CN1134545C - 自动化dna提纯装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种自动化DNA提纯装置，其包括：液体供给装置；多个流路；控制阀；多个注射器；多个分注针；移动装置；真空座；台架；多个多穴板座40；控制装置，用于控制选择和移送各种液体的控制阀的动作、控制定量吸入和排出液体的多个注射器的动作、控制连接这些注射器的多个分注针的移送、控制逐次移送装在多穴板台架的多穴板、以及摇动装置和真空座的按次序运转等。

Description

自动化DNA提纯装置

技术领域

本发明是关于自动化DNA(脱氧核糖核酸)提纯装置的发明，特别是关于由细胞培养液等各种含DNA的液体中自动进行分离及提纯DNA的装置。

背景技术

众所周知，从含有DNA的液体如细胞培养液中分离及提纯DNA的过程是进行基因增殖、核苷酸序列分析、基因重组等的必要过程。目前，已经公知有很多方法可用来从血液、生物组织、动物细胞、植物组织、大肠杆菌、病毒等生物样品和琼脂凝胶等中分离及提纯DNA。

例如，已经报道了用加热法(boiling method；holms，D.S.and M.Quigley，1981，Anal.Biochem.114：193)及碱溶菌法(alkaline lysismethod；Birnboim，H.C.及J.Doly，1979，Nucleic Acids Res.7：1513)作为从大肠杆菌及其他细菌转化株中分离质粒DNA的方法。

作为得到高纯度DNA的方法，采用氯化铯密度梯度离心分离方法来提纯质粒DNA的方法也是众所周知的。但是此方法不仅相当消耗时间，而且，由于包含着洗净剂媒介溶解(detergent-mediated lysis)阶段、蛋白酶处理阶段、有机溶剂提纯及乙醇沉淀阶段，所以，将其作为大规模分离和提纯DNA的商业性方法是很困难的。

此外，在NaI或NaCIO4等离液序列高的阴离子盐(chaotropicsalts)存在的条件下，将含DNA的液体中的DNA吸附在SiO₂或玻璃表面使之分离的方法也是人所共知的(Marko，M.A.等，1982，Aprocedure for the large scale isolation of highly purified DNA usingalkaline extraction and binding to glass powder.Anal.Biochem.121：382-387；Vogeistein.B.等，1979，Preparative and analyticalpurification of DNA from agarose.proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：615-619)。这种在氧化硅或玻璃表面的离液序列高的阴离子盐诱导DNA吸附的方法是从细胞溶菌液中分离及提纯染色体DNA及质粒DNA时常用的方法(Buffone，G.J.等，1991，Clin.Chem.37，1945)。

上述的DNA吸附反应是使用具有可吸附DNA的表面的氧化硅粒子悬浊液或被压缩了的玻璃纤维，在pH值为4～5的盐酸胍缓冲液体内，或pH值为7.5～8的4M的碘化钠液体内进行的。

近来，在基因组研究、血液试验、作物种子检查、农产品检疫、微生物环境检查等方面，需求一种可以一次从多个生物样品中提纯DNA的装置。

如上所述，DNA的分离及提纯过程是核苷酸序列分析、基因增殖、无性繁殖等必不可少的过程，但是，传统的手工操作的提纯方法，不仅需要很多的时间和劳动力，而且由于操作者的熟练程度不同，提纯出来的DNA的量也不同。

为了解决这些问题，一直致力于开发DNA的自动化提纯装置。但至今已开发的DNA提纯装置，一次可处理的样品数量有限，不能连续供给而是顺序供给含DNA的液体，所以还不能在短时间内大量提纯DNA。

再者，由于以上的现有DNA提纯装置在注入各种液体时采用了一次性注射针，所以是不经济的，而且过滤过程及DNA吸附过程完全不能自动化。

因此，行业界一直力求开发一种自动化DNA提纯装置，用自动化的方法从多个含DNA的液体样品中同时分离及提纯DNA，并且利用可反复使用的注射针替代一次性注射针。

为了制作这样的自动化DNA提纯装置，就必须有按照所定的顺序选择多种样品，并且精确地进行定量注入的注射装置。

但是，目前已开发的旋转式多通道阀存在着很多缺点，例如，样品在流路的接点处向外泄漏，或液体样品在分注针末端残留有形如液滴的问题，还不能用于把多种样品逐次精确定量注入的自动化DNA提纯装置上。

因此，高效的自动化DNA提纯装置需要这样的多通道定量控制阀，它可以使样品的泄漏减小到最少，还可以用脉冲的方式供给样品、防止分注针末端形成液滴，以能更精确地定量注入的新方式控制液体的注入。

