JP2923771B1 - アミノトランスフェラーゼ活性を有する耐熱性酵素及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

【要約】 【解決手段】 高温で安定であるとともに、広範なpH域
で安定であるアミノトランスフェラーゼである。 【効果】 苛酷な条件下で行われるアミノトランスフェ
ラーゼ反応の新規な触媒が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、光学純度の高いア
ミノ酸誘導体の合成に有用な耐熱性アミノトランスフェ
ラーゼ、並びにそれをコードする遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】アミノトランスフェラーゼは、光学純度
の高いアミノ酸、アミン、プロキラルケトンの合成に有
用な酵素である。アミノトランスフェラーゼは、アミノ
酸のアミノ基をα-ケト酸へ転移して、別のオキソ酸と
アミノ酸とを生じる反応を触媒する（図１）。この反応
によって、アミノ基供与体の立体光学異性を保持したア
ミノ酸誘導体が生成する（図２）。

【０００３】これまでに基質特異性の異なる種々のアミ
ノトランスフェラーゼが哺乳類動物細胞や酵母細胞から
単離されている。しかし、これらの多くが常温生物由来
のものであるため、耐熱性並びに耐酸性及び耐アルカリ
性に乏しく、有機溶媒等が使用される過酷な条件下での
化学合成反応（例えば、アミノ酸誘導体合成反応）にお
いて使用することができなかった。従って、高温で安定
であり、かつ広範なpHで安定であるアミノトランスフェ
ラーゼが単離されれば、過酷な条件下で行われる化学合
成反応（例えば、アミノ酸誘導体合成反応）における新
たな触媒として非常に有用であると考えられる。そこ
で、過酷な条件下でも安定であるアミノトランスフェラ
ーゼの提供が渇望されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、高温で安定
であり、かつ広範なpHで安定であるアミノトランスフェ
ラーゼ、並びにそれをコードする遺伝子を提供すること
を目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究した結果、90〜100℃で生育
する超好熱性細菌の染色体ＤＮＡの塩基配列を決定し、
その塩基配列からアミノトランスフェラーゼ活性を有す
るタンパク質をコードすると推定される遺伝子を単離し
た。そして、この遺伝子を大腸菌に導入し発現させ、こ
の遺伝子によってコードされるタンパク質がアミノトラ
ンスフェラーゼ活性を有するとともに、高温（90℃以
上）で安定であり、かつ広範なpH（pH４〜11）で安定で
あることを確認し、本発明を完成するに至った。すなわ
ち、本発明は、以下の性質を有する酵素である。

【０００６】（１）アミノトランスフェラーゼ活性を有
する （２）非芳香族アミノ酸をアミノ基供与体とするより
も、芳香族アミノ酸をアミノ基供与体とした方が、高い
アミノトランスフェラーゼ活性を示す （３）至適温度は90℃であるまた、本発明は、以下の性
質を有する酵素である。

【０００７】（１）アミノトランスフェラーゼ活性を有
する （２）非芳香族アミノ酸をアミノ基供与体とするより
も、芳香族アミノ酸をアミノ基供与体とした方が、高い
アミノトランスフェラーゼ活性を示す （３）至適温度は90℃である （４）至適pHは6.0である （５）pH6.5、95℃で６時間処理しても失活しない （６）pH6.5、110℃における半減期は30分である （７）pH４〜11、25℃で24時間以上安定である （８）pH6.5における融解温度は120.1℃であって、その
際のモルエンタルピー変化は2.4×10³KJ／moleである （９）pH6.5、25℃におけるαヘリックス含量は40％で
ある（10）分子量が44,000Daである （11）ホモダイマーのサブユニット構造を有する （12）等電点は5.2である （13）変性は不可逆的である さらに、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタン
パク質である。

【０００８】（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列から
なるタンパク質 （ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１若し
くは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつアミノトランスフェラーゼ
活性を有するタンパク質さらに、本発明は、上記タンパ
ク質をコードする遺伝子である。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 １．本発明の第一は、以下の性質を有する酵素である。 （１）アミノトランスフェラーゼ活性を有する （２）非芳香族アミノ酸をアミノ基供与体とするより
も、芳香族アミノ酸をアミノ基供与体とした方が、高い
アミノトランスフェラーゼ活性を示す （３）至適温度は90℃である （４）至適pHは6.0である （５）pH6.5、95℃で６時間処理しても失活しない （６）pH6.5、110℃における半減期は30分である （７）pH４〜11、25℃で24時間以上安定である （８）pH6.5における融解温度は120.1℃であって、その
際のモルエンタルピー変化は2.4×10³KJ／moleである （９）pH6.5、25℃におけるαヘリックス含量は40％で
ある （10）分子量が44,000Daである （11）ホモダイマーのサブユニット構造を有する （12）等電点は5.2である （13）変性は不可逆的である

