JPS6324894A - アミノ酸の製造法及びアミノ酸生産菌 - Google Patents
アミノ酸の製造法及びアミノ酸生産菌Info
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- JPS6324894A JPS6324894A JP61167534A JP16753486A JPS6324894A JP S6324894 A JPS6324894 A JP S6324894A JP 61167534 A JP61167534 A JP 61167534A JP 16753486 A JP16753486 A JP 16753486A JP S6324894 A JPS6324894 A JP S6324894A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は遺伝子の新規形質発現方法によジアミノ酸を製
造する方法及び新規微生物に関与する。
造する方法及び新規微生物に関与する。
さらに詳細には本発明はＮ−カルバミルアミノ酸に作用
し対応するアミノ酸に変換する酵素に関与する遺伝子を
含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを
用いエシェリヒア属、シュードモナス属、フラがバクテ
リウム属、バチルス属、セラチア属、コリネバクテリウ
ム属、ブレビバクテリウム属に属する微生物から選ばれ
る宿主菌株を形質転換して得られる形質転換株を培地に
培養し培養物とＮ−カルバミルアミノ酸を水性媒体中で
保ｉし対応するアミノ酸を生成蓄積せしめ、アミノ酸を
採取することを特徴とするアミノ酸の製造法及び創製し
た新規微生物に関する。
し対応するアミノ酸に変換する酵素に関与する遺伝子を
含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを
用いエシェリヒア属、シュードモナス属、フラがバクテ
リウム属、バチルス属、セラチア属、コリネバクテリウ
ム属、ブレビバクテリウム属に属する微生物から選ばれ
る宿主菌株を形質転換して得られる形質転換株を培地に
培養し培養物とＮ−カルバミルアミノ酸を水性媒体中で
保ｉし対応するアミノ酸を生成蓄積せしめ、アミノ酸を
採取することを特徴とするアミノ酸の製造法及び創製し
た新規微生物に関する。
アミノ酸は従来よシ飼料・食品添加剤、化粧品、医薬な
どの原料として広く用いられている。
どの原料として広く用いられている。
従来、醗酵によるアミノ酸生産が行われているが、醗酵
液からのアミノ酸採取コヌト、アミノ酸採取後の醗酵液
の廃棄法等に問題があシ、酵素を使用したアミノ酸の製
造法が注目されて・きた。
液からのアミノ酸採取コヌト、アミノ酸採取後の醗酵液
の廃棄法等に問題があシ、酵素を使用したアミノ酸の製
造法が注目されて・きた。
酵素を用いたアミノ酸の製法には化学的に安価に合成さ
れるヒダントイン化合物類を出発物質としてこれを光学
活性なアミノ酸にまで不斉水解する方法が知られている
。この反応は中・１間体として、Ｎ−カルバミルｌアミ
ノ酸を経由し、このＮ−カルバミルｌアミノ酸を水解す
る過程を含んでいる。
れるヒダントイン化合物類を出発物質としてこれを光学
活性なアミノ酸にまで不斉水解する方法が知られている
。この反応は中・１間体として、Ｎ−カルバミルｌアミ
ノ酸を経由し、このＮ−カルバミルｌアミノ酸を水解す
る過程を含んでいる。
この過程を触媒する酵素にはブレビバクテリウム属、シ
ュードモナス属、バチルス属に属する微生物起元のそれ
が知られていて、アミノ酸生産にはこれらの微生物を培
養した培養物とＮ−カルバミルｌアミノ酸を水性媒体中
で保温し、生成蓄積するアミノ酸を採取する方法があっ
た。
ュードモナス属、バチルス属に属する微生物起元のそれ
が知られていて、アミノ酸生産にはこれらの微生物を培
養した培養物とＮ−カルバミルｌアミノ酸を水性媒体中
で保温し、生成蓄積するアミノ酸を採取する方法があっ
た。
このＮ−カルバミルアミノ酸を対応するアミノ酸に変換
する酵素の供給源としては７うざバクテ細菌が知られて
いるが、いずれも酵素生産量が士。
する酵素の供給源としては７うざバクテ細菌が知られて
いるが、いずれも酵素生産量が士。
分でなく、酵素の生産に高価なヒダントイン化合物類ま
たはＮ−カルバミルｌアミノ酸類が必要、である、など
の欠点を有していた。
たはＮ−カルバミルｌアミノ酸類が必要、である、など
の欠点を有していた。
本発明はこのような問題点を解決すべく酵素の生産性が
高い微生物を創製するとともに、このようにして得られ
た酵素源を使用し、アミノ酸を効率よく生産することを
目的として行われた。また目的の酵素の遺伝子またはベ
クターを含む組み換え体ＤＮＡを導入して該目的遺伝子
の形質を２発現させた例は今まで全く知られていない。
高い微生物を創製するとともに、このようにして得られ
た酵素源を使用し、アミノ酸を効率よく生産することを
目的として行われた。また目的の酵素の遺伝子またはベ
クターを含む組み換え体ＤＮＡを導入して該目的遺伝子
の形質を２発現させた例は今まで全く知られていない。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明はＮ−カルバミル−アミノ酸に作用し対応するア