此外，为了从多种含DNA的液体样品中，用自动化的方法同时分离及提纯DNA，自动化DNA提纯装置还需要开发按所定的顺序连续供给多种含DNA样品的注入装置。技术方案

本发明的目的在于提供同时从含DNA的各种液体样品中在短时间内大量地把DNA分离及提纯出来的DNA提纯装置。

为达到这一目的，本发明的自动化DNA提纯装置的特征是包括：

供给各种含DNA的液体和液体试剂的液体供给装置10；

移送贮存在上述液体供给装置中的各种液体的多个流路21；

控制选择和移送上述各种液体的控制阀22、24、25；

定量吸入和排出上述各种液体的多个注射器23；

通过多个液体流路分别与上述多个注射器23连接的多个分注针26；

使上述多个分注针和/或多穴板上下和/或左右移动的移动装置30；

将上述多穴板中的液体进行真空减压过滤的真空座41；

在上下方向上移动上述多个多穴板的多穴板台架31；

安装上述多穴板台架移送来的多穴板的多个多穴板座40；以及

按照输入的计算机程序进行控制的控制装置，用于控制选择和移送上述各种液体的控制阀的动作、控制定量吸入和排出液体的上述多个注射器的动作、控制连接这些注射器的上述分注针的移动、控制按顺序移送装在多穴板台架的多穴板、以及摇动装置座及真空座按次序运转等。

本发明的自动化DNA提纯装置，还可以有选择地设置洗净上述分注针的洗净台60和/或摇动上述多穴板的摇动装置50。

本发明的自动化DNA提纯装置的运转受所述控制装置控制，该控制装置按照预先输入的计算机程序，按次序指示、调节或中断所有操作。本发明的自动化DNA提纯装置的机械操作由马达驱动，通过控制装置的电气信号来控制。控制阀的操作及液体的移送按照控制装置发出的电气信号，由压缩机和/或气泵(图中未示)所产生的气压而动作。

上述控制装置由装有各种记忆装置、中央处理器、输入输出装置等众所周知的一般的计算机构成。在上述控制装置中输入了控制DNA的分离及提纯过程的各个阶段的计算机程序，这种计算机程序可以使用现在市场上销售的过程处理软件。

附图简述

下面参照附图详细说明本发明的自动化DNA提纯装置的实施例，以使本发明的以上目的和其他优点更明了。附图中：

图1是本发明的自动化DNA提纯装置主要部分的透视图。

图2是本发明的自动化DNA提纯装置的正视图。

图3是本发明的自动化DNA提纯装置的侧视图。

图4是本发明的自动化DNA提纯装置的平面图。

图5a是本发明的自动化DNA提纯装置的液体控制阀的正视图。

图5b是本发明的自动化DNA提纯装置的控制阀的断面图。

最佳实施例

下面参照附图详细说明本发明。

图1是本发明的自动化DNA提纯装置的主要部分的透视图。液体供给装置10位于该提纯装置的下部，它设置了各种用于贮存各种含DNA的液体的容器和盛装由真空座排出的废液的容器，所述液体为，例如，细菌培养液、溶菌缓冲液、胶合缓冲液(用来吸附DNA)、洗净缓冲液、洗提缓冲液(DNA脱离附着用)、蒸馏水、洗净液等。

如图5a所示，液体控制阀装置20通过流路21连接上述液体供给装置10，该控制阀装置20包括：控制通过上述流路21进行液体移送的第一控制阀22；通过上述流路21依靠活塞的作用吸入或排出定量液体的注射器23；阻挡由上述注射器23排出的液体向液体供给装置返流的第二控制阀24；将上述注射器23转送的液体注射到多穴板的各穴中的分注针26；及控制上述注射器23和分注针26之间液体流动的第三控制阀25。

如果打开第一控制阀，通过流路21a从液体供给装置10供给液体，而此时由于第二控制阀24关闭，液体不能流入注射器内部。然后，第一控制阀22关闭，第二控制阀24打开，通过用马达驱动的活塞的作用，液体被定量地吸入到注射器23里。上述多个注射器23通过多个流路21b和第三控制阀25分别与多个分注针26连接。定量地吸入到上述注射器里的上述液体通过马达驱动的活塞运动排出，然后通过打开了的第三控制阀移送到多个分注针里，并且靠第二控制阀的关闭不返流到液体供给装置10。

被这样移送的液体通过分注针26同时注入到多穴板的各穴(well)里。如上所述，用带有靠马达驱动活塞的注射器，可以把注入到各穴的液体的量调节到1μl的误差范围之内。随着活塞的往复动作，注射器23可以用洗净缓冲液或洗净液通过反复地进行吸入及排出洗净缓冲液或洗净液而清洗分注针26，而且，还可以用来混合不同的液体。

