CN102978293B - 一种特异性检测植物乳杆菌的检测方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性检测植物乳杆菌的检测方法及试剂盒。该检测方法包括步骤：（1）提取基因组DNA；（2）以（1）所提取的DNA为模板，采用如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行PCR反应；（3）对（2）得到的扩增产物进行电泳检测和结果判断。该试剂盒包括序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物。该引物和方法检测植物乳杆菌的灵敏度和准确度相比现有技术有大幅度提高。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及特异性检测植物乳杆菌的检测方法及其试剂盒。
背景技术
乳酸菌是一群形态代谢性能和生理学特征不完全相同且能发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌。目前在自然界中已发现的乳酸菌在细菌分类学上可以划分为43个属，包括373个种及亚种，其中绝大多数是厌氧菌或兼性厌氧菌。人类对乳酸菌的分类鉴定和利用已经有久远的历史，并积累了丰富的经验和知识，形成了至今一直沿用的传统分类鉴定方法，包括形态特征、生理生化反应及血清学反应等，这些方法都是基于微生物表面受体的特异性，属于表型分类法。
随着科技的进步，分子生物学方法以其较高的准确性及稳定性等优点逐步替代传统的形态学和生理学检测方法，并已成功介入到益生菌的鉴定领域。16S rDNA序列同源性分析作为细菌系统发育和亲缘关系研究已被普遍接受和广泛应用，但是乳杆菌属内许多种的16S rDNA基因序列具有较高同源性，利用该方法无法使鉴定精确到种。例如，16S rDNA基因序列分析法不能将相近的植物乳杆菌与戊糖乳杆菌区分开。伴随着高通量测序技术的快速发展，大量乳酸菌菌株的基因组图谱已被解析。这些基因组数据可以使我们了解不同益生菌的遗传结构和特点，找出不同菌株的专有特征，从而为不同种乳酸菌的区分和鉴定奠定了基础。
发明内容
因此，本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的检测方法难以将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）鉴定到种的水平的缺陷，而根据现有的已测序的乳酸菌基因组信息并运用生物信息学的方法设计植物乳杆菌的种特异性引物，运用多重PCR的方法与电泳图谱分析来确定菌种特征性片段的存在有无，从而对植物乳杆菌进行特异性快速检测。
本发明提供的技术方案之一是：一种特异性检测植物乳杆菌的方法，其包括如下步骤：
（1）提取待测样品的基因组DNA；
（2）以步骤（1）所提取的基因组DNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行多重PCR反应，以扩增特征性片段；
（3）对步骤（2）得到的扩增产物进行电泳检测并进行结果判断。
本发明中，步骤（1）所述的提取基因组DNA的方法为本领域常规的提取微生物基因组的方法，如碱裂解法或者利用市售的基因组DNA提取试剂盒提取。
本发明中，步骤（2）所述多重PCR反应的反应体系为本领域常规；较佳地，反应体系中包括浓度各为0.2～0.5μmol/L的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物，0.1～0.3mmol/L的dNTP，1×PCR缓冲液，0.5～1.5mmol/L的Mg2+，0.05～0.15U/μL的Taq DNA聚合酶和1.0～2.0ng/μL的DNA模板；更佳地，所述多重PCR反应的反应体系中包括浓度各为0.4μmol/L的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物，0.2mmol/L的dNTP，1×PCR缓冲液，1mmol/L的Mg2+，0.05U/μL的Taq DNA聚合酶和2.0ng/μL的DNA模板；所述多重PCR反应的反应体系的总体积较佳地为20～50μL，更佳地为25μL。
本发明中，步骤（2）所述多重PCR反应的反应程序为本领域常规，只要能够扩增出植物乳杆菌特异性的基因片段即可；较佳地，所述多重PCR反应的反应程序为：①94～95℃，4～5min；②94～95℃，30～40s；③55～57℃，30～50s；④71～73℃，15～60s；步骤②至④共20～30个循环；⑤71～73℃，8～10min；⑥3～5℃保存；更佳地，所述多重PCR反应的反应程序为：①95℃，5min；②95℃，40s；③55℃，30s；④72℃，30s；步骤②至④共25个循环；⑤72℃，8min；⑥4℃保存。
本发明中，步骤（3）所述的电泳为本领域常规，如琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，较佳的是琼脂糖凝胶电泳，更佳的是1～3%的琼脂糖凝胶电泳，最佳的是2%的琼脂糖凝胶电泳。
本发明中，步骤（3）所述结果判断的方法为本领域常规的方法，即将电泳产物在一定条件下成像，即可判断结果。较佳地，所述结果判断的方法为在紫外凝胶成像仪下拍照成像，采用序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示引物的PCR反应产物，若同时存在101bp，189bp和378bp的核酸片段，则说明待测样品中存在植物乳杆菌；若不同时存在101bp，189bp和378bp的核酸片段，则说明待测样品中不存在植物乳杆菌。与本领域常规一样，可与对照DNA标准品比较而得DNA片段的长度。