ミノ酸に変換する酵素に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断
片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡヲ用いエシェリ
ヒア属、シュードモナス属、フラがバクテリウム属、バ
チルス属、セラチア属、＝リネパクテリウム属、ブレビ
パフチリウム属に属する微生物から選ばれる宿主菌株を
形質転換して得られる形質転換株を培地に培養し、培養
物とＮ−カルバミルｌアミノ酸を水性媒体中で保温させ
対応するアミノ酸を製造する方法を提供する・本発明に
用いる遺伝子を含むＤＮＡ断片としては、真核生物、原
核生物、ウィルス、バクテリオファーソまたはグラヌミ
ドに由来しＮ−カルバミルｌアミノ酸に作用し、対応す
るアミノ酸を生成する酵素に関与する遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片があげられる。原核生物に由来する遺伝子として
は細菌とくに７２？バクテリウム属、シュードモナス属
およびバチルス属に属する細菌の菌株に由来する遺伝子
で、 Ｎ−カルバミルｌアミノ酸に作用し対応するアミ
ノ酸を生成する酵素の生成に係る遺伝子が好適にあげら
れる。
ミノ酸に変換する酵素に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断
片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡヲ用いエシェリ
ヒア属、シュードモナス属、フラがバクテリウム属、バ
チルス属、セラチア属、＝リネパクテリウム属、ブレビ
パフチリウム属に属する微生物から選ばれる宿主菌株を
形質転換して得られる形質転換株を培地に培養し、培養
物とＮ−カルバミルｌアミノ酸を水性媒体中で保温させ
対応するアミノ酸を製造する方法を提供する・本発明に
用いる遺伝子を含むＤＮＡ断片としては、真核生物、原
核生物、ウィルス、バクテリオファーソまたはグラヌミ
ドに由来しＮ−カルバミルｌアミノ酸に作用し、対応す
るアミノ酸を生成する酵素に関与する遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片があげられる。原核生物に由来する遺伝子として
は細菌とくに７２？バクテリウム属、シュードモナス属
およびバチルス属に属する細菌の菌株に由来する遺伝子
で、 Ｎ−カルバミルｌアミノ酸に作用し対応するアミ
ノ酸を生成する酵素の生成に係る遺伝子が好適にあげら
れる。
本発明に用いるベクターとしては、宿主菌細胞内で自律
増殖できるものであればいずれのベクターでもかまわな
い。また酵素の生産量を上昇させるために強力な構造プ
ロモーターをもつように改質したベクターなどを使用す
ることもできる。
増殖できるものであればいずれのベクターでもかまわな
い。また酵素の生産量を上昇させるために強力な構造プ
ロモーターをもつように改質したベクターなどを使用す
ることもできる。
遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組み換え
体の炸裂は、公知の試験管内組み換えＤＮＡ技法を駆使
することにより実施できる。
体の炸裂は、公知の試験管内組み換えＤＮＡ技法を駆使
することにより実施できる。
試験管内のＤＮＡ組み換えは、通常、目的の遺伝子を含
む供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡの切断と結合（リガー
ゼ反応〕によシ行われる（特願昭５６−２１１９０８号
、ＵＳＰ ４，２３７，２２４参照〕。
む供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡの切断と結合（リガー
ゼ反応〕によシ行われる（特願昭５６−２１１９０８号
、ＵＳＰ ４，２３７，２２４参照〕。
リガーゼ反応によシ目的の組み換え体以外に他の組み換
え体も生成するが、目的の組み換え体を取得するにはこ
のＤＮＡ混成液を用いてエシェリヒア属、シュードモナ
ス属、フラボパフチリウム属、的の遺伝子の遺伝情報に
由来する遺伝形質を付与された形質転換株を選択分離し
、その培養菌体から抽出単離することによって達成でき
る。
え体も生成するが、目的の組み換え体を取得するにはこ
のＤＮＡ混成液を用いてエシェリヒア属、シュードモナ
ス属、フラボパフチリウム属、的の遺伝子の遺伝情報に
由来する遺伝形質を付与された形質転換株を選択分離し
、その培養菌体から抽出単離することによって達成でき
る。
前記属菌種を直接形質転換しないで例えば大腸菌のよう
な他の微生物の宿主ベクター系にて目的の遺伝子を一旦
クローン化し、しかる後に適当なベクターとの組み換え
体を試鉄管内で炸裂してから前記属菌種を形質転換し前
記と同様に形質転換株を選択分離しても組み換え体を取
得できる。
な他の微生物の宿主ベクター系にて目的の遺伝子を一旦
クローン化し、しかる後に適当なベクターとの組み換え
体を試鉄管内で炸裂してから前記属菌種を形質転換し前
記と同様に形質転換株を選択分離しても組み換え体を取
得できる。
組み換え体製造のためには下記文献の記載が広く応用で
