JP2012157366A - Dnaを単離するための溶出試薬、方法およびキット - Google Patents
Dnaを単離するための溶出試薬、方法およびキット Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012157366A JP2012157366A JP2012109533A JP2012109533A JP2012157366A JP 2012157366 A JP2012157366 A JP 2012157366A JP 2012109533 A JP2012109533 A JP 2012109533A JP 2012109533 A JP2012109533 A JP 2012109533A JP 2012157366 A JP2012157366 A JP 2012157366A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- reagent
- solid support
- purification
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
【解決手段】緩衝剤、塩基、キレート剤及び水を含むDNA溶離試薬を提供する。
【選択図】なし
Description
とする多数の固体支持体が用いられている。おそらく最も広く用いられる固体支持体はシリカに基づく粒子である(例えば、特許文献1、特許文献2、特許文献3、特許文献4、特許文献5を参照)。例えば、特許文献1中に開示された方法は、シリカ粒子にDNAを結合するために高濃度のカオトロピック溶液を用い、そして全血からDNAを精製するために6回の遠心分離工程及び5種の試薬を必要とする。この方法の不都合な点は、粒子懸濁液の使用、多数の遠心分離工程の使用並びにグアニジニウムイソチオシアネート及びアセトンのような危険な試薬の使用である。
れた方法を使用する。しかしながら、(使用前に均一に懸濁されなければならい)樹脂の使用を省くか、細胞の繰返された洗浄を省くか、または血液スポットの面倒なオートクレーブを省くことによりこれら3つの方法(非特許文献4、非特許文献5及び非特許文献6)をさらに簡略化できるはずである。
和していようと乾燥していようと、様々な生物学的出発材料を用いて実施することができる数工程の方法も必要とされる。
ているDNA精製試薬を本発明に用いる。DNA精製試薬の組成は、PCR増幅のような次のDNA分析とそれが適合する(すなわち、著しく阻害しない)ようにすべきである。例えば、DNA精製試薬のモル濃度は低いべきである。
固体支持体と生物学的サンプルを接触させることを含む。不純物の可溶化、細胞壁の溶解、細胞からのDNAの遊離及び固体支持体へのDNA結合を容易にするために生物学的サンプルを含有する固体支持体にDNA精製試薬を添加する。DNA精製試薬で固体支持体を(好ましくは少なくとも2回)洗浄することにより、不純物が固体支持体から除かれる。結合し、精製されたDNAを含有する固体支持体を増幅または他の分析に直接用いることができる。あるいはまた、DNA溶離試薬を用いてDNAを取り出すことができる。固体支持体からDNAを溶離させるために、DNA溶離試薬を固体支持体と接触させ、インキュベートし、次に取り除く。
DNAから成ることができる。
Oから商品名「BICINE」の下に入手可能)、3−[シクロヘキシルアミノ]−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホン酸(Sigma Chemical Companyから商品名「CAPSO」の下に入手可能)及びTrisが含まれるがこれらに限られるわけではない。緩衝剤は、PCR増幅のようなその後のDNA分析に有意に妨害性でない量で用いられる。かくしてそれは典型的には約20mM以下の量で用いられる。好ましくは緩衝剤はTrisであり、試薬の合計容積に基づいて約0.001〜20mM、より好ましくは約0.01〜15mM、そして最も好ましくは約1〜10mMの量で用いられる。
Suspension Reagent)」及び「溶解酵素試薬(Lytic Enzyme Reagent)」と呼ぶ。それらは核酸精製試薬による溶解に抵抗性であり得る細胞壁を消化するために、DNA精製法の第1段階で用いられる。細胞懸濁試薬を生物学的サンプルと合わせて細胞懸濁液を形成する。溶解酵素試薬を細胞懸濁液と合わせて消化された細胞を含有する混合物を形成する。これらの消化された細胞を次いで例えば遠心により混合物から分離し、次いで直接、又は固体支持体への適用の後に核酸精製試薬と接触させる。
nt)」と呼ぶ第4の補助試薬であるタンパク質消化試薬は、特に固体組織試料中の汚染タンパク質を消化するために用いられる。この酵素の精製された形態であるプロテイナーゼ K(Proteinase K)はSigma Chemical Companyのような商業的供給源から容易に入手可能であり、約0.1mg/mLの濃度で用いられる。36℃より高い温度における加熱はこの酵素の活性を促進する。
体積の最低1/10である。より好ましくは、溶解試薬の体積は固体支持体の総体積の最低半分であり、そして最も好ましくは、溶解試薬の体積は固体支持体の総体積に対応する。固体支持体の総体積は、その固体支持体の外的境界により規定される体積を指す。生じる生成物は、本明細書で「溶解マトリックス(Lysing Matrix)」と称される、DNAのような核酸の単離のための溶解マトリックスである。溶解試薬を固体支持体と組み合わせることにより、DNA精製法は、別個の溶解段階を除去することにより単純化される。好ましくは、溶解試薬を固体支持体に適用し、そしてその後、生物学的物質との接触前に固体支持体上で乾燥する。対照的に、慣習的系は、典型的には、生物学的物質を、固体支持体との接触に先立つ1段階として溶解試薬と接触させるか、もしくは、生物学的物質を固体支持体とともに懸濁し、その後、溶解試薬を、生じる懸濁液に添加する。
を、実施例1、2および3に記述されるとおり蒸発もしくは遠心分離のような方法により精製されたDNAを含有する固体支持体から除去することができる。
での洗浄の回数は最低2回、そしてより好ましくは最低3回である。本方法は実施例7、8、9、10、12および13で具体的に説明される。
を封止する自己封止機構である。第二の入口は試薬ポートとしてはたらく。双方の入口ポート上の任意の一特徴は保護解放(breakaway)封止である。さらに、入口ポート、解放封止および拡散装置が任意のスクリューキャップ中に収容されてよい。固体支持体の底部には、細胞破片、タンパク質および脂質分子の通過に適する孔径をもつ任意の拡散装置がある。この拡散装置は、カートリッジの断面を横断する生物学的物質の均一な横切りを見込み、そして固体支持体の下のどこででも生物学的物質の一様でない集積を予防する。カートリッジの出口は、テーパーバレルの上に適切に嵌まる保護キャップを装備されてできあがる。精製されたDNAは、容易なかつ混入のない貯蔵のため、スナップキャップを伴う円錐チューブより成る収集チューブに収集される。容器全体は、加工されるべきサンプルの大きさおよびその後の分析に必要とされる収量に依存して、大きさに合わせて調整し得る。
約3mm直径もしくは2mm平方の表面積をもつ小片に切断されたいくつかの固体支持体を、DNA精製のための支持体として評価した。1μl体積の全血を各固体支持体上にピペットで移し、0.6mlチューブもしくは96穴プレートのウェル中に保持し、そして乾燥させた。DNAを精製するために、200μlのDNA精製試薬(ジェネレーション[GENERATION](商標)DNA精製溶液、ジェントラ システムズ インク(Gentra Systems,Inc.)、ミネソタ州ミネアポリス)を添加し、そして15分間インキュベートした。ピペットで3回上下して混合した後に、DNA精製試薬(溶出された不純物を含有する)を廃棄した。この洗浄処置を、合計3回の洗浄のため
さらに2回反復した。この3段階の洗浄処置の間に、不純物は選択的に除去されて、固体支持体に結合された精製されたDNAが残った。固体支持体は室温ないし80℃での蒸発により乾燥し得たとは言え、任意のアルコール洗浄段階を使用して乾燥過程を加速した。200μlの体積の100%エタノールを各固体支持体上にピペットで移し、1分間インキュベートし、そしてその後除去した。100%のイソプロパノール(2−プロパノール)もまた乾燥を加速するための適するアルコールであることが見出された。エタノールのすすぎを、合計2回のすすぎのためさらに1回反復し、そしてその後、円板を室温で最低2時間乾燥させた。
