JPH09507382A - 浄化方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 核酸のような目的化合物を細胞から精製するために提供された方法。この方法は、次の工程からなる。１）目的化合物を含む細胞溶解物を形成する細胞の懸濁液を形成する、２）望まない細胞及び細胞破片を除くために、細胞溶解物をフィルターに適用する、３）マトリックスに核酸を結合する状態の下で、個相マトリックスと濾過された溶解物を接触させる、４）マトリックスから濾過された溶解物を分離する、５）マトリックスから目的物を溶出する。装置もまた提供される。遠心分離のような複雑な精製操作が避けられる。

Description

【発明の詳細な説明】 浄化方法及び装置 本発明は、細胞から核酸のような目標化合物を精製するための方法及び装置に 関する。 ＤＮＡのようなタンパク質または核酸の精製のための従来の方法は、原細胞の 溶解およびこれに続く遠心分離に関わる種々の分別ステップを必要とする。ＤＮ Ａの操作が実施されるべき場合、原細胞からこのＤＮＡをスクリーニングするた めに、小規模のＤＮＡのプリパレーション(preparations)が、大量にしばしば型 にはまって必要とされる。これらの方法では、時間及び手間がかかる。 比較的複雑な一連のステップによりＤＮＡを抽出及び精製する場合、遠心分離 を回避することが提案されている。ＥＰ ０３７６０８０は、一般的な用語で、 ＤＮＡを、これに随伴する不純物から沈澱させるための沈澱剤の使用を開示して いる。次に限外濾過が、このＤＮＡを離隔する手段として使用される。しかし、 この提案された方法のいかなる処理の例も記載されていず、また、その実現性の 表示もない。限外濾過は、ＷＯ ８７／０７６４５およびＥＰ ０５１７５１５ に記載された他のＤＮＡ精製方法の基礎を形成する。 比較的汚染されない核酸を不純物から分離するための手段として陽イオン交換 樹脂も提案されている。ＥＰ ０２８１３９０は、交雑物を非交雑核酸から特に 分離するための多陽イオン固体支持部の使用を開示している。ＥＰ ０３６６４ ３８は、タンパク質を陽イオン交換樹脂に結合させることによってタンパク質か ら核酸を分離することを開示している。 生化学反応を実施するための一部自動化になる装置は、ＷＯ ９２／０２３０ ３に開示されている。この装置では、微滴定量板を操作するための台が提案され ている。 本発明は、核酸のような目標化合物の細胞からの精製のための改良になる方法 であって、遠心分離、限外濾過または他の複合処理の使用を回避する方法を提供 しようとするものである。 目標化合物は、核酸、タンパク質または他の所望の化合物を包含してもよく、 そして、細胞によって生成され、内部または外部に表現される。核酸とは別に、 本方法は、組み替えタンパク質及び抗体を精製するために特におもしろい。 一つの態様においては、本発明は、核酸を細胞から精製する方法を提供する。 この方法は、 （１） 核酸を含む細胞溶解物を形成するために細胞懸濁物を溶解し、 （２） 不所望の細胞および細胞の屑を除去するためにフィルタにこの細胞溶解 物を送り、 （３） 核酸を固相基質(solid phase matrix)に結合するための条件下でこの基 質に対し濾過した溶解物を接触させ、 （４） 結果として生じる濾過した溶解物を前記基質から分離し、および、 （５） 前記基質から核酸を抽出することを特徴とする。 本発明の方法は、比較的簡単であるために、細胞溶解物から始めて、例えば、 自動化された装置では、連続方法として（すなわち、−バッチの細胞の溶解物か ら所望の製品まで途切れずに）適用することができる。 他の態様においては、本発明は、細胞から目標の化合物を浄化する連続方法を 提供する。 この連続方法は、 （１） 目標化合物を含む細胞溶解物を得、 （２） 望ましくない細胞および細胞の屑を除去するためにフィルタにこの細胞 溶解物を送り、 （３） 核酸を固相基質に結合するための条件下でこの固相基質に対し濾過物を 接触させ、 （４） 結果として生じる濾過物を前記固相基質から分離し、および、 （５） この固相基質から核酸を抽出することを特徴とする。 なるべくなら、細胞溶解物は、目標化合物を含む細胞溶解物を形成するために ステップ（１）において溶解されることが好ましい。 なるべくなら、この方法は、さらに、目標の化合物を基質から抽出する前に汚 染物を除去するように目標化合物を連結する基質を洗浄するステップを有するこ とが好ましい。 目標化合物を生成するどの細胞もこの方法において使用してよい。これを明確 にするために、「細胞」なる用語は、細菌の細胞、高級微生物から得た細胞、フ ァージ粒子および他の細胞種、または、目標化合物を含み、そして、それを解除 するためになんらかの形の溶解ステップを必要とする可能性のある細胞小器官を 包含しようとするものである。細菌の場合、核酸は、この細菌の細胞核からまた は、プラスミドのような細胞含有物から生じることがある。実際、この方法は、 プラスミドＰＮＡの調製に特に有用である。ファージ感染細菌は、また、Ｍ１３ ＤＮＡのようなファージＤＮＡの調製に使用することもできる。高等有機物から 得た細胞には、血液の細胞を含む。ゲノム核酸が調製されるべき場合、凝集した 血液の細胞は、溶解のための細胞懸濁物を形成する。 この方法における代表的な第１のステップでは、細胞懸濁物が、培養媒体から 細胞を分離するようにフィルタに細胞の培養菌を与えることによって形成される 。その液体の培養媒体は、このフィルタを通って、廃棄される。このフィルタ上 の細胞は、溶解の用意ができた適当な再懸濁緩衝剤内で再び懸濁される。しかし 、ファージの場合は、このファージの種類に依存して、細胞の屑からファージの 細胞（粒子）を除去するように余分の濾過ステップを導入することが必要となろ う。例えば、ラムダファージが細菌に感染する場合、ある感染細菌は、溶解する が、またある細菌は、溶解されない。この場合、前処理として余分の濾過ステッ プを使用することが必要である。この前処理においては、溶解した細菌の細胞、 未溶解の細菌の細胞および未溶解のファージ細胞（粒子）の初期の混合物は、一 般的に前処理フィルタで濾過されて未溶解の細菌の細胞及び細胞の屑を除去する 。結果として生じるファージ細胞は、つぎに、以下に記載するラインに沿って、 溶解の用意のできた懸濁物内に保持される。なるべくなら、ファージの細胞の懸 濁物は、溶解の前に濃縮されることが好ましい。濃縮は、塩とポリエチレングリ コール（ＰＥＧ）のような疎水性剤で処理することによって行うことができる。 これと対照的に、ファージＭ１３が細菌に感染する場合、細菌の細胞の溶解は、 起こらず、従って、いかなる余分の濾過ステップも必要とはされない。 