KR20170043957A - Lactobacillus kefiri 유산균 특이 신속 정량 검출용 프라이머, 프로브 세트 및 이를 이용한 실시간 PCR 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Lactobacillus kefiri 유산균 특이 신속 정량 검출용 프라이머, 프로브 세트 및 이를 이용한 real-time PCR 방법에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머, 프로브 세트 및 real-time PCR방법은 케피어 발효유의 품질 관리 및 케피어의 발효 프로세스 연구에 적극적으로 활용될 수 있다.

Description

Lactobacillus kefiri 유산균 특이 신속 정량 검출용 프라이머, 프로브 세트 및 이를 이용한 실시간 PCR 방법{A primer and probe set for specific and rapid quantitative detection of Lactobacillus kefiri and a real-time PCR method using the same}

본 발명은 Lactobacillus kefiri 유산균 특이 신속 정량 검출용 프라이머, 프로브 세트 및 이를 이용한 real-time PCR 방법에 관한 것이다.

Lactobacillus kefiri는 구 소련의 코카서스 지방의 장수식품인 케피어 발효유에서 처음으로 분리된 유산균이다. 최근 본 균에 대한 연구가 활발히 이루어지면서 본 균의 항균효과, 독소 중화능, 식중독 세균의 장 상피세포 부착 억제능, 혈중콜레스테롤 저하효과, 면역 조절능, 세포외다당체 생성능 등 다양한 유익효과가 밝혀짐에 따라 새로운 프로바이오틱 유산균종으로 인정받고 있다.

본 균이 유래된 케피어 발효유는 50종 이상의 유산균, 초산균, 효모가 공생계를 형성하고 있는 복합 발효식품이다. 케피어 발효유를 정기적으로 섭취할 경우 정장 작용, 항비만 작용, 항염증 작용, 항미생물 작용 등 다양한 건강 유익효과를 얻을 수 다고 알려져 있다. 이러한 케피어 발효유의 건강 유익효과를 극대화하기 위해서는 핵심 유익균인 Lb. kefiri에 적합한 발효 환경을 제공할 필요가 있다.

케피어 발효시에 다양한 미생물 그룹의 양적 관계를 이해하고, 본 균의 활성을 극대화하기 위한 발효 조건을 연구하기 위해서는 본 균에 대한 선택적인 정량 기술이 필요하지만, 아직까지 이 균을 특이적으로 검출 및 정량할 수 있는 방법이 개발되어있지 않은 실정이다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 Lb. kefiri를 선택적으로 정량 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 Lb. kefiri를 선택적으로 정량 검출할 수 있는 real-time PCR법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 Lactobacillus kefiri 특이적인 서열번호 1 내지 2에 기재된 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어진 프로브를 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 유효성분으로 포함하는 Lactobacillus kefiri 검출용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 유효성분으로 포함하는 Lactobacillus kefiri 검출용 키트를 제공한다.

또 본 발명은 시료로부터 얻어진 핵산 시료를,서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프라이머 세트와 혼성화시키는 단계;표적 핵산 서열을 증폭시키는 단계; 및 증폭된 표적 핵산 서열을 검출하는 단계를 포함하는, 시료 중 Lactobacillus kefiri 균주를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 증폭된 핵산 서열을 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브와 혼성화시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 시료는 케피어인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 표적 핵산 서열 증폭은 중합효소 연쇄반응에 의한 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 검출은 실시간(real time) 검출인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 케피어 발효유에서 지노믹 DNA를 추출한 후 제1항의 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 얻은 Ct값을 표준 검량선에 대입하여 케피어 발효유에 존재하는 Lb. kefiri의 수를 정량하는 방법을 제공한다.

본 발명에서,뉴클레오티드는 당업계에 알려진 방법에 따라, 적절한 방법(예를 들면, 화학적 합성)에 의해 합성되고 제조될 수 있다. 또한, 뉴클레오티드는 상업적으로 구입할 수 있다.

용어 "프라이머(primer)"는 적합한 온도에서 적합한 버퍼 내에서 적합한 조건(예를 들면, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합 반응 효소)에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다.

프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 차이가 있지만 전형적으로 15-35개의 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구할 수 있다. 용어 "정방향 프라이머(forward primer)" 및 "역방향 프라이머(reverse primer)"는 중합 효소 연쇄 반응에 의해 증폭되는 주형의 일정한 부위의 3' 말단 및 5' 말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다.

상기 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성할 수 있다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다.

용어 "프로브(probe)"는 특정 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연 또는 변형된 단량체(monomer) 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머(oligomer)를 의미한다. 예를 들어, 상기 프로브는 혼성화의 효율을 높일 수 있도록 단일 가닥일 수 있다.

