JPH062061B2 - Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製法 - Google Patents
Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製法Info
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- JPH062061B2 JPH062061B2 JP59122818A JP12281884A JPH062061B2 JP H062061 B2 JPH062061 B2 JP H062061B2 JP 59122818 A JP59122818 A JP 59122818A JP 12281884 A JP12281884 A JP 12281884A JP H062061 B2 JPH062061 B2 JP H062061B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼ産生遺伝子
を含有する新規な大腸菌を用いるＮ−アセチルノイラミ
ン酸リアーゼの製造法に関する。
を含有する新規な大腸菌を用いるＮ−アセチルノイラミ
ン酸リアーゼの製造法に関する。
従 来 技 術 Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（ＥＣ4.1.3.3，以
下ＮＡリアーゼと略記する）Ｎ−アセチルノイラミン酸
をＮ−アセチルマンノサミンとピルビン酸に分解する酵
素である。また、このＮＡリアーゼは血清等の生体中の
シアル酸含有物質の定量に用いられることはよく知られ
ている。
下ＮＡリアーゼと略記する）Ｎ−アセチルノイラミン酸
をＮ−アセチルマンノサミンとピルビン酸に分解する酵
素である。また、このＮＡリアーゼは血清等の生体中の
シアル酸含有物質の定量に用いられることはよく知られ
ている。
ＮＡリアーゼは、動物組織およびガス壊疽菌（Clostrid
ium perfringens），コレラ菌（Vibrocholerae）等の病
原性微生物、および各種の非病原性微生物等に存在する
ことが知られている。
ium perfringens），コレラ菌（Vibrocholerae）等の病
原性微生物、および各種の非病原性微生物等に存在する
ことが知られている。
発明が解決しようとする問題点 これらの微生物は、一般の酵素生産に利用される培地で
培養してもその生産量は極めて少量に留まり、培地中に
Ｎ−アセチルノイラミン酸を存在させるときにのみ本酵
素の生産量が上昇することが報告されている。（特公昭
５６−５４１５３，特公昭５６−５１７５１）。然る
に、このＮ−アセチルノイラミン酸を大量に使用するこ
とは経済的に不利であり、ＮＡリアーゼの生産にＮ−ア
セチルノイラミン酸を必要としない微生物を用いる方法
の開発が望まれている。
培養してもその生産量は極めて少量に留まり、培地中に
Ｎ−アセチルノイラミン酸を存在させるときにのみ本酵
素の生産量が上昇することが報告されている。（特公昭
５６−５４１５３，特公昭５６−５１７５１）。然る
に、このＮ−アセチルノイラミン酸を大量に使用するこ
とは経済的に不利であり、ＮＡリアーゼの生産にＮ−ア
セチルノイラミン酸を必要としない微生物を用いる方法
の開発が望まれている。
問題点を解決するための手段 かかる状況に鑑み、工業的に安価にＮＡリアーゼを製造
する方法について種々検討した結果、ＮＡリアーゼ活性
を有するエシェリヒア・コリよりＮＡリアーゼの遺伝情
報を担うデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を単離し、次いで
このＮＡリアーゼの遺伝情報を担うＤＮＡをベクターに
組み込ませ、この組み換えＤＮＡをエシェリヒア・コリ
に導入することによって得られた微生物がＮ−アセチル
