CN102965271A - 一种木材中松材线虫核酸快速提取装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种木材中松材线虫核酸快速提取装置，包括相互配合使用的木材收集装置和核酸速提装置；所述的木材获取装置包括收集器、钻头和电钻；所述的核酸速提装置包括注射器、过滤器、吸附柱和吸头，在吸附柱内设吸附膜；在收集木屑时，所述的钻头与电钻相连，所述的收集器设在钻头与待测木材之间；在所述的收集器下方设注射器；在提取核算时，所述的注射器先与吸头相连吸取裂解液，然后与过滤器、吸附柱和吸头依次连接提取核酸。该木材中松材线虫核酸快速提取装置，可以直接快速地提取样本中的核酸，提取过程无需使用离心机等仪器设备，节约了大量时间，简化了许多操作步骤，成本低，操作快，具有很好的实用性。

Description

一种木材中松材线虫核酸快速提取装置

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种木材中松材线虫核酸快速提取装置。

背景技术

目前检测松材线虫方法主要有以下几种：

（1）形态学鉴别法：将疑似染有松材线虫的木材用刀具劈开成小条状，然后将条状木材置于下部漏斗状玻璃容器中，在玻璃器皿的下部漏斗出口处套一根橡皮管，在管上加一弹簧夹夹紧，在玻璃容器中加水使木条浸满，静止数天，使松材线虫从木材中游离到水中并沉入到漏斗出口处，放开弹簧夹将底部含虫的水放入玻璃皿内，在显微镜下观察，以形态学特征诊断松材线虫。此法的最大缺点是，耗时长、效率低、形态学鉴别具有不确定性。在日本，Mamiya等早在1979年就提出了采用尾部的尾尖突来区分松材线虫和拟松材线虫，这也是目前两种线虫鉴别中的主要形态学依据。由于北美的松材线虫有些群体中的雌虫尾部也有尾尖突，因此从形态上要将两者正确区分开来对一些非专业从事植物线虫分类的人员是非常困难的。

（2）酶测定法：谷氨酸草酰乙酸转氨酶是可区分两种线虫的酶，松材线虫分泌的纤维素酶的谱带类型与拟松材线虫的纤维素酶的不同，酯酶同功酶和苹果酸脱氢酶谱，也可以区别松材线虫和拟松材线虫。由于酯酶的稳定性并不好，同一株系在不同菌上培养后也有变化。这可能与酶本身易受外界环境条件如培养线虫的条件(湿度和温度等) 、提取过程及提取物的贮藏条件、分析方法及线虫本身即线虫的各发育阶段或在某一阶段线虫的生理状况的影响有关。因此，酶虽然在密切相关的种类间保持着高度保守性，但由于上述因素，利用电泳分析线虫蛋白易导致结果的不稳定性。该方法复杂、繁琐、不稳定、特异性差，无实际应用价值。

（3）免疫学方法：主要有多克隆抗体和单克隆抗体技术，用多克隆抗体酶联免疫法测定，虽然EL ISA的敏感度高，但种间区分度并不好，这跟多克隆抗体的特异性差有关。用单克隆抗体方法在一些重要的植物寄生线虫的鉴定中已有成功先例，如Arjen Schots等应用单克隆抗体技术区分出马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(G.pallida)，其他如大豆孢囊线虫(Het2erodera glycines)和南方根结线虫(M. incog2nita)也有过单克隆抗体技术的应用。

（4）激素测定法：松材线虫与拟松材线虫产生的性外激素具有种特异性，即松材线虫或拟松材线虫只有各自的雌虫才能吸引各自相应的雄虫，这是各自雌虫释放性外激素引起的反应。因此可利用测定性外激素来区分两者。松材线虫与拟松材线虫产生的性外激素具有种特异性，即松材线虫或拟松材线虫只有各自的雌虫才能吸引各自相应的雄虫，这是各自雌虫释放性外激素引起的反应。因此可利用测定性外激素来区分两者。

（5）脂类测定方法：Krusberg等(1973)报道，南方根结线虫和花生根结线虫的成熟雌虫和卵的脂肪酸性质相同，但是两种线虫中某种脂肪酸的含量不同，因此可以以此来区分两种线虫。但目前尚未见有用脂类来区分松材线虫与拟松材线虫的报道，在这方面是否可行，也可进行一番尝试。

