JP2788070B2 - ２―ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子 - Google Patents
２―ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、２−ハロ酸デハロゲナーゼの遺伝情報をコ
ードしている２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子に
関するものである。
ードしている２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子に
関するものである。
（従来の技術） ２−ハロ酸デハロゲナーゼ（EC3.8.1.2）は,2−ハロ
酸の脱ハロゲン反応を触媒する酵素であり，本酵素が特
定の微生物に存在すること及び本酵素の理化学的諸性質
については，既に報告されている〔アグリカルチユラル
アンド バイオロジカル ケミストリー（Agric.Bio
l.Chem.,）第46巻，第837〜838頁,1982年〕。
酸の脱ハロゲン反応を触媒する酵素であり，本酵素が特
定の微生物に存在すること及び本酵素の理化学的諸性質
については，既に報告されている〔アグリカルチユラル
アンド バイオロジカル ケミストリー（Agric.Bio
l.Chem.,）第46巻，第837〜838頁,1982年〕。
２−ハロ酸デハロゲナーゼは,2−ハロ酸のＬ体に作用
してハロゲン原子を遊離させるとともに,D体の２−ヒド
ロキシ酸を生成させるという性質を有している。そのた
め，本酵素を用いて，農薬等として使用される２−ハロ
酸をＤ体とＬ体に分別定量する方法（特開昭58−201998
号公報）や医薬中間体等として有用な光学活性２−ヒド
ロキシ酸を製造する方法（特開昭63−173598号公報）等
が開発され提案されている。
してハロゲン原子を遊離させるとともに,D体の２−ヒド
ロキシ酸を生成させるという性質を有している。そのた
め，本酵素を用いて，農薬等として使用される２−ハロ
酸をＤ体とＬ体に分別定量する方法（特開昭58−201998
号公報）や医薬中間体等として有用な光学活性２−ヒド
ロキシ酸を製造する方法（特開昭63−173598号公報）等
が開発され提案されている。
このような２−ハロ酸デハロゲナーゼを取得するため
の手段としては,2−ハロ酸デハロゲナーゼ生産菌株を培
養し，得られた培養物から本酵素を単離・精製する方法
が知られている。
の手段としては,2−ハロ酸デハロゲナーゼ生産菌株を培
養し，得られた培養物から本酵素を単離・精製する方法
が知られている。
（発明が解決しようとする課題） ２−ハロ酸デハロゲナーゼは，誘導物質の存在により
生合成される誘導酵素であるため，本酵素を生産するた
めには，誘導物質である２−ハロ酸等を炭素源として含
む培地を用いて,2−ハロ酸デハロゲナーゼ生産菌体を培
養しなければならなかった。このことは,2−ハロ酸デハ
ロゲナーゼ生産菌株の生育にとって好ましい栄養源を含
む培地を用いることができないことを意味し，従って，
菌の生育が悪く，また培養に長時間を要した。さらに,2
−ハロ酸を資化するに伴い，培地は酸性に傾くため，培
養管理上も問題があった。
生合成される誘導酵素であるため，本酵素を生産するた
めには，誘導物質である２−ハロ酸等を炭素源として含
む培地を用いて,2−ハロ酸デハロゲナーゼ生産菌体を培
養しなければならなかった。このことは,2−ハロ酸デハ
ロゲナーゼ生産菌株の生育にとって好ましい栄養源を含
む培地を用いることができないことを意味し，従って，
菌の生育が悪く，また培養に長時間を要した。さらに,2
−ハロ酸を資化するに伴い，培地は酸性に傾くため，培
養管理上も問題があった。
また，得られた培養物中の２−ハロ酸デハロゲナーゼ
含有量も満足できるものではなかった。
含有量も満足できるものではなかった。
上記のように，従来の２−ハロ酸デハロゲナーゼの生
産方法は，本酵素の実用的な生産上大きな問題があっ
た。
産方法は，本酵素の実用的な生産上大きな問題があっ
た。
本発明は,2−ハロ酸デハロゲナーゼの生産性を実用レ
ベルにまで向上させるために，遺伝子工学の手法が応用
できうる２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子を提供
することを目的とするものである。
ベルにまで向上させるために，遺伝子工学の手法が応用
できうる２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子を提供
することを目的とするものである。
（課題を解決するための手段） 本発明者らは，上記の目的を達成するため鋭意検討し
た結果,2−ハロ酸デハロゲナーゼ遺伝子の採取並びにそ
の塩基配列の解明に成功し，本発明に到達した。
た結果,2−ハロ酸デハロゲナーゼ遺伝子の採取並びにそ
の塩基配列の解明に成功し，本発明に到達した。
すなわち，本発明は，下記塩基配列 を有することを特徴とする２−ハロ酸デハロゲナーゼ生
産性遺伝子を要旨とするものである。
産性遺伝子を要旨とするものである。
以下，本発明を詳細に説明する。
本発明の２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子は，
上記の塩基配列で特定されるものであるが，その発現産
物である２−ハロ酸デハロゲナーゼは，アグリカルチユ
ラル アンド バイオロジカル ケミストリー（Agric.