細胞懸濁物を溶解するステップは、一般的には、さらに溶解緩衝剤のアリカン トの追加が必要となる。溶解の後では、この溶解した細胞懸濁物に対して中和溶 液を加えることが好ましいことがある。一般的には、再度の懸濁及び溶解用の緩 衝剤及び中和溶液は、この分野ですべて公知であり、そして、細胞の種類および 精製されるべき目標化合物に従って変化することがある。例えば、核酸が精製さ れるべき場合、再懸濁緩衝剤は、一般的には、媒体から金属イオンを除去するた めのキレート試薬を含んでおり、そして、７ないし８．５のｐＨ値の範囲、とく に好都合な範囲として、７ないし８のｐＨ値を持つことができる。プラスミド精 製については、溶解緩衝剤は、一般的には、アルカリ性であり、そして、硫酸ド デシルナトリウム（ＳＤＳ）のような界面（表面）活性剤を有する。中和溶液は 、このｐＨ値を有用な範囲に戻すためのものであり、そして、不所望のタンパク 質を凝集することができ、一般的には、約２．５Ｍでのカリウムアセテートのよ うな高度に濃縮した塩溶液である。血液の細胞から核酸を精製するために、溶解 緩衝剤は、一般的な表面活性剤としてＮｏｎＩｄｅｔ Ｐ−４０を有し、このｐ Ｈは、約ｐＨ８．３に上げることが好ましい。 核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。ＤＮＡが精製されるべき場合、 再懸濁緩衝剤は、不所望のＲＮＡを切断するためのＲＮａｓｅを含んでもよい。 ＲＮＡが精製されるべき場合、再懸濁緩衝剤は、不所望のＤＮＡを切断するため のＤＮａｓｅを含んでもよい。随意事項であるが、核酸精製については、再懸濁 緩衝剤は、また、プロテアーゼ、例えば、プロテイナーゼＫを含んでもよい。 再懸濁緩衝剤、溶解緩衝剤、および中和溶液を加える各段階においては、これ らの溶液を充分に一緒に混合することが好ましい。 溶解の後、細胞溶解物は、フィルタに送られて不所望の細胞及び細胞の屑を除 去し、それによって、目標化合物及び他の溶解可能な汚染物の生の調製を行う。 普通に人手可能などのようなフィルタも、このフィルタが、使用される試薬に耐 えることができ、そして、不所望の細胞及び細胞の屑がこのフィルタによって保 持されるならば、このステップで使用してもよい。例えば、フィルタは、セルロ ースアセテートＰＴＦＥあるいは任意の他の同様な材料から作ることができる。 なるべくなら、フィルタの穴のサイズは、５０ミクロンを越えないことが望まし い。穴サイズが大きすぎると、不所望の物質が通り抜けてしまう。この穴のサイ ズが、０．２ミクロンより小さく減少されると、このフィルタを通る流量は不都 合に低くなる。実際、この穴のサイズは、細胞の濃度及び公称の細胞サイズに従 って選ばれる。 本方法で使用される固相基質は、使用される動作条件のもとで目標化合物を結 合しなければならない。この動作条件は、従って、基質の種類および目標化合物 に従って調整されなければならない。核酸については、基質は、一般的には、ガ ラスまたは樹脂を基材としており、そして、イオン反応、親和力作用または疎水 作用によって核酸を結合することができる。イオン交換材料の使用は、有利であ る。なるべくなら、この目的のために市販されているイオン交換樹脂が好ましい 。陽イオン交換基は、一般的な動作ｐＨで、目標の核酸が負に帯電されるという 点に基づく好適なイオン交換基である。考えられる陽イオン交換基は、（Ｐｒｏ ｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から発売の「Ｍａｇｉｃ」または「Ｗｉｚａｒｄ」の範囲 、または、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢからのＳｅｐｈａｃｒｙｌのような任意適 当な登録商標の樹脂またはホウ珪酸塩のガラス交換基または珪藻土を含む。さら なる選択事項として、ポリマデリネン柱を使用してもよい。 各々の場合、ｐＨおよび塩濃度の条件は、目標化合物の能力及び基質に対して 結合すべき不所望の汚染物の両方に影響を与える。従って、目標化合物よりも基 質に対して弱く結合する不所望の汚染物を除去するように、分離の前に基質を洗 浄するステップを有すると、有利である。核酸のための一般的な洗浄緩衝剤は、 ２００ｍＭの塩化ナトリウムと５ｍＭのＥＤＴＡを有する、約ｐＨ７．５のアル コールＴｒｉｓ−ＨＣｌである。 固相基質と濾過物との接触は、濾過物をある体積の基質、おそらく、例えば、 円柱の形をしたある体積の基質を通して単に送ることによって起こすことができ る。あるいはまた、この基質の懸濁物は、濾過物に加えてもよい。各処理されて 生じた濾過物の基質からの分離は、単に、基質を保持し、不所望の液相を廃棄す ることによって行ってもよい。 基質から目標化合物を分離することは、この化合物と基質との間の相互作用の 性質に依存する。イオン相互作用が支配する場合には、より低い塩濃度を有する 分離緩衝剤中で核酸を分離することが普通行われる。タンパク質には、より大き なｐＨ、または、より高級な塩が一般的に要求される。あるいはまた、分離緩衝 剤は、目標の核酸またはタンパク質を分離するために特に工夫されたアフィナン トを含んでもよい。 目標化合物が固相基質に結合されない場合、溶液内にこの目標化合物を保持す ると、一般的に好都合である。この方法は、従って、好ましくは、目標化合物の どのような沈澱も実質的に存在しない場合に行うことが好ましい。 上記の一般的な系統的分類法とは対照的に、精製すべき目標化合物がＭ１３Ｄ ＮＡである場合、変形した方法を使用することが好適である。この場合、原”細 胞”は、Ｍ１３ファージ粒子を含んでいる。Ｍ１３ファージで感染された細菌細 胞は、濾過物がＭ１３ファージ粒子を含むように、濾過されて不所望の細菌細胞 及び細菌細胞の屑を除去する。このファージ粒子は、氷酢酸のような任意適当な 沈澱剤で沈澱させられ、引き続いて、濃縮のＮａＣ１０₄のような適当なカウト ロピズムの溶解溶液との接触により溶解される。いまや濾過物に存在する溶解さ れたＭ１３ファージ粒子は、ファージＤＮＡを結合するに適当な固相基質と接触 している。この基質は、上記のように接触されてもよいし、あるいは、この便利 な実施例では、ホウ珪酸塩ガラスフィルタのような溶解したファージ粒子が結合 するフィルタの形で存在してもよい。この基質は、エタノール溶液のような適当 な洗浄溶液及び上記のような分離したＤＮＡで洗浄されると好都合である。 本 発明の他の態様においては、細胞懸濁物から目標化合物を精製するための装置が 提供される。この目標化合物は、タンパク質または核酸、好ましくは、核酸のよ うな目標高分子であってもよい。