【００１０】本発明の酵素は、例えば、以下の方法によ
って得ることができる。すなわち、本発明の酵素を生産
することができる微生物の菌体を破砕した後、緩衝液中
に懸濁し、遠心分離する。遠心分離により得られる上清
をアミノトランスフェラーゼ活性の有無を指標として各
種クロマトグラフィーで精製することにより、本発明の
酵素を得ることができる。

【００１１】上記方法において使用する緩衝液、遠心分
離及びクロマトグラフィーの条件は、微生物菌体から酵
素を精製する場合に常用される範囲から、適宜選択する
ことができる。また、アミノトランスフェラーゼ活性の
有無は、例えば、L-システイン酸と2-ケトグルタル酸を
基質とし、5,5'-Dithiobis（2-nitrobenzoic acid）(DT
NB)の還元により生ずる412nmの吸光度増加を追跡するこ
とにより判定することができる。また、上記方法におい
て使用する微生物は、本発明の酵素を生産することがで
きる限り特に限定されず、いかなる微生物であってもよ
い。

【００１２】このような微生物としては、例えば、超好
熱性細菌を使用することができる。より具体的には、硫
黄代謝好熱性古細菌であるパイロコッカス・ホリコシ
（理化学研究所微生物系統保存施設の保存番号：JCM997
4）を使用することができる。また、後述する本発明の
遺伝子を導入した微生物（例えば、大腸菌）を使用する
こともできる。

【００１３】本発明の酵素は、アミノトランスフェラー
ゼ活性を有するとともに、高温で安定であり、かつ広範
なpH域で安定であるため、苛酷な条件下におけるアミノ
トランスフェラーゼ反応の触媒として使用することがで
きる。本発明の酵素は、芳香族アミノ酸に対するアミノ
トランスフェラーゼ活性が特に高いので、芳香族アミノ
酸を基質としたアミノトランスフェラーゼ反応の触媒と
して特に有用である。本発明の酵素を用いてアミノトラ
ンスフェラーゼ反応を行なうことにより、光学純度の高
いアミノ酸誘導体を得ることができる。

【００１４】２．本発明の第二は、以下の（ａ）又は
（ｂ）に示すタンパク質である。 （ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク
質 （ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１若し
くは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつアミノトランスフェラーゼ
活性を有するタンパク質

【００１５】ここで、「１若しくは複数個のアミノ酸」
とは、本願の出願時に常用される技術により欠失、置換
若しくは付加することができ、かつアミノトランスフェ
ラーゼを喪失させない限り、その個数は特に限定されな
い。また、１若しくは複数個のアミノ酸を欠失、置換若
しくは付加させたタンパク質は、本願の出願時において
常用される技術、例えば、部位特異的変異誘発法（Zoll
erら.,Nucleic AcidsRes.10,6487-6500,1982）により作
製することができる。本発明のタンパク質は、例えば、
上記本発明の酵素と同様の方法によって得ることができ
る。

【００１６】本発明のタンパク質は、上記本発明の酵素
と同様に、アミノトランスフェラーゼ活性を有するとと
もに、高温で安定であり、かつ広範なpH域で安定であ
る。従って、本発明のタンパク質は、苛酷な条件下にお
けるアミノトランスフェラーゼ反応の触媒として使用す
ることができる。また、本発明のタンパク質は、上記本
発明の酵素と同様に、芳香族アミノ酸に対するアミノト
ランスフェラーゼ活性が特に高いので、芳香族アミノ酸
を基質としたアミノトランスフェラーゼ反応の触媒とし
て特に有用である。本発明のタンパク質を用いてアミノ
トランスフェラーゼ反応を行なうことにより、上記本発
明の酵素と同様に、光学純度の高いアミノ酸誘導体を得
ることができる。