きる。
きる。
Ｓ、ＩＮ、 Ｃｏｈｅｎ、 ａｔ ａｌ、 Ｕ、Ｓ、
Ｐａｔ＠ｎｔ ４．２３７，２２４％遺遺伝子操作実験
法〔高木東歌編著、講談社すイエンティフィ、り（１９
８０））、Ｍ＠ｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
Ｌａ、 Ｒ＠ｅｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、 ｅｄｉｔ
＠ｄ ｂｙ Ｒａｙ Ｍｕ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓ
ｓ １９７９．特願昭５６−２１１９０８゜形質転換株
は通常の栄養培地に培養することにより導入した組み換
え体ＤＮＡの一形質を発現させることができる。組み換
え体ＤＮＡに遺伝子ＤＮＡまたはベクターＤＮＡ由来の
性質が付与されている場合は、その性質にあわせて培地
に薬剤を補ってもかまわない。
Ｐａｔ＠ｎｔ ４．２３７，２２４％遺遺伝子操作実験
法〔高木東歌編著、講談社すイエンティフィ、り（１９
８０））、Ｍ＠ｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
Ｌａ、 Ｒ＠ｅｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、 ｅｄｉｔ
＠ｄ ｂｙ Ｒａｙ Ｍｕ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓ
ｓ １９７９．特願昭５６−２１１９０８゜形質転換株
は通常の栄養培地に培養することにより導入した組み換
え体ＤＮＡの一形質を発現させることができる。組み換
え体ＤＮＡに遺伝子ＤＮＡまたはベクターＤＮＡ由来の
性質が付与されている場合は、その性質にあわせて培地
に薬剤を補ってもかまわない。
このようにして得られた形質転換株を醇素源として得る
のには、通常の培地を用いて培養を行えばよいが必要に
応じてヒメントイン化合物・Ｎ−カルバミルｌアミノ酸
・ＩＰＴＯなどの添加、温度上昇等酵素誘導のための処
理を行うこともできる。
のには、通常の培地を用いて培養を行えばよいが必要に
応じてヒメントイン化合物・Ｎ−カルバミルｌアミノ酸
・ＩＰＴＯなどの添加、温度上昇等酵素誘導のための処
理を行うこともできる。
本微生物の培養のために用いられる培地は通常炭素源、
窒素源、無機イオンを含有する通常の培地である。更に
ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると望
ましい結果が得られる場合が多い。
窒素源、無機イオンを含有する通常の培地である。更に
ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると望
ましい結果が得られる場合が多い。
炭素源としては、グルコース、シークロース等の炭水化
物、酢酸等の有機酸、アルコール類、その他が適宜使用
される。窒素源としては、アンそニアガヌ、アンモニア
水、アンモニウム塩、その他が用いられる。無機イオン
としては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリイオ
ン、鉄イ；ン、その他が必要、に応じ適宜使用される。
物、酢酸等の有機酸、アルコール類、その他が適宜使用
される。窒素源としては、アンそニアガヌ、アンモニア
水、アンモニウム塩、その他が用いられる。無機イオン
としては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリイオ
ン、鉄イ；ン、その他が必要、に応じ適宜使用される。
培養は好気的条件下に−４ないし８、温度２５ないし４
５℃の適当な範囲に制御しつつ工ないし１０日培養を行
えば望ましい結果が得られる。
５℃の適当な範囲に制御しつつ工ないし１０日培養を行
えば望ましい結果が得られる。
菌体としては、培養終了後の培養液そのまま、培養液よ
り分離された菌体、洗浄された菌体などいずれも使用可
能である。菌体処理物としては凍結乾燥菌体、アセトン
乾燥菌体、トルエン、界面活性剤等と接触せしめた菌体
、リゾチームで処理した菌体、超音波にさらした菌体、
機械的に摩砕した菌体等のほか、これら菌体処理物から
得られたＮ−カルバミルガアミノ酸を対応するアミノ酸
に変換する酵素活性を有する酵素蛋白区分、更には、こ
れらの菌体の固定化物、菌体処理物の不溶化物、その他
いずれも使用できる。
り分離された菌体、洗浄された菌体などいずれも使用可
能である。菌体処理物としては凍結乾燥菌体、アセトン
乾燥菌体、トルエン、界面活性剤等と接触せしめた菌体
、リゾチームで処理した菌体、超音波にさらした菌体、
機械的に摩砕した菌体等のほか、これら菌体処理物から
得られたＮ−カルバミルガアミノ酸を対応するアミノ酸
に変換する酵素活性を有する酵素蛋白区分、更には、こ
れらの菌体の固定化物、菌体処理物の不溶化物、その他
いずれも使用できる。
水溶性媒体としては、水、バッファーおよびエタノール
等の有機溶媒を含むものが使用できる。
等の有機溶媒を含むものが使用できる。
更に必要に応じて、微生物の生育に必要な栄養素、抗酸
化剤、界面活性剤、補酵素、ヒドロキシルアミンおよび