ノイラミン酸の培地への添加なしにＮＡリアーゼを生産
することが見出された。
する方法について種々検討した結果、ＮＡリアーゼ活性
を有するエシェリヒア・コリよりＮＡリアーゼの遺伝情
報を担うデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を単離し、次いで
このＮＡリアーゼの遺伝情報を担うＤＮＡをベクターに
組み込ませ、この組み換えＤＮＡをエシェリヒア・コリ
に導入することによって得られた微生物がＮ−アセチル
ノイラミン酸の培地への添加なしにＮＡリアーゼを生産
することが見出された。
以下に本発明を詳細に説明する。
ＮＡリアーゼの遺伝情報を担うＤＮＡ（以下、染色体Ｄ
ＮＡと称する）のエシェリヒア・コリからの単離は常法
に従って、例えばBiochim.Biophys.Acta,Vol.72pp619-6
29(1963)に記載のフェノール法により行うことができ
る。上記のＤＮＡ供与体としては、ＮＡリアーゼ生産能
を有するエシェリヒア・コリであれば、すべて使用可能
である。
ＮＡと称する）のエシェリヒア・コリからの単離は常法
に従って、例えばBiochim.Biophys.Acta,Vol.72pp619-6
29(1963)に記載のフェノール法により行うことができ
る。上記のＤＮＡ供与体としては、ＮＡリアーゼ生産能
を有するエシェリヒア・コリであれば、すべて使用可能
である。
次いで、上記で得られたＤＮＡをベクターＤＮＡに組み
込んで組み換えＤＮＡを調製する。染色体ＤＮＡのベク
ターＤＮＡの組み込みは常法に従って、例えば染色体Ｄ
ＮＡ及びベクターＤＮＡを制限酵素で切断して染色体Ｄ
ＮＡ断片及びベクターＤＮＡ断片を調製したのち、両者
の混合物をＤＮＡリガーゼで処理することにより行うこ
とができる。ここで用いられるベクターＤＮＡとして
は、エシェリヒア・コリを宿主とするｐＢＲ３２２プラ
スミド，コリシンＥ１プラスミド，ラムダヒファージな
どが挙げられ、とりわけｐＢＲ３２２プラスミドが好適
に用いられる。また制限酵素としては、例えばＨｉｎｄ
III，ＢａｍＨＩ，ＥｏｃＲＩ，ＰｓｔＩ，ＳａｌＩな
どが挙げられ、とりわけＨｉｎｄIIIが好適に用いられ
る。更にＤＮＡリガーゼとしては、Ｔ４ファージ由来の
ＤＮＡリガーゼが好適に用いられる。
込んで組み換えＤＮＡを調製する。染色体ＤＮＡのベク
ターＤＮＡの組み込みは常法に従って、例えば染色体Ｄ
ＮＡ及びベクターＤＮＡを制限酵素で切断して染色体Ｄ
ＮＡ断片及びベクターＤＮＡ断片を調製したのち、両者
の混合物をＤＮＡリガーゼで処理することにより行うこ
とができる。ここで用いられるベクターＤＮＡとして
は、エシェリヒア・コリを宿主とするｐＢＲ３２２プラ
スミド，コリシンＥ１プラスミド，ラムダヒファージな
どが挙げられ、とりわけｐＢＲ３２２プラスミドが好適
に用いられる。また制限酵素としては、例えばＨｉｎｄ
III，ＢａｍＨＩ，ＥｏｃＲＩ，ＰｓｔＩ，ＳａｌＩな
どが挙げられ、とりわけＨｉｎｄIIIが好適に用いられ
る。更にＤＮＡリガーゼとしては、Ｔ４ファージ由来の
ＤＮＡリガーゼが好適に用いられる。
次いで、上記方法で得られた組み換えＤＮＡは常法によ
ってＮＡリアーゼ欠損株に導入することができる。
ってＮＡリアーゼ欠損株に導入することができる。
ＮＡリアーゼの欠損した変異株を取得するに当たって
は、まずエシェリヒア・コリ野生株（例えばエシェリヒ
ア・コリＣ６００−ＳＦ８）に変異を誘起せしめて、Ｎ
−アセチルノイラミン酸を資化できない変異株を取得す
る。変異の誘起は通常の変異誘起処理、例えばＮ−メチ
ル−Ｎ′−ニトロソ−Ｎ−ニトロソグアニジンの如き変
異誘起剤で処理することにより実施できる。
は、まずエシェリヒア・コリ野生株（例えばエシェリヒ
ア・コリＣ６００−ＳＦ８）に変異を誘起せしめて、Ｎ
−アセチルノイラミン酸を資化できない変異株を取得す
