JPS6181786A - Ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド及び形質転換微生物 - Google Patents
Ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド及び形質転換微生物Info
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- JPS6181786A JPS6181786A JP59181250A JP18125084A JPS6181786A JP S6181786 A JPS6181786 A JP S6181786A JP 59181250 A JP59181250 A JP 59181250A JP 18125084 A JP18125084 A JP 18125084A JP S6181786 A JPS6181786 A JP S6181786A
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- acid aldolase
- acylneuraminic acid
- acylneuraminic
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、エシェリヒア属に８するＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼ生産菌由来のＮ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を組込んで
なる新しい組換えプラスミド、該プラスミドを導入して
形質転換した微生物及び該微生物よりＮ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼを製造する方法に関する。
ン酸アルドラーゼ生産菌由来のＮ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を組込んで
なる新しい組換えプラスミド、該プラスミドを導入して
形質転換した微生物及び該微生物よりＮ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼを製造する方法に関する。
□従来の技術
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ（Ｎ−ａｃｙｌｎ
ｅｕｒａｍｉｎａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ）は、別名
シアル酸アルドラーゼとも呼ばれ、国際生化学連合酵素
委員会の酵素番号Ｅ 、 Ｃ，４，１，３，３，に分類
され、系統名ではＮ−アシルノイラミン酸：ピルビン酸
リアーゼ（Ｎ −ａｃｙｌｎｅｕｒａｍｉｎａｔｅ ：
ｐｙｒｕｖａｔｅ １ｙａｓｅ）と呼ばれている酵素
である。本酵素は下記の反応式に示す如く、シアル！ｍ
（Ｎ−アシルノイラミン酸）の分解及び合成反応を触媒
する酵素である。
ｅｕｒａｍｉｎａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ）は、別名
シアル酸アルドラーゼとも呼ばれ、国際生化学連合酵素
委員会の酵素番号Ｅ 、 Ｃ，４，１，３，３，に分類
され、系統名ではＮ−アシルノイラミン酸：ピルビン酸
リアーゼ（Ｎ −ａｃｙｌｎｅｕｒａｍｉｎａｔｅ ：
ｐｙｒｕｖａｔｅ １ｙａｓｅ）と呼ばれている酵素
である。本酵素は下記の反応式に示す如く、シアル！ｍ
（Ｎ−アシルノイラミン酸）の分解及び合成反応を触媒
する酵素である。
シアルｌｍ−Ｎ−アシルマンノサミン＋ピルビン酸本発
明者らは、先にエシェリヒア属、その他の数種の属に屈
する公知菌を、シアル酸の存在下に培養する時には、上
記Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼが工業的規模で
容易に製造できることを見出し、該酵素の製造技術を確
立した（特公昭５６−５４１５３号、特許第１１１１３
４６号）。
明者らは、先にエシェリヒア属、その他の数種の属に屈
する公知菌を、シアル酸の存在下に培養する時には、上
記Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼが工業的規模で
容易に製造できることを見出し、該酵素の製造技術を確
立した（特公昭５６−５４１５３号、特許第１１１１３
４６号）。
しかるに上記確立された方法では、培地へのシアル酸の
添加が必須であり、このシアル酸自体その！！１製に繁
雑な操作等を要し且つ高価なものである不利があった。
添加が必須であり、このシアル酸自体その！！１製に繁
雑な操作等を要し且つ高価なものである不利があった。
しかもこのシアル酸添加を行なわない限り、Ｎ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼは生産されないかあるいは極
微量生産されるのみで、側底工業的実施はできないもの
であった。即ち上記方法に利用される微生物は、それ自
体シアル酸の不存在下ではＮ−アシルノイラミン酸生産
能を実質的に発現できないものであった。
ノイラミン酸アルドラーゼは生産されないかあるいは極
微量生産されるのみで、側底工業的実施はできないもの
であった。即ち上記方法に利用される微生物は、それ自
体シアル酸の不存在下ではＮ−アシルノイラミン酸生産
能を実質的に発現できないものであった。
１１１１江
本発明者らは、上記方法の最大の欠点とするシアル酸利
用を必須とする点を解消し、該シアル酸を利用せずども
工業的規模で大量のＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼを製造できる技術を開発、 するべく鋭意研究を重ね
た。その結果上記確立された方法に利用される微生物の
うちエシェリヒア属に属するＮ−アシルノイラミン酸ア
ルドラーゼ生産菌からＮ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を抽出し、これをベ
クターに組み込んで組換えプラスミドを作成し、該プラ
スミドの導入により形質転換させた微生物を得るに成功
すると共に、該微生物がシアル酸無添加培地での培養に
より、目的とする酵素を著聞生産できるという事実を発
見した。本発明はこの新しい知見に基づいて完成された
ものである。
用を必須とする点を解消し、該シアル酸を利用せずども
工業的規模で大量のＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼを製造できる技術を開発、 するべく鋭意研究を重ね
た。その結果上記確立された方法に利用される微生物の
うちエシェリヒア属に属するＮ−アシルノイラミン酸ア
ルドラーゼ生産菌からＮ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を抽出し、これをベ
クターに組み込んで組換えプラスミドを作成し、該プラ
