CN111944919B

CN111944919B - 一种可以在田间、常温操作的香蕉枯萎病菌热带4号小种可视化检测技术体系

Info

Publication number: CN111944919B
Application number: CN202010759911.8A
Authority: CN
Inventors: 李春雨; 项丹丹; 刘思文; 易干军
Original assignee: Pomology Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Pomology Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2040-07-31
Also published as: CN111944919A

Abstract

本发明公开了一种可以在田间、常温操作的香蕉枯萎病菌热带4号小种可视化检测技术体系，公开了检测香蕉枯萎病菌Foc TR4的基因标记物基因FOIG_16627，Foc TR4/香蕉基因组DNA快速提取方法，以及结合PRA扩增和侧向流动试纸条，2‑3min内即可获知样品是否存有Foc TR4。本发明还公开了一种含有硅胶滤膜的抽提式的过滤吸附装置，通过利用硅胶膜对基因组DNA的吸附作用，可以在田间常温、不使用离心机的情况下对Foc TR4/香蕉基因组DNA快速提取，提取过程仅需要10min，快速方便，仪器设备要求不高。

Description

一种可以在田间、常温操作的香蕉枯萎病菌热带4号小种可视化检测技术体系

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种可以在田间、常温操作的香蕉枯萎病菌热带4号小种(Foc TR4)可视化检测技术体系，具体涉及一种Foc TR4鉴定的PCR特异性引物。

背景技术

香蕉枯萎病是国际植物检疫对象，Foc TR4是重点对象，其已对全球香蕉产业造成毁灭性威胁。Foc TR4最先在马来西亚、印度尼西亚暴发，已经传播至亚洲大部分香蕉种植国，其中我国也是Foc TR4危害最严重的国家，每年经济损失可以达到50亿元。2013年FocTR4传播至非洲的莫桑比克，直接威胁当地的主粮品种-煮食蕉。香蕉在非洲是主要粮食之一，Foc TR4的危害可能会断绝非洲人民的粮食来源。2019年Foc TR4又在南美洲的哥伦比亚暴发，引起中南美的香蕉种植国的极度恐慌，因为病菌将会毁灭当地的香蕉产业以及进出口贸易。

目前，有效防控Foc TR4的措施包括种植抗耐病新品种、植物检疫等。前者面临着病菌进化的威胁；病菌传播速度快，带菌蕉苗、土壤、农机具、水源等是主要媒介。另外，在不断发展的国际国内贸易，带菌香蕉果实可以轻易传送到世界各地。因此加强植物检疫，延缓Foc扩散是当前防控工作的重点。不过现在还比较缺乏快速、实用的Foc检测技术，限制了国际植物检疫措施标准的有效执行。

传统Foc鉴定方法(1)Race、VCG鉴别法；(2)常规PCR法等。传统方法的缺点为：病原菌的分离、单孢分离、接种试验、看家基因序列测定、突变体诱导和亲和试验等，耗时非常长、工作量大，技术高，田间操作的可行性非常小。

首先看家基因的扩增需要提取样品的基因组DNA，目前基因组DNA的提取方法如SDS法、CTAB法、尿素提取法及以硅胶滤膜为基质的离心柱吸附等。缺点在于：步骤繁琐，耗时比较长，对实验室的设备要求比较高，很难在田间实地、海关检测、条件落后的发展中国家应用。

其次缺乏稳定Foc TR4的鉴定标记，现有TR4标记均根据Foc看家基因的个别SNP标记设计的，容易受到PCR退火温度的影响，出现假阳性的几率比较高。

根据现今存在的问题，研发一种在田间、常温操作的香蕉枯萎病菌热带4号小种可视化检测技术体系，用以延缓Foc TR4扩散成为亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种香蕉枯萎病热带4号小种Foc TR4鉴定的PCR特异性引物。

