JP2602840B2

JP2602840B2 - プラスミド及びそれで形質転換されたエシェリチア・コリ

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Publication number: JP2602840B2
Application number: JP20052487A
Authority: JP
Inventors: 米和阪本; 雅夫影山
Original assignee: Unitika Ltd
Current assignee: Unitika Ltd
Priority date: 1987-08-10
Filing date: 1987-08-10
Publication date: 1997-04-23
Anticipated expiration: 2012-04-23
Also published as: JPS6443194A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は耐熱性のアラニン脱水素酵素の遺伝子を有す
る新規なプラスミド及びこのプラスミドで形質転換され
た新規なエシェリチア・コリに関するものである。

（従来の技術）アラニン脱水素酵素は，臨床検査，食品分析又はＬ−
アラニン合成用酵素として，非常に重要な酵素である。
このアラニン脱水素酵素を生産できる微生物としては常
温菌であるバチルス・スフェリカス（Bacillus sphaeri
cus）のようなバチルス属の細菌が知られている。しか
し，これらの細菌より得られるアラニン脱水素酵素は室
温の水溶液中で１〜３週間のうちに活性をほとんどを失
うのが通例であり，熱安定性及び長期の安定性に欠ける
ものであるという大きな欠点を有している。

それゆえ，アラニン脱水素酵素を用いる臨床検査の分
析法やＬ−アラニンの合成法の利点を最大限に発揮する
うえで，熱に安定で，室温で長時間活性を失わないアラ
ニン脱水素酵素の出現が熱望されていた。

このため，バイオキミカ・エト・バイオフイジカ・ア
タカ（Biochim.Biophys.Acta.）615,34〜47（1980）に
は，サーマス(Thermus)属に属する細菌から熱に安定
で，室温で長時間活性を失わないアラニン脱水素酵素が
得られることが提案されている。

しかし，この好熱性のサーマス属に属する細菌は，耐
熱性のアラニン脱水素酵素の生産性が低く，この酵素を
効率良く得るには，十分満足するものでなかった。

一方，エシェリチア（Escherichia）属に属する細菌
は，本来アラニン脱水素酵素生産能を全く有していな
い。

また，組換えDNAに有用なプラスミド及びそれによっ
て形質転換された微生物は良く知られている。例えば，
サイエンス（Science）198,1056（1978）には，プラス
ミドpBR322にラクトースプロモーターをつないだプラス
ミドを導入した大腸菌内で動物タンパク質が生産される
ことが記載されている。

また，特開昭56−5093号公報には，サーマス属に属す
る細菌の遺伝子を有するプラスミド（ベクターとしてプ
ラスミドpBR322が用いられている。）を導入することに
より形質転換されたエシェリチア（Escherichia）属に
属する細菌を用いて耐熱性の酵素を調製することが記載
されているが，耐熱性のアラニン脱水素酵素の遺伝子を
有するプラスミド及びそれによって形質転換された微生
物については，全く何も記載されていないし，またその
創製に成功したとの報告もなされていない。

さらに，本発明者らの一部は，このような観点から，
耐熱性のアラニン脱水素酵素の生産性を向上させるため
に常温微生物内で耐熱性のアラニン脱水素酵素が発現で
きるプラスミド及び耐熱性のアラニン脱水素酵素を効率
良く生産しうることのできる微生物を求めて鋭意研究し
た結果，好熱性の微生物からアラニン脱水素酵素の遺伝
子を分離し，この遺伝子が公知のプラスミドDNAに導入
しうること及びこのようにして遺伝子を導入して得たプ
ラスミドが前記の性質を有することを見い出し，さらに
このプラスミドで形質転換されたエシェリチア・コリが
大量の耐熱性のアラニン脱水素酵素を生産することを見
い出し，特許出願した（特開昭60−180580号公報及び特
開昭60−180590号公報）。

（発明が解決しようとする問題点）前記のプラスミドは，アラニン脱水素酵素の遺伝子の
他に好熱性微生物由来の多くのDNA領域を含んでいる
（分子量３メガダルトン）ため，常温微生物での発現が
充分でなく，それゆえ，このプラスミドで形質転換され
たエシェリチア・コリでは耐熱性のアラニン脱水素酵素
の生産性がいまだ充分ではなく，耐熱性のアラニン脱水
素酵素を効率良く得るには充分満足できるものではなか
った。

