CN105296327B - 一种核酸提取装置及其提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种核酸提取装置，包括具有第一连接端和吸附端的吸附管、设置在上述吸附端并能吸附待处理样品中核酸成分的吸附滤芯以及内置有活塞的活塞管，该活塞管包括第二连接端和敞口端并通过第二连接端与第一连接端连接而与吸附管连通，还包括用于抽吸流经吸附滤芯的液体的抽吸组件；还涉及一种应用上述核酸提取装置的核酸提取方法。该核酸提取装置中提取过程中无需拆装装置，结构简单、操作方便，实现了核酸提取操作连续性，易于实现核酸的自动化提取，能根据需要进行多次漂洗，保证了核酸提取的质量，是一种快捷、高效的核酸提取方法，可广泛推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种核酸提取装置及其提取方法。
背景技术
核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两类，是一切生物体的遗传物质，在细胞中主要存在于细胞核内并以与蛋白质结合的状态存在。核酸提取是生命科学研究、生物技术应用及基因诊断中非常重要的一项技术，早期的核酸提取是建立在苯酚氯仿抽提去杂质与乙醇沉淀核酸的原理上的，但这一方法非常累赘。目前，商品化的核酸提取方法主要建立在固相吸附方法上，即在特定的条件下(如pH、特定的盐等)将核酸分子吸附在某种固相吸附剂表面，然后加以洗脱的纯化方法，主要包括以下两种：(1)离心柱法：以含硅材料或者其它可以吸附核酸的固体为介质装填在离心柱中，并用胍盐等离液盐作为结合剂，当核酸分子通过离心柱时即被吸附在固相上，然后用含乙醇的溶液洗去杂质，最后用低盐溶液将核酸洗脱下来；该方法简单便捷，提取效率高，提取效果好，是目前使用最多的核酸纯化方法，缺点是提取过程中需要反复离心，不便于高通量、自动化操作。(2)磁珠法：利用表面包裹硅材料或者其它能结合核酸的材料的磁性微球作为固相载体，在离液盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)和在外加磁场的作用下，从样本中分离DNA和RNA；该方法操作简单，易于实现自动化、高通量操作，缺点是成本较高，提取效率易受影响，不同样品、不同厂家、不同批次的磁珠提取效果变化较大。
固相吸附法的技术关键为：(1)高效的固相吸附材料；(2)辅助核酸结合固相材料特殊溶液。目前，使用最广泛的固相吸附材料是含硅材料，如美国专利NO 6,218,531公开的二氧化硅；又如美国专利NO 5,503,816公开的多种具有亲水性和正电性的含硅材料，优选的含硅材料包括硅酸硼、硅酸铝、磷酸硅酸、羰基硅、磺基硅和膦酰基硅，其中一些材料可以在不使用离液剂、仅使用水的情况下回收DNA。在结合剂中，最重要的是离液剂(chaotrope，chaotropic agent)，包括离液盐(chaotropic salt)，常用的离液剂包括碘化钠(NaI)、尿素、盐酸胍(Gu·HCl)、高氯酸钠(NaClO4)和溴化钾(KBr)等。此外，也有使用醇类作为结合剂，如欧洲专利NO 0512676 A1和美国专利NO5,783,686中公开的100％的乙醇。
为对现有的核酸提取方法进行改进，申请号为201410333236.7(申请公布号为CN104059849A)的中国发明专利《一种用于核酸快速提取的装置及一种核酸快速提取 方法》公开了一种用于核酸快速提取的装置及一种核酸快速提取方法，该装置包括注射器、中空的转接器、核酸吸收膜管、加样针四个部分，在经过临床样本裂解处理、注射器抽吸、核酸吸附膜吸附核酸、漂洗液漂洗核酸吸附膜、洗脱液洗脱核酸等步骤后，可以获得纯的核酸溶液而用于下游实验。虽然该专利可在一体化的装置中实现核酸的提取，但是在利用该装置提取核酸时，无论是“两抽一推”法还是“三推”法中，最后将吸附在滤膜上的核酸成分洗脱时都需要更换新的注射器，此外“两抽一推”法中由于注射器腔容积有效，对样本的清洗次数有限，因此对核酸提取物的纯化程度造成的限制，而“三推”法中每一次“推”均需将注射器取下吸收相应的液体，无法实现自动化操作。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种结构简单、使用方便的核酸提取装置。