本发明所采取的技术方案是：

本发明第一方面，提供了一种检测Foc TR4的基因标记物，所述基因标记物为FOIG_16557。

根据本发明的实施例，所述香蕉枯萎病菌为Foc TR4。

现有技术中，Foc TR4的分子标记均根据Foc看家基因上面的SNP变异位点设计的，特别依赖于扩增温度，当退火温度出现变化时，有时会出现非特异性的扩增。但是，本发明根据Foc TR4的特异致病功能基因FOIG_16557的序列，研发的Foc TR4特异的分子标记，该分子标记是特异的，不会因为扩增过程中退火温度的变化，出现非特异性的扩增。

本发明第二方面，提供了用于扩增前面所述基因标记物FOIG_16557的引物对，引物对核苷酸序列为：

F：5’-ATTAGTGGGTCGTGTCAAGAC-3’；

R：5’-Biotin-ACAGGAAAAATATTCCGGACG-3’。

本发明第三方面，提供了用于扩增前面所述基因标记物FOIG_16557的探针，探针如下：5’-6-FAM-TTAGTGGGTCGTGTCAAGACCAGGCAACGAG-dspacer-GCGATCTATTGTGGGA-3`ddC-3’。

本发明第四方面，提供了前面所述基因标记物FOIG_16557在制备检测或辅助检测香蕉枯萎病菌试剂中的应用。

本发明第五方面，提供了一种检测Foc TR4的试剂盒，所述试剂盒包括前面所述基因标记物、前面所述引物对和前面所述探针。

本发明第六方面，提供了一种检测Foc TR4的方法，包括以下步骤：

1)提取香蕉组织的基因组DNA；

2)以步骤1)基因组DNA作为模板，使用前面所述引物对和前面所述探针进行RPA扩增；

3)结果判定：根据扩增产物判断是否含有香蕉枯萎病菌Foc TR4。

根据本发明的实施例，步骤1)所述香蕉组织为叶片、假茎或根系。

根据本发明的实施例，步骤2)RPA扩增温度：30～42℃孵育20～30min。

根据本发明的实施例，步骤2)RPA扩增体系：Primer Free Rehydration buffer29.5μl、10μM上游引物F 2.1μl、10μM下游引物R 2.1μl、探针0.6μl、模板基因组DNA 1μl、双蒸水12.2μl。

根据本发明的实施例，步骤3)结果判定：采用侧向流动试纸条检测扩增产物，若试纸条质控线和检测线显色，待测样品含有香蕉枯萎病菌Foc TR4；若试纸条质控线显色且检测线未显色，待测样品不含有香蕉枯萎病菌Foc TR4。

本发明第七方面，提供了一种装置，所述装置用于提取含有上述基因标记物的基因组DNA。

本发明提供了一种含有硅胶滤膜的抽提式的过滤吸附装置，所述过滤吸附装置包括柱体(粗过滤和吸附柱)、螺旋盖、滤膜、压圈、密封圈、注射器。

根据本发明的实施例，所述过滤吸附装置还包括核酸吸附的硅胶膜。

根据本发明的实施例，滤膜为软聚乙烯STPE(Soft polyethylene)或者硬聚乙烯HDPE(Hard polyethylene)；所述滤膜孔径为5μm、10μm，也可以根据需要定制其它孔径。

根据本发明的实施例，核酸吸附膜材质为硅胶膜(silica membrane)，孔径为1μm，也可以根据需要定制其它孔径。

本发明第八方面，提供了利用上述过滤吸附装置提取基因组DNA的方法：

1.破碎裂解样品；

2.将样品加到装置的粗过滤柱，注射过滤，滤液转移到新管，滤液中加入异丙醇、乙酸钠混匀静置；

3.将样品加到装置的吸附柱体，注射过滤弃废液；将柱体转移新管，漂洗液A、漂洗液B各冲洗一次，静置后加水洗脱，静置即得基因组DNA。

本发明第九方面，提供了一种抽提式基因组DNA快速提取试剂盒，包括前面所述含有硅胶滤膜的抽提式的过滤吸附装置。

根据本发明的实施例，还包括研磨缓冲液、尿素提取液、异丙醇溶液、乙酸钠溶液、漂洗液A和漂洗液B，余量为水。

本发明的有益效果是：

本发明公开了检测香蕉枯萎病菌Foc TR4的基因标记物基因FOIG_16557特异序列，Foc TR4/香蕉基因组DNA快速提取方法，以及结合PRA扩增和侧向流动试纸条，2-3min内即可获知样品是否存有Foc TR4。本发明还公开了一种含有硅胶滤膜的抽提式的过滤吸附装置，通过利用硅胶膜对基因组DNA的吸附作用，可以在田间常温、不使用离心机的情况下对Foc TR4/香蕉基因组DNA快速提取，提取过程仅需要10min，快速方便，仪器设备要求不高。