（問題点を解決するための手段）そこで，本発明者らは，耐熱性のアラニン脱水素酵素
の生産性を向上させるため，常温微生物内で効率良く発
現できるプラスミド及び耐熱性のアラニン脱水素酵素含
量の高い微生物を求めて鋭意研究した結果，特定の分子
量を有する好熱性微生物由来のアラニン脱水素酵素遺伝
子をベクタープラスミドに連結した組み換え体プラスミ
ドが前記の性質を有していることを見い出し，かつ，こ
のプラスミドで形質転換されたエシェリチア・コリ（Es
cherichia coli）が耐熱性のアラニン脱水素酵素を効率
良く生産することを見い出し，本発明を完成した。

すなわち，本発明は分子量が２メガダルトン以下の耐
熱性のアラニン脱水素酵素遺伝子をベクタープラスミド
に連結した組み換え体プラスミド及び分子量が２メガダ
ルトン以下の耐熱性のアラニン脱水素酵素遺伝子をベク
タープラスミドに連結した組換え体プラスミドで形質転
換されたエシェリチア・コリ（Escherichia coli）を
要旨とするものである。

本発明のプラスミドを得るには，例えばバイオキミカ
・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochim.Biophys.Ac
ta）72,619〜629（1963年）に記載の方法に従い，分子
量が２メガダルトン以下の耐熱性のアラニン脱水素酵素
の遺伝子とベクターとしての役割を有するDNAとをジヤ
ーナル・オブ・モレキユラー・バイオロジー（J.Mol.Bi
ol.）96 171〜184（1974）に記載の方法に従い，制限酵
素で消化し，次いでリガーゼを用いて結合することによ
り調製することができる。

上記のベクターとしての役割を有するDNAとしては，
例えばエシェリチア・コリ由来のプロモーターを有する
プラスミドpDR540,pDR720,pKK223−3,pBR322などのDNA
があげられ，特にプラスミドpKK223−３が好ましい。ま
た，制限酵素としては，例えばSal I,Hind IIIがあげら
れ，リガーゼとしては，例えばT4DNAリガーゼがあげら
れる。

本発明に用いられる耐熱性のアラニン脱水素酵素の遺
伝子としては，分子量が２メガダルトン以下であること
が必要であり，この遺伝子を得るには，例えば，次のご
とき方法を採用することができる。すなわち，まず，サ
ーマス属，好熱性のバチルス属（特にバチルス・ステア
ロサーモフイルスが好ましく，その具体例としてIFO125
50,ATCC7593,7594,8005,10149,12980があげられる），
クロストリジウム属などのアラニン脱水素酵素の遺伝子
を含む染色体DNAを調製し，これをベクタープラスミドp
BR322に導入することによりアラニン脱水素酵素遺伝子
を有するプラスミドを作成する。次にこのプラスミドの
外来遺伝子領域を取り出し，この取り出した外来遺伝子
領域をM13フアージベクターに導入して「蛋白質・核酸
・酵素」29 294〜306（1986）に記載の方法に従い,DNA
塩基配列を決定する。このDNA塩基配列をもとに、精製
したアラニン脱水素酵素のＮ末端のアミノ酸配列に対応
するDNA塩基配列と、各コドンに対応するアミノ酸翻訳
を行い、対応する開始コドンと終止コドンを決定した
後、アラニン脱水素酵素の遺伝子をコードしている２メ
ガダルトン以下のDNA領域を制限酵素処理し、アガロー
スゲル電気泳動により採取することができる。

この方法で例えば，プラスミドpKK223−３に，バチル
ス・ステアロサーモフィルスIFO12550株の染色体DNA由
来のアラニン脱水素酵素の遺伝子を導入したプラスミド
pICR330が得られる。このプラスミドpICR330を昭和62年
４月13日に通産省工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託の手続を行ったが，このプラスミドは受託されなかっ
た。