Biol.Chem.,）第46巻，第837〜838頁,1982年に記載され
た理化学的性質を備えている。すなわち,2−ハロ酸デハ
ロゲナーゼの理化学的性質は，以下の通りである。
上記の塩基配列で特定されるものであるが，その発現産
物である２−ハロ酸デハロゲナーゼは，アグリカルチユ
ラル アンド バイオロジカル ケミストリー（Agric.
Biol.Chem.,）第46巻，第837〜838頁,1982年に記載され
た理化学的性質を備えている。すなわち,2−ハロ酸デハ
ロゲナーゼの理化学的性質は，以下の通りである。
（１） 作用 水の存在下に,2−ハロ酸に作用してハロゲン原子を遊
離し,2−ヒドロキシ酸を生成する。
離し,2−ヒドロキシ酸を生成する。
（２） 基質特異性 Ｌ−２−クロルプロピオン酸を100とした場合の基質
に対する相対活性と生成物を次の表に示す。
に対する相対活性と生成物を次の表に示す。
モノフルオロ酢酸，トリクロル酢酸，クロルアセトア
ミド，クロルアセトアルデヒド,D−２−クロルプロピオ
ン酸,3−クロルプロピオン酸,DL−２−ブロモイソ酢酸,
DL−２−ブロモ−ｎ−吉草酸等には作用しない。
ミド，クロルアセトアルデヒド,D−２−クロルプロピオ
ン酸,3−クロルプロピオン酸,DL−２−ブロモイソ酢酸,
DL−２−ブロモ−ｎ−吉草酸等には作用しない。
（３） 至適pH: 約10.5 （４） 最適温度： 約45℃ （５） 安定pH pH6〜11において,37℃で10分間安定である。
（６） 熱安定性 50mMリン酸緩衝液（pH7.5）中，各温度で15分間処理
した後の残存活性は， 40℃;100％,45℃;90％， 50℃; 80％,55℃;50％， 60℃; 25％である。
した後の残存活性は， 40℃;100％,45℃;90％， 50℃; 80％,55℃;50％， 60℃; 25％である。
（７） 分子量 SDS電気泳動法により求めた分子量は，約25,000であ
る。
る。
次に本発明の２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子
の取得方法を説明する。
の取得方法を説明する。
２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産能を有する微生物から
周知の方法によりDNAを分離精製し，適当な制限酵素あ
るいは超音波等を用いて切断する。一方，適当な発現ベ
クターを，同様な方法で切断して１本鎖にした後，これ
と先のDNA断片とを，それぞれのDNA鎖の平滑又は接着末
端部においてDNAリガーゼ等により接合閉環させ，組換
えDNAベクターを作製する。このようにして得られた組
換えDNAベクターを複製可能な宿主微生物に移入した
後，ベクターのマーカーと２−ハロ酸デハロゲナーゼ活
性とを指標として，組換えDNAベクターを保持する微生
物を選択する。選択された形質転換株を培養し，その培
養菌体から組換えDNAベクターを分離精製し，次いで，
該ベクターから２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子
であるDNAを採取することができる。
周知の方法によりDNAを分離精製し，適当な制限酵素あ
るいは超音波等を用いて切断する。一方，適当な発現ベ
クターを，同様な方法で切断して１本鎖にした後，これ
と先のDNA断片とを，それぞれのDNA鎖の平滑又は接着末
端部においてDNAリガーゼ等により接合閉環させ，組換
えDNAベクターを作製する。このようにして得られた組
換えDNAベクターを複製可能な宿主微生物に移入した
後，ベクターのマーカーと２−ハロ酸デハロゲナーゼ活
性とを指標として，組換えDNAベクターを保持する微生
物を選択する。選択された形質転換株を培養し，その培
養菌体から組換えDNAベクターを分離精製し，次いで，
該ベクターから２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子
であるDNAを採取することができる。
本発明の２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子の供
与体としては,2−ハロ酸デハロゲナーゼ生産能を有する
微生物であればいかなるものでもよいが，好ましい例と
しては，シユードモナス プチダ（Pseudomonas putid
a）109株があげられ，本菌株は通産省工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研条寄第2631号（FERM BD−263
1）として寄託されている。