附图说明

图1是Foc TR4特异分子标记的扩增结果，图中泳道1-22分别对应着表1的模板1-22。

图2是本发明提取的香蕉叶片基因组DNA，其中1号泳道为本方法提取的香蕉叶片基因组DNA，2号泳道为阳性对照，3号泳道为阴性对照。

图3为Foc TR4基因组DNA，1-5号泳道分别为本方法所提的Foc TR4基因组DNA、阳性对照和阴性对照。

图4是含有硅胶滤膜的抽提式过滤吸附装置的柱体结构图。

图5是基因组DNA过滤和结合装置的组装过程。

图6为真菌Foc TR4的检测结果，其中泳道1为实验样品，2为阳性对照，3为阴性对照，C为质控线，T为检测线。

图7为接种不同类型香蕉枯萎病菌的香蕉苗根系检测结果，A-E分别是空白对照、FocTR4、FocRace1、FocSTR4、FocRace2。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。

实施例1 Foc TR4特异分子标记的验证

(1)Foc TR4特异基因和分子标记扩增引物的预测和合成

利用比较基因组学技术分析Foc TR4个生理小种、24个营养亲和群VCGs的基因组序列，筛选发现：FOIG_16557(Gene ID:42041802)是Foc TR4的特异基因。

根据基因序列设计出特异性强、灵敏度高的引物对：

上游引物F：5’-ATTAGTGGGTCGTGTCAAGAC-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物R：5’-ACAGGAAAAATATTCCGGACG-3’(SEQ ID NO.2).

同时对Foc TR4致病相关的基因TEF-1α-TR 4(Gene ID:MK754141.1)、XJZ2(GeneID:JX090598.1)及其特异性引物进行筛选。基因TEF-1α-TR 4(Gene ID:MK754141.1)特异性引物对：

上游引物F：5’-ACGTTTAAGGTG CCATGAGAG-3’(SEQ ID NO.3)；

下游引物R：5’-CCTCGTGAGCCACTTTTTAT-3’(SEQ ID NO.4).

基因XJZ2(Gene ID:JX090598.1)特异性引物对：

上游引物F：5’-GCCGATGTCTTCGTCAGGTA-3’(SEQ ID NO.5)；

下游引物R：5’-CTGAGACTCGTGCTGCATGA-3’(SEQ ID NO.6)。

应用上面引物分别检测靶基因(FOIG_16557、TEF-1α-TR 4和XJZ2基因)，比较这些靶基因扩增效果。

结果发现，只有Foc TR4植株能够成功扩增出FOIG_16557的特异序列，因此在检测Foc TR4时，FOIG_16557的该特异序列作为扩增片段会比TEF-1α-TR 4和XJZ2基因的特异性更高。

(2)Foc菌株的培养及基因组DNA的提取

将发明人存有的22个VCG菌株(表1)在PDA平板活化后，再利用PDB液体培养基进行培养，按照常规方法提取菌株的基因组DNA。

表1 22个VCG菌株的信息

(3)扩增反应

PCR扩增反应体系：2×Taq Master Mix 25μl、上游引物F(10μM)和下游引物R(10μM)各1μl、模板基因组DNA1μl、双蒸水补足50μl。

PCR扩增反应：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸15s，循环35次；72℃延伸5min。

(4)扩增结果分析

扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示：本发明PCR引物对上游引物F和下游引物R对Foc TR4特异性极强，仅仅在Foc TR4菌株中(VCG0121、01213和01216)有扩增产物(图1)。