本发明提供的技术方案之二是：一种用于特异性检测植物乳杆菌的试剂盒，其包括如前所述的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物。
本发明中，所述的试剂盒较佳地还包括dNTP、PCR缓冲液、Mg2+和TaqDNA聚合酶中的一种或多种。
本发明中，所述的试剂盒较佳地还包括阳性对照和/或基因抽提试剂。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明所提供的特异性检测植物乳杆菌的引物仅能扩增出植物乳杆菌种内的各个亚种及种内各株系的特异性片段，而对其他近缘菌株特别是戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）和副植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)等在常规检测手段中干扰性较强的菌株均无相应扩增。运用本发明所述的多重PCR反应进行种间特异性扩增，并依据琼脂糖凝胶电泳图谱分析，能够简便、快速、准确地定性检测产品中是否含有植物乳杆菌，其灵敏度和准确度相比现有的检测技术有大幅度提高，检出限可达2.2×102cfu/mL。
附图说明
图1为实施例1中植物乳杆菌的引物特异性验证图，其中M为500bpMarker；第1泳道为L.plantarum ATCC14917，作为阳性对照；第2泳道为H2O，作为阴性对照；第3泳道为L.plantarum1.2437；第4泳道为L.plantarumWCFS1；第5泳道为L.plantarum P8；第6泳道为L.plantarum C5；第7泳道为L.pentosus ATCC8041；第8泳道为L.paraplantarum ATCC700211；第9泳道为L.casei ATCC334；第10泳道为L.acidophilus ATCC4356；第11泳道为L.fermentum1.1880。
图2为实施例2中的乳制品中植物乳杆菌的定性检测结果图，其中M为500bp Marker；第1泳道为L.plantarum14917，作为阳性对照；第2泳道为H2O，作为阴性对照；第3泳道为光明乳业所产的添加了植物乳杆菌ST-III的酸奶；泳道4-6为从西藏采集的自然发酵乳；泳道7-11为市售益生菌乳制品。
图3为实施例3中的自制乳酸菌酸奶中植物乳杆菌定性检测图，其中M为500bp Marker；第12泳道为自制含L.plantarum14917的酸奶样品，作为阳性对照；第11泳道为H2O，作为阴性对照；第10泳道为自制含L.plantarumWCFS1的酸奶样品；第9泳道为自制含L.pentosus ATCC8041的酸奶样品；第8泳道为自制含L.paraplantarum700211的酸奶样品；第7泳道为自制含L.helveticus CGMCC1.1877的酸奶样品；第6泳道为自制含L.rhamnosus1.12的酸奶样品；第5泳道为自制含L.fermentum1.1880的酸奶样品；第4泳道为自制含Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus2038的酸奶样品；第3泳道为自制含L.acidophilus NCFM的酸奶样品；第2泳道为自制含Streptococcus thermophilus的酸奶样品；第1泳道为自制含L.johnsoniiATCC332的酸奶样品。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中的引物均由上海生工生物工程有限公司合成。
部分菌株的来源如下：
植物乳杆菌(L.plantarum)ATCC14917，购自美国ATCC；
戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)ATCC8041，购自美国ATCC；
副植物乳杆菌(L.paraplantarum)ATCC700211，购自美国ATCC；
干酪乳杆菌(L.casei)ATCC334，购自美国ATCC；
嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)ATCC4356，购自美国ATCC；
发酵乳杆菌(L.fermentum)1.1880，购自中国普通微生物保藏管理中心。
实施例1
特异性检测植物乳杆菌的引物的设计及其验证：
通过生物信息学方法设计本发明特异性检测植物乳杆菌的引物，所设计的引物如下所示。选用30株植物乳杆菌株和50株非植物乳杆菌株（主要为其近缘菌，如戊糖乳杆菌）进行引物特异性验证。
①选用的植物乳杆菌特异性引物如下：
SEQ ID No.1：5’-ATCAAGCACCCTAAGGCAAGTAT-3’
SEQ ID No.2：5’-GGTGCCATCTTCTTAGTTTTCGT-3’
SEQ ID No.3：5’-CAAGCCTACGCAACTATCAACC-3’
SEQ ID No.4：5’-ACCGTGGGCAAACATTTTATT-3’
SEQ ID No.5：5’-CTAGTTATCGGGATCACTGAGGAAT-3’
SEQ ID No.6：5’-GATAAACAAGACGAGATAGAGCACC-3’。
②PCR反应体系如下：
以从上述菌株提取的待测基因组DNA为模板，反应体系为20.0μL，各反应物终浓度为：1×PCR缓冲液，0.5mmol/L的Mg2+，0.1mmol/L的dNTP，0.2μmol/L上下游引物（SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6），0.1U/μL的Taq DNA聚合酶和1.0ng/μL的DNA模板，用dd H2O补足至20.0μL。