迅速固相精製法を評価するため、2個の血液サンプルを3個体のそれぞれから収集し、一方は新鮮で使用し、そして他方は3ヶ月間−80℃で凍結させて保存しそしてその後使用前に融解した。3μlの体積の全血を、2ml回転チューブ(スピン(Spin)−X、カタログ番号9424、コーニング コスター(Corning Costar)、マサチューセッツ州ケンブリッジ)のインサート中に含有されたS&S 903紙の3mm直径の円板上にピペットで移した。200μlの体積の核酸DNA精製試薬(ジェネレーション[GENERATION](商標)DNA精製試薬、ジェントラ システムズ インク(Gentra Systems,Inc.)、ミネソタ州ミネアポリス)をインサート中にピペットで移し、そしてサンプルを1分間インキュベートした。DNA精製試薬を、15,000×gで10秒間の遠心分離により除去して、溶出された不純物を回転チューブ中に収集した。DNA精製試薬での第二のおよび第三の洗浄を、合計3回の洗浄のため同一の様式で実施した。精製されたDNAを含有する各円板を、増幅分析のため0.6mlのシリコン処理チューブに移した。回転チューブ中に収集された廃棄物を廃棄した。
最低2個のDNAサンプルを、以下の生物学的物質(注記された場合を除いてヒト起源)、すなわち全血、骨髄、唾液、頬側細胞、培養されたK562リンパ腫細胞、ショウジョウバエDrosophila melanogaster(D.melanogaster)、アルファルファ葉および大腸菌Escherichia coli(E.coli)細菌から調製した。全血、骨髄、唾液および頬側細胞切屑のサンプルをS&S 903紙に適用し、乾燥し、そしてその後穴あけ器で3mm直径の円板を打ち抜くことによりサンプリングした。植物もしくは動物組織のサンプルは、成体のD.melanogasterハエもしくはアルファルファの第一葉(子葉)をS&S 903紙上で押すことにより調製した。サンプルを、収集紙と一片のパラフィルム(PARAFILM)「M」(アメリカン ナショナル キャン(American National Can)、コネティカット州グリニッジ)との間に置き、そして親指の圧を用いて押した。培養細胞懸濁液は、K562ヒト細胞もしくは大腸菌(E.coli)細菌細胞のいずれかに適する標準的成長培地中で調製した。約10,000個のK562細胞を含有する1μlの体積の培地、もしくは約300万個の大腸菌(E.coli)細胞を含有する5μlの体積を、3mm直径の円板上にピペットで移し、そして乾燥した。その後、各円板を実施例1に記述されたとおり精製した。
察された。
全血および頬側スワブの含水および乾燥双方のサンプルを試験するため、各型の3サンプルを3個体から収集し、合計12サンプルを生じた。液体の全血サンプルについて、25μlの体積を、2ml回転チューブ(スピン(Spin)−X、カタログ番号9424、コーニング コスター(Corning Costar)、マサチューセッツ州ケンブリッジ)のインサート中に置かれたS&S 903収集紙の8mm直径の円板上にピペットで移した。乾燥の全血サンプルについては、8mmの円板を、300μlの乾燥された血液のスポットから打ち抜き、そして2ml回転チューブのインサート中に挿入した。頬側スワブを、滅菌の先端に綿をつけられた(cotton-tipped)スワブ(パーラップス[Pur−Wraps](商標)、ハードウッド プロダクツ(Hardwood Products)、メーン州ギルフォード)で内側頬表面を20回ぬぐうことにより得た。スワブの綿端部を切り離し、そして、含水サンプルについては収集の2時間以内に、また、乾燥サンプルについては24時間乾燥後に、2ml回転チューブのインサート中に置いた。サンプルを精製するため、200μlのDNA精製試薬(ジェネレーション[GENERATION](商標)DNA精製溶液、ジェントラ システムズ インク(Gentra Systems,Inc.)、ミネソタ州ミネアポリス)を各インサート中にピペットで移し、そして、含水サンプルについて1分、また乾燥サンプルについて15分インキュベーションした。DNA精製試薬を、15,000×gで10秒間の遠心分離により除去して、溶出された不純物を2ml回転チューブ中に収集した。DNA精製試薬での第二および第三の洗浄を、合計3回の洗浄のため同一の様式で実施した。固体支持体に結合された精製されたDNAを溶出するため、各インサートを清浄な2ml受容器チューブに移した。その後、100μlのDNA溶出試薬を、固体支持体を含有するインサート中にピペットで移し、そして、12mm直径のウェルを含有するアルミニウムブロックを取り付けられた乾燥ブロックヒーター(例えば、VWR サイエンティフィック プロダクツ(VWR Scientific Products)カタログ番号13259−007)中で、80℃で15分間加熱した。DNA溶出試薬は、10mMトリス、1mM NaOHおよび0.1mM EDTA、pH10.9を含有した。加熱した後、各サンプルを15,000×gで20秒間遠心分離して、精製されたDNAを収集した。
カートリッジを、標準的な1mlポリプロピレンシリンジ(カタログ番号309602、ベクトン ディッキンソン(Beckton Dickinson)、ニュージャージー州フランクリンレイクス)を使用して構築し、その中に固体支持体を挿入した。固体支持体は、約5mm直径×27mm長さの寸法のセルロースアセテート(フィルトローナ[Filtrona](商標)、アメリカン フィルトローナ(American Filtrona)、ヴァージニア州リッチモンド)から構成された。固体支持体は、既に500μlの溶解試薬およびRNアーゼAで処理しそして室温で24時間乾燥させてあった。溶解試薬は、0.5%SDS、0.1Mトリス、0.1M EDTAを含有し、これに0.04mg/mlのRNアーゼAを添加した(1mgあたり約100単位のRNアーゼA)。それぞれ300μlの体積中に約200万個の細胞を含有する、2個の全血サンプル
および2個のK562培養細胞サンプルを、それぞれ垂直の位置に支持されたカートリッジにピペットで移した。細胞を溶解させそしてRNアーゼにサンプル中に存在するRNAを消化させるために室温で15分間インキュベートした後に、300μlの体積のDNA精製試薬(ジェネレーション[GENERATION](商標)DNA精製溶液、ジェントラ システムズ インク(Gentra Systems,Inc.)、ミネソタ州ミネアポリス)を、60rpmのペリスタリックポンプ(カタログ番号MC13003、マークソン サイエンス(Markson Science)、オレゴン州ヒルズボロ)を使用して2.5mm内径のシリコンチューブを介して導入した。1分のインキュベート後に、空気を、カートリッジを通してポンプで送って、カートリッジの内容物を廃棄物容器中に排出した。その後、第二の300μlの体積のDNA精製試薬をカートリッジ中にポンプで送り、そして1分インキュベートした。この洗浄段階を、DNA精製試薬での合計3回の洗浄のためさらに1回反復した。カートリッジ中の固体支持体を、それを通して300μlのDNA溶出試薬をポンプで送ることによりすすいだ。精製されたDNAを固体支持体から取り出すために、300μlのDNA溶出試薬をカートリッジ中にポンプで送った。カートリッジを、双方の端部で栓をし、そして重力対流オーブン中60℃で30分間インキュベートした。あるいは、適切な電子レンジを使用してもよい。カートリッジは、1100Wのシャープ(Sharp)電子レンジ中で、30%出力で25分間加熱してよい。その後、精製されたDNAを含有したDNA溶出試薬を、カートリッジからそして1.5ml微小遠心管中にポンプで送った。あるいは、DNA溶出試薬を、60℃より上の温度に加熱し得そしてその後カートリッジ上にポンプで送り得る。
DNA精製試薬(ジェネレーション[GENERATION](商標)DNA精製溶液、ジェントラ システムズ インク(Gentra Systems,Inc.)、ミネソタ州ミネアポリス)を使用して精製されたDNAの質を、固体支持体に結合されている間にさらに試験するため、7種の制限酵素を使用して精製されたDNAを消化するそれらの能力を試験した。単一の個体からの300μlの体積の全血をS&S 903紙上にピペットで移し、そして室温で乾燥した。その後、7個の5mm直径の円板を押して抜き取り、そしてそれぞれを0.6mlチューブ中に置いた。200μlの体積のDNA精製試薬を各チューブに添加し、そして15分間インキュベートした。ピペットで3回上下して混合した後に、DNA精製試薬を廃棄した。この洗浄処置を、合計3回の洗浄のため2回反復した。この3段階の洗浄処置の間に、不純物は選択的に除去されて、円板に結合された精製されたDNAが残った。200μlの体積の100%イソプロパノール(2−プロパノール)を各円板上にピペットで移し、1分間インキュベートし、そしてその後除去した。これを、合計2回のアルコールのすすぎのため1回反復した。精製されたDNAを含有する円板を室温で2時間乾燥させた。
単位)、Msp I(20単位)、Bam HI(20単位)、Hpa I(5単位)、およびHae III(10単位)を、明記された各反応に添加された単位で試験した。サンプルを37℃で4時間消化し、その時間の間、消化されたDNAフラグメントは固体支持体から消化溶液中に遊離された。制限フラグメントを収集するために、各サンプルチューブを27ゲージの針を用いて刺し通し、そして清浄な0.6mlチューブ中に置いた。消化溶液を、2,000×gで2分間の遠心分離により収集した。精製されたDNAが消化されたかどうかを決定するために、20μlの体積を各サンプルから取り出し、そして1%アガロースゲルにより22ボルトで12時間電気泳動した。