与体としては,2−ハロ酸デハロゲナーゼ生産能を有する
微生物であればいかなるものでもよいが，好ましい例と
しては，シユードモナス プチダ（Pseudomonas putid
a）109株があげられ，本菌株は通産省工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研条寄第2631号（FERM BD−263
1）として寄託されている。
本発明の２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子を含
むDNAは，供与体である微生物から周知の方法〔例え
ば，モレキユラー クローニング（Molecular Clonin
g）A Laboratory Manual第90〜91頁,1982年に記載の方
法〕に従い採取することができる。すなわち，供与微生
物を，例えば，液体培地で約１〜２日間好気的に培養
し，得られた微生物菌体を溶菌させることによって,2−
ハロ酸デハロゲナーゼ遺伝子を含有する溶菌物を得る。
溶菌方法としては，例えば，リゾチームやβ−グルカナ
ーゼ等を用いた酵素処理，ラウリル硫酸ナトリウムやト
リトン等を用いた界面活性剤処理,EDTAと酵素，界面活
性剤との併用，凍結融解，フレンチプレス又は機械的磨
砕等の物理的処理があげられる。このようにして得られ
た溶菌物から，例えば，フエノール抽出による除タンパ
ク処理，プロテアーゼ処理，リボヌクレアーゼ処理，ア
ルコール沈澱，遠心分離等の方法を組合わせることによ
りDNAを分離精製することができる。
むDNAは，供与体である微生物から周知の方法〔例え
ば，モレキユラー クローニング（Molecular Clonin
g）A Laboratory Manual第90〜91頁,1982年に記載の方
法〕に従い採取することができる。すなわち，供与微生
物を，例えば，液体培地で約１〜２日間好気的に培養
し，得られた微生物菌体を溶菌させることによって,2−
ハロ酸デハロゲナーゼ遺伝子を含有する溶菌物を得る。
溶菌方法としては，例えば，リゾチームやβ−グルカナ
ーゼ等を用いた酵素処理，ラウリル硫酸ナトリウムやト
リトン等を用いた界面活性剤処理,EDTAと酵素，界面活
性剤との併用，凍結融解，フレンチプレス又は機械的磨
砕等の物理的処理があげられる。このようにして得られ
た溶菌物から，例えば，フエノール抽出による除タンパ
ク処理，プロテアーゼ処理，リボヌクレアーゼ処理，ア
ルコール沈澱，遠心分離等の方法を組合わせることによ
りDNAを分離精製することができる。
分離精製された微生物DNAを切断する方法としては，
例えば，超音波処理，制限酵素処理等により行うことが
できるが，得られるDNA断片とベクターとの結合を容易
にするため，制限酵素，とりわけ特定ヌクレオチド配列
に作用する，例えば,Sal I,EcoR I,Hind III,BamH I等
のII型制限酵素が適している。
例えば，超音波処理，制限酵素処理等により行うことが
できるが，得られるDNA断片とベクターとの結合を容易
にするため，制限酵素，とりわけ特定ヌクレオチド配列
に作用する，例えば,Sal I,EcoR I,Hind III,BamH I等
のII型制限酵素が適している。
ベクターとしては，宿主微生物体内で自律的に増殖し
得るフアージ又はプラスミドから遺伝子組換え用として
構築されたものが適しており，大腸菌（E.coli）を宿主
とする場合には，フアージとしては，例えば，λgt・λ
C,λgt・λＢ等が，また，プラスミドとしては，例え
ば,pBR322,pBR325,pACYC184,pUC12,pUC13,pUC18,pUC19
等が使用できる。このようなベクターを，先に述べた２
−ハロ酸デハロゲナーゼ遺伝子を含む微生物DNAの切断
に使用した制限酵素と同じ制限酵素で切断して，ベクタ
ー断片を得ることが好ましい。
得るフアージ又はプラスミドから遺伝子組換え用として
構築されたものが適しており，大腸菌（E.coli）を宿主
とする場合には，フアージとしては，例えば，λgt・λ
C,λgt・λＢ等が，また，プラスミドとしては，例え
ば,pBR322,pBR325,pACYC184,pUC12,pUC13,pUC18,pUC19
等が使用できる。このようなベクターを，先に述べた２
−ハロ酸デハロゲナーゼ遺伝子を含む微生物DNAの切断
に使用した制限酵素と同じ制限酵素で切断して，ベクタ
ー断片を得ることが好ましい。
微生物DNA断片とベクター断片とを結合させる方法と
しては，公知のDNAリガーゼを用いる方法であればいか
なる方法でもよく，例えば，微生物DNAの接着末端とベ