（6）核酸测定法：随着近几年分子生物学技术的迅猛发展，以DNA为基础的诊断，在线虫分类鉴定中的作用与日俱增，在许多植物线虫类群中已建立了较成熟的分子诊断系统。目前已经有比较成熟的PCR和RT-qPCR的试剂盒供应。

在核酸测定法中，从生物中提取核酸的方法甚多，目前提取核酸的方法主要有以下几种：

（1）有机提取法。基本原理：苯酚使蛋白变性，SDS裂解细胞膜，蛋白酶K和EDTA消化蛋白或多肽或小肽，核蛋白变性降解使DNA从核蛋白中游离出来。利用DNA易溶于水，不溶于有机溶剂的特性提取DNA。

（2）螯合树脂法。基本原理：以主要使用的螯合树脂chelex-100为例，其含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用。在低离子强度、碱性及煮沸下可以使细胞膜裂解，并使蛋白变性，DNA游离。

（3）无机提取法。基本原理：利用NaCI或醋酸钠沉淀蛋白，经离心，用无水乙醇沉淀提取DNA。

（4）差异裂解提取法。基本原理：利用某些生物样本的细胞膜易于破碎，另一些生物样本的细胞不容易破碎的特点，使用常规方法先去除易于破碎细胞，再用特殊试剂裂解不容易破碎细胞，再提取其中的DNA。

（5）磷酸盐缓冲液法。基本原理：细胞在含非离子去垢剂和蛋白酶K的溶液中消化后，高温加热使蛋白质及蛋白酶K失活，离心沉淀分离蛋白质，从离心上清液中提取DNA。

（6）甲酰胺解聚法。基本原理：甲酰胺可裂解DNA与蛋白质的复合物，又可变性沉淀释放的蛋白质，但对蛋白酶K的活性无显著影响。用高难度甲酰胺裂解染色质中DNA与蛋白质，然后用火棉胶袋进行充分透析去除蛋白酶K及有机溶剂。此法适合于构建高容量载体的基因组DNA文库及进行大片段的脉冲场凝胶电泳分析。

（7）玻璃棒缠绕法。基本原理：DNA会沉淀于细胞裂解液和乙醇的交界面，用带钩的玻璃棒将大片段DNA从无水乙醇中转移至PH8.0的TE液中。此法适用于构建基因文库，PCR扩增，适合于同时从不同细胞或组织标本中提取DNA。

（8）基于二氧化硅吸附提取核酸的方法。基本原理：利用二氧化硅吸附核酸的特性，生物体经异硫氰酸胍，roton X-100的Tris-HCl-EDTA处理后核酸与二氧化硅结合，再经含有异硫氰酸胍的Tris-HCl缓冲液和70%乙醇以及丙酮分别洗涤，最后用TE洗脱，获取核酸。

（9）玻璃纤维膜吸附法。基本原理：玻璃纤维膜具有与核酸可逆性结合的特点，生物体裂解液中的DNA在促吸附液的作用下与玻璃纤维膜结合，用去蛋白液去除玻璃纤维膜上吸附的蛋白及其他杂质，再用洗涤液再次清洗玻璃纤维膜上吸附的蛋白及其他杂质，最后用洗脱液将玻璃纤维膜上吸附的核酸洗脱下来。

（10）磁珠法。基本原理：利用硫氰酸胍等强烈蛋白变性剂，破坏细胞膜及核膜蛋白，释放DNA，并使核酸酶失活；然后加入磁珠通过表面的化学集团与DNA特异性吸附，而蛋白质等杂质不被吸附而留在容夜里；接着在磁场的作用下，磁性颗粒与液体分开，回收颗粒；最后再用纯水或TE洗脱吸附的DNA，在溶解液中进行DNA与磁珠的解离，将DNA重新溶出。

（11）硅胶膜吸附柱提取法。基本原理：硅胶模吸附柱法是采用特制的硅胶模吸附柱来选择性吸附裂解细胞释放的DNA，再经过洗涤和洗脱等简单程序，就可以获得高纯度DNA。