種々の界面活性剤を試験して、DNAの収量を至適化するために必要な界面活性剤の最良の種類を決定した。以下の種類の界面活性剤を試験した:
アニオン性 ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)
Sarkosyl
カチオン性 ドデシルトリメチラム−モニウム ブロミド
非イオン性 Tween-20
Triton X-100
センス5’CCT−GGC−TCA−CCT−GGA−CAA−CCT−CAA3’(配列番号3)およびアンチセンス5’TAG−CCA−CAC−CAG−CCA−CCA−CTT−TCT3’(配列番号4)。サンプルは、94℃で1分間、70℃で1分間、そして72℃で2分間の35サイクルを使用して増幅した。次に10μlの増幅したDNAは、0.125μg/mlのエチジウムブロマイドをゲルおよび泳動緩衝剤に含有する2%アガロースゲルに乗せた。サンプルは80ボルトで45分間電気泳動し、そして1.1kbのDNAバンドをUVトランスイルミネーター上で視覚化した。界面活性剤は表2に示すように、ゲノムおよび増幅DNAの両方についてバンド強度を視覚で順位付けすることにより評価した。
NaOH濃度および界面活性剤の種類(アニオン性または両イオン性であるか)の効果を、2種の固体支持体密度で調査した。0または5mM NaOHおよび1% ドデシル硫酸ナトリウムまたは1%CHAPSを含有する4種の溶液を調製した。CHAPSは市販されている両イオン性界面活性剤である。各360μl容量のこのような溶液を実施例7に記載するように固体支持体に加えた。調査した2種類のポリオレフィン固体支持体密度は、0.113グラム繊維/cc(低密度)および0.184グラム繊維/cc(高密度)(Filtrona(商標)、アメリカン フィルトロナ、リッチモンド、バージニア州)であった。300μlの全血を各固体支持体に加え、洗浄し、そして実施例7に記載したように、しかし150μl容量のDNA精製試薬(GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州)の使用は除いて溶出させた。精製したDNAはPCR増幅およびUV分光光度計により分析した。使用したPCRプロトコルは、実施例7に記載したものと同一であった。ゲノムDNAの収量は、UV分光光度計および0.7%アガロースゲル電気泳動により調査した。UV
分光光度計によりDNAを定量するために、50μlの精製したDNAを950μlの脱イオン水に最初に加えた。次にUV吸収を320(バックグラウンド)nmおよび260nmおよび280nmの波長で測定した。収量はA260×50×希釈因子×溶出容量として計算した。
錯化剤、塩および界面活性剤が固体支持体の処理に及ぼす効果を決定するために、ポリオレフィン固体支持体を0.5%または2.0%のドデシル硫酸ナトリウム、0または50mM EDTAおよび0または100mM NaClを含有する8種類の溶液を用いて処理した。実施例7に記載したように200μlの全血サンプルを各固体支持体に加え、洗浄し、そして溶出させた。精製したDNAを回収し、そしてゲノムDNAの収量を実施例8に記載したようにUV分光光度計により調査した。相対的収率は、さらに実施例7に記載したように0.7%アガロースゲルで精製したDNAサンプルをアガロースゲル電気泳動することにより視覚化した。0と50mM NaClの間で観察されるDNA収率の差異は無かった。同様に0と50mM EDTAとの間で観察されるDNA収量の差異は無かった。しかし2%SDSに比べて0.5%SDSを使用した時、収率が3倍向上した。
最適なアニオン性界面活性剤濃度は、ポリオレフィン固体支持体を0.2〜1.6%の範囲のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液を用いて処理することにより予測した。固体支持体は実施例7に記載するように0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6%SDSを含有する8溶液で処理した。実施例7に記載するように200μlの全血を各固体支持体に加え、洗浄し、そして溶出した。精製したDNAを集め、そしてゲノムDNAの収量を実施例7に記載したようにアガロースゲル電気泳動により視覚化した。
DNA収量に及ぼす時間および温度の効果を、実施例7に記載したポリオレフィン固体支持体を使用して試験した。200μlの血液サンプルに由来するDNAは、DNA精製試薬(GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州)を用いた2回の400μl洗浄およびDNA溶出試薬を用いた1回の洗浄を使用して精製した。
カートリッジは、中に固体支持体が挿入された標準の1mlのポリプロピレンシリンジ(カタログ番号309602、ベクトン デッキンソン(Beckton Dickinson)、フランクリンレイクス、ニュージャージー州)を使用して構成した。固体支持体は、約5mm直径×27mm長の酢酸セルロース(Filtrona(商標)、アメリカン フィルトロナ、バージニア州)から成った。
高処理量システムでDNA精製の効力を試験するために、親水性ポリオレフィン固体支持体(R-18495、アメリカン フィルトロナ社、リッチモンド、バージニア州)を、800μlのウェル容量を持つ96-ウェルプレート(マサチューセッツ州、ロックランドのポリフィルトロニックス(Polyfiltronics)による、フィルター無しで製造されたユニフィルタープレート(Unifilter plate))中のウェルに挿入した。固体支持体はサイズが円筒状であり、そして16.7mmの円周および10mmの長さを有した。前述の96-ウェルサンプル処理プレートを、廃液回収プレートとして役立つ2mlウェル容量を持つ別の96ウェルプレート上に置いた。100μl容量の全血を各固体支持体に適用し、そして1分間インキュベートした。続いて固体支持体は、200μl容量のDNA精製試薬(GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州)をウェルに加えることにより2回洗浄し、そして1分間インキュベートした。続いて廃棄材料は、マイクロプレートキャリアーを装備したM4ローターを持つJouan C412遠心機(ジョアン(Jouan)、ウィンチェスター、バージニア州)中で1500×gにて1分間、遠心することにより除去した。次に固体支持体は、100μlのDNA溶出試薬を用いて洗浄し、そして上記のようにインキュベーション無しで遠心した。洗浄した固体支持体から精製したDNAを溶出するために、処理プレートをきれいな標準ポリスチレン96-ウェルプレートに移し、そして100μl容量のDNA溶出試薬を各ウェルに加えた。積み重ねた処理プレートおよびサンプル回収プレートを80℃に設定した対流オーブン(BioOven I、セント ジョーンズ アソシエイツ(St.John's
Associates)、ベルツビレ、メリーランド州)に置き、そして30分間インキュベートした。次にDNAを固体支持体から1500×gで1分間遠心することにより溶出させた。8つの10μlのサンプル溶出物を80ボルトで15分間、1%アガロースゲル中で電気泳動することにより、DNAの存在を分析した。8サンプルの各々が、UVトランスイルミネーターで調査することにより視覚化されるようなDNAを含んだ。
300μl容量の溶解試薬(0.5% SDS、0.1M Tris塩基、0.1M EDTA二ナトリウム塩)を、酢酸セルロース固体支持体(アメリカン フィルトロナ、リッチモンド、バージニア州) に適用し、そして室温で乾燥させた。第2の固体支持体は、0.04mg/mlのRNaseA(ミネソタ州、ミネアポリスのジェントラ システムズ社からの4mg/mlで)も含む溶解試薬で処理し、そして室温で乾燥させた。固体支持体は8mmの直径および6.75mmの長さを有した。2つの処理した固体支持体をスピン管のインサート中に置き(実施例8に記載したように)、そして150μl容量の大腸菌(E.coli)の一晩のバクテリアカルチャーを各固体支持体に直接加えた。大腸菌(E.coli)のバクテリアカルチャーは、大量のRNAを含み、そして固定化されたRNA消化酵素の効力を試験するためのモデルとして役立った。次にサンプルは37℃で12分間インキュベートしてRNA消化を可能とした。続いてそれらを150μl容量のDNA精製試薬(GENERATION(商標)DNA 精製試薬、ジェントラ システムズ社、ミネ
アポリス、ミネソタ州)で3回、洗浄した。次に150μlの塩基性溶出試薬(10mM Tris、0.1M EDTAおよび1mM NaOH)を固体支持体に室温で20分間加えた。核酸は15,000×gで10秒間遠心することにより溶出させた。10μl容量を、80ボルトで60分間、1%アガロースゲルを通して電気泳動することにより、DNAの存在について分析した。UVトランスイルミネーター上でのゲルの調査では、溶解試薬を用いて処理した固体支持体を使用して精製されたサンプル中のRNAに対応する主要な低分子量スメア(約0.1〜1.4kb)の存在が明らかに示された。対照的に、RNaseAを加えた溶解試薬で精製したサンプルは、低分子量RNAスメアを欠き、RNaseの存在が混入RNAの除去に効果的であることを示している。