この装置は、 細胞懸濁物を受けるための第１の室、 未溶解細胞および細胞の屑を保持するための前記第１の室の下流のフィルタ、 および 前記フィルタの下流で濾過物を受け取る第２の室であって、この室に対して溶 液を供給する手段と連通している第２の室を有し、 前記第２の室内またはこの第２の室の下流には、目標化合物を結合するために 固相基質を保持するための手段が設けられているとともに、浄化された目標化合 物を供給する出口が固相基質を保持する前記手段の下流に設けられている。 前記第１の室は、この第１の室に溶液を供給する別の手段と連通することが望 ましい。 本装置は、本装置を制御するための中心制御手段とともに、上記の一個以上の 本装置を有する自動化システムに組み込むことができる。本装置は、上記の方法 を実施するに特に適しており、そして、自動化の形態では、ありふれた仕方で、 複数の別々の浄化を同時に行うことが可能である。 それぞれの室に対し溶液を供給する各手段は、液体供給用の適当な装置を有し ていてもよい。例えば、各緩衝溶液の供給には注射器を設けてもよい。あるいは また、適当な試薬を含む複数の容器を、例えば、共通の開口を通して各室に弁で 結合しても良い。この装置の自動化形態では、制御手段は、溶液の正しいシーケ ンスの供給を保証するために弁にリンクされよう。 好適な実施例では、本装置は、さらに、フィルタの下流端を基準にしてこのフ ィルタの土流端に正の圧力を供給する第１の加圧手段を有する。この加圧手段の 目的は、細胞または、このフィルタに保持された細胞または細胞の屑から液体を 分離するように、このフィルタを通して前記第１の室内へ、液体を押し込み、ま たは、そこから液体を吸引することである。これは、例えば、第１の室に正の圧 力を作るために第１の室へ溶液を供給する手段を利用してフィルタの上流に正の 圧力を加えることによって行ってもよい。また別の構成では、例えば、真空ライ ンを使用することによって、圧力がフィルタの下流端で低下される。また別の構 成では、注射器、または、これに似た手段が、このフィルタの下流端における圧 力を減少し、同時に、不要の洗浄緩衝剤を集めることもできる。 なるべくなら、この固相基質を保持する手段は、少なくとも第２の室の一部と 前記出口との間に好都合に位置づけた固相基質に対する障壁を有することが好ま しい。この構成では、濾過物から下流の前記第２の室の端に固相基質が保持され て、廃棄した溶液が基質及び障壁を通過してこの装置の出口から放出することが できるようにすると、便利である。また別の構成では、出口は、この障壁のレベ ルより上に設けてもよい。この装置のまた別の実施例では、装置には、すでに適 所にある丙相基質を供給することができる。この障壁は、なるべくなら、上記の 種類のフィルタであることが好ましい。ＰＴＦＥは、このフィルタに特に有用な 材料である。 また別の実施例として、障壁は、別個の要素である必要はなく、例えば、壁ま たはその仕切室のような第２の室の幾何学的構成から単に生じるものであっても よい。 前記第１の加圧手段に類似の仕方で、本装置は、さらに、その下流端を基準に して前記障壁の上流端に正の圧力を供給する第２の加圧手段を有していてもよい 。第１の加圧手段に関して記載したように、障壁の上流端に正の圧力を、または 、この障壁の下流端に負の圧力を加えてもよい。一つの実施例では、別個の廃棄 物 の出口が、浄化した目標化合物用の出口の他に設けてある。例えば、固相基質か ら不所望の液体を除去するために、負の圧力を、真空ラインを用いて、屑の出口 に加えてもよい。 これらの出口の各々は、弁により制御してもよく、本装置の自動化形態では、 これらの弁は、この制御手段とリンクされる。 溶液を供給する手段、そして、これが存在するときに、懸濁物を供給する手段 、および、加圧手段は、連続圧力、好ましくは、連続的な正圧力を用いて圧搾空 気供給システムにより駆動されると、好都合である。 ファージ感染の細菌が、原材料として使用され、そして、溶解及び未溶解の細 菌細胞が形成される場合、本装置のさらなる実施例が必要となるかもしれない。 この実施例では、装置は、ファージで感染された溶解および未溶解の細菌細胞を 受け取るために第１室の上流の前処理室と、未溶解の細菌細胞および細菌細胞の 屑を保持するための、前記前処理室の下流および前記第１の室の上流の前処理フ ィルタとをさらに有する。 また、好適な実施例では、単一のコラム構成が使用される。この場合、フィル タは、前記第１の室を前記第２の室から仕切るように作用する。この種の構成で は、前記第１の室を確定する壁は、前記第２の室を確定する壁と連続している。 このために、この構成では、本明細書に記載した種類の圧搾空気供給システムで 使用されるような比較的高作動圧力に耐えることができる利点がある。また別の 実施例では、前記第１と第２の室は、互いに並べて位置決めされ、そして、（垂 直）フィルタは、再び、これらの室の間の仕切りとして作用する。また、これら の室から分離した直列フィルタを有する管類によってこれら二つの室を相互連通 させることもできる。 特に好適な実施例では、本装置は、前記第２の室に液体が存在するときに、こ の液体と連通するように位置決めされた出口を有する流体供給手段を備えている 。一般的には、この液体は、第２の室の底に集まり、そして、出口は、この液体 の表面の下に位置決めされている。流体供給手段は、第２の加圧手段として動作 することができるけれども、第２の加圧手段から分離され、そして、前記第２の 室に対して液体及び気体の両方を供給することができることが好ましい。この出 口の位置決めにより、液体の成分の混合を容易にするように、前記第２の室にあ る 液体に直接気体を通じさせることができる。これは、固相基質の懸濁物またはス ラリが、前記第２の室の濾過した溶解物に供給される場合に、特に有用である。 この出口から放出された気体により、固相基質と濾過した溶解物との混合が容易 になり、それにより、目標化合物と基質との接触が最大となる。 次に、本発明を実施例のみを目的に添付の図面によりさらに説明する。 第１図は、プラスミドＤＮＡに関する本発明に基づく、簡易手動式−駆動装置 を示す： 第２図は、当該装置のカラム説明を示す： 第４図は、常法によって製造されたＤＮＡサンプルと本発明に従って得られた サンプルを比較するアガロースゲル電気泳動の結果を示し： 第３図は、自動化された本装置の説明を示し： 第５図は、本装置の第二カラム説明を示し、そして 第６図は、本装置の操作のための回路線図を示す。 第１図に示した発明の単純な具体例では、細胞貯留器１は、フィルター２と三 方−バルブ３を通して濾液貯留器７と連絡(communicates)している。同様に、濾 液貯留器７は、フィルター８と３方バルブ９を経由して出口１１とつながってい る。注入器４と１０も、また、三方−バルブ３と９とそれぞれ結合している。