【００１７】３．本発明の第三は、上記本発明のタンパ
ク質をコード遺伝子である。 本発明の遺伝子は、例えば、以下のようにして得ること
ができる。まず、本発明の遺伝子を有する微生物から染
色体ＤＮＡを抽出する。この際使用する微生物は、本発
明の遺伝子を有する限り特に限定されない。このような
微生物としては、例えば、超好熱性細菌を使用すること
ができる。より具体的には、硫黄代謝好熱性古細菌であ
るパイロコッカス・ホリコシ（理化学研究所微生物系統
保存施設の保存番号：JCM9974）を使用することができ
る。また、微生物からの染色体ＤＮＡの抽出は、常法に
従って行なうことができる。

【００１８】次に、抽出した染色体ＤＮＡを制限酵素で
部分分解し、ベクターに挿入する。この際使用する制限
酵素は、染色体ＤＮＡを適当な長さ（例えば約40kb長）
に切断することができる限り特に限定されない。このよ
うな制限酵素としては、例えばHindIII、EcoRI、SalI、
KpnI等を使用することができるが、HindIIIを使用する
のが好ましい。また、使用するベクターは、クローニン
グベクターとして機能する限り特に限定されない。この
ようなベクターとしては、例えば、pBAC108L、pFOS1等
を使用することができる。

【００１９】次に、上記組換えベクターを適当な宿主細
胞に導入してゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、染色
体ＤＮＡの塩基配列を決定する。この際宿主細胞として
は、例えば、大腸菌、酵母等の細胞を使用することがで
きるが、これらに限定されるわけではない。宿主細胞へ
の組換えベクターの導入法は、使用するベクターに応じ
て適宜選択することができる。例えば、ベクターとして
pBAC108Lを使用する場合には、電気孔窄法が好ましく、
またベクターとしてpFOS1を使用する場合には、λファ
ージ等を利用するのが好ましい。また、染色体ＤＮＡの
塩基配列の決定は、例えば、マクサム・ギルバートの化
学修飾法、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法、またはこ
れらの自動化された変法等を用いて行なうことができ
る。

【００２０】次に、得られたシークエンスデータから本
発明のタンパク質のホモロジー領域を調べ、本発明のタ
ンパク質をコードする構造遺伝子を特定する。次に、上
記構造遺伝子の両末端に相補的なプライマーを合成し、
ＰＣＲによって該構造遺伝子を増幅させることにより、
本発明の遺伝子を得ることができる。また、本発明の遺
伝子は、例えばフォスファイト・トリエステル法等の公
知の方法に従い、化学合成することもできる。なお、本
発明の遺伝子を導入した大腸菌BL21 PET11a/ArATphは、
工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P-1
6601として寄託されている（寄託日：平成10年１月26
日）。

【００２１】本発明の遺伝子は、本発明のタンパク質を
コードする。従って、本発明の遺伝子を発現ベクターに
組み込み、これを原核生物又は真核生物由来の宿主細胞
に導入し発現させることにより、本発明のタンパク質を
大量に生産することができる。この際、発現ベクターと
しては、pET11a、pET15b等を使用することができる。ま
た、原核生物由来の宿主細胞としては、大腸菌（例え
ば、大腸菌BL21（DE3）、大腸菌XL1-BlueMRF'、等）、
枯草菌等を使用することができ、真核生物由来の宿主細
胞としては、脊椎動物、酵母等の細胞を使用することが
できる。

【００２２】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されない。 〔実施例１〕菌の培養 硫黄代謝好熱性古細菌であるパイロコッカス・ホリコシ
（理化学研究所微生物系統保存施設の保存番号：JCM997
4）（以下、「JCM9974」という）を以下のようにして培
養した。13.5gの食塩、4gのNa₂SO₄、0.7gのKCl、0.2gの
NaHCO₃、0.1gのKBr、30mgのH₃BO₃、10gのMgCl₂・６H₂O、
1.5gのCaCl₂、25mgのSrCl₂、1.0mlのレザスリン溶液
（0.2g/L）、1.0gの酵母エキス、及び5gのバクトペプト
ンを１Lの水に溶かし、この溶液のｐHを6.8に調整し加
圧殺菌した。次いで、乾熱殺菌した元素硫黄を0.2％と
なるように加え、この培地をアルゴンで飽和して嫌気性
とした後、JCM9974を植菌した。なお、培地が嫌気性で
あることは、Na₂S溶液を加えて、培地液中でNa₂Sによる
レザスリン溶液のピンク色が着色しないことにより確認
した。その後、上記培養液中でJCM9974を95℃で２〜４
日培養した。