溶出溶液は、固体支持体から最高のDNA収量を提供し、そしてPCR緩衝剤系を妨害せずに高いPCR収量を生成するように至適化した。塩基、NaOHまたはKOHのいずれか、トリス緩衝剤および錯化剤(EDTA)の至適濃度は、PCRを使用してDNA増幅収量につい試験した。
さまざまな洗浄および溶出手順を試験して、どの組み合わせが至適なDNA収量および低い%増幅阻害を提供するかを、TaqMan7700Quantitative PCR装置を使用して決定した。PCR手順は実施例4に記載した通りである。
(1) 3×150μl NA精製試薬+1×150μl DNA 溶出試薬
(2) 4×200μl NA精製試薬+1×200μl DNA 溶出試薬
(3) 3×200μl NA精製試薬+2×200μl DNA 溶出試薬
結果を表5に示す。
セルロース固体支持体は、未処理固体支持体に対する比較のために異なる組成を有する溶解試薬を用いて処理した。第1組成は、0.5%SDS、0.1M Trisおよび0.1mM EDTAから成り、一方第2組成は1%SDS、10mM Trisおよび0.1mM EDTAから成った。セルロース紙をスピン管(スピン-X、コーニング コースター番号9424、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)に挿入し、そして2つの上述の組成で処理した。処理したセルロース紙を次に室温で少なくとも16時間、乾燥させた。未処理セルロース紙も、処理したサンプルに対する比較として使用した。25μl容量の血液を各セルロース固体支持体に適用し、そして5分間インキュベートした。DNA精製試薬(GENERATION(商標)DNA 精製溶液、ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州)を用いた3回の洗浄およびDNA溶出試薬を用いた2回の洗浄を含む最適な精製法を行った。DNAを回収し、そしてTaqMan7700Quantitative PCR装置を使用して分析し、ここでβ-アクチン増幅標的を製造元(パーキン エルマー、アプライドバイオシステムズ デビジョン、ホスター市、カリフォルニア州)が推薦するようにDNA増幅に使用した。
全血のサンプルを、EDTA(B-D16852、ベクトン デッキンソン アンド社(Becton Dickinson & Co.)、フランクリン レイクス、ニュージャージー州)を含むバキュテイナー(vacutainer)管に引き出し、そして良く混合した。全血の小さいアリコートを取り出し、そして白血球細胞の総数をCBC5細胞カウンター(コールター エレクトロニックス(Coulter Electronics)、ハイアレア、フロリダ州)で製造元の指示に従い計数した。これにより7.25×106細胞/mlと決定された。次に血液の残りを1mlのアリコートで-80℃にさらに精製を必要とするまで凍結した。
4、コーニング コースター、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)に加えた。溶解マトリックスは直径8mmおよび高さ8mmの円筒状のポリオレフィン固体支持体マトリックスから成った(Filtrona(商標)、カタログ番号18475、アメリカン フィルトロナ、リッチモンド、バージニア州)。ポリオレフィン固体支持体マトリックスは、1%SDSおよび20μg/ml RNaseAを含む溶液ですでに飽和され、そして続いて乾燥された。
(A260−A320)/(A280−A320)
実施例18からの7種の精製したサンプルを、さらに濃度および収量について分析した。各々のサンプルの1:50希釈を脱イオン水中で、DNA溶出試薬を含むブランクと共に調製した。320nm(バックグラウンド)、260nmおよび280nmで の吸収を、ベックマン DU64分光光度計(ベックマン インスツルメンツ社(Beckman Instruments,Inc.)、フラートン、カリフォルニア州)を使用して読んだ。DNA濃度は以下のように算出した:
(A260−A320)X 50(DNA消光係数)X 50(希釈因子)
(7.25×106細胞/ml)X(0.2ml)X(6×106μg)=8.7μg
。この計算により94%の収率を得た。
実施例18の7種の各サンプルに関するDNAサイズは、HindIIIで消化したラムダDNAの23.1kbバンドと比較することにより決定した。7種の各200μlのDNAサンプルをから10μlの容量を追跡色素と混合し、そして1%アガロースゲルに乗せた。サンプルを80ボルトで1時間、1XTAE泳動緩衝剤中で電気泳動した。ゲルおよび泳動緩衝剤の両方が、DNAをトランスイルミネーター上で視覚化できるように0.125μg/mlのエチジウムブロミドを含んだ。DNAサンプルとマーカーレーンと比較することにより、95%より多くのDNAが23.1kbマーカーを越え、DNAが実質的により高分子量であることを示した。
実施例17からの7種の各サンプルを、それらがPCRによる分析に適するかどうかを見るために試験した。2.5μl容量の7種の各サンプルを22.5PCR増幅ミックスに加えて、全増幅容量を25μlとした。各増幅反応は、1X増幅緩衝剤(プロメガ、マジソン、ウィスコンシン州)、1.5mM MgCl2、200μM 各デオキシヌクレオチド、1.25単位のTaq DNA ポリメラーゼ(プロメガ、マジソン、ウィスコンシン州)、および1μM 各プライマーを含んだ。プライマーは、遺伝性ヘモクロマトーシス遺伝子スクリーニングに使用するHLA-H遺伝子の領域に特異的な配列、5’−TGG−CAA−GGG−TAA−ACA−GAT−CC−3’(配列番号5)および5’−CTC−AGG−CAC−TCC−TCT−CAA−CC−3’(配列番号6)(Federら、1995,Nature Genetics 13:399-408)であった。サンプルは94℃で1分間、58℃で1分間、そして72℃で1分間の35サイクルを使用して増幅した。
7種の5mm直径の乾燥した血液スポットに由来するDNAを、実施例6に記載したように精製し、消化し、そして電気泳動した。電気泳動後、制限断片をナイロン膜(Biotrans+(商標)、ICNバイオメディカルズ社(Biomedicals,Inc.)、イルバイン、カルフォルニア州)に、0.4N NaOHおよび0.6M NaClを含有する転写溶液を使用してサザンブロットにより7時間にわたり転写した。このナイロンブロットを65℃で14時間、HYB-9(商標)ハイブリダイゼーション溶液(ジェントラ システムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州)中でハイブリダイズさせ、そして製造元の支持に従い洗浄した。プローブは、グルタルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼの32P-標識化dCTPを用いて標識した増幅した300bp領域から、ランダムプライミングキット(アマーシャム ライフ サイエンス社(Amersham Life Science,Inc.)、アーリントンハイツ、イリノイ州)を使用して調製した。膜は2枚の増感スクリーンの間のX-線フィルム(XRA5、イーストマン コダック社(Eastman Kodak Company)、ロチェスター、ニューヨーク州)に対して、-80℃で14時間、置いた。得られたオートラジオグラムは、消化したDNAに対応する各レーン中のバンドがゲノム中のGAPDH配列に相補的であることを示した。
*試験材料:全血(Memorial Blood Center of Minneapolis)、8ES培養細胞(Folk,et al.,1986,Guenthner et al.,1998)もしくはリン酸緩衝剤生理食塩水(PBS)を、2種の異なる容器型(CaptureプレートTM,Gentra Systems Inc.,Minneapolis,MNおよびCaptureカラムTM,Gentra Systems Inc.,Minneapolis,MN)に含有された溶解マトリックス(lysing matrix)上に負荷した。CaptureカラムTMは、遠心チューブ内に置かれた挿入物(insert)中に封入された溶解マトリックスからなる。CaptureプレートTMは、各々溶解マトリックスを封入されている96個の流出(flow−through)ウェルからなる。各ウェルの底は先細りの出口をもつ。
reプレートTMを、1100W Sharpマイクロウェーブオーブンにおいて30%出力で25分間加熱した。遠心に続いて、溶出液を増幅のために用いた。
DNAは、溶解マトリックス(CaptureカラムTM,Gentra Systems Inc.,Minneapolis,MN)において、全血、骨髄、軟膜、培養細胞および固形組織(solid tissue)から精製した。CaptureカラムTMにおける精製の前に、サンプルを次のように処理した:
全血および骨髄は、DNA分解を減少させるためにEDTA中に収集した。しかしながら、他の抗凝血剤、例えばACD(クエン酸塩)およびヘパリンを、成功裏に使用できる。サンプルは、新鮮なものでも凍結されたものでもよい。しかしながら、改善された収量は、凍結サンプルを用いて観察される。凍結サンプルは、−80℃において少なくとも2年間安定である。使用前に、サンプルを、37℃温浴で速やかに融解し、そして使用まで氷上に保つ。血液もしくは骨髄が凍結されない場合は、4℃で貯蔵することが推奨される。血液もしくは骨髄の200μl容量がDNA精製のために使用できる。より大容量からDNAを精製する必要がある場合は、軟膜サンプルが調製されてもよい。
全血は、DNA分解を減少させるためにEDTA中で収集した。しかしながら、他の抗凝血剤、例えばACD(クエン酸塩)およびヘパリンを、成功裏に使用できる。新鮮サンプルは、4℃で貯蔵された。白血細胞は、十分な溶解試薬(Lysis SolutionTM,Gentra Systems Inc.,Minneapolis,MN)を用いて素早く単離された。あるいはまた、軟膜は、5mlまでの全血から、室温で10分間800xgでサンプルを遠心することによって調製されてもよい。あるいはまた、血液を含有するチューブを、直立位置に4℃で一夜放置して細胞を沈降させてもよい。白血細胞の薄層(軟膜)は、上部血漿層と下部赤血細胞層の間に、肉眼で見られるであろう。上部血漿層を除去し、そして軟膜を、ピペットを用いて注意深く収集し、そして使用まで氷上に保つ。DNAは、最大10x106白血細胞を含有する200μlまでの軟膜調製物から精製できる。
(例は、唾液、滑液、脳脊髄液、尿、羊水、血漿および血清を含む。)
体液サンプルを収集し、4℃で保存し、そして可能な限り速やかに使用する。あるいはまた、それらを−80℃で凍結保存してもよい。低い細胞数の体液では、サンプルを遠心
によって濃縮することが望ましい。体液3〜40mlからの細胞を、2,000xg10分間の遠心によってペレットにした。上澄液を、残液200μl〜1mlを残して除去した。残留液におけるペレットを、上下繰り返し10回ピペッティングして完全に懸濁し、そして氷上に維持するか、−80℃で凍結保存した。
新鮮サンプルおよび−80℃で凍結保存されたサンプルを使用した。懸濁された培養細胞を収集し、そして使用まで氷上に置いた。細胞計数は、血球計もしくは他の細胞カウンターを用いて得られた。10x106までの培養細胞を含有する懸濁液200μlを、CaptureカラムTMに直接添加した。
新鮮サンプルおよび−80℃で凍結保存されたサンプルを使用した。サンプルを、常時、氷上に保ってDNアーゼ活性を減少させた。組織20mgを、冷PBS1)(好ましくは、DNアーゼ活性を減少させるために1mM EDTAを含有)30μlを含有する1.5mlミクロフュージ(microfuge)チューブに添加し、そして素早く、ミクロフュージチューブ乳棒でホモジナイズした。サンプルを氷上に置いて細胞塊を2〜10分間沈降させた。次いで、上部細胞懸濁液200μlを採取してすべての細胞塊を排除した。
1) EDTA含有PBS:8gmNaCl,0.2gmKCl,2.72gmNa2HPO4・7H2O,0.24gmKH2PO4,0.372gmEDTA二ナトリウム塩を超純水に溶解し、1000mlまでの容量にしてオートクレーブする。
新鮮サンプルおよび−80℃で凍結保存されたサンプルを使用した。サンプルを氷上に維持した。典型的には、一夜培養液は、1〜3x109細胞/mlを含有する。しかしながら、グラム陰性細菌の比較的小さいゲノムサイズによっては、3x109までの細胞がDNA精製用カラムに適用された。培養液を遠心し、洗浄し、再懸濁し、そしてカラムに適用した。
例24からのサンプルを、溶解マトリックス(CaptureカラムTM,Gentra
Systems,Minneapolis,MN)を用いて次のように精製した:
i.サンプル精製
1.十分混合したサンプル容量200μlを、CaptureカラムTMに添加し、そして室温で少なくとも1分〜1時間吸着させた。
心し、そして廃液容量を集めた。
精製DNAは、4℃において少なくとも3カ月間安定である。長期保存のためには、それは−20℃で保存できる。
UV分光光度分析用のDNAを希釈するために、しばしば水が使用される。しかしながら、水が希釈液として使用される場合、測定されたA260/A280比および収量の両方には、有意な変化が生じることがある。市販緩衝剤、例えばTrisもしくはリン酸に基づく緩衝剤は、これらの問題に打ち勝つために使用できる。確実な結果は、下記のようなTE緩衝剤TM(10mM Tris,11mM EDTA pH8.0)(Gentra Systems,Minneapolis,MN)中にDNAサンプルを希釈することによって得られる。さらに確実には、マスクされた石英キュベット(例えば、Beckman
Instruments,Inc.Semi−Microcell Masked Cuvette Cat.No.533041)を用いることによって得られる。
1.精製DNAサンプルを、5秒間静かに旋回させる。
1.各サンプルのDNA濃度を算出するために:(A260−A320)x50x希釈ファクター(例えば200/10)=DNA濃度(μg/ml)。注意:A320はバックグラウ
ンド散乱を測定する。
新鮮もしくは凍結生物サンプルを収集し、そして例24.に記述されたように処理した。大サンプル容量(例えば300μl)を平板固形支持体(Collection CardTM,Gentra Systems,Minneapolis,MN)上にピペットで添加し、乾燥し、次いで、DNA精製前にディスクを打ち抜くことによってサンプリングした。サンプルは、室温で少なくとも9カ月、または長期保存では−20℃で、Collection Card上で保存できる。
ii.頬細胞(頬内側からの上皮細胞)
iii.体液(唾液、尿、血漿、血清)
iv.培養細胞
サンプルを、清潔なホールパンチを用いて3mmディスクを打ち抜くことによって、Coolection Cardから採取し、次いで、96穴プレート、0.2mlもしくは0.6mlミクロフュージ・チューブにおいて精製した。3mmディスクを、96穴プレートのウェルに置き、そしてプレートを自動ワークステーション中に設置した。(さもなくば、サンプルを、マルチチャンネルピペットを用いて96穴プレート中に、またはミクロピペットを用いて0.2もしくは0.6mlチューブ中に、手動で処理してもよい)。DNA精製試薬(DNA精製溶液TM,Gentra Systems,Minneapolis,MN)容量200μlを添加し、そして室温で15分間インキュベートさせて、汚染物が遊離される間、DNAをディスクに結合させたままにした。溶液をピペッティングによって混合し、次いで除去した。この処理を2回繰り返した。次いで、100%イソプロパノールもしくは100%エタノール容量200μlを添加し、そして室温で1分間インキュベートさせた。アルコールを除去し、そしてアルコール洗浄を繰り返した。次いで、ディスクを、室温で少なくとも1〜16時間乾燥させてアルコールを蒸発させた。乾燥後、サンプルディスクは、明橙色ないし白色であった。精製ディスクは、室温で少なくとも9カ月、または長期保存では−20℃で安定である。
1.ディスクを、0.2もしくは0.6ml増幅チューブで精製する場合は、少なくとも50μlの増幅溶液を、直接チューブに添加した。ディスクを、96穴平底プレートで精製する場合は、精製DNAサンプルディスクを増幅チューブに移し、次いで、少なくと
も50μlの増幅溶液を添加した。ディスクを完全に増幅溶液中に沈めた。次いで、サンプルを標準条件を用いて増幅した。
精製DNAディスクを洗浄し、そして少なくとも5回再使用してもよい。
DNAは、溶解マトリックスディスク(Captureディスク,Gentra Systems,Minneapolis,MN)において、5種の生物サンプルから精製した。DNAの品質はPCR増幅を用いて確認された。
i.軟膜調製物
全血もしくは骨髄を、DNA分解を減少させるためにEDTA中に収集した。しかしながら、他の抗凝血剤、例えばACD(クエン酸塩)およびヘパリンを、成功裏に使用できる。白血細胞は、RBC溶解試薬(PUREGENER RBC Lysis Solution,Gentra Systems,Minneapolis,MN)を用いて、サンプル中の赤血細胞から単離された。あるいはまた、軟膜は、室温で10分間800xgでサンプルを遠心することによって調製されてもよい。白血細胞の薄層(軟膜)は、上部血漿層と下部赤血細胞層の間に、肉眼で見られるであろう。上部血漿層を除去し、そして軟膜を、ピペットを用いて収集し、そして氷上に保つ。少なくとも2,100の白血細胞を含有する軟膜の懸濁液3μlを、次いで、Captureディスクに添加した。
体液の例は、唾液、滑液、脳脊髄液、尿、羊水、血漿および血清を含む。低い細胞数の体液では、サンプルを遠心によって濃縮する。体液3〜40mlからの細胞を、800xg10分間の遠心によってペレットにする。上澄液を除去し、そしてペレットを、残液中
に懸濁し、そして氷上に維持する。
細胞数は、血球計もしくは他の細胞カウンターを用いて測定された。少なくとも2,100培養細胞を含有する懸濁液3μlを、溶解マトリックスディスクに添加した。