回 収チューブ１２は、精製したサンプルを収集するため出口１１に連絡されている 。 第２図に示した発明のカラム本体(column embodyment)では、２つのチェンバ ー２１と２７はフィルター２２によって仕切られている。さらにフィルター２８ は、チャンバー２７における固形相マトリックスが第２チャンバー３０の余剰部 分(remainder)を経てと出口３１へ通過することを防止する障壁(barrire)として 作動する。 チャンバー２１と２７へ溶液を送出するため貯留容器（図示せず）から試薬は 注入口３３と３８に入る。それらの注入口は、すべてバルブ２３で制御される。 共通ポート（common ports）２４と２９は、チャンバー２１と２７をそれぞれ試 薬用品に結合させる。真空系統（vacum lines）は、導管２５と２６とに利用す ることができる。その導管２５と２６は、さらに廃液用出口としても働く。回収 チューブ３２は、精製したサンプルを回収するため出口３１と連通(communicate s)させる。 複数のカラムは、第３図における配列の仕方で組み立てることができる。カラ ム４１と回収チューブ４２は、図に示したとおりである。試薬と液体送出と制御 方式４３は、各々のカラムの工程を制御するために存在する。 第５図に示した発明の第２カラム本体は、第６図で示した回路に従って使用す ることができる。 第５図に関しては、２つのチャンバー４１と４８とが、フィルター４９によっ て仕切られている。さらにフィルター４６は、カラムの外側へチャンバーの中の 固形相マトリックスへの流れを防止する障壁の働きをする。注入口４２は、圧縮 された空気の通路のためにカラムの第１チャンバーに、そして、そのカラムから 空気が逃げられるように設けられている。注入口４３は、カラムへ追加的な液体 を添加するために設けられている。導管４７は、管状部に係合された円錐部から なっている。導管４７は、フィルター４６から液体を回収し、典型的には、その 液体を第２チャンバー４８の基部ある回収部に移動させる。その第２チャンバー の基部はその装置で基本的に使用した低量液体何収(low volumes liquid collec tion)を最大にするよう円錐凹部(conical recess)を含んでいる。系統４４は、 圧縮した空気のそのカラムへの通路のための第２チャンバーの上部に設けられ、 カラムから空気が排出されるのを許容する。さらに注入口４５は、液体あるいは ガスのカラムへの追加のために存在し、そしてカラムの低部の近くに設けられた 出口と一緒のチューブを構成している。ピンチバルブ５０は、第２チャンバーか らの流れを抑制するためにフィルター４９の下流に設置され、流体センサー５１ の手段によってモニタされる。指示機構５４(Indexing mechaniss)は、廃液チュ ーブ(waste tube)５３又は回収チューブ５２の相対位置(relative position)を 、カラムから流れる液体がサンプリングに適しているか、あるいは廃棄されるべ きものかどうかにしたがって制御する。 第６図に示した液体配送システムは、典型的には0.5bar fine pressureで調節 加圧された空気で加圧された貯留容器（Ｒ1からＲ8）に在る多量の試薬を備える 。使用すべき正確な数の試薬は適用される正確なプロトコル(protocol)に依存す る。試薬は、２つのブロックに区分される：貯留容器Ｒ1からＲ4は、カラムの注 入口４３に送出される試薬を含み、対応するバルブ６１から６４によって制御さ れる：そしてＲ5、Ｒ6およびＲ8の貯留容器は、バルブ６５と６６の制御の下に 注入口 ４５を経由してカラムの第２チャンバーへ送り出される試薬を含む。貯留容器Ｒ 7は、対応する７４と７６の制御の下に注入口５５を通してチャンバー４８の上 部へ独立系統によって配分・送り出される粒子マトリックス材を包含する。 一つの例として貯留容器Ｒ4から送り出される試薬を取り出すとき、この試薬 は選んだ時間（例えば２５０ｍｓ）の間、バルブ６４を開放することによって送 り出される。貯留容器は圧力下に置かれているため、バルブ６４の開放側では圧 力下の液滴(a drop in pressure)があるため、試薬は、バルブが閉じるまで系内 に入る。バルブ６４からバルブ６８への系統内に、ある量の液体が存在する。こ の系統の長さと径は、最大となりそうな量(maximum likely volume)に調和する ように選択される。ある量の試薬は、チャンバーの頂部に達するのを許容するの に充分な時間の間バルブ６８とバルブ６７をオンするように切り換える(switchi ng)することによって第１チャンバーの頂部へ移動させる。系統の下へ液体を付 勢(forcing)している空気圧は０．５バールか、あるいは、もしバルブ７７がオ ンにスイッチされている場合、１．７バールのいずれかである。移動させられる 液体の前の空気は、バルブ６９と７０を経由して大気（外気）の方へ排出される 。全バルブのタイミングは、マイクロプロセッサー（図示せず）によって制御さ れる。 カラムへの液体の流れは、Ｃ1からＣ3の流れ絞り管(flow constrictor)か、若 しくは小さい直径の系統(０．５あるいはそれ以下−逆流防止バルブＮＲＶ2へバ ルブ８０を接続(say))によって制御される。逆流防止(non-return)バルブＮＲＶ １乃至４は、また、逆方向への流れを防止するため回路のいろいろなパーツに組 み込まれている。 貯留容器Ｒ4からの試薬の送出に類似するように、バルブコントロールの類似 の配列が貯留容器Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5とＲ6からの試薬の送出に使用される。貯留容器 Ｒ2、Ｒ3及びＲ4からの試薬の添加後の系統を洗浄するために、大量の水が試薬 の送出と同様な方法で貯留容器Ｒ1から系統を通して一気に流し出されるが、水 はバルブ６８で廃棄する方へその流出方向が変えられる。同様な機能はバルブ８ ０を経由して廃棄するために流れの方向を変えた貯留容器Ｒ8の水を使用し貯留 容器Ｒ5とＲ6からの系統を洗浄するために行われる。 貯留容器Ｒ7における固形相マトリックス試薬は、微粒子の性質のため、分離 送出方式が装備される。この試薬は、密閉した貯留容器内に収められていて、２ つ のラインが試薬に至り、その他のものが貯留容器の頂部に配置されている。送出 より先にマトリックスを混合するためと、それが懸濁液になっていることを確認 するため、バルブ７６が開口されて空気が廃棄口を経由して出ていくことを許容 する。その貯留容器は、閉ざされた方式を形成するため密封されるので、空気は 逆流防止バルブＮＲＶ4を経由して下降し、試薬の中でマトリックス粒子を懸濁 させるのに十分な起泡動作をもたらす。