金属イオン等を水性媒体に添加することもできる。
化剤、界面活性剤、補酵素、ヒドロキシルアミンおよび
金属イオン等を水性媒体に添加することもできる。
上記微生物の菌体を水溶性媒体中で培養しながら、菌体
とＮ−カルバミルＩアミノ酸を接触せしめて作用せしめ
る場合には、Ｎ−カルバミルガアミノ酸を含み、かつ微
生物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオンなどの
栄養素を含む水性媒体が用いられる。更にビタミン、ア
ミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると望ましい結果が
得られる場合が多い。
とＮ−カルバミルＩアミノ酸を接触せしめて作用せしめ
る場合には、Ｎ−カルバミルガアミノ酸を含み、かつ微
生物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオンなどの
栄養素を含む水性媒体が用いられる。更にビタミン、ア
ミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると望ましい結果が
得られる場合が多い。
炭素ｓ−トじてハ、グルコース、シュクロース等の炭水
化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、その他が適宜使
用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニ
ア水、アンモニウム塩、その他が用いられる。無機イオ
ンとしては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリイ
オン、鉄イオン、その他が必要に応じ適宜使用される。
化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、その他が適宜使
用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニ
ア水、アンモニウム塩、その他が用いられる。無機イオ
ンとしては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリイ
オン、鉄イオン、その他が必要に応じ適宜使用される。
培養に好気的条件下に、ｐ）１４ないし８、温度２５な
いし４５℃の適当な範囲に制御しつつ行えば望ましい結
果が得られる。
いし４５℃の適当な範囲に制御しつつ行えば望ましい結
果が得られる。
かくして工ないし１０日間も培養を行えば、Ｎ−カルバ
ミルＨアミノ酸はアミノ酸のみに効率よく変換される。
ミルＨアミノ酸はアミノ酸のみに効率よく変換される。
これに対し、上記微生物の培養液をそのまま、培養菌体
あるいは菌体処理物をＮ−カルバミルガアミノ酸と接触
せしめて作用せしめる場合には、Ｎ−カルバミルＨアミ
ノ酸と培養液、培養菌体あるいは菌体処理物を溶解また
は懸濁した水性媒体を１０℃ないし７０℃の適当な温度
に調節し−を４ないし９．５に保ちつつ、暫時静置また
は攪拌すればよい。かくして５ないし１００時間も経過
すれば水性媒体中に多量のアミノ酸が生成蓄積される。
あるいは菌体処理物をＮ−カルバミルガアミノ酸と接触
せしめて作用せしめる場合には、Ｎ−カルバミルＨアミ
ノ酸と培養液、培養菌体あるいは菌体処理物を溶解また
は懸濁した水性媒体を１０℃ないし７０℃の適当な温度
に調節し−を４ないし９．５に保ちつつ、暫時静置また
は攪拌すればよい。かくして５ないし１００時間も経過
すれば水性媒体中に多量のアミノ酸が生成蓄積される。
またＮ−カルバミルＩアミノ酸は反応の進行に伴って分
割添加してもよい。
割添加してもよい。
尚Ｎ−カルバミルＩアミノ酸は２つの光学異性体を含む
が本酵素の光学特異性を利用し、未変換で残った一方の
光学異性体を常法でアミノ酸に変換することによりＬ体
り体のアミノ酸を別々に取得することも可能である。
が本酵素の光学特異性を利用し、未変換で残った一方の
光学異性体を常法でアミノ酸に変換することによりＬ体
り体のアミノ酸を別々に取得することも可能である。
ノ酸アナライデーを用いて測定した。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１
フンゲバクテリウム・アミノグネスＡＪ３９１２（ＦＥ
ＲＭ−Ｐ３１３３）由来のＮ−力ルパミルアミノ酸の対
応するアミノ酸への変換に関与する遺伝子のクローン化 （１）７う？バクテリウム・・アミノグネスＡＪ ３９
１２（ＦＥＲＭ−Ｐ ３１３３ ） の全ＤＮＡの抽
出；４００１ＬｌのＬ−Ｂｒｏｔｈ（Ｐｅｐｔｏｎｅ
１０９／Ｉ％Ｙ＠ａｓｔ＊ｘｔｒａｅｔ ５り／）、Ｎ
＆ＣＪ ５ｐ／ｌ ｐＨ７，ｏ ）に７ラゴバクテリウ
ム、・アミノダネスＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ−３１
３３）を培養し、対数増殖期の菌体ｌ〜２ｐを得た。こ
れに６ ｄ ＯＴＥＳＳ ｂｕｆｆｅｒ （３０ｍＭ
Ｔｒｉｍ、５ｍＭ ＥＤＴＡ５０ｍＭ ＮａＣ） ２５
チ（φ） ５ｕｃｒｏｓａ Ｐ）（８，０）を加えよく
懸濁した。これにＬｙｓｏｚｙｍｅを５１Ｆ９／ＩＩＬ