少なくとも600,000細菌細胞を含有する懸濁液3μlを溶解マトリックスディスクに添加した。典型的には、細菌の一夜培養液は、1〜3x109細胞/mlを含有する。かくして、培養液は直接使用されても、また必要ならば、遠心によって濃縮されてもよい。
マウスを直立位に拘束し、そして唾液3〜5μlを、ミクロピペッターを用いてマウスの舌下から採取した。
全血もしくは骨髄は、DNA分解を減少させるためにEDTA中に収集した。しかしながら、他の抗凝血剤、例えばACD(クエン酸塩)およびヘパリンを成功裏に使用できる。血液もしくは骨髄の3μl容量がDNA精製のために使用された。
上記サンプルを次のように精製する:
1.十分混合したサンプル容量3μlを、2mlスピンチューブの挿入物中の3mm溶解マトリックスディスク上にピペッティングした。サンプルを、室温で少なくとも1分もしくは2時間まで吸収させた。
ディスクを、直接、増幅チューブ中に置いた。増幅主混合液容量25〜50μlをチューブに添加し、そしてDNAを標準条件を用いて増幅した。ディスクは、増幅溶液中で少なくとも4カ月間室温で保存された。
ディスクは、さらなる増幅のために再使用されてもよい。方法は次のとおりである:ディスクをDNA精製溶液200μlで2回洗浄し、そして増幅前に、2,000〜16,000xg5秒間遠心する。
本発明の特徴または主たる態様を以下に挙げる。
(b)塩基;
(c)キレート剤;および
(d)水、
を含んで成るDNA溶出試薬。
(b)DNAを含有する生物学的物質をDNA精製試薬で処理すること;
(c)DNAを生物学的物質の残余から精製すること;そして
(d)DNAを、DNA溶出試薬を用いて固体支持体から溶出すること、
の段階を含んで成る、DNAの単離方法であって、DNA溶出試薬が、
(i)緩衝剤;
(ii)塩基;
(iii)キレート剤;および
(iv)水、
を含んで成る方法。
(b)DNA精製試薬;および
(c)DNA溶出試薬、
を含んで成る、DNAを単離するためのキットであって、
DNA溶出試薬が、
(i)緩衝剤;
(ii)塩基;
(iii)キレート剤;および
(iv)水、
を含んで成るキット。
(b)DNA溶出試薬
を含んで成る、DNAを単離するためのキットであって、
DNA溶出試薬が、
(i)緩衝剤;
(ii)塩基;
(iii)キレート剤;および
(iv)水、
を含んで成るキット。
(a)生物学的サンプルから本質的に純粋なDNAを単離するための説明手段;
(b)DNA精製試薬;および
(c)溶解試薬で処理された固体支持体、
を含んで成る、DNAを単離するためのキット。
(b)溶解酵素、グリセロール、トリスおよび塩化カルシウムを含んで成る溶解酵素試薬をさらに含んで成る、態様29、31および32のキットであって、
当該細胞懸濁試薬および当該溶解酵素試薬が酵母およびグラム陽性細菌の細胞壁を消化するための組み合わせでの使用に適するキット。
(b)細胞懸濁試薬;
(c)溶解酵素試薬;
(d)タンパク質消化試薬;および
(e)等張溶液、
より成る群から選択される試薬をさらに含んで成る、態様29、31および32のキット。
Claims (1)
- (a)緩衝剤;
(b)塩基;
(c)キレート剤;および
(d)水、
を含んで成るDNA溶離試薬。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US12642998P | 1998-02-02 | 1998-02-02 | |
US12641398P | 1998-02-02 | 1998-02-02 | |
US60/126,413 | 1998-02-02 | ||
US60/126,429 | 1998-02-02 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000529467A Division JP2004500002A (ja) | 1998-02-02 | 1999-02-02 | Dnaを単離するための溶出試薬、方法およびキット |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012157366A true JP2012157366A (ja) | 2012-08-23 |
Family
ID=26824623
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000529467A Pending JP2004500002A (ja) | 1998-02-02 | 1999-02-02 | Dnaを単離するための溶出試薬、方法およびキット |
JP2012109533A Pending JP2012157366A (ja) | 1998-02-02 | 2012-05-11 | Dnaを単離するための溶出試薬、方法およびキット |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000529467A Pending JP2004500002A (ja) | 1998-02-02 | 1999-02-02 | Dnaを単離するための溶出試薬、方法およびキット |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1053353A1 (ja) |
JP (2) | JP2004500002A (ja) |
AU (1) | AU2574299A (ja) |
CA (1) | CA2319691C (ja) |
WO (1) | WO1999039010A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018518162A (ja) * | 2015-05-12 | 2018-07-12 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | 血液サンプルをプールする方法 |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU9317198A (en) | 1997-09-17 | 1999-04-05 | Gentra Systems, Inc. | Apparatuses and methods for isolating nucleic acid |
US6750059B1 (en) | 1998-07-16 | 2004-06-15 | Whatman, Inc. | Archiving of vectors |
EP1141234A4 (en) * | 1999-01-06 | 2004-05-19 | Invitrogen Corp | METHOD AND COMPOSITIONS FOR INSULATING NUCLEIC ACID MOLECULES |
EP1313543A4 (en) | 2000-07-18 | 2004-06-30 | Invitrogen Corp | DEVICE AND METHODS FOR SUBDIVISION AND FILTRATION OF GEL MATERIAL AND FOR EXTRACTION OF MOLECULES THEREOF |
WO2002048385A2 (en) | 2000-12-12 | 2002-06-20 | Invitrogen Corporation | Compositions and methods for the release of nucleic acid molecules from solid matrices |
US20050032105A1 (en) * | 2001-10-12 | 2005-02-10 | Bair Robert Jackson | Compositions and methods for using a solid support to purify DNA |
EP1466018B2 (en) | 2002-01-08 | 2015-08-12 | Roche Diagnostics GmbH | Use of silica material in an amplification reaction |
JP5441290B2 (ja) * | 2002-10-04 | 2014-03-12 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション | 核酸精製システムの媒体上に核酸を保存するツールとして、化学物質を用いる方法および材料 |
JP2008220380A (ja) * | 2003-10-31 | 2008-09-25 | Fujifilm Corp | 核酸の分離精製方法 |
CN101124321B (zh) * | 2004-11-05 | 2012-02-29 | 恰根北美控股有限公司 | 用于从稳定剂中纯化核酸的组合物和方法 |
US9243289B2 (en) * | 2013-12-23 | 2016-01-26 | Roche Molecular Systems, Inc. | Method for screening reagents used in PCR assays |