【００２３】〔実施例２〕染色体ＤＮＡの調製 JCM9974の染色体ＤＮＡを以下の方法により調製した。J
CM9974の培養終了後、5000rpmで10分間遠心分離し、菌
体を集菌した。この菌体を10ｍM Tris(pH7.5)−1mM EDT
A溶液で2回洗浄した後、InCert Agarose（FMC社製）ブ
ロック中に封入した。このブロックを1％ N−ラウロイ
ルサルコシン及び１mg/ml プロテアーゼＫを含有する溶
液中で処理することにより、染色体ＤＮＡをアガロース
ブロック中に分離調製した。

【００２４】〔実施例３〕染色体ＤＮＡを含むライブラ
リークローンの作製 実施例２で得られた染色体ＤＮＡを制限酵素HindIIIに
より部分分解した後、アガロースゲル電気泳動により約
40kb長の断片を調製した。このＤＮＡ断片と、制限酵素
HindIIIによって完全分解したBacベクターpBAC108L（St
ratagene社製）及びpFOS1（Stratagene社製）とをT4リ
ガーゼを用いて結合させた。前者のベクターpBAC108Lを
用いた場合には、結合終了後のＤＮＡをただちに大腸菌
内へ電気孔窄法により導入した。一方、後者のベクター
pFOS1を用いた場合には、結合終了後のＤＮＡをGIGA Pa
ck Gold（Stratagene社製）により試験管内でλファー
ジ粒子内に詰め込み、この粒子を大腸菌に感染させるこ
とによりＤＮＡを大腸菌内に導入した。これらの方法に
より得られた抗生物質クロラムフェニコール耐性の大腸
菌集団をBAC及びFosmidライブラリーとした。これらの
ライブラリーからJCM9974の染色体ＤＮＡをカバーする
のに適したクローンを選択して、クローンの整列化を行
なった。

【００２５】〔実施例４〕各BAC又はFosmidクローンの
塩基配列決定 整列化した各BAC又はFosmidクローンからＤＮＡを回収
し、回収したＤＮＡを超音波処理して断片化した。断片
化したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動し、1kb及び2kb
長のＤＮＡ断片を回収した。そして、これらのＤＮＡ断
片をプラスミドベクターpUC118のHincII制限酵素部位に
挿入し、各BAC又はFosmidクローン当たり500個のショッ
トガンクローン作製した。各ショットガンクローンの塩
基配列をパーキンエルマー373又は377（ABI社製自動塩
基配列読み取り装置）を用いて決定し、各ショットガン
クローンから得られた塩基配列を塩基配列自動連結ソフ
トSequencherを用いて連結編集し、各BAC又はFosmidク
ローンの全塩基配列を決定した。

【００２６】〔実施例５〕Flapエンドヌクレアーゼ遺伝
子の同定 実施例４で決定された各BAC又はFosmidクローンの塩基
配列を大型計算機によって解析した結果、芳香族アミノ
酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子（配列
番号２）が同定された。

【００２７】〔実施例６〕発現プラスミドの構築 構造遺伝子領域の前後に制限酵素（NdelとBamHI）サイ
トを構築する目的で、以下に示す２種類のＤＮＡプライ
マーを合成した。そして、これらのプライマーを用いて
ＰＣＲを行ない、構造遺伝子の前後に制限酵素サイトを
導入した。 Upper primer： 5'−TTTTGTCGACTTACATATGGCGCTAAGTGACAGA−3' Lower primer： 5'−TTTTGGTACCTTTGGATCCTTAACCAAGGATTTAAACTAG−3' ＰＣＲにより得られた増幅断片を、制限酵素（NdelとBa
mHI）で完全分解（37℃で2時間）することにより構造遺
伝子を単離し、これを精製した。pET11a（Novagen社
製）を制限酵素NdelとBamHIで切断、精製した後、上記
構造遺伝子とT4リガーゼの存在下で16℃、２時間反応さ
せ連結させた。連結させたＤＮＡの一部を大腸菌XL１−
BlueMRF'のコンピテントセルに導入し、形質転換体のコ
ロニーを得た。得られたコロニーから発現プラスミドを
単離し、これをアルカリ法で精製した。

【００２８】〔実施例７〕組換え遺伝子の発現 大腸菌（大腸菌BL21（DE3），Novagen社製）のコンピテ
ントセルを融解して、このうちの0.1ｍＬをファルコン
チューブに移した。その中に発現プラスミド溶液0.005m
Lを加え、氷中に30分間放置した後、42℃で30秒間ヒー
トショックを与えた。これにSOCmedium0.9mLを加え、37
℃で1時間振盪培養した後、アンピシリンを含む２YT寒
天プレートに適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体
を得た。この形質転換体をアンピシリンを含む２YT培地
（２リットル）で600nmの吸収が１に達するまで培養し
た後、IPTG（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）
を加え、さらに6時間培養した。培養後、遠心分離（6,0
00rpmで20分間）して集菌した。

