ｐ５８６５）から分離されたプラスミド
ｐｃＧ１における制限酵素Ｂｇｌｎのただ−っの切断部
位に、コリネバクテリウム・グルタミクム２２５−２５
０ （ＡＴＣＣ３１８３０，ＦＦ、ＲＭ−Ｐ５９３９）
がら分離されたプラスミド−ｐＣＧ４のストレプトマイ
シンおよび／またはスペクチノマイシン耐性（Ｓ ｍ
”／５ｐｅｃρ）遺伝子を含むＢ ａ ｍ ＨＩ断片を
両者の同一接着末端を利用して結合せしめたプラスミド
である。
５７−１３４５００）したプラスミドで、コリネバクテ
リウム・グルタミクム２２５−５７（ＡＴＣＣ３１８０
８，ＦＥＲＭ−Ｐ５８６５）から分離されたプラスミド
ｐｃＧ１における制限酵素Ｂｇｌｎのただ−っの切断部
位に、コリネバクテリウム・グルタミクム２２５−２５
０ （ＡＴＣＣ３１８３０，ＦＦ、ＲＭ−Ｐ５９３９）
がら分離されたプラスミド−ｐＣＧ４のストレプトマイ
シンおよび／またはスペクチノマイシン耐性（Ｓ ｍ
”／５ｐｅｃρ）遺伝子を含むＢ ａ ｍ ＨＩ断片を
両者の同一接着末端を利用して結合せしめたプラスミド
である。
ｐｃＧｌｌは、分子量約６．８ Ｋ ｂのプラスミドで
単一な制限部位としてＢｇｎＩＩ、ＰＳｔｌを有しＳｍ
Ｒ／５ｐｅｃＲの表現型を与える。
単一な制限部位としてＢｇｎＩＩ、ＰＳｔｌを有しＳｍ
Ｒ／５ｐｅｃＲの表現型を与える。
ＤＮＡ混成物による形質転換は、本発明者らが先に特許
出願したコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウ
ム属菌種のプロトプラストを使用する形質転換法（特開
昭５７−１８６４９２および特開昭５７−１８６４８９
）により実施することができる。選択にはストレプトマ
イシンまたはスペクチノマイシンを使用すればよい。形
質転換株はＤＮＡ無添加系で受容菌プロトプラストが正
常細胞へ復帰増殖できない濃度の薬剤（通常、ストレプ
トマイシン１００〜４００μｇ／ｍｌもしくはスペクチ
ノマイシン２００〜１０００μｇ／ｍｌ）を含む高張寒
天培地上で形成されるコロニーを分離するか、あるいは
、一旦非選択的に再生培地とで正常細胞に復帰増殖させ
た後にかき集め、この懸濁液を受容菌正常細胞が生育で
きない濃度の薬剤（通常、ストレプトマイシン５〜５０
μｇ／ｍｌもしくはスペクチノマイシン５０〜５００μ
ｇ／ｍ＋）を含む寒天培地上で生育するコロニーを分！
１１１することによって得られる。
出願したコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウ
ム属菌種のプロトプラストを使用する形質転換法（特開
昭５７−１８６４９２および特開昭５７−１８６４８９
）により実施することができる。選択にはストレプトマ
イシンまたはスペクチノマイシンを使用すればよい。形
質転換株はＤＮＡ無添加系で受容菌プロトプラストが正
常細胞へ復帰増殖できない濃度の薬剤（通常、ストレプ
トマイシン１００〜４００μｇ／ｍｌもしくはスペクチ
ノマイシン２００〜１０００μｇ／ｍｌ）を含む高張寒
天培地上で形成されるコロニーを分離するか、あるいは
、一旦非選択的に再生培地とで正常細胞に復帰増殖させ
た後にかき集め、この懸濁液を受容菌正常細胞が生育で
きない濃度の薬剤（通常、ストレプトマイシン５〜５０
μｇ／ｍｌもしくはスペクチノマイシン５０〜５００μ
ｇ／ｍ＋）を含む寒天培地上で生育するコロニーを分！
１１１することによって得られる。
こうして得られる形質転換株の保有するプラスミドＤＮ
Ａは、本発明者らが特開昭５７−１３４５００および特
開昭５７−１８６４８９に開示した方法で培養菌体から
単離精製でき、さらに各種制限酵素で消化して生成する
ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で解析する常法に
より構造を知ることができる。形質転換株の一株から分
離されたプラスミドがｐｃＧｌｌである。
Ａは、本発明者らが特開昭５７−１３４５００および特
開昭５７−１８６４８９に開示した方法で培養菌体から
単離精製でき、さらに各種制限酵素で消化して生成する
ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で解析する常法に
より構造を知ることができる。形質転換株の一株から分
離されたプラスミドがｐｃＧｌｌである。
プラスミド保有菌株からのプラスミドの採取は、たとえ
ば特開昭５７．１３４５００．同５７−１８３７９９お
よび同５８−３５１９７に記載の方法に従って行えばよ
い。
ば特開昭５７．１３４５００．同５７−１８３７９９お
よび同５８−３５１９７に記載の方法に従って行えばよ
い。
遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体
の作製は、公知の試験管内組換えＤＮＡ技法を駆使する
ことにより実施できる。
の作製は、公知の試験管内組換えＤＮＡ技法を駆使する
ことにより実施できる。
試験管内のＤＮＡ組換えは、通常、目的の遺伝子を含む
供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡの切断と結合（リガーゼ
反応）により行われる（特願昭５６−２１１９０８号、
Ｕ Ｓ Ｐ ４，２３７，２２４参照）。
供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡの切断と結合（リガーゼ
反応）により行われる（特願昭５６−２１１９０８号、
Ｕ Ｓ Ｐ ４，２３７，２２４参照）。
リガーゼ反応により目的の組換え体以外に他の組換え体
も生成するが、目的の組換え体を取得するにはこのＤＮ
Ａ混成液を用いてコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属菌種を直接形質転換し、目的の遺伝子の遺
伝情報に由来する遺伝形質を付与された形質転換株を選
択分離し、その培養菌体から抽出単離することによって
達成できる。コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属菌種を直接形質転換しないで例えば大腸菌のよ
うな他の微生物の宿主ベクター系にて目的の遺伝子を一
旦クローン化し、しかる後にコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属菌種のベクターとの組換え体を
試験管内で作製してからコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌種を形質転換し前記と同様に形質
転換株を選択分離しても組換え体を取得できる。
も生成するが、目的の組換え体を取得するにはこのＤＮ
Ａ混成液を用いてコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属菌種を直接形質転換し、目的の遺伝子の遺
伝情報に由来する遺伝形質を付与された形質転換株を選
択分離し、その培養菌体から抽出単離することによって
達成できる。コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属菌種を直接形質転換しないで例えば大腸菌のよ
うな他の微生物の宿主ベクター系にて目的の遺伝子を一
旦クローン化し、しかる後にコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属菌種のベクターとの組換え体を
試験管内で作製してからコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌種を形質転換し前記と同様に形質
転換株を選択分離しても組換え体を取得できる。
組換え体製造のためには下記文献の記載が広く応用でき
る。
る。
Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ、 ｅｔ ａｌ、 Ｉｌ、Ｓ、Ｐａ
ｔｅｎｔ ４，２３７，２２４．遺伝子操作実験法〔高
木康敬編著、講談社すイエンティフインク （１９８０
） ） ＋ Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ６８、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、ｅｄｉｔｅ
ｄ ｂｙ Ｒａｙ Ｗｕ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ
１９７９．特願昭５６−２１１９０８゜本発明の宿主
微生物としては、コリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属しＤＮＡ取り込み能を有する菌株なら
ばいかなる菌株を用いてもよい。好適には次の菌株があ
げられる。
ｔｅｎｔ ４，２３７，２２４．遺伝子操作実験法〔高
木康敬編著、講談社すイエンティフインク （１９８０
） ） ＋ Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ６８、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、ｅｄｉｔｅ
ｄ ｂｙ Ｒａｙ Ｗｕ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ
１９７９．特願昭５６−２１１９０８゜本発明の宿主
微生物としては、コリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属しＤＮＡ取り込み能を有する菌株なら
ばいかなる菌株を用いてもよい。好適には次の菌株があ
げられる。
寄託番号
宿主微生物の組換え体Ｄ’ Ｎ Ａによる形質転換は１
）培養細胞からのプロトプラストの調製、２）プロトプ
ラストの組換え体ＤＮＡによる形質転換処理、３）プロ
トプラストの正常細胞への復−帰再生と形質転換株の選
択、からなる工程にて行われる。具体的方法の例を以下
に示す。
）培養細胞からのプロトプラストの調製、２）プロトプ
ラストの組換え体ＤＮＡによる形質転換処理、３）プロ
トプラストの正常細胞への復−帰再生と形質転換株の選
択、からなる工程にて行われる。具体的方法の例を以下
に示す。
１）培養細胞からのプロトプラストの調製プロトプラス
ト形成は、微生物を細胞壁溶解酵素リゾチームに感受性
にする条件下で増殖させ、この培養細胞を高張液中でリ
ゾチーム作用させ細胞壁を溶解除去することによって行
われる。微生物をリゾチーム感受性型細胞にするには各
種細胞壁合成阻害剤が用いられる。例えば、微生物培養
の対数増殖期の中途で生育を抑制しないかある０は半抑
制する濃度のペニシリンを添加し、さらＧこ数世代増殖
させることによって微生物細胞をリゾチーム感受性にす
ることができる。
ト形成は、微生物を細胞壁溶解酵素リゾチームに感受性
にする条件下で増殖させ、この培養細胞を高張液中でリ
ゾチーム作用させ細胞壁を溶解除去することによって行
われる。微生物をリゾチーム感受性型細胞にするには各
