CN110643601A - 一种革兰氏阳性细菌基因组dna的快速提取方法 - Google Patents

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程红玉
管雄
马文涛
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

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Abstract

本发明公开了一种革兰氏阳性细菌基因组DNA的快速提取方法，包括以下步骤：G+细菌通过离心方法收集，采用9000r/min 2min；G+细菌细胞壁的破碎方法为使用裂解buffer‑TENT buffer，然后100℃煮沸三分钟，3000g离心5min，收集上清；G+细菌基因组的沉淀，G+细菌基因组的收集方法为上清中加入75％乙醇，上下颠倒混匀，12000g离心5min；重复2‑3次，收集沉淀，加入无菌ddH2O，溶解DNA。置于‑20℃备用。本发明技术操作简单，省时而且避免了蛋白污染的引入，节约了成本，适合推广应用。

Description

一种革兰氏阳性细菌基因组DNA的快速提取方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种革兰氏阳性细菌基因组DNA的快速提取方法，具体地说，涉及一种G+(革兰氏阳性)革兰氏阳性细菌基因组DNA的快速提取方法。
背景技术
常见的革兰氏阳性菌有：葡萄球菌、链球菌(Streptococcus)、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等。而且大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人和动物致病。革兰氏阳性菌细胞壁较厚，主要由肽聚糖和包括磷壁酸的酸性多糖构成，约20～80nm。肽聚糖含量丰富，有15～50层，每层厚度1nm，约占细胞干重的50～80％。此外，尚有大量特殊组份磷壁酸，导致其细胞壁极难破碎。目前，常规的G+细菌基因组DNA提取过程中，都是采用溶菌酶来破碎细胞壁，大多采用终浓度为300ug/ml的溶菌酶，冰上孵育就需要1小时，所需时间过长。并且溶菌酶价格较贵且运输储存需要注意事项较多，极大的增加了G+细菌基因组DNA提取的成本，而且溶菌酶的化学本质即为蛋白质，破碎了细胞壁的同时也引进了新的蛋白，导致所提取的基因组DNA不纯，影响后续检测结果的同时，也为基因组提取过程中，蛋白质抽提技术提出了更高的要求，增加试验时间与试验成本。因此，现在急需一种G+革兰氏阳性细菌基因组DNA的快速提取方法为G+细菌的研究与检测提供便利。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种革兰氏阳性细菌基因组DNA的快速提取方法。该方法其利用利用TENT buffer与煮沸联合使用的方法快速简便破碎G+细菌细胞壁，为G+细菌基因组DNA的提取提供了方便快捷，节约成本且避免了蛋白污染引入的方法，为生产和科研提供便利。
其具体技术方案为：
一种革兰氏阳性细菌基因组DNA的快速提取方法，包括以下步骤：
1)G+细菌通过离心方法收集，为节约时间，可采用9000r/min 2min。
2)G+细菌细胞壁的破碎方法为使用裂解buffer-TENT buffer，buffer-TENTbuffer的成分为：10mM Tris-HCl，0.1M NaCl，1mM EDTA，5％[v/v]Triton X100，pH 8.0，然后100℃煮沸3-5分钟，3000g离心5min，收集上清。
3)G+细菌基因组的沉淀方法为95％乙醇加入上清中，-20℃放置20分钟后，在1000g-14000g范围内离心10min，收集上清。G+细菌基因组的收集方法为上清中加入质量百分浓度为70％-90％乙醇，上下颠倒混匀，12000g离心5min。重复2-3次，收集沉淀，加入无菌ddH2O，溶解DNA。置于-20℃备用。
进一步，步骤2)中，煮沸时间为3分钟。
进一步，步骤3)中，12000g离心10min。