图5b是控制阀装置的详细图示，表示第一控制阀22、第二控制阀24及第三控制阀25的断面图，其中第一控制阀21控制通过流路由液体供给装置10流入注射器的液体，第二控制阀24阻挡注射器24和第一控制阀之间液体逆流，第三控制阀25控制注射器和分注针之间的液体流动。

以上的控制阀装置由几个通道块组成。在每个通道块的内空间有三个阀室，这些阀室中设置有膜。气体流路与各阀室相连。气压通过气体流路施加到阀室，使膜膨胀，从而起到遮断流路的作用。

液体通过流路从所述液体供给装置10供给。液体通过第一控制阀22、第二控制阀24及第三控制阀25的选择性控制流向注射器和分注针。在本发明的自动化DNA提纯装置上，可以用通常的各种电磁阀作为控制阀，也可以根据需要使用韩国专利申请第10-2000-0055968号说明书中详细介绍的多通道定量控制阀装置。

通过台架31移送到多穴板座40中的多穴板包括：含细胞培养液的多穴板、过滤细胞溶菌液的第一过滤板(俘获过滤板)、吸附DNA的第二过滤板(吸附过滤板)、及从第二过滤板回收DNA的回收过滤板。

在本发明的自动化DNA提纯装置上，可以使用现在市场上销售的标准多穴板，例如96(12×8)穴板。插装在这些板上的穴也可以用通常的DNA分离及提纯试验用的圆筒形管。在穴内的下部装上俘获过滤器和吸附过滤器等，在其底面上有可以与真空泵相连接的真空吸入口，可以进行真空过滤。

在第一过滤板上插装着的俘获过滤器，在常压下不能透过细胞溶菌液，但在对细胞溶菌液施加离心力或者进行真空减压吸入的情况下，实现使细胞溶菌液中的蛋白质、染色体DNA、各种细胞残留物等不能透过而含质粒液体透过的机能。本发明的自动化DNA提纯装置可以把众所周知的具有这种机能的一般的疏水性过滤器作为俘获过滤器使用。适用于本发明的自动化DNA提纯装置的俘获过滤器，可以是一层聚烯烃过滤层和按疏水性要求进行过表面处理的玻璃过滤层结合成的多层过滤器。韩国专利申请第10-2000-0054999号作了详细介绍。

在第二过滤板上插装着的吸附过滤器，是在存在离液序列高的阴离子盐的情况下选择性地吸附质粒DNA的过滤层(DNA吸附层)，和在常压下防止含DNA的液体透过的疏水性过滤层组成的多层过滤器。DNA吸附层在离液序列高的阴离子盐存在的情况下能选择性地吸附DNA，而如果添加了Tris-HCl液体等洗提缓冲液，则可完成DNA脱离的机能。吸附过滤器在常压下防止液体透过，但在施加离心力或者进行真空减压过滤时液体能够透过。很多种类的具有这种机能的过滤器都可以作为吸附过滤器用于本发明的自动化DNA提纯装置上，也可以根据需要使用韩国专利申请第10-2000-0054999号所介绍的多层吸附过滤器。

本发明的自动化DNA提纯装置包括移送多穴板的台架31及卡紧夹杆32。如图2所示，台架31包括装了多穴板的多个板台33及为使板台33上下移动的板台移动装置。板台移动装置包括：同步传动带、设在同步传动带两侧的轴、设在下面的滚珠衬套及马达。所述台架31通过轴的旋转，移动板台33，把装载在板台33上的多穴板移送到多穴板座40上。

各种液体通过分注针注入到用台架31被移送到多穴板座上的多穴板的穴中。卡紧夹杆32起着把经过这样处理的多穴板上下、左右地移动，使之移动到摇动装置50或真空座41上的功能。卡紧夹杆32上还装有把板罩用真空吸住使之与板分离的真空吸附缓冲器。

如图4所示，移动装置30是使分注针26和卡紧夹杆32按前后(Y轴)、左右(X轴)、上下(Z轴)的方向移动的装置。在各方向上设有线性移动(LM)导轨、同步传动带及步进马达，用以移动分注针及卡紧夹杆32。为了沿Z轴方向移动，在Y轴方向的LM导轨的两侧装有一对滚珠花键。在Y轴的LM导轨上沿Z轴方向装有连接支架，在连接支架的两侧装有2个同步传动带。分注针及卡紧夹杆32分开装在连接支架上，用马达使滚珠花键旋转，使分注针及卡紧夹杆独立地移动到下一个位置。