／になるようにＴＥＳＳ ｂｕｆｆｅｒに溶かした溶液
を２１１Ｌｌ添加し、３７℃で１時間放置した。さらに
プロナーゼＥをＴＥＳＳ ｂｕｆｆ＠ｒで５９／ａ／の
溶液にしたものを１ｄ゛加え３７℃１時間放置した。１
０％のＳＤＳ溶液を１ｄ加えよくかくはんした後に等容
の水飽和フェノールを加えかくはん後装置し、下層を別
容器にうりした。再び等容の水飽和フェノールを加え同
様の操作を行い、下層の溶液にエタノールを等容加え、
ゆるやかに混合した。この操作によってＤＮＡが析出し
たのでこれを別容器にとＦ） 、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（
１０ｍＭ Ｔｒｉｍ １ｍＭ ＥＤＴＡ ｐ）４８．
０ ）で透析した。これら操作によってフラがバクテリ
ウム・アミノグネスＡＪ ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ ３
１３３）の全ＤＮＡが得られた。
ＲＭ−Ｐ３１３３）由来のＮ−力ルパミルアミノ酸の対
応するアミノ酸への変換に関与する遺伝子のクローン化 （１）７う？バクテリウム・・アミノグネスＡＪ ３９
１２（ＦＥＲＭ−Ｐ ３１３３ ） の全ＤＮＡの抽
出；４００１ＬｌのＬ−Ｂｒｏｔｈ（Ｐｅｐｔｏｎｅ
１０９／Ｉ％Ｙ＠ａｓｔ＊ｘｔｒａｅｔ ５り／）、Ｎ
＆ＣＪ ５ｐ／ｌ ｐＨ７，ｏ ）に７ラゴバクテリウ
ム、・アミノダネスＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ−３１
３３）を培養し、対数増殖期の菌体ｌ〜２ｐを得た。こ
れに６ ｄ ＯＴＥＳＳ ｂｕｆｆｅｒ （３０ｍＭ
Ｔｒｉｍ、５ｍＭ ＥＤＴＡ５０ｍＭ ＮａＣ） ２５
チ（φ） ５ｕｃｒｏｓａ Ｐ）（８，０）を加えよく
懸濁した。これにＬｙｓｏｚｙｍｅを５１Ｆ９／ＩＩＬ
／になるようにＴＥＳＳ ｂｕｆｆｅｒに溶かした溶液
を２１１Ｌｌ添加し、３７℃で１時間放置した。さらに
プロナーゼＥをＴＥＳＳ ｂｕｆｆ＠ｒで５９／ａ／の
溶液にしたものを１ｄ゛加え３７℃１時間放置した。１
０％のＳＤＳ溶液を１ｄ加えよくかくはんした後に等容
の水飽和フェノールを加えかくはん後装置し、下層を別
容器にうりした。再び等容の水飽和フェノールを加え同
様の操作を行い、下層の溶液にエタノールを等容加え、
ゆるやかに混合した。この操作によってＤＮＡが析出し
たのでこれを別容器にとＦ） 、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（
１０ｍＭ Ｔｒｉｍ １ｍＭ ＥＤＴＡ ｐ）４８．
０ ）で透析した。これら操作によってフラがバクテリ
ウム・アミノグネスＡＪ ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ ３
１３３）の全ＤＮＡが得られた。
（２）組み換え体の創製
（１）の方法によって得られたフラ、ｆｆノ々クテリウ
ム・アミノグネスの全ＤＮＡｌ０μノに制限酵素５ａｕ
３ＡＩを０．０１ｖμＰＤＮＡになるように添加し、３
７℃１時間反応を行い全ＤＮＡを部分分解した。一方、
別Ｋプラスミドｐａｃ１ｓを制限酵素ＢａｍＨＩで切断
したものを用意し、この両者を常法によシ結合させ多種
のプラスミドを含む混成液を得た。
ム・アミノグネスの全ＤＮＡｌ０μノに制限酵素５ａｕ
３ＡＩを０．０１ｖμＰＤＮＡになるように添加し、３
７℃１時間反応を行い全ＤＮＡを部分分解した。一方、
別Ｋプラスミドｐａｃ１ｓを制限酵素ＢａｍＨＩで切断
したものを用意し、この両者を常法によシ結合させ多種
のプラスミドを含む混成液を得た。
Ｃ６００株を形質転換した。形質転換株をアンピシリン
耐性を選択マーカーとして、選別し、目的酵素の活性を
測定した。活性測定は形質転換株をＬ−Ｂｒｏｔｈで３
７℃１６時間培養した後に１−の培せ継時的に生成する
Ｌ−ｐｈｅをアミノ酸アナライデーで定量した。
耐性を選択マーカーとして、選別し、目的酵素の活性を
測定した。活性測定は形質転換株をＬ−Ｂｒｏｔｈで３
７℃１６時間培養した後に１−の培せ継時的に生成する
Ｌ−ｐｈｅをアミノ酸アナライデーで定量した。
以上の操作で目的遺伝子をもつシラスミドが得られた。
この形質転換株を用い、シラスミドを大量調製し、マツ
ピングしたところ第１図に示す構造を有していた。
ピングしたところ第１図に示す構造を有していた。
実施例２
リヒ・コリＪＭ１０９ ＨＡ３（ＦＥＲＭ−Ｐ））。こ
の株をアンピシリン５０μｙ／ｍｌ ＩＰＴＧ ２０μ
ｐ／ｒｎｌを含むＬ−Ｂｒｏｔｈで３７℃ １６ｈ培養
した。この培養液５１１１１を遠心し、菌体を集菌し、
５０ ｍＭ ＫＰＢ（リン酸パ、ファー）（ｐＨ７，５
）で２回洗浄した後に２．５コの５０ ｍＭ ＫＰＢ（
ｐＨ７，５）を加え水冷中、遠音波破砕した。これに最
終濃度１０ｍＭになるように表１に示すＮ−カルバミル
〃アミノ酸を添加し全量を５０ ｍＭ ＫＰＢ （ｐ）
１７．５）で５ＩＩＬ／ＫＬ、３０℃で１時間反応を行
った。
の株をアンピシリン５０μｙ／ｍｌ ＩＰＴＧ ２０μ
ｐ／ｒｎｌを含むＬ−Ｂｒｏｔｈで３７℃ １６ｈ培養
した。この培養液５１１１１を遠心し、菌体を集菌し、
５０ ｍＭ ＫＰＢ（リン酸パ、ファー）（ｐＨ７，５
）で２回洗浄した後に２．５コの５０ ｍＭ ＫＰＢ（