本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供一种操作简单、提取纯度高且易于实现自动化操作的核酸提取方法。
本发明解决第一个技术问题所采用的技术方案为：一种核酸提取装置，包括具有第一连接端和吸附端的吸附管、设置在上述吸附端并能吸附待处理样品中核酸成分的吸附滤芯和活塞管，该活塞管中内置有能沿活塞管内壁上下移动移动的活塞，且该活塞管包括第二连接端和敞口端并通过第二连接端与第一连接端连接而与吸附管连通，其特征在于，还包括用于抽吸流经吸附滤芯的液体的抽吸组件。
或者采用以下技术方案：一种核酸提取装置，包括具有第一连接端和吸附端的吸附管、设于上述吸附端并能吸附待处理样品中核酸成分的吸附滤芯及内置有活塞的活塞管，该活塞管包括第二连接端和敞口端，并通过第二连接端与第一连接端连接而与吸附管连通，所述敞口端设置有一密封圈，所述活塞嵌设在该密封圈中并能沿活塞管长度方向上下移动，其特征在于，还包括用于抽吸流经吸附滤芯的液体的抽吸组件。
为使装置结构简单并使抽吸组件的抽吸效果较好，作为优选，所述抽吸组件包括吸管、单向阀以及真空泵，该吸管一端用于抽吸液体，另一端通过单向阀与真空泵连接；或者，所述吸收组件包括吸管、电动阀门以及电动气泵，该吸管一端用于抽吸液体，另一端通过电动阀门与电动气泵连接。
进一步，所述吸附滤芯与活塞之间形成液体腔，所述吸管插设于液体腔的腔壁上。
进一步，所述吸管的一端竖向延伸至吸附管中并位于吸附滤芯上方，从而加快液体腔的液体经抽吸组件外排的速度，且吸管的自由端套设有一次性保护管，核酸提取中可更换一次性保护管，避免吸管端部污染，保证核酸的提取纯度。
第一连接端与第二连接端的连接方式有多种，为方便操作，所述第一连接端与第二连接端可拆卸连接，本发明中可拆卸连接可有多种形式，如螺纹连接，即第一连接端与第二连接端通过螺纹连接，又如卡扣连接，第一连接端卡入第二连接端或第二连接端卡入第一连接端。
进一步，为实现上述可拆卸连接同时也使第一连接端与第二连接端连接稳固，作为优选，所述第一连接端和第二连接端均呈圆台状，第二连接端卡入第一连接端且其外周面与第一连接端的内周面紧密贴合。
作为优选，所述吸附滤芯为核酸吸附膜或核酸吸附填料，当吸附滤芯为核酸吸附膜时可选用玻璃纤维膜或硅胶膜。
为易于实现该装置的自动化操作，作为优选，该装置还包括用于驱动活塞沿活塞管内壁上下移动的驱动装置，例如步进电机驱动的蜗杆装置等。
本发明解决第二个技术问题所采用的技术方案为：一种利用上述核酸提取装置的核酸提取方法，其特征在于，经过吸附滤芯吸附待处理样品中的核酸成分、多种漂洗液分步多次漂洗除杂以及洗脱液洗脱吸附于吸附滤芯的核酸成分，最终获得所述的核酸溶液。
具体过程包括以下步骤：
(1)吸附：将吸附管的吸附端插入待处理样品，打开真空泵或电动气泵，利用吸管产生的吸力使待处理样品中的核酸成分流经吸附滤芯因吸附滤芯的特异性吸附而被吸附在吸附滤芯中，滤液为含有细胞碎片和蛋白质等杂质的过滤液且经吸管抽吸排出；
(2)一次漂洗：将吸附端插入漂洗液A中，打开真空泵或电动气泵，利用吸管产生的吸力使漂洗液A通过吸附滤芯而清洗残留在吸附滤芯上的蛋白质或其他杂质成分，清洗后的漂洗液A进入经吸管抽吸排出；
(3)多次漂洗：根据待处理样品处理需要，将吸附端依次插入多种不同的漂洗液中，且各漂洗液分别按照步骤中的操作进行漂洗；
(4)洗脱：漂洗结果后，关闭真空泵或电动气泵，将吸附管插入装有洗脱液的干净容器中并使吸附端伸入液面下，驱动活塞上下移动，洗脱液在活塞管的吸力作用下流经吸附滤芯，并将吸附在吸附滤芯上的核酸成分洗脱，重复多次洗脱吸附滤芯上吸附的核酸成分，收集至核酸收集容器或检测装置中，完成样品中核酸的提取。