次にこのプラスミドpICR330の理化学的性質を示す。

（１）常温微生物内で耐熱性のアラニン脱水素酵素を発
現させることができる。

（２）第１図に示すごとく，下記制限酵素に対し，次の
切断感受性を有する。

制限酵素切断部位数Eco R I １Hin d III １Pst I １Sal I １Bam H I １制限酵素の名称は，次の菌種から得られる制限酵素の
略称である。Eco R I ;エシェリチア・コリHin d III;ヘモフィラス・インフルエンザPst I ;プロビデンシア・スチュアーティーSal I ;ストレプトマイセス・アルブスBam H I ;バチルス・アミロリクエファシエンス制限酵素による切断部位数は，過剰の制限酵素存在下
でプラスミドpICR330を消化し，その消化物をアガロー
スゲル電気泳動にかけ，分離可能な断片の数から決定さ
れる。

（３）分子量は約４メガダルトンである。

（４）分子量が２メガダルトン以下の耐熱性のアラニン
脱水素酵素遺伝子がベクタープラスミドのプロモーター
の下流に同方向に挿入されている。

本発明のエシェリチア・コリは，上記の分子量が２メ
ガダルトン以下の耐熱性のアラニン脱水素酵素遺伝子を
ベクタープラスミドに連結した組換え体プラスミドで形
質転換されたエシェリチア・コリであり，このプラスミ
ドpICR330を用いてエシェリチア・コリを形質転換させ
るには，例えば，ジャーナル・オブ・モレキュラ・バイ
オロジー（J.Mol.Biol.）53,159〜162（1970）の方法に
従って,0℃付近の温度で塩化カルシウム処理した上記の
プラスミドpICR330とエシェリチア・コリC600とを接触
させることにより行えばよい。

以上のようにして形質転換されたエシェリチア・コリ
の例として，プラスミドpICR330が導入されたエシェリ
チア・コリC600−pICR330株があげられる。

この菌株は，公知のエシェリチア・コリC600〔ネイチ
ャー（Nature）217,1110〜1114（1968）を参照〕と，耐
熱性のアラニン脱水素酵素生産能及びアンピシリン耐性
を有する点以外は同じ菌学的性質を有している。この菌
株は，非伝達性を伝達性に変えることなく，また非病原
性を病原性に変えることなく安全性が保持されている。
特に，分子量が２メガダルトン以下の耐熱性のアラニン
脱水素酵素遺伝子をエシェリチア・コリのプロモーター
の下流に組み込んだ耐熱性のアラニン脱水素酵素生産能
を有するエシェリチア・コリの報告はなかった。このこ
とから，エシェリチア・コリC600−pICR330株は新菌株
であると考えられるので，昭和62年４月13日に通産省工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。その微生物
受託番号は第9329号である。

本発明のエシェリチア・コリを培養するに際して用い
られる栄養培地の炭素源として，例えば，グルコース，
シュークロース，フルクトース，澱粉加水分解物，糖
蜜，亜硫酸パルプ廃液の糖類，酢酸，乳酸などの有機酸
類，さらには使用する細菌が資化しうるアルコール類，
脂肪酸及びグリセリンなどが使用でき，窒素源として，
例えば硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム，リン酸ア
ンモニウム，アミノ酸，ペプトン，肉エキス，酵母エキ
スなどの無機又は有機物が使用できる。さらに無機塩類
として，例えばカリウム，ナトリウム，リン酸，亜鉛，
鉄，マグネシウム，マンガン，銅，カルシウム，コバル
トなどの各塩類，必要に応じて微量金属塩，コーン・ス
ティープ・リカー，ビタミン類，核酸などを使用しても
よく，細菌の一般的栄養培地が使用できる。

これらの培地を用いて，本発明のエシェリチア・コリ
を20℃〜45℃，好ましくは35℃〜40℃，最適には37℃で
約10〜20時間,pHを7.0〜7.4,最適には7.2で好気的に培
養すればよい。