ｐＨ７，５）を加え水冷中、遠音波破砕した。これに最
終濃度１０ｍＭになるように表１に示すＮ−カルバミル
〃アミノ酸を添加し全量を５０ ｍＭ ＫＰＢ （ｐ）
１７．５）で５ＩＩＬ／ＫＬ、３０℃で１時間反応を行
った。
この結果を表１に示す。尚定量は光学分割カラムを使用
した。
した。
表Ｉ Ｎ−カルノ々ミル〃アミノ酸の対応するアミノ酸
への変換Ｌ−Ｐｈｅ ５１．３
０Ｌ−Ｔｙｒ
４０．ＯＱＬ−Ｔｒｐ ４０．２
０Ｌ−Ｍｅｔ
１０．５ ＱＬ−Ｌ＠ｕ
１．８ ０Ｌ−Ａｌ
ａ Ｏ・３０Ｌ−１１・
１．Ｉ Ｑ
。
への変換Ｌ−Ｐｈｅ ５１．３
０Ｌ−Ｔｙｒ
４０．ＯＱＬ−Ｔｒｐ ４０．２
０Ｌ−Ｍｅｔ
１０．５ ＱＬ−Ｌ＠ｕ
１．８ ０Ｌ−Ａｌ
ａ Ｏ・３０Ｌ−１１・
１．Ｉ Ｑ
。
Ｌ−Ｐｒｏ Ｏ，Ｉ
ＱＬ−Ｈｌａ
０．１ ００−ベンジル−Ｌ−８ｅ
ｒ ９．３ ００
−メチル−Ｌ−８ｅｔ ５．６
０Ｌ−Ｖａｔ
Ｏ，７０Ｌ−Ｓ＊ｒ ２．０
０Ｌ−ＬｙｓＯ，１０ Ｌ−Ａｓｐ ０．１
０Ｌ−Ｇｌｕ Ｏ，２
０Ｇ１７ １．５
０Ｌ−Ｇｉｎ ０．４
０Ｌ−ＶＧ＊２１８．６
０中２ ３，４−シーメトキン−Ｌ−Ｐｈｅ実施
例３ リ エシェリヒア・ｗ Ｉ ＪＭ１０９ ａＡ３（ｒｇＲＭ
−ｐ）を実施例２のごとく培養し、培養液５００ｍを得
た。
ＱＬ−Ｈｌａ
０．１ ００−ベンジル−Ｌ−８ｅ
ｒ ９．３ ００
−メチル−Ｌ−８ｅｔ ５．６
０Ｌ−Ｖａｔ
Ｏ，７０Ｌ−Ｓ＊ｒ ２．０
０Ｌ−ＬｙｓＯ，１０ Ｌ−Ａｓｐ ０．１
０Ｌ−Ｇｌｕ Ｏ，２
０Ｇ１７ １．５
０Ｌ−Ｇｉｎ ０．４
０Ｌ−ＶＧ＊２１８．６
０中２ ３，４−シーメトキン−Ｌ−Ｐｈｅ実施
例３ リ エシェリヒア・ｗ Ｉ ＪＭ１０９ ａＡ３（ｒｇＲＭ
−ｐ）を実施例２のごとく培養し、培養液５００ｍを得
た。
これを実施例２同様に集菌洗浄した後に２５−の中の最
終濃度が２０ ｐ／ｌになるように一加し５０ ｍｊｉ
！ ＫＰＢ （ｐ）（７，５）で全量を５０ｔ／にした
。これを３０℃ ４８時間反応させた後に反応液をｐＨ
６，０に適当な酸を用い調製した。この溶液を遠心し上
清をＤｉａｌｏｎ ５Ｋ−ＩＢカラムに流した。非吸着
画分を２等分し、一方を適当な酸を用いｐＨ２，５Ｋ
したところＮ−カルバミル−Ｄ −Ｐｈ・が０．２３
Ｆ結晶として得られた。またもう一方の非吸着画分に塩
酸を最終ＩＮになるように加え水冷下皿硝酸を１、’２
ｍｎｏ！加え水冷下１晩放置した。これを常法によシ晶
析したところＤ−Ｐｈ＠が０．１８ ｊｌ （光学純度
９６％］得られた。また吸着画分を２〜４Ｎのアンモニ
ア水を溶出しアンモニアを減圧除去し念後常法により晶
析したところＬ−Ｐｈｅが０．４ｊｌ（光学純度９８％
〕得られた。
終濃度が２０ ｐ／ｌになるように一加し５０ ｍｊｉ
！ ＫＰＢ （ｐ）（７，５）で全量を５０ｔ／にした
。これを３０℃ ４８時間反応させた後に反応液をｐＨ
６，０に適当な酸を用い調製した。この溶液を遠心し上
清をＤｉａｌｏｎ ５Ｋ−ＩＢカラムに流した。非吸着
画分を２等分し、一方を適当な酸を用いｐＨ２，５Ｋ
したところＮ−カルバミル−Ｄ −Ｐｈ・が０．２３
Ｆ結晶として得られた。またもう一方の非吸着画分に塩
酸を最終ＩＮになるように加え水冷下皿硝酸を１、’２
ｍｎｏ！加え水冷下１晩放置した。これを常法によシ晶
析したところＤ−Ｐｈ＠が０．１８ ｊｌ （光学純度
９６％］得られた。また吸着画分を２〜４Ｎのアンモニ
ア水を溶出しアンモニアを減圧除去し念後常法により晶
析したところＬ−Ｐｈｅが０．４ｊｌ（光学純度９８％
〕得られた。
（ＦＥＲＭ−Ｐ） １９を脱イオン水４Ｍに加えて懸濁
し、氷冷したのちアクリルアミド５０ｍ９とメチレンビ
スアクリルアミド４５〜を加えて溶解させ、窒素ガスを
通じて酸素を追い出した後、過硫酸アンモエクム３．５
ダおよびＮ、Ｎ’−ツメチルアミノプロピオニトリル８
μノを加えて水冷下に静置した。１時間後、生成した画
体含有グルを５０メッシェの金網で裏ごしし、生理食塩
水で洗浄し、グル固定化に添加し、３０℃で１６ｈ反応
した。このとき生成したＬ−Ｐｈ・は１．２ Ｐ／ノで
あった。
し、氷冷したのちアクリルアミド５０ｍ９とメチレンビ
スアクリルアミド４５〜を加えて溶解させ、窒素ガスを
通じて酸素を追い出した後、過硫酸アンモエクム３．５
ダおよびＮ、Ｎ’−ツメチルアミノプロピオニトリル８
μノを加えて水冷下に静置した。１時間後、生成した画
体含有グルを５０メッシェの金網で裏ごしし、生理食塩
水で洗浄し、グル固定化に添加し、３０℃で１６ｈ反応
した。このとき生成したＬ−Ｐｈ・は１．２ Ｐ／ノで
あった。
改画面の簡忰も艶岨
第１は、Ｎ−力ましい゛ミルフ三／肢ヒ？ミノ鉄＋−夜
襖−＃ろ詐系琶ロートイる−７９う又ミドｐＵＯＫＨ＾
３の別鼓詳禾叱図。
襖−＃ろ詐系琶ロートイる−７９う又ミドｐＵＯＫＨ＾
３の別鼓詳禾叱図。
Claims (12)
- （１）Ｎ−カルバミルアミノ酸に作用し対応するアミノ
酸に変換する酵素に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片と
ベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを用いエシェリヒア
属、シュードモナス属、フラボバクテリア属、バチルス