与现有技术相比，本发明的优点在于：该核酸提取装置中设置抽吸组件，提取过程中待处理样品经吸附滤芯过滤后的滤液和漂洗液清洗后的废液均能直接通过抽吸组件抽吸，整个提取过程中无需拆装装置，结构简单、操作方便，实现了核酸提取操作连续性，易于实现核酸的自动化提取，此外，能根据需要进行多次漂洗，保证了核酸提取的质量，是一种快捷、高效的核酸提取方法，可广泛推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例1中的核酸提取装置结构示意图；
图2为本发明实施例1中的核酸提取装置局部结构示意图；
图3为本发明实施例3中核酸提取方法操作流程示意图；
图4为本发明实施例2中的核酸提取装置结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1：
如图1和图2所示，一种核酸提取装置，包括具有第一连接端12和吸附端11的吸附管1、吸附滤芯3以及内置有能沿管内壁上下位移的活塞4的活塞管2。本发明中吸附管1可为一次性吸附管，其吸附端11设置有用于吸附待处理样品中核酸成分的吸附滤芯3。活塞管2包括第二连接端22和敞口端21，该第二连接端22和上述第一连接端12均呈圆台状并通过可拆卸方式连接，具体地，第二连接端22卡入第一连接端12且其外周面与第一连接端12的内周面紧密贴合，使得活塞管2与吸附管1连通。此外，该装置外部还设置有能驱动活塞4沿活塞管2内壁上下移动的驱动装置7，方便操作，为核酸的自动化提取提供基础。
上述吸附滤芯3与活塞4之间形成液体腔5，该液体腔5上设置有用于抽吸液体腔5中液体的抽吸组件6，该抽吸组件6包括吸管61、单向阀62以及真空泵63，吸管61插设于液体腔5腔壁，一端竖向延伸至吸附管1中并位于吸附滤芯3上方，另一端通过单向阀62与真空泵63连接，当然吸收组件也可以是其他可能的组合形式，如：吸收组件包括吸管、电动阀门以及电动气泵，该吸管一端用于抽吸液体，另一端通过电动阀门与电动气泵连接，在此不再赘述。提取过程中待处理样品经吸附滤芯3过滤后的滤液和漂洗液清洗后的废液均能直接通过抽吸组件6抽吸。为避免吸管61的端部在核酸提取过程中受到污染，从而影响核酸提取的纯度，吸管61的自由端(即位于吸附滤芯3上方的端部)套设有一次性保护管8，核酸提取中通过更换一次性保护管8，进一步保证核酸提取的纯度。
实施例2：
如图4所示，与上述实施例1不同的是，实施例2中活塞管2内置有活塞4，活塞管2的敞口端21设置有一密封圈9，活塞4嵌设在该密封圈9中并能沿活塞管2长度方向上下移动。
本发明中的核酸提取装置均可作为独立的装置用于核酸的提取，也可以作为核酸自动提取装置的一部分，从而实现核酸的自动化提取。
利用上述实施例1中的核酸提取装置进行核酸提取的过程如下：
(1)吸附：待处理样品加入试管中，将吸附管1的吸附端11插入待处理样品，打开真空泵63，利用吸管61产生的吸力使待处理样品中的核酸成分流经吸附滤芯3因吸附滤芯3的特异性吸附而被吸附在吸附滤芯3中，滤液为含有细胞碎片和蛋白质等杂质的过滤液，滤液经吸管61抽吸排出；
(2)一次漂洗：漂洗液A加入到另一干净的试管中，将吸附端11插入漂洗液A中，打开真空泵63，利用吸管61产生的吸力使漂洗液A通过吸附滤芯3而清洗残留在吸附滤芯3上的蛋白质或其他杂质成分，清洗后的漂洗液A进入经吸管61抽吸排出；
(3)多次漂洗：根据待处理样品处理需要，分步将多种不同的漂洗液注入到对应地的新试管中，依次将吸附端11插入上述各漂流液中，分步按步骤(2)中的操作进行多次漂洗；
(4)洗脱：漂洗结束后，关闭真空泵63，将吸附管1插入装有洗脱液的新试管中并使吸附端11伸入液面下，打开驱动装置驱动活塞4上下移动，洗脱液在活塞管2的吸力作用下流经吸附滤芯3，并将吸附在吸附滤芯3上的核酸成分洗脱，重复多次洗脱吸附滤芯3上吸附的核酸成分，收集至核酸收集容器或检测装置中，完成样品中核酸的提取。
以下通过具体实施例对本发明进行进一步阐述：
实施例3：
1、样品前处理