【００２９】〔実施例８〕耐熱性酵素の精製 集菌した菌体を‐20℃で凍結融解し、菌体量の2倍のア
ルミナと1mgのDNaseとを加え、菌体を粉砕した後、５倍
量の10ｍMトリス塩酸緩衝液（ｐH8.0）を加え懸濁液を
得た。得られた懸濁液を85℃で30分間加熱した後、遠心
分離（11,000rpmで20分間）し、上清をHiTrapQカラム
（ファルマシア社製）に吸着させ、NaCl濃度勾配による
溶出を行ない活性画分を得た。さらに得られた活性画分
溶液をHiLoad 26/60 Superdex200pgゲルろ過カラム（フ
ァルマシア社製）に通して精製酵素を得た。

【００３０】〔実施例９〕酵素の理化学的性質の測定 （１）酵素の化学的性質 塩基配列解析に基づくタンパク質コード領域の確定とN
末アミノ酸配列解析より、本酵素が388残基から構成さ
れていることが明らかとなった。また、本酵素のSDSポ
リアクリルアミド電気泳動の結果より、本酵素の分子量
は44,000Daであることが明らかとなった。また、G2000S
ＷＸL（Toso社製）カラムを用いたゲルろ過分析より、
本酵素はホモダイマーのサブユニット構造を有すること
が明らかとなった。さらに、本酵素の等電点電気泳動の
結果より、本酵素の等電点は5.2であることが明らかと
なった。

【００３１】（２）アミノ酸基転移反応 アミノ基受容体として、2-ケトグルタル酸を用い、アミ
ノ基供与体として2種類の基質を用いて、酵素反応をpH
8.0、25℃の条件下で行ない、各基質でのキネティック
パラメーターの比較を行なった。アミノ基供与体として
酸性基質（アスパラギン酸）を用いた場合には、リンゴ
酸脱水素酵素と反応をカップルさせ、NADHの変化量を34
0nmでの吸光度変化で追跡し、キネティックパラメータ
ー、K_cat及びK_m値を測定した。また、アミノ基供与体と
して疎水性基質（フェニルアラニン）を用いた場合に
は、反応産物（フェニルピルビン酸）の生成量を280nm
の吸光度変化で追跡し、K_cat及びK_m値を測定した。その
結果を表１に示す。

【００３２】

【表１】

【００３３】表１に示すように、フェニルアラニン及び
アスパラギン酸に対する本酵素のK_catは、各々12及び0.
18秒^-1（25℃、pH8.0）であり、K_cat/K_m値は、各々1.0
×１０^４及び１．７秒^-1M^-1であった。従って、本酵素
は、アスパラギン酸のような非芳香族アミノ酸よりもフ
ェニルアラニンのような芳香族アミノ酸に対して高い触
媒活性を有するアミノトランスフェラーゼであることが
明らかとなった。

【００３４】（３）至適温度と至適pH 至適温度と至適pHの測定は、L-システイン酸及び2-ケト
グルタル酸を基質として以下のように行なった。至適温
度は、50mMのりん酸緩衝液（pH6.5）中で反応温度を30
℃から98℃まで変化させ、5,5'-Dithiobis（2-nitroben
zoic acid）（DTNB）の還元により生じる412nmの吸光度
増加を5分間追跡し、その初速度よりK_app値を求め、K
_appの温度依存性より決定した。また、至適pHは、上記
測定条件において、反応温度を90℃に固定し、酵素反応
液のpHを3.4〜7.5まで変化させ、K_appを求め、K_appのpH
依存性より決定した。その結果を図３に示す。

【００３５】図３に示すように、L-システイン酸と2-ケ
トグルタル酸とを基質として用いた場合には、K_app値は
温度の上昇とともに増加し、90℃で最高に達した。この
時のK_app値は1.39×10²秒^-1（pH6.5、90℃）であった。
これにより、本酵素の至適温度は90℃であることが明ら
かとなった。また、本酵素の至適pHは6.0であることが
明らかとなった。

