KR102182731B1 - 락토바실러스 퍼멘툼 판별용 마커 및 이의 용도 - Google Patents

락토바실러스 퍼멘툼 판별용 마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 특이 검출 및 선발을 위한 마커 및 이를 이용한 분석 방법에 관한 것으로, 김치 및 발효식품 등에서 발견되는 유산균인 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 통해 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)를 정량 및 정성 분석할 수 있고, 김치 내 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 밀도 변화를 모니터링할 수 있다.

Description

락토바실러스 퍼멘툼 판별용 마커 및 이의 용도{Marker for discriminating Lactobacillus fermentum and use thereof}
본 발명은 락토바실러스 퍼멘툼 특이 검출 및 선발을 위한 마커 및 이를 이용한 판별 방법에 관한 것이다.
젖산균은 글루코오스 등 당류를 분해하여 젖산을 생성하는 세균으로 유산균이라고도 불리며, 젖산발효에 의해 생성되는 젖산에 의해서 병원균과 유해세균의 생육이 저지되는 성질을 유제품·김치류·양조식품 등의 식품제조에 이용하고 있다. 또한, 젖산균은 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상발효를 방지하여 정장제로도 이용되고 있다. 상기 유산균은 그람양성균으로, 통성혐기성 또는 혐기성을 성질을 지니며, 락토바실러스 속과 스트렙토코쿠스 속에 여러 종류가 알려져 있다.
김치는 유산균(젖산균)에 의하여 발효되는 한국 전통 식품으로, 김치에서 분류된 젖산균(유산균)으로는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 덱스트라니쿰(Leuconostoc dextranicum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 페디오코코스 펜토사쿠스(Pediococcus pentosacues), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 등이 있다.
일반적으로 김치가 발효되면서 발효 초기에 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)를 포함한 류코노스톡들이 우세하게 증식하여 초기의 산 생성을 주도하여 김치 발효에 관여하며, 점차 pH가 감소함에 따라 처음에 왕성했던 류코노스톡 균주의 수도 감소하게 된다. 반면, 발효 후기에는 산에 내성적인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 등의 락토바실러스 균들이 활발하게 활동하여 락토바실러스 균의 수가 점차 증가하면서 김치가 시어지게 된다.
다만, 종래 유산균을 분석하기 위해 김치와 같은 발효물 내에 존재하는 유산균을 유산균에 특이적인 배양조건상에서 도말 배양함으로써 형성된 콜로니(colony)의 형태나 수를 확인해왔다. 그러나, 도말 배양은 인위적인 배양조건에서 생존할 수 있는 미생물의 개체 수만 측정할 수 있어, 실제 김치에 존재하여 발효에 중요한 역할을 하는 미생물이 시료의 준비과정이나 배양과정에서 사멸될 수 있으며, 미생물이 배양이 된다 하더라도 균주가 콜로니를 형성하기까지 다소 시간이 소요되며, 특이성(specificity)과 민감성(sensitivity)이 낮은 단점이 있었다. 또한, 유산균이 함유된 제품에서 유전적으로 비슷한 성질을 가지는 락토바실러스를 분리 및 동정하기 위해서는 많은 시간과 비용이 필요하였다.
이에 따라, 유전적 성질이 비슷한 락토바실러스 종들을 정확하고 간단하게 동정할 수 있는 새로운 기술 개발의 필요성이 존재하였다.
대한민국공개특허 제10-2015-0075994호
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 판별방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명의 용어 "프라이머 세트(a pair of primers)"란 판별 대상 유전자를 PCR을 이용하여 증폭시키기 위한 염기서열들로, 하나의 진단대상 유전자에 정방향 프라이머와 역방향 프라이머가 세트를 이루어 반응하여 PCR 산물을 합성한다. 이때, 상기 정방향과 역방향 프라이머 세트가 결정되면 이로부터 합성되는 PCR 생성물의 크기를 예측할 수 있다.
상기 프라이머들은 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 의 세포 표면 단백질(cell surface protein)(등록번호: GenBank accession protein ID WP_003684284.1)을 코딩하는 유전자(GenBank accession NC_010610.1:185484-186275, AP008937.1:1906662-1907357)에 특이적인 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함한다.