る。変異の誘起は通常の変異誘起処理、例えばＮ−メチ
ル−Ｎ′−ニトロソ−Ｎ−ニトロソグアニジンの如き変
異誘起剤で処理することにより実施できる。
Ｎ−アセチルノイラミン酸を資化できない変異株の取得
は変異処理して得られた菌体をグルコース最少培地（例
えば、グルコース２ｇ／，(NH4)2SO4１ｇ／，K2HPO
4７ｇ／，K2HPO4３ｇ／，MgSO4・7H2O0.1ｇ／，
チアミン５μｇ／ml，スレオニン0.2ｍＭ，ロイシン0.2
ｍＭ，寒天１５ｇ／の組成の培地）で培養する。その
後、生じたコロニーをグルコース最少培地とＮ−アセチ
ルノイラミン酸最少培地（例えば、Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸0.2％，(NH4)2SO4１ｇ／，K2HPO4７ｇ／，K2
HPO4３ｇ／，MgSO4・7H2O0.1ｇ／，チアミン５μｇ
／ml，スレオニン0.2ｍＭ，ロイシン0.2ｍＭ，寒天１５
ｇ／の組成の培地）にレプリカレ，グルコース最少培
地で生育できて、Ｎ−アセチルノイラミン酸最少培地生
育できないコロニーを釣菌分離することにより行う。か
くして得られたＮＡリアーゼ欠損株の例としては、例え
ばエシェリヒア・コリ(Escherichia Coli)０−２が挙げ
られる。
は変異処理して得られた菌体をグルコース最少培地（例
えば、グルコース２ｇ／，(NH4)2SO4１ｇ／，K2HPO
4７ｇ／，K2HPO4３ｇ／，MgSO4・7H2O0.1ｇ／，
チアミン５μｇ／ml，スレオニン0.2ｍＭ，ロイシン0.2
ｍＭ，寒天１５ｇ／の組成の培地）で培養する。その
後、生じたコロニーをグルコース最少培地とＮ−アセチ
ルノイラミン酸最少培地（例えば、Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸0.2％，(NH4)2SO4１ｇ／，K2HPO4７ｇ／，K2
HPO4３ｇ／，MgSO4・7H2O0.1ｇ／，チアミン５μｇ
／ml，スレオニン0.2ｍＭ，ロイシン0.2ｍＭ，寒天１５
ｇ／の組成の培地）にレプリカレ，グルコース最少培
地で生育できて、Ｎ−アセチルノイラミン酸最少培地生
育できないコロニーを釣菌分離することにより行う。か
くして得られたＮＡリアーゼ欠損株の例としては、例え
ばエシェリヒア・コリ(Escherichia Coli)０−２が挙げ
られる。
組み換えＤＮＡの上記ＮＡリアーゼ欠損株への導入は常
法に従って行うことが出来、例えばＪ．Bacteriol.,Vo
l.119,pp1072-1074(1974)に記載のカルシウムイオン処
理法により行うことができる。組み換えＤＮＡ（すなわ
ち、ＮＡリアーゼの遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだ
ベクターＤＮＡ）を含有する菌株の選択方法は、当該組
み換えＤＮＡを調製するに際して使用した制限酵素やベ
クターＤＮＡの種類によっても異なるが、制限酵素とし
てＨｉｎｄIIIを用い、ベクターＤＮＡとしてｐＢＲ３
２２プラスミドを用いた場合には、次の如くして行うこ
とができる。すなわち、菌株をアンピシリンを含むＮ−
アセチルノイラミン酸最少培地に培養し、生じたコロニ
ーを釣菌分離することにより第一次選択する。次いでＮ
Ａリアーゼ活性の有無で最終的に確認する。かくして得
られた組み換えＤＮＡを含有する微生物の例としては、
例えばエシェリヒア・コリ(Escherichia Coli)Ｈ３−４
（微工研条寄第５１３号）が挙げられる。
法に従って行うことが出来、例えばＪ．Bacteriol.,Vo
l.119,pp1072-1074(1974)に記載のカルシウムイオン処
理法により行うことができる。組み換えＤＮＡ（すなわ
ち、ＮＡリアーゼの遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだ
ベクターＤＮＡ）を含有する菌株の選択方法は、当該組
み換えＤＮＡを調製するに際して使用した制限酵素やベ
クターＤＮＡの種類によっても異なるが、制限酵素とし
てＨｉｎｄIIIを用い、ベクターＤＮＡとしてｐＢＲ３
２２プラスミドを用いた場合には、次の如くして行うこ
とができる。すなわち、菌株をアンピシリンを含むＮ−
アセチルノイラミン酸最少培地に培養し、生じたコロニ
ーを釣菌分離することにより第一次選択する。次いでＮ
Ａリアーゼ活性の有無で最終的に確認する。かくして得
られた組み換えＤＮＡを含有する微生物の例としては、
例えばエシェリヒア・コリ(Escherichia Coli)Ｈ３−４
（微工研条寄第５１３号）が挙げられる。
上記の如くして取得した本発明の微生物は培養すれば菌
体内にＮＡリアーゼを著量生成蓄積する。
体内にＮＡリアーゼを著量生成蓄積する。
本発明微生物の培養に用いられる培地としては、炭素
源，窒素源，無機物を含有する合成培地または天然培地
のいずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコ
ール，シュクロース，フラクトース，でん粉，でん粉加
水分解別，糖蜜などの種々の炭水化物が用いられ、その
使用量は５〜５０ｇ／程度が好ましい。また窒素源と
しては、例えば硫酸アンモニウム，リン酸アンモニウ
ム，炭酸アンモニウム，酢酸アンモニウムなどの各種の
無機および有機アンモニウム塩類，あるいはペプトン，
酵母エキス，コーンスチープリカー，カゼイン加水分解
物などの窒素含有有機物などが用いられ、その使用量は
５〜２０ｇ／程度が好ましい。更に無機物としては、
例えばリン酸第一水素カリウム，リン酸第二カリウム，
硫酸マグネシウム，硫酸マンガンなどが用いられ、その
使用量は0.05〜５ｇ／程度が好ましい。
源，窒素源，無機物を含有する合成培地または天然培地
のいずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコ
ール，シュクロース，フラクトース，でん粉，でん粉加
水分解別，糖蜜などの種々の炭水化物が用いられ、その
使用量は５〜５０ｇ／程度が好ましい。また窒素源と
しては、例えば硫酸アンモニウム，リン酸アンモニウ
ム，炭酸アンモニウム，酢酸アンモニウムなどの各種の
無機および有機アンモニウム塩類，あるいはペプトン，
酵母エキス，コーンスチープリカー，カゼイン加水分解
物などの窒素含有有機物などが用いられ、その使用量は
５〜２０ｇ／程度が好ましい。更に無機物としては、
例えばリン酸第一水素カリウム，リン酸第二カリウム，
硫酸マグネシウム，硫酸マンガンなどが用いられ、その
使用量は0.05〜５ｇ／程度が好ましい。
培養は振とう培養あるいは通気撹拌培養などの好気的条
件下に行われる。培養温度は２５〜３７℃が好適であ
り、培養期間は通常１６〜４８時間程度で完了する。
件下に行われる。培養温度は２５〜３７℃が好適であ
り、培養期間は通常１６〜４８時間程度で完了する。
培養を終了した菌体からＮＡリアーゼを精製するに当た
っては、上記培養液から遠心分離等の方法で菌体を集
め、得られた菌体を超音波処理，ガラスビーズを用いた
摩砕処理，フレンチプレス処理等によって破砕し、酵素
を抽出する。抽出液はこれを硫安塩析法，イオン交換樹
脂を用いるクロマトグラフィー，ゲル濾過法等の常法に
より処理して、精製Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ
を得ることができる。
っては、上記培養液から遠心分離等の方法で菌体を集
め、得られた菌体を超音波処理，ガラスビーズを用いた
摩砕処理，フレンチプレス処理等によって破砕し、酵素
を抽出する。抽出液はこれを硫安塩析法，イオン交換樹
脂を用いるクロマトグラフィー，ゲル濾過法等の常法に