实施例2一种抽提式基因组DNA快速提取试剂盒

抽提式基因组DNA快速提取试剂和仪器：

1.电动组织研磨器(定速型，10000rpm)和研磨杵(锥形头，PP，蓝色，研磨头外径6.2mm，研磨头长度9.5mm，长度70mm)；

2.粗过滤柱(Filter column，软PE过滤器10μm)、吸附柱(内含4层硅胶膜)和20ml注射器；

3.研磨缓冲液，所述研磨缓冲液的配方为：50mM Tris[pH 8.0],150mM NaCl,2％PVP,1％Tween-20；

4.尿素提取液，所述尿素提取液的配方为：7mol/L Urea、50mmol/L Tris-HCl pH8.0、62.5mmol/L NaCl、1％SDS；

5.异丙醇溶液和3M乙酸钠溶液(PH＝5.2)；

6.漂洗液A由70％乙醇组成；

7.漂洗液B由无水乙醇组成；

8.洗脱液C：双蒸水。

基因组DNA快速提取的方法：

(一)香蕉叶片基因组DNA快速提取

1、香蕉叶片细胞的破碎和裂解：

称取100mg新鲜的香蕉叶片置于1.5ml的空的离心管中，加入0.2g的二氧化硅粉末和200μl研磨缓冲液，用手持电动组织研磨器充分研磨样品，研磨时间约2min；然后加入1ml的尿素提取液，将样品进行裂解，时间为2min。

2、过滤、沉淀

将加入了尿素提取液的样品混合液加入到粗过滤柱中，连接好注射器-螺旋盖-柱体，利用注射器推杆，将液体推至2ml的离心管中。向过滤后的液体中加入700μl的异丙醇，摇匀，再加入200μl的3M乙酸钠溶液(pH＝5.2)，摇匀后静置2min。

3、香蕉叶片基因组DNA吸附、漂洗、洗脱

将混合液加入到吸附柱体(Binding column，内含4层硅胶膜)中，连接好注射器-螺旋盖-柱体，利用注射器推杆，将废液推注至废液桶中。将柱体(Binding column)放置到2ml无盖收集管中，加入1ml漂洗液A，利用注射器推杆将液体推出，弃掉滤液。再加入1ml漂洗液B，利用注射器推杆将液体推出，弃掉滤液；最后取出柱体常温下放置10-15min让乙醇挥发干净，将柱体放置到1.5ml干净的收集管中，加50μl洗脱液C，室温静置1min，然后利用注射器推杆将液体推出，得到基因组DNA溶液；

4、香蕉叶片基因组DNA的验证

检测香蕉的ACTIN基因的通用引物：

ACTIN-F:5’-TGTTGCATCCTGGTACTGCT-3’(SEQ ID NO.7)；

ACTIN-R:5’-GGCTTTCTTGCACTGGTACAC-3’(SEQ ID NO.8).

PCR反应体系：2×Taq Master Mix 25μl、ACTIN-F(10μM)1μl、ACTIN-R(10μM)1μl、模板叶片基因组DNA1μl、双蒸水补足50μl。

PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸15s，循环35次；最后72℃延伸5min。

扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示：采用本发明快速提取的香蕉基因组DNA的方法，能够扩增出单一的、清晰的约112bp的条带，见图2。本发明的DNA提取的方法提取的基因组DNA能够用于后续的分子实验。

(二)Foc TR4基因组DNA的快速提取

1、Foc TR4细胞的破碎和裂解：

吸取200μl Foc TR4菌液(菌液孢子浓度大于10⁴/L)置于1.5ml的空的离心管中，加入0.2g的二氧化硅粉末和200μl研磨缓冲液；用手持电动组织研磨器充分研磨样品，研磨时间约为2min；然后加入1ml的尿素提取液，将样品进行裂解，时间为2min。

2、过滤、沉淀

将加入了尿素提取液的样品混合液加入到粗过滤柱(Filter column，软PE过滤器10μm,)中，连接好注射器-螺旋盖-柱体，利用注射器推杆，将液体推至2ml的离心管中。向过滤后的液体中加入700μl的异丙醇，摇匀，再加入200μl的3M乙酸钠溶液(pH＝5.2)，摇匀后静置2min。