AU2015342907A1 (en) * | 2014-11-07 | 2017-05-25 | The Johns Hopkins University | Chaotrope- and volatile-free method for purifying nucleic acids from plasma |
MX2019010800A (es) | 2017-03-15 | 2020-07-28 | Ancestry Com Dna Llc | Dispositivo y metodo de recoleccion de muestras. |
Citations (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02289596A (ja) * | 1989-03-23 | 1990-11-29 | Akzo Nv | 核酸の単離方法 |
JPH04158784A (ja) * | 1990-10-24 | 1992-06-01 | Tax Adm Agency | 酵母細胞壁溶解酵素の製造法及びその利用 |
JPH05125088A (ja) * | 1991-05-03 | 1993-05-21 | Becton Dickinson & Co | Dnaの固相抽出精製 |
JPH06277040A (ja) * | 1991-02-13 | 1994-10-04 | Tax Adm Agency | 酵母細胞壁溶解酵素の製造法及び溶解法 |
JPH07501222A (ja) * | 1991-12-02 | 1995-02-09 | クイアジェン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 天然原料から核酸のような細胞成分を単離する方法及び装置 |
JPH07177887A (ja) * | 1993-09-27 | 1995-07-18 | Becton Dickinson & Co | 固相抽出によるdna精製に有用な修飾グラスファイバー膜 |
JPH08501321A (ja) * | 1993-07-01 | 1996-02-13 | キアゲン・ゲーエムベーハー | クロマトグラフィーによる核酸混合物の精製分離法 |
JPH08103275A (ja) * | 1991-02-22 | 1996-04-23 | Meiji Milk Prod Co Ltd | 乳酸桿菌由来の新規なプラスミドpBUL1 及びその誘導体 |
WO1996039813A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Flinders Technologies Pty. Ltd. | Dry solid medium for storage and analysis of genetic material |
JPH09507382A (ja) * | 1993-07-09 | 1997-07-29 | ケンブリッジ モレキュラー テクノロジーズ リミテッド | 浄化方法及び装置 |
US5654179A (en) * | 1990-11-14 | 1997-08-05 | Hri Research, Inc. | Nucleic acid preparation methods |
JPH09508638A (ja) * | 1994-02-11 | 1997-09-02 | クイアジェン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 二本鎖/単鎖核酸構造物の分離方法 |
JPH11127854A (ja) * | 1997-10-28 | 1999-05-18 | Hitachi Ltd | 核酸の回収方法及び装置 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4034036C2 (de) * | 1990-10-26 | 1994-03-03 | Diagen Inst Molekularbio | Vorrichtung und Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellsuspensionen |
EP0580305B1 (en) * | 1992-07-02 | 1999-09-22 | Edge Biosystems, Inc. | Method and material for purification of nucleic acids |
WO1995034569A1 (de) * | 1994-06-14 | 1995-12-21 | Invitek Gmbh | Universelles verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren aus extrem geringen mengen sowie sehr stark verunreinigten unterschiedlichsten ausgangsmaterialien |
US5702884A (en) * | 1996-03-12 | 1997-12-30 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Whole blood sample preparation for polymerase chain reaction using ammonium chloride and a carboxylic acid or metal carboxylate for selective red blood cell lysis |
US5777098A (en) * | 1996-07-23 | 1998-07-07 | University Of North Dakota Medical Education Research Foundation | DNA purification procedure |
WO1999039009A1 (en) * | 1998-02-02 | 1999-08-05 | Gentra Systems, Inc. | Processes for isolating, amplifying and characterizing dna |
-
1999
- 1999-02-02 EP EP99905618A patent/EP1053353A1/en not_active Withdrawn
- 1999-02-02 CA CA2319691A patent/CA2319691C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-02 WO PCT/US1999/002190 patent/WO1999039010A1/en active Application Filing
- 1999-02-02 AU AU25742/99A patent/AU2574299A/en not_active Abandoned
- 1999-02-02 JP JP2000529467A patent/JP2004500002A/ja active Pending
-
2012
- 2012-05-11 JP JP2012109533A patent/JP2012157366A/ja active Pending
Patent Citations (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02289596A (ja) * | 1989-03-23 | 1990-11-29 | Akzo Nv | 核酸の単離方法 |
JPH04158784A (ja) * | 1990-10-24 | 1992-06-01 | Tax Adm Agency | 酵母細胞壁溶解酵素の製造法及びその利用 |
US5654179A (en) * | 1990-11-14 | 1997-08-05 | Hri Research, Inc. | Nucleic acid preparation methods |
JPH06277040A (ja) * | 1991-02-13 | 1994-10-04 | Tax Adm Agency | 酵母細胞壁溶解酵素の製造法及び溶解法 |
JPH08103275A (ja) * | 1991-02-22 | 1996-04-23 | Meiji Milk Prod Co Ltd | 乳酸桿菌由来の新規なプラスミドpBUL1 及びその誘導体 |
JPH05125088A (ja) * | 1991-05-03 | 1993-05-21 | Becton Dickinson & Co | Dnaの固相抽出精製 |
JPH07501222A (ja) * | 1991-12-02 | 1995-02-09 | クイアジェン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 天然原料から核酸のような細胞成分を単離する方法及び装置 |
