KR102293251B1 - 인삼 뿌리썩음병원균 길항미생물 검출용 핵산 분자 및 이를 포함하는 검출 키트 - Google Patents
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Abstract
인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물 검출 가능한 핵산 분자, 이를 포함하는 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물 검출용 키트, 및 상기 핵산 분자 및/또는 키트를 이용한 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물 검출 방법이 제공된다.
Description
인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물 검출 가능한 핵산 분자, 이를 포함하는 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물 검출용 키트, 및 상기 핵산 분자 및/또는 키트를 이용한 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물 검출 방법이 제공된다.
인삼 뿌리썩음병은 인삼 재배에 있어서 수확량에 영향을 주는 질병 중 하나로, 이에 의한 인삼의 수확량 감소량이 약 30~50%에 달한다고 보고되어 있다.
이러한 인삼 뿌리썩음병을 방제하기 위하여, 토양훈증제를 사용하는 화학적 방법, 담수, 벼재배, 증기소독에 의한 물리적 방법, 길항미생물을 이용한 생물학적 방제법 등의 다양한 방법이 사용되고 있다.
토양 훈증제를 토양에 처리하는 화학적 방법의 경우, 토양 내 유익균까지 죽이는 결과를 초래하며, 물리적 방법인 담수처리, 태양열 소독 등은 수행과정이 까다롭고 시간이 많이 소요되나 방제효과에 대한 신뢰성이 낮다는 문제가 있다.
따라서, 인삼 뿌리썩음병의 보다 안전하고 효율적인 방제를 위하여, 인삼 뿌리썩음병원균에 대하여 길항작용을 하는 미생물을 이용한 생물학적 방제법이 각광받고 있으며, 이를 위하여, 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물 처리 후의 토양 내 정착 및 증식여부를 모니터링할 수 있는 효율적인 검정 기술의 개발이 요구된다.
일 예는 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물의 유전체 중 특정 부위의 핵산 서열 또는 이에 혼성화 가능한 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 상기 핵산 분자는 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물의 검출 용도로 사용될 수 있다.
다른 예는 상기 핵산 분자를 포함하는, 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물의 검출용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 핵산 분자 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물의 검출용 키트를 제공한다.
다른 예는 시료 내의 DNA에 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물 검출용 핵산 분자를 처리하여 표적 서열을 증폭시키는 단계를 포함하는, 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물 검출 방법을 제공한다.
상기 핵산 분자, 조성물, 키트, 및 방법에 있어서, 상기 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물은 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis), 예컨대, 바실러스 벨레젠시스 ARRI17 균주일 수 있다.
일 예는 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물의 유전체 중 특정 부위의 핵산 서열 또는 이에 혼성화 가능한 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 상기 핵산 분자를 포함하는, 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물의 검출용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 핵산 분자 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물의 검출용 키트를 제공한다.
다른 예는 시료 내의 DNA에 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물 검출용 핵산 분자를 처리하여 표적 서열을 증폭시키는 단계를 포함하는, 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물 검출 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상기 인삼 뿌리썩음병원균은 인삼 뿌리썩음병의 원인균으로서, 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 피시윰 속 균주(Pythium sp .), 파이톱쏘라 켁토륨(Phytophthora cactorum), 어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 인삼 뿌리썩음병원균은 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans)일 수 있다.