3、Foc TR4基因组DNA吸附、漂洗、洗脱

将混合液加入到吸附柱体(Binding column，内含4层硅胶膜)中，连接好注射器-螺旋盖-柱体，利用注射器推杆，将废液推注至废液桶中。将柱体(Binding column)放置到2ml无盖收集管中，加入1ml漂洗液A，利用注射器推杆将液体推出，弃掉滤液。再加入1ml漂洗液B，利用注射器推杆将液体推出，弃掉滤液；最后取出柱体常温下放置10-15分钟让乙醇挥发干净，将柱体放置到1.5ml干净的收集管中，加50μl洗脱液C，室温静置1分钟，然后利用注射器推杆将液体推出，得到基因组DNA溶液。

4、Foc TR4基因组DNA的验证

根据Foc TR4 ACTIN基因合成通用引物：

F:5’-ATG GGT AAG GARGAC AAG AC-3’(SEQ ID NO.9)

R:5’-GGARGT ACC AGT SAT CAT GTT-3’(SEQ ID NO.10)

PCR反应体系：2×Taq Master Mix 25μl、F引物、R引物(10μM)各1μl、模板DNA1μl、双蒸水补足50μl。

PCR反应条件：：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s循环35次；最后72℃延伸5min。

扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳结果显示采用本发明快速提取的Foc TR4 DNA能扩增出单一的、清晰的约700bp的条带，见图3。

实施例3

一种含有硅胶滤膜的抽提式过滤吸附装置，该装置包括柱体、螺旋盖、滤膜、压圈、密封圈、注射器(如图4和图5)。过滤膜为软聚乙烯STPE(Soft polyethylene)或者硬聚乙烯HDPE(Hard polyethylene)，常规孔径为5μm、10μm，也可以根据需要定制其它孔径；核酸吸附膜材质为硅胶膜(silica membrane)，常规孔径为1μm，也可定制其它孔径。

实施例4田间香蕉枯萎病植株的鉴定

1、香蕉根部组织的破碎和裂解：

取约100mg的香蕉根部组织置于1.5ml的离心管中，加入0.2g的二氧化硅粉末和200μl研磨缓冲液，用手持电动组织研磨器充分研磨样品，研磨时间约2min；然后加入1ml的尿素提取液，将样品进行裂解，时间为2min。

2、过滤、沉淀

将加入了尿素提取液的样品混合液加入到粗过滤柱中，连接好注射器-螺旋盖-柱体，利用注射器推杆，将液体推至2ml的离心管中。向过滤后的液体中加入700μl的异丙醇，摇匀，再加入200μl 3M乙酸钠溶液(pH＝5.2)，摇匀后静置2min。

3、基因组DNA吸附、漂洗、洗脱

将混合液加入到吸附柱体(Binding column，内含4层硅胶膜)中，连接好注射器-螺旋盖-柱体，利用注射器推杆，将废液推注至废液桶中。将柱体(Binding column)放置到2ml无盖收集管中，加入1ml漂洗液A，利用注射器推杆将液体推出，弃掉滤液。再加入1ml漂洗液B，利用注射器推杆将液体推出，弃掉滤液；最后取出柱体常温下放置10-15分钟让乙醇挥发干净，将柱体放置到1.5ml干净的收集管中，加50μl洗脱液C，室温静置1分钟，然后利用注射器推杆将液体推出，得到基因组DNA溶液；

4、TR4基因组DNA的验证

根据Foc TR4常规PCR检测的特异性引物对合成适用于RPA反应的引物对和探针：

F:5’-ATTAGTGGGTCGTGTCAAGAC-3’(SEQ ID NO.11)

R:5’-Biotin-ACAGGAAAAATATTCCGGACG-3’(SEQ ID NO.12)

探针：5’-6-FAM-TTAGTGGGTCGTGTCAAGACCAGGCAACGAG-dspacer-

GCGATCTATTGTGGGA-3`ddC-3’(SEQ ID NO.13)

Biotin又名生物素(Biotin)，是一种非放射性标记物。

RPA反应体系：Primer Free Rehydration buffer 29.5μl、正、反向引物(10μM)各2.1μl、探针0.6μl、模板基因组DNA 1μl，双蒸水12.2μl。