次に得られた培養物から本発明における耐熱性のアラ
ニン脱水素酵素が採取されるが，培養物，分離生菌体，
分離菌体の処理物，粗酵素抽出液，精製酵素などのあら
ゆる段階で採取できる。その際の精製法としては，通常
の酵素精製法を用いることができる。特に本発明では，
耐熱性のアラニン脱水素酵素を採取するに先立って，破
砕液を加熱処理すれば，耐熱性を有しない酵素や蛋白質
が熱変性することにより選択的に耐熱性のアラニン脱水
素酵素が得られるので有利である。この加熱処理の条件
としては，例えば50〜80℃の温度で５〜30分間処理すれ
ばよい。このようにして処理した後，分離精製して耐熱
性のアラニン脱水素酵素を得てもよいが，そのまま酵素
液として利用できる。

本発明によって得られる耐熱性のアラニン脱水素酵素
は，特開昭60−180580号公報や特開昭60−180590号公報
に記載の耐熱性のアラニン脱水素酵素と同じ理化学的性
質を有する。

すなわち，次の理化学的性質を示す。

（ａ）次の反応を触媒する。

Ｌ−アラニン＋NAD←−→ピルビン酸＋NADH＋NH₄ ⁺＋H⁺ 酸化的脱アミノ化反応の基質としてＬ−アラニン（10
0％）,L−α−アミノ酪酸（7.5％）,L−セリン（3.5
％）などがあり，また還元的アミノ化反応の基質として
ピルビン酸（100％），グリオキル（70％），α−ケト
酪酸（79％）などがある。

（ｂ）分子量約230,000であり，約38,000の同一サブユニツト６個
よりなるオリゴマー酵素である。

（ｃ）至適pH 脱アミノ化反応では10〜11であり，アミノ化反応では
８〜９である。

（ｄ）耐熱性 70℃で30分間熱処理しても失活しない。

（実施例）次に本発明を実施例により具体的に説明する。

なお，耐熱性のアラニン脱水素酵素の活性は，ヨーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur.
J.Biochem.）100,29〜30（1979）に記載されているアラ
ニン脱水素酵素活性の測定法に準じた。すなわちpH10.5
の100μmoleのグリシン−KCl −KOH緩衝液中で1.25μmo
leのNADと,10μmoleのＬ−アラニンを含む混合液を調製
し，その混合液に適当量の粗酵素抽出液を加えて，最終
容量を0.8mlとし,30℃における還元型NADの単位時間あ
たりの増加を340nmの吸光度の増加として測定する方法
で行った。

また，実施例及び参考例中の％は，容量％を示す。

実施例１（ａ）バチルス・ステアロサーモフィルスの染色体DNA
の分離。

バチルス・ステアロサーモフィルスIFO12550株から，
バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochi
m.Biophys.Acta.）72,619〜629（1963）に記載の方法に
準じ，染色体DNAを分離した。

まず，バチルス・ステアロサーモフィルスIFO12550株
をポリペプトン10g/l,酵母エキス2.5g/l,肉エキス2g/l,
グリセロール2g/l,塩化ナトリウム5g/l,リン酸１カリウ
ム2g/l,リン酸２カリウム2g/l,硫酸マグネシウム0.1g/
l,ビオチン４μg/lそしてpH7.2に調製した培地2lで,55
℃で12時間振盪培養した後，遠心分離にて集菌した。

次に12mgのリゾチームを6mlのサリン（saline）−EDT
A溶液（0.15M NaClと0.1M EDTAを含み,pH8.0に調製。）
に溶かし，この溶液に集菌した菌株を加え，よく攪拌し
た。これを37℃で約10分間加温し，菌体が溶菌し始めた
ら，直ちに凍結した。

この凍結した菌体に50mlのトリス−SDS緩衝液（10mg/
mlSDSと0.1M NaClを含むpH9.0に調製された0.1Mトリス
緩衝液。）を加えて攪拌し，さらに60℃に加温し，完全
に溶菌させた。