真空座41包括底面上形成真空吸入口的真空容器42和覆盖在真空容器的上端缘部的罩。真空吸入口与真空泵(图中未示)相连接，起着通过抽真空使真空容器的内部压力减小的作用。真空座的罩靠马达的驱动来开闭，起着密封放在真空容器中的多穴板的端部与真空容器的上端的作用。

如图4所示，本发明的自动化DNA提纯装置中选择性地使用了作为分注针的洗净装置的洗净台60，它包括杀菌液流动的杀菌区61和蒸馏水流动的洗净区62。而且，本发明的自动化DNA提纯装置还可包括把多穴板和罩在使用后拆卸到装置外部的拆卸口。

下面介绍用如上所述的本发明的自动化DNA提纯装置，从含DNA的生物样品分离及提纯DNA的方法。

通过分注针26把各种含DNA的生物液体样品移送到第一过滤板(俘获过滤器)。在真空容器42内的下部装上第二过滤板(吸附过滤板)，把第一过滤板(俘获过滤板)装在第二过滤板的上方。然后使真空座工作，通过对布满第一过滤板的含DNA生物液体样品进行减压过滤，把细胞残留物、蛋白质、染色体DNA等留在第一过滤板上，把含质粒DNA的液体收集到第二过滤板中。

用分注针把含离液序列高的阴离子盐的吸附缓冲液注入到含质粒DNA液体的第二过滤板中，质粒就被第二过滤板的吸附过滤层所吸附。把这样吸附到吸附过滤层上的质粒DNA用洗净缓冲液清洗几次，然后让其在安装在真空座上的吸附过滤器上干燥。

之后，由于在真空容器42内的下部装有回收过滤板，把吸附了干燥质粒DNA的第二过滤板装在回收过滤板上方，用分注针26把Tris-HCl液体等洗提缓冲液注入每个第二过滤板的每个穴中，以使质粒DNA从吸附过滤器上脱离。然后使真空座41运转，把提纯后的质粒DNA收集到回收板中。产业上的可利用性

本发明的自动化DNA提纯装置包括多通道定量控制阀装置，该阀装置由多个注射器和控制阀所组成，所以，可以同时从多种生物样品分离及提纯质粒DNA。此外，本发明的自动化DNA提纯装置不使用一次性分注针头，采用不拆卸就可以洗净而反复使用的分注针，节省了传统DNA分离提纯过程所需消耗品的费用。本发明的自动化DNA提纯装置采用了装有多块板并逐次移送的台架及移送装置，使连续地供给含DNA液体样品成为可能，并且使板的移动过程、装设过程以及通过真空座的减压过滤过程自动化，使DNA的分离及提纯过程可以连续进行，从而可以在短时间内从细胞培养液等含DNA样品中大量分离及提纯高纯度的DNA。

采用本发明的自动化DNA提纯装置，可以使在传统的基因操作中最频繁进行的DNA分离及提纯过程完全自动化，替代了传统的一系列手动操作。

尽管以上已经详细图示及说明了本发明的实施例，但本领域的技术人员应该理解，在不脱离所附权利要求限定的本发明的宗旨和范围的前提下，可以对以上实施例中的形式和细节做出各种改变。

Claims (5)

1.自动化DNA提纯装置，其包括：

液体供给装置(10)，用来供给各种液体试剂和含DNA的溶液；

多个流路(21)，用来移送贮藏在液体供给装置(10)中的各种液体；

控制阀(22、24、25)，用来控制各种液体的选择和移送；

多个注射器(23)，用来定量吸入或排出所述的各种液体；

多个分注针(26)，其与所述的多个注射器(23)分别通过多个流路连接；

移动装置(30)，使所述的分注针和/或多穴板上下和/或左右移动；

真空座(41)，将盛在所述的多穴板中的液体进行真空减压过滤；

多穴板台架(31)，用来在上下方向上移动所述的多穴板；

多个多穴板座(40)，用来安装通过所述多穴板台架移送来的多穴板；

通过输入的计算机程序进行控制的控制装置，用于控制选择和移动各种液体的控制阀的动作、控制定量吸入和排出液体的多个注射器的动作、控制连接这些注射器的多个分注针的移送、控制按顺序移动装在多穴板台架上的多穴板、以及控制摇动装置和真空座的按次序运转。

2.如权利要求1所述的自动化DNA提纯装置，还包括摇动所述多穴板的摇动装置(50)。

3.如权利要求1或2所述的自动化DNA提纯装置，还包括用来洗净分注针的洗净台(60)。

4.如权利要求3所述的自动化DNA提纯装置，其特征为，上述洗净台由杀菌区和洗净区组成。

5.如权利要求1所述的自动化DNA提纯装置，其特征为，所述多穴板的台架(3)包括多个上下移送多块板的板台(33)和上下移动板台(33)的板台移动装置。

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