상기 프로브는 주형이 되는 폴리뉴클레오티드 서열에 완전하게 상보적인 서열일 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 서열일 수도 있다.

상기 조성물은 표적 핵산을 증폭하기 위한 조성물일 수 있다. 증폭은 핵산 증폭을 위하여 알려진 방법일 수 있다. 증폭은 예를 들면, DNA 증폭 또는 RNA 증폭일 수 있다. 증폭 방법은 열순환(termal cycling)을 필요로 하는 것 또는 등온 (isothermal)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 증폭방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR), 핵산 서열-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction: LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplificaton: SDA), 롤링 서클증폭(rolling circle amplification: RCA) 등을 포함할 수 있다. 증폭 방법은 또한, RNA 증폭 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 역전사(reverse transcription: RT) 또는 역전사-PCR을 포함할 수 있다. 증폭이란 표적핵산 서열 또는 그에 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. "PCR"은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법일 수 있다.

또한, 상기 조성물은 표적 핵산의 증폭에 요구되는 알려진 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 핵산 폴리머라제, 그의 활성에 필요한 버퍼, 보조인자, 및/또는 기질을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사 효소(reverse transcriptase) 및 이들의 조합일 수 있다. 역전사(reverse transcription)란 RNA를 주형으로 하여 RNA 서열에 상보적인 DNA 가닥을 합성하는 것일 수 있다.상기 핵산 폴리머라제는 가닥 치환 활성을 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 레트로바이러스, 예를 들면, HIV,MMLV, 및 AMV로부터 유래된 하나 이상의 역전사 효소일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 3'-> 5' 엑소뉴클레아제 활성(exonuclease activity)을 갖지 않는 것일 수 있다. 상기 조성물은 역전사 또는 PCR 증폭에 필요한 물질을 포함하는 것일 수 있다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는 Lactobacillus kefiri 균주 검출용 키트일 수 있다.

또한, 예를 들면 프로브가 FRET(Fluorescence resonance energy transfer) 쌍으로 표지된 것일 수 있다. 아울러, 예를 들면 프로브의 5' 말단은 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, 및 NED로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광 마커로 표지되거나, 프로브의 3' 말단은 6-TAMRA, BHQ-1,2,3, 및 MGBNFQ(molecular groove binding non-fluorescence quencher)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 형광 퀀처(fluorescent quencher)로 표지될 수 있다.

상기 키트는 표적 핵산을 증폭하기 위한 키트일 수 있다. 증폭은 핵산 증폭을 위하여 알려진 방법일 수 있다. 증폭은 예를 들면, DNA 증폭 또는 RNA 증폭일 수 있다. 증폭 방법은 열순환(termal cycling)을 필요로 하는 것 또는 등온 (isothermal)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 증폭방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR), 핵산 서열-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction: LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplificaton: SDA), 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification: RCA) 등을 포함할 수 있다. 증폭 방법은 또한, RNA 증폭 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 역전사(reverse transcription: RT) 또는 역전사-PCR을 포함할 수 있다. 증폭이란 표적 핵산 서열 또는 그에 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. "PCR"은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법일 수 있다.

또한, 상기 키트는 표적 핵산의 증폭에 요구되는 알려진 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 키트는 핵산 폴리머라제, 그의 활성에 필요한 버퍼, 보조인자, 및/또는 기질을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는

DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사 효소(reverse transcriptase) 및 이들의 조합일 수 있다. 역전사(reverse transcription)란 RNA를 주형으로 하여 RNA 서열에 상보적인 DNA 가닥을 합성하는 것일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 가닥치환 활성을 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 레트로바이러스, 예를 들면, HIV, MMLV, 및 AMV로부터 유래된 역전사 효소일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 3'-> 5' 엑소뉴클레아제 활성(exonuclease activity)을 갖지 않는 것일 수 있다. 상기 키트는 역전사 또는 PCR 증폭에 필요한 물질을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 키트는 표적 핵산을 증폭하기 위하여 사용하기 위한 설명서를 더 포함할 수 있다.

본 발명을 설명한다.

본 발명에서는 케피어의 품질 관리 및 발효 프로세스 이해를 돕기 위해서 Lb. kefiri를 선택적으로 정량 검출할 수 있는 real-time PCR법을 개발하였다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 개발된 Primer/Probe 세트는 다양한 표준균주 및 식품분리균주들 중에서 Lb. kefiri 균에서만 특이적으로 양성 반응을 나타내었다. 또한, 다양한 발효 조건 하에서 생산된 케피어 발효유 내에 존재하는 Lb. kefiri를 신속정량 할 수 있었다. 결론적으로, 새롭게 개발된 본 발명의 real-time PCR방법은 케피어 발효유의 품질 관리 및 케피어의 발효 프로세스 연구에 적극적으로 활용될 것으로 예상된다.