【００３６】（４）熱安定性 熱安定性は、加熱後の残存活性測定と示差走査熱量計
（DSC）により解析した。加熱後の残存活性測定におい
ては、本酵素（0.1mg/ml）を20mMりん酸緩衝液（pH6.
5）中で95℃と110℃とで所定時間加熱し、急冷後、残存
活性を測定した。また、DSC測定は、Calolimetry Scien
ce社のCSC5100型を用い、セル温度を０〜125℃まで昇温
（1K/min）させ、20ｍMリン酸緩衝液（pH6.5）中での酵
素タンパク質の熱容量変化を測定した。酵素濃度は、1m
g/mlとした。加熱後の残存活性測定の結果、本酵素はpH
6.5、95℃で6時間処理しても全く失活せず安定であり、
110℃における半減期は30分であることが明らかとなっ
た。また、DSC測定の結果、pH6.5における融解温度（T_m
値）は120.1℃であり、その際のモルエンタルピー変化
は2.4×10³KJ/moleであることが明らかとなっった。ま
た、変性は不可逆的であった。

【００３７】（５）pH安定性 ｐH安定性は日本分光社のJ-720W型円二色偏光分析計（C
D）を用いて解析した。すなわち、酵素溶液（0.1mg/m
l）のpHを1.0から13.0まで変化させ、25℃におけるnega
tive ellipicity［θ］の強度変化を測定し、ｐH安定性
が求めた。その結果、25℃、pH6.5における本酵素のα
−ヘリックス含量は40％であり、pH４〜11の広範なpH域
において、24時間以上安定であることが明らかとなっ
た。以上の（４）及び（５）の結果より、本酵素が極め
て高い熱安定性とpH安定性を示すことが明らかとなっ
た。

【００３８】

【発明の効果】本発明により、高温で安定であり、かつ
広範なpH域で安定であるアミノトランスフェラーゼが提
供される。本発明のアミノトランスフェラーゼは、過酷
な条件下におけるアミノトランスフェラーゼ反応の触媒
として有用である。本発明のアミノトランスフェラーゼ
は、芳香族アミノ酸に対するアミノトランスフェラーゼ
活性が特に高いので、芳香族アミノ酸を基質とするアミ
ノトランスフェラーゼ反応の触媒として特に有用であ
る。本発明のアミノトランスフェラーゼを用いて、アミ
ノトランスフェラーゼ反応を行なうことにより、光学純
度の高いアミノ酸誘導体を得ることができる。さらに、
本発明により、本発明のアミノトランスフェラーゼをコ
ードする遺伝子が提供される。本発明の遺伝子は、本発
明のアミノトランスフェラーゼを生産する上で有用であ
る。すなわち、本発明の遺伝子を発現ベクターに組み込
み、これを宿主細胞に導入し発現させることによって、
本発明のタンパク質を大量に生産することができる。

【００３９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３８９ 配列の型：タンパク質 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：パイロコッカス・ホリコシ 配列 Met Ala Leu Ser Asp Arg Leu Glu Leu Val Ser Ala Ser Glu Ile Arg 1 5 10 15 Lys Leu Phe Asp Ile Ala Ala Gly Met Lys Asp Val Ile Ser Leu Gly 20 25 30 Ile Gly Glu Pro Asp Phe Asp Thr Pro Gln His Ile Lys Glu Tyr Ala 35 40 45 Lys Glu Ala Leu Asp Lys Gly Leu Thr His Tyr Gly Pro Asn Ile Gly 50 55 60 Leu Leu Glu Leu Arg Glu Ala Ile Ala Glu Lys Leu Lys Lys Gln Asn 65 70 75 80 Gly Ile Glu Ala Asp Pro Lys Thr Glu Ile Met Val Leu Leu Gly Ala 85 90 95 Asn Gln Ala Phe Leu Met Gly Leu Ser Ala Phe Leu Lys Asp Gly Glu 100 105 110 Glu Val Leu Ile Pro Thr Pro Ala Phe Val Ser Tyr Ala Pro Ala Val 115 120 125 Ile Leu Ala Gly Gly Lys Pro Val Glu Val Pro Thr Tyr Glu Glu Asp 130 135 140 Glu Phe Arg Leu Asn Val Asp Glu Leu Lys Lys Tyr Val Thr Asp Lys 145 150 155 160 Thr Arg Ala Leu Ile Ile Asn Ser Pro Cys Asn Pro Thr Gly Ala Val 165 170 175 Leu Thr Lys Lys Asp Leu Glu Glu Ile Ala Asp Phe Val Val Glu His 180 185 190 Asp Leu Ile Val Ile Ser Asp Glu Val Tyr Glu His Phe Ile Tyr Asp 195 200 205 Asp Ala Arg His Tyr Ser Ile Ala Ser Leu Asp Gly Met Phe Glu Arg 210 215 220 Thr Ile Thr Val Asn Gly Phe Ser Lys Thr Phe Ala Met Thr Gly Trp 225 230 235 240 Arg Leu Gly Phe Val Ala Ala Pro Ser Trp Ile Ile Glu Arg Met Val 245 250 255 Lys Phe Gln Met Tyr Asn Ala Thr Cys Pro Val Thr Phe Ile Gln Tyr 260 265 270 Ala Ala Ala Lys Ala Leu Lys Asp Glu Arg Ser Trp Lys Ala Val Glu 275 280 285 Glu Met Arg Lys Glu Tyr Asp Arg Arg Arg Lys Leu Val Trp Lys Arg 290 295 300 Leu Asn Glu Met Gly Leu Pro Thr Val Lys Pro Lys Gly Ala Phe Tyr 305 310 315 320 Ile Phe Pro Arg Ile Arg Asp Thr Gly Leu Thr Ser Lys Lys Phe Ser 325 330 335 Glu Leu Met Leu Lys Glu Ala Arg Val Ala Val Val Pro Gly Ser Ala 340 345 350 Phe Gly Lys Ala Gly Glu Gly Tyr Val Arg Ile Ser Tyr Ala Thr Ala 355 360 365 Tyr Glu Lys Leu Glu Glu Ala Met Asp Arg Met Glu Arg Val Leu Lys 370 375 380 Glu Arg Lys Leu Val 385 389