種細胞壁合成阻害剤が用いられる。例えば、微生物培養
の対数増殖期の中途で生育を抑制しないかある０は半抑
制する濃度のペニシリンを添加し、さらＧこ数世代増殖
させることによって微生物細胞をリゾチーム感受性にす
ることができる。
このとき使用する培地は微生物が増殖できる培地であれ
ばよく、例えば栄養培地ＮＢ（粉末ブイヨン２０ｇ、酵
母エキス５ｇ−を純水１ｐに含み、ｐ Ｈ７，２に調整
した培地）あるいは半合成培地ＳＳＭ（グルコース１０
ｇ、ＮＨａＣβ ４ｇ、尿素２ｇ、酵母エキス１ｇ、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４１ｇ。
ばよく、例えば栄養培地ＮＢ（粉末ブイヨン２０ｇ、酵
母エキス５ｇ−を純水１ｐに含み、ｐ Ｈ７，２に調整
した培地）あるいは半合成培地ＳＳＭ（グルコース１０
ｇ、ＮＨａＣβ ４ｇ、尿素２ｇ、酵母エキス１ｇ、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４１ｇ。
ＫＨ２Ｏ４３ｇ、ＭｇＣ１１２・６Ｈ２００，４ｇ、Ｆ
ｅｓＯ４Ｈ７Ｈ２０１０ｒｔｇ、Ｍｎ５Ｏａ・４〜６
Ｈ２００，２ｍｇ、Ｚｎ５Ｏａ ・７Ｈ２００，９ｍｇ
、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，４ｍｇ＊ Ｎａ２ＢａＯ７
１０Ｈ２００，０９ｍｇ、（ＮＨａ）ｓＭ Ｏ７０２１
・４Ｈ２００，０４■、ビオチン３０μｇ＋サイアミン
塩酸塩１■を水１１に含み、ｐＨ７，２に調整した培地
〕などが用いられる。
ｅｓＯ４Ｈ７Ｈ２０１０ｒｔｇ、Ｍｎ５Ｏａ・４〜６
Ｈ２００，２ｍｇ、Ｚｎ５Ｏａ ・７Ｈ２００，９ｍｇ
、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，４ｍｇ＊ Ｎａ２ＢａＯ７
１０Ｈ２００，０９ｍｇ、（ＮＨａ）ｓＭ Ｏ７０２１
・４Ｈ２００，０４■、ビオチン３０μｇ＋サイアミン
塩酸塩１■を水１１に含み、ｐＨ７，２に調整した培地
〕などが用いられる。
この培地に微生物を接種し、振盪培養する。
比色計によって６６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測
定し対数増殖期の初期（ＯＤ＝０．１〜０．４）に培養
液中０．１〜２．０単位／ｍｌの濃度になるようにペニ
シリンＧなどのペニシリン類を添加スる。
定し対数増殖期の初期（ＯＤ＝０．１〜０．４）に培養
液中０．１〜２．０単位／ｍｌの濃度になるようにペニ
シリンＧなどのペニシリン類を添加スる。
培養をさらに続けて、ＯＤが０．３〜０．５に増加した
ところで細胞を集菌し３３Ｍ培地で洗滌する。
ところで細胞を集菌し３３Ｍ培地で洗滌する。
次いで細胞を適当な高張培地、例えばＰＦＭ培地（３３
Ｍ２倍希釈液中にシロ糖０．４Ｍ、ＭｇＣｌ２２・６Ｈ
２００，０１Ｍを含み、ｐ Ｈ７，０〜８．５に調整し
た培地）あるいはＲＣＧ培地〔グルコース５ｇ、カゼイ
ン加水分解物５ｇ、酵母エキス２．５ｇ＋ Ｋ２ ＨＰ
Ｏ４３，５ｇ＋、ＫＨ２ＰＯａ １．５ｇ、 Ｍｇ Ｃ
Ａ ２ ・６Ｈ２００，４’ｌ ｇ、Ｆ ｅｓＯ４・７
Ｈ２０１０ｎｗ、Ｍｎ５Ｏａ ・４〜６Ｈ６Ｈ２Ｏ２，
ＺｎＳＯ４７Ｈ２００，９ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０
０，４〜Ｉ、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２００，０９μｗ
、（ＮＨ４）６Ｍｏ７ｏＸ Ｈ４Ｈ２００，０４■、ビ
オチン３０μｇ、サイアミン塩酸塩２■、コハク酸二ナ
トリウム１．３５ｇを水１６に含み、ｐＨ７，０〜８．
５に調整した培地〕に再懸濁する。この細胞懸濁液に最
終濃度０．２〜Ｉ（］■／ｍ１となるようにリゾチーム
を加え３０〜３７℃で反応する。プロトプラスト化は反
応時間が進むにつれて進行し、その経過は光学顕微鏡で
観察できる。顕微鏡下でほとんどの細胞がプロトプラス
ト化されるに要する時間は、細胞培養時の添加ペニシリ
ン濃度および用いるリゾチームの濃度によって変わるが
、前記条件にて３〜２４時間である。
Ｍ２倍希釈液中にシロ糖０．４Ｍ、ＭｇＣｌ２２・６Ｈ
２００，０１Ｍを含み、ｐ Ｈ７，０〜８．５に調整し
た培地）あるいはＲＣＧ培地〔グルコース５ｇ、カゼイ
ン加水分解物５ｇ、酵母エキス２．５ｇ＋ Ｋ２ ＨＰ
Ｏ４３，５ｇ＋、ＫＨ２ＰＯａ １．５ｇ、 Ｍｇ Ｃ
Ａ ２ ・６Ｈ２００，４’ｌ ｇ、Ｆ ｅｓＯ４・７
Ｈ２０１０ｎｗ、Ｍｎ５Ｏａ ・４〜６Ｈ６Ｈ２Ｏ２，
ＺｎＳＯ４７Ｈ２００，９ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０
０，４〜Ｉ、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２００，０９μｗ
、（ＮＨ４）６Ｍｏ７ｏＸ Ｈ４Ｈ２００，０４■、ビ
オチン３０μｇ、サイアミン塩酸塩２■、コハク酸二ナ
トリウム１．３５ｇを水１６に含み、ｐＨ７，０〜８．
５に調整した培地〕に再懸濁する。この細胞懸濁液に最
終濃度０．２〜Ｉ（］■／ｍ１となるようにリゾチーム
を加え３０〜３７℃で反応する。プロトプラスト化は反
応時間が進むにつれて進行し、その経過は光学顕微鏡で
観察できる。顕微鏡下でほとんどの細胞がプロトプラス
ト化されるに要する時間は、細胞培養時の添加ペニシリ
ン濃度および用いるリゾチームの濃度によって変わるが
、前記条件にて３〜２４時間である。
生成したプロトプラストは低張条件で破裂外するので、
プロトプラストの形成度は低張条件で生残する正常細胞
の残存度で間接的に知ることができる。通常、正常細胞
はりゾチーム処理供試正常細胞の約１０ の残存度に抑
えることができる。
プロトプラストの形成度は低張条件で生残する正常細胞
の残存度で間接的に知ることができる。通常、正常細胞
はりゾチーム処理供試正常細胞の約１０ の残存度に抑
えることができる。
このようにして調製したプロトプラストは適当な高張寒
天培地上でコロニー形成能（再生能）を有する。この寒
天培地としては栄養培地、半合成培地あるいは数種類の
アミノ酸を補充した合成培地８；： ０．３〜０．８Ｍ
コハク酸二ナトリウムおよび０．５〜６％ポリビニルピ
ロリドン（分子量１０．０００あるいは４０，０００）
を含有せしめたものが好適に川いられる。
天培地上でコロニー形成能（再生能）を有する。この寒
天培地としては栄養培地、半合成培地あるいは数種類の
アミノ酸を補充した合成培地８；： ０．３〜０．８Ｍ
コハク酸二ナトリウムおよび０．５〜６％ポリビニルピ
ロリドン（分子量１０．０００あるいは４０，０００）
を含有せしめたものが好適に川いられる。
通常、半合成培地ＲＣＧＰ培地（ＲＣＧ培地に３％のポ
リビニルピロリドン（分子量１０，０００）と１．４％
の寒天を添加した培地、ｐＨ７，２）を用いることがで
きる。培養は２５〜３５℃で行うのが好ましい。再生コ
ロニーの出現が認められるのに要する培養日数は菌株に
より差があるが、釣菌できるまでの大きさになるのは１
０〜１４日である。
リビニルピロリドン（分子量１０，０００）と１．４％
の寒天を添加した培地、ｐＨ７，２）を用いることがで
きる。培養は２５〜３５℃で行うのが好ましい。再生コ
ロニーの出現が認められるのに要する培養日数は菌株に
より差があるが、釣菌できるまでの大きさになるのは１
０〜１４日である。
ＲＣＧＰ培地でのプロトプラストの再生は菌種。
培養中途ペニシリン添加濃度およびリゾチーム処理濃度
によって異なるが、リゾチーム処理供試正常細胞あたり
１０−〜１０−〜効率である。
によって異なるが、リゾチーム処理供試正常細胞あたり
１０−〜１０−〜効率である。
２）プロトプラストの組換え体ＤＮＡによる形質転換
プロトプラストへの組換え体ＤＮＡの取り込みは細胞が
プロトプラスト状態を保持できる高張液中でプロトプラ
ストと組換え体ＤＮＡとを混合し、これにＤＮＡ取り込
み媒介作用のあるポリエチレングリコール（ＰＥＧ、平
均分子量１，５４０〜６，０００あるいはポリビニルア
ルコール（ＰＶＡ、 重合度５００〜１．５００ ）と
二価金属陽イオンを加えて処理することによって行われ
る：高張条件を与える安定化剤としては、微生物のプロ
トプラストの保持に一般に使われるものでよ（、例えば
シー糖やコハク酸二ナトリウムを用いることができる。
プロトプラスト状態を保持できる高張液中でプロトプラ
ストと組換え体ＤＮＡとを混合し、これにＤＮＡ取り込
み媒介作用のあるポリエチレングリコール（ＰＥＧ、平
均分子量１，５４０〜６，０００あるいはポリビニルア
ルコール（ＰＶＡ、 重合度５００〜１．５００ ）と
二価金属陽イオンを加えて処理することによって行われ
る：高張条件を与える安定化剤としては、微生物のプロ
トプラストの保持に一般に使われるものでよ（、例えば
シー糖やコハク酸二ナトリウムを用いることができる。
ＰＥＧおよびＰＶＡの使用可能な濃度範囲は最終濃度テ
各々５〜６０％、１〜２０％である。二価金属陽イオン
は最終濃度１〜１００ｍＭの、たとえばＣａ”、Ｍｇ”
、Ｍｎ”、Ｂａ”、Ｓｒ″″などが効果的で単独あるい
は併用することができる。処理の温度は０〜２５℃が好
適である。
各々５〜６０％、１〜２０％である。二価金属陽イオン
は最終濃度１〜１００ｍＭの、たとえばＣａ”、Ｍｇ”
、Ｍｎ”、Ｂａ”、Ｓｒ″″などが効果的で単独あるい
は併用することができる。処理の温度は０〜２５℃が好
適である。
３）プロトプラストの正常細胞への復帰再生と形質転換
株の選択 組換え体ＤＮ、Ａで形質転換処理したプロトプラストの
再生は、前記のプロトプラストの再生と同様に、コハク
酸二ナトリウムとポリビニルピロリドンを含有する高張
寒天培地（例えばＲＣＧＰ培地）上にプロトプラストを
塗布し、正常細胞が生育できる温度、一般に２５〜３５
℃で培養することによって行われる。形質転換株は供与
ＤＮＡに由来する遺伝子が菌に付与する形質について選
択することによって取得できる。この特徴的形質獲得に
基づく選択は、高張寒天培地上で再生と同時に行っても
よく、あるいは一旦非選択的に再生させてから再生正常
細胞を集め普通の低張寒天培地上で行ってもよい。
株の選択 組換え体ＤＮ、Ａで形質転換処理したプロトプラストの
再生は、前記のプロトプラストの再生と同様に、コハク
酸二ナトリウムとポリビニルピロリドンを含有する高張
寒天培地（例えばＲＣＧＰ培地）上にプロトプラストを
塗布し、正常細胞が生育できる温度、一般に２５〜３５
℃で培養することによって行われる。形質転換株は供与
ＤＮＡに由来する遺伝子が菌に付与する形質について選
択することによって取得できる。この特徴的形質獲得に
基づく選択は、高張寒天培地上で再生と同時に行っても
よく、あるいは一旦非選択的に再生させてから再生正常
細胞を集め普通の低張寒天培地上で行ってもよい。
本発明における具体的に好適な宿主菌株として示したリ
ゾチーム感受性菌株を用いる場合には形質転換は上記工