取60μl抗凝全血，加入等体积的裂解液GL并混匀，接着加入适量蛋白酶，混匀15s，37℃下反应10min，加入GL体积1.5倍的无水乙醇，混匀得待处理样品。上述裂解液GL、蛋白酶均来自试剂盒ZD-XY-Micro-50(购自宁波重鼎生物技术有限公司)。
2、核酸提取
利用本发明中的核酸提取装置，参照上述提取方法对待处理样品进行处理，提取过程中使用的试剂均来自试剂盒ZD-XY-Micro-50(购自宁波重鼎生物技术有限公司)，如图3所示，具体过程如下：
(1)吸附：将上述制得的待处理样品加入试管Ⅰ中，将吸附管1的吸附端11插入待处理样品，打开真空泵63，利用吸管61产生的吸力使待处理样品中的核酸成分流经吸附滤芯3(购自宁波重鼎生物技术有限公司)因吸附滤芯3的特异性吸附而被吸附在吸附滤芯3中，滤液为含有细胞碎片和蛋白质等杂质的过滤液，滤液经吸管61抽吸排出；
(2)一次漂洗：漂洗液A(本实施例中漂洗液A为试剂盒ZD-XY-Micro-50中的洗液W1)加入到试管Ⅱ中，将吸附端11插入漂洗液A中，打开真空泵63，利用吸管61产生的吸力使漂洗液A通过吸附滤芯3而清洗残留在吸附滤芯3上的蛋白质或其他杂质成分，清洗后的漂洗液A进入经吸管61抽吸排出；
(3)多次漂洗：根据待处理样品处理需要，分步将漂洗液B(本实施例中漂洗液C为试剂盒ZD-XY-Micro-50中的洗液W2)和漂洗液C(本实施例中漂洗液A为试剂盒ZD-XY-Micro-50中的无水乙醇)注入试管Ⅲ和试管Ⅳ中，依次将吸附端11插入上述各漂流液中，分步按步骤(2)中的操作进行多次漂洗；
(4)洗脱：漂洗结束后，空吸两分钟使滤芯上的无水乙醇挥发，然后关闭真空泵63，将吸附管1插入装有洗脱液(本实施例中的洗脱液为50μl的试剂盒ZD-XY-Micro-50中的TE溶液)试管Ⅴ中并使吸附端11伸入液面下，打开驱动装置7驱动活塞4上下移动，洗脱液在活塞管2的吸力作用下流经吸附滤芯3，并将吸附在吸附滤芯3上的核酸成分洗脱，重复多次洗脱吸附滤芯3上吸附的核酸成分，收集至核酸收集容器中，完成样品中核酸的提取。利用分光光度法对提取的DNA进行检测，检测结果如表1所示。
比较例：
利用MICRO离心柱法对全血中的核酸进行提取，具体过程如下：
(1)取60μl抗凝全血，加入等体积的裂解液GL并混匀，接着加入适量蛋白酶，混匀15s，37℃下反应10min，加入GL体积1.5倍的无水乙醇，混匀得待处理样品。
(2)将待处理样品全部移入套有收集管的微量离心柱中，转速12000g下离心2min，取出离心柱(勿让离心柱碰到下面废液)，弃去收集管中废液后将离心柱放回收集管中。
(3)向离心柱中加入500μl溶液W1，转速12000g下离心2min，取出离心柱后弃去收集管中废液，将离心柱放回收集管中。
(4)向离心柱中加入500μl溶液W2，转速12000g下离心10sec，取出离心柱后弃去收集管中废液，将离心柱放回收集管中。
(5)转速12000g下离心2min。
(6)将微量离心柱取出并放入新的1.5ml离心管中，加入50μl溶液TE，室温静止2min，转速12000g下离心1min，DNA即被洗脱。利用分光光度法对提取的DNA进行检测，检测结果如表1所示。
比较例中使用的试剂裂解液GL、蛋白酶、溶液W1、溶液TE也均来自试剂盒ZD-XY-Micro-50。
表1为实施例和比较例中提取的DNA的检测结果
由表1可见，本发明中的核酸提取方法不仅操作方便，提取速度快，OD260/OD280在1.8左右，表明提取的DNA纯度高，无蛋白质等杂质，提取效果与离心柱法基本一致，可广泛应用于各种生物样本中核酸的提取。
Claims (8)
1.一种核酸提取装置，包括具有第一连接端(12)和吸附端(11)的吸附管(1)、设于上述吸附端(11)并能吸附待处理样品中核酸成分的吸附滤芯(3)及活塞管(2)，该活塞管(2)内置有能沿其内壁上下移动的活塞(4)，且该活塞管(2)包括第二连接端(22)和敞口端(21)，并通过第二连接端(22)与第一连接端(12)连接而与吸附管(1)连通，其特征在于，还包括用于抽吸流经吸附滤芯(3)的液体的抽吸组件(6)；