도 1은 15가지 Lactobacillus species의 recA gene sequence의 partial alignment. 본 발명에서 개발한 LK_508F/R primer 및 LK_508P probe를 제작한 위치를 상자로 표시하였음,
도 2는 표준 균주를 활용한 새로 개발된 real-time PCR의 민감성 및 특이성 검증한 그림,
도 3은 Lb. kefiri 정량용 표준곡선을 나타냄.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: Primer/probe 세트의 개발

본 발명에서 개발된 Primer/probe 세트는 Lb. kefiri의 recA 유전자를 표적으로 제작되었으며, 그 서열은 아래 표 1에 기재되어 있다.

Primer/Probe 명칭	서열	농도
LK_508F (forward primer)	5′- GGGAGATGCCCATGTTGGT -3′(서열번호 1)	300 nM
LK_508R (reverse primer)	5′- AAGCTTTCGAAGTGCCTGTGA -3′(서열번호 2)	900 nM
LK_508P (probe)	5′-FAM- TGCAAGCACGACTGAT -3′-TAMRA(서열번호 3)	250 nM

표 1은 Lb. Kefiri 특이 정량검출용 primer/probe 세트를 나타냄.

본 발명의 프라이머 및 프로브 디자인에 대해서 도 1에서와 같이, 도 1의 균종들은 다른 유전자(16S rRNA gene등) 및 동 유전자의 기타 부위를 타깃으로 하였을 때 Lb. kefiri와 sequence가 거의 일치하여 특이적인 primer/probe set을 디자인할 수 없었다. 하지만, 본 발명에서는 recA gene을 타깃으로, 상기 부위에 대한 primer/probe set을 디자인하였기 때문에 매우 근연한 유산균들 중에서도 Lb. kefiri만 선택적으로 검출 및 정량할 수 있었다.

실시예 2: 표준 균주 및 식품분리주를 이용한 민감성/특이성의 검증

본 발명에서 개발된 Primer/probe 세트의 민감성/특이성을 평가하기 위해서 23개의 표준균주 및 40개의 식품 분리 균주을 사용하여 검증실험을 실시하였다. 사용된 균주의 목록은 아래 표 2와 같다.

Test strain	Result
Acetobacter aceti ATCC23746	-
Bifidobacterium adolescents ATCC15703	-
Bifidobacterium longum BL-720	-
Enterococcus faecalis ATCC19433	-
Escherichia coli ATCC25922	-
Lactobacillus acidophilus ATCC4357	-
Lactobacillus acidophilus (isolated from kefir grain, n = 1)	-
Lactobacillus brevis ATCC8287	-
Lactobacillus crispatus KCTC3174	-
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC11842	-
Lactobacillus gasseri KCTC3163	-
Lactobacillus helveticus KCTC3545	-
Lactobacillus jensenii KCTC5194	-
Lactobacillus johnsonii JCM1022	-
Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens ATCC43761	-
Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum DSM10550	-
Lactobacillus kefiranofaciens (isolated from kefir grain, n = 24)	-
Lactobacillus kefiri ATCC35411	+
Lactobacillus kefiri (isolated from kefir grain, n = 13)	+
Lactobacillus casei ATCC393	-
Lactobacillus paracasei KCTC13169	-
Lactobacillus parakefiri KCTC5087	-
Lactobacillus parakefiri KCTC5044	-
Lactobacillus fermentum ATCC11739	-
Lactococcus lactis subsp. lactis (isolated from kefir grain, n = 1)	-
Lactococcus lactis subsp. cremoris (isolated from kefir grain, n = 1)	-
Leuconostoc mesenteroides KCTC13302	-
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus KCTC5091	-

위에 제시된 균주들에서 genomic DNA 를 추출한 후 아래 표 3에 제시된 것과 같은 PCR 반응용액을 제조하였다. 이후 반응액을 real-time PCR system (CFX96, BioRad)을 이용하여 50℃에서 2분, 95℃에서 10분간 반응시킨 후, 그리고 95℃에서 15초, 57℃에서 60초로 구성된 반응사이클을 40회 반복하며 결과를 얻었다.

재료	용량
TaqMan? Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)	12.5 μL
LK_508F	2.5 μL
LK_508R	2.5 μL
LK_508P.	2.5 μL
Extracted genomic DNA	5 μL
총 합	25 μL

표 3은 PCR 반응 용액의 제조에 대한 표이다.