バルブ７６はそして閉じられ、貯留容器 ７からの適当な量の試薬がピンチバルブ７４を開くことによって取り出される。 その試薬は、バルブ７３を解放しバルブ７１を経由して吐き出すことによってカ ラムの第２チャンバーの頂部へ送り出される。 第１チャンバー４１から第２チャンバー４８へのカラムにおける液体の移動が 必要なときは、これはバルブ６８、７３と７２とを閉じることによって、また、 バルブ７０を経て第１チャンバーの頂部に空気を供給することを許容するとによ って達成される。第１チャンバー内の幾らかの液体は、バルブ７１を経て吐き出 されている空気と一緒に第２チャンバーに移される。カラム出口に取り付けたセ ンサー５１は、バルブ７２を経由してカラムの外へ液体が通過しているかどうか を点検する。指示機構５４は、回収チューブ５２を精製システムによる生成物を 受け入れる部所に移動させるように設けられている。 実施例Ｉ この実施例では次の材料を使用した。 衝緩液 成分 再懸濁液 衝緩液（３００ｕｌ） ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５ １０ｍＭエチンジアミン四酢酸 （ＥＤＴＡ） １００ｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ 溶解緩衝液（３００ｕｌ） ０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ ドデシル硫酸ナトリウム 中和溶液（３００ｕｌ） ２．５５Ｍ 酢酸カリウム マトリックス（５００ｕｌ） ウイザード（正式にはマジック）ミニプ レプス ＤＮＡ ７Ｍにおける精製樹脂 グアニジンハイドロクロライド Wizard and Magic Miniprepsはプロメガ コーポの登録商標である 溶離緩衝液（５０ｕｌ） １０ｍＭ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５ １ｍＭ ＥＤＴＡ 第１図について述べればプラスミドＤＮＡを含有する細菌細胞カルチャーは２ ｍｌの容積の細胞貯留容器１に加えられた。その培養物は注入器４のバレルを引 き込んで発生した真空によって、注入器４に濾液を回収し、フィルターで２（８ ミクロンセルロースアセテート）を通して瀘過された。その細胞をそのフィルタ ー２の表面に放置した。注入器４は接続を絶たれ、処分した濾液と注入器４は、 三方−バルブ３の上に位置を変えられた。開口部５を通して細胞再懸濁緩衝液の 次の連続添加、細胞溶解緩衝液及び細胞中和溶液が調製された。各々の連続添加 の間にその細胞は多量の流体の乱れが生じるように注入器４をその中に押し込ん で混合された。最後の添加の後、全部の液体層は、フィルター２を通して濾過さ れ注入器４に集められた。粗製ＤＮＡの溶液はこのように作製された。 三方−バルブ３は、注入器４の全内容物が濾液貯留容器７と連通するように回 転させられた。注入器４の内容物は、マトリックス懸濁液が添加された濾過貯留 容器７に押し出された。粗製ＤＮＡとマトリックスは、マトリックスの空間体積 (the void volume)と等しい間隔で注入器１０を出したり入れたり動かして混合 された。それから濾過貯留容器７の全内容物は、真空を発生させるように注入器 １０を使用しフィルター８（焼結したＰＴＦＥ）を通して濾過された。次に三方 −バルブ９は濾液が捨てられるように切り替えられた。洗浄緩衝液が濾液貯留容 器 に添加され前述のように取り除かれた。全ての残余洗浄緩衝液はプランジャー注 入器１０によってフィルター８を通し空気を通過させ除去された。最後に溶離緩 衝液が濾過貯留容器７に添加され、当該注入器１０を使って混合されフィルター ８を通過させた。精製されたＤＮＡは溶解緩衝液中の樹脂から分離され三方−バ ルブ９を切り替えることにより回収チューブ１２に集められた。 本実施例の結果は、従来の遠心分離技術を使用して得た結果と比較すると第４ 図に示したとおりである。本実施例の方法と従来方の両方法に関し５ｍｌプラス ミド含有Ｅ． Ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＤＨ５ アルファの接種菌培養(starter cul ture)が育成され、そして２ｍｌの培養物がプラスミドＤＮＡを作製するために 使われた。２つの分離培養物はそれぞれの方法で作製された。即ち、１つは、プ ラスミドｐＢＳ ＳＫＩＩ＋を含んでいる培養物；そして他の１つは、クローン のｐＢＳ ＳＫＩＩ＋含有の培養物＋インサートｐＦＢ４１Ｂ２を含有する培養 物。結果は次の略語一覧(Key)に従って第４図に示したとおりである。 系列 サンプル Ｍ ＮＷ ｍａｒｋｅｒ ｌａｍｂｄｅ／Ｈｉｎｄ III １ ｐＢＳ ＳＫＩＩ＋／ｐＦＢ４１Ｂ２（Ｅｘａｍｐｌｅ） ２ ｐＢＳ ＳＫＩＩ＋／ｐＦＢ４１Ｂ２（Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ） ３ ｐＢＳ ＳＫＩＩ＋（Ｅｘａｍｐｌｅ） ４ ｐＢＳ ＳＫＩＩ＋（Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ） Ｍ ＮＷ ｍａｒｋｅｒ ｌａｍｂｄｅ／Ｈｉｎｄ III 本発明の方法で得られる取量は、従来の遠心分離による収量より多くはないが 、それらと対比できる収量であることが第４図から理解できる。さらに、本発明 に基づくＤＮＡ生成物の純度は、少なくとも、従来の方法によって作製されたＤ ＮＡ生成物の純度と比較し得るものである。例えば、本発明に基づいて作製され たＤＮＡは、制限酵素分析と更なる精製工程を経る必要性のない操作に適用され る。 実施例II乃至IVから これらの実施例では表１に示したような材料が使用された。 実施例II プラスミドＤＮＡ用の精製プロトコル プラスミドＤＮＡを精製するためのカラムには、２つのフィルターがある。上 部ラムフィルター４６と下部２０ｕｍフィルター４９である。フィルターの材質 は工程の間に使用した薬品に耐えるもの、そして工程中に発生するものにできる だけ迅速に対応できることを見越し適当な流動特性を有するものを選択する。精 製されるプラスミドを含むＥ．Ｃｏｌｉの生育した新鮮な培養菌はチャンバー４ １に典型的には１−５ｍｌに添加される。添加は頂部を取り除くか、あるいはチ ューブ（図示せず）を介して直接添加することによって行われる。次に、正圧が ポート４２によってチャンバー４１に適応される。それから菌は導管４７、フィ ルター４９及びバルブ５０を経由して廃棄するために通っている過剰な液体とと もにフィルター４６を通して濾過される。液体廃液は流体センサー５１によって 監視される。