この溶菌液に56mlの80％フェノールを加えて，約20分
間振とうさせ，フェノール抽出を行い，夾雑蛋白質を除
去した。この抽出された粗DNA溶液に２倍容量の冷エタ
ノールを加えてガラス棒で繊維状の沈殿を巻き取り,70,
80,90％のエタノール各10ml中に順次，数分ずつ浸漬し
た後,20mlの希サリン−サイトレート（saline−citrat
e）溶液（0.015 M NaCl,0,0015 M Na₃−クエン酸に調
製。）に溶かし，さらに濃saline−citrate溶液（1.5 M
NaCl,0.15M Na₃−クエン酸に調製。）を2ml加えて，粗
DNA液を調製した。

この粗DNA液を500μg/ml位にうすめて，リボヌクレア
ーゼＡ〔RNaseA（シグマ社製）〕を50μg/mlになるよう
に加え,37℃で30分間加温した。冷却後，等量の80％フ
ェノールを加え，フェノール抽出を行い，抽出DNAをエ
タノール沈殿にて回収し，さらに上記の希saline−citr
ate溶液20mlに溶解させ，さらに上記の濃saline−citra
te溶液を2ml加えることにより，染色体DNAの抽出液を調
製した。

（ｂ）ベクタープラスミドpBR322の調製。

プラスミドpBR322〔ベセダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ（Bethesda Research Laboratories）社製〕を導入し
たエシェリチア・コリC600株を,2lのＬ−培地（ポリペ
プトン10g/l,酵母エキス5g/l,グルコース1g/l,塩化ナト
リウム5g/lを加え,pH7.2に調製。）で対数増殖前期にな
るまで37℃で好気培養した後,10mlのクロラムフェニコ
ール溶液（3.6mg/mlとなるようにエタノールで調製。）
を添加し，さらに37℃で15分間好気培養してプラスミド
pBR322を増殖させた。

次に遠心分離にて集菌した菌を80mlのTE−シュクロー
ス緩衝液（200mg/mlシュクロース,20mM EDTAを含み,pH
8.0に調製された0.05Mトリス緩衝液。）に懸濁し，さら
に8mlのリゾチーム溶液（5mg/mlとなるように上記TE−
シュクロース緩衝液にて調製。）を添加し，さらに28ml
の5M NaCl溶液と4mlの40mg/mlSDS溶液を加えた。

この混合液を37℃で２時間反応させた後，遠心分離に
て粗プラスミドDNAを分離した。

次に,1/2容量の80％フェノールを加えてフェノール処
理を行い，夾雑蛋白質を除去した。この抽出した粗プラ
スミドを冷イソプロパノールにて沈殿回収し，さらにTE
緩衝液（0.14 M NaCl,1mM EDTAを含む,pH7.5に調製され
た20mMトリス緩衝液。）に溶解した。この混合液に2mg
のRNaseAを添加し,37℃で２時間反応させ，上記と同様
の方法でフェノール処理にて夾雑RNAを除去した。この
抽出された粗プラスミドを２倍容量のエタノール沈殿に
て回収した。これを，さらに10mlの上記のTE緩衝液に溶
解させ，アガロースゲル濾過にて夾雑RNAをさらに除去
し，得られた粗DNAをエタノール沈殿にて再び回収し
た。

この沈殿を23.1mlの0.02Mトリス緩衝液（pH8.0に調
製。）に溶解し，さらに23.7gの塩化セシウムと0.6mlの
エチジウムブロマイド溶液（10mg/mlに調製。）を加
え，約40時間超遠心することにより，プラスミドDNAを
分離し，次にノルマルブタノールにより，エチジウムブ
ロマイドを除去した。この分離したプラスミドを0.01M
のTE緩衝液（0.1mM EDTAを含むpH7.5に調製された0.01M
トリス緩衝液。）で透析することにより，精製プラスミ
ドpBR322を得た。

（ｃ）プラスミドpICR3の創製。

（ａ）の方法で得られたバチルス・ステアロサーモフ
ィルスの染色体DNA10μｇと制限酵素Sal I（宝酒造社
製）30ユニットを,7mM MgCl₂,150mM NaCl,0.2mM EDTA,7
mM 2−メルカプトエタノール,0.01％BSAを含むpH7.5に
調製した10mMトリス緩衝液100μｌに入れ,37℃で30分間
反応させてDNAを消化させた後,65℃で５分間加熱し，Sa
l Iを不活性化し，冷エタノールにて消化DNA断片を沈殿
回収した。