JPH07501223A (ja) * | 1991-12-02 | 1995-02-09 | クイアジェン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 核酸を単離する装置及び方法 |
JPH08501321A (ja) * | 1993-07-01 | 1996-02-13 | キアゲン・ゲーエムベーハー | クロマトグラフィーによる核酸混合物の精製分離法 |
JPH09507382A (ja) * | 1993-07-09 | 1997-07-29 | ケンブリッジ モレキュラー テクノロジーズ リミテッド | 浄化方法及び装置 |
JPH07177887A (ja) * | 1993-09-27 | 1995-07-18 | Becton Dickinson & Co | 固相抽出によるdna精製に有用な修飾グラスファイバー膜 |
JPH09508638A (ja) * | 1994-02-11 | 1997-09-02 | クイアジェン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 二本鎖/単鎖核酸構造物の分離方法 |
WO1996039813A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Flinders Technologies Pty. Ltd. | Dry solid medium for storage and analysis of genetic material |
JPH11127854A (ja) * | 1997-10-28 | 1999-05-18 | Hitachi Ltd | 核酸の回収方法及び装置 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
JPN6009020542; SAMBROOK, J. et al.: Molecular Cloning 2nd edition 3 , 1989, B.11 * |
JPN6009020544; JOHNS, M.B. et al.: '"Purification of human genomic DNA from whole blood using sodium perchlorate in place of phenol"' Anal. Biochem. Vol.180, 1989, pp.276-278 * |
JPN6015000201; TOPIC, E. and GLUHAK, J.: Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Vol.29, 1991, pp.327-330 * |
JPN6015000203; WERFEL, U. et al.: Carcinogenesis Vol.19, No.3, 1998, pp.413-418 * |
JPN6015000205; KOHN, K.W.: Pharmac. Ther. Vol.49, 1991, pp.55-77 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018518162A (ja) * | 2015-05-12 | 2018-07-12 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | 血液サンプルをプールする方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2319691C (en) | 2012-12-18 |
AU2574299A (en) | 1999-08-16 |
WO1999039010A1 (en) | 1999-08-05 |
JP2004500002A (ja) | 2004-01-08 |
CA2319691A1 (en) | 1999-08-05 |
EP1053353A1 (en) | 2000-11-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5300112B2 (ja) | Dnaを単離するための溶解マトリックスを使用するための組成物および方法 | |
JP2012157366A (ja) | Dnaを単離するための溶出試薬、方法およびキット | |
US11060082B2 (en) | Polynucleotide capture materials, and systems using same | |
US7893228B2 (en) | Compositions and methods for using a solid support to purify RNA | |
US7790865B1 (en) | Eluting reagents, methods and kits for isolating DNA | |
JP2006517298A (ja) | 生物学的試料からの核酸の抽出のための前処理方法、およびそのためのキット | |
JP3979996B2 (ja) | 固体支持体を使用してrnaを精製するための組成物および方法 | |
AU2002211719A1 (en) | Compositions and methods for using a solid support to purify RNA | |
JP4616990B2 (ja) | Dnaを単離し、増幅し、そして特性化するための方法 | |
US7670768B1 (en) | Processes for isolating, amplifying and characterizing DNA | |
AU2007200429B2 (en) | Compositions and methods for using a lysing matrix for isolating DNA | |
AU2017268667A1 (en) | Processes for isolating, amplifying and characterizing DNA | |
AU2013219151A1 (en) | Processes for isolating, amplifying and chacterizing DNA | |
AU2011201979A1 (en) | Processes for isolating, amplifying and characterizing DNA | |
AU2018202375B2 (en) | Polynucleotide capture materials, and methods of using same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120511 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20131210 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20140121 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20140124 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20140121 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20140307 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20140312 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20140409 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20140411 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20140414 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20140417 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140609 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140609 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150107 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150406 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150501 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150605 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20151014 |