目前，国际上在核酸提取方面，已逐渐淘汰一些操作复杂和繁琐的方法。玻璃纤维膜吸附法和硅胶膜吸附柱提取法具有操作简便、容易获得高纯度DNA和RNA、可以通过调节吸附膜的厚度来适应提取不同量的核酸要求以及成本低廉等优点，因此已广泛应用于各种核酸测定试剂盒中。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种木材中松材线虫核酸快速提取装置，以使其具有高效、快速提取松材线虫核酸等优点。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种木材中松材线虫核酸快速提取装置，包括相互配合使用的木材收集装置和核酸速提装置；所述的木材获取装置包括收集器、钻头和电钻；所述的核酸速提装置包括注射器、过滤器、吸附柱和吸头，在吸附柱内设吸附膜；在收集木屑时，所述的钻头与电钻相连，所述的收集器设在钻头与待测木材之间；在所述的收集器下方设注射器；在提取核算时，所述的注射器先与吸头相连吸取裂解液，然后与过滤器、吸附柱和吸头依次连接提取核酸。

所述的收集器为左右两端开口、下端开口的T型三通收集器。

所述的钻头，采用木材开孔钻头，其前部直径为10~40mm可选。

所述的电钻为手控无级变速的手持式电钻，采用锂电池供电。

所述的吸附膜的材料选自玻璃纤维膜、硅胶膜；吸附膜的厚度0.1~10mm。

所述注射器的容量在1~100mL范围内。

所述过滤器为用塑料制成含有上、下接头的中空圆形容器，上接头与注射器头相连接，下接头与吸附柱相连接，在圆形容器内放置过滤膜。

所述后过滤器的内径为5~50mm。

所述过滤器中过滤膜选自混合纤维膜、醋酸纤维膜、硝酸纤维膜、尼龙膜、聚醚砜膜或玻璃纤维膜；过滤膜的厚度为0.1~10mm，过滤膜的孔径为0.1~10um。

在所述吸附柱内壁、吸头内壁上均涂有硅油。

本发明的木材中松材线虫核酸快速提取装置，使用电钻和取木钻头，通过木材收集装置直接将木材收集于注射器内，然后用注射器直接吸取松材线虫裂解液加温，使松材线虫裂解释放出核酸。含有核酸的裂解液可以直接通过连接于注射器上的过滤器中的滤膜，有效地滤除样本中的颗粒和杂质，而核酸不被滤膜吸附。通过过滤器后的液体继续直接通过同时连接于过滤器上的核酸吸附柱，液体中的核酸被吸附柱中的吸附膜吸附，通过清洗，最后用洗脱液将核酸洗脱进行扩增与检测。

有益效果：与现有技术相比，本发明的木材中松材线虫核酸快速提取装置，可以直接快速地提取样本中的核酸，提取过程无需使用离心机等仪器设备，节约了大量时间，简化了许多操作步骤，成本低，操作快，具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。

附图说明

图1是木材收集装置的结构示意图；

图2是核酸速提装置的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图进一步阐明本发明，本具体实施方式在以本发明技术方案为前提下进行实施，应理解这些方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

如图1和图2所示，木材中松材线虫核酸快速提取装置，包括木材收集装置和核酸速提装置。木材获取装置包括收集器11、钻头12和电钻13。核酸速提装置包括依次相连的注射器21、过滤器22、吸附柱23和吸头25，在吸附柱23内设吸附膜24。收集器11为左右两端开口、下端开口的T型三通收集器；钻头12，采用木材开孔钻头，其前部直径为10~40mm可选；电钻13为手控无级变速的手持式电钻，采用锂电池供电；注射器21与收集器11下端开口相连。注射器21的容量在1~100mL范围内。过滤器22为用塑料制成含有上、下接头的中空圆形容器，上接头与注射器21头相连接，下接头与吸附柱23相连接，在圆形容器内放置过滤膜，过滤膜选自混合纤维膜、醋酸纤维膜、硝酸纤维膜、尼龙膜、聚醚砜膜或玻璃纤维膜；过滤膜的厚度为0.1~10mm，过滤膜的孔径为0.1~10um；过滤器22的内径为5~50mm。吸附膜24的材料选自玻璃纤维膜、硅胶膜；吸附膜的厚度0.1~10mm。在吸附柱23内壁、吸头25内壁上均涂有硅油。

