CN105802957A - 一种从煤层水样中提取微生物总dna的方法 - Google Patents

一种从煤层水样中提取微生物总dna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种从煤层水样中提取微生物总DNA的方法，属于煤层水样微生物分析。本发明要解决的技术问题是从成分复杂的煤层水样中提取微生物总DNA的方法。本发明方法包括以下步骤：煤层水样的预处理，通过离心去除大颗粒杂质，采用膜过滤的方式收集水样中的微生物；微生物细胞破碎，将收集好微生物的滤膜剪碎后重悬在缓冲液中，用珠磨器法破碎细胞，再用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠溶液在55℃孵育2h‑4h，至溶液澄清；微生物总DNA的纯化和沉淀，用酚‑氯仿法去除杂蛋白，加入异丙醇沉淀收集总DNA。本发明的总DNA提取方法适合于成分复杂的煤层水样及相关样品，细胞破碎效果好，提取的基因组纯度高、完整性好，可直接用于后续的宏基因组学分析、DGGE分析等。

Description

一种从煤层水样中提取微生物总DNA的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及从煤层水样中提取微生物总DNA的方法。
背景技术：
煤层气是成煤过程中生成的非常规天然气，是一种洁净的化石能源。据国际能源机构(IEA)估计，全世界煤层气资源量达263.8×1012m3，其中我国煤层气资源量约30×1012-36.81×1012m3，开发潜力巨大。煤层气的开发不仅可以改善我国能源以煤炭为主，石油供给不足的格局，而且有助于煤矿的安全开采，减少温室气体排放，改善大气环境。煤层气按其成因可分为生物成因气、热成因气或混合成因气。其中，生物成因气是以微生物为产气主体。近年来，美国、加拿大等国家在生物成气方面开展的大量研究，其中，解析产气微生物群落的结构有助于掌握功能微生物的类型，为实现调控微生物成气奠定理论基础。我国目前也在煤层气生物成气方面开展了一些工作，鉴于煤层微生物中存在大量极端且不可培养的微生物，常规分离培养等分析方法无法确定微生物的种类与丰度。宏基因组学、分子指纹图谱技术等免培养技术的发展，为揭开不可培养微生物的神秘面纱提供了技术支撑。因此，高质量的微生物基因组提取方法成为决定数据准确全面的关键。由于煤层水样组成复杂，水样中除了含有煤颗粒外，还存在大量理化性质复杂的物质，目前还没有一种适合煤层水样中微生物基因组高效提取的方法。
当前煤层水样品中微生物总DNA的提取多数采用试剂盒法，但是并没有针对煤层水样品的专用试剂盒，由于样品中腐殖酸、吸附性颗粒等杂质的影响，采用高温及化学法来破壁的试剂盒的缺陷在于菌体细胞破碎并不彻底。已经公布的类似的基因组提取专利，如中国专利《一种煤层水中微生物多样性和物种丰度的分析方法》(申请号：201410186729.2)，中国专利《一种煤层气田地下水微生物检测方法》(申请号：201110005095.2)，其中涉及DNA提取的方法采用的是试剂盒法，而中国专利《煤矿酸性矿井水底泥DNA提取方法》(申请号：200810231369.8)，中国专利《一种矿区环境样品微生物基因组DNA与总RNA同时提取的方法》(专利号：CN103642798A)，由于样品性质和组成与煤层水样有较大差异，上述方法并不适用于煤层水样中的微生物基因组的提取。因此，开发适合于煤层水样中微生物总DNA的提取方法对于研究煤层气田微生物群落结构与丰度具有重要意义。
发明内容：
本发明的目的是针对上述现有技术的不足，建立一种适合从成分复杂的煤层水样中高效提取微生物的总DNA的方法，解决基因组提取过程中细胞破碎的关键步骤，采用珠磨器机械破碎、化学破碎与酶消化相结合的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
一种从煤层水样中提取微生物总DNA的方法，包括如下步骤：
1)煤层水样的预处理：取煤层水样10-20mL通过低速离心去除大颗粒杂质，收集上清液，采用抽滤的方式将水样中的微生物收集到滤膜上，将滤膜剪碎后置于STE缓冲液中，待用；所述STE缓冲液组成包括：NaCl 0.1-0.2g/L，Tris-HCl 20-40mmol/L，EDTA 0.3-0.6mol/L，溶剂为ddH2O；
2)微生物细胞的破碎：将含有滤膜的缓冲液移入含有玻璃珠的预冷螺旋帽管中，用珠磨器对细胞进行破碎，重复2-3次，重复过程中将上清液移至离心管后，再向螺旋帽管加满STE缓冲液，将所有上清液合并，加入蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液，充分混匀后置于55℃水浴锅内孵育2-4h；