程（１）におけるペニシリン処理を行わずに単に培養増
殖させた細胞を直接リゾチーム処理する以外は上記工程
（１１〜（３）と同様に行えばよい。リゾチーム感受性
微生物を用いる場合の形質−λ 転換株は再生菌あたりｌＯ〜１０−４の高頻度で得られ
る。
ゾチーム感受性菌株を用いる場合には形質転換は上記工
程（１）におけるペニシリン処理を行わずに単に培養増
殖させた細胞を直接リゾチーム処理する以外は上記工程
（１１〜（３）と同様に行えばよい。リゾチーム感受性
微生物を用いる場合の形質−λ 転換株は再生菌あたりｌＯ〜１０−４の高頻度で得られ
る。
形質転換株は通常の栄養培地に培養することにより導入
した組換え体ＤＮＡの形質を発現させることができる。
した組換え体ＤＮＡの形質を発現させることができる。
組換え体ＤＮＡに遺伝子ＤＮＡまたはベクターＤＮＡ由
来の性質が付与されている場合は、その性質にあわせて
培地に薬剤を補給するときもある。
来の性質が付与されている場合は、その性質にあわせて
培地に薬剤を補給するときもある。
かくして得られた形質転換株を、従来発酵法によるフェ
ニールアラニン製造に用いられる培養方法により培養す
ることによって、フェニールアラニンを製造することが
できる。すなわち、該形質転換株を炭素源、窒素源、無
機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中
、好気的条件下、温度、ｐＨなどを調節しつつ培養を行
えば、培養物中にフェニールアラニンが生成蓄積するの
で、これを採取する。
ニールアラニン製造に用いられる培養方法により培養す
ることによって、フェニールアラニンを製造することが
できる。すなわち、該形質転換株を炭素源、窒素源、無
機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中
、好気的条件下、温度、ｐＨなどを調節しつつ培養を行
えば、培養物中にフェニールアラニンが生成蓄積するの
で、これを採取する。
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、シュークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解液、糖蜜などの種々の炭水化物、ポリアル
コール、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各
種有機酸が使用できる。更に菌の資化性によって、炭化
水素、アルコール類なども用いうる。とくに廃糖蜜は好
適に用いられる。
ス、シュークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解液、糖蜜などの種々の炭水化物、ポリアル
コール、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各
種有機酸が使用できる。更に菌の資化性によって、炭化
水素、アルコール類なども用いうる。とくに廃糖蜜は好
適に用いられる。
窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム。
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム。
酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウ
ム塩類あるいは尿素および他の窒素含有物質ならびにペ
プトン、ＮＺ−アミン、肉エキス。
ム塩類あるいは尿素および他の窒素含有物質ならびにペ
プトン、ＮＺ−アミン、肉エキス。
酵母エキス、コーン・スチープ・リカー、カゼイン加水
分解物、フィツシュミールあるいはその消化物、脱脂大
豆軸あるいはその消化物、輔加水分解物などの窒素含有
有機物など種々のものが使用可能である。
分解物、フィツシュミールあるいはその消化物、脱脂大
豆軸あるいはその消化物、輔加水分解物などの窒素含有
有機物など種々のものが使用可能である。
さらに無機物としては、燐酸第一水素カリウム。
燐酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用する
。微生物の生育に必要とするビタミン、アミノ酸源など
は、前記したような他の培地成分に従って培地に供給さ
れれば特に加えなくてもよい。
ニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用する
。微生物の生育に必要とするビタミン、アミノ酸源など
は、前記したような他の培地成分に従って培地に供給さ
れれば特に加えなくてもよい。
培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好魚釣条件
下に行う。培養温度は一般に２−０〜４０℃が好適であ
る。培養中の培地のｐｉ（は中性付近に維持することが
望ましい。培養期間は通常１〜５日間で培地中に著量の
フェニールアラニンが蓄積する。
下に行う。培養温度は一般に２−０〜４０℃が好適であ
る。培養中の培地のｐｉ（は中性付近に維持することが
望ましい。培養期間は通常１〜５日間で培地中に著量の
フェニールアラニンが蓄積する。
培養終了後、菌体を除去して活性炭処理、イオン交換樹
脂処理などの公知の方法で培養液からフェニールアラニ
ンが回収される。
脂処理などの公知の方法で培養液からフェニールアラニ
ンが回収される。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１゜
コリネバクテリウム・グルタミクムに３Ｂのコリスミン
酸合成酵素及びプレフェン酸脱水素酵素遺伝子のコリネ
バクテリウム・グルタミクムでのクローン化とフェニー
ルアラニンの生産：（１） 染色体ＤＮＡとプラスミド
ｐｃＧ１１の調整法： コリネバクテリウム・グルタミクムに３８゜ＦＥＲＭ
Ｐ−７０８７の染色体ＤＮＡを以下の方法で調製する。
酸合成酵素及びプレフェン酸脱水素酵素遺伝子のコリネ
バクテリウム・グルタミクムでのクローン化とフェニー
ルアラニンの生産：（１） 染色体ＤＮＡとプラスミド
ｐｃＧ１１の調整法： コリネバクテリウム・グルタミクムに３８゜ＦＥＲＭ
Ｐ−７０８７の染色体ＤＮＡを以下の方法で調製する。
４００ ｍｌ半合成培地ｓｓＭ （グルコース２０ｇ。
（ＮＨ４） ２３０４ １０ ｇ、尿素３ｇ、酵母エキ
ス１ ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、 ＭｇＣｎ ２ ・６
Ｈ２００，４ｇ、Ｆｅ５Ｏ４・７Ｈ２０’ １０ｍｇ、
ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２００，２１Ｗ、Ｚｎ５Ｏａ ７
Ｈ２００，９ｍｇ＋ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，４＋ｎ
ｇ、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７１０Ｈ２００，０９ｎｖ、（ＮＨａ
）ｓＭｏ７０２４・４Ｈ２００，０４■、ビオチン３０
μｇ。
ス１ ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、 ＭｇＣｎ ２ ・６
Ｈ２００，４ｇ、Ｆｅ５Ｏ４・７Ｈ２０’ １０ｍｇ、
ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２００，２１Ｗ、Ｚｎ５Ｏａ ７
Ｈ２００，９ｍｇ＋ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，４＋ｎ
ｇ、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７１０Ｈ２００，０９ｎｖ、（ＮＨａ
）ｓＭｏ７０２４・４Ｈ２００，０４■、ビオチン３０
μｇ。
サイアミン塩酸塩１■を水Ｈに含みｐ Ｈ７，２に調整
した培地〕に種培養を接種して３０℃で振盪培養する。
した培地〕に種培養を接種して３０℃で振盪培養する。
種培養はＮＢ培地を用いる。東京光電比色針で６６０ｎ
ｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定し、ＯＤ ０．２にな
った時点で培養液中０．５単位／ｍｌの濃度となるよう
にペニシリンＧを添加する。
ｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定し、ＯＤ ０．２にな
った時点で培養液中０．５単位／ｍｌの濃度となるよう
にペニシリンＧを添加する。
さらに培養を継続しＯＤ約０．６になるまで生育させる
。
。
培養液から菌体を集菌し、ＴＢＳ緩衝液（０，０３Ｍト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌ （以
下トリスと略す）、０．００５ＭＥＤＴＡ。
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌ （以
下トリスと略す）、０．００５ＭＥＤＴＡ。
０．０５ＭＮａ（１１！ ： ｐＨ８，０）で洗浄後、
リゾチーム液（２５％シロ糖、０．１ＭＮａＣ７＋、０
．０５Ｍトリス、０．８ｗ／ｍｌリゾチーム： ｐ Ｈ
８，０以下同じ）で１０ｍ１に懸濁し３７℃で４時間反
応させる。
リゾチーム液（２５％シロ糖、０．１ＭＮａＣ７＋、０
．０５Ｍトリス、０．８ｗ／ｍｌリゾチーム： ｐ Ｈ
８，０以下同じ）で１０ｍ１に懸濁し３７℃で４時間反
応させる。
集菌した菌体から斎藤らの方法（Ｓａｉｔｏ、 Ｉｌ、
ｅｔ ａｌ： Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、
Ａｃｔａ、 ７２６１９ （１９６３） ）に従って
高分子染色体ＤＮＡを単離する。
ｅｔ ａｌ： Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、
Ａｃｔａ、 ７２６１９ （１９６３） ）に従って
高分子染色体ＤＮＡを単離する。
ベクターとして用いるｐｃＧｌｌは次の方法でその保有
株コリネバクテリウム・グルタミクムし一２２株の培養
菌体から単離する。
株コリネバクテリウム・グルタミクムし一２２株の培養
菌体から単離する。
４００ｍ１ＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス
５ｇを水１７！に含みｐＨ７，２に調整した培地）で３
０℃で振盪培養しＯＤ約０．７になるまで生育させる。
５ｇを水１７！に含みｐＨ７，２に調整した培地）で３
０℃で振盪培養しＯＤ約０．７になるまで生育させる。
菌体を集菌し、ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、リゾチーム液１
０ｍ１に懸濁し、３７℃で２時間反応させる。反応液に
５ＭＮａＣｌ２２．４ｍｌ。
０ｍ１に懸濁し、３７℃で２時間反応させる。反応液に