본 발명의 상기 프라이머 세트는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 세포 표면 단백질(cell surface protein)(등록번호: GenBank accession protein ID WP_003684284.1)을 코딩하는 유전자(GenBank accession NC_010610.1, AP008937.1)의 186113번 내지 186208번으로 이루어진 96bp(서열번호 5)의 핵산 단편을 증폭시키는 프라이머 세트일 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 판별용 조성물은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함한다.
본 발명의 용어 "프라이머", "프라이머 세트(a pair of primers)" 에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 판별용 키트는 PCR 분석 또는 multiplex-PCR 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 키트는, 상기 각 폴리뉴클레오티드에 대한 특이적인 각각의 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 판별방법을 제공한다.
상기 시료는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 판별용 키트를 포함한 유산균 또는 유산균을 포함한 발효식품, 유제품 등 식품으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 보다 구체적으로 김치 또는 김치 국물을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 판별방법에 있어서, 상기 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 세포 표면 단백질(Bcell surface protein)을 코딩하는 유전자의 DNA는 게놈 DNA와 클론(cloned) DNA를 포함한다. 상기 DNA는 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 SDS 추출법(Tai et al. Plant Mol. Biol. Reporter, 8:297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al. Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 분리될 수 있으며, 예를 들면, Fast DNA spin kit for soil(Mp Biomedicals)나 게놈(genomic) DNA 추출 키트(DNeasyⓡBlood & Tissue Kit, Qiagen, Hilden, Germany)를 이용할 수 있다.
상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 세포 표면 단백질(Bcell surface protein)을 코딩하는 유전자의 표적 서열을 증폭할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 본 발명의 기술 분야에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C.등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사 중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop mediated isothermal amplification; LAMP), Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 반응, 또는 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system) 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭방법들은 미국특허 제5,242,794호, 제5,494,810호, 제4,988,617호 및 미국 특허 출원 제09/854,317호에 기술되어 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 증폭 반응으로 실시간(Real time) PCR을 수행한다. 실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술로, PCR 생산물의 증가가 타겟 주형의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클(cycle)에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 CT 값(threshold cycle)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다.
종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.
PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 CT 값이 산출된다.
실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 인터킬레이팅(interchelating) 방법(SYBR 그린I 방법)와 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. 인터킬레이팅 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다.
상기 실시간 PCR에 의한 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 세포 표면 단백질(cell surface protein)을 코딩하는 유전자의 검출을 위한 최소 DNA 양은 5 fg(femtogram) 내지 5 ng(nanogram)인 것이 바람직하고, 최소 5 fg만 있어도 검출이 가능하므로 검출감도가 매우 높은 것이다.
본 발명의 판별방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 판별방법에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법의 하나로서, 젤 전기영동을 수행할 수 있으며, 젤 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 젤 전기영동 또는 아가로스 젤 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 세포 표면 단백질(cell surface protein)을 코딩하는 유전자에 특이적인 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머는 같은 속 다른 종의 균주들은 검출하지 못한 반면, 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 종만을 특이적으로 검출하였다(도 2 참조). 또한, 게놈 DNA와 클론 DNA는 각각 50 fg 및 5 fg, 세포 현탁액에서는 6.37Х 103 (CFU/mL)에서도 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)을 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(표 2 참조).
또한, 본 발명의 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)에 특이적이고 민감성이 높다. 따라서 본 발명의 프라이머 세트는 실시간 PCR 방법을 통해 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 정량, 정성 분석과 김치 내에서 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 밀도 변화를 신속, 정확하게 판단할 수 있다.
본 발명은 김치 및 발효식품 등에서 발견되는 유산균인 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 통해 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)를 정량 및 정성 분석할 수 있고, 김치 내 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 밀도 변화를 모니터링할 수 있다.