より処理して、精製Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ
を得ることができる。
以下、実施例をあげて本発明を具体的に説明する。
実施例１． (1) ＮＡリアーゼの遺伝情報を担う染色体ＤＮＡの調
製 エシェリヒア・コリＫＹ８４８２をＬ−培地（グルコー
ス１ｇ／，トリプトン１０ｇ／，酵母エキス５ｇ／
，塩化ナトリウム５ｇ／，ｐＨ7.2）３００ml中、
２８℃で１６時間振とう培養して得られた菌体を集洗菌
後、Saito＆Miuraの方法〔Biochim.Biophys.Acta,72,61
9-629(1963)〕でフェノール処理し、染色体ＤＮＡ約２m
gを得た。
製 エシェリヒア・コリＫＹ８４８２をＬ−培地（グルコー
ス１ｇ／，トリプトン１０ｇ／，酵母エキス５ｇ／
，塩化ナトリウム５ｇ／，ｐＨ7.2）３００ml中、
２８℃で１６時間振とう培養して得られた菌体を集洗菌
後、Saito＆Miuraの方法〔Biochim.Biophys.Acta,72,61
9-629(1963)〕でフェノール処理し、染色体ＤＮＡ約２m
gを得た。
(2) 染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体ＤＮＡ2.6μｇをとり、制限エンドヌク
レアーゼＨｉｎｄIIIと２時間反応させた。また、ベク
ターとして使用するｐＢＲ３２２（Bethesda Research
Laboratories社製，ＵＳＡ）2.6μｇもＨｉｎｄIIIと２
時間反応させ、完全に切断した。両反応液を各々６５
℃，１０分間加熱処理した後、両反応液を混合し、Ｔ４
ファージ由来のＤＮＡリガーゼで４℃，１６時間連結反
応を行った。次いで、反応液を６５℃，１０時間加熱し
た後、この溶液をＤＮＡ溶液とした。
レアーゼＨｉｎｄIIIと２時間反応させた。また、ベク
ターとして使用するｐＢＲ３２２（Bethesda Research
Laboratories社製，ＵＳＡ）2.6μｇもＨｉｎｄIIIと２
時間反応させ、完全に切断した。両反応液を各々６５
℃，１０分間加熱処理した後、両反応液を混合し、Ｔ４
ファージ由来のＤＮＡリガーゼで４℃，１６時間連結反
応を行った。次いで、反応液を６５℃，１０時間加熱し
た後、この溶液をＤＮＡ溶液とした。
(3) ＮＡリアーゼの遺伝情報を担ったプラスミドによ
る形質転換 エシェリヒア・コリＣ６００−ＳＦ８より変異誘導した
ＮＡリアーゼ欠損株０−２をＬ−培地４０mlにて対数増
殖中間（ＣＤ660＝約0.40）まで生育させた後、0.1Ｍ塩
化カルシウム溶液で洗浄後、同溶液１mlに再懸濁させ
た。この懸濁液0.15mlに(2)で得たＤＮＡ溶液を加え、
０℃にて３０分間保持した後、３７℃で２０分間加熱し
てＤＮＡを細胞内に取り込ませた。次いで、この懸濁液
をＬ−培地1.5mlに接種し、２時間振とう培養した。菌
体を集洗菌後、２０μｇ／mlのアンピシリンを含むＮ−
アセチルノイラミン酸最少培地（Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸２ｇ／，(NH4)2SO4１ｇ／，K2HPO4７ｇ／，K
2HPO4３ｇ／，MgSO4・7H2O0.1ｇ／，チアミン５μ
ｇ／ml，スレオニン0.2ｍＭ，ロイシン0.2ｍＭ，寒天１
５ｇ／，ｐＨ7.0）に塗布し、３０℃で２日間培養し
た。生じたコロニーについて更に菌体内のＮＡリアーゼ
活性を検討し、形質転換株Ｈ３−４を取得した。
る形質転換 エシェリヒア・コリＣ６００−ＳＦ８より変異誘導した
ＮＡリアーゼ欠損株０−２をＬ−培地４０mlにて対数増
殖中間（ＣＤ660＝約0.40）まで生育させた後、0.1Ｍ塩
化カルシウム溶液で洗浄後、同溶液１mlに再懸濁させ
た。この懸濁液0.15mlに(2)で得たＤＮＡ溶液を加え、
０℃にて３０分間保持した後、３７℃で２０分間加熱し