一度全ての液体が流体センサーの前を通過すると、試薬２（ＴＥ／ ＲＮＡａｓｅ）の所定量が取り入れ口３を経由して、典型的には３０ｕｌチャン バー４１の頂部に添加される。混合を効果的にするため、チャンバー４８は系統 ４４を経て短い噴射で加圧され、チャンバー４１内の圧力は、ポート４２を経て 吐出される。これはフィルター上に結合した全ての細胞が再懸濁されるというこ とを確実にするために行われる。試薬３（ＮａＯＨ／ＳＤＳ）の所定量は取り入 れ口４３を経由して、典型的にはチャンバー４１の頂部へ添加される。ついで、 これは試薬２について述べたように混合される。試薬４（酢酸カリウム）は取り 入れ口４３を経由して、典型的には３００ｕｌチャンバー４１の上部に添加され る。次に、これは試薬２について述べたように混合される。結果として得られる 混合物は、沈澱した蛋白質を伴う、細胞を含まない粗製ＤＮＡの溶解物(the cel l free lyasate of crude DNA)である。このものは、系統４４を経由してチャン バー４８を開放(venting)し、バルブ５０を閉じ、ポート４２を経て正圧を加え ることによってチャンバー４６からチャンバー４８に移送される。試薬７の所定 量（ＤＮＡ結合剤、例えばシリカ樹脂、珪薬土、親和マトリックス）がチューブ ５５を経由して、典型的には５００ｕｌチャンバー４８に添加される。そのＤＮ Ａ結合剤がライン４５を経てチャンバー４８の中へ空気を通過させることによっ て粗製ＤＮＡと一緒に混合される。過剰の液体は次にチャンバー４８から 廃液の方へ移される。ＤＮＡは、フィルター４９を通過しないＤＮＡ結合剤に担 持される。試薬５（５０％エタノール／食塩）の所定量が系統４５を経由して、 典型的には２０００ｕｌチャンバー４８に添加され、フィルター４９を通過して 系統４４から空気と共にチャンバー４８を加圧することにより直接に廃棄の方へ 移される。空気はフィルターを充分に乾燥させている間、フィルター４９を継続 して通過する。指示機構５４は、チャンバー４８から出口管と共に系統内に来る ように回取管５２を移動させる。つぎにＤＮＡは、系統４５を経由して基本的に は５０ｕｌの試薬６（ＴＥ）の添加によってチャンバー４８から溶離され、系統 ４４を介して圧力の律動を加えることによってチャンバー４８から押出される。 液体添加の間に系統は、水（試薬１）とバルブ６８（図６）を介して洗浄される 。 実施例III Ｍ13ＤＮＡの精製プロトコル この実施例の試薬は、上の実施例の試薬とは異なる試薬がＭ13からＤＮＡを精 製するために使用されるが、装置の重要な部分は、上の実施例と同じである。一 本鎖Ｍ13ＤＮＡを精製するカラムには、２つのフィルターがある：上部ラムフィ ルター４６：と下部ラムフィルター４９である。フィルターの素材は精製工程中 に使用される薬品類に耐性があるものを選んで、そして、一連の変化の工程がで きるだけ速く出現するのを見越して適当な流動／結合特性を有しているものが選 ばれる。精製されるＭ13を含有するＥ．Ｃｏｌｉの生育した新たな培養物がチャ ンバー４１、典型的には１−５ｍｌに添加される。次にボート４２によって正圧 がそのチャンバー４１にかけられる。バクテリアは、それから導管４７を経てＭ 13ファージを含む過剰な液体と一緒にチャンバー４８に通過しフィルター４６を 通して濾過される。試薬２(Glacial acetic acid)の所定量(a dose)は取り入れ 口４３を介して典型的には２０ｕｌチャンバー４１の頂部へ添加される。次にフ ァージがフィルター４９を通してバルブ５０を経由して廃液の方へ進んでいる過 剰の液体と一緒に濾過される。液体廃液は流動センサー５１によって監視される 。一度全ての液体は、流動センサーの前を通過するので試薬３(4M NaClO₄)の所 定量が系統４５を経て、典型的には１０００ｕｌチャンバー４８の上部へ添加さ れる。フィルター４９は、次に試薬４（７０％ ＥｔＯＨ）、典型的には１００ ０ｕｌ で、洗浄され系統４４から空気と一緒にチャンバー４８に加圧することにより廃 液の方へ直接に移される。空気はフィルターを充分に乾燥している間、フィルタ ー４９を連続して通過している。指示機構５４は、回収チューブ５２がチャンバ ー４８から出口チューブと一列に並んでいるようにその回収チューブ５２を移動 させる。それからそのＭ13ＤＮＡは、系統４５を経由して試薬５（ＴＥ）、基本 的には５０ｕｌの添加によりチャンバー４８から溶離させ、そしてチャンバー４ ８から系統４４を介して圧力の律動を加えて押出される。 実施例IV 血液からゲノムＤＮＡを精製するためのプロトコール 血液からゲノムＤＮＡを精製するカラムには、２つのフィルターがある：上部 フィルター４６がLeukosorb type A、あるいはB Pall Biosuport divisionが一 つと；そして下部フィルター４９が２０ｕｍフィルターの２つである。上部フィ ルターの素材は、全体を通して赤血球細胞から核を除去している間に核をもった 細胞が、そのまま残り得るようなものを選んだ。抗凝血物質としてのＥＤＴＡと 一緒に新たに集めた血液が、チャンバー４１，基本的には１−１０ｍｌに加えら れた。これはチューブ（図示せず）を介して直接添加によるか、或いは上部を移 動させることによって行われた。それから、取り入れ口４２によってチャンバー ４１に正圧が加えられる。次に赤血球細胞は、導管４７、フィルター４９とバル ブ５０を経由し廃液の方へ進んでいる過剰の液体と一緒にフィルター４６を通し て濾過される。その液状廃液が一度その流動センサーの前を通過すると、試薬２ （ＰＢＳ）の所定量が系統４３を経由して、基本的には２０００ｕｌチャンバー ４１の頂部に添加される。混合効果を上げるために、チャンバー４８はライン４ ４を介して短かい爆発により(in short bursts)加圧され、チャンバー４１は、 系統４２を介して開放されている。これはフィルター上に捉えられた細胞が再懸 濁されることを保証するために行われる。試薬３（２０ＴＥ）の所定量が系統４ ３を経由して、基本的には２０００ｕｌが残っている赤血球細胞を溶解させるた めチャンバー４１の上部に添加される。次にこれは試薬２に関して述べたとおり に混合される。白血球細胞は、系統４３を介して、基本的には５００ｕｌチャン バー４１の上部へ添加され、試薬４（溶解緩衝液）の所定量と共に溶解させられ る。これは、次に試薬１のために述べたとおりに混合される。その結果得られる 混合 物は、細胞を含まない粗製ＤＮＡの溶解物である。そして、これは、ポート４２ を経由して正圧を掛け、系統４４を介してチャンバー４８を開放し、そして、バ ルブ５０を閉めることにより、チャンバー４１からチャンバー４０に移送される 。