使用时，首先确定被检木材15，用T型样本收集器11上部的开口端紧贴木材15表面，收集器11下端连接注射器21，然后用装有钻头12的电钻13穿过收集器11上部，手指按动电钻开关钻取木屑，木屑会自动流入注射器21内。手指按电钻开关的控制松紧度可以随意调节电钻的速度，控制电钻钻头与木材间的压力，可以得到粗细不同的木屑。

将含有木屑样本的注射器21头部装上吸头25，根据木屑的量吸取不同量的裂解液(TES+蛋白酶K)，进行加温65℃裂解30min。然后将吸头25去掉，将过滤器22装在注射器21头部，再将核酸吸附柱23连接在过滤器22上。使注射器21、过滤器22和吸附柱23连成一体。然后用手推动注射器针杆，把木屑中的裂解液推入过滤器22，并经过过滤器22进入吸附柱23，最后将裂解液推出弃去。经过此过程，木屑中的松材线虫被裂解释放出DNA，裂解液中的杂质通过过滤器22被滤去，而裂解液中的DNA可以通过过滤器被吸附柱23中的吸附膜24吸附，再将注射器21和过滤器22脱去，用清洗液（75%乙醇）清洗吸附膜24进一步出去杂质，最后用核酸洗脱液（1×TE）将吸附膜24中的DNA洗脱收集到有盖的离心管内，供扩增使用。

Claims (10)

1.一种木材中松材线虫核酸快速提取装置，其特征在于：包括相互配合使用的木材收集装置和核酸速提装置；所述的木材获取装置包括收集器（11）、钻头（12）和电钻（13）；所述的核酸速提装置包括注射器（21）、过滤器（22）、吸附柱（23）和吸头（25），在吸附柱（23）内设吸附膜（24）；在收集木屑时，所述的钻头（12）与电钻（13）相连，所述的收集器（11）设在钻头（12）与待测木材（15）之间；在所述的收集器（11）下方设注射器（21）；在提取核算时，所述的注射器（21）先与吸头（25）相连吸取裂解液，然后与过滤器（22）、吸附柱（23）和吸头（25）依次连接提取核酸。

2.根据权利要求1所述的木材中松材线虫核酸快速提取装置，其特征在于：所述的收集器（11）为左右两端开口、下端开口的T型三通收集器。

3.根据权利要求1所述的木材中松材线虫核酸快速提取装置，其特征在于：所述的钻头（12），采用木材开孔钻头，其前部直径为10~40mm可选。

4.根据权利要求1所述的木材中松材线虫核酸快速提取装置，其特征在于：所述的电钻（13）为手控无级变速的手持式电钻，采用锂电池供电。

5.根据权利要求1所述的木材中松材线虫核酸快速提取装置，其特征在于：所述的吸附膜（24）的材料选自玻璃纤维膜、硅胶膜；吸附膜的厚度0.1~10mm。

6.根据权利要求1所述的木材中松材线虫核酸快速提取装置，其特征在于：所述注射器（21）的容量在1~100mL范围内。

7.根据权利要求1所述的木材中松材线虫核酸快速提取装置，其特征在于：所述过滤器（22）为用塑料制成含有上、下接头的中空圆形容器，上接头与注射器（21）头相连接，下接头与吸附柱（23）相连接，在圆形容器内放置过滤膜。

8.根据权利要求1或7所述的木材中松材线虫核酸快速提取装置，其特征在于：所述后过滤器（22）的内径为5~50mm。

9.根据权利要求1或7所述的木材中松材线虫核酸快速提取装置，其特征在于：所述过滤器（22）中过滤膜选自混合纤维膜、醋酸纤维膜、硝酸纤维膜、尼龙膜、聚醚砜膜或玻璃纤维膜；过滤膜的厚度为0.1~10mm，过滤膜的孔径为0.1~10um。

10.根据权利要求1所述的木材中松材线虫核酸快速提取装置，其特征在于：在所述吸附柱（23）内壁、吸头（25）内壁上均涂有硅油。

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