상기 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물은 인삼 뿌리썩음병원균에 대하여 항균 활성을 갖는 세균을 의미하는 것으로, 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis)일 수 있고, 보다 구체적으로, 바실러스 벨레젠시스 ARRI17 균주 (Bacillus velezensis ARRI17 strain; KFCC11778P)일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 핵산 분자는 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis), 예컨대, 바실러스 벨레젠시스 ARRI17 균주의 유전체 중 특정 부위 (표적 부위)의 핵산 서열 또는 이에 혼성화 가능한 핵산 서열을 포함하거나, 상기 핵산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 특정 부위는 바실러스 벨레젠시스 균주의 특이적인 마커 유전자일 수 있고, 예컨대 RecA 유전자일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 핵산 분자는 바실러스 벨레젠시스 (예컨대, 바실러스 벨레젠시스 ARRI17 균주)의 RecA 유전자의 일부 (예컨대, 5 내지 100 nt, 5 내지 75 nt, 5 내지 50 nt, 5 내지 45 nt, 5 내지 40 nt, 10 내지 100 nt, 10 내지 75 nt, 10 내지 50 nt, 10 내지 45 nt, 10 내지 40 nt, 15 내지 100 nt, 15 내지 75 nt, 15 내지 50 nt, 15 내지 45 nt, 또는 15 내지 40 nt 길이 유전자 단편) 핵산 서열 또는 이와 혼성화 가능한 핵산 서열을 포함하거나, 상기 핵산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 핵산 분자는 5 내지 100 nt, 5 내지 75 nt, 5 내지 50 nt, 5 내지 45 nt, 5 내지 40 nt, 10 내지 100 nt, 10 내지 75 nt, 10 내지 50 nt, 10 내지 45 nt, 10 내지 40 nt, 15 내지 100 nt, 15 내지 75 nt, 15 내지 50 nt, 15 내지 45 nt, 또는 15 내지 40 nt 길이를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 '혼성화'는 단일 가닥 핵산이 상보적인 핵산 서열을 갖는 다른 단일 가닥 핵산과 결합하여 이중가닥을 이루는 것을 의미하는 것으로, 본 명세서에서 '혼성화 가능하다'고 함은 서로 표적 부의의 단일 가닥 핵산 서열과 완전히 상보적인 핵산 서열을 가지거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 이중 가닥을 이룰 수 있는 것을 의미할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 핵산 분자는
서열번호 1의 핵산 분자 및 서열번호 2의 핵산 분자;
서열번호 3의 핵산 분자; 또는
이들의 조합
을 포함하는 것일 수 있다:
(서열번호 1: 5'-ACAAAGTCGCTCCTCCGTTC-3'
서열번호 2: 5'-TCCAAGGTCGATGATTTCCC -3'
서열번호 3: 5'-CTTCTTTGGAGATTCCTTCACCGTACATAATGTCC-3').
바실러스 벨레젠시스, 예컨대, 바실러스 벨레젠시스 ARRI17 균주 유전체 DNA에 대하여, 상기 서열번호 1의 핵산 분자는 정방향 프라이머로, 서열번호 2의 핵산 분자는 역방향 프라이머로, 서열번호 3의 핵산 분자는 프로브로서 작용할 수 있다.
상기 핵산 분자는 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물, 구체적으로, 바실러스 벨레젠시스, 예컨대, 바실러스 벨레젠시스 ARRI17 균주의 검출 용도로 사용될 수 있다.
일 예에서, 상기 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물, 구체적으로, 바실러스 벨레젠시스, 예컨대, 바실러스 벨레젠시스 ARRI17 균주의 검출 용도로 사용되는 핵산 분자는,
서열번호 1의 정방향 프라이머로 및 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍; 또는
상기 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브
를 포함하는, 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물, 구체적으로, 바실러스 벨레젠시스, 예컨대, 바실러스 벨레젠시스 ARRI17 균주의 검출용 핵산 분자 세트일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 검출 키트에 있어서, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 증폭시에 통상적으로 사용되는 모든 시약을 포괄하는 것으로, 예컨대, DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 본 명세서에서 제공되는 키트는, 상기한 프라이머 세트 외에, 통상적으로 PCR 반응 (예컨대, 통상적인 real-time PCR 등) 및 염기서열 분석에 필요한 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 통상적으로 PCR 반응 및 염기서열 분석에 필요한 물질은 DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소 등), dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 반응 완충액, 증류수 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 PCR 반응 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물 검출 방법은 시료로부터 추출된 DNA에 상기 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물 검출용 핵산 분자를 처리하여 표적 서열을 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 표적 서열은 상기 핵산 분자에 의하여 증폭되는 유전자 부위를 의미한다.
상기 시료는 인삼 재배지로부터 얻은 토양 시료 (토양 재배시), 배양액 (수경 재배시) 등일 수 있다.
상기 시료 내의 DNA는 상기 시료로부터 통상적인 방법으로 추출된 DNA일 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 시료에 존재하는 세포, 예컨대, 세균, 진균 등의 미생물, 동물 세포, 식물 세포 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로부터 통상적인 방법으로 추출된 DNA일 수 있다.
일 예에서, 상기 검출 방법은, 상기 증폭시키는 단계 이전에, 상기 시료로부터 DNA를 추출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 예에서, 상기 증폭시키는 단계는 DNA 증폭에 통상적으로 사용되는 증폭 방법 및/또는 수단을 이용하여 수행될 수 있으며, 예컨대, 실시간 중합효소연쇄반응 (real-time PCR)에 의하여 수행될 수 있다.
일 예에서, 상기 검출 방법은, 상기 증폭시키는 단계 이후에, 얻어진 증폭 산물을 검출, 확인, 및/또는 분석(정성 및/또는 정량)하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 검출, 확인, 및/또는 분석하는 단계는 소망하는 목적에 따라서 적절히 수행될 수 있다. 상기 검출, 확인, 및/또는 분석하는 단계는, 통상적인 DNA 검출 및/또는 정성/정량 수단에 의하여 수행될 수 있으며, 예컨대, DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 또는 형광 측정 등에 의할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 상기 시료가 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물, 예컨대, 바실러스 벨레젠시스 (e.g., 바실러스 벨레젠시스 ARRI17 균주)가 처리된 인삼 재배지에서 얻어지는 경우, 상기 검출, 확인, 및/또는 분석하는 단계는 상기 시료 내의 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물의 존재 여부 및/또는 수준 (미생물 개체수, 농도 등)을 측정하여, 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물을 이용한 인삼 뿌리썩음병원균 방제 방법 및/또는 효과를 모니터링하거나 인삼 뿌리썩음병원균 방제의 구체적 조건 (추가 투입 여부, 투입 시기, 투입 간격, 및/또는 투입량 등)을 결정하는데 정보를 제공할 수 있다.
따라서, 다른 예는,
인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물 또는 이를 포함하는 미생물 제제가 처리된 인삼 재배지로부터 얻어진 토양 또는 배양액 시료 내의 DNA에 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물 검출용 핵산 분자를 처리하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및
얻어진 증폭 산물을 분석하는 단계
를 포함하는, 인삼 뿌리썩음병원균 방제 모니터링 방법 또는 인삼 뿌리썩음병원균 방제에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
예를 들어, 상기 모니터링 방법에 있어서, 상기 얻어진 증폭 산물의 분석 결과, 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물의 투입량 (시료에 처리된 길항미생물 개체수 및/또는 농도)이 유지되거나 증가된 경우, 인삼 뿌리썩음병원균 방제가 효과적으로 진행되는 것으로 결정 또는 확인할 수 있다.
다른 예는,
(1) 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물 또는 이를 포함하는 미생물 제제가 처리된 인삼 재배지로부터 얻어진 토양 또는 배양액 시료 내의 DNA에 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물 검출용 핵산 분자를 처리하여 표적 서열을 증폭시키는 단계;
(2) 얻어진 증폭 산물을 분석하는 단계; 및
(3) 증폭 산물 분석 결과, 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물 처리량 (개체수 또는 농도) 대비 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하, 또는 검출되지 않는 경우, 인삼 뿌리썩음병원균에 대한 길항미생물을 추가 처리하는 단계
를 포함하는, 인삼 뿌리썩음병원균 방제 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 본 명세서에서 제공되는 검출용 조성물, 검출용 키트, 및 검출 방법은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 및 서열번호 3의 핵산 분자는 프로브를 모두 사용함으로써, 바실러스 벨레젠시스, 예컨대, 바실러스 벨레젠시스 ARRI17 균주의 검출 민감도 및/또는 특이도를 보다 높일 수 있다. 예컨대, 본 명세서에서 제공되는 검출용 조성물, 검출용 키트, 및 검출 방법은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 및 서열번호 3의 핵산 분자는 프로브를 모두 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행함으로서, 바실러스 벨레젠시스 ARRI17 균주에 대한 검출 민감도(검출 한계)가 1000 copies/rxn 이하 (즉, 시료 내 균주수가 1000개 이하인 경우도 검출 가능함), 100 copies/rxn 이하, 또는 10 copies/rxn 이하일 수 있으며, 예컨대, 10 copies/rxn까지 검출 가능하여, 매우 우수한 검출 효율을 보일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 핵산 분자를 이용하여 인삼 뿌리썩음병원균 길항미생물인 바실러스 벨레젠시스 균주의 토양 내 정착 및 증식여부를 효과적으로 모니터링할 수 있고, 미생물 제제의 처리시기, 처리횟수 및 처리량 등에 관한 정확한 정보 제공할 수 있어서, 인삼 생산비 절감에 기여할 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 프라이머 및 프로브를 이용한 바실러스 벨레젠시스 검출의 민감도를 보여주는 실시간 중합효소연쇄반응 결과(Ct값)를 보여준다.
도 2는 도 1의 결과의 직선성을 보여주는 그래프이다.
도 3은 기존의 프라미어 및 프로브를 이용한 바실러스 벨레젠시스 검출 민감도를 보여주는 전기영동 사진이다.
도 2는 도 1의 결과의 직선성을 보여주는 그래프이다.
도 3은 기존의 프라미어 및 프로브를 이용한 바실러스 벨레젠시스 검출 민감도를 보여주는 전기영동 사진이다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 인삼
뿌리썩음병원균
길항미생물 검출을 위한 Real-time
PCR
수행을 위한 프라이머/프로브 구축
인삼 뿌리썩음병원균의 길항미생물로서 인삼 뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans)에 대하여 길항작용(항균작용)을 하는 바실러스 벨레젠시스 ARRI17 균주 (Bacillus velezensis ARRI17 strain; KFCC11778P)을 조사한 뒤, NCBI sequence data base를 이용하여 유전체의 핵산 서열을 수집하였다. 수집된 길항미생물 균주들의 핵산 서열을 분석하여, 보존 부위를 찾고, 이를 기초로 프라이머 세트와 프로브를 디자인하였다. 이와 같이 디자인된 프라이머 세트와 프로브를 하기 표 1에 나타내었다:
| Name | 핵산 서열(5'→3') | 서열번호 |
| B. velezensis 정방향 프라이머 | ACAAAGTCGCTCCTCCGTTC | 1 |
| B. velezensis 역방향 프라이머 | TCCAAGGTCGATGATTTCCC | 2 |
| B. velezensis 프로브 (FAM, BHQ) | CTTCTTTGGAGATTCCTTCACCGTACATAATGTCC | 3 |
검출 편의를 위하여 Bacillus velezensis ARRI17 검출용 프로브 (서열번호 3)의 5' 말단은 FAM (fluorescein amidite) 형광물질로 표지하고, 3' 말단은 Black hole quencher (BHQTM)로 표지하였다.
실시예 2. Real-time PCR 수행
본 실시예에서 수행되는 Real-time PCR 방법은, 통상적인 PCR 방법에서 DNA 증폭을 위해 사용되는 프라이머 쌍에 추가로 프로브를 함께 사용하여, PCR 과정 중 중합효소로 유도되는 프로브 파괴 현상을 실시간으로 측정하고 프로브에 표지된 형광물질의 특정 파장을 측정함으로써, 프라이머와 프로브를 사용한 이중 검증 및 정확한 정량 측정이 가능하다.
본 실시예에서 수행되는 Real-time PCR의 수행 조건을 다음의 표 2 및 3에 정리하였다:
| System | Name | Final concentration (nM) |
| B.velezensis | B.velezensis F-프라이머 | 1,000 |
| B.velezensis R-프라이머 | 1,000 | |
| B.velezensis 프로브 (FAM, BHQ) | 200 |
| Temperature (℃) | Time | Cycle |
| 50 | 2 min | 1 |
| 95 | 10 min | 1 |
| 95 | 15 sec | 40 |
| 60 | 1 min |
실시예 3. 표적 길항미생물에 대한 검출 특이도 평가
실시예 1에서 설계된 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여, 다양한 종류의 세균 및 동물 세포로부터 추출된 유전체 DNA (genome DNA; gDNA)에 대하여 실시예 2의 조건으로 다중 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여, 상기 프라이머 쌍 및 프로브의 검출 특이도를 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 표 4에 나타내었다:
| No. | Category | Name | Bacillus velezensis |
| 1 | Bacteria | Bacillus velezensis ARRI17 | + |
| 2 | Bacillus cereus | - | |
| 3 | Bacillus subtilis | - | |
| 4 | Bacillus thuringiensis | - | |
| 5 | Campylobacter rectus | - | |
| 6 | Campylobacter ureolyticus | - | |
| 7 | E. coli O157 | - | |
| 8 | Listeria monocytogenes | - | |
| 9 | Yersinia enterocolitica | - | |
| 10 | Clostridium perfringens | - | |
| 11 | Salmonella typhi | - | |
| 12 | Salmonella typhimurium | - | |
| 13 | Shigella sonnei | - | |
| 14 | Staphylococcus aureus | - | |
| 15 | Vibrio vulnificus | - | |
| 16 | Yersinia enterocolitica | - | |
| 17 | Legionella pneumophila | - | |
| 18 | Pseudomonas aeruginosa | - | |
| 19 | Mycoplasma pneumoniae | - | |
| 20 | Animal | Pig | - |
| 21 | Duck | - | |
| 22 | Cow | - | |
| 23 | Chicken | - | |
| 24 | Turkey | - | |
| 25 | Sheep | - | |
| 26 | Horse | - | |
| 27 | Goat | - |
(Bacillus velezensis ARRI17 검출용 키트를 이용하여 RT-PCR로 분석한 결과, +: 검출, -: 불검출;박테리아 균주: 생물자원센터 KCTC 또는 농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC에서 분양받음;
동물세포: 구입한 정육에서 세포를 분리하여 사용)
또한, In silico 상에서 표적 길항미생물 (바실러스 벨레젠시스) 및 기존 등록된 바실러스 속의 다른 미생물에 대하여 실시예 1에서 설계된 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 실시예 2의 조건으로 다중 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여, 표적 길항미생물에 대한 검출 특이도를 시험하였다.
상기 얻어진 결과를 하기 표 5에 나타내었다:
| No. | Strain name | Species name | Accession No. | Match(%) | ||
| Forward primer |
Probe | Reverse primer |
||||
| 1 | - | Bacillus velezensis | - | 100 | 100 | 100 |
| 2 | SRCM103529 | Bacillus licheniformis | CP0035228 | 90 | 88.57 | 95 |
| 3 | BSD-2 | Bacillus subtils | CP013654 | 85 | 85.71 | 85 |
| 4 | DSM8716 | Bacillus clauii | CP019985 | 85 | 82.86 | 50 |
| 5 | NCT-2 | Bacillus megaterium | CP032527 | 85 | 82.86 | 80 |
| 6 | NEB414 | Bacillus caldolyticuus | CP025074 | 75 | 80 | 70 |
| 7 | MBGJa3 | Bacillus cereus | CP026523 | 85 | 85.71 | 90 |
| 8 | SRCM103574 | Bacillus glycinifermentans | CP035232 | 84 | 94.29 | 100 |
| 9 | AM31D | Bacillus krulwichiae | CP020814 | 70 | 74.29 | 35 |
| 10 | T30 | Bacillus intestinalis | CP011051 | 85 | 88.57 | 85 |
| 11 | ZB201702 | Bacillus halotolerans | CP029364 | 90 | 82.85 | 80 |
(Forward primer match(%)=(다른균 유전자내 ARRI17 검출키트의 Forward primer와 상보적 염기서열/ARRI17 검출키트 Forward primer 상보적 염기서열)*100;Reverse primer match(%)=(다른균 유전자내 ARRI17 검출키트의 Reverse primer와 상보적 염기서열/ARRI17 검출키트 Reverse primer 상보적 염기서열)*100;
probe match(%)=(다른균 유전자내 ARRI17 검출키트의 probe와 상보적 염기서열/ARRI17 검출키트 probe 상보적 염기서열)*100)
상기 표 4 및 표 5의 결과에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하여 Real-time PCR 수행시에 목적으로 하는 균주(바실러스 벨레젠시스)를 성공적으로 증폭하는 것을 확인할 수 있다. 또한 목적 균주 이외의 박테리아 및 가축에 대해서는 증폭반응을 보이지 않았다. 또한, In silico 분석 결과에서도 바실러스 벨레젠시스 특이적으로 검출하는 것으로 확인하였다. 이러한 결과는, 실시예 1에서 설계된 프라이머 및 프로브가 바실러스 벨레젠시스에 대한 검출 특이도가 높다는 것을 보여준다.
실시예 4. 표적 길항미생물에 대한 검출 민감도 평가
실시예 2의 조건으로 Real-time PCR 기술을 이용하여 실시예 1에서 설계한 프라이머 및 프로브의 표적 길항미생물(바실러스 벨레젠시스) 검출 민감도를 시험하였다. 바실러스 벨레젠시스 ARRI17 균주를 106~100copies/reaction으로 10배씩 희석하여 3반복으로 Real-time PCR을 진행하였으며, 그 결과를 PowerChekTM Antagonistic Real-time PCR Kit (㈜코젠바이오텍)로 측정하였다.
상기 얻어진 결과(Ct값)를 도 1에 나타내고, 도 1의 결과를 그래프로 도시하여 도 2에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하여 Real-time PCR 수행시 길항미생물(바실러스 벨레젠시스)을 10copies/rxn까지의 감도로 검출할 수 있었다. 또한, 도 2에 나타난 직선성 테스트의 결과, PowerChekTM Antagonistic ARRI17 Real-time PCR Kit (PowerChekTM Antagonistic Real-time PCR Kit에 실시예 1의 프라이머 및 프로브가 적용된 것)에서 길항미생물은 Eff%(기울기 값을 토대로 유추한 효율, Efficiency=(10^(-1/기울기(slope)))-1/ 가장 좋은 PCR 반응의 효율은 90%~110%) 100.606%, R2:0.994로 나타났다.
비교예
실시예 1에서 설계된 프라이머 및 프로브의 표적 길항미생물 검출 민감도 우수성을 확인하기 위하여, 기존에 알려진 바실러스 벨레젠시스 CBMB205 균주에 대한 프라이머 쌍 (표 6 참조; 총 12 쌍)을 이용하여, 표적 길항미생물인 바실러스 벨레젠시스 ARRI17 균주로부터 추출된 gDNA 106~100copies/reaction으로 10배씩 희석하여 3반복으로 Conventional PCR을 수행하였다.
보다 구체적으로, 하기 표 6과 같이 제작된 프라이머 세트를 5pM/ul로 희석하여 2ul를 사용해 총 20ul의 PCR 반응 혼합물을 만들었다. PCR 과정은 preheating 95℃ 5분, denaturation 95℃ 30초, annealing Tm℃ 30초, extension 72℃ 30초로 35 cycle을 반복했으며 final extension 72℃ 30분을 반응하여 PCR을 수행하였다. Tm값은 4, 5, 6, 7, 8번째 프라이머 쌍 및 universal primer 는 54℃, 3 및 10번째 프라이머 쌍은 56℃, 1, 2, 9, 11 및 12번째 프라이머 쌍은 58℃이다.
| No. | F-Primer | 핵산 서열(5'→3') | 서열번호 | R-Primer | 핵산 서열(5'→3') | 서열번호 |
| 1 | BM205-1F | GGGCCACTATTCCCATTCTGATAT | 4 | BM205-1R | CCAAGATGTTCCCGTCTTTCCA | 16 |
| 2 | BM205-2F | CGAAGAAGCAGTAAAGTCCGC | 5 | BM205-2R | ACTTGTAGTTTTTCTTTACAACCCAGA | 17 |
| 3 | BM205-3F | TGCAGTTAATATTGGTTTTTGTCGG | 6 | BM205-3R | CATTCTTATCACATTCTGTTTGACTGT | 18 |
| 4 | BM205-4F | TGGTTTTTGTCGGTTGGTTTATAA | 7 | BM205-4R | CATACTTATCCCAATCATTCAACAAGA | 19 |
| 5 | BM205-5F | TCTAGTGACTTGTTCGCTGTT | 8 | BM205-5R | AGACCGTGAAACCTTTTGCA | 20 |
| 6 | BM205-6F | TCATTTGTACAAGATGCCGTAAGT | 9 | BM205-6R | CGTGAAACCTTTGCAATCATCTATT | 21 |
| 7 | BM205-7F | TGGTATTGAAAATTAACAACGAATCAA | 10 | BM205-7R | ACTTTTCTTCTTCTTTTGTAATGTCCA | 22 |
| 8 | BM205-8F | AACGAAAAAGCCAGAATCAAGCA | 11 | BM205-8R | TTGTAATGTCCAAAACTACCTTATCAA | 23 |
| 9 | BM205-9F | GTCGGTTCAGTCCTTGAGGG | 12 | BM205-9R | TCGCCTTAAAGACACCTGC | 24 |
| 10 | BM205-10F | GGACAGTATGGATCGCTGGT | 13 | BM205-10R | TGTGTGTTCATCATTTAACCCCA | 25 |
| 11 | BM205-11F | GTTCCCCCAGTTGCACCG | 14 | BM205-11R | GGGGCAACTGGGGTAACA | 26 |
| 12 | BM205-12F | GCGCCGATTTCTCCCGTC | 15 | BM205-12R | GTGACTGGAATAACGGGCACG | 27 |
상기와 같이, 바실러스 벨레젠시스 ARRI17 균주에 대하여 표 6의 프라이머쌍을 사용하여 얻어진 증폭 산물에 대하여 전기영동을 실시하여, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 기존에 알려진 바실러스 벨레젠시스 CBMB205 균주에 대한 프라이머 쌍 (표 6의 1~12번 프라이머 쌍)을 이용하여 표적 길항미생물인 바실러스 벨레젠시스 ARRI17 균주를 검출하는 경우, 1번 및 2번 프라이머 쌍 (gerQ gene 부위)을 사용하는 경우에만 바실러스 벨레젠시스 ARRI17 균주가 검출되었고, 검출 민감도는 103 copies/reaction였다. 한편, 상기 실시예 4에서 확인된 바와 같이, 실시예 1에서 설계된 프라이머 및 프로브를 사용하여 RT-PCR 수행시 바실러스 벨레젠시스 ARRI17 균주의 검출 민감도가 100 copies/reaction인 것으로 확인되었다. 이러한 결과는, 실시예 1의 프라이머 및 프로브를 사용한 경우, 기존의 다른 프라이머를 사용한 경우와 비교하여, 적어도 1000배 이상 민감도가 높다는 것을 보여준다.
<110> GYEONGGI-DO
<120> Nucleic Acid Molecule for Detecting Antagonistic Microorganism
against Pathogen Causing Root Rot Disease of Ginseng and
Detecting Kit Comprising the Same
<130> DPP20194016KR
<160> 27
<170> koPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B.velezensis F primer
<400> 1
acaaagtcgc tcctccgttc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B.velezensis R primer
<400> 2
tccaaggtcg atgatttccc 20
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B.velezensis probe
<400> 3
cttctttgga gattccttca ccgtacataa tgtcc 35
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-1F primer
<400> 4
gggccactat tcccattctg atat 24
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-2F primer
<400> 5
cgaagaagca gtaaagtccg c 21
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-3F primer
<400> 6
tgcagttaat attggttttt gtcgg 25
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-4F primer
<400> 7
tggtttttgt cggttggttt ataa 24
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-5F primer
<400> 8
tctagtgact tgttcgctgt t 21
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-6F primer
<400> 9
tcatttgtac aagatgccgt aagt 24
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-7F primer
<400> 10
tggtattgaa aattaacaac gaatcaa 27
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-8F primer
<400> 11
aacgaaaaag ccagaatcaa gca 23
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-9F primer
<400> 12
gtcggttcag tccttgaggg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-10F primer
<400> 13
ggacagtatg gatcgctggt 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-11F primer
<400> 14
gttcccccag ttgcaccg 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-12F primer
<400> 15
gcgccgattt ctcccgtc 18
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-1R primer
<400> 16
ccaagatgtt cccgtctttc ca 22
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-2R primer
<400> 17
acttgtagtt tttctttaca acccaga 27
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-3R primer
<400> 18
cattcttatc acattctgtt tgactgt 27
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-4R primer
<400> 19
catacttatc ccaatcattc aacaaga 27
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-5R primer
<400> 20
agaccgtgaa accttttgca 20
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-6R primer
<400> 21
cgtgaaacct ttgcaatcat ctatt 25
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-7R primer
<400> 22
acttttcttc ttcttttgta atgtcca 27
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-8R primer
<400> 23
ttgtaatgtc caaaactacc ttatcaa 27
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-9R primer
<400> 24
tcgccttaaa gacacctgc 19
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-10R primer
<400> 25
tgtgtgttca tcatttaacc cca 23
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-11R primer
<400> 26
ggggcaactg gggtaaca 18
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BM205-12R primer
<400> 27
gtgactggaa taacgggcac g 21
Claims (7)
- 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍; 또는
상기 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브의 조합
을 포함하고,
검출 민감도가 100 copies/rxn 이하인,
바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) 검출용 핵산 분자 세트. - 제1항의 핵산 분자 세트를 포함하는, 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) 검출용 조성물.
- 제1항의 핵산 분자 세트, 및 DNA 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) 검출용 키트.
- 인삼 재배지로부터 얻어진 시료 내의 DNA에 제1항의 핵산 분자 세트를 처리하여 표적 서열을 증폭시키는 단계를 포함하는, 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) 검출 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 증폭시키는 단계는 실시간 중합효소연쇄반응에 의하여 수행되는 것인, 검출 방법.
- 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis)가 처리된 인삼 재배지로부터 얻어진 시료 내의 DNA에 제1항의 핵산 분자 세트를 처리하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및
얻어진 증폭 산물을 분석하는 단계
를 포함하는, 인삼 뿌리썩음병원균 방제 모니터링 방법. - 제6항에 있어서, 상기 증폭시키는 단계는 실시간 중합효소연쇄반응에 의하여 수행되는 것인, 모니터링 방법.
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| KR101803642B1 (ko) * | 2016-05-13 | 2017-12-01 | 충북대학교 산학협력단 | 바실러스 벨레젠시스 cbmb205의 판별 마커 |
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2019
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| GENBANK ACCESSION NO. CP025308 (2017.12.18.)* |
| LIM ET AL, PLANT PATHOL J., 2017,33(5):488_498 |
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