실시예 3: 케피어 내에 존재하는 Lb. kefiri 균의 정량

Lactobacillus kefiri ATCC 35411 균주를 MRS 배지에서 27℃에서 72시간 동안 혐기배양하여 얻어진 집락을 10% skim milk에 접종하였다. 이를 10% skim milk를 이용하여 10배로 희석한 후 MRS 배지에 도말하여 균을 계수하였다. 동시에 접종액에서 genomic DNA를 추출하여 단계희석한 후, 위와 동일한 방법으로 real-time PCR 반응을 수행하였다. Real-time PCR에서 얻은 Ct값과 MRS배지에서 얻은 시료액의 균수를 각각 대응시켜 표준검량선을 작성하였다. 이어, 세 가지 온도 조건 (20 ℃, 25 ℃, 30 ℃) 및 세 가지 Kefir grain-milk ratio (2%, 5%, 10%)에서 24시간 동안 발효시킨 케피어 발효유 1ml에서 genomic DNA를 추출한 후 위와 동일한 방법으로 real-time PCR을 수행하여 얻은 Ct값을 표준 검량선에 대입하여 케피어 발효유에 존재하는 Lb. kefiri의 수를 정량하였다.

본 발명의 상기 실시예의 결과는 SPSS (version 18.0, SPSS Inc.)를 이용하여 평균 ± 표준편차로 제시하였다. 또한 정량치간의 통계학적 유의차는 analysis of variance (ANOVA; Tukey's method)으로 분석하였으며 P값이 0.05이하인 경우를 통계학적으로 유의차가 있는 것으로 간주하였다.

상기 실시예의 결과는 하기와 같다.

(1)민감성과 특이성

총 63개의 표준균주를 이용한 검증실험에서는 Lb. kefiri ATCC35411 및 kefir 그레인(n=13)으로부터 분리된 Lb. kefiri 만이 양성반응을 나타내었으며, 나머지 49가지 균주들은 모두 음성 반응을 나타내었다(도 2).

(2)케피어 및 케피어 그레인에 존재하는 Lb. kefiri의 정량

케피어 및 케피어 그레인에 존재하는 Lb. kefiri를 정량하기 위해서 도 3과 같은 표준 검량선을 얻을 수 있었다.

위의 표준 검량선을 이용하여 케피어 1ml 에 존재하는 Lb. kefiri균을 정량한 결과가 아래 표4에 제시되어 있다.

발효온도	Grain-milk ratio	케피어 발효유 1ml당 균수 (Log CFU, 평균±표준편차)
20 ℃	2%	2.31 ± 0.27 A
	5%	2.37 ± 0.17 A
	10%	4.5 ± 0.02 D
25 ℃	2%	2.67 ± 0.13 A
	5%	3.14 ± 0.11 B
	10%	4.58 ± 0.16 D
30 ℃	2%	3.21 ± 0.24 B
	5%	3.92 ± 0.22 C
	10%	4.85 ± 0.14 D

표 4는 다양한 조건에서 발효된 케피어 발효유에 존재하는 Lb. kefiri균의 수

* 동일 열 내의 다른 알파벳은 두 값 사이의 통계학적 유의차가 있음을 의미함 (P < 0.05)

상기 표에서 볼 수 있듯, 케피어 발효유의 발효 온도가 높을수록, Grain-milk ratio가 높을수록 케피어 발효유 내에 존재하는 Lb. kefiri의 수가 높음을 알 수 있다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> A primer and probe set for specific and rapid quantitative detection of Lactobacillus kefiri and a real-time PCR method using the same <130> HY151241 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gggagatgcc catgttggt 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aagctttcga agtgcctgtg a 21 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 tgcaagcacg actgat 16

Claims (9)

1. Lactobacillus kefiri 특이적인 서열번호 1 내지 2에 기재된 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어진 프로브.
2. 제 1항의 프라이머 세트 및 프로브를 유효성분으로 포함하는 Lactobacillus kefiri 검출용 조성물.
3. 제 1항의 프라이머 세트 및 프로브를 유효성분으로 포함하는 Lactobacillus kefiri 검출용 키트.
4. 시료로부터 얻어진 핵산 시료를,
   서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프라이머와 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프라이머 세트와 혼성화시키는 단계;
   표적 핵산 서열을 증폭시키는 단계; 및
   증폭된 표적 핵산 서열을 검출하는 단계를 포함하는, 시료 중 Lactobacillus kefiri 균주를 검출하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 증폭된 핵산 서열을 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브와 혼성화시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 시료는 케피어인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제4항에 있어서, 상기 표적 핵산 서열 증폭은 중합효소 연쇄반응에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제4항에 있어서, 상기 검출은 실시간(real time) 검출인 것인 방법.
9. 케피어 발효유에서 지노믹 DNA를 추출한 후 제1항의 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 얻은 Ct값을 표준 검량선에 대입하여 케피어 발효유에 존재하는 Lb. kefiri의 수를 정량하는 방법.
   
   

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