属、セラチア属、コリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物から選ばれる宿主菌株を形
質転換して得られる形質転換株を培地に培養し、培養物
にＮ−カルバミルアミノ酸を加え水性媒体中で対応する
アミノ酸を生成蓄積せしめ、アミノ酸を採取することを
特徴とするアミノ酸の製造法。 - （２）該遺伝子を含むＤＮＡ断片が真核生物、原核生物
、ウィルス、バクテリオファージまたはプラスミド由来
であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
法。 - （３）該原核生物が細菌であることを特徴とする特許請
求の範囲第２項記載の方法。 - （４）該細菌がフラボバクテリウム属、シュードモナス
属およびバチルス属から選ばれることを特徴とする特許
請求の範囲第３項記載の方法。 - （５）該細菌がフラボバクテリウム・アミノゲネスＡＪ
３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）、フラボバクテリウ
ム・アミノゲネスＡＪ３９４０（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３５
）であることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の
方法。 - （６）該細菌がシュードモナス・ヒダントイノフィラム
ＡＪ１１２２０（ＦＥＲＭ−Ｐ４３４７）であることを
特徴とする特許請求の範囲第４項記載の方法。 - （７）該細菌がバチルス、ａｐ．ＡＪ１２２９９（ＦＥ
ＲＭ−Ｐ８８３７）であることを特徴とする特許請求の
範囲第４項記載の方法。 - （８）該ベクターがエシェリヒア属、シュードモナス属
、フラボバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、コ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌中
で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージま
たはその誘導体であることを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載の方法。 - （９）該宿主菌株がエシェリヒア・コリ、シュードモナ
ス・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ、フラボバ
クテリウム・アミノゲネス、バチルス・ズブチリス、セ
ラチア・マルセスセンス、コリネバクテリウム・グルタ
ミカム、コリネバクテリウム・ハーキュリス、ブレビバ
クテリウム・フラバムおよびブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタムからえらばれることを特徴とする特許
請求の範囲第８項記載の方法。 - （１０）Ｎ−カルバミルアミノ酸に作用し対応するアミ
ノ酸に変換する酵素に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片
とベクターＤＮＡとの組換え体を含む微生物。 - （１１）該組換え体を含む微生物がエシェリヒア属、シ
ュードモナス属、フラボバクテリウム属、バチルス属、
セラチア属、コリネバクテリウム属およびブレビバクテ
リウム属に属する微生物であることを特徴とする特許請
求の範囲第１０項記載の微生物。 - （１２）該微生物がエシェリヒア・コリＪＭ１０９ＨＡ
３ＡＪ１２２９７（ＦＥＲＭ−Ｐ）であることを特徴と
する特許請求の範囲第１１項記載の微生物。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP61167534A JP2679031B2 (ja) | 1986-07-16 | 1986-07-16 | アミノ酸の製造法及びアミノ酸生産菌 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61167534A JP2679031B2 (ja) | 1986-07-16 | 1986-07-16 | アミノ酸の製造法及びアミノ酸生産菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6324894A true JPS6324894A (ja) | 1988-02-02 |
| JP2679031B2 JP2679031B2 (ja) | 1997-11-19 |
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ID=15851476
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP61167534A Expired - Lifetime JP2679031B2 (ja) | 1986-07-16 | 1986-07-16 | アミノ酸の製造法及びアミノ酸生産菌 |
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|---|---|