クター断片の接着末端とのアニーリングの後，適当なDN
Aリガーゼの作用により，微生物DNA断片とベクター断片
との組換えDNAベクターが作製できる。
しては，公知のDNAリガーゼを用いる方法であればいか
なる方法でもよく，例えば，微生物DNAの接着末端とベ
クター断片の接着末端とのアニーリングの後，適当なDN
Aリガーゼの作用により，微生物DNA断片とベクター断片
との組換えDNAベクターが作製できる。
宿主微生物としては，組換えDNAベクターが安定かつ
自律的に増殖可能で，さらに外来遺伝子の形質が発現で
きるものであればいかなるものでもよく，宿主微生物と
して大腸菌を用いる場合には，例えば,E.coli DH1,E.co
li HB101,E.coli W3110,E.coli C600等が利用できる。
自律的に増殖可能で，さらに外来遺伝子の形質が発現で
きるものであればいかなるものでもよく，宿主微生物と
して大腸菌を用いる場合には，例えば,E.coli DH1,E.co
li HB101,E.coli W3110,E.coli C600等が利用できる。
宿主微生物に組換えDNAベクターを移入する方法とし
ては，例えば，宿主微生物が大腸菌の場合には，カルシ
ウムイオンの存在下で組換えDNAベクターを移入するこ
とができ，宿主微生物への目的組換えDNAベクター移入
の有無については，用いたベクターの薬剤耐性マーカー
と２−ハロ酸デハロゲナーゼ活性とを同時に発現する微
生物を検索すればよい。このようにして得られた形質転
換株である微生物から，組換えDNAベクターを採取し，
制限酵素により分解後，電気泳動にて分離して，本発明
の２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子を得ることが
できる。
ては，例えば，宿主微生物が大腸菌の場合には，カルシ
ウムイオンの存在下で組換えDNAベクターを移入するこ
とができ，宿主微生物への目的組換えDNAベクター移入
の有無については，用いたベクターの薬剤耐性マーカー
と２−ハロ酸デハロゲナーゼ活性とを同時に発現する微
生物を検索すればよい。このようにして得られた形質転
換株である微生物から，組換えDNAベクターを採取し，
制限酵素により分解後，電気泳動にて分離して，本発明
の２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子を得ることが
できる。
上述の方法により得られた２−ハロ酸デハロゲナーゼ
遺伝子の塩基配列は，塩基配列の決定方法として現在広
く用いられているジデオキシ法〔サイエンス（Scienc
e）第214巻，第1205〜1210頁,1981年〕で解読すること
ができる。
遺伝子の塩基配列は，塩基配列の決定方法として現在広
く用いられているジデオキシ法〔サイエンス（Scienc
e）第214巻，第1205〜1210頁,1981年〕で解読すること
ができる。
本発明の２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子は，
周知の遺伝子工学の手法により，適当な宿主微生物に組
込むことができ，得られた組換え微生物を培養すること
によって,2−ハロ酸デハロゲナーゼの実用的な生産を可
能にするものである。
周知の遺伝子工学の手法により，適当な宿主微生物に組
込むことができ，得られた組換え微生物を培養すること
によって,2−ハロ酸デハロゲナーゼの実用的な生産を可
能にするものである。
形質転換株である宿主微生物を培養するには，宿主微
生物の生理的性質を考慮して条件を設定すればよく，通
常液体培養が採用され，工業的には深部通気撹拌培養が
有利である。用いる培地の栄養源としては，微生物培養
に通常用いられるものが広く利用できる。炭素源として
は，宿主微生物が利用可能な炭素化合物であればいかな
るものでもよく，例えば，グルコース，シユークロー
ス，ラクトース，マルトース，フラクトース，糖蜜等が
使用できる。窒素源としては，同じく利用可能なもので
あればいかなるものでもよく，例えば，ペプトン，肉エ
キス，酵母エキス，コーンステイープリカー及び硫安，
硝安等の無機窒素化合物が使用できる。その他，リン酸
塩，炭素塩，硫酸塩，マグネシウム，カリウム，カルシ
ウム，鉄，マンガン，亜鉛等の塩類，特定のアミノ酸，
特定のビタミン等を必要に応じて添加してもよい。
生物の生理的性質を考慮して条件を設定すればよく，通
常液体培養が採用され，工業的には深部通気撹拌培養が
有利である。用いる培地の栄養源としては，微生物培養
に通常用いられるものが広く利用できる。炭素源として