【００４０】配列番号２ 配列の長さ：１１７０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：パイロコッカス・ホリコシ 配列 ATG GCG CTA AGT GAC AGA TTA GAA TTA GTT AGT GCT TCT GAA ATT AGA 48 Met Ala Leu Ser Asp Arg Leu Glu Leu Val Ser Ala Ser Glu Ile Arg 1 5 10 15 AAG CTC TTT GAT ATT GCT GCA GGA ATG AAG GAT GTT ATC TCC CTG GGA 96 Lys Leu Phe Asp Ile Ala Ala Gly Met Lys Asp Val Ile Ser Leu Gly 20 25 30 ATA GGG GAA CCT GAT TTT GAT ACG CCT CAA CAT ATT AAG GAG TAT GCC 144 Ile Gly Glu Pro Asp Phe Asp Thr Pro Gln His Ile Lys Glu Tyr Ala 35 40 45 AAG GAA GCC CTG GAT AAG GGA TTG ACT CAT TAT GGT CCA AAT ATA GGG 192 Lys Glu Ala Leu Asp Lys Gly Leu Thr His Tyr Gly Pro Asn Ile Gly 50 55 60 CTT TTA GAG CTT AGG GAA GCC ATA GCT GAA AAG TTA AAG AAG CAG AAT 240 Leu Leu Glu Leu Arg Glu Ala Ile Ala Glu Lys Leu Lys Lys Gln Asn 65 70 75 80 GGC ATA GAG GCT GAT CCA AAG ACA GAG ATA ATG GTC TTA TTA GGT GCG 288 Gly Ile Glu Ala Asp Pro Lys Thr Glu Ile Met Val Leu Leu Gly Ala 85 90 95 AAC CAA GCT TTC TTA ATG GGC CTC TCG GCT TTT CTT AAG GAT GGT GAA 336 Asn Gln Ala Phe Leu Met Gly Leu Ser Ala Phe Leu Lys Asp Gly Glu 100 105 110 GAG GTA TTA ATA CCA ACT CCA GCC TTT GTC AGC TAC GCA CCT GCC GTT 384 Glu Val Leu Ile Pro Thr Pro Ala Phe Val Ser Tyr Ala Pro Ala Val 115 120 125 ATA TTG GCT GGA GGA AAG CCC GTT GAA GTC CCA ACG TAC GAA GAG GAT 432 Ile Leu Ala Gly Gly Lys Pro Val Glu Val Pro Thr Tyr Glu Glu Asp 130 135 140 GAA TTC AGG CTA AAC GTT GAT GAG CTT AAA AAG TAT GTT ACC GAC AAG 480 Glu Phe Arg Leu Asn Val Asp Glu Leu Lys Lys Tyr Val Thr Asp Lys 145 150 155 160 ACT AGA GCT TTA ATA ATA AAC TCA CCG TGT AAT CCA ACG GGA GCA GTG 528 Thr Arg Ala Leu Ile Ile Asn Ser Pro Cys Asn Pro Thr Gly Ala Val 165 170 175 TTA ACT AAG AAA GAT CTA GAA GAG ATA GCG GAT TTT GTC GTT GAA CAT 576 Leu Thr Lys Lys Asp Leu Glu Glu Ile Ala Asp Phe Val Val Glu His 180 185 190 GAT CTA ATT GTA ATA AGC GAT GAA GTT TAT GAG CAC TTC ATT TAC GAT 624 Asp Leu Ile Val Ile Ser Asp Glu Val Tyr Glu His Phe Ile Tyr Asp 195 200 205 GAT GCT AGG CAC TAC AGT ATA GCC TCC CTG GAT GGA ATG TTT GAA AGG 672 Asp Ala Arg His Tyr Ser Ile Ala Ser Leu Asp Gly Met Phe Glu Arg 210 215 220 ACA ATA ACC GTT AAC GGA TTC TCA AAG ACG TTT GCA ATG ACG GGC TGG 720 Thr