５ＭＮａＣｌ２２．４ｍｌ。
０．５ＭＥＤＴＡ （ｐＨ８，５）０．６ｍｌ、４％ラ
ウリル硫酸ナトリウムと０．７ＭＮａＣＡからなる溶液
４、４ ｍｌを順次添加し、緩やかに混和してから氷水
中に１５時間置く。
ウリル硫酸ナトリウムと０．７ＭＮａＣＡからなる溶液
４、４ ｍｌを順次添加し、緩やかに混和してから氷水
中に１５時間置く。
溶菌物全体を遠心管に移し４℃で６０分間６９．４００
×ｇの遠心分離にかけ上澄液を回収する。これに重量百
分率１０％相当のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
６，０００ （牛丼化学薬品社製）を加え、静かに混和
して溶解後、氷水中に置く。１０時間後１，５００Ｘｇ
で１０分間遠心分離してペレットを回収する。ＴＢＳ緩
衝緩衝液５査ｌえてベレットを静かに再溶解してから１
．５■／ｍｌエチジウムブロマイド２．０ｍｌを添加し
、これに塩化セシウムを加えて静かに溶解し密度を１．
５８０に合わせる。
×ｇの遠心分離にかけ上澄液を回収する。これに重量百
分率１０％相当のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
６，０００ （牛丼化学薬品社製）を加え、静かに混和
して溶解後、氷水中に置く。１０時間後１，５００Ｘｇ
で１０分間遠心分離してペレットを回収する。ＴＢＳ緩
衝緩衝液５査ｌえてベレットを静かに再溶解してから１
．５■／ｍｌエチジウムブロマイド２．０ｍｌを添加し
、これに塩化セシウムを加えて静かに溶解し密度を１．
５８０に合わせる。
この溶液を１０５，０００ ｘ ｇ、１８℃で４８時間
超遠心分＃ｌｌこかける。この密度匂配遠心により共有
結合で閉じられた環状のＤＮＡは紫外線照射下に遠心チ
ューブ中下方の密度の高いバンドとして見出される。こ
のバンド画分を注射器で遠心チューブの側面から抜きと
ることによってＩ）ＣＧＩＩＤＮＡが分離される。次い
で分画液を等容量のイソプロピルアルコール液〔容量百
分率９０％イソプロピルアルコール、１０％ＴＢＳ緩衝
液（この混液中に飽和溶解量の塩化セシウムを含む）〕
で５回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、し
かる後にＴＢＳ緩衝液に対して透析する。
超遠心分＃ｌｌこかける。この密度匂配遠心により共有
結合で閉じられた環状のＤＮＡは紫外線照射下に遠心チ
ューブ中下方の密度の高いバンドとして見出される。こ
のバンド画分を注射器で遠心チューブの側面から抜きと
ることによってＩ）ＣＧＩＩＤＮＡが分離される。次い
で分画液を等容量のイソプロピルアルコール液〔容量百
分率９０％イソプロピルアルコール、１０％ＴＢＳ緩衝
液（この混液中に飽和溶解量の塩化セシウムを含む）〕
で５回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、し
かる後にＴＢＳ緩衝液に対して透析する。
（２） パラフルオロフェニールアラニン（ＰＰＰ）耐
性形質を支配する遺伝子のクローン化：上記で調製した
ｐｃＧ１１プラスミドＤＮＡ３μｇを含む制限酵素Ｂｇ
β■反応液１００μｌに５単位のＢａ（！■（宝酒造社
Ｎ）を、また染色体ＤＮＡ９μｇを含む制限酵素Ｂａｍ
ＨＩ反応液１００μｌに５単位のＢａｍＨＩ （宝酒造
社製）を加え、それぞれ３７°Ｃで６０分間反応後６５
℃で１０分間加温して反応を停止させる。両反応液を混
合後、この混合物にＴ４リガーゼ用緩衝液（トリス６６
０ ｍＭ、 Ｍ ｇ Ｃ４２６６ｍＭ、ジチオスレイト
ール１００ｍＭ、ｐＨ７，６）４０ｐＬＡＴＰ （５ｍ
Ｍ）４０μ１１．Ｔ４リガーゼ（宝酒造社製、１単位／
μβ）０．４μｌおよびＨ２Ｏ１２０μｋを加え、１２
’Ｃで１６時間反応さゼる。
性形質を支配する遺伝子のクローン化：上記で調製した
ｐｃＧ１１プラスミドＤＮＡ３μｇを含む制限酵素Ｂｇ
β■反応液１００μｌに５単位のＢａ（！■（宝酒造社
Ｎ）を、また染色体ＤＮＡ９μｇを含む制限酵素Ｂａｍ
ＨＩ反応液１００μｌに５単位のＢａｍＨＩ （宝酒造
社製）を加え、それぞれ３７°Ｃで６０分間反応後６５
℃で１０分間加温して反応を停止させる。両反応液を混
合後、この混合物にＴ４リガーゼ用緩衝液（トリス６６
０ ｍＭ、 Ｍ ｇ Ｃ４２６６ｍＭ、ジチオスレイト
ール１００ｍＭ、ｐＨ７，６）４０ｐＬＡＴＰ （５ｍ
Ｍ）４０μ１１．Ｔ４リガーゼ（宝酒造社製、１単位／
μβ）０．４μｌおよびＨ２Ｏ１２０μｋを加え、１２
’Ｃで１６時間反応さゼる。
（３）組換えプラスミドの形質転換：
このリガーゼ反応混合物を形質転換に供する。
形質転換に供する受容菌として、コリネバクテリウム・
グルタミクムＬ−１５ＡＴＣＣ３１８３４を用いる。Ｌ
−１５株の種培養をＮＢ培地に植菌し３０℃で振盪培養
する。ＯＤ ０．６になった時点で集菌し、該細胞をＲ
ＣＧＰ培地〔グルコース５ｇ、カザミノ酸５ｇ、酵母エ
キス２．５ｇ、に２ＨＰＯ４３，５ｇ＋ ＫＨ２ＰＯ４
１，５ｇ＋ ＭｇＣβ２・６Ｈ２００，４１ｇ、Ｆｅ５
Ｏａ７Ｈ２０１０ｎｖｒ、 ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２０
２ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２００，９■、（ＮＨ４）６
ＭＯ７０２４・４Ｈ２００，０４■、ビオチン３０μｇ
。
グルタミクムＬ−１５ＡＴＣＣ３１８３４を用いる。Ｌ
−１５株の種培養をＮＢ培地に植菌し３０℃で振盪培養
する。ＯＤ ０．６になった時点で集菌し、該細胞をＲ
ＣＧＰ培地〔グルコース５ｇ、カザミノ酸５ｇ、酵母エ
キス２．５ｇ、に２ＨＰＯ４３，５ｇ＋ ＫＨ２ＰＯ４
１，５ｇ＋ ＭｇＣβ２・６Ｈ２００，４１ｇ、Ｆｅ５
Ｏａ７Ｈ２０１０ｎｖｒ、 ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２０
２ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２００，９■、（ＮＨ４）６
ＭＯ７０２４・４Ｈ２００，０４■、ビオチン３０μｇ
。
サイアミン塩酸塩２■、コハク酸二ナトリウム１３５
ｇ、ポリビニルピロリドン（分子量１０．０００）３０
ｇを水１βに含む培地〕に１■／ｎ＋１のりゾチームを
含む液（ｐＨ７，６＞に約１０９細胞／ｍｌとなるよう
に懸濁し、Ｌ型試験管に移して３０℃で５時間緩やかに
振盪反応してプロトプラスト化する。
ｇ、ポリビニルピロリドン（分子量１０．０００）３０
ｇを水１βに含む培地〕に１■／ｎ＋１のりゾチームを
含む液（ｐＨ７，６＞に約１０９細胞／ｍｌとなるよう
に懸濁し、Ｌ型試験管に移して３０℃で５時間緩やかに
振盪反応してプロトプラスト化する。
このプロトプラスト懸濁液０．５ｍｌを小試験管にとり
２５００Ｘｇで５分間遠心分離し、７３ＭＣ緩衝液（１
０ｍＭ塩化マグネシウム、３０ｍＭ塩化カルシウム、５
０ｍＭ）リス、４００ｍＭショ糖、ｐＨ７，５）１ｍｌ
に再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ緩衝液０．１ｍｌに
再懸濁する。この懸濁液に２倍濃度の７３ＭＣ緩衝液と
上記リガーゼ反応ＤＮＡ混合物の１対１混合液１００μ
βを加えて混和し、次いでＴＳＭｑ緩衝液中に２０％Ｐ
ＥＧ６．０００を含む液０．８ｍｌを添加して混合する
。３分後、ＲＣ，ＣＰ培地（ｐＨ７，２）２ｍｌを添加
し、２．５００Ｘｇで５分間遠心分離にかけて上澄み液
を除去し、沈降したプロトプラストを１ｍｌのＲＣＧＰ
培地に懸濁してから０．２ｍｌをスペクチノマイシン２
００μｇ／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ培地
に１．４％寒天を含む培地、ｐＨ７，２）に塗抹し、３
０℃で７日間培養する。
２５００Ｘｇで５分間遠心分離し、７３ＭＣ緩衝液（１
０ｍＭ塩化マグネシウム、３０ｍＭ塩化カルシウム、５
０ｍＭ）リス、４００ｍＭショ糖、ｐＨ７，５）１ｍｌ
に再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ緩衝液０．１ｍｌに
再懸濁する。この懸濁液に２倍濃度の７３ＭＣ緩衝液と
上記リガーゼ反応ＤＮＡ混合物の１対１混合液１００μ
βを加えて混和し、次いでＴＳＭｑ緩衝液中に２０％Ｐ
ＥＧ６．０００を含む液０．８ｍｌを添加して混合する
。３分後、ＲＣ，ＣＰ培地（ｐＨ７，２）２ｍｌを添加
し、２．５００Ｘｇで５分間遠心分離にかけて上澄み液
を除去し、沈降したプロトプラストを１ｍｌのＲＣＧＰ
培地に懸濁してから０．２ｍｌをスペクチノマイシン２
００μｇ／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ培地
に１．４％寒天を含む培地、ｐＨ７，２）に塗抹し、３
０℃で７日間培養する。
選択プレート上に生育したスペクチノマイシン耐性コロ
ニーをかき集め、生理食塩水を用いて２回遠心洗浄後、
スペクチノマイシン１００μｇ／ｍ１およびＰ Ｆ Ｐ
Ｏ，５■／ｍ＋を含む最小寒天培地Ｍ１に塗布して３
０℃で２日間培養し、スペクチノマイシン耐性でかつパ
ラフルオロフェニールアラニン耐性となった形質転換株
を選択する。
ニーをかき集め、生理食塩水を用いて２回遠心洗浄後、
スペクチノマイシン１００μｇ／ｍ１およびＰ Ｆ Ｐ
Ｏ，５■／ｍ＋を含む最小寒天培地Ｍ１に塗布して３
０℃で２日間培養し、スペクチノマイシン耐性でかつパ
ラフルオロフェニールアラニン耐性となった形質転換株
を選択する。
これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様にプラス
ミドＤＮＡを単離する。形質転換株の一株から得られた
プラスミドｐＣ３−ＣＭＩを各種制限酵素消化後アガロ
ースゲル電気泳動で解析した結果、ｐｃＧｌｌの唯一の
Ｂｇ１ｍ切断部位に約９．４ Ｋ ｂのＢａｍＨＩ Ｄ
ＮＡ切断断片が挿入されたプラスミドであることがわか
った。
ミドＤＮＡを単離する。形質転換株の一株から得られた
プラスミドｐＣ３−ＣＭＩを各種制限酵素消化後アガロ
ースゲル電気泳動で解析した結果、ｐｃＧｌｌの唯一の
Ｂｇ１ｍ切断部位に約９．４ Ｋ ｂのＢａｍＨＩ Ｄ
ＮＡ切断断片が挿入されたプラスミドであることがわか
った。
次に、コリスメートムターゼ、プレフェネートデヒドラ
ターゼを欠損したコリネバクテリウム・グルタミクムの
フェニールアラニン、チロシン要求株を受容菌として前
記と同様に形質転換を行い、スペクチノマイシン耐性で
かつ、フェニールアラニン、チロシン非要求性となった
形質転換株を選択する。
ターゼを欠損したコリネバクテリウム・グルタミクムの
フェニールアラニン、チロシン要求株を受容菌として前
記と同様に形質転換を行い、スペクチノマイシン耐性で
かつ、フェニールアラニン、チロシン非要求性となった
形質転換株を選択する。
これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様にプラス
ミドＤＮＡを単離する。形質転換株の一株から得られた
プラスミドｐｃｓ−ＣＭ２を各種制限酵素消化後アガロ
ースゲル電気泳動で解析した結果、ｐｃＧｌｌの唯一の
Ｂｇβ■切断部位に約９．４ Ｋ ｂのＢａｍＨＩ Ｄ
ＮＡ切断断片が挿入されたプラスミドであることがわか
った。
ミドＤＮＡを単離する。形質転換株の一株から得られた
プラスミドｐｃｓ−ＣＭ２を各種制限酵素消化後アガロ
ースゲル電気泳動で解析した結果、ｐｃＧｌｌの唯一の
Ｂｇβ■切断部位に約９．４ Ｋ ｂのＢａｍＨＩ Ｄ
ＮＡ切断断片が挿入されたプラスミドであることがわか
った。
以上の様にして得られたｐｃｓ−ＣＭＩ、ｐＣ３−０Ｍ
２は、下記のＥｃｏＲＩ 、 Ｓａｌ、 Ｉ 、旧ｎｄ
ｌｌｌなどの各種制限酵素の切断パターンから、同一の
プラスミドであることが判明した。
２は、下記のＥｃｏＲＩ 、 Ｓａｌ、 Ｉ 、旧ｎｄ
ｌｌｌなどの各種制限酵素の切断パターンから、同一の
プラスミドであることが判明した。
’Ｋｂｐ ”
ｐＣ３−ＣＭＩ、ｐＣ３−０Ｍ２を用い、同様な方法で
コリネバクテリウム・グルタミクムのフェニールアラニ
ン、チロシン要求株を形質転換したところ、フェニール
アラニン、チロシンを各々１００μｇ／ｍｌ及びスペク
チノマイシン２００μｇ／ｍｌを含むＰＣＣＰ寒天培地
上で生育するコロニーハ、同時にフェニールアラニン、
チロシン非要求性かつ、ＰＰＰ耐性となり、それらは各
々ｐＣ３−ＣＭＩ、ｐＣ３−ＣＭ２と同一のプラスミド
を保有している。
コリネバクテリウム・グルタミクムのフェニールアラニ
ン、チロシン要求株を形質転換したところ、フェニール
アラニン、チロシンを各々１００μｇ／ｍｌ及びスペク
チノマイシン２００μｇ／ｍｌを含むＰＣＣＰ寒天培地
上で生育するコロニーハ、同時にフェニールアラニン、
チロシン非要求性かつ、ＰＰＰ耐性となり、それらは各
々ｐＣ３−ＣＭＩ、ｐＣ３−ＣＭ２と同一のプラスミド
を保有している。
以上の結果は、ｐＣ３，−ＣＭＩ、ｐＣ３−０Ｍ２にク
ローン化された約９．４ Ｋ ｂのＢａｍＨＩＤＮΔ切
断片には、コリネバクテリウム・グルタミクムに３Ｂの
コリスメートムターゼ、ブレフェネートデヒドラターゼ
遺伝子が存在し、さらにこのＤＮＡ断片によって、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムにパラフルオロフェニー
ルアラニン耐性が付与されることを示している。
ローン化された約９．４ Ｋ ｂのＢａｍＨＩＤＮΔ切
断片には、コリネバクテリウム・グルタミクムに３Ｂの
コリスメートムターゼ、ブレフェネートデヒドラターゼ
遺伝子が存在し、さらにこのＤＮＡ断片によって、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムにパラフルオロフェニー
ルアラニン耐性が付与されることを示している。
（４）形質転換株によるフェニールアラニンの生産二上
記と同様にして、フェニールアラニン生産性のコリネバ
クテリウム・グルタミクムに３Ｂ株（ＦＥＲＭ Ｐ−７
０８７）をｐＣ３−０Ｍ２で形質転換する。得られた形
質転換株は、微工研にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｋ ３９ 、Ｆ Ｅ ＲＭＰ
−７０８８として、寄託されている。ｐＣ３−ＣＭ２保
有株、コリネバクテリウム・グルタミクムに３９による
し一フェニールアラニンを生産試験を下記のとおり行う
。
記と同様にして、フェニールアラニン生産性のコリネバ
クテリウム・グルタミクムに３Ｂ株（ＦＥＲＭ Ｐ−７
０８７）をｐＣ３−０Ｍ２で形質転換する。得られた形
質転換株は、微工研にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｋ ３９ 、Ｆ Ｅ ＲＭＰ
−７０８８として、寄託されている。ｐＣ３−ＣＭ２保
有株、コリネバクテリウム・グルタミクムに３９による
し一フェニールアラニンを生産試験を下記のとおり行う
。
菌株をＮＢ液体培地中で３０℃、１６時間振盪培養した
菌液０．５ｍｌを５ｍｌの生産培地Ｐ４（廃糖蜜１００
ｇ／β、（ＮＨａ）２ＳＯ４２０ｇ／Ｉ１． ＫＨ２Ｐ
Ｏ４０，５ｇ／ｊ！、 Ｋ２ ＨＰＯ４０，５ｇ／４．
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２５ｇ／１２、ＣａＣＯ３２
０ｇ／ｊ＃ ｐＨ７，２）の入った試験管に植菌し、３
０°Ｃで９６時間振盪培養する。
菌液０．５ｍｌを５ｍｌの生産培地Ｐ４（廃糖蜜１００
ｇ／β、（ＮＨａ）２ＳＯ４２０ｇ／Ｉ１． ＫＨ２Ｐ
Ｏ４０，５ｇ／ｊ！、 Ｋ２ ＨＰＯ４０，５ｇ／４．
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２５ｇ／１２、ＣａＣＯ３２
０ｇ／ｊ＃ ｐＨ７，２）の入った試験管に植菌し、３
０°Ｃで９６時間振盪培養する。
培養後、培養濾液をペーパークロマトグラフィーにかけ
、ニンヒドリン発色後、比色定量して、Ｌ−フェニール
アラニンの生成量を測定する。
、ニンヒドリン発色後、比色定量して、Ｌ−フェニール
アラニンの生成量を測定する。
対照として、コリネバクテリウム・グルタミクムに３Ｂ
株を同様に処理する。
株を同様に処理する。
結果を第１表に示す。
手続補正書
昭和５年７月１ｇ日
１、事件の表示
昭和５８年特許願第９４３９２号
２、発明の名称
フェニールアラニンの製造法
３゜補正をする者
事件との関係 特許出願人
郵便番号 １００
住 所 東京都千代田区大手町−丁目６ｓ１号名 称
（１０２）協和醗酵工業株式会社（２） 明細書第２頁
下行目および同第１９頁１２行目の「脱水素酵素」を［
デヒドラターゼＪに訂正する。
（１０２）協和醗酵工業株式会社（２） 明細書第２頁
下行目および同第１９頁１２行目の「脱水素酵素」を［
デヒドラターゼＪに訂正する。
（３）明細書第２６頁１３行目のｒＢａｊ２ＩＩＪを「
Ｂｇｊｌ’ＩＩＪに訂正する。
Ｂｇｊｌ’ＩＩＪに訂正する。
（４）明細書第２６頁１４行目の「反応液」の後に１’
４１０ｍＭ）リス、７ｍＭ ＭｇＣｊ！２゜１００ｍＭ
ＮａＣ１，２ｍＭメルカプトエタノール、０．０１％
ウシ血清アルブミン、ｐＨ８，０（以下同じ）〕」を加
入する。
４１０ｍＭ）リス、７ｍＭ ＭｇＣｊ！２゜１００ｍＭ
ＮａＣ１，２ｍＭメルカプトエタノール、０．０１％
ウシ血清アルブミン、ｐＨ８，０（以下同じ）〕」を加
入する。
（５）明細書第２６頁下から３行目のＩＰ−７０８７）
の後にｒ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５４）Ｊを加入する。
の後にｒ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５４）Ｊを加入する。
（６）明細書第２６頁１行目のｒＰ−７０８８Ｊの後に
ｒ （ＦＥＲＭ、ＢＰ−４５９）Ｊを加入する。
ｒ （ＦＥＲＭ、ＢＰ−４５９）Ｊを加入する。
（７）特許請求の範囲を別紙のとおり訂正する。
特許請求の範囲
（１）フェニールアラニン生成に関与する遺伝子を含む
ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用い
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換して得られ
る形質転換株を培地に培養し、培養物中にフェニールア
ラニンを生成蓄積せしめ、該培養物からフェニールアラ
ニンを採取することを特徴とするフェニールアラニンの
製造法。
ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用い
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換して得られ
る形質転換株を培地に培養し、培養物中にフェニールア
ラニンを生成蓄積せしめ、該培養物からフェニールアラ
ニンを採取することを特徴とするフェニールアラニンの
製造法。
（２）該遺伝子を含むＤＮＡ断片が原核生物由来である
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
（３）該原核生物が細菌であることを特徴とする特許請
求の範囲第２項記載の方法。
求の範囲第２項記載の方法。
（４）該細菌がエッシエリヒア属、コリネバクテリウム
属、ブレビバクテリウム属、バチルス属。
属、ブレビバクテリウム属、バチルス属。
スタフィロコッカス属およびセラチア属から選ばれるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の方法。
とを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の方法。
（５）該細菌がフェニールアラニン、グ°ロジンまたは
それらのアナログに耐性であることを特徴とする特許請
求の範囲第４項記載の方法。
それらのアナログに耐性であることを特徴とする特許請
求の範囲第４項記載の方法。
（６） 該細菌がコリネバクテリウム・クルクミクムの
パラフルオロ・フェニールアラニン耐性株であることを
特徴とする特許請求の範囲第５項記載の方法。
パラフルオロ・フェニールアラニン耐性株であることを
特徴とする特許請求の範囲第５項記載の方法。
（７）該ベクターがコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属細菌中で自律複製できる微生物由来のプ
ラスミド、ファージまたはその誘導体であることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
バクテリウム属細菌中で自律複製できる微生物由来のプ
ラスミド、ファージまたはその誘導体であることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
（８）該プラスミドおよびその誘導体がコリネバクテリ
ウム属に属する微生物由来のｐｃＧｌ、ｐｃＧ２．ｐｃ
ｃ４．ｐＣＥ５２．ｐＣＥ５３゜ｐＣＥ５４．ｐｃＧｌ
ｌまたはｐｃＢｌｏｌと名付けたプラスミドであること
を特徴とする特許請求の範囲第７項記載の方法。
ウム属に属する微生物由来のｐｃＧｌ、ｐｃＧ２．ｐｃ
ｃ４．ｐＣＥ５２．ｐＣＥ５３゜ｐＣＥ５４．ｐｃＧｌ
ｌまたはｐｃＢｌｏｌと名付けたプラスミドであること
を特徴とする特許請求の範囲第７項記載の方法。
（９）該宿主菌株がコリネバクテリウム・グルクミクム
、コリネバクテリウム・ハーキュリス、ブレビバクテリ
ウム・フラバムおよびブレビバクテリウム・ラクトフア
ーメンクムからえらばれることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の方法。
、コリネバクテリウム・ハーキュリス、ブレビバクテリ
ウム・フラバムおよびブレビバクテリウム・ラクトフア
ーメンクムからえらばれることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の方法。
（１０）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属する微生物由来のフェニールアラニン生成に関
与する遺伝子を含むＤＮＡ断片または該ＤＮＡ断片を含
む組換え体ＤＮＡ。
ム属に属する微生物由来のフェニールアラニン生成に関
与する遺伝子を含むＤＮＡ断片または該ＤＮＡ断片を含
む組換え体ＤＮＡ。
（１１）該遺伝子がコリスミン酸ミュクーセおよび／ま
たはプレフェン酸デヒドラクーゼの合成に関与する遺伝
子であることを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載
のＤＮＡ断片。
たはプレフェン酸デヒドラクーゼの合成に関与する遺伝
子であることを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載
のＤＮＡ断片。
り１２）宿主にフェニールアラニン、チロシンまたはそ
れらのアナログに対する耐性を付与することができるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載のＤＮＡ断
片。
れらのアナログに対する耐性を付与することができるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載のＤＮＡ断
片。
（１３）両端がＢａｍＨＩによる切断部位であり、分子
中に旧ｎｄＩＩＩ 、 ＢｃｏＲＩおよびＳａｌ Ｉ
ニよる切断部位があり、かつ分子長が約９．４ Ｋ ｂ
であることを特徴とする特許請求の範囲第１１項記載の
ＤＮＡ断片。
中に旧ｎｄＩＩＩ 、 ＢｃｏＲＩおよびＳａｌ Ｉ
ニよる切断部位があり、かつ分子長が約９．４ Ｋ ｂ
であることを特徴とする特許請求の範囲第１１項記載の
ＤＮＡ断片。
（１４）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属する微生物由来のフェニールアラニン生成に関
与する遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組
換え体を含むコリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属する微生物。
ム属に属する微生物由来のフェニールアラニン生成に関
与する遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組
換え体を含むコリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属する微生物。
（１５）コリネバクテリウム・グルタミクムに３９゜Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−７０８８゜
ＥＲＭ Ｐ−７０８８゜
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） フェニールアラニン生成に関与する遺伝子を含
むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用
いコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に
属する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換して得ら
れる形質転換株を培地に培養し、培養物中にフェニール
アラニンを生成蓄積せしめ、該培養物からフェニールア
ラニンを採取することを特徴とするフェニールアラニン
の製造法。 （２）該遺伝子を含むＤＮＡ断片が原核生物由来である
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 （３）該原核生物が細菌であることを特徴とする特許請
求の範囲第２項記載の方法。 （４） 該細菌がエソシェリヒア属、コリネバクテリウ
ム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属。 スタフィロコッカス属およびセラチア属から選ばれるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の方法。 １５１ Ｍ１ｍ菌がフェニールアラニン、チロシンまた
はそれらのアナログに耐性であることを特徴とする特許
請求の範囲第４項記載の方法。 （６）該細菌がコリネバクテリウム・グルタミクムのバ
ラフルオロ・フェニールアラニン耐性株であることを特
徴とする特許請求の範囲第５項記載の方法。 （７）該ベクターがコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属細菌中で自律複製できる微生物由来のプ
ラスミド、ファージまたはその誘導体であることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 （８） 該プラスミドおよびその誘導体がコリネバクテ
リウム属に属する微生物由来のｐｃｃｌ、ｐＣＧ、２．
ｐＣＧ４．ｐＣＥ５２．ｐＣＥ５３゜ｐ’ｃＥ５ｔ、ｐ
ＣＧＩＩまたはｐｃＢｌｏｌと名付けたプラスミドであ
ることを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の方法。 （９） 該宿主菌株がコリネバクテリウム・グルタミク
ム、コリネバクテリウム・ハーキュリス、ブレビバクテ
リウム・フラバムおよびブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタムからえらばれることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の方法。 α０） コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属する微生物由来のフェニールアラニン生成に関
与する遺伝子を含むＤＮＡ断片または該ＤＮＡ断片を含
む組換え体ＤＮＡ。 αＤ 該遺伝子がコリスミン酸合成酵素および／または
ブレフェン酸脱水素酵素の合成に関与する遺伝子である
ことを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載のＤＮＡ
断片。 ω 宿主にフェニールアラニン、チロシンまたはそれら
のアナログに対する耐性を付与することができることを
特徴とする特許請求の範囲第１０項記載のＤＮＡ断片。 ａｆｆｌ 両端がＢａｍＨＩによる切断部位であり、分
子中にＨｉｎｄＩ［［、ＥｃｏＲＩおよび５ａｌＩによ
る切断部位があり、かつ分子長が約９．４ Ｋ ｂであ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１１項記載のＤＮ
Ａ断片。 Ｑ４） コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属する微生物由来のフェニールアラニン生成に関
与する遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組
換え体を含むコリネバクテリウム属またブレビバクテリ
ウム属に属する微生物。 ■ コリネバクテリウム・グルタミクムに３９゜ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−７０８８゜
Priority Applications (25)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58094392A JPH0732710B2 (ja) | 1983-05-28 | 1983-05-28 | フエニ−ルアラニンの製造法 |
| EP89108172A EP0332234B1 (en) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Process for preparing l-tyrosine |
| AT89108172T ATE92103T1 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur herstellung von l-tyrosin. |
| DE1984900870 DE136359T1 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Herstellungsverfahren fuer aminosaeuren. |
| AT89108164T ATE89316T1 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur herstellung von l-isoleucin. |
| PCT/JP1984/000047 WO1984003301A1 (en) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Process for preparing amino acid |
| AT89108165T ATE95838T1 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur herstellung von l-phenylalanin. |
| EP89108165A EP0336452B1 (en) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Process for preparing l-phenylalanine |
| EP89108171A EP0332233B1 (en) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Process for preparing L-arginine |
| DE89108171T DE3486232T2 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur Herstellung von L-Arginin. |
| AT89108171T ATE96170T1 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur herstellung von l-arginin. |
| EP84900870A EP0136359B1 (en) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Process for preparing l-histidine |
| DE89108164T DE3486147T2 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin. |