③PCR反应参数：
95℃预变性4min；95℃变性35s，56℃退火40s，73℃延伸15s，循环20次；73℃延伸9min，3℃保存。
④琼脂糖凝胶电泳：将PCR产物于1%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20-30min，EB染色，紫外拍照。
部分结果见图1。从图1可以看出，本发明所提供的特异性检测植物乳杆菌的引物仅能扩增出植物乳杆菌，如3-6泳道所示，而对其他近缘菌株特别是戊糖乳杆菌和副植物乳杆菌等均无相应扩增，如第7泳道为戊糖乳杆菌，其没有扩增出相应的特征性条带，第8泳道为副植物乳杆菌，其也没有扩增出相应的特征条带。由此可见，本发明的引物特异性强，并且由于采用3对引物进行多重PCR，其特异性更能得到保证，从而使对植物乳杆菌的鉴定可以精确到种的水平。
实施例2
益生菌乳制品中植物乳杆菌的快速定性鉴定方法：
a.模板DNA的制备采用液氮冻融-CTAB法抽提样品DNA，具体步骤如下：
（1）取1.0g益生菌发酵乳制品或乳酸菌的纯培养物于10.0mL离心管中，加入3.0mL DNA提取液(100mmol/L Tris-HCl；100mmol/LEDTA；100mmol/L Na3PO4，1.5mol/LNaCl，1%CTAB，pH8.0)混合均匀，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴中融化（约5min），反复冻融3次；
（2）加0.5mL10%SDS和10.0μL10mg/mL蛋白酶K，37℃恒温摇床中200r/min摇动4h；
（3）加入等体积的苯酚︰氯仿︰异戊醇（25︰24︰1）混匀，10000rpm离心10min，溶液明显分为三层，上层为水相，中间为固相，下层为有机相；
（4）吸取上清液，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25︰24︰1）抽提一次；
（5）上清液中加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇，静置30min，10000rpm离心5min以沉淀总DNA。
（6）70%乙醇洗涤沉淀2次，室温下自然干燥DNA，加入50μL无菌超纯水回溶，-20℃保存备用。
对于基因组DNA的提取，也可以使用等效的商业化的DNA提取试剂盒并按其说明书操作。
b.PCR扩增
（1）植物乳杆菌特异性引物：
SEQ ID No.1：5’-ATCAAGCACCCTAAGGCAAGTAT-3’
SEQ ID No.2：5’-GGTGCCATCTTCTTAGTTTTCGT-3’
SEQ ID No.3：5’-CAAGCCTACGCAACTATCAACC-3’
SEQ ID No.4：5’-ACCGTGGGCAAACATTTTATT-3’
SEQ ID No.5：5’-CTAGTTATCGGGATCACTGAGGAAT-3’
SEQ ID No.6：5’-GATAAACAAGACGAGATAGAGCACC-3’。
（2）PCR反应体系
以上述提取的基因组DNA为模板，反应体系25.0μL，各反应物终浓度为：1×PCR缓冲液，1mmol/L的Mg2+，0.2mmol/L的dNTP，0.4μmol/L上下游引物（SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQID No.5、SEQ ID No.6），0.05U/μL的Taq DNA聚合酶和2.0ng/μL的DNA模板，用dd H2O补足至25.0μL。
（3）PCR反应参数
95℃预变性4min；95℃变性40S，55℃退火30S，72℃延伸30S，循环25次；72℃延伸8min，4℃保存。
c.琼脂糖凝胶电泳：将PCR产物于2%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20-30min，EB染色，紫外拍照。
d.结果及判断
经植物乳杆菌特异性引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检验结果见图2，样品3，4出现特征条带。其中样品3为含有植物乳杆菌的酸奶产品，样品4-6经传统生理生化鉴定表明样本4中含有植物乳杆菌，其余则不含有。市售产品中已知均不含有植物乳杆菌，也未检测出特征条带。
实施例3
自制乳酸菌酸奶中植物乳杆菌定性检测
a.自制乳酸菌酸奶产品
将菌株在试管中逐个活化，分别接种于质量分数为12%的脱脂牛乳中，其中接种德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌，培养温度为42℃，以及植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、副植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌和约氏乳杆菌，培养温度为37℃，对于部分在乳中生产较慢的菌株在脱脂乳中添加1%的酵母提取物进行培养。培养至凝乳，结束发酵，置冰箱备用。
b.模板DNA的制备采用溶菌酶法抽提样品DNA，具体步骤如下：
（1）细菌收集：取发酵乳10mL，离心（200g，4℃）10min，收集上清液，于灭菌抽滤系统中，双层滤纸过滤，滤液离心（3000g，4℃）10min收集菌体，菌体重新悬浮于1mlTE（pH8.0）中。
（2）菌体裂解：加入6μl50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS110μl，20mg/ml的蛋白酶K3μl，50℃作用3h或37℃过夜，此时菌液应为透明粘稠液体。