は，宿主微生物が利用可能な炭素化合物であればいかな
るものでもよく，例えば，グルコース，シユークロー
ス，ラクトース，マルトース，フラクトース，糖蜜等が
使用できる。窒素源としては，同じく利用可能なもので
あればいかなるものでもよく，例えば，ペプトン，肉エ
キス，酵母エキス，コーンステイープリカー及び硫安，
硝安等の無機窒素化合物が使用できる。その他，リン酸
塩，炭素塩，硫酸塩，マグネシウム，カリウム，カルシ
ウム，鉄，マンガン，亜鉛等の塩類，特定のアミノ酸，
特定のビタミン等を必要に応じて添加してもよい。
培養温度としては，菌が生育する範囲であればいかな
る温度でもよく，宿主が大腸菌の場合，好ましくは25〜
40℃程度である。培地のpHとしては，宿主が生育可能な
範囲であればいかなるpHでもよく，好ましくはpH6〜８
の範囲に調整すればよい。培養時間としては，培養条件
によって異なるが，菌体中の２−ハロ酸デハロゲナーゼ
活性が最高に達する時期に培養を終了すればよく，通常
12〜48時間程度である。
る温度でもよく，宿主が大腸菌の場合，好ましくは25〜
40℃程度である。培地のpHとしては，宿主が生育可能な
範囲であればいかなるpHでもよく，好ましくはpH6〜８
の範囲に調整すればよい。培養時間としては，培養条件
によって異なるが，菌体中の２−ハロ酸デハロゲナーゼ
活性が最高に達する時期に培養を終了すればよく，通常
12〜48時間程度である。
以上のようにして培養した後，培養物から本発明の遺
伝子産物である２−ハロ酸デハロゲナーゼを採取するに
は，以下の方法を採用すればよい。
伝子産物である２−ハロ酸デハロゲナーゼを採取するに
は，以下の方法を採用すればよい。
すなわち，得られた培養物から遠心分離等により菌体
を分離し，次いで，この菌体を機械的方法又はリゾチー
ム等の酵素法，また，必要に応じてEDTA等のキレート剤
及び界面活性剤等を添加して細胞破砕し,2−ハロ酸デハ
ロゲナーゼを可溶化して細胞破片等を除き，粗抽出液を
得る。さらに精製を行うにあたっては，酵素の一般的な
精製法，すなわち，除核酸，硫安塩析，有機溶媒による
分別沈澱及びイオン交換クロマト，吸着クロマト，疎水
クロマト等の各種カラムクロマトグラフイー，さらにゲ
ル濾過，電気泳動等の処理を施せばよい。
を分離し，次いで，この菌体を機械的方法又はリゾチー
ム等の酵素法，また，必要に応じてEDTA等のキレート剤
及び界面活性剤等を添加して細胞破砕し,2−ハロ酸デハ
ロゲナーゼを可溶化して細胞破片等を除き，粗抽出液を
得る。さらに精製を行うにあたっては，酵素の一般的な
精製法，すなわち，除核酸，硫安塩析，有機溶媒による
分別沈澱及びイオン交換クロマト，吸着クロマト，疎水
クロマト等の各種カラムクロマトグラフイー，さらにゲ
ル濾過，電気泳動等の処理を施せばよい。
（実施例） 次に，実施例によって，本発明をさらに具体的に説明
する。
する。
なお，実施例中の２−ハロ酸デハロゲナーゼの活性値
は,30℃で１分間に１μmolのハロゲンイオンを遊離する
酵素量を１ユニツトとしたものであり，基質は,DL−２
−クロルプロピオン酸を用いた。ハロゲンイオンは，チ
オシアン酸水銀と硫酸鉄アンモニウムを用いる比色定量
法〔ブリテン ケミカル ソサイエテイー オブ ジヤ
パン（Bull.Chem.Soc.Jpn.,）第29巻，第860〜864頁,19
56年〕にて求めた。
は,30℃で１分間に１μmolのハロゲンイオンを遊離する
酵素量を１ユニツトとしたものであり，基質は,DL−２
−クロルプロピオン酸を用いた。ハロゲンイオンは，チ
オシアン酸水銀と硫酸鉄アンモニウムを用いる比色定量
法〔ブリテン ケミカル ソサイエテイー オブ ジヤ
パン（Bull.Chem.Soc.Jpn.,）第29巻，第860〜864頁,19
56年〕にて求めた。
また，実施例中の％は，すべてW/V％を表す。
実施例１ シユードモナス プチダ 109株（微工研菌寄第10262
号）を培養し,2−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子を
含むDNAを，モレキユラー クローニング（Molecular C
loning）A Laboratory Manual第90〜91頁,1982年に記載
の方法に従い，以下のようにして得た。
号）を培養し,2−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子を
含むDNAを，モレキユラー クローニング（Molecular C
loning）A Laboratory Manual第90〜91頁,1982年に記載