| DE89108172T DE3486188T2 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur Herstellung von L-Tyrosin. |
| DE8484900870T DE3484378D1 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Herstellungsverfahren fuer l-histidin. |
| AU25721/84A AU568340B2 (en) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Process for preparing amino acid |
| EP89108164A EP0334391B1 (en) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Process for preparing l-isoleucine |
| AT84900870T ATE62272T1 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Herstellungsverfahren fuer l-histidin. |
| DE89108165T DE3486229T2 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin. |
| CA000455139A CA1221928A (en) | 1983-05-28 | 1984-05-25 | Process for producing phenylalanine |
| ES532859A ES532859A0 (es) | 1983-05-28 | 1984-05-25 | Un procedimiento para producir fenilalanina |
| IT67541/84A IT1178948B (it) | 1983-05-28 | 1984-05-28 | Procedimento per la produzione di fenilanina |
| MX84937U MX7638E (es) | 1983-05-28 | 1984-05-28 | Procedimiento biotecnologico para la preparacion de fenilalanina |
| IL71944A IL71944A (en) | 1983-05-28 | 1984-05-28 | Process for producing l-phenylalanine by corynebacterium and brevibacterium,expression vectors and transformed host microorganisms involved in the process |
| US07/281,920 US4908312A (en) | 1983-05-28 | 1988-12-07 | Process for producing phenylananine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58094392A JPH0732710B2 (ja) | 1983-05-28 | 1983-05-28 | フエニ−ルアラニンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6024192A true JPS6024192A (ja) | 1985-02-06 |
| JPH0732710B2 JPH0732710B2 (ja) | 1995-04-12 |
Family
ID=14109000
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58094392A Expired - Lifetime JPH0732710B2 (ja) | 1983-02-17 | 1983-05-28 | フエニ−ルアラニンの製造法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4908312A (ja) |
| JP (1) | JPH0732710B2 (ja) |
| CA (1) | CA1221928A (ja) |
| ES (1) | ES532859A0 (ja) |
| IL (1) | IL71944A (ja) |
| IT (1) | IT1178948B (ja) |
| MX (1) | MX7638E (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60210993A (ja) * | 1984-04-04 | 1985-10-23 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
| JPS61260892A (ja) * | 1985-05-14 | 1986-11-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−フエニルアラニンの製造法 |
| JPS62143682A (ja) * | 1985-12-16 | 1987-06-26 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ―チロシン又はｌ―フェニルアラニンの製造法 |
| JPS6324894A (ja) * | 1986-07-16 | 1988-02-02 | Ajinomoto Co Inc | アミノ酸の製造法及びアミノ酸生産菌 |
| US4970157A (en) * | 1986-08-12 | 1990-11-13 | Sagami Chemical Research Center | Isolated phenylalanine dehydrogenase gene and process for production of phenylalanine dehydrogenase |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3078312B2 (ja) * | 1990-11-22 | 2000-08-21 | 協和醗酵工業株式会社 | 物質の製造法 |
| US5168056A (en) * | 1991-02-08 | 1992-12-01 | Purdue Research Foundation | Enhanced production of common aromatic pathway compounds |
| US5776736A (en) * | 1992-12-21 | 1998-07-07 | Purdue Research Foundation | Deblocking the common pathway of aromatic amino acid synthesis |
| US5629181A (en) * | 1993-09-16 | 1997-05-13 | Purdue Research Foundation | Synthesis of catechol from biomass-derived carbon sources |
| US5487987A (en) * | 1993-09-16 | 1996-01-30 | Purdue Research Foundation | Synthesis of adipic acid from biomass-derived carbon sources |
| CA2319283A1 (en) | 1999-09-20 | 2001-03-20 | Kuniki Kino | Method for producing l-amino acids by fermentation |
| JP4245746B2 (ja) | 1999-09-20 | 2009-04-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 発酵法によるアミノ酸の製造法 |
| US6627232B1 (en) * | 2000-06-09 | 2003-09-30 | Mars Incorporated | Method for extracting cocoa procyanidins |
| BRPI0510746A (pt) * | 2004-06-10 | 2007-11-20 | Univ Michigan State | sìntese de caprolactama a partir de lisina |
| WO2008103366A2 (en) * | 2007-02-20 | 2008-08-28 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Catalytic deamination for carprolactam production |
| JP2011529087A (ja) * | 2008-07-24 | 2011-12-01 | ドラス コーポレイション | 環状アミドモノマーを作製する方法、ならびに関連する誘導体および方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS561890A (en) * | 1979-06-15 | 1981-01-10 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-phenylalanine by fermentation |
| JPS56160997A (en) * | 1980-05-16 | 1981-12-11 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-lysine by fermenaition method |
| JPS57186496A (en) * | 1981-05-11 | 1982-11-16 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-threonine by fermentation |
| JPS58893A (ja) * | 1981-06-25 | 1983-01-06 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3660235A (en) * | 1969-08-22 | 1972-05-02 | Ajinomoto Kk | Method for producing phenylalanine by fermentation |