（3）抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25︰24︰1)，混匀，室温放置5-10min，12000rpm离心10min，抽提两次。
（4）沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min，12000rpm离心10min。
（5）洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。
（6）抽（凉）干后，溶于50μlddH2O中，-20℃保存备用。
c.PCR扩增
（1）植物乳杆菌特异性引物：
SEQ ID No.1：5’-ATCAAGCACCCTAAGGCAAGTAT-3’
SEQ ID No.2：5’-GGTGCCATCTTCTTAGTTTTCGT-3’
SEQ ID No.3：5’-CAAGCCTACGCAACTATCAACC-3’
SEQ ID No.4：5’-ACCGTGGGCAAACATTTTATT-3’
SEQ ID No.5：5’-CTAGTTATCGGGATCACTGAGGAAT-3’
SEQ ID No.6：5’-GATAAACAAGACGAGATAGAGCACC-3’。
（2）PCR反应体系
以上述提取的基因组DNA为模板，反应体系50.0μL，各反应物终浓度为：1×PCR缓冲液，1.5mmol/L的Mg2+，0.3mmol/L的dNTP，0.5μmol/L上下游引物（SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQID No.5、SEQ ID No.6），0.15U/μL的Taq DNA聚合酶和1.0ng/μL的DNA模板，用dd H2O补足至50.0μL。
（3）PCR反应参数
94℃预变性5min；94℃变性30S，57℃退火50S，71℃延伸60S，循环30次；71℃延伸10min，5℃保存。
d.琼脂糖凝胶电泳：将PCR产物于3%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20-30min，EB染色，紫外拍照。
e.结果及判断
经植物乳杆菌特异性引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检验结果见图3，样品10为由L.plantarum WCFS1发酵得到的酸奶样品，出现特征条带，其余由其他乳酸菌发酵的酸奶样品均未出现特征条带，特别是含有副植物乳杆菌和戊糖乳杆菌的产品均未出现特征性条带而干扰实验结果，说明本发明的方法特异性好，可以快速定性鉴定产品中是否含有植物乳杆菌。
Claims (7)
1.一种特异性检测植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
（1）提取待测样品的基因组DNA；
（2）以步骤（1）所提取的基因组DNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行多重PCR反应，以扩增特征性片段；
（3）对步骤（2）得到的扩增产物进行电泳检测并进行结果判断；
其中，步骤（2）所述多重PCR反应的反应体系中包括浓度各为0.2～0.5μmol/L的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物，0.1～0.3mmol/L的dNTP，1×PCR缓冲液，0.5～1.5mmol/L的Mg2+，0.05～0.15U/μL的Taq DNA聚合酶和1.0～2.0ng/μL的DNA模板；
步骤（2）所述多重PCR反应的反应程序为：①94～95℃，4～5min；②94～95℃，30～40s；③55～57℃，30～50s；④71～73℃，15～60s；步骤②至④共20～30个循环；⑤71～73℃，8～10min；⑥3～5℃保存；
步骤（3）所述结果判断的方法为在紫外凝胶成像仪下拍照成像，采用序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示引物的PCR反应产物，若同时存在101bp，189bp和378bp的核酸片段，则说明待测样品中存在植物乳杆菌；若不同时存在101bp，189bp和378bp的核酸片段，则说明待测样品中不存在植物乳杆菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述多重PCR反应的反应体系中包括浓度各为0.4μmol/L的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物，0.2mmol/L的dNTP，1×PCR缓冲液，1mmol/L的Mg2+，0.05U/μL的Taq DNA聚合酶，2.0ng/μL的DNA模板。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述多重PCR反应的反应程序为：①95℃，5min；②95℃，40s；③55℃，30s；④72℃，30s；步骤②至④共25个循环；⑤72℃，8min；⑥4℃保存。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述的电泳为1%～3%琼脂糖凝胶电泳。
5.一种用于特异性检测植物乳杆菌的试剂盒，其包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液、Mg2+和Taq DNA聚合酶中的一种或多种。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括阳性对照和/或基因抽提试剂。
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