の方法に従い，以下のようにして得た。
0.3％DL−２−クロルプロピオン酸,0.5％硫安,0.1％
リン酸１カリウム,0.1％リン酸２ナトリウム,0.01％硫
酸マグネシウム,pH7の培地が100ml入った500ml容三角フ
ラスコ５本にシユードモナス プチダ 109株を植菌し,
30℃で24時間回転振盪培養後，遠心分離により集菌し
た。この菌体を,50mMグルコース,25mMトリス塩酸緩衝液
（pH8.0）,10mMEDTA,5mg/mlリゾチームの混合液10mlに
懸濁し，室温で５分間処理した後,20mlの１％SDSを含ん
だ0.2NNaOHを添加し，ゆるやかに撹拌後，氷水中に10分
間放置した。次いで,15mlの氷冷した5M酢酸カリウム（p
H4.8）溶液を添加して，すばやく撹拌し，氷水中に10分
間放置後，遠心分離し，上澄みを集め，この上澄液に，
上澄液の0.6容量のイソプロパノールを添加して，撹拌
し,15分間放置した。遠心分離により沈澱物を集め,70％
エタノールで洗浄後,0.1mMEDTAを含む10mMトリス塩酸緩
衝液（pH8.0）に溶解した。
リン酸１カリウム,0.1％リン酸２ナトリウム,0.01％硫
酸マグネシウム,pH7の培地が100ml入った500ml容三角フ
ラスコ５本にシユードモナス プチダ 109株を植菌し,
30℃で24時間回転振盪培養後，遠心分離により集菌し
た。この菌体を,50mMグルコース,25mMトリス塩酸緩衝液
（pH8.0）,10mMEDTA,5mg/mlリゾチームの混合液10mlに
懸濁し，室温で５分間処理した後,20mlの１％SDSを含ん
だ0.2NNaOHを添加し，ゆるやかに撹拌後，氷水中に10分
間放置した。次いで,15mlの氷冷した5M酢酸カリウム（p
H4.8）溶液を添加して，すばやく撹拌し，氷水中に10分
間放置後，遠心分離し，上澄みを集め，この上澄液に，
上澄液の0.6容量のイソプロパノールを添加して，撹拌
し,15分間放置した。遠心分離により沈澱物を集め,70％
エタノールで洗浄後,0.1mMEDTAを含む10mMトリス塩酸緩
衝液（pH8.0）に溶解した。
次に,2−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子を含むDN
Aを切断し，ベクタープラスミドに挿入し，組換えプラ
スミドを作製した。すなわち，上記で得られたDNA約１
μｇにEcoR Iを８ユニツト添加し,37℃で１晩反応後,65
℃で５分間熱処理した。これに２倍量のエタノールを添
加し，−70℃に冷却して生じた沈澱を遠心分離により集
め，分解DNAを得た。この分解DNAを,25mMEDTA,89mMほう
酸,89mMトリス緩衝液（pH8.3）,0.5mg/エチジウムブ
ロマイド,8mg/mlアガロースからなるゲルを用いて,7ボ
ルト/cmの定電圧で電気泳動により分離し，それぞれのD
NA断片をゲルから抽出した。一方，約１μｇのpBR322に
８ユニツトのEcoR Iを添加し,37℃で一晩反応後,65℃で
５分間熱処理した。これに２倍量のエタノールを添加
し，−70℃に冷却して生じた沈澱を遠心分離により集め
た。このようにして得られたEcoR Iにより切断されたpB
R322と，同じくEcoR Iにより切断され，電気泳動により
分離されたDNA断片とを,66mMトリス緩衝液（pH7.6）,6.
6mM MgCl2,10mMDTT,0.1mMATP,約1000ユニツトのT4DNAリ
ガーゼを含む総容量50μの混合液に溶解し,12〜13℃
で一晩反応させた。
Aを切断し，ベクタープラスミドに挿入し，組換えプラ
スミドを作製した。すなわち，上記で得られたDNA約１
μｇにEcoR Iを８ユニツト添加し,37℃で１晩反応後,65
℃で５分間熱処理した。これに２倍量のエタノールを添
加し，−70℃に冷却して生じた沈澱を遠心分離により集
め，分解DNAを得た。この分解DNAを,25mMEDTA,89mMほう
酸,89mMトリス緩衝液（pH8.3）,0.5mg/エチジウムブ
ロマイド,8mg/mlアガロースからなるゲルを用いて,7ボ
ルト/cmの定電圧で電気泳動により分離し，それぞれのD
NA断片をゲルから抽出した。一方，約１μｇのpBR322に
８ユニツトのEcoR Iを添加し,37℃で一晩反応後,65℃で
５分間熱処理した。これに２倍量のエタノールを添加
し，−70℃に冷却して生じた沈澱を遠心分離により集め
た。このようにして得られたEcoR Iにより切断されたpB
R322と，同じくEcoR Iにより切断され，電気泳動により
分離されたDNA断片とを,66mMトリス緩衝液（pH7.6）,6.