RPA反应体系混匀后转移至反应微球中，吹打均匀，然后加入2.5μl的280mMMgOAc，再次将液体混合充分，在恒温仪中40℃孵育20min。如果模板拷贝数较低，4min后取出离心管，通过枪头吹打液体使反应液混匀，然后放回到40℃的恒温仪中。

取5μl RPA反应产物与95μl PBST电泳缓冲液混合，将试纸条末端样本垫放入混合液中检测。采用侧向流动试纸条(Milenia的Genline Hybridetect-1试纸条)检测扩增产物。

结果判定：若试纸条质控线和检测线显色，待测样品有枯萎病菌Foc TR4；若试纸条质控线显色且检测线未显色，待测样品无枯萎病Foc TR4。图6结果显示，红色的检测线表明有扩增产物产生，说明在香蕉的根部组织中存在真菌Foc TR4。

对比例温室接种样品的检测

将Foc Race 1(VCG0123)、Foc Race 2(VCG0128)、Foc TR4(VCG0121)、Foc STR4(VCG0120)于PDB培养基中28℃震荡培养4d后，经Miracloth过滤后，收集孢子悬液。稀释至浓度为1×10⁶个孢子/ml的孢子悬浮液，备用。

在温室中选5-6叶期健康巴西蕉苗种植于蛭石、泥炭和椰糠(3：1：1)的混合基质(经高温灭菌)上。将待测菌株拌匀至混合基质中，使其孢子终浓度为5000个孢子/g土壤。每个菌株接种10株粉蕉苗。生长5周后观察整体的发病情况，统计其病情指数和发病率，按照本发明实施例的方法提取香蕉根系基因组DNA以及检测是否具有Foc TR4。结果发现，除了Foc TR4质控线和检测线均显色外，其他处理样品只有质控线显色。说明本发明的引物对以及探针对于Foc TR4特异性强，见图7。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院果树研究所

<120> 一种可以在田间、常温操作的香蕉枯萎病菌热带4号小种可视化检测技术体系

<130>

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

attagtgggt cgtgtcaaga c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acaggaaaaa tattccggac g 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acgtttaagg tgccatgaga g 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cctcgtgagc cactttttat 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gccgatgtct tcgtcaggta 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctgagactcg tgctgcatga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgttgcatcc tggtactgct 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggctttcttg cactggtaca c 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgggtaagg argacaagac 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggargtacca gtsatcatgt t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

attagtgggt cgtgtcaaga c 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

acaggaaaaa tattccggac g 21

<210> 13

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttagtgggtc gtgtcaagac caggcaacga ggcgatctat tgtggga 47

Claims

1.一种检测香蕉枯萎病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)采用过滤吸附装置提取香蕉组织的基因组DNA；

2)以步骤1)基因组DNA作为模板，使用引物对和探针进行RPA扩增；

3)结果判定：根据扩增产物判断是否含有香蕉枯萎病菌Foc TR4；

所述引物对的核苷酸序列为：

F：5’-ATTAGTGGGTCGTGTCAAGAC-3’；

R：5’-Biotin-ACAGGAAAAATATTCCGGACG-3’；

所述探针为：

5’-6-FAM-TTAGTGGGTCGTGTCAAGACCAGGCAACGAG-dspacer-GCGATCTATTGTGGGA-3`ddC-3’；

所述装置由柱体、螺旋盖、滤膜、压圈、密封圈、注射器组成；所述柱体包括粗过滤柱和吸附柱；所述粗过滤柱为10μm软PE过滤器，所述吸附柱内含4层硅胶膜；

步骤2)RPA扩增的条件：30-42℃孵育20-30min；步骤2)RPA扩增的体系：Primer FreeRehydration buffer 29.5μL、10μM上游引物F 2.1μL、10μM下游引物R 2.1μL、探针0.6μL、模板基因组DNA1μL、双蒸水12.2μL；

步骤3)结果判定：采用侧向流动试纸条检测扩增产物，若试纸条质控线和检测线显色，待测样品含有香蕉枯萎病菌Foc TR4；若试纸条质控线显色且检测线未显色，待测样品不含有香蕉枯萎病菌Foc TR4。