てＤＮＡを細胞内に取り込ませた。次いで、この懸濁液
をＬ−培地1.5mlに接種し、２時間振とう培養した。菌
体を集洗菌後、２０μｇ／mlのアンピシリンを含むＮ−
アセチルノイラミン酸最少培地（Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸２ｇ／，(NH4)2SO4１ｇ／，K2HPO4７ｇ／，K
2HPO4３ｇ／，MgSO4・7H2O0.1ｇ／，チアミン５μ
ｇ／ml，スレオニン0.2ｍＭ，ロイシン0.2ｍＭ，寒天１
５ｇ／，ｐＨ7.0）に塗布し、３０℃で２日間培養し
た。生じたコロニーについて更に菌体内のＮＡリアーゼ
活性を検討し、形質転換株Ｈ３−４を取得した。
実施例２． 下記第１表に示す菌株をＬ−培地および１ｇ／，のＮ
−アセチルノイラミン酸を含むＬ−培地に接種し、３０
℃で１８時間振とう培養した。培養終了後、遠心分離に
より菌体を集め、0.85％生理食塩水で洗浄後、菌体を超
音波処理により破砕し、菌体抽出液を調製し、その抽出
液中のＮＡリアーゼ活性を測定した。その結果は下記第
１表の通りであり、形質転換株Ｈ３−４は培地中にＮ−
アセチルノイラミン酸を添加しなくてもＮＡリアーゼを
生産することができた。
−アセチルノイラミン酸を含むＬ−培地に接種し、３０
℃で１８時間振とう培養した。培養終了後、遠心分離に
より菌体を集め、0.85％生理食塩水で洗浄後、菌体を超
音波処理により破砕し、菌体抽出液を調製し、その抽出
液中のＮＡリアーゼ活性を測定した。その結果は下記第
１表の通りであり、形質転換株Ｈ３−４は培地中にＮ−
アセチルノイラミン酸を添加しなくてもＮＡリアーゼを
生産することができた。
実施例３． Ｈ３−４株をグルコース１ｇ／，トリプトン１０ｇ／
，酵母エキス５ｇ／，塩化５ｇ／，アンピシリン
２０μｇ／mlより成る培地（ｐＨ7.0）３００mlを含む
２エルレンマイヤーフラスコに植菌し、３０℃で１８
時間振盪培養する。この培養液より遠心分離法にて菌体
を集める。得られた菌体を0.01Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ7.
0）２０mlに懸濁して超音波処理を行い細胞を破砕し、
菌体内の酵素を抽出する。次いで、ここに得られた抽出
液に硫安を加え、硫安３０〜８０％飽和で沈殿する部分
を採取する。この沈殿を少量(5ml)の0.01Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ7.0）に溶解する。この溶液を同緩衝液１で
２４時間透析する。透析液を同緩衝液で平衡化したＤＥ
ＡＥ−セファデックス（２５０ml、口径2.5cm）に通塔
する。この操作でＮＡリアーゼはＤＥＡＥ−セファデッ
クスに吸着される。さらに同緩衝液で不純蛋白質を洗い
流す。次に0.01Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）から1.0Ｍ食
塩を同緩衝液までの食塩の濃度匂配液で溶出を行う。溶
出してくる活性画分をあわせ、これに硫安を加えて硫安
９０％飽和で沈殿する部分を遠心分離（12,000×ｇ，２
０分）で集め、0.01Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）５mlに
溶解する。この溶液を同緩衝液１で２４時間透析す
る。透析液を凍結乾燥し、ＮＡリアーゼの粉末精製酵素
標品２０mg（比活性 3.0単位／mg）を得る。
，酵母エキス５ｇ／，塩化５ｇ／，アンピシリン
２０μｇ／mlより成る培地（ｐＨ7.0）３００mlを含む
２エルレンマイヤーフラスコに植菌し、３０℃で１８
時間振盪培養する。この培養液より遠心分離法にて菌体
を集める。得られた菌体を0.01Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ7.