スミドの導入により形質転換させた微生物を得るに成功
すると共に、該微生物がシアル酸無添加培地での培養に
より、目的とする酵素を著聞生産できるという事実を発
見した。本発明はこの新しい知見に基づいて完成された
ものである。
１旦１」１１
即ち本発明は、エシェリヒア属に属するＮ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼ生産菌由来のＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を組込
んだことを特徴とする大腸菌にて？！製できる組換えプ
ラスミド、該組換えプラスミドを上記Ｎ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼ生産菌又はＮ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼ欠損株に導入して形質転換させた微生物及
び該形質転換微生物を培養して培養物からＮ−アシルノ
イラミン酸アルドラーゼを採取することを特徴とするＮ
−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法に係わる。
ラミン酸アルドラーゼ生産菌由来のＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を組込
んだことを特徴とする大腸菌にて？！製できる組換えプ
ラスミド、該組換えプラスミドを上記Ｎ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼ生産菌又はＮ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼ欠損株に導入して形質転換させた微生物及
び該形質転換微生物を培養して培養物からＮ−アシルノ
イラミン酸アルドラーゼを採取することを特徴とするＮ
−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法に係わる。
本発明の上記組換えプラスミド及びこれを導入した形質
転換株の利用によれば、調製が面倒なシアル酸、その類
縁体等のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの誘導物
質を培地に添加せずとも、通常の微生物の培養用培地を
用いて工業的規模で大量の目的酵素を容易に製造採取す
ることができる。
転換株の利用によれば、調製が面倒なシアル酸、その類
縁体等のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの誘導物
質を培地に添加せずとも、通常の微生物の培養用培地を
用いて工業的規模で大量の目的酵素を容易に製造採取す
ることができる。
以下、本発明組換えプラスミド及びこれを導入した形質
転換株の製造法につき詳述する。
転換株の製造法につき詳述する。
本発明プラスミドは、エシェリヒア属に馬するＮ−アシ
ルノイラミン酸アルドラーゼ生産菌由来のＮ−アシルノ
イラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片
をベクターに組込むことにより製造される。ここで染色
体ＤＮＡ供与菌として用いるエシェリヒアＷＡｆＩｌｌ
菌は、例えばエシェリヒア・コリー（Ｅ、 ｃｏｌｉ
）のようなＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ高生産
性のものであるのが好ましいが、Ｎ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼ産生能を有する限り特に制限はなく、公
知の各種細菌をいずれも使用可能である。
ルノイラミン酸アルドラーゼ生産菌由来のＮ−アシルノ
イラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片
をベクターに組込むことにより製造される。ここで染色
体ＤＮＡ供与菌として用いるエシェリヒアＷＡｆＩｌｌ
菌は、例えばエシェリヒア・コリー（Ｅ、 ｃｏｌｉ
）のようなＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ高生産
性のものであるのが好ましいが、Ｎ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼ産生能を有する限り特に制限はなく、公
知の各種細菌をいずれも使用可能である。
上記Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産菌からの
染色体ＤＮＡの調製は、通常の方法、例えばフェノール
を用いる方法（Ｓ ａｉｔｏ −Ｍ １ｔｊｒａ法、Ｂ
１０Ｃｈｉ１１． Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ＡＣｔａ 、
、 ７２．６１９＜１９６３））等により行なわれる。
染色体ＤＮＡの調製は、通常の方法、例えばフェノール
を用いる方法（Ｓ ａｉｔｏ −Ｍ １ｔｊｒａ法、Ｂ
１０Ｃｈｉ１１． Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ＡＣｔａ 、
、 ７２．６１９＜１９６３））等により行なわれる。
調製された染色体ＤＮＡは、次いでベクターと連結する
ために切断される。この染色体ＤＮＡの切断は、通常の
制限エンドヌクレアーゼを用いる方法により行なわれる
が、特にこの方法に限定されず、Ｎ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼ遺伝子を切断しない限り例えば物理的に
剪断力を加えて切断する方法によることもできる。制限
エンドヌクレアーゼを用いて染色体ＤＮＡを切断する方
法の実施に当り、完全切断を起こす反応条件を採用する
場合には、目的とするＮ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼ遺伝子に切断部位を持たない各種の制限エンドヌク
レアーゼを用いることができ、また部分的にしか切断を
起こさない反応条件を採用する場合には、全ての種類の
制限エンドヌクレアーゼを用いることができる。特にベ
クターとの連結の容易さから該制限エンドヌクレアーゼ
としては、用いられるベクターに唯一の切断部位を有す
るものが好ましい。
ために切断される。この染色体ＤＮＡの切断は、通常の
制限エンドヌクレアーゼを用いる方法により行なわれる
が、特にこの方法に限定されず、Ｎ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼ遺伝子を切断しない限り例えば物理的に
剪断力を加えて切断する方法によることもできる。制限
エンドヌクレアーゼを用いて染色体ＤＮＡを切断する方
法の実施に当り、完全切断を起こす反応条件を採用する
場合には、目的とするＮ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼ遺伝子に切断部位を持たない各種の制限エンドヌク
レアーゼを用いることができ、また部分的にしか切断を
起こさない反応条件を採用する場合には、全ての種類の
制限エンドヌクレアーゼを用いることができる。特にベ
クターとの連結の容易さから該制限エンドヌクレアーゼ
としては、用いられるベクターに唯一の切断部位を有す
るものが好ましい。
かくして切断された染色体ＤＮＡ断片を挿入結合される
ベクターＤＮＡとしては、通常用いられる各種のものを
いずれも利用することができ、特にエシェリヒア・コリ
ー系ベクターが好適である。
ベクターＤＮＡとしては、通常用いられる各種のものを
いずれも利用することができ、特にエシェリヒア・コリ
ー系ベクターが好適である。
上記ベクターの例としては、例えばＣｏ１Ｅ１の系統、
Ｉ）ＳＣ１０１の系統、Ｉ）ＢＲ３２２の系統、ｐ Ａ
ＣＹＣｌ ７７の系統、Ｅ）ＣＲ１の系統、Ｒ６にの系
統、ラムダファージの系統等を例示できる。
Ｉ）ＳＣ１０１の系統、Ｉ）ＢＲ３２２の系統、ｐ Ａ
ＣＹＣｌ ７７の系統、Ｅ）ＣＲ１の系統、Ｒ６にの系
統、ラムダファージの系統等を例示できる。
上記染色体ＤＮＡとベクターＤＮＡとの結合は、一般的
に行なわれている方法、例えば供与染色体とベクターと
を同一の制限エンドヌクレアーゼで切断し、しかる後に
之等をＤＮＡリガーゼを用いて結合させる方法により行
なわれるが、この方法に限定されることなく、他の如何
なる方法によってもよい。かくして本発明組換えプラス
ミド（組換え体ＤＮＡ分子、即ち供与染色体［）ＮＡ断
片とベクターとの結合体）を得る。
に行なわれている方法、例えば供与染色体とベクターと
を同一の制限エンドヌクレアーゼで切断し、しかる後に
之等をＤＮＡリガーゼを用いて結合させる方法により行
なわれるが、この方法に限定されることなく、他の如何
なる方法によってもよい。かくして本発明組換えプラス
ミド（組換え体ＤＮＡ分子、即ち供与染色体［）ＮＡ断
片とベクターとの結合体）を得る。
本発明は、また上記プラスミドを導入して形質転換させ
た微生物をも提供するものである。本発明組換えプラス
ミドを導入して形質転換される宿主としての受容菌とし
ては、エシェリヒア属刊菌、特に上記染色体ＤＮＡ供与
菌又はこれより誘導したＮ−アシルノイラミン酸アルド
ラーゼ欠損株が使用される。これらの内で特にＮ−アシ
ルノイラミン酸アルドラーゼ欠損株は、本発明プラスミ
ドを保有する形質転換株の選択の際に好適である。
た微生物をも提供するものである。本発明組換えプラス
ミドを導入して形質転換される宿主としての受容菌とし
ては、エシェリヒア属刊菌、特に上記染色体ＤＮＡ供与
菌又はこれより誘導したＮ−アシルノイラミン酸アルド
ラーゼ欠損株が使用される。これらの内で特にＮ−アシ
ルノイラミン酸アルドラーゼ欠損株は、本発明プラスミ
ドを保有する形質転換株の選択の際に好適である。
宿土菌としてのエシェリヒア属細菌に本発明プラスミド
を導入して形質転換を行なわせる方法は、公知の方法、
例えば代表的にはコンピテント細胞を用いる形質転換法
（Ｍｏｌ、 Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、 。
を導入して形質転換を行なわせる方法は、公知の方法、
例えば代表的にはコンピテント細胞を用いる形質転換法
（Ｍｏｌ、 Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、 。
１６７．２５１ （１９７９））等に従うことができる
。本発明では特にこの方法に限定されることな（他の公
知の８秤の方法をいずれも採用することができる。
。本発明では特にこの方法に限定されることな（他の公
知の８秤の方法をいずれも採用することができる。
上記方法により得られる形質転換株から目的とするＮ−
アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む供与染色
体ＤＮＡ供与菌片を保有し、該酵素をシアル口等の誘導
物質の不存在下に生産する能力を有する微生物の選択分
離は、何ら特殊な方法を採用することなく、所望の染色
体上の遺伝形質もしくはベクターの持つ形質又はこれら
の両者を合せ持つ菌のクローンを運択的に生育させ得る
培地を利用して容易に実施できる。
アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む供与染色
体ＤＮＡ供与菌片を保有し、該酵素をシアル口等の誘導
物質の不存在下に生産する能力を有する微生物の選択分
離は、何ら特殊な方法を採用することなく、所望の染色
体上の遺伝形質もしくはベクターの持つ形質又はこれら
の両者を合せ持つ菌のクローンを運択的に生育させ得る
培地を利用して容易に実施できる。
かくして抗生物質耐性を有し、シアル酸最小培地に生育
し、シアル酸などの誘導物質の無添加培地で著量のＮ−
アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有する目的と
する形質転換株を収得できる。
し、シアル酸などの誘導物質の無添加培地で著量のＮ−
アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有する目的と
する形質転換株を収得できる。
従来かかる顕著に向上された酵素生産能を有するエシェ
リヒア属細菌は全く知られておらず、勿論公知のエシェ
リヒア属細菌が遺伝子組換え法によりかかる酵素生産能
を発現させ得るという事実、更にシアル酸無添加培地で
著量のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有
する形質転換株を育種するという事実も知られていない
。
リヒア属細菌は全く知られておらず、勿論公知のエシェ
リヒア属細菌が遺伝子組換え法によりかかる酵素生産能
を発現させ得るという事実、更にシアル酸無添加培地で
著量のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有
する形質転換株を育種するという事実も知られていない
。
本発明は、上記のごとくして得られる形質転換株を培養
してＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼを採取する方
法をも提供するものである。
してＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼを採取する方
法をも提供するものである。
上記形質転換株の培養のための培地としては炭素源、窒
素源、無機化合物その他の栄養素を含み、細菌の培養に
一般に用いられている合成培地、半合成培地或いは天然
培地のいずれをも使用することができる。上記各培地に
利用される炭素源としては、例えばブドウ糖、果糖、転
化糖、澱粉糖化液、ソルビトール、グリセロール等の糖
質液、ビルビン口、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸類等
を例示できる。窒素源としては、例えば硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アン
モニウム、水酸化アンモニウム、酒石酸アンモニウム、
酢酸アンモニウム、尿素等を例示できる。炭素源として
も窒素源としても利用できるものとしては、倒えばペプ
トン、肉エキス、コーンステイープリカー等を例示でき
る。無機化合物としては、例えばリン酸−カリウム、リ
ン酸二カリウム、リン酸−ナトリウム、リン酸二ナトリ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化カリ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、塩化第一鉄、硫酸
第二鉄、塩化第二鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン等を
例示できる。その他の栄養素としては、例えば酊母エキ
ス、ビタミン等を例示できる。
素源、無機化合物その他の栄養素を含み、細菌の培養に
一般に用いられている合成培地、半合成培地或いは天然
培地のいずれをも使用することができる。上記各培地に
利用される炭素源としては、例えばブドウ糖、果糖、転
化糖、澱粉糖化液、ソルビトール、グリセロール等の糖
質液、ビルビン口、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸類等
を例示できる。窒素源としては、例えば硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アン
モニウム、水酸化アンモニウム、酒石酸アンモニウム、
酢酸アンモニウム、尿素等を例示できる。炭素源として
も窒素源としても利用できるものとしては、倒えばペプ
トン、肉エキス、コーンステイープリカー等を例示でき
る。無機化合物としては、例えばリン酸−カリウム、リ
ン酸二カリウム、リン酸−ナトリウム、リン酸二ナトリ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化カリ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、塩化第一鉄、硫酸
第二鉄、塩化第二鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン等を
例示できる。その他の栄養素としては、例えば酊母エキ
ス、ビタミン等を例示できる。
培養は、液体培地又は固体培地のいずれでも行なうこと
ができるが、通常液体培地の方が有利であって、特に振
盪培養又は通気撹拌培養を行なうのが量産上有利である
。培養温度は２０〜４５℃、好ましくは２８〜３７℃と
するのが好適である。
ができるが、通常液体培地の方が有利であって、特に振
盪培養又は通気撹拌培養を行なうのが量産上有利である
。培養温度は２０〜４５℃、好ましくは２８〜３７℃と
するのが好適である。
培養中は適当な中和剤を用いてＥ）Ｈを６〜９に調整す
るのが好ましい。上記培養を通常１０〜５０時間行なう
ことにより、目的とするＮ−アシルノイラミン酸アルド
ラーゼの活性は最高に達する。
るのが好ましい。上記培養を通常１０〜５０時間行なう
ことにより、目的とするＮ−アシルノイラミン酸アルド
ラーゼの活性は最高に達する。
本酵素は一般に菌体内酵素であるので、培養物からの本
酵素の採取、精製に当っては、上記培養液から遠心分離
等の方法で菌体を集め、得られた菌体を超音波処理、ガ
ラスピーズを用いる磨砕処理、或いはフレンチプレス処
理等によって破砕し、酵素を抽出するのが好ましい。抽
出液はこれを硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過法等の常法により処理して精製Ｎ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼとすることができる。
酵素の採取、精製に当っては、上記培養液から遠心分離
等の方法で菌体を集め、得られた菌体を超音波処理、ガ
ラスピーズを用いる磨砕処理、或いはフレンチプレス処
理等によって破砕し、酵素を抽出するのが好ましい。抽
出液はこれを硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過法等の常法により処理して精製Ｎ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼとすることができる。
哀−」Ｌ」１
以下、実施例を挙げ本発明を更に詳しく説明する。
実施例１
（１） Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産株Ｅ
、ｃｏｌｉ Ｋ１２Ｃ６００株からの染色体ＤＮＡの
調製 下記組成のし培地１Ｑ中でエシェリヒア・コリー （Ｅ
、ｃｏｌｉ）Ｋ１２Ｇ６００株を３７℃で約３時間振盪
培養し、対数増殖期の菌体を集めた。
、ｃｏｌｉ Ｋ１２Ｃ６００株からの染色体ＤＮＡの
調製 下記組成のし培地１Ｑ中でエシェリヒア・コリー （Ｅ
、ｃｏｌｉ）Ｋ１２Ｇ６００株を３７℃で約３時間振盪
培養し、対数増殖期の菌体を集めた。
くＬ培地組成〉
ペプトン ｌ／ｄＱ
醪母エキス ０．５（ＩＩ ／ｄ Ｑグルコース
０．１／ｄＱ ＮａＣＱ Ｏ，５１１１／ｄ（２゛ｐＨ７，
２に調整 上記菌体につきフェノール法によるＤＮＡ抽出操作を行
なって、最終３．８ｍａの染色体ＤＮＡを抽出精製した
。
０．１／ｄＱ ＮａＣＱ Ｏ，５１１１／ｄ（２゛ｐＨ７，
２に調整 上記菌体につきフェノール法によるＤＮＡ抽出操作を行
なって、最終３．８ｍａの染色体ＤＮＡを抽出精製した
。
（２） ベクターＤＮＡの調製と制限酵素による切断
ベクターとしてのプラスミドｐＢＲ３２２のＤＮＡを以
下の通り調製した。即ち、まずｐＢＲ３２２をプラスミ
ドとして保有するエシェリヒア・コリーに１２株の一種
を下記組成のＧＰＭ培地に接種し、３７℃で対数期中期
まで培養した後、最終濃度１００μｇ／鶴のクロラムフ
ェニコールを添加し、更に一夜培養した。
下の通り調製した。即ち、まずｐＢＲ３２２をプラスミ
ドとして保有するエシェリヒア・コリーに１２株の一種
を下記組成のＧＰＭ培地に接種し、３７℃で対数期中期
まで培養した後、最終濃度１００μｇ／鶴のクロラムフ
ェニコールを添加し、更に一夜培養した。
＜ＧＰＭ組成〉
グルコース １０ｇ
ペプトン ｊ（Ｉ
ＮＨＡＣ９１ｇ
Ｎａａ ＨＰＯａ ・１２Ｈ２０１５，２０に８２ Ｐ
Ｏム ３ｇＮａ ＣＱ
３１１１Ｎａ２Ｓｏｔ
０．１１５（１ＭｇＣ＋２２ ・６Ｈ２００，０８３！
ＩＩ酵母エキス １ｇ 脱塩水 全体を１Ｑとする量上記操作に
より、細胞内にプラスミドＤＮＡを多量に生産させた。
Ｏム ３ｇＮａ ＣＱ
３１１１Ｎａ２Ｓｏｔ
０．１１５（１ＭｇＣ＋２２ ・６Ｈ２００，０８３！
ＩＩ酵母エキス １ｇ 脱塩水 全体を１Ｑとする量上記操作に
より、細胞内にプラスミドＤＮＡを多量に生産させた。
クロラムフェニコール添加の１６時間目に菌体を集め、
リゾチーム・ＳＯ３処理して溶菌させ、３００００ｘｇ
、１時間の超遠心により上清を得た。これよりプラス
ミドＤＮＡを溌縮し、セシウムクロライドーエチジウム
ブムロマイド平衡密度勾配遠心法によって最終７００μ
Ｑのｐ ＢＲ３２２のプラスミドＤＮＡを分画採取した
。
リゾチーム・ＳＯ３処理して溶菌させ、３００００ｘｇ
、１時間の超遠心により上清を得た。これよりプラス
ミドＤＮＡを溌縮し、セシウムクロライドーエチジウム
ブムロマイド平衡密度勾配遠心法によって最終７００μ
Ｑのｐ ＢＲ３２２のプラスミドＤＮＡを分画採取した
。
（３） 染色体ＤＮＡ溶液０片のベクターへの導入上記
（１）で得た染色体ＤＮＡ１０μｇを取り、制限エンド
ヌクレアーゼＨｉｎｄｎｌを３７℃で３０分間、６０分
間又は１２０分間それぞれ反応させ、ＤＮＡの部分的切
断を行なった。
（１）で得た染色体ＤＮＡ１０μｇを取り、制限エンド
ヌクレアーゼＨｉｎｄｎｌを３７℃で３０分間、６０分
間又は１２０分間それぞれ反応させ、ＤＮＡの部分的切
断を行なった。
予め６５℃で１０分間熱処理し、制限エンドヌクレアー
ゼ１（ｉｎｄｌ［を用いて完全に切断後、アルカリフォ
スファターゼで処理してＥ）ＢＲ３２２のＤＮＡ断片を
調製した。
ゼ１（ｉｎｄｌ［を用いて完全に切断後、アルカリフォ
スファターゼで処理してＥ）ＢＲ３２２のＤＮＡ断片を
調製した。
上記染色体ＤＮＡ断片とＤＢＲ３２２のＤＮＡ断片５μ
ｇとを混合し、ＡＴＰ及びジチオスレイトールの存在下
に、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼを用いて、１０
℃で１６時間を要してＤＮＡｔｌの連結反応を行なった
。６５℃で１０分間の熱処理後、反応波に２倍容のエタ
ノールを加えて連結反応終了後のＤＮＡを沈澱させ、採
取した。
ｇとを混合し、ＡＴＰ及びジチオスレイトールの存在下
に、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼを用いて、１０
℃で１６時間を要してＤＮＡｔｌの連結反応を行なった
。６５℃で１０分間の熱処理後、反応波に２倍容のエタ
ノールを加えて連結反応終了後のＤＮＡを沈澱させ、採
取した。
（４） 組換えプラスミドＤＮＡによる形質転換エシェ
リヒア・コリーＫｌ ２Ｃ６００株から、ニトロソグア
ニジン変異処理によって誘導したＮ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼ欠損株を、Ｌ培地１０戒にて対数則殖中
期まで生育させた後、塩化カルシウム５０１Ｍを含むト
リス緩衝液（５０ｉ Ｍ、ｐ Ｈ７，０）で２回洗浄す
ることにより、コンピテントな（ＤＮＡ取り込み能を有
する）ｌｌ［ｌ胞を調製した。このコンピテント１Ｉｆ
１１懸濁液０．４戒に上記（３）で得たＤＮＡ溶液０．
１四を加えて、０℃で３０分間保持した後、直ちに４２
℃、２分間の熱パルスを与え、ＤＮＡを細胞内に取込ま
せた。
リヒア・コリーＫｌ ２Ｃ６００株から、ニトロソグア
ニジン変異処理によって誘導したＮ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼ欠損株を、Ｌ培地１０戒にて対数則殖中
期まで生育させた後、塩化カルシウム５０１Ｍを含むト
リス緩衝液（５０ｉ Ｍ、ｐ Ｈ７，０）で２回洗浄す
ることにより、コンピテントな（ＤＮＡ取り込み能を有
する）ｌｌ［ｌ胞を調製した。このコンピテント１Ｉｆ
１１懸濁液０．４戒に上記（３）で得たＤＮＡ溶液０．
１四を加えて、０℃で３０分間保持した後、直ちに４２
℃、２分間の熱パルスを与え、ＤＮＡを細胞内に取込ま
せた。
次にこのｍ胞懸濁液をし培地に接種し、３７℃で２時間
静置培養を行なって形質転換反応を完了させた後、集菌
し、洗浄し、再懸濁液を最小培地プレートに塗抹し、３
７℃で２日間培養した。
静置培養を行なって形質転換反応を完了させた後、集菌
し、洗浄し、再懸濁液を最小培地プレートに塗抹し、３
７℃で２日間培養した。
尚上記最小培地プレートは、シアル酸の２ｇ、（ＮＨ４
）２ Ｓｏｔの１ ｇ、Ｋ２８ Ｐ ＯＬの７ｇ、ＫＨ
２ＰＯ４の２０ 、Ｍ（ＩＩ Ｓ Ｏｔ・７Ｈ２０の０
．１ｇ、ロイシンの２０１１１ｇ、スレオニンノ２０ｍ
ｇ及びチアミンの１ｍａを１９の純水に溶解し、ＤＨを
７．０に調整したものに寒天２０ｏを加えて殺菌した固
形培地にアンピシリンを１０μｇ／脱となるように加え
ることにより調製したものである。
）２ Ｓｏｔの１ ｇ、Ｋ２８ Ｐ ＯＬの７ｇ、ＫＨ
２ＰＯ４の２０ 、Ｍ（ＩＩ Ｓ Ｏｔ・７Ｈ２０の０
．１ｇ、ロイシンの２０１１１ｇ、スレオニンノ２０ｍ
ｇ及びチアミンの１ｍａを１９の純水に溶解し、ＤＨを
７．０に調整したものに寒天２０ｏを加えて殺菌した固
形培地にアンピシリンを１０μｇ／脱となるように加え
ることにより調製したものである。
上記により生じたコロニーを釣菌し、アンピシリン耐性
と菌体内のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ活性と
を検討し、形質転換株ＲＣ−Ｈ１／ｌ）ＭＫ２（約１４
．２ｋｂ）を収得した。
と菌体内のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ活性と
を検討し、形質転換株ＲＣ−Ｈ１／ｌ）ＭＫ２（約１４
．２ｋｂ）を収得した。
（５） Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの遺伝情
報を担うプラスミドのセルフクローニング 上記（４）で得た形質転換株をし培地１００鶴中で培養
し、上記（２）と同様にしてクロラムフェニコール処理
を行なった。菌体を集菌、洗浄後、ビルンボイム及びド
リー（Ｂ ｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｙ ）の方
法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ 、 ７゜１Ｃ’ｔｌＱ、１区つつ ／１ｎ７ｎＳ
）＋−１−１ｎ ｋｌ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼの遺伝情報を担う組換えプラスミド（以下ｒｌ）Ｍ
Ｋ２Ｊと称する）を含む液を調製した。
報を担うプラスミドのセルフクローニング 上記（４）で得た形質転換株をし培地１００鶴中で培養
し、上記（２）と同様にしてクロラムフェニコール処理
を行なった。菌体を集菌、洗浄後、ビルンボイム及びド
リー（Ｂ ｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｙ ）の方
法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ 、 ７゜１Ｃ’ｔｌＱ、１区つつ ／１ｎ７ｎＳ
）＋−１−１ｎ ｋｌ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼの遺伝情報を担う組換えプラスミド（以下ｒｌ）Ｍ
Ｋ２Ｊと称する）を含む液を調製した。
この溶液をアガロースゲル電気泳動（アガロース０．７
％、９０■）にかけ、Ｉ）ＭＫ２のバンドを紫外線照射
下で切り出し、これを透析チューブに入れ、再度電気泳
動を行ない、ゲルよりＤＮＡを抽出した。エチジウムブ
ロマイドの除去を行なった後、２倍容のエタノールを加
えて沈澱させ、得られたＩ）ＭＫ２の９０μｇを５１Ｍ
トリス塩酸！！衝液（ｐＨ７，５）に溶解した。
％、９０■）にかけ、Ｉ）ＭＫ２のバンドを紫外線照射
下で切り出し、これを透析チューブに入れ、再度電気泳
動を行ない、ゲルよりＤＮＡを抽出した。エチジウムブ
ロマイドの除去を行なった後、２倍容のエタノールを加
えて沈澱させ、得られたＩ）ＭＫ２の９０μｇを５１Ｍ
トリス塩酸！！衝液（ｐＨ７，５）に溶解した。
次いで上記（４）と同様にして、エシェリヒア・コリー
に１２０６００株にＤＮＡ取り込み能を持たせた後、上
記ｐＭＫ２を取り込ませた。かくして得られる菌株をア
ンピシリン１０μｇ／ＩＩＱを含む最小培地プレートに
培養し、生じてくるコロニーを分離し、アンピシリン耐
性と菌体内のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ活性
を検討して、形質転換株ＲＣ−に１ ′２Ｃ６００／ｐ
ＭＫ２を収得した。
に１２０６００株にＤＮＡ取り込み能を持たせた後、上
記ｐＭＫ２を取り込ませた。かくして得られる菌株をア
ンピシリン１０μｇ／ＩＩＱを含む最小培地プレートに
培養し、生じてくるコロニーを分離し、アンピシリン耐
性と菌体内のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ活性
を検討して、形質転換株ＲＣ−に１ ′２Ｃ６００／ｐ
ＭＫ２を収得した。
（６） Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子の
サブクローニング 上記（５）で得た形質転換株から、該（５）と同様の方
法によりプラスミドｐＭＫ２の１０μｇを取り、これに
２種の制限エンドヌクレアーゼＥＯＯＲＩ及び）（ｉｎ
ｄｌ［を同時に作用させて３７℃で１Ｒ間部分的に切断
反応を行なった。
サブクローニング 上記（５）で得た形質転換株から、該（５）と同様の方
法によりプラスミドｐＭＫ２の１０μｇを取り、これに
２種の制限エンドヌクレアーゼＥＯＯＲＩ及び）（ｉｎ
ｄｌ［を同時に作用させて３７℃で１Ｒ間部分的に切断
反応を行なった。
予め６５℃で１０分間熱処理し、制限エンドヌクレアー
ゼＥＣ０ＲＩ及びＨｉｎｄｌ［［を同時に用いて完全に
切断後、アルカリフォスファターゼで処理してｐ ＢＲ
３２２のＤＮＡｌｌｌｉ片を調製した。
ゼＥＣ０ＲＩ及びＨｉｎｄｌ［［を同時に用いて完全に
切断後、アルカリフォスファターゼで処理してｐ ＢＲ
３２２のＤＮＡｌｌｌｉ片を調製した。
上記１）ＭＫ２のＤＮＡＩ！７ｉ片とｐＢＲ３２２のＤ
ＮＡ断片５μＱとを混合し、ＡＴＰ及びジチオスレイト
ールの存在下に、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼを
用いて、１０℃で１６時間を要して０ＮＡｔ！ｉの連結
反応を行なってＭｌｉＩＡえプラスミドを調製した。
ＮＡ断片５μＱとを混合し、ＡＴＰ及びジチオスレイト
ールの存在下に、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼを
用いて、１０℃で１６時間を要して０ＮＡｔ！ｉの連結
反応を行なってＭｌｉＩＡえプラスミドを調製した。
次いで上記（４）と同様にしてエシェリヒア・コリーに
１２０６００株にＤＮＡ取り込み能を持たせた後、上記
で：１１１した組換えプラスミドを取り込ませた。
１２０６００株にＤＮＡ取り込み能を持たせた後、上記
で：１１１した組換えプラスミドを取り込ませた。
かくして得られる菌体をアンピシリン１０μｇ／−を含
む最小培地プレートに培養し、生じてくるコロニーを分
離し、アンピシリン耐性及び菌体内のＮ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼ活性を検討して、形質転換株ＲＣ−
に１２Ｃ６００／ｌ）ＭＫ６を得た。
む最小培地プレートに培養し、生じてくるコロニーを分
離し、アンピシリン耐性及び菌体内のＮ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼ活性を検討して、形質転換株ＲＣ−
に１２Ｃ６００／ｌ）ＭＫ６を得た。
この形質転換株は二本発明のＮ−アシルノイラミン酸ア
ルドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を組込んだ組
換えプラスミドを保有するものであり、該プラスミドを
以下ｒｐ ＭＫ６Ｊと称する。
ルドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を組込んだ組
換えプラスミドを保有するものであり、該プラスミドを
以下ｒｐ ＭＫ６Ｊと称する。
ｐ ＭＫ６の制限酵素切断地図は第１図に示す通りであ
る。これはｐ ＢＲ３２２に由来しＰＳｔＩ、ＰｖｕＩ
［，５ａｌＩ及びＢａ１ＨＩで各々切断される切断部位
を有するＤＮＡ断片と、Ｎ−アシルノイラミン酸アルド
ラーゼ生産菌由来の染色体ＤＮＡ断片とが、ＥＣ０ＲＩ
及び）ｌｉｎｄＩ［の切断部位で１結されてなり、約５
．５ｋｂの大きさを有するものである。
る。これはｐ ＢＲ３２２に由来しＰＳｔＩ、ＰｖｕＩ
［，５ａｌＩ及びＢａ１ＨＩで各々切断される切断部位
を有するＤＮＡ断片と、Ｎ−アシルノイラミン酸アルド
ラーゼ生産菌由来の染色体ＤＮＡ断片とが、ＥＣ０ＲＩ
及び）ｌｉｎｄＩ［の切断部位で１結されてなり、約５
．５ｋｂの大きさを有するものである。
また上記プラスミドｌ）ＭＫ６を保有する形質転換株は
、工業技術院微生物工業技術研究所にエシェリヒア・コ
リーに１２Ｃ６００／ＥＩ ＭＫ６なる名称にて寄託さ
れており、その寄託番号は微工研菌寄第７７９７号であ
る。
、工業技術院微生物工業技術研究所にエシェリヒア・コ
リーに１２Ｃ６００／ＥＩ ＭＫ６なる名称にて寄託さ
れており、その寄託番号は微工研菌寄第７７９７号であ
る。
（６） 本発明形質転換°株によるＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼの生産 上記（５）で得た形質転換株につき、ＤＮＡ供与菌であ
るエシェリヒア・コリーＫｌ ２０６００株と対比して
、それらのシアル酸添加培地及びシアル散無添加培地（
＠母エキス培地）の各々におけるＮ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼ生産性を検討した。
ン酸アルドラーゼの生産 上記（５）で得た形質転換株につき、ＤＮＡ供与菌であ
るエシェリヒア・コリーＫｌ ２０６００株と対比して
、それらのシアル酸添加培地及びシアル散無添加培地（
＠母エキス培地）の各々におけるＮ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼ生産性を検討した。
各微生物の培養培地としては、以下の組成の培地をそれ
ぞれ利用した。
ぞれ利用した。
くシアル酸添加培地組成〉
シアル酸 ５ｇ
（ＮＨａ ）２８ｏｔ ＩＱ
Ｋ２ＨＰＯＡ ７Ｑ
Ｋ８２ ＰＯ４２ｇ
入Ａｓ 〇 八 −７目 八 八
１６酵母エキス ０．５ａ 純水 全体を１Ｑとする最（ｐ Ｈ６，０）く酵母エ
キス培地組成〉 酵母エキス ２Ｃｌ コハク酸 １０り 純水 全体を１９とする量（ｐ Ｈ６，０）上記各培
地に各微生物を接種し、３０”Ｃで２４時間振盪培養を
行なった。その後、培ｉ液から遠心分離法により菌体を
集め、２５ｎ＋Ｍリンｍｍ１ｉ液（ｐ Ｈ７，５＞１０
０ＩＩＱに懸濁させて超音波処理を行ないｍ胞を破砕し
、菌体内の酵素を抽出し、遠心分離により沈渣と上澄と
を分離した後、抽出液（上澄）として粗醪素液を得た。
１６酵母エキス ０．５ａ 純水 全体を１Ｑとする最（ｐ Ｈ６，０）く酵母エ
キス培地組成〉 酵母エキス ２Ｃｌ コハク酸 １０り 純水 全体を１９とする量（ｐ Ｈ６，０）上記各培
地に各微生物を接種し、３０”Ｃで２４時間振盪培養を
行なった。その後、培ｉ液から遠心分離法により菌体を
集め、２５ｎ＋Ｍリンｍｍ１ｉ液（ｐ Ｈ７，５＞１０
０ＩＩＱに懸濁させて超音波処理を行ないｍ胞を破砕し
、菌体内の酵素を抽出し、遠心分離により沈渣と上澄と
を分離した後、抽出液（上澄）として粗醪素液を得た。
得られた酵素液の活性を、バーネットらの方法（Ｊ、
Ｅ、 Ｇ、 Ｂａｒｎｅｔｔ、 Ｄ、 Ｌ、 Ｃｏｒｉ
ｎａ 。
Ｅ、 Ｇ、 Ｂａｒｎｅｔｔ、 Ｄ、 Ｌ、 Ｃｏｒｉ
ｎａ 。
ａｎｄ Ｑ、Ｒａ５ｏｏｌ 、 ３ｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ’ Ｊｏｕｒｎａｌ。
ｌ’ Ｊｏｕｒｎａｌ。
１２５．２７５ （１９７１））に従い測定した。
Ｎ−アシルノイラミン俄アルドラーゼ活性は、上記方法
により測定されるものであり、その酵素沃椅の１■位と
け Ｅ大泪附１７℃Ｌ−木いＴ１→問に１マイクロモル
のＮ−アセチルノイラミン酸を分解する活性をいう。
により測定されるものであり、その酵素沃椅の１■位と
け Ｅ大泪附１７℃Ｌ−木いＴ１→問に１マイクロモル
のＮ−アセチルノイラミン酸を分解する活性をいう。
得られた結果を下記第１表に示す。
第 １ 表
上記第１表より、本発明によれば、シアル酸無添加培地
において著量のＮ−アシルノイラミン酸。
において著量のＮ−アシルノイラミン酸。
アルドラーゼを収得できることが明らかである。
なお、上記粗酵素液は、これを常法に従い硫安で塩析し
、遠心分離し、透析後、凍結乾燥することにより粗酵素
粉末とすることができる。また該酵素粉末は、これをイ
オン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過等の手段により１
！製して更に純化された酵素標品とすることができる。
、遠心分離し、透析後、凍結乾燥することにより粗酵素
粉末とすることができる。また該酵素粉末は、これをイ
オン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過等の手段により１
！製して更に純化された酵素標品とすることができる。
第１図は、本発明組換えプラスミドＩ）ＭＫ６の制限酵
素切断地図を示す。 （以 上） 第１図 Ｏ二 田 二＝＝コ； ｐＢＲ３２２＠芹 ■■■■；兎色体ＤＮＡ断キ 手続補正書（自制 昭和５９年１０月１９日 特許庁長官 志賀 学 殿 １、事件の表示 昭和５９年 特 許 願第１８１２５０ 号３、補正
をする者 事件との関係 持ｆｆ出願人 丸金音油株式会社 ４、代理人 大阪市東区平野町２のＩＯ沢の鶴ビル電話０６−２０３
−０９４１Ｃ代）６、補正により増加する発明の数 補 正 の 内 容 （１） 明細書第１５頁第１〜２行に「エチジウムラ
ム０マイト」とあるｔ−ｒエチジウムプロマイト」と訂
正する。 （２） ！！Ｉノ細書第１５頁第９〜１０行及び第１
９頁第７〜８行に「を行なった。・・・・・処理し、」
とあるを夫々法の通り訂正する。 「全行なった後、６５°Ｃで１０分間熱処理して反応を
停止させた。他方ベクター、ＢＲ３２２につき」 （以 上） 受託番号変更届 １ 事件の表示 昭和５９年特許願第１８１２５０号 ２ 発明の名称 Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法３ 手続
をした者 事件との関係 特許出願人 丸金醤油株式会社 ４代理人 大阪市東区平野町２の１０ 沢の鴎ビル通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所６ 旧受託番号 微工研菌寄第７７９７号 ７ 新寄託様関の名称
素切断地図を示す。 （以 上） 第１図 Ｏ二 田 二＝＝コ； ｐＢＲ３２２＠芹 ■■■■；兎色体ＤＮＡ断キ 手続補正書（自制 昭和５９年１０月１９日 特許庁長官 志賀 学 殿 １、事件の表示 昭和５９年 特 許 願第１８１２５０ 号３、補正
をする者 事件との関係 持ｆｆ出願人 丸金音油株式会社 ４、代理人 大阪市東区平野町２のＩＯ沢の鶴ビル電話０６−２０３
−０９４１Ｃ代）６、補正により増加する発明の数 補 正 の 内 容 （１） 明細書第１５頁第１〜２行に「エチジウムラ
ム０マイト」とあるｔ−ｒエチジウムプロマイト」と訂
正する。 （２） ！！Ｉノ細書第１５頁第９〜１０行及び第１
９頁第７〜８行に「を行なった。・・・・・処理し、」
とあるを夫々法の通り訂正する。 「全行なった後、６５°Ｃで１０分間熱処理して反応を
停止させた。他方ベクター、ＢＲ３２２につき」 （以 上） 受託番号変更届 １ 事件の表示 昭和５９年特許願第１８１２５０号 ２ 発明の名称 Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法３ 手続
をした者 事件との関係 特許出願人 丸金醤油株式会社 ４代理人 大阪市東区平野町２の１０ 沢の鴎ビル通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所６ 旧受託番号 微工研菌寄第７７９７号 ７ 新寄託様関の名称
Claims (3)
- （１）エシエリヒア属に属するＮ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼ生産菌由来のＮ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を組込んだこと
を特徴とする大腸菌にて複製できる組換えプラスミド。 - （２）エシエリヒア属に属するＮ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼ生産菌由来のＮ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を組込んでなる
組換えプラスミドを、上記Ｎ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼ生産菌又はエシエリヒア属に属するＮ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼ欠損株に導入したことを特徴