进一步，步骤3)中，乙醇的质量百分浓度为75％。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明利用TENT buffer与煮沸联合使用的方法快速简便破碎G+细菌细胞壁，不需要使用溶菌酶，技术操作简单，相对于现有技术而言，时间上节约了30-55分钟，省时而且避免了蛋白污染的引入，本发明的方法还避免使用价格昂贵的材料，节约了成本。
附图说明
图1为本发明检测三种G+细菌纯培养物灵敏度的PCR结果；
图2为本发明检测无菌乳汁中加入已知量G+细菌纯培养物的灵敏度的PCR结果；
图3为本发明检测无菌乳汁中加入已知量G+细菌纯培养物的回收试验结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
本发明为一种革兰氏阳性细菌基因组DNA的快速提取方法，包括以下步骤：1)G+细菌的分离与收集；2)G+细菌细胞壁的破碎；3)G+细菌基因组的沉淀与洗涤。G+细菌通过离心方法收集，为节约时间，可采用9000r/min 2min；使用TENT buffer(10mM Tris-HCl，0.1 MNaCl，1mM EDTA，5％[v/v]Triton X100，pH 8.0)重悬菌体，100℃煮沸三分钟，3000g离心5min，收集上清。上清中加入95％乙醇，-20℃放置20分钟后，12000g离心10min，收集上清。上清中加入75％乙醇，上下颠倒混匀，12000g离心5min。重复2-3次，收集沉淀，加入无菌ddH2O，溶解DNA，运用OD260/OD280的方法检测所提DNA质量。置于-20℃暂时存储，用于后续PCR检测。
实施案例
G+革兰氏阳性细菌基因组DNA的快速提取方法
1)G+细菌的分离与收集：取无菌乳汁，加入已知量革兰氏阳性细菌，9000r/min离心2min，收集细菌。
2)G+细菌细胞壁的破碎：使用300微升TENT buffer(10mM Tris-HCl，0.1M NaCl，1mM EDTA，5％[v/v]Triton X100，pH 8.0)重悬菌体，100℃煮沸三分钟，3000g离心5min，收集上清。
3)G+细菌基因组的沉淀与洗涤：上清中加入95％乙醇，-20℃放置20分钟后，12000g离心10min，收集上清。上清中加入75％乙醇，上下颠倒混匀，12000g离心5min。重复2-3次，收集沉淀，加入无菌ddH2O，溶解DNA，运用OD260/OD280的方法检测所提DNA质量。置于-20℃暂时存储，用于后续PCR检测。结果见图2。
本发明检测三种G+细菌的纯培养物，联合PCR技术，灵敏度可以达到102CFU(结果见图1)；并且可以用于乳汁中G+细菌的检测，灵敏度可以达到102CFU(结果见图2)，达到我国食品安全卫生要求的检测灵敏度，回收实验表明，回收率可以达到88.9％(结果见图3)。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种革兰氏阳性细菌基因组DNA的快速提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)G+细菌通过离心方法收集，采用9000r/min 2min；
2)G+细菌细胞壁的破碎方法为使用裂解buffer-TENT buffer：10mM Tris-HCl，0.1MNaCl，1mM EDTA，5％[v/v]Triton X100，pH 8.0，然后100℃煮沸3-5分钟，3000g离心5min，收集上清；
3)G+细菌基因组的沉淀方法为95％乙醇加入上清中，-20℃放置20分钟后，在1000g-14000g范围内离心10min，收集上清；G+细菌基因组的收集方法为上清中加入质量百分浓度为70％-90％乙醇，上下颠倒混匀，12000g离心5min；重复2-3次，收集沉淀，加入无菌ddH2O，溶解DNA；置于-20℃备用。
2.根据权利要求1所述的革兰氏阳性细菌基因组DNA的快速提取方法，其特征在于，步骤2)中，煮沸时间为3分钟。
3.根据权利要求1所述的革兰氏阳性细菌基因组DNA的快速提取方法，其特征在于，步骤3)中，12000g离心10min。
4.根据权利要求1所述的革兰氏阳性细菌基因组DNA的快速提取方法，其特征在于，步骤3)中，乙醇的质量百分浓度为75％。
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