次に，（ｂ）の方法で得られたプラスミドpBR322,3μ
ｇに制限酵素Sal I 3ユニットを加え，上記と同様の緩
衝液中で37℃で10時間反応させ，上記と同様の方法で消
化プラスミドDNAを回収した。こうして得られた消化染
色体及びプラスミドのDNAを混合し,T4DNAリガーゼ（宝
酒造社製）を用い,6.6mM MgCl₂,10mM DTT,66μM ATPを
含むpH7.6に調製した66mMトリス緩衝液中で,13℃で16時
間反応させ，消化DNAを再結合することにより，アラニ
ン脱水素酵素の遺伝子を有するプラスミドpICR3を得
た。

（ｄ）分子量が２メガダルトン以下の耐熱性のアラニン
脱水素酵素遺伝子の創製（ｃ）の方法で得られたプラスミドpICR3 5μｇを制
限酵素Sal I 20ユニットを用い,7mM MgCl₂,150mM NaCl,
0.2mM EDTA,7mM 2−メルカプトエタノール,0.1mg/ml BS
Aを含むpH7.5に調製した10mMトリス緩衝液で37℃で15時
間反応させてSal Iで処理したプラスミドpICR3を得，こ
のプラスミドpICR3と分子量マーカーとしてのラムダフ
アージDNAのHind III消化断片とを各１μｇを同時に1cm
当たり,7Vの定電圧で３〜４時間泳動させた。次に紫外
線ランプを照射し，目的とするフラグメントのバンドを
判定し，その部分のゲルを切り出し,65℃で５分間の熱
処理を行い，アガロースを溶解させてフェノール処理，
エタノール処理にてアラニン脱水素酵素遺伝子を含むバ
チルス・ステアロサーモフィルス染色体DNA領域を分離
した。

このときの電気泳動の条件は緩衝液として2.5mMのEDT
A,89mMの硼酸を含みpH8.3に調製した89mMのトリス緩衝
液を用い，またゲルとしてこのトリス緩衝液に8mg/mlの
LMPアガロース〔ベセダ・リサーチ・ラボラトリーズ（B
ethesda Research Laboratories）社製〕と,0.5mg/lに
調製したエチジウムブロマイドとを加えたものを用い
た。

次いで分離したDNAをM13フアージベクターにT4DNAリ
ガーゼを用いて結合させ，蛋白質・核酸・酵素29 294−
306（1984）に記載の方法に従い，ダイデオキシ法によ
るDNAの塩基配列を決定した。すなわち，精製したアラ
ニン脱水素酵素をエドマン分解して求めたＮ末端10個の
アミノ酸配列に対応するDNA塩基配列と，各コドンに対
応するアミノ酸翻訳を行い，対応する開始コドン（AT
G）と，終止コドン（TGA）とより決定した。

その結果を第２図に示す。

次に結合させたDNAをその近傍に存在する制限酵素Eco
R IとHind IIIのサイトをこれらの制限酵素（共に宝酒
造社製）で処理したのち，分子量が約１メガダルトンの
アラニン脱水素酵素遺伝子を上記と同様にしてアガロー
スゲル電気泳動により回収した。

（ｅ）プラスミドpICR330の創製ベクターとしてエシェリチア・コリ由来のタック（ta
c）プロモーターを有するプラスミドpKK223−３（フア
ルマシア社製）５μｇを制限酵素としてSma I,Hind III
（共に宝酒造社製）をそれぞれ５ユニット用い,7mM MgC
l₂,20mM KCl,7mM 2−メルカプトエタノール,0.1mg/ml B
SAを含むpH8.0に調製した10mMトリス緩衝液で約15時間
反応させ，次いで65℃で５分間熱処理を行って制限酵素
を失活させたのち，エタノール沈澱にてDNAを除去させ
た。

次に（ｄ）で得られた分子量が約１メガダルトンのア
ラニン脱水素酵素遺伝子を含むDNAと制限酵素処理した
プラスミドpKK223−３とを上記（ｄ）と同様のリガーゼ
反応を行って結合させてプラスミドpICR330を得た。