도 1은 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 Blastn 검색 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 (a) ALLF96F/R와 (b) LFermF/R primers 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭 결과를 도시한 것이다. M은 사이즈 마커(1 kb DNA plus ladder; Gibco BRL)이고, 레인 1 내지 4는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)이며, 레인 5 내지 36은 표 1에 나열된 바와 같은 락토바실러스(Lactobacillus), 류코노스톡(Leuconostoc), 락토코커스(Lactococcus) 및 웨이셀라(Weissella) 종에 속하는 균주들을 포함한다. 레인 37은 음성대조군으로 물을 나타낸다.
도 3은 표 1에 기재된 36종의 미생물을 대상으로, 종-특이적인 ALLF96F/R 프라이머 세트를 이용한 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 유래의 세포 표면 단백질(cell surface protein)을 코딩하는 유전자의 실시간 PCR 결과이다. 도 3에서 멜팅-피크는 약 84.0℃의 융점(Tm)에서 증폭된 산물을 나타낸다. 레인 37은 음성대조군으로 물을 나타낸다.
도 4는 표준 희석 계열에서 실시간 PCR의 민감성을 나타낸 것이다. 표준 곡선은 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 표준 희석의 교차점으로 알려진 threshold cycles (Ct)로부터 생성된다. 모든 곡선은 R2>0.99인 것으로 입증되었다. a. 게놈 DNA, b. 클론 DNA, c. 세균 세포 현탁액.
도 5는 4 ℃(a), 15℃ 및 25℃(b)에서 발효된 염장 배추 김치에서 분리된 총 DNA에서 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 정량에 대한 실시간 PCR Ct 값의 변화를 도시한 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
<실시예 1> 락토바실러스 퍼멘툼( Lactobacillus fermentum )에 특이적인 프라이머 제작
(1) Bacterial strain과 배양 조건
본 발명에서 사용된 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)를 포함한 기타 미생물은 벨기에의 the Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms (BCCMTM)와 Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea (KACC), Korean Collection for Type Cultures (KCTC)에서 분양 받았으며, 이들의 출처는 표 1에 정리하였다. 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 균주들은 MRS배지(OXOID CM0361)로 28, 30, 37℃에서 각각 24-48h 배양하였다.
No. Bacterial strain Source Biological origin
1 Lactobacillus fermentum LMG 6902T Fermented beets
2 Lactobacillus fermentum KCTC 33132 Kimchi
3 Lactobacillus fermentum KCTC 5468 Intestine of infant
4 Lactobacillus fermentum KCTC 5049 Saliva
5 Lactobacillus gastricus KACC 12399T Gastric biopsies, human stomach mucosa
6 Lactobacillus ingluviei KACC 12396T Pigeon, crop
7 Lactobacillus mucosae KACC 12381T Pig small intestine
8 Lactobacillus reuteri KACC 11452T Human feces
9 Lactobacillus frumenti KACC 12377 T Rye-bran sourdough
10 Lactobacillus vaginalis LMG 12891 T Patient suffering from trichomoniasis, vagina
11 Lactobacillus pontis KACC 12369T Rye sourdough
12 Lactobacillus panis KACC 12365T Sourdough
13 Lactobacillus antri KACC 12397T Gastric biopsies, human stomach mucosa
14 Lactobacillus rossiae KACC 12391T Wheat sourdough
15 Lactobacillus hammesii LMG 23074T Wheat sourdough
16 Lactobacillus parabrevis LMG 11984 T Wheat
17 Lactobacillus brevis LMG 6906 T Human, faeces
18 Lactobacillus acidifarinae LMG 22200 T Wheat sourdough
19 Lactobacillus zymae LMG 22198 T Artisanal wheat sourdough
20 Lactobacillus spicheri LMG 21871T Rice sourdough
21 Lactobacillus collinoides LMG 9194 T Fermenting apple juice
22 Lactobacillus buchneri LMG 6892T Tomato pulp
23 Lactobacillus hilgardii LMG 6895T Wine
24 Lactobacillus sanfranciscensis LMG 16002T San Francisco sourdough
25 Lactobacillus salivarius LMG 9477T Saliva
26 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum LMG 6907T Pickled cabbage
27 Lactobacillus sakei KACC 12414T Starter of sake(Moto)
28 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei KCTC 3510T Milk products