6mM MgCl2,10mMDTT,0.1mMATP,約1000ユニツトのT4DNAリ
ガーゼを含む総容量50μの混合液に溶解し,12〜13℃
で一晩反応させた。
このようにして得られた組換えプラスミドを用いて，
以下のようにしてE.coli C600の形質転換を行った。100
mlのＬ−ブロス（１％トリプトン,0.5％酵母エキス,1％
NaCl,pH7.5）にE.coli C600株を接種し,37℃で２〜４時
間振盪培養後，冷却して遠心分離により集菌した。50ml
の滅菌カルシウム溶液〔50mMCaCl2,10mMトリス緩衝液
（pH8.0）〕に懸濁し,15分間氷冷後，遠心分離して上澄
液みを捨て,7mlの滅菌カルシウム溶液に懸濁した。この
懸濁液0.2mlに対し組換えプラスミド40ngを加え，氷水
中に30分,42℃の温水に２分間浸漬後,1mlのＬ−ブロス
を添加し,37℃に１時間放置した。次いで,0.3％DL−２
−クロルプロピオン酸を含むＬ−寒天培地（１％トリプ
トン,0.5％酵母エキス,1％NaCl,1.5％寒天,pH7.5）上に
塗布し,37℃で一晩培養したところ,2.8kbのDNA断片を組
込んだプラスミド保持株が形質転換され，上記培地上で
生育することがわかった。
以下のようにしてE.coli C600の形質転換を行った。100
mlのＬ−ブロス（１％トリプトン,0.5％酵母エキス,1％
NaCl,pH7.5）にE.coli C600株を接種し,37℃で２〜４時
間振盪培養後，冷却して遠心分離により集菌した。50ml
の滅菌カルシウム溶液〔50mMCaCl2,10mMトリス緩衝液
（pH8.0）〕に懸濁し,15分間氷冷後，遠心分離して上澄
液みを捨て,7mlの滅菌カルシウム溶液に懸濁した。この
懸濁液0.2mlに対し組換えプラスミド40ngを加え，氷水
中に30分,42℃の温水に２分間浸漬後,1mlのＬ−ブロス
を添加し,37℃に１時間放置した。次いで,0.3％DL−２
−クロルプロピオン酸を含むＬ−寒天培地（１％トリプ
トン,0.5％酵母エキス,1％NaCl,1.5％寒天,pH7.5）上に
塗布し,37℃で一晩培養したところ,2.8kbのDNA断片を組
込んだプラスミド保持株が形質転換され，上記培地上で
生育することがわかった。
このようにして得られた形質転換株が保持する２−ハ
ロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子を，以下のようにして
特定した。形質転換株からプラスミドを分離精製し，電
気泳動で挿入断片を分離した。
ロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子を，以下のようにして
特定した。形質転換株からプラスミドを分離精製し，電
気泳動で挿入断片を分離した。
すなわち,2.5mMEDTA,89mMほう酸,89mMトリス緩衝液
（pH8.3）に,0.5mg/エチジウムブロマイドを含む,8ml
/mlのアガロースゲルを用い，これにEcoR I処理したプ
ラスミドと分子量マーカーとを同時に７ボルト/cmの定
電圧で３〜４時間泳動後,UVランプを照射し,2.8kbのバ
ンドを確認してその部分のゲルを切り出し,60℃で,5分
間処理してアガロースを溶解させ，フエノール処理，エ
タノール沈澱を行ってDNAを回収した。
（pH8.3）に,0.5mg/エチジウムブロマイドを含む,8ml
/mlのアガロースゲルを用い，これにEcoR I処理したプ
ラスミドと分子量マーカーとを同時に７ボルト/cmの定
電圧で３〜４時間泳動後,UVランプを照射し,2.8kbのバ
ンドを確認してその部分のゲルを切り出し,60℃で,5分
間処理してアガロースを溶解させ，フエノール処理，エ
タノール沈澱を行ってDNAを回収した。
次に,T4DNAリガーゼを用いて，回収したDNAをM13フア
ージベクターに結合させ，生物化学実験法18,核酸の塩
基配列決定法（学会出版センター），第61〜114頁に記
載の方法に従って塩基配列を決定した。２−ハロ酸デハ
ロゲナーゼのポリペプチドをコードする領域は,2−ハロ
酸デハロゲナーゼのＮ末端10個のアミノ酸配列に対応す
るDNA塩基配列と，開始コドン（ATG）と終止コドン（TG
A）により決定した。
ージベクターに結合させ，生物化学実験法18,核酸の塩
基配列決定法（学会出版センター），第61〜114頁に記
載の方法に従って塩基配列を決定した。２−ハロ酸デハ
ロゲナーゼのポリペプチドをコードする領域は,2−ハロ
酸デハロゲナーゼのＮ末端10個のアミノ酸配列に対応す
るDNA塩基配列と，開始コドン（ATG）と終止コドン（TG
A）により決定した。
以上のような方法により得られたDNAの塩基配列は，
前記した通りの塩基配列を示した。
前記した通りの塩基配列を示した。
参考例１ 実施例１で得られた本発明の２−ハロ酸デハロゲナー
ゼ生産性遺伝子が挿入された組換えプラスミドを保持す
るE.coli C600株の２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性を
調べた。
ゼ生産性遺伝子が挿入された組換えプラスミドを保持す