試薬７の所定量（ＤＮＡ 結合剤、例えばシリカ樹脂、珪藻土、親和マトリッ クス）がチューブ５５を介して、基本的には５００ｕｌチャンバー４８に添加さ れる。そのＤＮＡ結合剤は、系統４５を経由して空気をチャンバー４８に通過さ せて粗製ＤＮＡと一緒に混合される。過剰の液体はチャンバー４８から廃液へ移 送される。そのＤＮＡは、フィルター４９を通過し得ないＤＮＡ結合剤上に担持 される。試薬５（５０％エタノール／ＮａＣｌ）の所定量が系統４５を介して、 基本的には２０００ｕｌがフィルター４９を通過してチャンバー４８に添加され 、系統４４から空気と一緒にチャンバー４８に加圧されることにより廃液に直接 移送される。空気は、フィルターが乾燥するのに充分な間隔をもってフィルター ４９を続けて通過する。指示機構が、チャンバー４８から取り出し管と一列にな るように回収チュープ５２を移動させる。そのＤＮＡは次に系統４４を経由して 圧力の律動を加えることによってチャンバー４８から溶離される。液体添加の間 に、系統はバルブ６８（第６図）を介して水（試薬１）で洗浄される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年９月２１日 【補正内容】 請求の範囲 １．次の各工程、即ち （１ａ）培地から細胞を分離するため第１チャンバーからフィルターに粗製細胞 懸濁液を充当させて細胞懸濁液を作製するため第１チャンバーの中の細胞を再度 懸濁させること； （１ｂ）核酸を含む細胞溶解液を作製するため第１チャンバー中の細胞懸濁液を 溶解させること； （２）不要な細胞と細胞砕片を除去するため細胞溶解液をフィルターに掛けるこ と； （３）核酸をマトリックスに結合させるための条件の下で第２チャンバーの中或 いは下流に係留させられた固形相マトリックスに瀘過した溶解液を接触させるこ と； （４）その結果としての濾過された溶解液をそのマトリックスから分離すること ；そして （５）そのマトリックスの下流に備えられている排出口を通してマトリックスか ら核酸を溶解させるように第２チャンバーと連通している溶液送り出し手段を経 由し液体を充当させること；並びに そこにおいて第１、第２チャンバーの壁が、他の一方と接続していること；そし て第１チャンバー中の細胞を再度懸濁させる工程が、細胞に再懸濁緩衝液を添加 し細胞懸濁液を作製するため、フィルターによって係留された細胞を再度懸濁さ せるフィルターの反対側に圧力差を発生させることから構成される細胞から核酸 を連続的に精製する方法。 ２．核酸が、ＤＮＡである請求の範囲１に記載された方法。 ３．ＤＮＡが、プラスミドＤＮＡである請求の範囲２に記載された方法。 ４．細胞が、血液細胞である請求の範囲２に記載された方法。 ５．粗製細胞懸濁液が、血液からなる請求の範囲４に記載された方法。 ６．固形相マトリックスが第２フィルターによって係留される前項のいずれか１ つに記載された方法。 ７．マトリックスと結合核酸が、溶離より前に空気の通過により乾燥させられる 前項のいずれか１つに記載された方法。 ８．次の工程：即ち （１）目標化合物を含有する細胞懸濁液を得て、適宜に細胞溶菌液を作製するた めその懸濁液を溶解させること； （２）不要な細胞と細胞砕片とを除去するため懸濁液あるいは溶菌液をフィルタ ーに掛けること； （３）マトリックスに目標化合物を拘束させるための条件の下で固形相マトリッ クスと濾液とを接解させること； （４）そのマトリックスから得られた濾液を分離させること；及び （５）Ｍ13 ＤＮＡ、ファージラムダＤＮＡ或いは蛋白質から目標化合物をマト リックスから溶離させること； から成る細胞から目標化合物を精製するための連続的方法。 ９．月標化合物が、Ｍ13ＤＮＡ及び細胞がＭ13ＤＮＡ及び細胞が、Ｍ13ファージ 粒子である請求の範囲８に記載された方法。 １０．目標化合物が、蛋白質を含有する請求の範囲８に記載された方法 １１．目標化合物が、ファージラムグＤＮＡそして面細胞がラムグファージ粒子 である請求の範囲８に記載された方法。 １２．核酸或いは目標化合物をマトリックスから溶離させる前に狭雑物を除去す るためその核酸或いは目標化合物が結合しているマトリックスを洗浄する工程か らなる前項のいずれか１つに記載された方法。 １３．フィルターは、０．２から５０ミクロンの範囲内の穴の大きさを有する前 項のいずれか１つに記載された方法。 １４．濾過した溶解液を固形相マトリックスに接触させる工程が、マトリックス の懸濁濾過をその濾過した溶解液に添加することからなる前項のいずれか１つに 記載された方法。 １５．固形相マトリックスが、イオン交換材を含む前項のいずれか１つに記載さ れた方法。 １６．そのイオン交換材が、アニオン交換材である前項のいずれか１つに記載さ れた方法。 １７．目標化合物或いは核酸が、固形相マトリックスに結合していないとき、溶 液状に保たれている前項のいずれか１つに記載された方法。 １８．粗製細胞懸濁液を受容し、再度懸濁した細胞の細胞懸濁液を受容し、そし て溶解した細胞懸濁液から生成された細胞溶解液を受容するための第１チャンバ ー；培地から細胞を分離し、非溶解細胞と細胞砕片を係留するためのフィルター 下流；そのフィルターの濾過した溶解物下流を受容するための第２チャンバー； 供給された目標化合物を結合させるため固形相マトリックスを第２チャンバーの 中或いは下流に係留させるための手段；マトリックスから目標化合物を溶離させ るための第２チャンバーと連通させる溶液送出手段；そして固形相マトリックス を係留させるため下流に供給された精製目標化合物を送出するための排出口；そ こにおいて、第１チャンバーの壁が相互に連続して；そして手段がフィルターに よって係留された細胞を再度懸濁させ、それから細胞懸濁液を生成させるようフ ィルターの反対側に異なる圧力差を発生させるために供給されることからなる粗 製細胞懸濁液から目標化合を連続的に精製するための装置。 １９．第１チャンバーが溶液をチャンバーに送出する次の手段と連通する請求の 範囲１８に記載された装置。 ２０．正圧をそれらの下流末端に関連するフィルターの上流末端に供給する第１ 加圧手段から成る請求の範囲１８若しくは１９に記載された装置。 ２１．固形相マトリックスに係留する手段が、少なくとも第２チャンバーと排出 口との間に配置されている仕切壁からなる請求の範囲１８から２０のいずれか１ つに記載された装置。 ２２．それらの下流末端に関連する仕切壁の上流末端で正圧を供給するための第 ２加圧手段からなる請求の範囲２１に記載された装置。 ２３．フィルターが、０．２から５０ミクロンの範囲内の穴の大きさを有する請 求の範囲１８から２２のいずれか１つに記載された装置。 ２４．排出口が、第２チャンバーに存在するとき液体と連通するように位置して いる排出口を有する流体送り出し手段からなる請求の範囲１８から２３のいずれ か１つに記載された装置。 ２５．第２チャンバーが、固形相マトリックスの懸濁液を要部に送り出すための 手段として連通している請求の範囲１８から２４のいずれか１つに記載された装 置。 ２６．導管が、第２チャンバーの回収部にフィルターから濾液を転送するように 装備されている請求の範囲１８から２６のいずれか１つに記載された装置。 ２７．溶液を送り出す手段、或いはそれぞれの手段と、それらが存在する場合、 懸濁液を送り出す手段と加圧手段が、連続的な圧力を使用して空気流体送り出し システムによって操作される請求の範囲１８から２６のいずれか１つに記載され た装置。 ２８．更に、溶液、懸濁液及び圧力の送り出しを調製するための制御手段からな る請求の範囲１８から２７のいずれか１つに記載された装置。 ２９．フィルターの反対側に圧力差を発生させる手段が、第２チャンバーを加圧 するような流体系統から成る請求の範囲１８から２８のいずれか１つに記載され た装置。 ３０．固形相マトリックスを係留する手段が、第２フィルターから成る請求の範 囲１７から２９のいずれか１つに記載された装置。 ３１．空気でマトリックスを乾燥させるように手段が装備されている請求の範囲 １７から３０のいずれか１つに記載された装置。 ３２．請求の範囲１から１７のいずれか１つに記載された方法で要時使用される 請求の範囲１８から３１のいずれか１つに記載された装置。 ３３．請求の範囲１から１７のいずれか１つに記載された方法において、請求の 範囲１８から３１のいずれか１つに記載された装置の使用法。 ３４．請求の範囲１８から３１のいずれか１つに記載された装置を使用して達成 される請求の範囲１から１７のいずれか１つに従う方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．次の各工程、即ち （１）核酸を含む細胞溶解液を作製するための細胞懸濁液を溶解させること； （２）不要な細胞と細胞砕片を除去するため細胞溶解液をフィルターに掛けるこ と； （３）核酸をマトリックスに拘束させるような条件の下で第２チャンバーの中、 或いは下流に係留させられた固形相マトリックスに濾過した溶解液を接触させる こと； （４）マトリックスから濾過されたその結果としての溶解液を分離すること；お よび （５）マトリックスから核酸を溶解させること からなる細胞から核酸を精製する方法 ２．精製する方法が、連続的な方法である請求の範囲１に記載された方法 ３．核酸が、ＤＮＡである請求の範囲１あるいは請求の範囲２に記載された方法 ４．ＤＮＡが、プラスミドＤＮＡである請求の範囲３に記載された方法 ５．細胞が、血液細胞である請求の範囲３に記載された方法 ６．次の工程：即ち （１）目標化合物を含有する細胞懸濁液を得て、適宜に細胞溶菌液を作製するた めその懸濁液を溶解させること； （２）不要な細胞と細胞砕片とを除去するため懸濁液あるいは溶菌液をフィルタ ーに掛けること； （３）マトリックスに目標化合物を付着させるための条件の下で、固形相マトリ ックスと濾液とを接解させること （４）そのマトリックスから得られた濾液を分離させること；及び （５）そのマトリックスから目標化合物を溶離させること； から成る細胞から核酸を精製する方法 ７．目標化合物が、Ｍ13ＤＮＡで、そして細胞がＭ13ファージ粒子である請求の 範囲６に記載された方法 ８．目標化合物が、蛋白質を含有する請求の範囲６に記載された方法 ９．核酸或いは目標化合物をマトリックスから溶離させる前に狭雑物を除去する ためその核酸或いは目標化合物が拘束されているマトリックスを洗浄する工程か らなる前項のいずれか１つに記載された方法 １０．フィルターは０．２から５０ミクロンの範囲内の穴の大きさを有する前項 のいずれか１つに記載された方法 １１．濾過した溶解物を固形相マトリックスに接触させる工程が、マトリックス の懸濁液をその濾過した溶解物に添加することからなる前項のいずれか１つに記 載された方法 １２．固形相マトリックスが、イオン交換材料を含む前項のいずれか１つに記載 された方法 １３．そのイオン交換材が、カチオン交換材料である請求の範囲１２に記載され た方法 １４．目標化合物或いは核酸が、固形相マトリックスに結束していないとき、溶 液状に保たれている前項のいずれか１つに記載された方法 １５．細胞溶解液を受容するための第１チャンバー； 非溶解細胞と細胞砕片を係留するためのフィルター下流；および そのフィルターの濾過した溶解物下流を受容してそしてチャンバーとそこへ溶液 を送り出す手段と連通している第２チャンバー； そこにおいて手段が目標化合物を拘束させるように固形相マトリックスに係留さ せるための第２チャンバーの中或いは下流に設けられ、そして 精製された目標化合物を送り出すために排出口が固形相マトリックスを係留させ るように下流に設けられていること からなる細胞懸濁液から目標化合を精製するための装置 １６．第１チャンバーと第２チャンバーとの壁が、他の１つと連通している請求 の範囲１５に記載された装置 １７．第１チャンバーが、そこへ溶液を送り出すための更なる手段と連通してい る請求の範囲１６に記載された装置 １８．正圧をそれらの下流未端に関連するフィルターの上流末端に供給する第１ 加圧手段から成る請求の範囲１５から１７に記載された装置 １９．固形相マトリックスを係留させる手段が、固形マトリックスへの仕切壁、 そして少なくとも第２チャンバーの一部と排出口との間に置かれることからなる 請求の範囲１５から１８のいずれか１つに記載された装置 ２０．更に、それらの下流末端に関連する仕切壁の上流末端で正圧を供給するた めの第２加圧手段からなる請求の範囲１９に記載された装置 ２１．フィルターが、０．２から５０ミクロンの範囲内の穴の大きさを有する請 求の範囲１５から２０のいずれか１つに記載された装置 ２２．第２チャンバーに存在するとき液体と連通するように位置している排出口 を有する流体送り出し手段からなる請求の範囲１５から２１のいずれか１つに記 載された装置 ２３．第２チャンバーが、固形相マトリックスの懸濁液をそれらに送り出すため の手段と連通している請求の範囲１５から２２のいずれか１つに記載された装置 ２４．導管が、フィルターから第２チャンバーにおける回収部に濾液を転送する ように設けられている請求の範囲１５から２３のいずれか１つに記載された装置 ２５．溶液を送り出す手段、或いはそれぞれの手段と、それらが存在する場合、 懸濁液を送り出す手段と加圧手段が、連続的な圧力を使用して空気流体送り出し システムによって操作される請求の範囲１５から２４のいずれか１つに記載され た装置 ２６．更に、溶液、懸濁液及び圧力の送り出しを調製するための制御手段からな る請求の範囲１５から２５のいずれか１つに記載された装置