29 Lactobacillus gasseri LMG 9203 T Human
30 Lactobacillus delbrueckii spp.bulgaricus LMG 6901T Bulgarianyoghurt
31 Lactobacillus amylolyticus LMG 18796 T Acidified beer wort
32 Lactobacillus helveticus LMG 6413T Swiss Emmental cheese
33 Lactobacillus amylovorus KACC 12435 T Cattle waste-corn fermentation
34 Leuconostoc mesenteroides KACC 12312 T Fermenting olives
35 Lactococcus lactis KACC 13877 T N.D.
36 Weissella cibaria KACC 11862T Chili bo
KCTC, Korean Collection for Type Cultures, Republic of Korea;
KACC, Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea;
LMG, The Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms (BCCMTM), Belgium
N.D., Not determined.
T Type strain.
(2) 총 DNA의 추출
배양된 균주의 총 DNA는 Qiagen (Hilden, Germany)사의 genomic DNA 추출 키트 (DNeasy® Blood & Tissue Kit)를 이용하여 추출하였다.
(3) 특이 염기서열 정보 탐색을 위한 blastn 프로그램 이용 분석
락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트의 제작을 위해 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 유전체 정보 중 세포 표면 단백질(cell surface protein)(GenBank accession: protein ID WP_003684284.1)을 코딩하는 유전자(GenBank accession: NC_010610.1, AP008937.1, Locus tag: LAF_RS00860)를 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인하고 primer를 제작하였다(도 1 참조).
(4) 특이 프라이머 제작
락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)에서 96bp 크기의 단편(서열번호 5)을 증폭하는 ALLF96F와 ALLF96R 프라이머 세트를 제작하였다. 프라이머의 서열은 다음과 같다.
Figure 112019053073349-pat00001
ALLF 96F 프라이머 : 5'-CCG CTC CAC GAT CGC CCA AAA C-3' 22mer(서열번호 1)
Figure 112019053073349-pat00002
ALLF 96R 프라이머 : 5'-AGC CCC AGG ATC CCG CCG ACT AA-3' 23mer(서열번호 2)
<실시예 2> PCR 증폭 반응
PCR 증폭 반응은 PTC-200TM thermo cycler (MJ research, Watertown, mass)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 Tris-HCl 10mM, KCl 50mM, MgCl2 1.5mM, 젤라틴 0.01%, dNTP 각각 0.2mM, 프라이머 각각 20pM, Taq polymerase 2unit (Promega, Madison, Wis.)을 함유하는 PCR 혼합액으로 총 25㎕의 양으로 수행하였다. 상기 PCR 혼합액에 첨가한 미생물의 게놈 DNA 양은 약 25ng이었다. 반응은 95℃에서 5분간 변성하고 95℃ 60초, 65℃ 30초, 72℃ 60초로 35회 반복시킨 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 증폭반응 후 10㎕의 PCR 산물을 LoadingStar(DYNEBIO, Republic of Korea)로 착색시켜 1.5% 농도의 아가로스 젤(agarose gel)에서 전기영동한 후 UV transilluminator에서 확인하였다.
이전 연구(Journal of Microbiological Methods 115, 2015 94-99)에서 16S rDNA 유전자로 제작된 LFermF (5'-GCA CCT GAT TGA TTT TGG TCG-3')(서열번호 3) 및 LFermR (5'-GGT ATT AGC ATC TGT TTC CAA ATG-3')(서열번호 4) 프라이머는 본 발명에서 개발한 ALLF96F/R 프라이머와의 특이성을 비교 검증하기 위해 사용하였다.
<실시예 3> 실시간(Real-time) PCR 특이성 분석
Real-time PCR 증폭 반응은 CFX96 Real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 TB-Green premix Ex Taq (2x) (TAKARA Bio, Inc., Japan)과 ALLF96F/R 프라이머 각각 10pM을 함유하는 Real-time PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. Real-time PCR 혼합액에 첨가한 미생물의 genomic DNA 양은 약 5ng이었다. 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 67℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, melting curve와 melting peak를 위해 65~95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다(도 3).