3)微生物DNA的抽提、纯化及沉淀：向孵育后的液体中加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，11000-13000×g离心10-30min，取上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液抽提，除去酚类物质和脂类物质，11000-13000×g离心10-30min，收集上清液，加入1-2倍体积的异丙醇，于-20℃低温沉淀1-2h，用预冷的75％乙醇洗涤沉淀，11000-13000×g离心10-30min，弃上清，室温放置至乙醇挥发完全后，加入50-150μL的TE缓冲液溶解沉淀，溶解后加入RNaseA去除RNA，得到微生物基因组总DNA。
其中，步骤1)所述去通过低速离心去除大颗粒杂质，离心转速为1000-2500×g，离心时间为5-10min。
其中，步骤1)所述滤膜置于的STE缓冲液的体积为5-10mL。
其中，步骤1)所述采用抽滤方式将水样中的微生物收集到滤膜上，滤膜孔径为0.22μm。
其中，步骤2)玻璃珠的添加量为0.6-0.8g，玻璃珠直径为0.3mm。
其中，步骤2)所述珠磨器转速为1500-3500rpm，破碎时间15-45s。
其中，步骤2)所述蛋白酶K的终浓度为20-50mg/mL，SDS的质量体积比为5％-10％。
其中，步骤1)所述的煤层水样可以用煤炭厌氧发酵液替代。
本发明所述方法从煤层水样和煤炭厌氧发酵液中提取得到的微生物总DNA，浓度和纯度较高，经检测微生物总DNA的完整性较好，可直接用于宏基因组高通量测序和DGGE分析。
与现有技术相比本发明的有益效果：
1.本发明的微生物总DNA提取方法适用于煤层水样、煤炭厌氧发酵液等。
2.本发明的方法采用低速离心去除煤层水样中的大颗粒杂质，根据样品特点，使用珠磨器机械振荡破碎、化学法和酶消化的方法高效地实现了微生物总DNA的提取，得到的基因组的完整性较好，纯度和浓度较高，所需试剂均可从公司直接购买。
3.本发明所述的DNA提取方法适合于从煤层水样中提取出古菌和细菌的总基因组，通过珠磨器法可以快速高效地完成微生物细胞的破壁，化学法和酶消化法有助于去除杂蛋白、腐殖酸等杂质。本方法提取得到的总DNA片段完整性较好、纯度高，可直接用于后续的宏基因组学分析、DGGE(变性梯度凝胶电泳)分析和PCR(聚合酶链式反应)扩增。
附图说明：
图1为本发明方法提取的煤层水样微生物总DNA琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道M为DNAmarkerλDNA-HindⅢ，泳道1为煤层水样微生物总DNA。
图2为某公司试剂盒提取煤层水样总DNA的琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道M为DNAmarkerλDNA-HindⅢ，泳道1-3分别为三个不同煤层水样中总DNA的提取结果。
图3为本发明方法提取的煤层水样和煤炭厌氧发酵后的水样微生物总DNA琼脂糖凝胶电泳图；其中M为DNA markerλDNA-HindⅢ，泳道1和2为煤层水样微生物总DNA，泳道3和4为煤炭厌氧发酵后的水样微生物总DNA。
图4为煤层水样提取DNA扩增细菌16S rDNA片段琼脂糖电泳图；其中泳道1和2为本发明方法提取的微生物总DNA扩增得到的细菌16S rDNA片段，泳道3和4为公司试剂盒提取的微生物总DNA扩增得到的细菌16S rDNA片段。
图5为不同方法提取煤层水样中微生物总DNA扩增古菌16S rDNA片段的琼脂糖电泳图；其中泳道1-3为公司试剂盒提取的微生物总DNA扩增得到的古菌16S rDNA片段，泳道4-7为本发明方法提取的微生物总DNA扩增得到的古菌16S rDNA片段。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明中所涉及的试剂和耗材均需要高压灭菌(如121℃灭菌15-20min)。
实施例1
(1)取15mL煤层水样于1500×g离心5min，收集上清液于血清瓶中，采用抽滤方式将水样中的微生物收集到滤膜上，然后将滤膜弄成碎片放入5mL STE缓冲液中(NaCl 0.12g，20mM Tris-HCl 10mL，0.5M EDTA 40μL，ddH2O 9960μL，至终体积为20mL)，移入装有预冷的含0.6g直径0.3mm玻璃珠的螺旋帽管中。