実施例２実施例１で得たプラスミドpICR330を用いてエシェリ
チア・コリの形質転換を行った。

まず，宿主菌のエシェリチア・コリC600r^-m^-株を50ml
の上記のＬ−培地にて培養し，遠心分離にて集菌後,50m
lの0.1M MgCl₂溶液に懸濁し，さらに遠心分離を行って
最終的には2.5mlの0.1M MgCl₂溶液に懸濁させた。

このようにして得られたエシェリチア・コリC600r^-m^-
株の懸濁液0.2mlに（ｅ）の方法で得られたプラスミドp
ICR330を含む混合物を0.1ml加え,0℃で30分間処理した
のち,42℃で２分間処理した。

次にこれに3mlの前記したＬ−培地を加え,37℃で１時
間培養し，さらにアンピシリン（15μg/mlに調製。）の
入ったＬ−寒天培地（Ｌ−培地１当り,15gの寒天を加
えたもの。）で37℃で培養後，生じたコロニーを見出す
ことにより，プラスミドpICR330の導入されたエシェリ
チア・コリC600−pICR330が得られた。

次にこうして得られたエシェリチア・コリC600−pICR
330のコロニーより，アンピシリン（15μg/mlに調
製。）の入った上記のグリセロール培地（ポリペプトン
10g/l,酵母エキス2.5g/l,肉エキス2g/l,グリセロール2g
/l,塩化ナトリウム5g/l,リン酸１カリウム2g/l,リン酸
２カリウム2g/l,硫酸マグネシウム0.1g/l,ビオチン４μ
g/lを含みpH7.2に調製）100mlで37℃で16時間，振とう
培養を行った。これを遠心分離にて集菌，洗浄後,5mlの
0.1mg/ml2−メルカプトエタノールを含み,pH7.4に調製
した0.01Mのリン酸緩衝液に懸濁し,0℃で５分間の超音
波処理にて菌体を破砕し，遠心分離にて粗酵素抽出液を
得た。

このようにして得た粗酵素抽出液の耐熱性のアラニン
脱水素酵素の活性を測定したところ,450ユニット/g・湿
菌体であった。これはDNA供与菌であるバチルス・ステ
アロサーモフィルスIFO12550株のアラニン脱水素酵素の
活性（2.8ユニット/g・湿菌体）よりも150倍以上の活性
があり，さらにエシェリチア・コリC600−pICR3株のア
ラニン脱水素酵素の活性（50ユニット/g・湿菌体）より
も約９倍の活性があった。

また，このアラニン脱水素酵素を含む粗酵素抽出液
は,2−メルカプトエタノールを0.1mg/ml％含むpH7.2の1
0mMリン酸緩衝液中,70℃で20分間加熱処理したところ,9
0％以上の残存活性を有していた。

次にこの菌株から実施例１の（ｂ）と同様の方法でプ
ラスミドpICR330を分離して，水平型のアガロースゲル
電気泳動でプラスミドpICR330の性質を調べた。

電気泳動に用いた緩衝液として,2.5mM EDTA−Na,89mM
の硼酸を含みpH8.3に調製した89mMのトリス緩衝液を用
い，ゲルとしてこの緩衝液に7mg/mlのアガロースと0.5m
g/lに調製したエチジウムブロマイドを加えたものを用
い，これに，プラスミドpICR330とプラスミドpBR322,さ
らに分子量マーカーとしてのラムダファージDNAのHind
III（宝酒造社製）消化断片を各１μgDNAを同一アガロ
ースゲル上で同時に巾1cm当たり,7Vの定付加電圧で３〜
４時間，泳動させた。次に紫外線ランプでバンドを判定
し，プラスミドpICR330の大きさを調べた結果，分子量
が約４メガダルトンであった。

また，このプラスミドpICR330を制限酵素EcoR I,Hind
III,BamH I,Pst I,Sal Iでそれぞれの制限酵素の適性
条件で反応させ，プラスミドpICR330を消化させた。

各制限酵素にて得られた消化試料は，上記と同様の方
法でアガロースゲル電気泳動を行い，各制限酵素による
切断部位数による切断部位数を調べた結果，プラスミド
pICR330は第１図に示すごとく，以下の切断感受性を有
する。