Ile Thr Val Asn Gly Phe Ser Lys Thr Phe Ala Met Thr Gly Trp 225 230 235 240 AGG TTG GGA TTT GTT GCA GCG CCT TCT TGG ATA ATA GAG AGG ATG GTG 768 Arg Leu Gly Phe Val Ala Ala Pro Ser Trp Ile Ile Glu Arg Met Val 245 250 255 AAG TTT CAG ATG TAT AAC GCT ACT TGT CCA GTG ACT TTC ATA CAA TAC 816 Lys Phe Gln Met Tyr Asn Ala Thr Cys Pro Val Thr Phe Ile Gln Tyr 260 265 270 GCT GCT GCT AAA GCG TTA AAG GAT GAG AGA AGC TGG AAA GCT GTT GAA 864 Ala Ala Ala Lys Ala Leu Lys Asp Glu Arg Ser Trp Lys Ala Val Glu 275 280 285 GAG ATG AGA AAG GAG TAC GAC AGA AGA AGA AAG CTC GTG TGG AAG AGG 912 Glu Met Arg Lys Glu Tyr Asp Arg Arg Arg Lys Leu Val Trp Lys Arg 290 295 300 CTT AAC GAG ATG GGA CTC CCA ACG GTA AAG CCG AAG GGT GCA TTT TAC 960 Leu Asn Glu Met Gly Leu Pro Thr Val Lys Pro Lys Gly Ala Phe Tyr 305 310 315 320 ATA TTC CCG AGG ATA AGG GAT ACT GGG CTA ACG AGC AAG AAA TTC AGC 1008 Ile Phe Pro Arg Ile Arg Asp Thr Gly Leu Thr Ser Lys Lys Phe Ser 325 330 335 GAG CTC ATG CTT AAA GAA GCT AGG GTT GCA GTA GTT CCA GGT AGT GCC 1056 Glu Leu Met Leu Lys Glu Ala Arg Val Ala Val Val Pro Gly Ser Ala 340 345 350 TTT GGA AAA GCC GGT GAG GGA TAC GTA AGG ATC AGC TAT GCA ACA GCT 1104 Phe Gly Lys Ala Gly Glu Gly Tyr Val Arg Ile Ser Tyr Ala Thr Ala 355 360 365 TAT GAG AAG CTT GAA GAG GCC ATG GAT AGA ATG GAA AGG GTG TTA AAG 1152 Tyr Glu Lys Leu Glu Glu Ala Met Asp Arg Met Glu Arg Val Leu Lys 370 375 380 GAG AGG AAG CTA GTT TAA 1170 Glu Arg Lys Leu Val 385 389

【図面の簡単な説明】

【図１】アミノトランスフェラーゼによって触媒される
アミノトランスフェラーゼ反応を表す図である。

【図２】アミノトランスフェラーゼによって触媒される
アミノトランスフェラーゼ反応のメカニズムを表す図で
ある。

【図３】温度とK_appとの関係を表す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 小杉 佳次 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 松井 えり子 茨城県つくば市吾妻２丁目905−104 (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏ ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，1247（１) （1995），ｐ．90−96 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク
   質。 （ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク
   質 （ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１若し
   くは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
   アミノ酸配列からなり、かつアミノトランスフェラーゼ
   活性を有するタンパク質
2. 【請求項２】 請求項１記載のタンパク質をコードする
   遺伝子。