| JP (1) | JP2679031B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992010579A1 (en) * | 1990-12-07 | 1992-06-25 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | PROCESS FOR PRODUCING D-α-AMINO ACID |
| WO1994000577A1 (en) * | 1992-06-30 | 1994-01-06 | Smithkline Beecham P.L.C. | D-n-carbamoyl-amino acid amidohydrolase and hydantoinase |
| EP0801131A4 (en) * | 1994-12-28 | 2000-03-22 | Kanegafuchi Chemical Ind | METHOD FOR PRODUCING A D-N-CARBAMOYL ALPHA AMINO ACID |
| SG84486A1 (en) * | 1990-12-07 | 2001-11-20 | Kanegafuchi Chemical Ind | Process for production of d--g(a)-amino acids |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6024192A (ja) * | 1983-05-28 | 1985-02-06 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | フエニ−ルアラニンの製造法 |
| JPS6062992A (ja) * | 1983-08-16 | 1985-04-11 | ジエネンテク，インコーポレイテツド | 組換え技術を用いたｌ―アミノ酸類の製造法 |
| JPS619292A (ja) * | 1984-06-25 | 1986-01-16 | Denki Kagaku Kogyo Kk | Ｌ−アミノ酸の製造方法 |
-
1986
- 1986-07-16 JP JP61167534A patent/JP2679031B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6024192A (ja) * | 1983-05-28 | 1985-02-06 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | フエニ−ルアラニンの製造法 |
| JPS6062992A (ja) * | 1983-08-16 | 1985-04-11 | ジエネンテク，インコーポレイテツド | 組換え技術を用いたｌ―アミノ酸類の製造法 |
| JPS619292A (ja) * | 1984-06-25 | 1986-01-16 | Denki Kagaku Kogyo Kk | Ｌ−アミノ酸の製造方法 |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992010579A1 (en) * | 1990-12-07 | 1992-06-25 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | PROCESS FOR PRODUCING D-α-AMINO ACID |
| EP0515698A4 (ja) * | 1990-12-07 | 1994-02-09 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | |
| US5565344A (en) * | 1990-12-07 | 1996-10-15 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for production of D-α-amino acids |
| SG84486A1 (en) * | 1990-12-07 | 2001-11-20 | Kanegafuchi Chemical Ind | Process for production of d--g(a)-amino acids |
| WO1994000577A1 (en) * | 1992-06-30 | 1994-01-06 | Smithkline Beecham P.L.C. | D-n-carbamoyl-amino acid amidohydrolase and hydantoinase |
| EP0801131A4 (en) * | 1994-12-28 | 2000-03-22 | Kanegafuchi Chemical Ind | METHOD FOR PRODUCING A D-N-CARBAMOYL ALPHA AMINO ACID |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2679031B2 (ja) | 1997-11-19 |
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