<실시예 4> 실시간(Real-time) PCR 민감도 분석
Real-time PCR 증폭 반응은 CFX96 Real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 TB-Green premix Ex Taq (2x) (TAKARA Bio, Inc., Japan)과 ALLF96F/R 프라이머 각각 10pM을 함유하는 Real-time PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) LMG6902 genomic DNA와 cloned DNA 양은 약 5ng에서부터 10배씩 희석하였고, 미생물 현탁액은 O.D 600에서 0.1이 되게 맞춘 후 10배씩 희석하여 Real-time PCR 혼합액에 첨가하였다. Real-time PCR 증폭반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 67℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, melting curve와 melting peak를 위해 65~95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다(표 2).
표 2는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) LMG6902 클론 DNA, 게놈 DNA 및 세포 현탁액을 10배씩 단계적으로 희석하여 실시간 PCR 분석을 진행한 평균 Ct end-point fluorescence을 나타내며, 도 4는 표준 희석 계열(standard dilution series)에서 실시간 PCR의 민감성을 나타낸다.
Cloned DNA Genomic DNA Cell suspension
Weight/μl reaction mix Ct ± SD
(n = 3)		 Weight/μl reaction mix Ct ± SD
(n = 3)		 CFU/ml
reaction mix		 Ct ± SD
(n = 3)
5 ng
(1.47 × 109copies)		 14.98 ± 0.25 5 ng 19.27 ± 0.15 6.37 × 108 20.35 ± 0.26
500 pg
(1.47 × 108copies)		 18.12 ± 0.05 500 pg 22.56 ± 0.20 6.37 × 107 23.64 ± 0.18
50 pg
(1.47 × 107copies)		 21.28 ± 0.19 50 pg 25.84 ± 0.25 6.37 × 106 26.85 ± 0.20
5 pg
(1.47 × 106copies)		 24.37 ± 0.02 5 pg 29.24 ± 0.17 6.37 × 105 30.20 ± 0.23
500 fg
(1.47 × 105copies)		 27.43 ± 0.17 500 fg 32.44 ± 0.10 6.37 × 104 33.39 ± 0.23
50 fg
(1.47 × 104copies)		 30.74 ± 0.29 50 fg 35.71 ± 0.33 6.37 × 103 36.96 ± 0.55
5 fg
(1.47 × 103copies)		 33.69 ± 0.35 N.D. a N.D. N.D. a N.D.
a N.D., Not determined.
<실시예 5> 김치 시료를 이용한 실시간 PCR 증폭
김치 시료부터의 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 실시간(real-time) PCR을 이용한 정량분석을 위하여 제조일로부터 하루 정도 지난 포기김치와 백김치를 구입하여 밀폐된 용기에 담아 각각 4℃, 15℃ 와 25℃에서 발효 및 보관하였다.
실험을 위해 김치 국물 30ml 씩 4℃의 경우 일주일간격으로, 15℃와 25℃의 경우 하루간격으로 채취하였다. 전처리로 고춧가루와 같은 큰 입자를 제거하기 위해 멸균된 거즈 (Daehan, Korea)를 네 겹으로 접어 짜낸 뒤 나온 김치 국물을 사용하였다. 거즈로 거른 김치 국물 1ml을 1.5ml 튜브에 담고 13,000rpm으로 10분간 원심분리 한 다음 아래에 수집된 pellet을 이용하여 MPbio (OH, USA)사의 Fast DNA® spin kit for soil을 이용하여 total DNA를 추출한 후 실시간(real-time) PCR을 실시하였다. Real-time(real-time) PCR 증폭반응은 CFX96 real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 TB-Green Premix Ex Taq (2x), 프라이머는 각각 10pM을 함유하는 TB-Green PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 김치 시료의 total DNA 양은 약 5ng이었다. 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 67℃ 30초로 45회 반복시킨 후 65℃에서부터 0.5℃씩 간격으로 10초간 반응 후 증가시키면서 95℃까지 반응시키면서 melting 커브와 melting 피크를 실시하였다. 그 결과 특이 커브와 피크를 각각 확인하였고 밀도 변화를 도 5와 같이 정리하였다.
<실험예 1> 분석 균주별 PCR 증폭 반응
표 1의 균주들에 적용하여 서열번호 1과 2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)에 해당하는 레인 1-4번의 4개 균주들에서만 96bp 크기의 DNA 단편을 특이적으로 증폭하는 것을 확인하였다(도 2a). 또한, 상기 서열번호 3과 4의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)에 해당하는 레인 1-4번의 4개 균주들에서 103bp 크기의 DNA 단편을 증폭하는 것을 확인하였으나, 레인 5-36번에 해당하는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 이외의 균주들에서 비특이적인 DNA 단편과 진한 프라이머 다이머 밴드들이 증폭되는 것을 확인하였는 바, 본 발명의 프라이머에 비하여 특이성이 낮음이 확인되었다(도 2b).
따라서 서열번호 1과 2의 ALLF96F/R 프라이머 세트가 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)만을 특이적으로 증폭함을 검증하였다(도 2a).
<실험예 2> 실시간 PCR 특이성 분석 결과
도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)에서만 특정 온도 (84.0℃)에서 melting peak를 확인할 수 있었다.
<실험예 3> 실시간 PCR 민감도 분석 결과
도 4의 standard curve의 R2값과 E값이 적정범위에 있는 것으로 보아 유효한 데이터로 판명할 수 있으며 genomic DNA와 cloned DNA는 각각 50 fg와 5 fg, bacterial cell suspension에서는 6.37 × 103에서 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)를 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
<실험예 4> 김치 총 DNA를 이용한 실시간 PCR 증폭결과
도 5는 본 발명의 프라이머 ALLF96F와 ALLF96R을 사용하여, 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)에 대하여 실시간(real-time) PCR 기법으로 25℃에서 보관된 백김치에 적용하여 밀도 변화를 관찰한 결과이다. 0일~2일차 까지는 검출되지 않다가 3일차에 Ct 값 34.62에서 처음 검출되었고, 이후부터는 Ct 값 31.33~34.14사이에서 밀도가 일정하게 유지되었다. 4, 15, 25℃에서 보관된 포기김치에 적용한 결과 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)는 검출되지 않았고, 4, 15℃에서 보관된 백김치에 적용한 결과 또한 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)는 검출되지 않았다. 따라서 25℃에서 보관한 백김치에서만 검출되는 것이 확인되었다.
결론적으로, 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 cell surface protein특이 DNA 단편으로부터 제작된 ALLF96F/R 프라이머는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 특이적인 검출을 위한 PCR 프라이머로 이용이 가능하다는 것을 알 수 있으며, 김치시료 내 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 정성, 정량분석과 밀도변화의 모니터링에 적용 가능하다는 것이 확인되었다.
<110> Republic of Korea <120> Marker for discriminating Lactobacillus fermentum and use thereof <130> DP20190077 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALLF 96F primer <400> 1 ccgctccacg atcgcccaaa ac 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALLF 96R primer <400> 2 agccccagga tcccgccgac taa 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LFermF primer <400> 3 gcacctgatt gattttggtc g 21 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LFermR primer <400> 4 ggtattagca tctgtttcca aatg 24 <210> 5 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus fermentum cell surface protein partial sequence <400> 5 ccgctccacg atcgcccaaa acgaccgggt ccaagaacaa agccaaaaga accagaccct 60 ctactacttc gttttagtcg gcgggatcct ggggct 96

Claims (9)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 판별용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 세포 표면 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인, 프라이머 세트.
  3. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 판별용 조성물.
  4. 제3항의 조성물을 포함하는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 판별용 키트.
  5. 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum)의 판별방법.
  6. 제5항에 있어서,
    시료는 김치 또는 김치 국물을 포함하는, 판별방법.
  7. 제5항에 있어서,
    증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 반응을 포함하는, 판별방법.
  8. 제7항에 있어서, 중합효소연쇄반응(PCR)은 실시간(real-time) PCR을 포함하는 것인, 판별방법.
  9. 제5항에 있어서,
    증폭 산물의 검출은 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 포함하는, 판별방법.
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