0）２０mlに懸濁して超音波処理を行い細胞を破砕し、
菌体内の酵素を抽出する。次いで、ここに得られた抽出
液に硫安を加え、硫安３０〜８０％飽和で沈殿する部分
を採取する。この沈殿を少量(5ml)の0.01Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ7.0）に溶解する。この溶液を同緩衝液１で
２４時間透析する。透析液を同緩衝液で平衡化したＤＥ
ＡＥ−セファデックス（２５０ml、口径2.5cm）に通塔
する。この操作でＮＡリアーゼはＤＥＡＥ−セファデッ
クスに吸着される。さらに同緩衝液で不純蛋白質を洗い
流す。次に0.01Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）から1.0Ｍ食
塩を同緩衝液までの食塩の濃度匂配液で溶出を行う。溶
出してくる活性画分をあわせ、これに硫安を加えて硫安
９０％飽和で沈殿する部分を遠心分離（12,000×ｇ，２
０分）で集め、0.01Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）５mlに
溶解する。この溶液を同緩衝液１で２４時間透析す
る。透析液を凍結乾燥し、ＮＡリアーゼの粉末精製酵素
標品２０mg（比活性 3.0単位／mg）を得る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (1)
- 【請求項１】エシェリヒア属に属する微生物由来のＮ−
アセチルノイラミン酸リアーゼ産生遺伝情報を担うＤＮ
Ａを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断して得た染色体ＤＮＡ
断片を組み込んだベクターを導入したエシェリヒア属に
属する微生物で、かつＮ−アセチルノイラミン酸非存在
下においてＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼを生産す
る能力を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中に
Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼを蓄積させ、これを
採取することを特徴とするＮ−アセチルノイラミン酸リ
アーゼの製法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59122818A JPH062061B2 (ja) | 1984-06-14 | 1984-06-14 | Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製法 |
| US06/743,802 US4670389A (en) | 1984-06-14 | 1985-06-12 | Process for producing N-acetylneuraminate lyase |
| EP85107297A EP0164754B1 (en) | 1984-06-14 | 1985-06-13 | Process for producing n-acetylneuraminate lyase |
| DE8585107297T DE3581958D1 (de) | 1984-06-14 | 1985-06-13 | Verfahren zur herstellung von n-acetylneuraminat-lyase. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59122818A JPH062061B2 (ja) | 1984-06-14 | 1984-06-14 | Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS611384A JPS611384A (ja) | 1986-01-07 |
| JPH062061B2 true JPH062061B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=14845393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59122818A Expired - Lifetime JPH062061B2 (ja) | 1984-06-14 | 1984-06-14 | Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製法 |
Country Status (4)
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| EP (1) | EP0164754B1 (ja) |
| JP (1) | JPH062061B2 (ja) |
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| JPS62278982A (ja) * | 1986-05-27 | 1987-12-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製造法 |
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Citations (1)
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-
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-
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- 1985-06-13 EP EP85107297A patent/EP0164754B1/en not_active Expired - Lifetime
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5654153A (en) * | 1979-10-09 | 1981-05-14 | Fujitsu Ltd | Information system of failure congestion |
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|---|---|
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| US4670389A (en) | 1987-06-02 |
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| EP0164754B1 (en) | 1991-03-06 |
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