KR102000463B1 - 바실러스 벨레젠시스 특이 검출 및 선발을 위한 마커 및 이를 이용한 분석 방법 - Google Patents

바실러스 벨레젠시스 특이 검출 및 선발을 위한 마커 및 이를 이용한 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바실러스 벨레젠시스 특이 검출 및 선발을 위한 마커 및 이를 이용한 분석 방법에 관한 것으로, 토양 및 김치 등의 발효식품 등에서 발견되는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 통해 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)를 정량 및 정성 분석할 수 있고, 김치 및 토양 내 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 밀도 변화를 모니터링할 수 있다.

Description

바실러스 벨레젠시스 특이 검출 및 선발을 위한 마커 및 이를 이용한 분석 방법{Marker for specifically detecting and selecting Bacillus velezensis and method for analyzing Bacillus velezensis using the same}
본 발명은 바실러스 벨레젠시스 특이 검출 및 선발을 위한 마커 및 이를 이용한 분석 방법에 관한 것이다.
바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 메틸로트로픽쿠스(Bacillus methylotrophicus), 바실러스 오르지콜라(Bacillus orzycola)라는 주관적 동종이명(subjective synonym)으로 불리기도 하며, 그람 양성균으로, 내생포자를 형성하고 호기성이며 콜로니는 하얀색의 둥근모형의 특성을 가진다. 균의 이름에서도 알 수 있듯이 에탄올과 메탄올을 에너지로 활용할 수 있다. 또한, 식물의 생장을 촉진한다고 알려진 ACC 탈아미노효소(aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase) 활성과 사이드로포어(siderophore) 생성 및 황 산화(sulfuroxidation) 활성 등 농업 기술로 활용할 수 있는 다양한 요소들을 가지고 있는 균으로 알려져 있다(Madhaiyan M 등, International journal of systematic and evolutionary microbiology, 제60권 제10호 제2490-2495면). 따라서, 토양 등의 시료로부터 바실러스 벨레젠시스를 검출하여 식물의 생장 촉진 등 다양한 농업 기술에 활용할 수 있고, 이를 활용한 비료 또는 농약을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)는 김치와 같은 발효물에도 존재하는데, 종래에는 이 균에 특이적인 배양조건상에서 도말 배양함으로써 형성된 콜로니(colony)의 형태나 수를 확인해왔다. 그러나, 도말 배양은 인위적인 배양조건에서 생존할 수 있는 미생물의 개체 수만 측정할 수 있어, 실제 김치에 존재하여 발효에 중요한 역할을 하는 미생물이 시료의 준비과정이나 배양과정에서 사멸될 수 있으며, 미생물이 배양된다 하더라도 균주가 콜로니를 형성하기까지 다소 시간이 소요되며, ribosomal RNA (rRNA) 오페론 서열, 특히 16S rRNA 유전자를 기반으로 하는 종의 식별은 그 서열이 큰 차이가 없으므로 구별하기 어렵기 때문에 특이성(specificity)과 민감성(sensitivity)이 낮은 단점이 있었다.
Madhaiyan M 등, International journal of systematic and evolutionary microbiology, 제60권 제10호 제2490-2495면
본 발명의 목적은 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 만을 정확하게 검출하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 특이 프라이머 세트 및 이의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 판별 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SEQ ID NOS: 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 SEQ ID NOS: 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 판별용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 판별방법을 제공한다.
본 발명은 토양뿐만 아니라 김치 및 발효식품 등에서 발견되는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 통해 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)를 정량 및 정성 분석할 수 있고, 김치, 토양 내 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 밀도 변화를 모니터링할 수 있다.
도 1은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 아종 플란타룸 에스티알(Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum str.) UCMB5036의 putative hydrolase 유전자를 이용한 Blastn 검색 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 각 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭 결과를 도시한 것으로, M은 사이즈 마커(1 kb DNA plus ladder; Gibco BRL)이고, 레인 1 내지 12는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주, 레인 13 내지 32는 표 1에 나열된 바와 같은 다른 바실러스(Bacillus) 종에 속하는 균주들이고, 레인 33은 음성 대조군 (증류수)의 결과이다.
도 3은 종-특이적인 BAm249F/R 프라이머 세트를 이용한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 아종 플란타룸 에스티알(Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum str.) UCMB5036의 유래의 putative hydrolase의 실시간 PCR 결과이다. 도 3에서 멜팅-피크 결과는 약 86℃의 융점 (Tm)에서 증폭된 산물을 나타낸다.
도 4는 표준 희석에서 실시간 PCR의 민감성을 나타낸 것으로, 표준 곡선은 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 표준 희석의 교차점으로 알려진 threshold cycles (Ct)로부터 제작되며, 모든 곡선은 R2>0.99인 것으로 임증되며, (A)는 게놈 DNA, (B)는. 클론 DNA, (C)는 세균 세포 현탁액이다.
도 5는 4℃에서의 보관 동안 포기김치 및 백김치의 총 DNA 중 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 정량화에 대한 실시간 PCR의 Ct 값의 변화를 도시한 것이다.
도 6은 15℃ 및 25℃에서의 보관 동안 포기김치 및 백김치의 총 DNA 중 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 정량화에 대한 실시간 PCR의 Ct 값의 변화를 도시한 것이다.
도 7은 토양의 총 DNA 중 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 정량화에 대한 실시간 PCR의 Ct 값의 변화를 도시한 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 SEQ ID NOS: 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 판별용 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연적으로 발생하는(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
상기 프라이머들은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 아종 플란타룸 에스티알(Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum str.) UCMB5036의 putative hydrolase(등록번호: GenBank Accession No. HF563562.1; SEQ ID NO.: 3)에 특이적인 SEQ ID NO: 1로 표시되는 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 SEQ ID NO: 2로 표시되는 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함한다.
본 발명의 상기 프라이머 세트는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)(또는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 아종 플란타룸 에스티알(Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum str.) UCMB5036)의 putative hydrolase 유전자(SEQ ID NO.: 3)의 263번 내지 512번으로 이루어진 249bp 핵산 단편을 증폭시키는 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명은 또한 SEQ ID NOS: 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 프라이머 세트 외에도 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 증폭 반응은 PCR 반응이 바람직하고, 이를 위한 DNA 중합효소, dNTP 및 PCR 반응 완충용액을 추가로 포함할 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 품종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 판별방법에 관한 것이다.
상기 시료는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)를 포함한 토양, 또는 김치, 발효식품, 유제품 등의 식품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 토양, 또는 포기김치 또는 포기김치 국물이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 판별방법에 있어서, 상기 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 putative hydrolase 유전자의 DNA는 게놈 DNA와 클론(cloned) DNA를 포함한다. 상기 DNA는 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 SDS 추출법(Tai et al. Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al. Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 분리될 수 있으며, 예를 들면, Fast DNA spin kit for soil(Mp Biomedicals)나 게놈(genomic) DNA 추출 키트(DNeasy®Blood & Tissue Kit(Qiagen (Hilden, Germany))를 이용할 수 있다.
상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 putative hydrolase 유전자의 표적 서열을 증폭할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 본 발명의 기술 분야에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C.등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사 중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop mediated isothermal amplification; LAMP), Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 반응, 또는 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system) 등을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭방법들은 미국특허 제5,242,794호, 제5,494,810호, 제4,988,617호 및 미국 특허 출원 제09/854,317호에 기술되어 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 증폭 반응은 실시간 PCR을 수행한다. 실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술로, PCR 생산물의 증가가 타겟 주형의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클(cycle)에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 CT 값(threshold cycle)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플 리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.
PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 CT 값이 산출된다.
실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 인터킬레이팅(interchelating) 방법(SYBR 그린I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. 인터킬레이팅 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다.
상기 실시간 PCR에 의한 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 putative hydrolase 유전자의 검출의 최소 DNA 양은 5 fg(femtogram) 내지 5ng(nanogram)인 것이 바람직하고, 최소 5 fg만 있어도 검출이 가능하므로 검출감도가 매우 높은 것이다.
본 발명의 판별방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 SSR 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 판별방법에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 젤 전기영동을 수행할 수 있으며, 젤 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 젤 전기영동 또는 아가로스 젤 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 putative hydrolase 유전자에 특이적인 SEQ ID NO: 1의 프라이머 및 SEQ ID NO: 2의 프라이머는 같은 속 다른 종의 균주들은 검출하지 못한 반면, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 종만을 검출하였다(도 2 참조). 또한, 게놈 DNA와 클론 DNA는 각각 50 fg 및 5 fg, 세균 세포 현탁액에서는 OD600 1×10-4에서도 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)를 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(표 2 참조).
또한, 본 발명의 SEQ ID NO: 1의 프라이머 및 SEQ ID NO: 2의 프라이머는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)에 특이적이고 민감성이 높다. 따라서 본 발명의 프라이머 세트는 실시간 PCR 방법을 통해 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 정량, 정성 분석과 토양, 김치 내에서 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 밀도 변화를 신속, 정확하게 판단할 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 바실러스 벨레젠시스에 특이적인 프라이머 제작
(1) 세균 균주와 배양 조건
본 발명에서 사용된 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)를 포함한 기타 미생물은 벨기에의 Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms (BCCMTM)와 Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea (KACC)에서 분양 받았으며, 이들의 출처는 표 1에 정리하였다. 바실러스(Bacillus) 균주들은 NA, R2A 배지로 30℃, 37℃에서 각각 이틀 배양하였다.
PCR 특이도 시험에 사용된 세균 균주
No. 학명
(주관적 동종이명)		 입수처a 숙주
1 Bacillus amyloliquefaciens(Bacillus velezensis) LMG 12331 N.D.b
2 Bacillus amyloliquefaciens KACC 10116T Takamine bacterial amylase concentrate
3 Bacillus amyloliquefaciens KACC 17029 Soil
4 Bacillus amyloliquefaciens KACC 17030 Soil
5 Bacillus amyloliquefaciens KACC 17031 Soil
6 Bacillus amyloliquefaciens KACC 17032 Soil
7 Bacillus amyloliquefaciens subsp . amyloliquefaciens LMG 12325 N.D.
8 Bacillus amyloliquefaciens subsp . amyloliquefaciens LMG 12326 N.D.
9 Bacillus amyloliquefaciens subsp . plantarum LMG 26770T N.D.
10 Bacillus amyloliquefaciens subsp . plantarum LMG 12384 N.D.
11 Bacillus amyloliquefaciens subsp . plantarum LMG 17599 N.D.
12 Bacillus amyloliquefaciens subsp . plantarum LMG 22478 N.D.
13 Bacillus subtilis KACC 10113 Soil
14 Bacillus subtilis KACC 10114 Adenine and phenylalanine-requiring mutant
15 Bacillus subtilis KACC 11994 Rhizosphere of Brassica napus
16 Bacillus methylotrophicus LMG 27586T N.D.
17 Bacillus subtilis subsp . subtilis LMG 7135T N.D.
18 Bacillus subtilis KACC 10111 N.D.
19 Bacillus subtilis subsp . spizizenii LMG 19156T N.D.
20 Bacillus licheniformis LMG 12363T N.D.
21 Bacillus pumilus LMG 18928T N.D.
22 Bacillus sonorensis LMG 21636T N.D.
23 Bacillus vallismortis LMG 18725T N.D.
24 Bacillus atrophaeus KACC 12090T Soil
25 Bacillus alveayuensis KACC 13323T Deep sea sediment of the Ayu Trough (4000 m below sea level) in the western Pacific Ocean
26 Bacillus pocheonensis KACC 14006T Soil, ginseng field
27 Bacillus kribbensis KACC 14005T Soil
28 Bacillus circulans KACC 14392T Soil
29 Bacillus firmus KACC 10897T N.D .
30 Bacillus jeotgali KACC 17399T Jeotgal
31 Bacillus niabensis KACC 11279T N.D .
32 Bacillus litoralis KACC 12148T Sea water
KACC, Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea; LMG, The Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms (BCCMTM),Belgium
a Superscript "T" indicates type strain.
b N.D., Not determined
(2) 총 DNA의 추출
배양된 균주의 총 DNA는 Qiagen (Hilden, Germany)사의 genomic DNA 추출 키트(DNeasy® Blood & Tissue Kit)를 이용하여 추출하였다.
(3) 특이 염기서열 정보 탐색을 위한 blastn 프로그램 이용 분석
바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트의 제작을 위해 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Genbank (www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 아종 플란타룸 에스티알(Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum str.) UCMB5036의 유전체 정보 (GenBank accession NC_020410.1, gi|452854062:275325-276725, protein ID WP_015416741.1) 중 putative hydrolase 유전자를 (등록번호 : GenBank Accession No. 452854312) blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인하고 프라이머를 제작하였다 (도 1 참조).
(4) 특이 프라이머 제작
바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)에서 249bp 크기의 단편을 증폭하는 BAm249F와 BAm249R 프라이머 세트를 제작하였다. 프라이머의 서열은 다음과 같다.
BAm249F 프라이머 : 5'-GTC CGG GGG CAT TGG CTG AG-3' 20mer
BAm249R 프라이머 : 5'-CCC CCT GCA CAT AGA CGG ACT GA-3' 23mer
상기 프라이머는 GenBank 등록된 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 아종 플란타룸 에스티알(Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum str.) UCMB5036 균주의 putative hydrolase 유전자의 서열정보를 blastn 프로그램을 통해 특이성을 확인 후 제작되었다.
(5) PCR 증폭 반응
PCR 증폭 반응은 PTC-200TM thermocycler (MJ research, Watertown, mass)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 10× Hot Taq buffer, dNTP 각각 10mM, 프라이머 각각 10pM, IncloneTM Hot Taq DNA polymerase 1.25unit (Inclone biotech, korea)을 함유하는 PCR 혼합액으로 총 25㎕의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 몇몇 미생물의 게놈 DNA 양은 약 25ng이었다. 반응은 95℃에서 5분간 변성하고 95℃ 60초, 67℃ 30초, 72℃ 60초로 35회 반복시킨 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 증폭반응 후 10㎕의 PCR 산물을 LoadingStar로 (DYNEBIO, Republic of Korea) 착색시켜 1.5% 농도의 아가로스 젤 (agarose gel)에서 전기영동한 후 UV transilluminator에서 확인하였다.
(6) 실시간 PCR 특이성 분석
실시간 PCR 증폭 반응은 CFX96 Real-time PCR system(Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 SYBR premix Ex Taq(2x)(TAKARA Bio, Inc., Japan)과 BAm249F/R 프라이머 세트 각각 5pM을 함유하는 실시간 PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. 실시간 PCR 혼합액에 첨가한 미생물의 게놈 DNA 양은 약 5ng이었다. 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 67℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, 멜팅 커브와 멜팅 피크를 위해 65~95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다.
(7) 실시간 PCR 민감도 분석
실시간 PCR 증폭 반응은 CFX96 Real-time PCR system(Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 SYBR premix Ex Taq(2x)(TAKARA Bio, Inc., Japan)과 BAm249F/R 프라이머 세트 각각 5pM을 함유하는 실시간 PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KACC 10116의 게놈 DNA와 클론 DNA 양은 약 5ng에서부터 10배씩 희석하였고, 미생물 현탁액은 O.D 600에서 0.1이 되게 맞춘 후 10배씩 희석하여 실시간 PCR 혼합액에 첨가하였다. 실시간 PCR 증폭반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 67℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, 멜팅 커브와 멜팅 피크를 위해 65~95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다.
바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KACC 10116 클론 DNA, 게놈 DNA 및 실시간 PCR 분석으로 측정된 세포 현탁액의 10배 연속 희석액의 평균 Ct 엔드-포인트 형광
클론DNA 게놈 DNA 세포 현탁액
Weight/㎕ reaction mix Ct ± SD a
(n = 3)		 Weight/㎕ reaction mix Ct ± SD
(n = 3)		 세포밀도 b Ct ± SD
(n = 3)
5 ng(1.42 Х 109copies) 8.93 ± 0.16 5 ng 16.55 ± 0.15 OD600=0.1 22.22 ± 0.11
500 pg (1.42 Х 108copies) 12.22 ± 0.12 500 pg 19.73 ± 0.07 OD600=0.01 25.34 ± 0.15
50 pg (1.42 Х 107copies) 15.51 ± 0.19 50 pg 23.11 ± 0.05 OD600=0.001 28.76 ± 0.41
5 pg (1.42 Х 106copies) 18.83 ± 0.14 5 pg 26.40 ± 0.05 OD600=0.0001 33.00 ± 0.41
500 fg (1.42 Х 105copies) 21.96 ± 0.28 500 fg 29.91 ± 0.23 OD600=0.00001 N.D.
50 fg (1.42 Х 104copies) 25.53 ± 0.05 50 fg 33.14 ± 0.31 OD600=0.000001 N.D.
5 fg (1.42 Х 103copies) 29.21 ± 0.09 5 fg N.D. c OD600=0.0000001 N.D.
a SD, Three reactions standard deviation.
b OD=600nm
c N.D., Not detected.
(8) 김치 시료를 이용한 실시간 PCR 증폭
김치 시료부터의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 실시간 PCR을 이용하여 정량분석을 위하여 시중에 판매되고 있는 제조일로부터 하루 정도 지난 포기김치와 백김치를 구입하여 밀폐된 용기에 담아 각각 4℃, 15℃ 와 25℃에서 발효, 보관하였고 실험을 위해 김치 국물 30mL 씩 4℃의 경우 일주일 간격으로, 15℃와 25℃의 경우 하루 간격으로 채취하였으며 전처리로 고춧가루와 같은 큰 입자를 제거하기 위해 멸균된 거즈 (Daehan, Korea)를 네 겹으로 접어 짜낸 뒤 나온 김치 국물을 사용하였다. 거즈로 거른 김치 국물 1mL을 1.5mL-튜브에 담고 13,000rpm으로 10분간 원심분리 한 다음 아래에 수집된 펠렛을 이용하여 MPbio (OH, USA)사의 Fast DNA® spin kit for soil을 이용하여 총 DNA를 추출한 후 실시간 PCR을 실시하였다. 실시간 PCR 증폭반응은 CFX96 real-time PCR system(Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 SYBR Premix Ex Taq (2x), 프라이머는 각각 5pM을 함유하는 SYBR-Green PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 김치 시료의 총 DNA 양은 약 5ng이었다. 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 65℃ 30초로 45회 반복시킨 후 65℃에서부터 0.5℃씩 간격으로 10초간 반응 후 증가시키면서 95℃까지 반응시키면서 멜팅 커브와 멜팅 피크를 실시하였다. 그 결과 특이 커브와 피크를 각각 확인하였고 밀도 변화를 도 5, 6과 같이 정리하였다.
(9) 토양 시료를 이용한 real-time PCR 증폭
토양 시료부터의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 실시간 PCR을 이용하여 정량분석을 위하여 멸균된 토양 100g에 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) KACC 10116 OD600=0.001이 포함된 증류수 100mL을 각각 접종하여 일주일간격으로 채취하였으며, MPbio (OH, USA)사의 Fast DNA® spin kit for soil을 이용하여 총 DNA를 추출한 후 실시간 PCR을 실시하였다. 실시간 PCR 증폭반응은 CFX96 real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 SYBR Premix Ex Taq (2x), 프라이머는 각각 5pM을 함유하는 SYBR-Green PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 김치 시료의 총 DNA 양은 약 5ng이었다. 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 67℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, 65℃에서부터 0.5℃씩 간격으로 5초간 반응 후 증가시키면서 95℃까지 반응시키면서 멜팅 커브와 멜팅 피크를 실시하였다. 그 결과 특이 커브와 피크를 각각 확인하였고 밀도 변화를 도 7과 같이 정리하였다.
<실험예 1> 분석 균주별 PCR 증폭 반응
도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주에서만 249bp 크기의 핵산 단편이 특이적으로 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 레인 13 내지 16의 Korean Agricultural Culture Collection (KACC)의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주 10113, 10114, 그리고 11994는 도 2에서와 같이 249bp 크기의 핵산 단편이 증폭된 것으로 확인되어 이들 균주들의 명칭이 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 오기인 것으로 입증되었는 바 KACC에 정보변경 요청하였다.
이로부터 상기 프라이머 세트는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주만을 특이적으로 증폭함을 알 수 있었다.
<실험예 2> 실시간 PCR 특이성 분석 결과
도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주에서만 특정 온도 (86℃)에서 멜팅 피크를 확인할 수 있었다.
<실험예 3> 실시간 PCR 민감도 분석 결과
도 4의 표준 곡선의 R2값과 E값이 적정범위에 있는 것으로 보아 유효한 데이터로 판명할 수 있으며 게놈 DNA는 50fg, 클론 DNA는 5fg, 세균 세포 현탁액에서는 각각 OD600 1×10-4에서도 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주를 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(표 2 참조).
<실험예 4> 김치 총 DNA를 이용한 실시간 PCR 증폭결과
도 5는 본 발명의 프라이머 세트 BAm249F와 BAm249R를 사용하여, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주에 대하여 실시간 PCR 기법으로 4℃에서 보관된 포기김치에 적용하여 밀도 변화를 관찰한 결과이다. 포기김치의 경우, Ct 값 29.04에서 처음 검출되었고, 그 이후부터는 Ct 값 32.12까지 밀도가 서서히 감소하였다. 백김치의 경우, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 가 검출되지 않았다.
도 6은 15℃와 25℃에서 보관된 포기김치와 백김치에 적용하여 밀도 변화를 관찰한 결과로, 15℃의 포기김치의 경우, Ct 값 26.81에서 처음 검출되었고 그 이후부터는 Ct 값 30.48까지 서서히 감소하였다. 15℃의 백김치의 경우, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)가 검출되지 않았다. 25℃의 포기김치의 경우, Ct 값 26.61에서 처음 검출되었고 그 이후부터는 Ct 값 31.75까지 서서히 감소하였다. 25℃의 백김치의 경우, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)가 검출되지 않았다.
<실험예 5> 토양 총 DNA를 이용한 실시간 PCR 증폭결과
도 7은 본 발명의 프라이머 BAm249F와 BAm249R을 사용하여, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)에 대하여 실시간 PCR 기법으로 멸균된 토양에 적용하여 밀도 변화를 관찰한 결과이다. Ct 값 29.64에서 처음 검출되었고 그 이후부터는 Ct 값 28.01에서 31.95까지 밀도가 유지되었다.
결론적으로, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 putative hydrolase 유전자의 특이 DNA 단편으로부터 제작된 BAm249F/R 프라이머는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)를 특이적인 검출을 위한 PCR 프라이머로 이용이 가능하다는 것을 알 수 있으며, 토양 내 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 정성, 정량분석과 밀도변화의 모니터링에 적용 가능하다는 것이 확인되었다.
<110> Republic of Korea <120> Marker for specifically detecting and selecting Bacillus velezensis and method for analyzing Bacillus velezensis using the same <130> P18R12C0576 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAm249F primer <400> 1 gtccgggggc attggctgag 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAm249R primer <400> 2 ccccctgcac atagacggac tga 23 <210> 3 <211> 1401 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum str. UCMB5036 <400> 3 atgaataaag aagaattgaa acagctggct ctccgaatcg gaaacgtacc tgcccgctac 60 gagagtaatg tggaagaata ccaggaagat gaggttctgt tttggtggga agataagaat 120 gatccggaag ccggcatcat ggtcgaatta gaccgggacg gaaaactgaa atacttatcc 180 cgtccggctt tccagactga tctgccggct ctttcggaat cggacataga agaacggatg 240 cgggcgtttt tagaaaccca tcgtccgggg gcattggctg agtttgaacc ggaaaaaaac 300 ggacccgcaa atgatggcga tgtgagatat tcctatgttc agatggctga cggtctgccg 360 cttccgctga ccgggtttta catcgacctg gctgtgacag gggaagtaac cggcttttct 420 taccatggga aggccgatga tctgttaaga ccggagacaa ttgcggacaa gcgggaagca 480 ttggctcact ttgtcaaaca tattgaagca gagctgttgt tcaccgtcct gcatcagtcc 540 gtctatgtgc agggggatga caagccccat ctcgtctatg aaatcgtgtc tccgacgcgg 600 ccgatatcgg ccgacctgaa ggaagagaat gcagaattag acgaatatga agagctggaa 660 gacgaaacgc ggccgtatgt cccgatttca cgccctgcac ctgaagcgga aaagatgagc 720 atcaatgaca tgatcgggct gcacgacggt ttttataaag atagggaaag cgatcttgga 780 gagggctgta tcggcattgc ctggcgtcct gaaaaaacaa aatccgtgcg ggaagataaa 840 agcttggaaa gtctgtttaa agaacggaat gaacacgtat tgaaaacaag atatgataaa 900 gaatcgggcc ggctcaccgg ggtgatgtca tttataaaag ttgaaggcga atcggtgttt 960 tccgaggaag aatgccatca catggccatc cgctttttat tcgccatgtt tccggaagcg 1020 gatcagtatt tccgggttca atatgatgaa ccggatgatg aaggagaaaa cgcagggctt 1080 acatataagg cttgttcgga cggcgttgat ttgcgattcg gagaggggag aatctgtgtc 1140 agcaaaaaga cgggtcttgt cactttttat atgccgccgg aaattgatcc gaaagagctc 1200 caggaaatcg atcccgttcc ttcattgaca atggaagagg cgaaggacgc gatccgccgg 1260 gccatcaaag ccgagctcgc ttgggatcgt tgttacgatg acgacagctg cggaaaagtg 1320 tacaggctcg tatacaagcc ggttttcccg cggtttattg aggctcatac aggggaagcg 1380 atcacgagtt taataggctg a 1401

Claims (9)

  1. SEQ ID NOS: 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 판별용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    프라이머 세트는 SEQ ID NO.: 3에 기재된 putative hydrolase 유전자에 특이적인, 조성물.
  3. SEQ ID NOS: 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 판별용 키트.
  4. 제3항에 있어서,
    증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함하는, 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs 및 완충용액을 포함하는, 키트.
  6. 시료에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기로부터 얻은 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 판별방법.
  7. 제6항에 있어서,
    시료는 토양, 또는 포기김치 또는 이의 김치 국물을 포함하는, 판별방법.
  8. 제6항에 있어서,
    증폭 반응은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 반응을 포함하는, 판별방법.
  9. 제6항에 있어서,
    증폭 산물의 검출은 젤 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 포함하는, 판별방법.

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