制限酵素切断部位数Eco R I １Hin d III １Pst I １Sal I １Bam H I １さらに，プラスミドpICR330は，Hind III,Sal I切断
部位にて，バチルス・ステアロサーモフィルスIFO12550
株のアラニン脱水素酵素の遺伝子を含む染色体DNA断片
とプラスミドpKK223−3DNAとが結合していることが明ら
かである。

参考例1,比較例１実施例２で得たエシェリチア・コリC600−pICR330株
をアンピシリン（15μg/mlに調製。）を含む前記グリセ
ロール培地100mlにて37℃で16時間振とう培養した。培
養後，遠心分離にて集菌し,0.1mg/mlの２−メルカプト
エタノールを含むpH7.4に調製した0.01Mリン酸緩衝液5m
lに懸濁し，約５分間の超音波処理で菌体を破砕した。
その菌体破砕液の酵素活性を測定したところ，アラニン
脱水素酵素の比活性は4.5ユニット/mg・プロテインであ
ることが判り，これは以下の比較例１に比べて約10倍近
くも活性があり，生産性が著しく向上していることが明
らかである。

その後，遠心分離にて粗酵素抽出液を得，その粗酵素
抽出液を70℃で30分間熱処理した後，遠心分離し，その
上澄液のアラニン脱水素酵素活性を測定したところ,36
ユニット/mg・プロティンの活性があり，粗酵素抽出液
を70℃で30分間熱処理することにより，熱処理前に比べ
て比活性が約８倍向上した。

次に7.5％濃度のアクリルアミドを用いた調製用電気
泳動，スーパーローズ12ゲルクロマトカラム（ファルマ
シア製,2本を直列に連結）による高速液体クロマトグラ
フィーで精製して比活性55ユニット/mg・プロテインの
耐熱性アラニン脱水素酵素を得た。

この酵素は,pH9.4の7.5％アクリルアミド電気泳動法
により単一なバンドを与え，従来のバチルス・ステアロ
サーモフィルス由来のアラニン脱水素酵素の性質と同じ
であった。

比較のため，バチルス・ステアロサーモフィルス由来
の遺伝子を組み込んだエシェリチア・コリC600−pICR1
（微工研菌寄第6937号）を公知文献（特開昭59−159778
号公報）に従い，前記グリセロール培地100mlにて37℃
で16時間振盪培養し，遠心分離にて集菌した後,0.1mg/m
lの２−メルカプトエタノールを含むpH7.4に調製した0.
01Mリン酸緩衝液5mlに懸濁し，約５分間の超音波処理で
菌体を破砕して破砕液を得た。この破砕液についてアラ
ニン脱水素酵素の活性を測定したところ,0.5ユニット/m
g・プロテインであった（比較例１）。

（発明の効果）本発明のプラスミドは，好熱性微生物由来のDNA領域
を除去したアラニン脱水素酵素の遺伝子そのもの（分子
量が２メガダルトン以下）を有するため，上記したよう
に有用な微生物，例えば，常温で生育する細菌を形質転
換して多量の耐熱性のアラニン脱水素酵素生産能を賦与
することができる。また，このプラスミドで形質された
本発明のエシェリチア・コリは，多量の耐熱性のアラニ
ン脱水素酵素を生産するため，臨床検査用試薬等の分野
に極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のプラスミドpICR330の制限酵素地図で
あり，第２図は本発明に用いられるアラニン脱水素酵素
遺伝子の塩基配列を示す図であるる。 S:Sal I,E:EcoR I,P:Pst I,B:Bam I,H:Hind III A:アデニン,T:チミン,C:シトシン,G:グアニン

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】分子量が２メガダルトン以下の耐熱性のア
ラニン脱水素酵素遺伝子をベクタープラスミドに連結し
た組み換え体プラスミド。
【請求項２】分子量が２メガダルトン以下の耐熱性のア
ラニン脱水素酵素遺伝子をベクタープラスミドに連結し
た組み換え体プラスミドで形質転換されたエシェリチア
・コリ（Escherichia coli）。