所述抽吸组件(6)包括吸管(61)、单向阀(62)以及真空泵(63)，该吸管(61)一端用于抽吸液体，另一端通过单向阀(62)与真空泵(63)连接；或者，所述抽吸组件(6)包括吸管(61)、电动阀门以及电动气泵，该吸管(61)一端用于抽吸液体，另一端通过电动阀门与电动气泵连接；
所述吸管(61)插设于由吸附滤芯(3)与活塞(4)之间形成的液体腔(5)的腔壁上，且所述吸管(61)的一端竖向延伸至吸附管(1)中并位于吸附滤芯(3)上方。
2.一种核酸提取装置，包括具有第一连接端(12)和吸附端(11)的吸附管(1)、设于上述吸附端(11)并能吸附待处理样品中核酸成分的吸附滤芯(3)及内置有活塞(4)的活塞管(2)，该活塞管(2)包括第二连接端(22)和敞口端(21)，并通过第二连接端(22)与第一连接端(12)连接而与吸附管(1)连通，所述敞口端(21)设置有一密封圈(9)，所述活塞(4)嵌设在该密封圈(9)中并能沿活塞管(2)长度方向上下移动，其特征在于，还包括用于抽吸流经吸附滤芯(3)的液体的抽吸组件(6)；
所述抽吸组件(6)包括吸管(61)、单向阀(62)以及真空泵(63)，该吸管(61)一端用于抽吸液体，另一端通过单向阀(62)与真空泵(63)连接；或者，所述抽吸组件(6)包括吸管(61)、电动阀门以及电动气泵，该吸管(61)一端用于抽吸液体，另一端通过电动阀门与电动气泵连接；
所述吸管(61)插设于由吸附滤芯(3)与活塞(4)之间形成的液体腔(5)的腔壁上，且所述吸管(61)的一端竖向延伸至吸附管(1)中并位于吸附滤芯(3)上方。
3.如权利要求1或2所述的核酸提取装置，其特征在于，所述吸管(61)的自由端套设有一次性保护管(8)。
4.如权利要求1或2所述的核酸提取装置，其特征在于，所述第一连接端(12)与第二连接端(22)可拆卸连接。
5.如权利要求4所述的核酸提取装置，其特征在于，所述第一连接端(12)和第二连接端(22)均呈圆台状，第二连接端(22)卡入第一连接端(12)且其外周面与第一连接端(12)的内周面紧密贴合。
6.如权利要求1或2所述的核酸提取装置，其特征在于，还包括用于驱动所述活塞(4)沿活塞管(2)内壁上下移动的驱动装置(7)，此外，所述吸附滤芯(3)为核酸吸附膜或 核酸吸附填料。
7.一种利用如权利要求1或2所述的核酸提取装置的核酸提取方法，其特征在于，经过吸附滤芯(3)吸附待处理样品中的核酸成分、多种漂洗液分步多次漂洗除杂以及洗脱液洗脱吸附于吸附滤芯(3)的核酸成分，最终获得所述的核酸溶液。
8.如权利要求7所述的核酸提取装置的核酸提取方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)吸附：将吸附管(1)的吸附端(11)插入待处理样品，打开真空泵(63)或电动气泵，利用吸管(61)产生的吸力使待处理样品中的核酸成分流经吸附滤芯(3)因吸附滤芯(3)的特异性吸附而被吸附在吸附滤芯(3)中，滤液为含有细胞碎片和蛋白质等杂质的过滤液且经吸管(61)抽吸排出；
(2)一次漂洗：将吸附端(11)插入漂洗液A中，打开真空泵(63)或电动气泵，利用吸管(61)产生的吸力使漂洗液A通过吸附滤芯(3)而清洗残留在吸附滤芯(3)上的蛋白质或其他杂质成分，清洗后的漂洗液A进入经吸管(61)抽吸排出；
(3)多次漂洗：根据待处理样品处理需要，将吸附端(11)依次插入多种不同的漂洗液中，且各漂洗液分别按照步骤(2)中的操作进行漂洗；
(4)洗脱：漂洗结束后，关闭真空泵(63)或电动气泵，将吸附管(1)插入装有洗脱液的干净容器中并使吸附端(11)伸入液面下，驱动活塞(4)上下移动，洗脱液在活塞管(2)的吸力作用下流经吸附滤芯(3)，并将吸附在吸附滤芯(3)上的核酸成分洗脱，重复多次洗脱吸附滤芯(3)上吸附的核酸成分，收集至核酸收集容器或检测装置中，完成样品中核酸的提取。
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