| GB2076853B (en) * | 1980-04-17 | 1983-12-21 | Ajinomoto Kk | L-glutamic acid producing microorganisms |
| JPS57183799A (en) * | 1981-04-17 | 1982-11-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Novel plasmid |
| IL67510A (en) * | 1981-12-17 | 1988-08-31 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Recombinant vector plasmids autonomously replicable in microorganisms belonging to the genus corynebacterium or brevibacterium and process for the production thereof |
| JPS58126789A (ja) * | 1981-12-29 | 1983-07-28 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | レースレオニンの製造法 |
| JPS58179497A (ja) * | 1982-04-10 | 1983-10-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 発酵法によるｌ−ヒスチジンの製造法 |
| ES522029A0 (es) * | 1982-05-04 | 1984-07-16 | Ajinomoto Kk | Procedimiento para preparar un plasmido compuesto. |
| JPS58192900A (ja) * | 1982-05-04 | 1983-11-10 | Ajinomoto Co Inc | 複合プラスミド |
| US4601983A (en) * | 1983-06-15 | 1986-07-22 | Ajinomoto Co., Inc. | Coryneform bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-threonine and L-isoleucine |
| US4591562A (en) * | 1983-08-02 | 1986-05-27 | Ajinomoto Company Incorporated | Method for producing L-phenylalanine by fermentation |
-
1983
- 1983-05-28 JP JP58094392A patent/JPH0732710B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1984
- 1984-05-25 CA CA000455139A patent/CA1221928A/en not_active Expired
- 1984-05-25 ES ES532859A patent/ES532859A0/es active Granted
- 1984-05-28 MX MX84937U patent/MX7638E/es unknown
- 1984-05-28 IT IT67541/84A patent/IT1178948B/it active
- 1984-05-28 IL IL71944A patent/IL71944A/xx unknown
-
1988
- 1988-12-07 US US07/281,920 patent/US4908312A/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS561890A (en) * | 1979-06-15 | 1981-01-10 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-phenylalanine by fermentation |
| JPS56160997A (en) * | 1980-05-16 | 1981-12-11 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-lysine by fermenaition method |
| JPS57186496A (en) * | 1981-05-11 | 1982-11-16 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-threonine by fermentation |
| JPS58893A (ja) * | 1981-06-25 | 1983-01-06 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法 |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60210993A (ja) * | 1984-04-04 | 1985-10-23 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
| JPS61260892A (ja) * | 1985-05-14 | 1986-11-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−フエニルアラニンの製造法 |
| JPS62143682A (ja) * | 1985-12-16 | 1987-06-26 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ―チロシン又はｌ―フェニルアラニンの製造法 |
| JPH0571237B2 (ja) * | 1985-12-16 | 1993-10-06 | Ajinomoto Kk | |
| JPS6324894A (ja) * | 1986-07-16 | 1988-02-02 | Ajinomoto Co Inc | アミノ酸の製造法及びアミノ酸生産菌 |
| US4970157A (en) * | 1986-08-12 | 1990-11-13 | Sagami Chemical Research Center | Isolated phenylalanine dehydrogenase gene and process for production of phenylalanine dehydrogenase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0732710B2 (ja) | 1995-04-12 |
| IL71944A0 (en) | 1984-09-30 |
| ES8602941A1 (es) | 1985-12-01 |
| IT8467541A1 (it) | 1985-11-28 |
| CA1221928A (en) | 1987-05-19 |
| US4908312A (en) | 1990-03-13 |
| ES532859A0 (es) | 1985-12-01 |
| IT1178948B (it) | 1987-09-16 |
| IT8467541A0 (it) | 1984-05-28 |
| MX7638E (es) | 1990-05-16 |
| IL71944A (en) | 1990-08-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO1984003301A1 (en) | Process for preparing amino acid | |
| KR900004426B1 (ko) | L-티로신의 제조방법 | |
| JPS6012995A (ja) | 発酵法によるｌ―スレオニン及び／又はｌ―イソロイシンの製造法 | |
| Falcone et al. | Complementation analysis and regulation of CO2 fixation gene expression in a ribulose 1, 5-bisphosphate carboxylase-oxygenase deletion strain of Rhodospirillum rubrum | |
| JPS6024192A (ja) | フエニ−ルアラニンの製造法 | |
| JP3369231B2 (ja) | 芳香族アミノ酸の製造法 | |
| JPH10512742A (ja) | コリネ型細菌中で遺伝子発現を調節するｄｎａ | |
| JPH0783714B2 (ja) | 発酵法によるｌ―アミノ酸の製造法 | |
| KR900009052B1 (ko) | 락토스를 동화시킬 수 있는 신규 미생물 | |
| WO2001005939A1 (fr) | Procede de production d'une substance cible par fermentation | |
| JP2656300B2 (ja) | Ｌ−トリプトファンの製造法 | |
| KR970001238B1 (ko) | L-트립토판의 제조방법 | |
| KR900004425B1 (ko) | L-아르기닌의 제조방법 | |
| CA1225051A (en) | Process for producing tryptophan | |
| JPH0523750B2 (ja) | ||
| US4968609A (en) | Coryneform bacteria carrying recombinant DNA and a process for producing aromatic amino acids using said bacteria | |
| CA1218025A (en) | Process for producing histidine | |
| KR940005580B1 (ko) | 미생물 배양에 의한 물질의 제조방법 | |
| KR900004424B1 (ko) | 아미노산의 제조방법 | |
| JPH05184366A (ja) | アスパルトキナーゼをコードする遺伝子ｄｎａ及びその利用 | |
| JPS62186795A (ja) | アミノ酸の製造法 | |
| JPS61260892A (ja) | Ｌ−フエニルアラニンの製造法 | |
| JPH0732711B2 (ja) | Ｌ−イソロイシンの製造法 | |
| JPS62232392A (ja) | Ｌ−スレオニンおよびｌ−イソロイシンの製造法 | |
| JPH01104160A (ja) | 遺伝子組換え大腸菌及びそれを用いるｌ‐フエニルアラニンの製造方法 |