(2)用珠磨器Mini-Bead Beater(MBB)破碎，2500rpm运行30s，然后将螺旋帽管在冰上静置，取上清液移至新的2mL Ep管中，再次用STE充满螺旋帽管，运行2500rpm、30s，冰上静置，并与第一次的上清液合并。
(3)加入24μL的蛋白酶K(20mg/mL)和216μL 10％SDS在55℃水浴中继续对菌体进行裂解消化3h。
(4)向步骤(3)裂解液中加入1mL的酚-氯仿-异戊醇混合液，上下混匀，12000×g离心15min，取上清液至新的Ep管中。
(5)加入900μL氯仿-异戊醇混合液抽提，上下混匀，12000×g离心10min，取上清液至新的Ep管中。
(6)在上清中加2mL预冷的异丙醇沉淀DNA，将Ep管上下颠倒混匀11000×g离心5min取沉淀。
(7)用75％的乙醇洗涤DNA两次，每次1mL，12000×g离心5min，然后置于37℃金属浴干燥沉淀，时间为1h。
(8)用80μL TE溶解DNA沉淀，60℃温浴溶解1.5h，随后将产物置4℃过夜充分溶解，溶解后加RNase A以消除RNA的污染。
(9)用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测基因组的大小和完整性(如图1所示)，并用Nandrop测其浓度，以验证其质量和纯度(结果见表1)。可以看出本发明方法提取的微生物总DNA浓度高于试剂盒法，而OD260/280在1.8-2.0之间中，表明总DNA纯度较高，与试剂盒法一样具有较高的纯度。
表1本发明方法与试剂盒方法提取的总DNA浓度及纯度
实施例2
(1)收集菌体：分别取6mL煤炭厌氧发酵液置于入无菌Ep管中，用0.22μm膜过滤收集菌体。将膜剪碎后，取一部分滤膜置于2mL STE缓冲液中，移到装有约0.6g直径0.3mm含玻璃珠的预冷的螺旋帽管中，用本发明方法提取总DNA；另一部分含菌体的滤膜用某公司试剂盒提取总DNA，作为对照。
(2)用MBB破碎细胞，运行程序为2500rpm、30s，破碎后将螺旋帽管放在冰上静置，取上清液移至新的2mL Ep管中，再次用STE缓冲液充满螺旋帽管，2500rpm运行30s，将上清与第一次的上清液合并。
(3)加入18μL的蛋白酶K(20mg/mL)和180μL 10％SDS在55℃水浴中继续对菌体进行裂解消化2.5h。
(4)向步骤(3)裂解液中加入900μL的酚-氯仿-异戊醇混合液，上下混匀，12000×g离心15min，取上清液至新的Ep管中。
(5)加入800μL氯仿-异戊醇混合液抽提，上下混匀，12000×g离心10min，取上清液至新的Ep管中。
(6)在上清中加入1.5mL预冷的异丙醇沉淀DNA，将Ep管上下颠倒混匀11000×g离心5min取沉淀。
(7)用75％的乙醇洗涤DNA两次，每次1mL，12000×g离心5min，，然后置于37℃金属浴干燥沉淀，时间为1h。
(8)用100μL TE溶解DNA沉淀，60℃温浴1h，随后将产物置4℃过夜充分溶解；溶解后加RNase A以消除RNA的污染。
(9)用琼脂糖凝胶电泳验证本方法及试剂盒法提取基因组的大小和完整性(如图3所示)，并用Nandrop测定总DNA的质量和纯度(结果见表2)。可以看出本发明方法提取的微生物总DNA浓度高于试剂盒法，而OD260/280在1.8-2.0之间中，表明总DNA纯度与试剂盒法一样具有较高的纯度。
表2本发明方法与试剂盒方法提取的总DNA浓度及纯度
实施例3
以实施例1和2中提取的基因组为模板，分别扩增细菌16S rDNA基因V1-V3区和古菌16S rDNA基因V3-V4区片段，用于后续的高通量测序。PCR引物为细菌27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)/518R(ATTACCGCGGCTGCTGG)，PCR反应体系为50μL，包括基因组DNA 1μL，10×Easy Taq buffer 5μL，dNTPs(2.5mM)4μL，上下游引物(10μM)各2μL，Easy Taq Ploymerase 1μL，用ddH2O补至50μL，PCR扩增程序为95℃预变性5min，30个循环：95℃30s，55℃30s，72℃45s，72℃终延伸10min。PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，由于试剂盒方法提取的微生物总DNA质量一般，出现了扩增不出细菌16S rDNA片段的情况(泳道4)，而本发明方法提取的总DNA扩增细菌16S rDNA片段效果良好(泳道1和2)；古菌16S rDNA V3-V4区片段扩增采用巢式PCR，先用第一对通用引物21F(TTCCGGTTGATCCYGCCGGA)/958R(YCCGGCGTTGAMTCCAATT)，PCR反应体系与前面一致，PCR扩增程序为95℃预变性5min，30个循环：95℃30s，55℃45s，72℃1min，72℃终延伸10min。扩增获得的产物作为二次扩增的模板，用于扩增古菌16S rDNA V3-V4区，所用引物为344F(ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA)/0691R(GGATTACARGATTTCAC)，PCR反应体系为50μL，包括一次PCR产物2μL，10×Easy Taq buffer 5μL，dNTPs(2.5mM)4μL，上下游引物(10μM)各2μL，Easy Taq Ploymerase 1μL，PCR扩增程序为95℃预变性5min，30个循环：95℃30s，55℃30s，72℃45s，72℃终延伸10min。PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示。图5显示试剂盒提取的微生物总DNA有无法扩增出古菌16S rDNA片段的情况(泳道1)，而本发明方法均能够较好地扩增出目的条带(泳道4-7)，切胶回收可用于后续高通量测序。

Claims (10)

1.一种从煤层水样中提取微生物总DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)煤层水样的预处理：取煤层水样10-20mL通过低速离心去除大颗粒杂质，收集上清液，采用抽滤的方式将水样中的微生物收集到滤膜上，将滤膜剪碎后置于STE缓冲液中，待用；所述STE缓冲液组成包括：NaCl 0.1-0.2g/L，Tris-HCl 20-40mmol/L，EDTA 0.3-0.6mol/L，溶剂为ddH2O；
2)微生物细胞的破碎：将含有滤膜的缓冲液移入含有玻璃珠的预冷螺旋帽管中，用珠磨器对细胞进行破碎，重复2-3次，重复过程中将上清液移至离心管后，再向螺旋帽管加满STE缓冲液，将所有上清液合并，加入蛋白酶K和十二烷基硫酸钠水溶液，充分混匀后置于55℃水浴锅内孵育2-4h；
3)微生物DNA的抽提、纯化及沉淀：向孵育后的液体中加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，11000-13000×g离心10-30min，取上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液抽提，除去酚类物质和脂类物质，11000-13000×g离心10-30min，收集上清液，加入1-2倍体积的异丙醇，于-20℃低温沉淀1-2h，用预冷的75％乙醇洗涤沉淀，11000-13000×g离心10-30min，弃上清，室温放置至乙醇挥发完全后，加入50-150μL的TE缓冲液溶解沉淀，溶解后加入RNaseA去除RNA，得到微生物基因组总DNA。
2.如权利要求1所述的一种从煤层水样中提取微生物总DNA的方法，其特征在于，步骤1)所述低速离心去除大颗粒杂质的离心转速为1000-2500×g，离心时间为5-10min。
3.如权利要求1所述的一种从煤层水样中提取微生物总DNA的方法，其特征在于，步骤1)所述滤膜置于的STE缓冲液体积为5-10mL。
4.如权利要求1所述的一种从煤层水样中提取微生物总DNA的方法，其特征在于,步骤1)所述滤膜孔径为0.22μm。
5.如权利要求1所述的一种从煤层水样中提取微生物总DNA的方法，其特征在于：所述步骤2)玻璃珠的添加量为0.6-0.8g，玻璃珠直径为0.3mm。
6.如权利要求1所述的一种从煤层水样中提取微生物总DNA的方法，其特征在于，所述步骤2)中珠磨器的转速为1500-3500rpm，破碎时间15-45s。
7.如权利要求1所述的一种从煤层水样中提取微生物总DNA的方法，其特征在于，所述步骤2)蛋白酶K的终浓度为20-50mg/mL，十二烷基硫酸钠的质量体积比为5％-10％。
8.如权利要求1-7任一所述的提取总DNA的方法，所述的煤层水样用煤炭厌氧发酵液替代。
9.如权利要求1-7任一所述方法提取得到的总DNA用于宏基因组高通量测序和DGGE分析。
10.如权利要求8所述方法提取得到的总DNA用于宏基因组高通量测序和DGGE分析。
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