るE.coli C600株の２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性を
調べた。
100mlのＬ−ブロスに，形質転換されたE.coli C600株
を接種し,37℃で８時間回転振盪培養し，得られた培養
物中の２−ハロ酸デハロゲナーゼ活性を測定したとこ
ろ，約380ユニツトであった。
を接種し,37℃で８時間回転振盪培養し，得られた培養
物中の２−ハロ酸デハロゲナーゼ活性を測定したとこ
ろ，約380ユニツトであった。
なお，比較のため，本発明の２−ハロ酸デハロゲナー
ゼ生産性遺伝子の供与微生物であるシユードモナス プ
チダ 109株の２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性を調べ
たところ，シユードモナス プチダ 109株をＬ−ブロ
スで培養して得られた培養物中には,2−ハロ酸デハロゲ
ナーゼ活性は検出できなかった。そこで,0.3％DL−２−
クロルプロピオン酸,0.5％硫安,0.1％リン酸１カリウ
ム,0.1％リン酸２ナトリウム,0.01％硫酸マグネシウム
からなる培地100mlにシユードモナス プチダ 109株を
接種し,30℃で８時間回転振盪培養し，得られた培養物
中の２−ハロ酸デハロゲナーゼ活性を測定したところ，
約25ユニツトであった。
ゼ生産性遺伝子の供与微生物であるシユードモナス プ
チダ 109株の２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性を調べ
たところ，シユードモナス プチダ 109株をＬ−ブロ
スで培養して得られた培養物中には,2−ハロ酸デハロゲ
ナーゼ活性は検出できなかった。そこで,0.3％DL−２−
クロルプロピオン酸,0.5％硫安,0.1％リン酸１カリウ
ム,0.1％リン酸２ナトリウム,0.01％硫酸マグネシウム
からなる培地100mlにシユードモナス プチダ 109株を
接種し,30℃で８時間回転振盪培養し，得られた培養物
中の２−ハロ酸デハロゲナーゼ活性を測定したところ，
約25ユニツトであった。
すなわち，本発明の遺伝子を用いて得られる形質転換
株を培養することにより,2−ハロ酸デハロゲナーゼの生
産性が著しく向上したことがわかった。
株を培養することにより,2−ハロ酸デハロゲナーゼの生
産性が著しく向上したことがわかった。
（発明の効果） 本発明の２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子を用
い，遺伝子工学の手法を適用することにより，医薬中間
体の合成や分析用試薬等に用いられる，有用な２−ハロ
酸デハロゲナーゼを多量に生産することが可能となり，
本酵素の工業的実用生産が達成できる。
い，遺伝子工学の手法を適用することにより，医薬中間
体の合成や分析用試薬等に用いられる，有用な２−ハロ
酸デハロゲナーゼを多量に生産することが可能となり，
本酵素の工業的実用生産が達成できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/55 C12N 9/14 ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】下記塩基配列 を有することを特徴とする２−ハロ酸デハロゲナーゼ生
産性遺伝子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21772289A JP2788070B2 (ja) | 1989-08-24 | 1989-08-24 | ２―ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21772289A JP2788070B2 (ja) | 1989-08-24 | 1989-08-24 | ２―ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0380085A JPH0380085A (ja) | 1991-04-04 |
| JP2788070B2 true JP2788070B2 (ja) | 1998-08-20 |
Family
ID=16708715
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21772289A Expired - Fee Related JP2788070B2 (ja) | 1989-08-24 | 1989-08-24 | ２―ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2788070B2 (ja) |
-
1989
- 1989-08-24 JP JP21772289A patent/JP2788070B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0380085A (ja) | 1991-04-04 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |