JPH06277040A - 酵母細胞壁溶解酵素の製造法及び溶解法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 リソバクテラーレス（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ
ａｌｅｓ）に類縁の細胞壁溶解酵素生産能を有する微生
物を培養して細胞壁溶解酵素を製造する。 【効果】 本法によって製造された細胞壁溶解酵素を利
用することにより、赤色酵母等担子菌類酵母及び不完全
菌類酵母の細胞壁を効率的に溶解することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵母細胞壁溶解酵素生
産菌を利用することによる酵母細胞壁の溶解法及び該酵
素の製造法に関するものであるが、更に詳細には、本発
明は、酵母細胞壁溶解酵素生産菌（微工研菌寄第１１７
６１号）の生産する酵素を用いて酵母細胞壁を溶解する
方法及びそのための酵素製造法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】酵母細胞壁を溶解する酵素に関しては既
にいくつかの報告があり、又、商品化されているものも
あり、サッカロミセス・セルビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の子のう菌酵母
に対して有効なものが、知られている。ところが、ロー
ドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属などの、いわゆ
る赤色酵母は、市販の細胞壁溶解素に対しては感受性を
示さず、その細胞壁の溶解は困難なものとなっている。
又、機械的破砕あるいは高熱処理、強酸・強アルカリ処
理等は、菌体内有用成分を消耗、破壊してしまう事とな
り好ましくない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】酵母から菌体内有用成
分を変性させることなく採取するためには、物理的ない
し機械的な菌体破砕法は好ましくなく、マイルドな条件
で菌体から細胞壁を効率的に除去する方法が当業界にお
いて強く望まれている。しかも、上記のように特定の子
のう菌酵母のみに有効なものでなく、他の酵母、特に赤
色酵母にも有効な汎用性のある方法が希求されている。

【０００４】また最近の遺伝子工学の進展に伴ない、例
えば酵母細胞から染色体ＤＮＡやｍＲＮＡを取り出した
りする場合、ないしは細胞融合を行う場合にも、酵母の
細胞壁を効率的に除去する方法の開発が強く待望されて
いる。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、酵母、特に赤
色酵母といった担子菌類酵母及び／又は不完全菌類酵母
に対して効率的に溶菌作用を示す溶菌酵素を開発する目
的でなされたものであって、本発明者らは、赤色酵母に
対して溶菌作用を示す微生物を広く自然界より検索した
結果、ＹＳ−０８株を分離取得するのに成功した。

【０００６】そして、本菌株ＹＳ−０８株を液体培養又
は固体培養し、生産された酵母細胞壁溶解酵素を必要に
応じて精製し、赤色酵母等の担子菌類酵母や不完全菌類
酵母の生菌体に作用させる事により広く各種酵母の細胞
壁を溶解する事を確認し、また、この酵素処理によって
も酵母の菌体内成分はいささかも影響されないことも併
せ確認し、本発明を完成した。

【０００７】本発明において使用する例示菌株ＹＳ−０
８の菌学的性質は、下記の表１に示すとおりである。

【０００８】

【表１】

【０００９】以上の菌学的性質に従い、本発明の菌株Ｙ
Ｓ−０８株の分類学的地位をバージーズ・マニュアル・
オブ・システマティク・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅ
ｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）に基づいて検索した。本菌
は、滑走運動を有し、Ｇ−Ｃ含量が６４％と高い、子実
体を形成しないことにより、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒａｌ
ｅｓに属するものと考えられる。ところが、Ｌｙｓｏｂ
ａｃｔｅｒａｌｅｓのキノンシステムを分析すると、ユ
ビキノン−８であることから、本菌のメナキノン−７と
は全く異なっている。従って、本菌は既存の属に属して
いない新種と考えられ、ここでは未同定菌ＹＳ−０８と
呼称することとし、これを工業技術院微生物工業技術研
究所にＦＥＲＭ Ｐ−１１７６１として寄託した。

【００１０】本発明に係る酵母細胞壁溶解酵素は、該物
質生産菌（例えばＹＳ−０８、ＦＥＲＭ Ｐ−１１７６
１）を資化しうる炭素源を含む栄養培地中に接種し、通
気撹拌培養、振とう培養、静置培養等の液体培養法、も
しくは固体培養法により生産せしめることができる。

【００１１】炭素源としては、グルコース、シュークロ
ース、澱粉、フラクトース、グリセリンその他の炭水化
物を使用するのが好ましい。

【００１２】窒素源としては、オートミール、イースト
エキストラクト、ペプトン、カザミノ酸、グルテンミー
ル、綿実粉、大豆ミール、コーンスティープリカー、乾
燥イースト、小麦胚芽、落花生粉、チキン骨肉ミール等
を使用するのが好ましいが、アンモニウム塩（例えば、
硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム等）、尿素、アミノ酸等の無機及び有機の窒素化合
物も有利に使用することができる。

【００１３】これらの炭素源及び窒素源は、併用するの
が有利であるが、純粋なものを必らずしも使用する必要
はない。純粋でないものには、生長因子や微量要素が含
まれているからである。

【００１４】必要ある場合には、例えば次のような無機
塩類を培地に添加してもよい：炭酸ナトリウム、炭酸カ
リウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナト
リウム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリ
ウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等。また、ア
ミノ酸、ミネラル、ビタミン等の生育必要因子や生育促
進物質を必要に応じて添加する。

【００１５】特に、培地が強く発泡するのであれば、必
要あるときに、液体パラフィン、動物油、植物油、鉱物
油、シリコン等を添加してよい。

【００１６】目的酵素を大量に工業生産するには、他の
発酵生産物の場合と同様に、通気撹拌培養するのが好ま
しい。少量生産の場合は、フラスコを用いる振とう培養
が好適である。

【００１７】また、培養を大きなタンクで行う場合、酵
素の生産工程において菌の生育遅延を防止するため、は
じめに比較的少量の培地に生産菌を種培養した後、次に
培養物を大きな生産タンクに移してそこで生産培養する
のが好ましい。この場合、前培養に使用する培地及び生
産培養に使用する培地の組成は、両者ともに同一であっ
てもよいし必要があれば両者を変えてもよい。

【００１８】培養温度は、本酵素生産菌が本酵素を生産
する範囲内で適宜変更しうるが、通常は１０〜４５℃、
好ましくは２５〜３５℃で培養するのがよい。培養時間
は、培養条件や培養量によっても異なるが、通常は約１
５〜１５０時間である。培地のｐＨは、５〜８、好まし
くは６〜７に調整しておき、滅菌して使用する。

【００１９】このようにして、酵母細胞壁を溶解する能
力を有する微生物及びその培養物が得られる。なおこの
際、本菌は誘導条件により誘導される酵素生産パターン
が変化するので被溶解菌となる酵母の生菌体、死菌体、
細胞壁その他の菌体成分などを添加する事は、一層効果
的である。

【００２０】本発明でいう酵母細胞壁溶解酵素として
は、上記培養によって得られる該酵素生産菌菌体のほ
か、その培養物も包含される。培養物としては、該菌体
を含む培養液、それから菌体を濾過、遠心分離、傾しゃ
等によって除去した培養液、及び／又はその処理物が広
く包含される。処理物としては、上記培養液を濃縮、抽
出、限外濾過、透析、溶媒沈殿、ゲル濾過クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィーなどの既知の精製方法を、単用又
は併用して得られるものすべてを包含する。また希望す
るのであれば、これら各種の精製工程を更に実施するこ
とにより、酵素のみを単離、精製することもできる。

【００２１】本発明においては、上記のような方法で得
られた酵母細胞壁を溶解する能力を有する微生物及び／
又はその培養物を酵母に作用させる事により細胞壁を溶
解させることが出来る。

【００２２】本発明に従って酵母細胞壁を溶解するには
上記のように、該酵素生産菌及び／又はその培養物から
なる酵素液を酵母に作用させれば良く、例えば両者を各
種の方法で接触させればよい。その態様としては、該酵
素生産菌を培養する際に、被溶解酵母を添加して該酵母
の存在下で該菌を培養することにより、該酵母を溶菌す
る方法、あるいは、該菌及び／又はその培養物を緩衝液
中等で被溶解酵母と混合接触せしめ、好適には更にイン
キューベートする方法その他がある。後者の具体的態様
としては、たとえば、酵母菌体を水に懸濁させ、これに
浸透圧調整剤を含む緩衝液及び上記酵素液を加えて３０
℃前後で３０分〜２時間程度作用させ、その反応液を水
で希釈することで、酵母菌体は生菌体、死菌体を問わず
容易に溶菌することが出来る。

【００２３】尚、本明細書において、本菌株の生産する
酵母細胞壁溶解酵素の活性は次のように測定している。

【００２４】すなわち、酵母懸濁液１ｍｌ（ＯＤ_６６０
＝８〜１３）、２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６、３．
２Ｍソルビトール、５００ｐｐｍアジ化ナトリウム）１
ｍｌ、酵素液２ｍｌを加え３０℃で１時間反応させ、そ
の反応液１ｍｌに蒸留水３ｍｌを添加し、６６０ｎｍの
濁度を測定し、反応前後での６６０ｎｍの濁度の減少を
百分率で表示する。

【００２５】以下に本発明の実施例を示す。

【００２６】

【実施例１】ＹＥＡＳＴ ＮＩＴＲＯＧＥＮ ＢＡＳＥ
ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓａｎｄ Ａｍｍｏｎ
ｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ ０．１７％、寒天２％を加圧
滅菌し、放冷後、予めＹＭ培地にて１７時間培養、集
菌、洗浄しておいた、以下に示す各種の酵母生菌体を添
加しよく混合してからプレートに固めた。

【００２７】次いで、ＹＳ−０８株（微工研菌寄第１１
７６１号）を塗布し３０℃で培養し、生じる溶菌斑を確
認したところ、下記の表２に示される結果が得られた。

【００２８】

【表２】

【００２９】

【実施例２】市販栄養培地からなる滅菌シード培地を含
むＬ字管に、ＹＳ−０８（ＦＥＲＭＰ−１１７６１）を
１白金耳接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。Ｙ
ＥＡＳＴ ＮＩＴＲＯＧＥＮ ＢＡＳＥ ｗ／ｏ Ａｍ
ｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕ
ｌｆａｔｅ ０．１７％をｐＨ６に調整した滅菌培地２
００ｍｌを含む５００ｍｌ容坂口フラスコに、予めＹＭ
培地にて１７時間培養後、集菌、洗浄しておいた赤色酵
母Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ ＩＦＯ ０８
７０の生菌体を培地のＯＤ_６６０が３．５となるように
無菌的に添加し、更に上記シード培養物３ｍｌを加え、
３０℃で５日間振とう培養を行った。この培養液を遠心
分離により除菌し酵素液として、１７時間培養した赤色
酵母生菌体に対し１時間作用させたときの酵母細胞壁溶
解活性を測定したところ、下記の表３に示される結果が
得られる。

【００３０】

【表３】

【００３１】

【実施例３】実施例２で得られた酵素液２ｍｌに、予め
ＹＭ培地で１７時間培養した酵母生菌体懸濁液１ｍｌ、
３．２Ｍソルビトールを含む２０ｍＭクエン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）１ｍｌをＬ字管に入れ、３０℃で２時間
ゆるく振とうし、反応を行った。反応後、１Ｍソルビト
ールを含む高張液にて充分洗浄し、遠沈する。これにつ
いて、デービスらの方法（Ｄａｖｉｓ．Ｒ．，ｅｔ ａ
ｌ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖ
ｏｌ．６５，ｐｐ４０４，１９７９）に従いＤＮＡの調
製を行い、アガロース電気泳動に供したところ、２３Ｋ
ベースより大きい箇所にスポットが認められ、簡便にＤ
ＮＡが調製できた。

【００３２】

【発明の効果】本発明によって、従来有効な細胞壁分解
手段に乏しかった赤色酵母等各種の担子菌類酵母及び不
完全菌類酵母について、菌体内容物を破壊したり変性し
たりすることなくその細胞壁のみを選択的に溶解するこ
とに成功したものである。

【００３３】したがって本発明は、各種発酵工業におい
て、酵素、抗生物質、菌体蛋白質、核酸、生理活性物質
等菌体内有用成分を分離、回収するのに極めて有益であ
るばかりでなく、細胞融合やＤＮＡ等の分取等遺伝子工
学の技術分野においても非常に重要な役割を果すもので
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 佐藤 俊一 東京都千代田区九段南１丁目１番15号 関 東信越国税局鑑定官室内 (72)発明者 家藤 治幸 東京都北区滝野川２丁目６番30号 国税庁 醸造試験所内 (72)発明者 下飯 仁 東京都北区滝野川２丁目６番30号 国税庁 醸造試験所内 (72)発明者 杉山 隆一 東京都北区滝野川１丁目54番18号 株式会 社醸造資源研究所内 (72)発明者 田村 學造 東京都北区滝野川１丁目54番18号 株式会 社醸造資源研究所内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵母細胞壁溶解酵素生産能を有する微生
   物及び／又はその培養物を酵母に作用せしめることを特
   徴とする酵母細胞壁の溶解法。
2. 【請求項２】 酵母細胞壁溶解酵素生産能を有する微生
   物及び／又はその培養物が、目的とする被溶解酵母の生
   菌体、死菌体、細胞壁及び／又は菌体成分と接触させて
   なることを特徴とする請求項１に記載の溶解法。
3. 【請求項３】 微生物がリソバクテラーレス（Ｌｙｓｏ
   ｂａｃｔｅｒａｌｅｓ）に類縁の細胞壁溶解酵素生産能
   を有する微生物であること、を特徴とする請求項１又は
   請求項２に記載の溶解法。
4. 【請求項４】 該微生物の培養物が、菌体を含む培養
   液、菌体を除去した培養液及び／又はその処理物である
   ことを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項に
   記載の溶解法。
5. 【請求項５】 リソバクテラーレス（Ｌｙｓｏｂａｃｔ
   ｅｒａｌｅｓ）に類縁の母細胞壁溶解酵素生産能を有す
   る微生物を培養すること、を特徴とする酵母細胞壁溶解
   酵素の製造法。
6. 【請求項６】 被溶解酵母が、赤色酵母といった担子菌
   類酵母及び／又は不完全菌類酵母であること、を特徴と
   する請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の方法。