とする形質転換微生物。 - （３）エシエリヒア属に属するＮ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼ生産菌由来のＮ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を組込んでなる
組換えプラスミドを、上記Ｎ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼ生産菌又はエシエリヒア属に属するＮ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼ欠損株に導入して得られる形
質転換株を、培養して培養物からＮ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼを採取することを特徴とするＮ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼの製造法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59181250A JPS6181786A (ja) | 1984-08-30 | 1984-08-30 | Ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド及び形質転換微生物 |
| DE19853530935 DE3530935A1 (de) | 1984-08-30 | 1985-08-29 | Rekombinantes plasmid, transformante und verfahren zur herstellung von n-acylneuraminat-aldolase |
| JP5018292A JP2587764B2 (ja) | 1984-08-30 | 1993-02-05 | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59181250A JPS6181786A (ja) | 1984-08-30 | 1984-08-30 | Ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド及び形質転換微生物 |
| JP5018292A JP2587764B2 (ja) | 1984-08-30 | 1993-02-05 | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5018292A Division JP2587764B2 (ja) | 1984-08-30 | 1993-02-05 | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6181786A true JPS6181786A (ja) | 1986-04-25 |
| JPH0559705B2 JPH0559705B2 (ja) | 1993-08-31 |
Family
ID=26354948
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59181250A Granted JPS6181786A (ja) | 1984-08-30 | 1984-08-30 | Ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド及び形質転換微生物 |
| JP5018292A Expired - Lifetime JP2587764B2 (ja) | 1984-08-30 | 1993-02-05 | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5018292A Expired - Lifetime JP2587764B2 (ja) | 1984-08-30 | 1993-02-05 | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JPS6181786A (ja) |
| DE (1) | DE3530935A1 (ja) |
Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| JPS62277A (ja) * | 1985-06-26 | 1987-01-06 | Rikagaku Kenkyusho | 新規プラスミド及びそれにより形質転換された新規微生物及びそれを用いた有用生理活性物質の製造法 |
| JPS62278982A (ja) * | 1986-05-27 | 1987-12-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製造法 |
| JPS62282586A (ja) * | 1986-06-02 | 1987-12-08 | Nippon Kayaku Co Ltd | 組換え遺伝子産物の製法及び培地 |
| JPS63209589A (ja) * | 1987-02-27 | 1988-08-31 | Toyobo Co Ltd | Ｎａｌ（ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ）の製造方法 |
Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
| JP4753904B2 (ja) | 2007-03-15 | 2011-08-24 | シャープ株式会社 | 発光装置 |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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| JPS611384A (ja) * | 1984-06-14 | 1986-01-07 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製法 |
-
1984
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1985
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Also Published As
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|---|---|
| JPH0638751A (ja) | 1994-02-15 |
| DE3530935C2 (ja) | 1987-06-11 |
| JPH0559705B2 (ja) | 1993-08-31 |
| JP2587764B2 (ja) | 1997-03-05 |
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